TR201808011T4

TR201808011T4 - Hümanize fc gama r fareleri.

Info

Publication number: TR201808011T4
Application number: TR2018/08011T
Authority: TR
Inventors: Macdonald Lynn; Tu Naxin; Gurer Cagan; Stevens Sean; J Murphy Andrew
Original assignee: Regeneron Pharma
Priority date: 2009-12-21
Filing date: 2010-12-17
Publication date: 2018-06-21
Also published as: HRP20180911T1; US20140154701A1; IL220365A0; HK1257001A1; JP2016093201A; IL261257A; AU2010339863B2; KR20200033981A; AU2010339863A1; JP5891259B2; KR101862277B1; US8658853B2; JP5595517B2; NO2516457T3; CN104232589B; DK2516457T3; AU2014210646A1; US12036288B2; CN102762590A; KR101973524B1

Abstract

Mevcut buluşun sahası, endojen murin Fc'R genlerinden yoksun olan, genetiği değiştirilmiş fareler olup, sözü edilen genetiği değiştirilmiş fareler, endojen Fc'R genlerinin insan Fc'R genleri ile bir ikamesini içerir ve sözü edilen genetiği değiştirilmiş fareler, en az iki, üç, dört, ya da beş adet fonksiyonel düşük afiniteli insan Fc'R genlerini ifade edebilen fareleri ihtiva eder ve endojen düşük afiniteli Fc'R genlerini ifade etmeyen immün hücreleri içeren genetiği değiştirilmiş fareleri ihtiva eder.

Description

TARIFNAME HUMANIZE FC GAMA R FARELERI BULUS SAHASI Mevcut bulusun sahasi, endojen murin FcyR genlerinden yoksun olan, genetigi degistirilmis fareler olup, sözü edilen genetigi degistirilmis fareler, endojen FcvR genlerinin insan FcvR genleri ile bir ikamesini içerir ve sözü edilen genetigi degistirilmis fareler, en az iki, üç, dört, ya da bes adet fonksiyonel düsük afiniteli insan FcyR genlerini ifade edebilen fareleri ihtiva eder ve endojen düsük afiniteli FcyR genlerini ifade etmeyen immün hücreleri içeren genetigi degistirilmis fareleri ihtiva eder. BULUSUN ARKA PLANI Fc reseptorleri (FCR'Ier), immün sistem hücrelerinin yüzeyinde bulunan ve memelilerde immün sistemin çesitli fonksiyonlarini icra eden proteinlerdir. Fc reseptörleri, çesitli tiplerde ve çesitli hücrelerde bulunur ve örnek olmasi bakiminda, enfekte hücrelere ya da istilaci patojenlere eklenmis antikorlara baglanma, fagositik veya sitotoksik hücrelerin mikroplari, ya da enfekte hücreleri, antikor aracili fagositoz veya antikora bagimli hücre aracili sitotoksisite (ADCC, antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) yoluyla imha etmeleri için stimüle etme gibi çesitli immün fonksiyonlarina aracilik ederler. ADCC, immün sisteme ait efektör hücrelerin, antikorlar tarafindan baglanmis olan bir hedef hücreyi eriterek parçaladiklari (Iizis) bir süreçtir. Bu süreç, bir antikor yanitiyla sonuçlanacagi sekilde, öncesinde bir yabanci antijene ya da hücreye maruz kalmaya baglidir. ADCC, örnek olarak dogal katil (NK) hücreleri gibi efektör hücreler üzerinden aracilik bulabilir ve bunun gerçeklesmesi için, efektör hücrenin yüzeyi üzerinde ifade edilen FcR, kendisi de yabanci antijene ya da hücreye bagli bulunan antikorun Fc kismina baglanir. Fc reseptorlerinin immün yanitinda oynadiklari merkezi rol sebebiyle, çoklu insan düsük afiniteli Fc reseptörlerini ortak sekilde ifade eden insan harici hayvanlar da dahil olmak üzere, çoklu insan Fc reseptörlerini ortak sekilde ifade eden, insan harici faydali hayvanlara ihtiyaç vardir. Ozellikle anti-tümör tedavileri ve otoimmün hastaliklari tedaviye yönelik terapiler gibi insan hastaligi tedavilerinin arastirilmasi ve aydinlatilmasi amaciyla ve farmasötik ilaçlarin gelistirilmesi, 'Özellikle de insan antikor farmasötiklerinin gelistirilmesi, tasarlanmasi ve test edilmesi amaciyla insan FcR fonksiyonunun ve antikora bagimli hücre aracili sitotoksisitenin (ADCC) insan süreçlerinin insan harici hayvan modellerine ihtiyaç söz konusudur. SEKILLERIN KISA AÇIKLAMASI Sekil 1, bir farede bir yabanil tip düsük afiniteli FcvR Iokusunun bir sematik temsilidir ve fare FcleIB, FcyRIV ve Fclell genlerini ve bu genlerin hedefli olarak silinmesi için kullanilan ve yere spesifik rekombinasyon pozisyonlari tarafindan çevrili bir neomisin kaseti içeren bir fare FcyR hedefleyici vektörü gösterir. Sekil 2, yabanil tipteki ve düsük afiniteli FcyR a-zinciri geninden yoksun farelere (mFcvR KO) yönelik endojen mFcyRII ve mFcyRIII genlerinin ekspresyonu da dahil olmak üzere, B hücreleri (anti-CD19), NK hücreleri (anti-NKp46) ve makrofajlara (anti-F4/80) geçitli splenositlerin histogramlarini gösterir. Sekiller 3A-3D, B hücrelerinin, hümanize CD20 farelerinde (hCD20) ve FcyR nakavti fareler (hCD20 / FcyR KO) olarak yetistirilmis hümanize CD20 farelerinde, fare Fc (Ab 168) ya da insan Fc (Ab 735) kismi içeren bir human anti-human CD20 antikoru ile, asagida belirtilen birkaç Ienfositler kompartimaninda in vivo olarak tüketilmesini gösterir: kemik iligi (Sekil 3A), kan (Sekil 38), lenf nodu (Sekil 3C) ve dalak (Sekil 3D). Her bir grafikte y ekseni, geçitlenen B grubuna yönelik antikor dozunu gösterir: 10 mg/kg kontrol antikoru (C), 2 mg/kg human anti- human CD20 antikoru (2 Ab) ve 10 mg/kg human anti-human CDZO antikoru (10 Ab). Sekil 4, düsük afiniteli fare FcyR Iokusunun neomisin hedefli olarak silinmesini ve silinen fare lokusu na iki adet insan düsük afiniteli FcyR genlerini (hFcvRIIIA ve hFclelA) sokmaya yönelik olarak, yere spesifik rekombinasyon pozisyonlari tarafindan kusatilmis bir higromisin kaseti içeren bir ikinci hedefleyici vektörü çizimsel olarak gösterir. hFcyRIIA geninin trombositler üzerinde ifadelenmesi için, insan FcvRIIIA-IIA hedefleyici vektörünün hFcyRIIA genine fonksiyonel sekilde bagli bir uzatilmis promotör bölgesi kullanilir; hFcyRIIA geninin trombositler üzerinde ifadelenmesini önlemek amaciyla promotör bölgesi ihmal edilir ya da büyük ölçüde ihmal edilir. Sekil 5Ai yabanil tipteki ve insan FcyRIIIA-IIA homozigot fareleri (Human FcvRIIIA/ FcyRIIA HO) için insan FclellA geninin ekspresyonu da dahil olmak üzere, NK hücreleri (anti-NKp46) ve makrofajlar (anti-F4/80) için geçitlenen splenositlerin histogramlarini gösterir. Sekil 5B, yabanil tipteki ve insan FcyRIIIA-IIA homozigot fareleri (Human FcvRIIIA/ FcyRIIA HO) için insan FclelA geninin ekspresyonu da dahil olmak üzere, nötrofiller (anti-LyßG) ve makrofajlar (anti-F4/80) için geçitlenen splenositlerin histogramlarini gösterir. Sekil 6, iki adet düsük afiniteli insan FcyR geninin (hFcyRIlIA ve hFcyRIIA) eklenmis oldugu düsük afiniteli fare FcyR Iokusunun higromisin hedefli olarak silinmesini ve üç adet ilave insan düsük afiniteli FcyR genini (hFcvRIIB, hFcvRIIIB ve hFcyRIIC) ve yere spesifik rekombinasyon pozisyonlari tarafindan kusatilmis bir neomisin kasetini sokmaya yönelik bir üçüncü hedefleyici vektörü çizimsel olarak gösterir. Sekil 7, yabanil tipteki ve insan FcvRIIlA-lIlB-IlA-IlB-IIC homozigot fareleri (Human FcvRllIA/ FcyRIlIB / FcvRIIA / FcvRIlB / FcvRIIC HO) için insan FcvRIlB ve insan FcvRIIIB geninin ekspresyonu da dahil olmak üzere, B hücreleri (anti-CD19) ve nötrofiller (anti-LyGG) için geçitlenen splenositlerin histogramlarini gösterir. BULUSUN KISA AÇIKLAMASI Genetigi degistirilmis fare hücreleri, fare embriyonlari, fareler ve bunlarin yapimi ve kullanimina yönelik yöntemler ve bilesimler açiklanmaktadir. Çesitli yönlerine göre fareler, bir endojen fare düsük afiniteli FcyR Iokusunda, bir endojen FcvR reseptörünün bir insan FcvR reseptörü ile bir ikamesini içerir. Bir yönüne göre, bir genetik modifikasyon içeren bir fare saglanmakta olup sözü edilen genetik modifikasyon, endojen fare düsük afiniteli FcyR geni lokusunun, FcyRIIB, FcyRIV ve FcyRIII d-alt birimlerini kodlayan fare genlerini içeren bir genomik fragmanin, insan FcyRIIA, FcyRIIB, FcvRllC, FclellA ve FcyRIIIB arasindan seçilen en az iki adet düsük afiniteli insan FcvR genini kodlayan bir insan genomik fragmani ile bir ikamesini içermekte ve sözü edilen fare, bir fonksiyonel FcR y-zincirine sahip olmaktadir. Bir yapilanmaya göre fonksiyonel FcR y-zinciri, bir fare FcR y-zinciri olmaktadir. Bir yapilanmaya göre söz konusu fare FcR y-zinciri, fareye endojen olan bir FcR y-zinciri olmaktadir. Bir yapilanmaya göre fareler, bir insan düsük afiniteli FcyR reseptörünün bir fonksiyonel (i- zincirini ve bir fonksiyonel endojen fare y-zincirini ifade etmektedir. Bir yönüne göre burada saglanan genetigi degistirilmis fare bir fonksiyonel FcvRIV d-zincirini ifade etmemekte ve bir fonksiyonel FcyRIII oi-zincirini ifade etmemektedir ve sözü edilen fare, bir fonksiyonel endojen fare v-zincirini ifade etmektedir. Bir yapilanmaya göre fare genomunda, bir endojen FcvRIIB d-zinciri, bir endojen FcyRIV 0t- zinciri ve bir endojen FcyRIIl oi-zinciri silinmis bulunmaktadir. Bir yapilanmaya göre fare genomunda, bir endojen FcyRIIB 0i-zinciri silinmis, bir endojen FcyRIV oi-zinciri silinmis ve bir endojen FcyRIll oi-zinciri silinmis bulunmakta ve ayrica, bir yabanil tipteki farenin bir antijene bir immün yanit üretme becerisine kiyasli olarak, ayni antijene karsi immün yanit üretmede azalmis beceri sergilemektedir. Bir yapilanmaya göre azalmis immün yanit, azalmis bir antikora bagimli hücre aracili sitotoksisite (ADCC, antibody- dependent cell-mediated cytotoxicity) durumunu ihtiva etmektedir. Bir yapilanmaya göre azalmis immün yanit, antikora bagimli NK hücresi katli saglamak üzere bir hücre öldürme testinde azalmis beceri ihtiva etmektedir. Spesifik yapilanmalara göre ADCC ya da antikora bagimli NK hücresi katlindeki azalma en az %50, bir yapilanmada en az %75, bir yapilanmada en az %90 olmaktadir. Bir yapilanmaya göre farede, bir endojen FcyRIIB oi-zinciri silinmis, bir endojen FcyRIV oi-zinciri silinmis ve bir endojen FcyRIII oi-zinciri silinmis bulunmakta ve ayrica, bir antijen ile bagisiklanmasi üzerine, yabanil tipteki bir fare ile karsilastirildiginda, örnek olarak sözü edilen zincirlerin silinmemis oldugu ayni ya da benzer soydan gelen bir fare ile karsilastirildiginda, artmis hümoral yanit göstermektedir. Bir yapilanmaya göre artmis hümoral antikor yaniti, bir yabanil tipteki fare ile karsilastirildiginda 2 misli olmaktadir. Bir yapilanmaya göre artmis hümoral antikor yaniti, bir yabanil tipteki fare ile karsilastirildiginda 3 misli olmaktadir. Bir yapilanmaya göre artmis hümoral antikor yaniti, bir yabanil tipteki fare ile karsilastirildiginda 5 misli olmaktadir. Bir yapilanmaya göre artmis hümoral antikor yaniti, bir yabanil tipteki fare ile karsilastirildiginda 7 misli olmaktadir. Bir yapilanmaya göre artmis hümoral antikor yaniti, bir yabanil tipteki fare ile karsilastirildiginda 10 misli olmaktadir. Spesifik bir yapilanmaya göre hümoral antikor yaniti, farenin birim serum proteini mikrogram miktarinda, bir antijeni (farenin bagisiklanmis oldugu antijeni) spesifik olarak baglayan mikrogram antikor miktari olarak ölçülür. Bir yapilanmaya göre artmis hümoral antikor yaniti, yabanil tipteki bir farenin tolerans gösterdigi bir antijen ile ilgili olmakta, ya da yabanil tipteki bir farede zayif ya da minimal hümoral immün yaniti sergileyen bir antijen ile ilgili olmaktadir. Spesifik bir yapilanmaya göre antijen, bir fare antijeni olmaktadir. Spesifik bir yapilanmaya göre antijen, bir fare proteini ile antijeni olmaktadir. Saglanan genetigi degistirilmis fare, düsük afiniteli fare FcyR d-zinciri genlerinin, bir düsük afiniteli insan FcyR d-zinciri geni ile bir ikamesini ihtiva etmekte ve bu ikame ise, endojen fare FcvR oi-zinciri geni lokusunda olmaktadir. Düsük afiniteli fare FcvR d-zinciri genleri; bir FcvRIIB, FcyRIV ve bir FcvRIII oi-zinciri geni olmaktadir. Spesifik bir yapilanmaya göre saglanan genetigi degistirilmis fare, bir endojen FcR y-zincirini ifade etmekte ve düsük afiniteli insan FcyR oi-zinciri geni ise FcyRIIIA oi-zinciri olmaktadir. Bir baska spesifik yapilanmaya göre genetigi degistirilmis fare, NK hücreleri üzerinde bir fonksiyonel insan FcleIIA oi-zincirini ve bir endojen FcR y-zincirini ifade etmektedir. Spesifik bir yapilanmaya göre FcvRIIIA oi-zincirinin NK hücreleri üzerindeki fonksiyonelligi, insan antikor-aracili NK katli (örnek olarak bir insan antikoru aracili ADCC) ile yansitilmaktadir. Bir yönüne göre genetigi degistirilmis bir hücre, insan harici bir embriyon, ya da insan harici bir hayvan saglanmakta olup sözü edilen genetik degisikligi, en az bir endojen düsük afiniteli FcvR d-zinciri geninin, bir insan FcyR d-zinciri geni ile bir ikamesini içermekte ve hücre, embriyon, ya da hayvan bir fonksiyonel FcR y-zincirini ifade etmektedir. Bir yapilanmaya göre fonksiyonel FCRy-zinciri, bir endojen FcR v-zinciri olmaktadir. Bir yapilanmaya göre düsük afiniteli insan FcyR d-zinciri geni; bir FcvRlIA oi-zinciri geni, bir FcvRIIIA oi-zinciri geni ve bunlarin bir kombinasyonu arasindan seçilmektedir. Spesifik bir yapilanmaya göre insan FcvRIIA geni bir polimorfizm içermekte ve sözü edilen polimorfizm ise bir 131 His düsük yanitçi polimorfizmi ve bir 131Arg yüksek yanitçi polimorfizmi arasindan seçilmektedir. Spesifik bir yapilanmaya göre FcyRIIA polimorfizmi, 131 His düsük yanitçi polimorfizmi olmaktadir. Bir yapilanmaya göre FcyRIIIA geni, spesifik bir allelik varyant olmakta ve allelik varyant ise bir 158Val varyanti ve bir 158Phe varyanti arasindan seçilmektedir. Spesifik bir yapilanmaya göre FoyRIIIA allelik varyanti, 158Val varyanti olmaktadir. Bir yapilanmaya göre düsük afiniteli insan FcyR geni; bir FcleIB, FcyRIIC, bir FcyRIIIB geni ve bunlarin bir kombinasyonu arasindan seçilmektedir. Spesifik bir yapilanmaya göre FcvRIIIB geni, bir amino asit substitusyonu içermekte ve sözü edilen substitusyon ise bir 232lle ya da bir 232Thr substitusyonu arasindan seçilmektedir. Bir baska spesifik yapilanmaya göre amino asit substitusyonu, bir 232Ile substitusyonu olmaktadir. Spesifik bir yapilanmaya göre FcyRIIIB geni, spesifik bir allelik varyant olmakta ve allelik varyant ise bir NA1 varyanti ve bir NA2 varyanti arasindan seçilmektedir. Bir baska spesifik yapilanmaya göre FcleIIB allelik varyanti, NA2 varyanti olmaktadir. Bir yapilanmaya göre düsük afiniteli insan FcyR d-zinciri genleri; bir FcyRIIA, FcyRIIB, FcvRllC, FcyRIIIA, FcyRIllB a-zinciri geni ve bunlarin bir kombinasyonu arasindan seçilmektedir. Bir yapilanmaya göre düsük afiniteli fare FcleV oi-zinciri geni ve FcleII a-zinciri geni, en az iki adet düsük afiniteli insan FcvR d-zinciri geni ile ikame edilmektedir. Bir yapilanmaya göre düsük afiniteli fare FcvRIV oi-zinciri geni ve FcyRIIB d-zinciri geni, en az iki adet düsük afiniteli insan FovR d-zinciri geni ile ikame edilmektedir. Bir yapilanmaya göre düsük afiniteli fare FcyRIlB oi-zinciri geni ve FcvRlli a-zinciri geni, en az iki adet düsük afiniteli insan FcyR d-zinciri geni ile ikame edilmektedir. Spesifik bir yapilanmaya göre en az iki adet düsük afiniteli insan FcvR oi-zinciri genleri; bir FcvRIIA, FcyRIIB, FclelC, FcvRIIIA, FcleIIB d-zinciri geni ve bunlarin bir kombinasyonu arasindan seçilmektedir. Bir baska spesifik yapilanmaya göre en az iki adet düsük afiniteli insan FcyR 0i-zinciri genleri; bir FcyRIIA d-zinciri geni, bir FcyRIIIA 0i- zinciri geni ve bunlarin bir kombinasyonu arasindan seçilmektedir. Bir baska spesifik yapilanmaya göre en az iki adet düsük afiniteli insan FcvR a-zinciri genleri; bir FcyRIIB, FovRlIC, FcyRIIIB a-zinciri geni ve bunlarin bir kombinasyonu arasindan seçilmektedir. Bir baska spesifik yapilanmaya göre düsük afiniteli fare FcyR genleri; bir insan FcyRIIA oi-zinciri geni ve bir insan FcvRIIIA oi-zinciri geni ile ikame edilmektedir. Bir baska spesifik yapilanmaya göre düsük afiniteli insan FcyRIIA ve FcyRIIIA d-zinciri genleri, varyantlar içermekte ve sözü edilen FcyRIIA oi-zinciri geni, bir 131 His varyantina ve FcvRIIIA d-zinciri geni ise bir 158Val varyantina sahip olmaktadir. Bir baska spesifik yapilanmaya göre düsük afiniteli fare FcyR 0i- zinciri genleri, asagida belirtilen düsük afiniteli insan FcyR d-zinciri genleri ile ikame edilmektedir: FcyRIIB, FcyRIIC ve FcyRIIIB. Bir baska spesifik yapilanmaya göre düsük afiniteli insan FcyRIIB oi-zinciri geni ve FcyRIlIB oi-zinciri geni, varyantlar içermekte ve sözü edilen FcyRIIB d-zinciri geni, bir 232lle varyantina ve FcyRIlIB 0i-zinciri geni ise bir NA2 varyantina sahip olmaktadir. Bir yapilanmaya göre genetik modifikasyonlar, fare ve insan kromozom 1'in sintenik genomik dizilerinin bir ikamesini içermektedir. Spesifik bir yapilanmaya göre genetik modifikasyonlar; endojen düsük afiniteli fare FcyR genleri içeren bir genomik fragmanin, düsük afiniteli insan FcyR genleri içeren bir genomik fragman ile bir ikamesini ihtiva etmektedir. Bir baska spesifik insan genomik fragmani ile ikame edilmektedir. Gene burada, genetigi degistirilmis bir hücre, insan harici bir embriyon, ya da insan harici bir hayvan saglanmakta olup sözü edilen genetik degisikliginde, bir ya da daha fazla endojen düsük afiniteli reseptör oi-zinciri geni nakavt edilmekte ve bir ya da daha fazla insan FcvR 0r- zinciri genleri içeren bir epizom bulunmaktadir. Spesifik bir duruma göre hücre, embriyon, ya da hayvan, bir fonksiyonel FcR v-zincirini ifade etmektedir. Spesifik bir duruma göre epizom, bir mini kromozom olmaktadir. Bir duruma göre fonksiyonel FcR y-zinciri hücreye, embriyona ya da hayvana endojen olmaktadir. Bir yönüne göre, genetigi degistirilmis bir fare saglanmakta olup sözü edilen genetik degisikligi, endojen fare düsük afiniteli FcyR geni lokusunun, FcvRIIB, FcvRIII ve FcyRIV oi-alt birimlerini kodlayan fare genlerini içeren bir genomik fragmanin, en az iki adet düsük afiniteli insan FcyR genini kodlayan ve sözü edilen en az iki adet düsük afiniteli insan FcvR geninin, bir insan FcyRIlIA a-alt birimini kodlayan bir geni içerdigi bir insan genomik fragmani ile bir ikamesini içermekte ve sözü edilen fare, bir endojen fare FcyR y-alt birimi ile iliskili bir insan FcyRIIIA proteinini ifade etmekte ve insan FcyRIIIA proteini ise bir fare NK hücresinin yüzeyi üzerinde ifade edilmektedir. Bir yapilanmaya göre fonksiyonel düsük afiniteli FcvR reseptörü, düsük afiniteli FcyR reseptörünün insanlarda ifade edildigi bir hücre tipinde ifade edilmektedir. Fonksiyonel insan düsük afiniteli FcyR reseptörü, FcyRIIIA olmakta ve FcyRIIIA ise NK hücreleri üzerinde ifade edilmektedir. Fare, üç adet fare FcyR o-zinciri geninin, en az iki adet insan FcyR oi-zinciri genleri ile bir ikamesini ihtiva etmektedir. Bir baska spesifik yapilanmaya göre üç adet fare FcyR oi-zinciri genleri, üç adet insan FcyR oi-zinciri genleri ile ikame edilmektedir. Düsük afiniteli fare FcvR oi-zinciri genleri; bir FcyRIIB, FcvRIV ve FcvRIII oi-zinciri geni olmaktadir. Bir yapilanmaya göre en az iki adet düsük afiniteli insan FcvR oi-zinciri genleri; bir FcyRIIA, FcvRIIB, FcyRIIC, FcvRIIIA, FcvRIIIB oi-zinciri geni ve bunlarin bir kombinasyonu arasindan seçilmekte ve sözü edilen en az iki adet düsük afiniteli insan FcvR genleri, insan FcyRIlI 0( alt birimini kodlayan bir geni ihtiva etmektedir. Bir yapilanmaya göre düsük afiniteli insan FcyR oi- zinciri geni; bir FcyRIIA, bir FcvRIIIA oi-zinciri geni ve bunlarin bir kombinasyonu arasindan seçilmekte ve sözü edilen en az iki adet düsük afiniteli insan FcvR genleri, insan FCYRIII a ait birimini kodlayan bir geni ihtiva etmektedir. Bir yapilanmaya göre düsük afiniteli insan FcvR oi- zinciri geni; bir FcyRIIB, FcyRIIC, bir FcleIlB oi-zinciri geni ve bunlarin bir kombinasyonu arasindan seçilmekte ve sözü edilen en az iki adet düsük afiniteli insan FcyR genleri, insan FcyRIII oi alt birimini kodlayan bir geni ihtiva etmektedir. Bir baska spesifik yapilanmaya göre fare oi-zinciri genleri, asagidaki insan FcyR oi-zinciri genleri ile ikame edilmektedir: FcyRIIA ve FcyRIIIA. Spesifik olan daha baska bir yapilanmaya göre fare oi-zinciri genleri, asagidaki insan FcvR oi-zinciri genleri ile ikame edilmektedir: FcvRIlB, FcyRIIC ve FcyRIIIB. Bir yönüne göre saglanan genetigi degistirilmis fare bir düsük afiniteli insan FcyR oi-zinciri ve bir fare FcR y-zinciri alt birimi içermekte ve sözü edilen fare, insan FcyR a-zincirini asagida sayilanlarin arasindan seçilen bir hücre üzerinde ifade etmektedir: bir nötrofil, bir eozinofil, bir bazofil, bir monosit, bir makrofaj, bir trombosit, bir Langerhans hücresi, bir dendritik hücre, bir NK hücresi, bir mast hücresi, bir B hücresi, bir T hücresi ve bunlarin bir kombinasyonu. Bir yapilanmaya göre fare, bir insan FcyRIIA oi-zincirini, asagida sayilanlarin arasindan seçilen bir hücre üzerinde ifade etmektedir: bir nötrofil, bir makrofaj, bir eozinofil, bir trombosit, bir dendritik hücre, bir Langerhans hücresi ve bunlarin bir kombinasyonu. Bir yapilanmaya göre fare, ifade edilen insan FcyRIIA oi-zinciri üzerinden baslayan ya da aracilik bulan fagositoz, ADCC ve hücresel aktivasyon becerisine sahip olmaktadir. Bir yapilanmaya göre fare, bir insan FcyRIIIA oi-zincirini, asagida sayilanlarin arasindan seçilen bir hücre üzerinde ifade etmektedir: bir makrofaj, bir NK hücresi, bir monosit, bir mast hücresi, bir eozinofil, bir dendritik hücre, bir Langerhans hücresi, en az bir T hücresi tipi ve bunlarin bir kombinasyonu. Bir yapilanmaya göre fare, NK hücreleri üzerinde ifade edilen insan FcyRIIIA oi-zinciri üzerinden aracilik bulan ADCC becerisine sahip olmaktadir. Spesifik bir yapilanmaya göre fare, bir insan Fc kismi içeren bir antikora yanit olarak, hFcleIIA-aracili ADCC sergilemektedir. Bir yapilanmaya göre fare, hem bir insan FcyRIIA oi-zinciri hem de bir insan FcyRIIIA oi-zincirini ifade etmektedir. Bir yapilanmaya göre insan FcyRIIA oi-zinciri, trombositler üzerinde ifade edilmekte ve insan FcvRIIIA oi-zinciri ise NK hücreleri üzerinde ifade edilmektedir. Bir yapilanmaya göre fare, bir insan FC kismi içeren bir antikor tarafindan aracilik göre ADCC becerisi göstermekte ve bu aracilik ise, aksesuar hücrelerin yüzeyi üzerinde ifade edildikleri üzere, ya insan FcvRIIA oi-zinciri, ya da insan FcvRlIIA d-zinciri üzerinden gerçeklesmektedir. Bir yapilanmaya göre insan FclelA d-zinciri, trombositler üzerinde ifade edilmemektedir. Insan FcvRllA d-zincirinin, trombositler üzerinde ifade edilmedigi spesifik bir yapilanmaya göre fare, bir insan genomunda insan FcyRIIA oi-zinciri ile fonksiyonel sekilde bagli olan bir insan promotör dizisinden yoksun olmakta ya da büyük Ölçüde yoksun olmaktadir. Bir yapilanmaya göre fare, bir insan FcyRIIB a-zincirini, asagida sayilanlarin arasindan seçilen bir hücre üzerinde ifade etmektedir: bir B hücresi, bir mast hücre, bir bazofil, bir makrofaj, bir eozinofil, bir nötrofil, bir dendritik hücre, bir Langerhans hücresi ve bunlarin bir kombinasyonu. Spesifik bir yapilanmaya göre fare, bir insan FcvRllB oi-zincirini bir B hücresi hem de bir mast hücresi üzerinde ifade etmektedir. Bir baska spesifik yapilanmaya göre fare, ifade edilen insan FcyRIIB o-zinciri üzerinden aracilik buldugu üzere, immün komplekslerin endositozunu saglama becerisi göstermektedir. Bir yapilanmaya göre fare, bir insan FcyRIIC (Ji-zincirini, asagida sayilanlarin arasindan seçilen bir hücre üzerinde ifade etmektedir: bir nötrofil, bir makrofaj, bir eozinofil, bir trombosit, bir dendritik hücre, bir Langerhans hücresi ve bunlarin bir kombinasyonu. Spesifik bir yapilanmaya göre fare, ifade edilen insan FcyRIIC d-zinciri üzerinden baslatildigi üzere, fagositoz, ADCC ve hücresel aktivasyon becerisine sahip olmaktadir. Bir yapilanmaya göre fare, bir insan FcyRIIIB oi-zincirini nötrofiller ve eozinofiller üzerinde ifade etmektedir. Spesifik bir yapilanmaya göre fare, hücresel aktivasyon, fagositoz, ADCC ve degranülasyon becerisine sahip olmakta ve sözü edilen hücresel aktivasyon, fagositoz, ADCC ve degranülasyon ise, ifade edilen insan FcyRIlIB o-zinciri üzerinden aracilik bulmaktadir. Bir yönüne göre saglanan farede, endojen FcvRIIB, FcyRIV ve FcyRIII genleri silinmis ve insan FcyRIIA, FcyRIIB, FcyRIIC, FcyRIIIA ve FcyRIIIB genleri sokulmus olmakta ve sözü edilen fare, bir fonksiyonel fare FcR v-zinciri geni içermektedir. Bir yapilanmaya göre farede, endojen FcyRIIB, FcyRIV ve FcyRIII genleri tarafindan kodlanan oi-zincirleri silinmis ve insan FcyRIIA, FcyRIIB, FcyRIIC, FcyRIIIA ve FcyRIIIB genleri tarafindan kodlanan a-zincirleri sokulmus bulunmaktadir. Insan FcyRIIA, FcyRIIB, FcyRIIC, FcvRlllA ve FcyRIIIB a-zinciri genlerinin sokulmasi, endojen fare düsük afiniteli FcyR a-zinciri lokusunda gerçeklesmektedir. Bir yapilanmaya göre fare, insan FcvRlllA reseptörünü NK hücreleri ve makrofajlar üzerinde ifade etmektedir. Spesifik bir yapilanmaya göre, farenin bir splenosit 'örneginden gelen NK hücrelerinin tamami ya da neredeyse tamami, insan FcyRIIlA reseptbrünü ifade etmektedir. Spesifik bir yapilanmaya göre, farenin bir splenosit örneginden gelen makrofajlarin tamami ya da neredeyse tamami, insan FcyRIIIA reseptörünü ifade etmektedir. Bir yapilanmaya göre fare; insan FcvRllA, insan FcyRIIIA ve bunlarin bir kombinasyonu arasindan seçilen bir insan FcvR reseptörünü, nötrofiller, makrofajlar ve bunlarin bir kombinasyonundan seçilen bir hücre tipi üzerinde ifade etmektedir. Spesifik bir yapilanmaya göre fare, insan FcvRllA reseptörünü ve insan FcvRlIIA reseptörünü, fareden alinan bir splenosit örnegine ait nötrofillerin ve makrofajlarin tamaminda ya da neredeyse tamaminda ifade etmektedir. Bir yapilanmaya göre fare, insan FcyRIIB reseptörünü ve insan FcyRIIIB reseptörünü, fareden alinan B hücresi geçitli bir splenosit örnegine ait B hücreleri ve B hücrelerinin nötrofilleri üzerinde ifade etmektedir. Spesifik bir yapilanmaya göre fare, insan FcyRIIIB reseptörünü ve insan FcvRlIB reseptörünü, fareden alinan B hücresi geçitli bir splenosit örnegine ait B hücrelerinin ve nötrofillerin tamaminda ya da neredeyse tamaminda ifade etmektedir. Bir yapilanmaya göre fare, ayrica bir hümanize CD20 geni içermektedir. Bir yapilanmaya göre, ayrica hümanize CD20 genini içeren farede, bir Fc içeren bir anti-CD20 baglayici protein ile muamele yapilmasi üzerine B hücreler (in vivo olarak) tükenmektedir. Bir yapilanmaya göre tükenme, asagida sayilanlarin arasindan seçilen bir kompartimanda gerçeklesmektedir: kemik iligi, kan, lenf nodu, dalak ve bunlarin bir kombinasyonu. Bir yapilanmaya göre Fc, bir insan FC kismi olmaktadir. Bir yapilanmaya göre Fc, bir fare Fc kismi olmaktadir. Bir yapilanmaya göre anti-CD20 baglayici protein, bir anti-CD20 antikor olmaktadir. Gene burada, burada tarif edilen bir genetik modifikasyonu içeren bir hücre saglanmaktadir. Bir duruma göre hücre, asagida sayilanlarin arasindan seçilmektedir: bir embriyonik kök (ES, embryonic stem) hücresi, bir pluripotent hücre, bir uyarilmis pluripotent hücre ve bir totipotent hücre. Spesifik bir duruma göre hücre, bir ES hücresi olmaktadir. Daha spesifik bir duruma göre hücre, bir fare ES hücresi olmaktadir. Bir yönüne göre, burada tarif edilen bir genetik modifikasyonu içeren bir fare embriyonu saglanmaktadir. Bir yönüne göre, bir terapötigin etkinligini belirlemeye yönelik bir yöntem saglanmakta ve sözü edilen terapötik ise, bir insan FC kismini içeren bir antikor (örnek olarak m0n0-, bi-, tri-, multispesifik) olmaktadir. Bir yapilanmaya göre terapötik, bir insan antikoru olmaktadir. Söz konusu etkinlik, terapötik aracili hücre katlinin (örnek olarak ADCC) etkinligi olmaktadir. Spesifik bir yapilanmaya göre insan terapötigi, bir insan immünoglobulin agir zincirinin bir Fc kismini içeren bir füzyon proteini olmaktadir. Söz konusu terapötik, burada tarif edilen bir fareye uygulanmakta ve terapötige bagimli ADCC durumunun bir düzeyi ölçülmektedir. Bir yapilanmaya göre fare, bir terapötigin ADCC aktivitesini degerlendirmek üzere kullanilmakta ve bu amaçla terapötik, fareye uygulanmakta ve daha sonra terapötigin, FcyR reseptörünü ifade eden bir hücre üzerinde, bir insan düsük afiniteli FcvR reseptörüne baglanmasi saptanmaktadir (örnegin hayvandan alinan bir örnekte (mesela kan) in vitro olarak yapilmaktadir). Spesifik bir yapilanmaya göre farenin aksesuar hücreleri, fareden izole edilmekte ve terapötige bagimli ADCC durumuna aracilik etme becerileri bakimindan, terapötigin varliginda ve yoklugunda test edilmektedir. Dolayisiyla mevcut bulus, antikora bagimli hücre katlini ölçmeye yönelik olarak, asagida belirtilenleri ihtiva eden bir yöntemi de saglamaktadir: (a) 7. Istemde tanimlanan genetigi degistirilmis fareye, farede NK hücresi olmayan bir hedef hücreye spesifik olarak baglanan bir terapötik antikorun uygulanmasi, burada sözü edilen terapötik antikor, bir insan Fc kismi içermektedir; (b) farede ya da fareden alinan bir doku örneginde, NK aracili hedef hücre katli düzeyinin ölçülmesi; ve (c) terapötik antikorun aracilik ettigi hedef hücre katli miktarinin belirlenmesi ve böylece antikora bagimli hücre katlinin ölçülmesi. Gene burada, bir düsük afiniteli FcvR reseptörünün, bir insan hastaligi ya da bozuklugu ile baglantili olup olmadigini belirlemeye yönelik olarak, mevcut bulusa uygun bir farede insan hastaligi ya da bozuklugu ile baglantili bir karakterin belirlenmesi adimini içeren bir yöntem açiklanmaktadir. Bir duruma göre bu karakter, bir ya da daha fazla düsük afiniteli FcyR reseptörüne ait fonksiyonun yoklugu veya kaybiyla iliskili bir fenotip olmaktadir. Spesifik bir duruma göre hastalik ya da bozukluk, bir otoimmün hastalik veya bozukluk olmaktadir. Spesifik bir duruma göre otoimmün hastalik ya da bozukluk, asagida sayilanlarin arasindan seçilmektedir: romatoit artrit (RA), sistemik Iupus eritematozus (SLE), tip I diyabet, Guillain- Barre sendromu, skleroz, multipl skleroz, Goodpasture sendromu, Wegener granülomatozu ve deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE). Spesifik bir duruma göre fare, bir düsük afiniteli FcyR reseptöründe bir polimorfizm içermekte ve sözü edilen karakter ise, söz konusu polimorfizmi tasimayan insan popülasyonunun çogunlugu ile karsilastirmali olarak, ADCC durumuna aracilik etmede artmis beceri ve söz konusu polimorfizmi tasimayan insan popülasyonunun çogunlugu ile karsilastirmali olarak, ADCC durumuna aracilik etmede azalmis beceri arasindan seçilmektedir. Gene burada, bir farede bir anti-human FcR oi-zinciri antikorunun yapimina yönelik olarak, mevcut bulusa uygun bir farenin burada tarif edildigi üzere bir insan FcR reseptörüne maruz birakilmasini içeren bir yöntem açiklanmaktadir. Bir duruma göre, insan FcR reseptörünü taniyan bir antikor, fareden izole edilmektedir. Bir baska duruma göre, insan FCR reseptörünü taniyan bir antikorun bir degisken bölgesinin tamamini ya da bir kismini kodlayan bir nükleik asit dizisi saptanmakta ve klonlanmaktadir. Gene burada, anti-human FCR antikorlarinin, hedef molekülün fagositozu amaciyla, molekülleri, FcR reseptörünü ifade eden hücrelere hedefleme becerilerini belirlemeye yönelik olarak, burada tarif edilen bir farenin, bir anti-human FcR antikoru içeren bir ajana maruz birakilmasini ve hedef molekülün fagositozunun ölçülmesini ihtiva eden bir yöntem açiklanmaktadir. Gene burada, bir ya da daha fazla FcvR reseptörleri bakimindan yabanil tip olan bir farede zayif derecede immünojenik olan bir antijene karsi bir farede bir antikor yapimina yönelik olarak, burada tarif edilen ve bir fare düsük afiniteli FcR reseptöründen yoksun olan, ancak bir FcyR y-zincirini ifade eden bir farenin, bir ya da daha fazla FcvR reseptörleri bakimindan yabanil tip olan farede zayif derecede immünojenik olan antijene maruz birakilmasini ve zayif derecede antijenik olan antijeni taniyan bir antikorun belirlenmesini ihtiva eden bir yöntem de açiklanmaktadir. Bir duruma göre bu yöntem, antikorun fareden izole edilmesini ihtiva etmektedir. Bir baska duruma göre, antikorun bir degisken bölgesinin tamamini ya da bir kismini kodlayan bir nükleik asit dizisi belirlenmekte ve klonlanmaktadir. Gene burada, insan degisken bölgeleri içeren antikorlari yapma becerisine sahip bir farenin yapimina yönelik olarak, burada tarif edilen bir birinci farenin, (a) bir ya da daha fazla insan immünoglobulin degisken bölge gen kisimlari ve bir ya da daha fazla insan sabit bölge genleri; veya (b) bir fare sabit bölge genine fonksiyonel sekilde bagli bir ya da daha fazla insan immünoglobulin degisken bölge gen kisimlari içeren bir ikinci fare ile çiftlestirilmesini ihtiva eden bir yöntem açiklanmakta olup, sözü edilen insan gen kisimlari, fare degisken bölge gen kismi Iokusunda, degisken bölge gen kisimlarini ikame etmektedir. Bir duruma göre ikinci fare, (a) bir ya da daha fazla insan immünoglobulin hafif zincir degisken bölgesi gen kisimlari ve bir insan hafif zincir sabit geni içeren bir transgeni ve bir ya da daha fazla insan immünoglobulin agir zincir degisken bölge gen kisimlari ve bir ya da daha fazla insan agir zincir sabit genleri içeren bir transgeni ihtiva etmektedir. Bir duruma göre bir ya da daha fazla insan immünoglobulin agir zincir degisken bölge gen kisimlari içeren transgen, iki ya da daha fazla agir zincir sabit genleri içermekte ve sinif geçisi yapabilmektedir. Spesifik bir duruma göre fare, bir etkisizlestirilmis endojen hafif zincir lokusu ve / veya bir etkisizlestirilmis endojen agir zincir Iokusu içermektedir. Spesifik bir duruma göre farede, bir endojen hafif zincir Bir duruma göre ikinci fare, (b) agir ve hafif fare lokuslarinda bu siraya göre insan agir ve insan hafif degisken bölge gen kisimlari içermektedir. Bir yönüne göre, bir anti-tümör antikorunu seçmeye yönelik olarak, bir antikorun antikora bagimli hücre aracili sitotoksisiteye (ADCC) aracilik etme becerisinin belirlenmesi adimini ihtiva eden bir yöntem saglanmakta olup, bu çerçevede, antikorun antikora bagimli hücre aracili sitotoksisiteye aracilik etme becerisi, burada tarif edilen bir farenin bir hücresi tarafindan aracilik gören antikora bagimli hücre aracili sitotoksisitenin belirlenmesi yoluyla test edilmekte ve antikorun, burada tarif edilen genetigi degistirilmis bir farenin bir hücresi kullanilarak, antikora bagimli hücre aracili sitotoksisiteye aracilik etmesi halinde seçilmektedir. Spesifik bir yapilanmaya göre antikorun, genetigi degistirilmis farenin hücresine baglanmasi belirlenmekte ve anti-tümör antikoru, hücre üzerinde bir insan FcyR reseptörüne baglanma becerisi bakimindan seçilmektedir. Spesifik bir yapilanmaya göre insan FcyR, bir düsük afiniteli FcyR olmaktadir. Bir yapilanmaya göre anti-tümör antikoru, anti-tümör antikorunun, yabanil tipteki birfarenin bir hücresi üzerinden ADCC durumuna aracilik etme becerisi ile karsilastirildiginda, farenin bir hücresi üzerinden ADCC durumuna aracilik becerisindeki bir artis ile belirlenir. Spesifik bir yapilanmaya göre anti-tümör antikoru, NK hücreleri üzerinden ADCC durumuna aracilik etme becerisi ile belirlenir. Spesifik bir yapilanmaya göre NK hücreleri, insan FcleIIA reseptbrünü ifade etmektedir. Gene burada, bir anti-tümör ajanin seçilmesine yönelik olarak, bir insan Fc kismi ya da bir degistirilmis insan Fc kismi içeren bir ajanin, insan harici bir hayvana uygulanmasi adimini, ki burada birinci insan harici hayvanin genetigi mevcut bulusa göre degistirilmis bulunmakta ve bir insan tümörü içermektedir; ajanin, tümörü içeren bir ikinci insan harici hayvana uygulanmasi; ve birinci insan harici hayvanin ve ikinci insan harici hayvanin, ajanin uygulanmasi üzerine insan tümörünün büyümesini geciktirme becerisinin belirlenmesi adimini ihtiva eden bir yöntem saglanmakta olup bu çerçevede, sözü edilen ajan, insan tümörünün büyümesini ikinci insan harici hayvanda degil de birinci insan harici hayvanda geciktirmek bakimindan artmis beceri sergilemesi halinde bir anti-tümör ajani olarak seçilmektedir. Bir duruma göre birinci insan harici hayvan, bir endojen FcR d-alt biriminin silinecegi sekilde degistirilmekte ve bir FcyRIIA d-alt birimi, bir FcyRIIB ci-alt birimi, bir FcyRIIC d-alt birimi, bir FcyRIIIA d-alt birimi, bir FcyRIIIB oi-alt birimi ve bunlarin bir kombinasyonundan olusan gruptan seçilen bir insan FcR 0i-alt birimini içerecegi sekilde degistirilmektedir. Bir duruma göre ikinci hayvan, bir yabanil tip hayvan olmaktadir. Bir duruma göre birinci insan harici hayvan, bir endojen FcR y-zincirini ifade etmektedir. Bir duruma göre birinci insan harici hayvan, bir fonksiyonel endojen FcyRI reseptörünü ifade etmektedir. Gene burada, bir düsük afiniteli fare FcyR reseptöründen yoksun olan, bir fonksiyonel FcR y- zincirini ifade eden ve insan FcyRIIA, FcyRIIB, FcyRIIC, FcleIlA ve FcyRIIlB d-zincirlerini kodlayan genleri içeren bir farenin yapimina yönelik olarak, düsük afiniteli fare FcyR o- zincirlerinin, fare FcyR ci-zinciri Iokusunda, insan FcyR d-zincirleri ile ikame edilmesi adimini içeren bir yöntem açiklanmaktadir. Bir duruma göre bir birinci adim, endojen FcyRIIB, FcyRIV ve FcyRIlI genlerine ait 0:- zincirlerinin Silinmesini ve Insan FcyRIIA ve FcyRIIIA genlerine ait oi-zincirlerinin sokulmasini içermekte; bir ikinci adim, insan FcvRllB, FcyRIlC ve FcyRIIIB genlerine ait d-zincirlerinin, birinci adimdan sonuçlanan fare genomu içerisine sokulmasini içermektedir; burada sözü edilen fare, bir fonksiyonel fare FcR y-zinciri ihtiva etmektedir. Spesifik bir duruma göre ikinci adim kapsamindaki insan FcyRIIB, FcyRIIC ve FcleIIB genlerine ait oi-zincirleri, birinci adim kapsamindaki insan FcyRIIA ve FcvRIIIA genlerinin d-zincirlerine göreli olarak 5' pozisyonuna sokulmaktadir. Gene burada, primat harici bir hayvanda bir insan terapötigi tarafindan hücre katlini belirlemeye yönelik olarak, bir hücrenin, insan harici bir embriyonun, ya da insan harici bir hayvanin, bir insan Fc reseptörü içeren bir insan terapötigine maruz birakilmasi adimini, ki burada sözü edilen hücre, embriyon, ya da hayvan, bir fonksiyonel FcR y-zinciri içermekte ve bir ya da daha fazla endojen düsük afiniteli FcyR d-zincirlerinin, bir ya da daha fazla insan FcvR a-zincirleri ile bir ikamesini içermektedir; ve insan terapötiginin, hücre, embriyon, ya da hayvanin düsük afiniteli insan FcyR reseptörü üzerinden hücre katline aracilik etme becerisinin belirlenmesini içeren bir yöntem açiklanmaktadir. Bir duruma göre primat harici hayvan, bir fare olmaktadir. Spesifik bir yapilanmaya göre endojen fare FcyR a-zinciri genleri FcyRIIB, FcleV ve FclelI; insan FcyR a-zinciri genleri FcyRIIA, FcyRIIB, FcvRIIC, FcvRIIIA ve FcvRIIIB ile ikame edilmektedir. Bir duruma göre hücre; bir B hücresi, bir mast hücre, bir bazofil, bir makrofaj, bir eozinofil, bir nötrofil, bir dendritik hücre, bir Langerhans hücresi ve bunlarin bir kombinasyonu arasindan seçilmektedir. Spesifik bir duruma göre hücre, bir NK hücresi olmakta ve insan kökenli ya da hümanize bir antikor tarafindan NK hücresi aracili ADCC durumu belirlenmektedir. Spesifik bir duruma göre düsük afiniteli insan FcyR, bir insan FcyRIIIA olmaktadir. Gene burada, terapötige bagimli trombozu belirlemeye yönelik olarak, bir trombosit üzerinde bir insan FcvRIIA reseptörünü ifade eden bir birinci insan harici hayvanin bir terapötige maruz birakilmasini; insan FcyRIIA reseptörünü bir trombosit üzerinde ifade etmeyen bir ikinci insan harici hayvanin sözü edilen terapötige maruz birakilmasini; birinci insan harici hayvanda ve ikinci insan harici hayvanda, terapötige bagimli tromboz miktarinin ölçülmesini; ve terapötige bagimli trombozdaki bir farkin belirlenmesini ihtiva eden bir yöntem açiklanmaktadir. Bir duruma göre insan harici hayvan bir fare ve bir siçan arasindan seçilmektedir. Bir duruma göre terapötige bagimli trombozda belirlenen fark, terapötigin bir insana verilmesi ile baglantili bir riski belirlemek için kullanilmaktadir. Bir duruma göre belirlenen fark, terapötigin, ihtiyaç halindeki bir insan hastaya verilmesinde bir degisiklikle sonuçlanmaktadir. BULUSUN DETAYLI AÇIKLAMASI Bu bulus, tarif edilen özel metotlar ve deney sartlari ile sinirli degildir, zira bu tip metotlar ve sartlar degiskenlik gösterebilir. Ayrica burada faydalanilan terminoloji, sadece özel yapilanmalari tarif etmek amaciyla kullanilmakta ve sinirlayici olmasi amaçlanmamaktadir, çünkü mevcut bulusun kapsami, sadece ekli istemler ile sinirli tutulacaktir. Burada kullanilan tüm bilimsel ve teknik terimler, aksi belirtilmedikçe, mevcut bulusun ait oldugu teknik alanin uzmanlarinca yaygin olarak bilinen anlamlara sahiptir. Burada tarif edilenlere benzer ya da esdeger metotlar ve materyaller, mevcut bulusun tatbikinde veya testinde kullanilabilecek olmasina ragmen, özel metotlar ve materyaller simdi tarif edilecektir. Bir hedefleyici bölge, bir hedef hücre, doku ya da hayvandaki bir dizi ile büyük ölçüde homolog olan bir diziyi ihtiva eder ve hedefleyici yapinin, hücre, doku veya hayvanin genomu içerisindeki bir pozisyona entegre edilmesini saglar. Spesifik bir yapilanmaya göre hedefleyici konstrakt ayrica ilgi dahilindeki bir nükleik asit dizisi ya da geni, seçilebilir bir belirteci, kontrol ve veya regülatör dizileri ve bu tip dizilerin kullanildigi rekombinasyona destek olan ya da kolaylastiran proteinlerin eksojen olarak eklenmesi yoluyla aracilik bulan rekombinasyona imkan veren baska nükleik asit dizilerini ihtiva etmektedir. Bir baska spesifik yapilanmaya göre hedefleyici konstrakt ayrica ilgi dahilindeki bir geni içermekte ve ilgi dahilindeki gen ise, endojen dizi tarafindan kodlanan bir protein ile benzer bir fonksiyona sahip bir proteini kodlayan bir heterolog gen olmaktadir. bir genom içerisindeki bir diziyi, genomik dizinin Iokusunda, bir heterolog dizi ile (örnek olarak bir farede bir insan dizisi ile) ikame edecegi sekilde yerlestirilmesini ihtiva eder. Bu sekilde yerlestirilen DNA dizisi, bu dizinin elde edilmesi için kullanilan kaynak DNA'nin parçasi olan bir ya da daha fazla regülatör dizi ihtiva edebilir (örnek olarak promotörler, hizlandiricilar, 5'- ya da 3'-çevrilmemis bölgeler vs). Ornek olmasi bakimindan çesitli yapilanmalara göre ikame, bu sekilde yerlestirilen DNA dizisinden (heterolog diziyi ihtiva eder) bir gen ürününün üretimiyle sonuçlanacagi, ancak endojen dizinin ekspresyonu ile sonuçlanmayacagi sekilde bir endojen dizinin, bir heterolog dizi ile bir substitusyonu olmaktadir; bir endojen genomik dizinin, endojen genomik dizi tarafindan kodlanan bir protein ile benzer bir fonksiyona sahip bir proteini kodlayan bir DNA dizisi tarafindan ikamesi olmaktadir (örnek olarak endojen genomik dizi, bir düsük afiniteli fare FcvR reseptörünü kodlamakta ve DNA fragmani ise, örnegin bir insan FclelC ve / veya bir FclelIB reseptörü gibi bir ya da daha fazla insan düsük afiniteli FcyR bir reseptörü ihtiva etmektedir. FcyR genleri, hücrenin yüzeyi üzerinde ifade edilen ve bir Iigant baglayici domen seklinde islev gösteren ve ya FcR y-zincirinin bir homodimeri ile, ya da FcR v-zinciri ve ö-zincirinin bir heterodimeri ile birlesen bir oi-zincirini ihtiva etmektedir. Birkaç farkli FcvR genleri vardir ve bunlar, immün komplekslerde lgG'ye öncelikli olarak baglanmalarina göre düsük afiniteli ve yüksek afiniteli olarak kategorize edilebilirler. Insanlardaki düsük afiniteli FcvR genleri; FcvRIIA, FcyRIIB, FcvRIIC, FcyRIIIA ve FcvRIIIB genlerini ihtiva eder ve otoimmün hastaliklari olan insan bireylerde, bu genlerin çogu içerisinde dogal olarak bulunan genetik farkliliklar, ya da polimorfizmler tarif edilmistir. Burada açiklananlari okumasi üzerine uzman kisiler, bir genomda bulunan bir ya da daha fazla (veya tüm) endojen düsük afiniteli FcvR genlerinin, bir ya da daha fazla heterolog düsük afiniteli FcyR genleri (örnek olarak varyantlar veya polimorfizmler, mesela aIIeIik formlar, baska türlerin genleri, kimerik formlar vs.) ile ikame edilebildigini fark edecektir. formlarinin bir dizisiyle sonuçlanan varyasyonlari ihtiva eder. Farkli formlar, bir genin bir proteinine ait dizide, 'örnegin 20 kadar amino asit farkliliklari ihtiva edebilir. Ornek olmasi bakimindan alleller, ayni fiziksel gen lokusunda, mesela ayni gen için baska alIeIIer ile sonuçlanmayan ya da degisken derecelerde baska aIIeIIer ile sonuçlanan belirli hastaliklara veya durumlara yatkinlik gibi farkli karakterler (örnek olarak kalitlanabilir fenotipik karakteristikler) ile sonuçlanabilen ya da sonuçlanamayan alternatif DNA dizileri olarak anlasilabilir. Bir "aksesuar hücre", immün yanitin efektör fonksiyonlarina katilan bir immün hücresini ihtiva eder. Ornek olarak verilebilecek immün hücreleri; Ienfoit ya da miyeloit kökenli bir hücre, 'Örnek olarak Ienfositler, dogal katil (NK) hücreler, monositler, makrofajlar, nötrofiller, eozinofiller, bazofiller, trombositler, Langerhans hücreleri, dendritik hücreler, mast hücrelerini ihtiva eder. Aksesuar hücreleri, kendi yüzeyleri üzerinde ifade edilen, örnek olarak FcR reseptörieri gibi reseptörler üzerinden immün sistemin spesifik fonksiyonlarini gerçeklestirir. Spesifik bir yapilanmaya göre bir aksesuar hücre, hücre yüzeyi üzerinde ifade edilen, 'Örnegin düsük afiniteli bir FcyR gibi bir FcR üzerinden aracilik bulan ADCC durumunu tetikleyebilir. Ornek olmasi bakimindan, FcR reseptörlerini ifade eden makrofajlar, antikor kapli bakterilerin imhasina ve fagositoz sürecine karisir. Aksesuar hücreler, baska immün süreçlerine aracilik eden bir ajani serbest birakma becerisine de sahip olabilir. Örnegin mast hücreleri, mesela enflamatuar molekülleri (mesela sitokinler) gibi granülleri enfeksiyon yerinde salmak üzere FcR reseptörlerine bagli bir antikor ile aktiflesebilir. Çesitli baska yapilanmalara göre FcR reseptörlerinin aksesuar hücreleri üzerinde ekspresyonu, baska faktörler (örnek olarak sitokinler) tarafindan regüle edilebilir. Ornek olmasi bakimindan FcvRI ve FcvRIII ekspresyonu, interferon-y (IFN-v) ile stimülasyon yoluyla indüklenebilir. Immünoglobulinlerin Fc (yani sabit) bölgelerine yönelik reseptörler (FcR'ler), immün yanitin regülasyonunda Önemli bir rol oynarlar. FcR reseptörleri, bir antikor tarafindan baglanan yabanci antijenlerin etkin sekilde bertaraf edilmesi için, konakçinin immün sistemine ait aksesuar hücreleri üzerinde bulunur. FcR reseptörleri, immün sistemine ait aksesuar hücrelerin hem aktiflestirici hem de inhibe edici yanitlarinin dengelenmesinde de önemli roller oynar. FcR reseptörleri; makrofajlar tarafindan gerçeklestirilen fagositoza, mast hücrelerinin degranülasyonuna, antikor-antijen komplekslerinin alimina ve immün yanitin modülasyonuna ve ayrica baska immün sistemi süreçlerine karisirlar. Farelerde ve insanlarda farkli Fc reseptörleri, her biri, ifade edilen antikor repertuvarinda mevcut olan immünoglobulin izotipleri için spesifik olan farkli aksesuar hücrelerin yüzeyi üzerinde farkli sekilde ifade edilir. Ornek olmasi bakimindan immünoglobulin G (IgG) antikorlari, efektör fonksiyonlarina IgG reseptörleri (FcyR reseptörleri) üzerinden aracilik eder. FcyR reseptörleri, üç grup halinde siniflandirilmistir: yüksek afiniteli aktiflestirici Fcle (CD64), düsük afiniteli inhibitör FcyRII (CD32) ve düsük afiniteli aktiflestirici FcvRIII (CD16). Her bir grup, hem farelerde hem de insanlarda bulunmakla birlikte, üzerinde bulunduklari immün hücrelerin alt kümelerinin ve izoformlarinin sayisi farkli olmaktadir. Ornek olmasi bakimindan FcyRIIA ve FcvRIIIB, insanlardaki aksesuar hücreleri üzerinde ifade edilir, ancak bildirildigi haliyle farelerdeki aksesuar hücreleri üzerinde ifade edilmez. Ayrica, farkli IgG izotiplerinin (örnek olarak lgG1 ) her bir FcyR reseptörüne afinitesi, farelerde ve insanlarda farkli olmaktadir. FcyR reseptörleri üzerinden hücre sinyali iletiminin ve FcyR reseptbrlerine antikor baglanmasi ile iliskili efektör fonksiyonlari aktivasyonunun ve inhibisyonunun, FcyR reseptörlerine, ya da ko-reseptörlerin alt birimlerine ait intraselüler domenlerin spesifik dizi motifleri ile aracilik bulduguna inanilmaktadir. Aktiflestirici reseptbrler, en yaygin olarak, bir immünoresept'or tirozin-tabanli aktivasyon motifi (ITAM, immunoreceptor tyrosine-based activation motif) içeren ortak v-zinciri (FcR v-zinciri) ile iliskilidir. ITAM motifleri, bir FcR reseptörüne antikor baglanmasina yanit olarak fosforile olan tirozin rezidüleri ihtiva eden, yaklasik 9-12 amino asitlik spesifik bir dizi içerir. Fosforilasyon, bir sinyal iletim kaskadina yol açar. Bir FcR v- zincirini (FcR y-zinciri KO) kodlayan bir genden yoksun olan fareler bildirilmistir (bkz. örnegin Takai ve ark. (1994) FcR y Chain Depletion Results in Pleiotrophic Effector Cell Defects, Cell Resistance of Fc Receptor-deficient Mice to Fatal Glomerulonephritis, J. Clin. Invest. 102(6) : 1229-1238). Bildirildigine göre FcR y-zinciri, FcR reseptörlerinin çogunun uygun yüzey ekspresyonu ve fonksiyonu (örnek olarak sinyal iletimi, fagositoz ve benzerleri) için zaruridir; bazi raporlara göre FcR v-zinciri KO fareleri, FcyRI reseptöründen yoksun olmaktadir. Ancak baska raporlar, FcR y-zinciri KO farelerinin, gerçekten de FcvRl reseptörünü belirli aksesuar hücrelerin yüzeyi üzerinde ifade ettigini ve bildirildigine göre, ifade edilen FcyRI reseptörünün, farelerde, ifade edilen FcR y-zincirinin yoklugunda IgG antikorunu baglamak bakimindan fonksiyonel göründügünü ortaya çikarmistir (Barnes ve ark. (2002) FcyRI-Deficient Mice Show Multiple Alterations to Inflammatory and Immune Responses, Immunity 16 : 379-389). Buna karsi FcyRIIB, kendi sitoplazmik domeninde bir immünoreseptör tirozin tabanli inhibitör motif (ITIM, immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif) içeren bir inhibitör reseptördür. Ancak, bir ITM motifinin fosforilasyonunu takiben meydana gelen olaylar, immün hücre fonksiyonlarinin aktivasyonuna degil de inhibisyonuna yol açmaktadir. Bildirildigine göre, FcvRIIB reseptörü bakimindan yoksun olan fareler, yabanil tipteki fareler ile karsilastirildiginda artmis bir antikor yaniti sergilemektedir (Takai ve ark. (1996) Augmented humoral and anaphylactic responses in FchII-deficient mice, Nature 379 : 346-349), ki bu gözlem, FcyRIIB reseptörünün, B hücresi antikor yanitinin bir azaltici regülatör (downregulator) olarak rolünü desteklemektedir. Insanlarda FcleIA, FcyRIIB, FcyRIlC, FcyRIIIA ve FcyRIIIB reseptörleri, klasik düsük afiniteli FcyR genleri olarak görülür ve birlikte ayni kromozom üzerinde bulunur (Su ve ark. (2002) Genomic organization of Classical human Iow-affinity Fcy receptor genes, Genes and Immunity 3 (Supple 1) : 851-856). Bu genler, örnek olarak reseptörün fonksiyonunda ve ligant baglamasinda degisimler gibi farkli fenotipler ile iliskili birkaç polimorfizm sergiler. Bazi polimorfizmler, otoimmün hastaliklar, örnegin sistemik Iupus eritematozus (SLE), romatoit artrit (RA) ve multipl skleroz (MS) ile iliskilidir. Farkli insan FcyR reseptörleri (hFcvR reseptörleri) için fareler gelistirilmis ve hastalik modelleri olarak, yüksek afiniteli antikorlarin üretilmesinde, terapötik antikorlarin spesifik hücresel yanitlari uyarma becerilerinin test edilmesinde, aberran immün yanitlari iyilestiren bilesiklerin taranmasinda vs. kullanilmistir (bkz. örnegin Heijnen ve ark. (1996) A Human FchI/CD64 Transgenic Model for In Vivo Analysis of (Bispecific) Targeting to Myeloid-specific Human FchI/CD64 Triggers Enhanced Antibody Responses in Fc reseptörlerinin, immün sistemin aksesuar hücreleri ve antikorlar arasindaki köprüyü saglamadaki önemli rollerine ragmen, düsük afiniteli tüm hFcyR reseptörlerinin ifade edildigi bir model sistemi halihazirda bulunmamaktadir. Endojen fare FcvR reseptörlerinden yoksun olan fareler de dahil olmak üzere, sahip oldugu tüm düsük afiniteli hFcyR reseptörlerinin birlikte ifade edildigi fareler, çesit yapilanmalara göre, ADCC araciliginda gerçeklesen etkiler de dahil olmak üzere bir insan antikor terapötiginin etkilerini dogru olarak yansitmakta kullanilabilecektir. Böylesi bir fare, özellikle insan antikor terapötiklerinin test edilmesi baglaminda olmak üzere, insanlardaki immünolojik süreçlerin daha dogru olarak degerlendirilmesini saglayabilen bir hayvan modeli saglayarak, mesela RA, tip I diyabet, SLE ve otoimmün hastaliklar gibi insan hastaliklarinin tedavisine yönelik terapötik antikorlarin dizayn edilmesinde, analizinde ve degerlendirilmesinde bir yasamsal gereç olarak islev gösterebilecektir. Böylesi bir fare, düsük afiniteli reseptörleri tasiyan hücrelerin degerli bir kaynagi da olacaktir, ki bu hücreler, düsük afiniteli reseptörleri baglayan terapötikler için terapötige bagimli hücre katlinin degerlendirilmesine ve dolayisiyla faydali insan terapötiklerinin belirlenmesine yönelik in vitro testlerde kullanilabilir. Endojen Düsük Afiniteli FcyR Geninden Yoksun Fareler Endojen düsük afiniteli fare FcyR genlerini ifade etmeyen, ancak bir endojen fare FcR v- zincirini ifade eden, genetigi degistirilmis insan harici hayvanlar saglanmaktadir. Çesitli yapilanmalara göre FcR y-zinciri, bir dagilim halinde (yani hücre tiplerinde) ve farede, bir yabanil tipteki fare ile ayni ya da neredeyse ayni olan bir seviyede ifade edilmektedir. Endojen düsük afiniteli FcyR genleri, ya hayvanlarin immün hücrelerinin yüzeyi üzerinde, ya da periferinde çözünür sekilde ifade edilebilir. Endojen düsük afiniteli fare FcyR genlerini ifade etmeyen insan harici bir hayvanin yapimina yönelik genetik modifikasyonlar, farenin bir örnek olarak kullanilmasiyla uygun sekilde tarif edilir. Mevcut bulusa göre genetigi degistirilmis bir fare, özel yapilanmalari burada ele alinan çesitli yollarda yapilabilir. Düsük afiniteli fare FcyR gen Iokusunun bir sematik gösterimi (dogru ölçekte verilmemistir), endojen Iokustaki FcyR gen düzenlemesini göstermek üzere Sekil 1 içerisinde (üstte) verilir. Sekilde gösterildigi gibi düsük afiniteli fare FcyR genleri FcyRIIB, FcvRIV ve FcyRIII, bir kromozom üzerinde birlikte yakin bir proksimitede bulunurlar. Bu genlerin her biri, bir antikor molekülüne ait Fc kismini baglamaktan sorumlu a-zincirini ya da Iigant baglayici domeni ihtiva Endojen düsük afiniteli FcyR genlerinin oi-zincirini kodlayan bir nükleotit dizisinden yoksun olan genetigi degistirilmis birfare, ilgili teknikte bilinen her yöntem ile yapilabilir. Ornek olarak, düsük afiniteli fare FcyR d-zinciri genlerini bir seçilebilir belirteç geni ile silebilen bir hedefleyici vektör yapmak mümkündür. Sekil 1, endojen düsük afiniteli FcyR d-zinciri Iokusunun akis yukarisindaki diziyi içeren bir 5' homoloji koluna, akabinde bir ilaç seleksiyon kasetine (örnegin, onP dizileri ile kusatilmis bir neomisin direnç geni) ve endojen düsük afiniteli FcyR ci-zinciri ile hedeflenen bir fare genomunu gösterir (alt kisimda). Lokusta homolog rekombinasyon gerçeklesmesi üzerine, endojen düsük afiniteli FcyR oi-zinciri Iokusu, bir ilaç seleksiyon kaseti kaseti ile ikame edilir (Sekil 1'in alt kismi). Böylelikle, endojen düsük afiniteli FcyR ci-zinciri gen ya da insan harici hayvan meydana gelir. Ilaç seleksiyon kaseti, sonradan bir rekombinaz eklenerek (örnek olarak Cre muamelesi yoluyla) istege göre uzaklastirilabilir. Çesitli yapilanmalara göre bir farenin genetiginin, bir endojen düsük afiniteli fare FcyR a-zinciri geninin ya da genlerinin islevsiz kilinmasi amaciyla degistirilmesi, immün yanitlarda kusurlar sergileyen bir fare ile sonuçlanir ve böylece fare, endojen düsük afiniteli fare FcyR genlerinin, normal ve bozulmus immün fonksiyonunda, lgG araciliginda gerçeklesen süreçlerde ve otoimmün hastaliklarda oynadiklari rollerin hem birlikte hem de ayri ayri olarak degerlendirilmesi için faydali hale getirilir. Çesitli yapilanmalara göre, endojen düsük afiniteli farenin FcR y-zincirinin degil de FcyR genlerine ait d-zincirlerinin modifiye edilmesi, yüzey ekspresyonu ve fonksiyonu için FcR y-zincirini gerektiren diger endojen FcR genlerinde (örnegin yüksek afiniteli Fcle) bir potansiyel azalmanin `önüne geçerek, y-zincirine bagimli süreçlerle aracilik bulan çesitli baska immünolojik fonksiyonlar ve süreçler muhafaza edilir. Bazi raporlara göre FcR y-zincirinden yoksun farelerde, FcyRIII ve FcyRI yüzey ekspresyonu söz konusu olmaz. Ancak bildirildigine göre Fcle, FcR y-zincirinden yoksun farelerde hücre yüzeyi üzerinde saptanmistir ve gene bildirildigine göre en azindan kismi olarak fonksiyoneldir. Bunun aksine bulus konusu fareler, FcR y-zinciri gerektiren diger FcR genlerinin hücresel fonksiyonlarini ve dogal hücre yüzeyi ekspresyon motiflerini koruyan, modifiye olmamis FcR y-zincirini içerir. Çesitli yapilanmalara göre bulus konusu fareler, tasidiklari genetik modifikasyonlarin, tamamen düsük afiniteli FcyR genlerine adanmamis olan baska immünolojik fonksiyonlar için gerekli baska genlerin korunmasini saglamalari bakimindan, FcyR geninden yoksun baska farelere göre avantajlidir. Örnegin bir fonksiyonel FcR y-zinciri sayesinde, baska y-zincirine bagimli proteinler (Örnegin FcyRI) FcR y-zinciri ile birlesebilecek ve immün yanitta efektor hücre fonksiyonlarina katilabilecektir. Mevcut bulusun genetigi degistirilmis çesitli farelerinde, endojen düsük afiniteli FcyR genleri (bir ya da daha fazla a-alt birimi) silinirken böylesi fonksiyonlarin muhafaza edilmesinin (bir fonksiyonel FcR y-zincirinin varligi sayesinde), FcR reseptörlerinin otoimmünitedeki rollerinin daha dogru olarak aydinlatilmasini mümkün kildigina inanilmaktadir Düsük Afiniteli FcyR Hümanize Fareler Düsük afiniteli insan FcyR genlerini ifade eden, genetigi degistirilmis insan harici hayvanlar saglanmaktadir. Düsük afiniteli insan FcyR genleri, ya hayvanin immün sistemine ait aksesuar hücrelerin yüzeyi üzerinde, ya da hayvanlarin periferinde çözünür sekilde ifade edilebilir. Çesitli yapilanmalara göre genetik modifikasyon, düsük afiniteli fare FcyR genlerine ait bir fonksiyonel d-zincirinin silinmesini ihtiva etmekte ve bazi yapilanmalara göre bir baska modifikasyon, iki ya da daha fazla, üç ya da daha fazla, dört ya da daha fazla, ya da bes adet düsük afiniteli insan FcvR o-alt birimi genleri ile bir ikameyi içermekte ve burada insan harici hayvan, bir fonksiyonel fare FCR y-zinciri genini ifade etmektedir. Dolayisiyla, bir genetik modifikasyon içeren bir fare saglanmakta olup sözü edilen genetik modifikasyon, endojen fare düsük afiniteli FcyR geni Iokusunun, FcyRIIB, FcyRIV ve FcvRIII ci-alt birimlerini kodlayan fare genlerini içeren bir genomikfragmanin; insan FcyRIIA, FcyRIIB, FcyRIIC, FcyRIIIA ve FoyRIIIB arasindan seçilen en az iki adet düsük afiniteli insan FcvR genini kodlayan bir insan genomik fragmani ile bir ikamesini içermekte ve sözü edilen fare, bir fonksiyonel FCR v-zincirine sahip olmaktadir. Genetigi degistirilmis fareler, embriyonlar, hücreler ve farelerin, fare embriyonlarinin ve hücrelerin yapimina yönelik hedefleyici konstraktlar da tarif edilmektedir. Spesifik polimorfik formlar ya da allelik varyantlar (örnek olarak tek amino asit farkliliklari) içeren bir insan FcyR genini ifade eden bir farenin yapimina yönelik bilesimler ve yöntemler tarif edilmekte olup bunlar, bir insan promotöründen ve bir insan regülatör dizisinden bu tip genleri ifade eden bir farenin yapimina yönelik bilesimleri ve yöntemi de kapsamaktadir. Söz konusu yöntemler, bir endojen düsük afiniteli fare FcyR geninin selektif olarak islevsiz kilinmasini (örnegin kendi o-zincirinin silinmesi yoluyla) ve bir farede, düsük afiniteli bir insan FcvR ci-alt birim genini ifade etmek üzere, endojen düsük afiniteli fare FcyR geni lokusunda bir düsük afiniteli insan FcvR genine ait bir d-zincirinin kullanilmasini ihtiva etmektedir. Düsük afiniteli fare FcyR geninin silinmesi, bir FcR y-zinciri degil de, bir ya da daha fazla o-zinciri genleri silinerek yapilir. Bu yaklasim, endojen düsük afiniteli FCR y-zinciri genlerini selektif olarak islevsiz hale getirirken, bir fonksiyonel endojen FcR v-zincirini muhafaza eder. Çesitli yapilanmalara göre endojen FcyR oi-zincirinin ikame edilmesi yaklasimi, hayvanda dogal FcvR araciliginda gerçeklesen sinyal iletiminde nispeten minimum bozulmaya yer verir, çünkü FcyR o-zincirlerinin genomik dizisi tek bir fragmanda ikame edilir ve dolayisiyla, gerekli regülatör diziler içerilerek normal fonksiyonellik muhafaza edilir. Dolayisiyla bu tip yapilanmalara göre FcvR d-zinciri modifikasyonu, fonksiyonel FCR v-zinciri moleküllerine bagimli diger endojen FCR reseptörlerini etkilememektedir. Dahasi, çesitli yapilanmalara göre modifikasyon, bir FcvR (Ji-zincirine ve endojen FcR y-zincirine yer veren bir fonksiyonel reseptör kompleksinin birlestirilmesini de etkilemektedir, ki bu durumun, bazi FcyR o- zincirlerinin hücre yüzeyi üzerinde dogru olarak ifade edilmesi ve bir aktiflesmis reseptörden sonuçlanan akis asagi sinyal iletimi için gerekli olduguna inanilmaktadir. Çesitli yapilanmalara göre FCR y-zinciri silinmediginden, endojen FcyR oi-zinciri genlerinin insan FcvR oi-zinciri genleri ile bir ikamesini içeren fareler, IgG immünoglobulinlerin FC kismini, aksesuar hücrelerin yüzeyi üzerinde bulunan insan FcvR oi-zincirlerine baglamak yoluyla, antikorlardan gelen normal efektör fonksiyonlari islemden geçirebilmeleri gerekir. Düsük afiniteli fare FcvR geninin bir sematik gösterimi (dogru ölçekte verilmemistir), Sekil 4 içerisinde (üstte) verilir. Gösterildigi üzere, düsük afiniteli insan FcvR genleri FcvRIIA ve FcvRIIIA, insan düsük afiniteli insan FcyRIIA ve FcyRIIIA genlerini içeren bir genomik fragmana sahip bir hedefleyici konstrakt (insan FcyRIIIA-IIA hedefleyici konstrakt) tarafindan, silinen endojen düsük afiniteli fare FcyR Iokusuna sokulur. Bu genlerin her biri, bir antikor molekülüne ait Fc kismini baglamaktan sorumlu insan FcyR genlerinin ci-zincirini ya da Iigant baglayici domenini ihtiva eder. Endojen düsük afiniteli fare FcyR lokusunda düsük afiniteli insan FcvR genlerini ifade eden, genetigi degistirilmis bir fare, ilgili teknikte bilinen her yöntem ile yapilabilir. Ornegin, düsük afiniteli insan FcyR genlerini (örnek olarak FcyRIIA ve FcvRIIIA) bir seçilebilir belirteç geni ile sokan bir hedefleyici vektör yapmak mümkündür. Sekil 4, endojen düsük afiniteli Fch hedefleyici konstrakt, endojen düsük afiniteli fare FcvR Iokusunun akis yukarisindaki diziyi içeren bir 5' homoloji koluna, akabinde bir ilaç seleksiyon kasetine (örnek olarak, onP dizileri ile her iki taraftan kusatilmis bir higromisin direnç geni), bir insan FcvRIIA geni, insan HSP76 geni ve insan FcyRIIIA geni içeren bir genomik fragmana ve endojen düsük afiniteli fare FcvR homolog rekombinasyon gerçeklesmesi üzerine ilaç seleksiyon kaseti, hedefleyici vektörde bulunan dizi ile ikame edilir (Sekil 4'ün alt kismi). Böylece endojen düsük afiniteli FcyR geni lokusu, düsük afiniteli insan FcvR genleri ile ikame edilerek, düsük afiniteli insan FcyR genlerini ifade eden bir hücre ya da hayvan üretilir. Ilaç seleksiyon kaseti, sonradan bir rekombinaz eklenerek (örnek olarak Cre muamelesi yoluyla) istege göre uzaklastirilabilir. hFcvRIIA geninin trombositler üzerinde ifadelenmesi için hedefleyici konstrakt insan hFcvRIIA -IIA hedefleyici vektörü, örnek olarak bir insan genomunda hFchIIA genine fonksiyonel sekilde bagli insan promotör bölgesinin tamamini ya da neredeyse tamamini içeren bir uzatilmis diziyi ihtiva eder. hFcyRIIA geninin trombositler üzerinde ifadelenmesini önlemek için hedefleyici konstrakt, bir insanda hFcvRIIA genine fonksiyonel sekilde bagli insan promotör bölgesinin tamamindan ya da neredeyse tamamindan yoksun olur. Kimerik Iokustaki baska modifikasyonlar (Sekil 4'ün alt kismi), iki insan FcyR geni ile ikame için tarif edilen tekniklere benzer teknikler kullanilarak basarilabilir. Endojen düsük afiniteli FcvR geni Iokusunun iki insan FcyR geni ile ikame edildigi modifikasyon, baska düsük afiniteli insan FcyR genlerinin dahil edilmesi için bir baslangiç noktasi da saglayabilir. Ornegin, iki düsük afiniteli insan FcyR geni ile ikame edilmis bir endojen düsük afiniteli FcvR Iokusunun bir sematik gösterimi (dogru ölçekte verilmemistir), Sekil 6 içerisinde (üstte) verilir. Gösterildigi üzere, düsük afiniteli insan FcyR genleri FcyRIIB, FcyRIIC ve FcyRIIIB, düsük afiniteli insan FcvRlIB, FcyRIIC ve FcvRIIIB genlerini içeren bir genomik fragmana sahip bir baska hedefleyici konstrakt (insan FcvRIIB-lIlB-IIC hedefleyici konstrakt) tarafindan, modifiye edilmis endojen düsük afiniteli fare FcyR Iokusuna sokulur. Bu genlerin her biri, bir antikor molekülüne ait Fc kismini baglamaktan sorumlu insan FcyR genlerinin d-zincirini ya da Iigant baglayici domenini ihtiva eder. Endojen düsük afiniteli fare FcyR Iokusunda bes adet düsük afiniteli insan FcyR genlerini ifade eden, genetigi degistirilmis bir fare, ilgili teknikte bilinen her yöntem ile yapilabilir. Ornegin, düsük afiniteli insan FcyR genlerini (örnek olarak FcyRIIB, FcyRIlC ve FcyRIIIB) bir seçilebilir belirteç geni ile sokan bir hedefleyici vektör yapmak mümkündür. Sekil 6, endojen düsük afiniteli FcyR lokusunun iki adet düsük afiniteli insan FcyR geni ile bir ikamesini içeren bir fare genomunu gösterir (üst kisimda). Gösterildigi üzere hedefleyici konstrakt, endojen düsük afiniteli fare FcyR lokusunun akis yukarisindaki diziyi içeren bir 5' homoloji koluna, akabinde bir ilaç seleksiyon kasetine (örnek olarak, onP dizileri ile her iki taraftan kusatilmis bir neomisin direnç geni), bir insan FcvRIIB geni, bir insan FcyRIIIB, bir insan HSP77 geni, bir insan FcvRIIC geni içeren bir genomik fragmana, akabinde endojen Iokusta bulunan düsük afiniteli insan FclelIA geninin akis yukarisindaki diziyi içeren bir 3' homoloji koluna sahiptir. Modifiye edilen bulunan dizi tarafindan 5' yönünde bir insan FcvRllB, FcvRlllB ve FclelC geni sokulur (Sekil 6'nin alt kismi). Böylece, degistirilmis endojen düsük afiniteli FcyR geni Iokusu, üç adet daha düsük afiniteli insan FcvR geni içerecegi sekilde ayrica modifiye edilir ve böylece bes adet düsük afiniteli insan FcyR geni ifade eden bir hücre ya da hayvan üretilir. Ilaç seleksiyon kaseti, sonradan bir rekombinaz eklenerek (örnek olarak Cre muamelesi yoluyla) istege göre uzaklastirilabilir. Sekil 6 (alt kisimda), meydana gelen lokusun yapisini gösterir; bu Iokus, hayvanin immün sistemine ait aksesuar hücrelerin yüzeyi üzerinde saptanabilen ve uygun oldukça, bir endojen FcR y-zinciri ile bagimsiz olarak birlesen bes adet düsük afiniteli insan FcvR genini ifade edecektir. FcyR Yoksunu Farelerin ve FcvR Hümanize Farelerin Deneysel Modelleri Endojen düsük afiniteli fare FcyR genlerini ifade etmeyen genetigi degistirilmis fareler, örnegin ayri ayri düsük afiniteli FcyR genlerinin immün yanittaki çesitli fonksiyonlarini aydinlatmak üzere, bir insan terapötik antikorunun hücre araciliginda gerçeklesen immünitedeki (örnek olarak ADCC) etkinligini ölçmek üzere, bir FcvR reseptörünün immün hastaliklar ya da bozukluklarindaki rolünü belirlemek üzere, immün hastaliklarinin veya bozukluklarinin modelleri olarak islev göstermek üzere, bir ya da daha fazla FcyR proteinine karsi antikorlar üretmek üzere ve ilgi dahilindeki baska genetigi degistirilmis fareler üretmede çiftlesme esleri olarak hizmet vermek üzere faydalidir. Bir duruma göre bulus konusu bir fare, yabanil tipteki bir farede FcyR reseptörüne bagimli bir sitotoksik etkiyi tetikledigi bilinen bir ajanin verilmesi yoluyla, (yabanil tipteki fare ile karsilastirildiginda) düsük afiniteli FcyR genlerini ifade etmeyen bir fare tarafindan kaybedilen sitotoksik etkiyi belirlemek için kullanilabilir. Bir duruma göre bulus konusu bir fareye tümör hücreleri implante edilir ve tekip eden bir zaman periyodundan sonra, tümör hücrelerinin yüzeyi üzerinde ifade edilen bir antijene spesifik bir antikor enjekte edilir. Antikorun izotipi, enjeksiyondan önce bilinir ve hayvanlar, yabanil tipteki hayvanlarda gözlenen antikora bagimli hücre aracili sitotoksisitesi (ADCC) ile kiyasli olarak, FcvR'ye bagimli antikora bagimli hücre aracili sitotoksisitede bozulma yönünden analiz edilir. Bir baska duruma göre endojen düsük afiniteli reseptörler bakimindan yoksun fareler, otoimmün hastaliginin in vivo modellerini gelistirmek üzere baska immün yetersiz fareler ile birlestirilebilir (örnegin çiftlestirilerek). Ornegin Severe Combined Immunodeficiency (SCID) fareleri, bagisiklik sisteminin incelenmesi amaciyla model organizmalar olarak ilgili teknikte rutin sekilde kullanilmaktadir. SCID farelerinin T ya da B Ienfositlerini yapma becerileri bozulmustur, ya da kompleman sistemin bazi bilesenlerini aktiflestiremezler ve enfeksiyonlar ile etkin sekilde mücadele edemez, tümörleri ve transplantlari reddedemezler. Mevcut bulusun, düsük afiniteli FcyR o-alt birimi geni bakimindan yoksun fareleri, SCID fareleri halinde yetistirilebilir ve böylece bir terapötik antikorun (örnegin bir anti-tümör antikoru) verilmesine yanit olarak bir konakçi hayvanda hücre deplesyonu ortaya çikarilir, ki bu durum, in vivo tümör hücresi deplesyonunda ADCC ve komplemana bagimli sitotoksisitenin (CDC, complement- dependent cytotoxicity) rollerini belirleyebilecektir. Endojen düsük afiniteli FcyR genlerinin, düsük afiniteli insan FcyR genleri ile ikame edildigi genetigi degistirilmis fareler saglanmaktadir. Bu tip hayvanlar, tamamen insan antikorlarin ve hFcvR-araciliginda gerçeklesen antikora bagimli hücre aracili sitotoksisitenin (ADCC) farmakokinetigini arastirmak için faydalidir. Ilave olarak insan FcyR genlerinin, hastalik (örnek olarak SLE, RA, Wegener granülomatozu, Guillain-Barr'e sendromu ve multipl skleroz) ile iliskili polimorfizmler ya da allelik varyantlar sergiledigi gösterilmistir. Dolayisiyla, endojen düsük afiniteli FcyR genlerinin, insan FcyR genlerinin spesifik allelik ya da polimorfik formlari ile ikame edilmis oldugu genetigi degistirilmis insan harici hayvanlar, insan otoimmün hastaliklarini ve hayvanda polimorfizmler ile iliskili karakteristikleri arastirmak için kullanilabilir. Spesifik bir yapilanmaya göre insan FcyR genlerinin allelik formlari, insan IgG antikoru için artmis etkinlik ile iliskili olmaktadir. Bir baska spesifik duruma göre bir düsük afiniteli insan FcyR polimorfizminin, bir insan antikor terapötiginin etkinligi üzerindeki etkisi belirlenmektedir. Spesifik bir duruma göre bir anti-tümör antikoru, bir insan FcyR reseptörünün bir birinci polimorfizmini içeren bir birinci hümanize fareye ve ayrica bir insan FcyR reseptörünün bir ikinci polimorfizmini içeren bir ikinci hümanize fareye uygulanir, ki sözü edilen birinci ve ikinci farelerin her biri bir insan tümör hücresine sahiptir; ve anti-tümör antikorunun anti-tümör aktivitesi birinci farede ve ikinci farede degerlendirilmektedir. Spesifik bir duruma göre, anti-tümör antikorunun birinci fare ve ikinci faredeki etkinliginin degerlendirilmesi esnasinda, birinci ya da ikinci polimorfizme sahip olan ve insan tümör hücresine karsilik gelen bir tümörü bulunan bir insanin tedavi edilmesi bakimindan bir hekim tarafindan bir tedavi opsiyonu seçilmektedir. Insan FcyR genlerinin uygun polimorfizmleri, ilgili teknikte bilinen her polimorfizmi ihtiva eder. Insan FcvRIIA geni bakimindan polimorfizmler, örnek olarak T hücrelerinin IgG antikoruna yanit olarak çogalma (proliferasyon) becerisi ile bildirilen yüksek yanitçi ve düsük yanitçi fenotipi içerir. Yüksek yanitçi polimorfizmi, 131. pozisyonda bir arginin rezidüsü (131Arg) ile karakterize edilir iken düsük yanitçi, 131. pozisyonda bir histidin rezidüsü (131 His) ile karakterize edilir. Spesifik bir yapilanmaya göre insan FcvRIIA dizisi, 131 His polimorfizmini içermektedir. Insan FcvRIlA d-zincirinin temsili bir protein dizisi, SEQ ID NO: 32 içerisinde gösterilir. Insan FcyRIIB geninin tek nükleotitli substitusyonlari, Iigant baglayici domende (ci-zinciri) mis- sens substitusyonlar ile sonuçlanir ve bir IgG antikoruna ait bir Fc kisminin, hücre yüzeyi üzerinde FcyRIIB reseptörünün d-zincirine baglanma becerisini varsayimsal olarak etkiler. Ornek olmasi bakimindan, farelerde FcvRIIB geninin transmembran domeni içerisindeki 232. pozisyonda bir izolösin rezidüsünün bir treonin ile substitusyonunun (Ile232Thr), reseptörün sinyal iletme becerisini bozdugu gösterilmistir. Spesifik bir yapilanmaya göre insan FcyRIIB geni, izolösin varyantini (232lle) içermektedir. Insan FcvRIIB d-zincirinin temsili bir protein dizisi, SEQ ID NO: 33 içerisinde gösterilir. Insan FcvRIIIA geninin allelik varyantlarinin, SLE ve RA hastaliklarina yatkinliga karistigi önerilmistir. Söz konusu allelik varyant, 158. pozisyonda valin rezidüsünün bir fenilalanin ile substitusyonunu içerir (Val158Phe). Valin allelik varyanti (158Val), fenilalanin allelik varyantina (158Phe) göre IgG1 ve IgG3 için daha yüksek afinite sergilemekle karakterize edilir. 158Phe allelik varyanti, immün komplekslerinin azalmis klirensine yol açtiklari yönünde önerilmistir. Spesifik bir yapilanmaya göre insan FcyRIIA geni, 158Val allelik varyantini içermektedir. Insan FcyRIllA d-zincirinin temsili bir protein dizisi, SEQ ID NO: 35 içerisinde gösterilir. Insan FcyRIIIB geninin allelik varyantlari, nötrofil antijen 1 (NA1) ve nötrofil antijen 2 (NA2) allellerini ihtiva eder. Bu allelik varyantlar, kan-transfüzyon reaksiyonlarina, alloimmune neutropaenia, SLE ve Wegener granülomatozuna karistigi yönünde önerilmistir. NA2 allelik varyanti, fagositoza aracilik etmede azalmis beceri göstermesi ile karakterize edilir. Spesifik bir yapilanmaya göre insan FcvRIIIB geni, NA2 allelik varyantini içermektedir. Insan FcvRlllB cat-zincirinin temsili bir protein dizisi, SEQ ID NO: 36 içerisinde gösterilir. Bir yönüne göre genetigi degistirilmis fareler, terapötik antikorlarin Fc kismi tarafindan tetiklenen FcvR aracili fonksiyonlarin optimize edilmesi için faydali olmaktadir. Antikorlarin Fc bölgeleri, ilgili teknikte bilinen her yöntemle modifiye edilebilir. Ornek olmasi bakimindan FC kismi (mesela CH2 ve CH3 domenleri) içerisindeki amino asit rezidüleri, insan FcyRIIlA reseptörüne baglanma afinitesini selektif olarak artirmak üzere modifiye edilebilir. Böylelikle meydana gelen antikorun, artmis FcvRIIIA-bagimli ADCC göstermesi gerekir. Spesifik bir yapilanmaya göre, mevcut bulusun, insan FcvRIIIA reseptörünü ifade eden bir faresi, degistirilmis bir insan antikorunun artmis ADCC becerisini degerlendirmek üzere kullanilir ve bu amaçla fareye bir degistirilmis insan antikoru uygulanir, FcvRIIIA reseptörünü ifade eden hücrelere antikor baglanmasi (örnek olarak in vitro) olarak saptanir ve gözlenen ADCC aktivitesi, bir yabanil tip hayvanda belirlenmis olan ADC aktivitesi ile karistirilir. ÖRNEKLER Ornek 1: Düsük Afiniteli FcvR Geninden Yoksun Farelerin Uretilmesi Endojen düsük afiniteli fare FcyR Iokusunu silecek (asagida tarif edilir) bir hedefleyici konstrakt yapilmistir (Sekil 1). Hedefleyici konstrakt, Bacterial Artificial Chromosome (BAC) RP23- modifiye etmek üzere VELOCIGENE® teknolojisi kullanilarak yapilmistir (bkz. örnek olarak US Pat. No. 395f6 BAC DNA, FcyR reseptörlerinden her birinin d-zincirini içeren endojen düsük afiniteli FcvRIIB, FcvRIV ve FcvRIII genlerini silecek sekilde modifiye edilmistir. Ozetle, sirasiyla mFcR 5-up-1 (5'-ACCAGGATAT GACCTGTAGA G; SEQ ID NO: 1) ve mFcR 3-up-1a (GTCCATGGGT AAGTAGAAAC A; SEQ ID NO: 2) primerleri ve mFcR 5-DN TGCCCAATAC TTAC; SEQ ID NO: 3) ve mFcR 3-DN (ACTCATGGAG CCTCAACAGG A; SEQ ID NO: 4) primerleri kullanilarak, akis yukari ve akis asagi homoloji kollari yapilmistir. Bu homoloji kollari, endojen düsük afiniteli FcvRIIB, FcyRIV ve FcvRIII genlerinin a-zincirlerini silen bir kaseti yapmak için kullanilmistir. Hedefleyici konstrakt, endojen Iokusa göre bir 5' ve bir 3' bölgesine homolog olan diziyi içeren homoloji kollarini ihtiva eden bir oned neomisin direnç geni içermistir. Endojen FclelB geninin akis yukarisindaki ve endojen FcvRIII geninin akis asagisindaki genler ve / veya diziler (bkz. Sekil 1), hedefleyici konstrakt tarafindan modifiye edilmemistir. Hedeflenen silme (delesyon), silinen bölgenin disinda ve hedefleyici konstrakt içerisinde primerler kullanilarak polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yoluyla dogrulanmistir. Silinen NO: 5) ve PGK-up-detect (ACTAGTGAGA CGTGCTACTT C; SEQ ID NO: 6) primerleri kullanilarak PCR yoluyla dogrulanmis ve silinen Iokusun akis asagi bölgesi, pA-DN-detect (CTCCCACTCA TGATCTATAG A; SEQ ID NO: 7) ve mFcR-DN-detect (TGGAGCCTCA ACAGGACTCC A; SEQ ID NO: 8) primerleri kullanilarak dogrulanmistir. Akis yukari delesyon noktasindan geçen nükleotit dizisi, asagidaki diziyi içermistir ve bu dizi, silme noktasinda bulunan kaset dizisi ile bitisik olarak bagli olan FcyRIIB geninin akis asagisindaki endojen fare dizisini (asagida parantezler içerisinde verilir) gösterir: (GTCCATGGGT AAGTAGAAAC A)TTCGCTACC TTAGGACCGT TA (SEQ ID NO: 9). Akis asagi delesyon noktasindan geçen nükleotit dizisi, asagidaki diziyi içermistir ve bu dizi, FcyRIIB geninin akis yukarisindaki endojen fare dizisi (asagida parantezler içerisinde verilir) ile bitisik olan kaset dizisini gösterir: CGGGTGCGGA GAAAGAGGTA AT(GCATTCTT GCCCAATACT TA) (SEQ ID NO: 10). FcvRIIB, FcvRIII ve FcvRIV yönünden yoksun olan fareler, hedeflenen bir BAC DNA'nin (yukarida tarif edilir) farenin ES hücrelerine elektroporasyonu yoluyla üretilmistir. Pozitif ES hücrelerinin klonlari, TaqmanTM taramasi ve karyotipleme yoluyla dogrulanir. Pozitif ES hücresi klonlari daha sonra disi fareleri implante etmek üzere kullanilmis ve böylece düsük afiniteli FcvR genleri bakimindan yoksun yavrularin dogmasi saglanmistir. Örnek 2: Düsük Afiniteli FcvR Geninden Yoksun Farelerin Karakterizasyonu FcvR yoksunu ve yabanil tip farelerin dalaklari çikarilmis ve tek kullanimlik steril torbalarda 10 mL Collagenase-D ile perfüze edilmistir. Tek bir dalak içeren her bir torba daha sonra bir Stomacher® (Seward) içerisine konulmus ve orta ayarda 30 saniye homojenize edilmistir. Homojenize edilen dalaklar 10 cm'lik Petri kaplarina nakledilmis ve 37 'C sicaklikta 25 dakika inkübe edilmistir. Hücreler, 1 : 50'lik bir 0.5 M EDTA seyreltisi kullanilarak bir pipet ile ayrilmis, akabinde 37 °C sicaklikta be s dakika daha inkübe edilmistir. Hücreler daha sonra bir santrifüj ile peletlenmis (10 dakika, içerisinde lize edilmistir. Splenositler, RPMI-164O (Sigma) ile seyreltilmis ve yeniden santrifüj edilmistir. Peletlenmis hücreler, 10 mL RPMI-1640 içerisinde yeniden süspansiyon haline getirilmis ve 0.2 um'lik bir hücre filtresi ile filtrelenmistir. Akim Sitometri. Lenfosit hücre popülasyonlari, BD LSR II System (BD Bioscience) üzerinde FAC hücreleri ile, asagida belirtilen florokrom-konjüge hücre yüzeyi belirteçleri kullanilarak belirlenmistir: anti-CD19 (B hücreleri), anti-CD3 (T hücreleri), anti-NKp46 (NK hücreleri) ve anti-F4/80 (makrofajlar). Lenfositler, spesifik hücre soylari için geçitlenmis ve endojen FcleIl ve FcyRIIB reseptörlerini bir rat anti-mouse FcyRIII / Il antikor (clone 2.4G2, BD Biosciences) ile ifadelenme yönünden analiz edilmistir. Klon 2.4G2, murin FcvRIII ve FcyRII reseptörlerinin ekstraselüler domenleri üzerinde bir ortak polimorfik epitopu tanimaktadir. Elde edilen sonuçlar, mFcvR KO farelerinde B hücreleri, NK hücreleri ve makrofajlar üzerinde saptanabilir düsük afiniteli murin FcyRIII ya da FcvRII olmadigini gösterir (Sekil 2). ADCC Testi. FcyR geninden yoksun ve yabanil tip farelerden izole edilen splenositler, bir hücre öldürme testinde antikora bagimli hücre aracili sitotoksisite gerçeklestirme becerileri yönünden analiz edilmistir. Hücre popülasyonlari izole edilmis ve MACS® Technology (Miltenyi Biotec) kullanilarak ayrilmistir. Ozetle, T hücrelerinin splenositleri, manyetik olarak isaretli anti- mouse CD3 kürecikleri kullanilarak tüketilmistir. T hücreleri tüketilen splenositler daha sonra manyetik olarak isaretli anti-mouse CD498 kürecikleri kullanilarak NK hücreleri yönünden zenginlestirilmistir. Ayri ayri olacak sekilde Raji hücreleri (insan CD20 ifade ederler), mouse anti-human CD20 antikorunun (klon B1; Beckman Coulter) degisken konsantrasyonlari (0.1 ve pg/mL arasinda degisir) ile 4 `C sicaklikta 30 dakika kaplanmi stir. Antikor ile kaplanan Raji hücreleri, zenginlestirilmis NK hücreleri ile 100 : 1 ve 50 : 1'Iik oranlarda (NK : Raji) 37 °C sicaklikta dört saat inkübe edilmistir. Hücre ölümü, CytoTox-GloTM sitotoksisite testi (Promega) kullanilarak ölçülmüstür. Lüminesans sinyali, Iize edilmis hücrelerden ve ölü hücrelerin sayisina göre orantili olarak türetilir. Kontrollerden (anti-CD20 antikoru bulunmaz) gelen farelerine yönelik ölçümlerden çikarilmistir. Ortalama hücre ölümü hesaplanmis ve hücre öldürmedeki azalma yüzdesi (ADCC %), yabanil tip ile karsilastirilarak belirlenmistir. Sonuçlar mFcvR ADCC % Antikor Antikor Antikor hücresi 50 : 1 15 O 0 Ornek 3: Düsük Afiniteli FcvR Geninden Yoksun Farelerde B Hücrelerinin In Vivo Deplesyonu Insan ya da murin Fc izotiplerinin, ADCC yolagi üzerinden B hücrelerinin tüketilmesi (deplesyon) üzerindeki etkisi, bir human anti-human CD20 antikoru kullanilarak insan CD20'yi ifade edecek sekilde dizayn edilmis düsük afiniteli FcyR geninden yoksun farelerde çesitli B hücresi kompartimanlarinda belirlenmistir. Insan CD20'si ifade eden hücreler, ilgili teknikte bilinen teknikler kullanilarak ayri ayri dizayn edilmistir. Insan CD20'yi B hücreleri üzerinde ifade eden ve düsük afiniteli FcyR genlerinden yoksun olan fareler (Ornek 1 içerisinde tarif edilir), dizayn edilmis iki susun standart yetistirme teknikleri ile yapilmistir. Insan CD20`si ifade eden ve endojen düsük afiniteli FcvR genlerinin tüm üyelerine sahip olan farelerin ayri gruplarinin her biri asagidaki uygulamaya tabi tutulmustur: (1) 10 mg/kg kontrol antikor (N = 4; bir fare IgG2a'si olan, insan CD20'si için spesifik olmayan insan antikoru); (2) 2 mg/kg Ab 168 (N = 3; bir fare IgG2a'si olan human anti-hCD2O antikoru; agir ve hafif zincir degisken bölgesi dizileri, sirasiyla SEQ ID NO: 339 ve 347 içerisinde bulunur, US PatentYayini endojen düsük afiniteli FcvR genleri silinmis olan farelerin gruplarina, kontrol ve human anti- hCD20 antikorlari uygulanmistir (yukarida tarif edildigi gibi). Antikorlar her bir gruptaki farelere intra-peritoneal enjeksiyonlar ile uygulanmistir. Enjeksiyondan yedi gün sonra hayvanlar ötenazi edilmis ve kemik iliginin (B220+ / IgM*), geriye kalan B hücresi içerikleri, bir LSR-II akim sitometre üzerinde gerçeklestirilen çok renkli FACS ile belirlenmis ve Flow-Jo yazilimi kullanilarak analiz edilmistir (yukarida tarif edildigi gibi). B hücresi deplesyon deneylerinin sonuçlari, Sekiller 3A-3D içerisinde gösterilir. Sekiller 3A-3D içerisinde gösterildigi üzere Ab 735, düsük afiniteli FcyR genlerinin tüm üyelerine sahip olan farelerde B hücrelerini Ab 168 ile karsilastirildiginda daha düsük bir etkinlik ile tüketmistir. Dahasi her iki antikor (fare ve insan Fc) itibariyla B hücresi deplesyonu, düsük afiniteli FcyR genlerinin tüm üyelerinden yoksun olan farelerde anlamli ölçüde azalmistir. Bu Ornek, B hücrelerini ADCC (antikora bagimli hücre aracili sitotoksisite) yolagi üzerinden tüketme becerisinin düsük afiniteli FcvR reseptörleri gerektirdigini gösterir ve farelerde, insan sabit bölgeleri içeren antikorlara yönelik ADCC etkinligi ölçümünün, düsük afiniteli insan FcyR genlerinin tüm üyelerini içeren genetigi dizayn edilmis farelerin kullanimi ile daha uygun oldugunu ortaya koyar. Ornek 4: FcyRIIIAI FclelA Hümanize Farelerin Uretimi Silinmis olan bir endojen düsük afiniteli fare FcyR lokusu (asagida tarif edilir) içerisine iki adet düsük afiniteli insan FcvR geni sokmaya yönelik bir hedefleyici konstrakt yapilmistir (Sekil 4). Benzer yöntemler kullanilarak BAC RP modifikasyonu yoluyla insan FcyRIlA ve FcleIlA genleri içeren bir hedefleyici konstrakt yapilmistir (bkz. Ornek 1). Her iki BAC'nin BAC DNA'si, silinmis olan endojen düsük afiniteli FcyR Iokusuna, düsük afiniteli insan FcvRIIA ve FcvRIIIA genlerine ait d-zincirlerinin bir delesyonu sokulacagi sekilde degistirilmistir. Benzer olarak, sirasiyla primerler h14 (GCCAGCCACA AAGGAGATAA TC; SEQ ID NO: 11) ve MS (GCAACATTTA GGACAACTCG GG; SEO ID NO: 12); ve M (GATTTCCTAA CCACCTACCC C; SEQ ID NO: 13) ve h5 (TCTTTTCCAA TGGCAGTTG; SEQ ID NO: 14) kullanilarak akis yukari ve akis asagi homoloji kollari yapilmistir. Bu homoloji kollari, düsük afiniteli insan FcyRIIA ve FcyRIIIA genlerine ait oi-zincirlerini, endojen düsük afiniteli fare FcyR endojen düsük afiniteli FcyR Iokusuna göre 5' olan diziyi, bir FRT'ed higromisin direnç genini, akabinde düsük afiniteli insan FcvRIIA ve FcyRIIIA ci-zinciri genlerini içeren, BAC CTD-2514j12 menseli bir insan genomik fragmanini ve silinmis olan endojen düsük afiniteli FcyR Iokusuna göre 3' olan fare dizisine sahip 3' homoloji kolunu içermistir (Sekil 4'ün orta kismi). Fare trombositleri üzerinde FcyRIIA reseptörünü ifade eden bir fare için benzer sekilde bir hedefleyici konstrakt yapilmis (ayni BAC'Ier kullanilir), ancak bu durumda konstrakt, insan genomunda insan FcyRIIA genine fonksiyonel sekilde bagli, yaklasik 18 kb ya da üzerinde uzatilmis bir promotör dizisi içermistir ve bu amaçla, her iki tarafindan on2372 pozisyonlari ile kusatilan bir higromisin kaseti kullanilmistir; burada promotör bölgesinin ve birinci on 2372 pozisyonunun kesistigi kisim, ATCGGGGATA GAGATGTTTG (CC)GCGATCGC GGTACCGGGC (SEQ ID NO: 37 human / lox2372 kesisme kismi parantezler içerisinde bulunur) olur iken ikinci on2372 pozisyonunun ve fare dizisinin kesistigi kisim, TTATACGAAG TTATACCGG(T G)CATTCTTGC CCAATACTTA (SEQ ID NO: 38 lox2372 / fare kesisme kismi parantezler içerisinde bulunur) olmustur. Promotör bölgesi içeren hümanizasyonu genotiplemek için uygun primerler kullanilmistir. Insan FcyRIIA ve FcvRIIIA a-zinciri genlerinin hedefli olarak sokulmasi, PCR ile dogrulanmistir (yukarida tarif edildigi gibi). Kismi olarak hümanize olan Iokusun akis yukari bölgesi, primerler h16 (CCCAGGTAAG TCGTGATGAA ACAG; SEQ ID NO: 15) ve pA-DN-detect (CTCCCACTCA TGATCTATAG A; SEQ ID NO: 16) kullanilarak PCR ile dogrulanmis ve kismi olarak hümanize olan Iokusun akis asagi bölgesi ise primerler mFcR DN-detect-9 (TGGAGCCTCA ACAGGACTCC A; SEQ ID NO: 17) ve h6 (CACACATCTC CTGGTGACTT G; SEQ ID NO: 18) kullanilarak PCR ile dogrulanmistir. Akis asagi kesisme kismindan geçen nükleotit dizisi, asagida belirtilenleri içermistir, ki bu dizi de, endojen insan dizisinin, silinmis olan düsük afiniteli FcyR Iokusunun endojen fare dizisi 3' ile bitisik olan hFcyRIIA geninin (asagida parantezler içerisinde gösterilir) akis asagisina yeni bir eklenme noktasini gösterir: (CAACTGCCAT TGGAAAAGA)C TCGAGTGCCA TTTCATTACC TC (SEQ ID NO: 19). Akis yukari kesisme kismi iki yeni dizi ihtiva eder. Akis yukari kesisme kisminin bir noktasi, asagida belirtilenleri ihtiva eder, ki nokta da, sokulmus olan hFcyRIIIA geninin akis yukari bölgesini içeren insan genomik dizisi (asagida parantezler içerisinde bulunur) ile bitisik olan higromisin kasetinin nükleotit dizisini gösterir: TAAACCCGCG GTGGAGCTC(G CCAGCCACAA AGGAGATAAT CA) (SEQ lD NO: 20). Akis yukari kesisme kisminin ikinci noktasi, asagida belirtilenleri ihtiva eder, bu nokta da, higromisin kaseti içerisindeki bir nükleotit dizisi ile bitisik olan silinmis düsük afiniteli FcyR Iokusunun akis yukari bölgesi itibariyla bir endojen fare dizisinin (asagida parantezler içerisinde bulunur) bir nükleotit dizisini gösterir: (CCATGGGTAA GTAGAAAC)TC TAGACCCCCG GGCTCGATAA CT (SEQ ID NO: 21). Endojen düsük afiniteli fare FcyR Iokusu yerine iki adet düsük afiniteli insan FcyR geni (hFcyRIIA, uzatilmis promotör bölgesinden yoksundur ve hFcyRII IA) içeren fareler, hedeflenen BAC DNA'sinin (yukarida tarif edilir) fare ES hücreleri içerisine elektroporasyonu yoluyla üretilmistir. Pozitif ES hücrelerinin klonlari, TaqmanTM taramasi ve karyotipleme yoluyla dogrulanmistir. Pozitif ES hücresi klonlari daha sonra endojen düsük afiniteli FcyR genlerinin iki adet insan düsük afiniteli FcyR genleri ile bir ikamesini içeren yavrularin dogmasini saglamak üzere, VELOCIMOUSE® yöntemi (asagida tarif edilir) kullanilarak disi fareleri implante etmek üzere kullanilmistir. Yukarida tarif edildigi üzere, hedeflenen ES hücreleri, donör ES hücreleri olarak kullanilmis ve 8 hücre evresindeki bir fare embriyonuna, VELOCIMOUSE® yöntemiyle sokulmustur (bkz. essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech. 25(1) : 91-99). hFcyRIIA ve hFcyRIIIA tasiyan VELOCIMICE® (tamamen donör ES hücresinden türetilen F0 fareleri), hFcyR genlerinin varligini saptayan allel testinin bir modifikasyonu kullanilarak genotipleme yoluyla saptanmistir (Valenzuela ve ark., yukaridaki atif). hFcvR genlerini tasiyan fareler, örnek olarak ES hücre evresinde ya da embriyonda çikarilmamis olan hedef konstraktin dahil ettigi oned neo kasetini çikarmak amaciyla, bir Cre silici (deleter) fare soyu olarak yetistirilebilir (bkz. örnek olarak Uluslararasi Patent Basvurusu Yavrular genotiplenir ve hFcyR genleri için heterozigot olan bir yavru, FclelA ve FcyRIIIA hümanizasyonunu karakterize etmek üzere seçilir. Ornek 5: FclellAl FclelA Hümanize Farelerin Karakterizasyonu Hümanize FcyRIIIA/ FcyRIIA (heterozigot, uzamis FcyRIIA promotör bölgesinden yoksun) ve yabanil tip farelerin dalaklari toplanmis ve FAC çalismalari için hazirlanmistir (yukarida tarif edildigi gibi). Akim Sitometri. Lenfositler, spesifik hücre soylari bakimindan geçitlenmis ve sirasiyla bir mouse anti-human FcyRII antikoru (Klon FLI8.26; BD Biosciences) ve bir mouse anti-human FcvRlll antikoru (Klon 3G8; BD Biosciences) kullanilarak hFclel ve hFcvRIII genlerinin ekspresyonu bakimindan analiz edilmistir. Her bir Ienfosit alt popülasyonu için gözlenen göreli ekspresyon (++, +) ya da ekspresyon olmamasi (-), Tablo 2 içerisinde gösterilir. B hücreleri - - NK hücreleri ++ - Makrofajlar + + Nötrofiller - + Benzer bir deneyde hümanize FclellA / FcyRIIA (homozigot, uzamis FcyRIIA promotör bölgesinden yoksun) ve yabanil tip farelerin dalaklari toplanmis ve FAC çalismalari için hazirlanmistir (yukarida tarif edildigi gibi). Sonuçlar Sekiller 5A ve SB içerisinde gösterilir. FcyRIIIA / FcvRIIA homozigot farelerde, insan FcvRIIIA, FcyRIIA ya da her ikisini birden ifade eden ayri lenfosit hücre popülasyonlarinin yüzdesi, Tablo 3 içerisinde gösterilir. Lenfosit Soyu hFcvRlll hFclel hFclel I hFcvRlll NK hücreleri 97 - - Makrofajlar 26 14 39 Nötrofiller - 94 - Bu Ornek içerisinde gösterildigi üzere, Ornek 3'e uygun olarak üretilen genetigi degistirilmis fareler (hem heterozigot hem de homozigot genotipler), insan FcvRlllA reseptörünü NK hücreleri ve makrofajlar üzerinde ifade etmis; ve insan FcyRIIA reseptörünü nötrofiller ve makrofajlar üzerinde ifade etmis, ancak trombositler üzerinde etmemistir. Insan FcyRIIIA, NK hücreleri üzerinde yüksek seviyede ifade edilmistir. Bu Ornekte gösterildigi üzere insan FcyR genlerinin ekspresyon motifi, bu genlerin insan aksesuar hücrelerindeki ekspresyon motifi ile tutarlidir. Örnek 6: Düsük Afiniteli FcvR H'ümanize Farelerin Uretilmesi Kismi olarak hümanize edilmis endojen düsük afiniteli bir FcvR lokusuna, üç adet ilave düsük afiniteli insan FcyR geni sokmaya yönelik bir hedefleyici konstrakt yapilmistir (asagida tarif edilir) (Sekil 6). Benzer yöntemler (bkz. Ornek 1) kullanilarak BAC RP-23 395f6 ve RP-11 modifikasyonu yoluyla insan FcvRIIB, FcvRIIIB ve FclelC genleri içeren bir hedefleyici konstrakt yapilmistir. Her iki BAC'nin BAC DNA'si, iki adet düsük afiniteli insan FcyR geni içeren, kismi olarak hümanize edilmis endojen düsük afiniteli FcyR Iokusuna, düsük afiniteli insan FcvRIIB, FcvRIIIB ve FcvRIIC genlerine ait oi-zincirleri sokulacagi sekilde degistirilmistir. Benzer olarak, sirasiyla primerler mFcR up-1 (ACCAGGATAT GACCTGTAGA G; SEQ lD NO: 22) ve mFcR2b Nhel-2 (GTTTCTACTT ACCCATGGAC; SEQ ID NO: 23); ve h1O (AAATACACAC TGCCACAGAC AG; SEQ ID NO: 24) ve h11 (CCTCTTTTGT GAGTTTCCTG TG; SEQ ID NO: 25) kullanilarak akis yukari ve akis asagi homoloji kollari yapilmistir. Bu homoloji kollari, düsük afiniteli insan FcvRIIB, FcvRIIIB ve FcvRIIC genlerinin d-zincirlerini kodlayan DNA dizilerini sokan bir kaseti yapmak için kullanilmistir. Hedefleyici konstrakt, silinmis olan endojen düsük afiniteli FcyR Iokusuna göre 5' olan fare dizisini, bir oned neomisin direnç genini, akabinde düsük afiniteli insan FcleIB, FcvRIIIB ve FcyRIIC a-zinciri genlerini içeren, BAC RP-11 697e5 menseli bir insan genomik fragmanini içeren bir 5' homoloji kolunu ve düsük afiniteli insan FcyRIIIA (Jr-zinciri genine göre 5' olan insan dizisini içeren (Sekil 6'nin orta kismi) bir 3' homoloji kolunu içermistir. Uç ilave düsük afiniteli insan FcvR genlerinin hedefli olarak sokulmasi, PCR ile dogrulanmistir (yukarida tarif edildigi gibi). Tamamen hümanize durumdaki Iokusun akis yukari bölgesi, mFcR up-detect-3 (GAGTATACTA TGACAAGAGC ATC; SEQ ID NO: 26) ve PGK up-detect (ACTAGTGAGA CGTGCTACTT C; SEQ ID NO: 27) primerleri kullanilarak PCR yoluyla dogrulanmis ve tamamen hümanize durumdaki Iokusun akis asagi bölgesi, neo detect (CTCCCACTCA TGATCTATAG A; SEQ ID NO: 28) ve h12 (CTTTTTATGG TCCCACAATC AG; SEQ ID NO: 29)pA-DN-detect (CTCCCACTCA TGATCTATAG A; SEQ ID NO: 28) primerleri kullanilarak dogrulanmistir. Akis asagi kesisme kismindan geçen nükleotit dizisi, hFcvRIIA d-zinciri geninin akis yukarisinda bulunan ayni insan genomik dizisini içermistir (bkz. Ornek 3; SEQ ID NO: 19). Akis yukari kesisme kismindan geçen nükleotit dizisi, asagida belirtilenleri içermistir ve bu ise, farenin iki yeni kesisme kismini ve kaset dizilerini ve eklenme noktasindaki kaset ve insan genomik dizilerini gösterir. Genomik fare dizisinin kesisme kismi (asagida parantezler içerisinde bulunur) ve yeni kaset dizisinin akis yukari bölgesi, asagidaki gibidir: (GTCCATGGGT AAGTAGAAAC A)TTCGCTACC TTAGGACCGT TA (SEQ ID NO: ). Ikinci yeni kesisme kismi, yeni kasetin (asagida parantezler içerisinde bulunur) 3' ucunun ve hFchllB oi-zinciri geninin akis asagisinda bulunan bir insan genomik dizisinin birlesme yerini ihtiva eder: (GCTTATCGAT ACCGTCGAC)A AATACACACT GCCACAGACA GG; SEQ lD NO: 31). Bu birlesme yerleri, Sekil 6 içerisinde (orta kisim) hedefleyici konstrakt içerisinde gösterilir. Tam olarak hümanize durumdaki düsük afiniteli FcvR Iokusunun meydana gelen, Sekil 6 içerisinde gösterilir (alt kisim). Endojen düsük afiniteli fare FcyR lokusu yerine bes adet düsük afiniteli insan FcvR geni içeren fareler, hedeflenen BAC DNA'sinin (yukarida tarif edilir) fare ES hücreleri içerisine elektroporasyonu yoluyla üretilmistir. Pozitif ES hücrelerinin klonlari, TaqmanTM taramasi ve karyotipleme yoluyla dogrulanmistir. Pozitif ES hücresi klonlari daha sonra endojen düsük afiniteli FcvR genlerinin bes adet düsük afiniteli insan FcvR genleri ile bir ikamesini içeren yavrularin dogmasini saglamak üzere disi fareleri implante etmek için kullanilmistir (yukarida tarif edildigi gibi). Örnek 7: Düsük Afiniteli FcvR Hümanize Farelerin Karakterizasyonu Tam olarak hümanize durumdaki FcyR ve yabanil tip farelerin dalaklari toplanmis ve FAC çalismalari için hazirlanmistir (yukarida tarif edildigi gibi). Akim Sitometri. Lenfositler, spesifik hücre soylari bakimindan geçitlenmis ve sirasiyla bir mouse anti-human FcyRII antikoru (Klon FLI8.26; BD Biosciences) ve bir mouse anti-human FcyRIII antikoru (Klon 3G8; BD Biosciences) kullanilarak FcyRIlA ve FcyRIIIA ekspresyonu bakimindan analiz edilmistir. Her bir lenfosit alt popülasyonu için gözlenen göreli ekspresyon (++, +) ya da ekspresyon olmamasi (-), Tablo 4 içerisinde gösterilir. Lenfosit Soyu hFcvRlll hFclel B hücreleri - + NK hücreleri + + Makrofajlar + + Nötrofiller + + Benzer bir deneyde, tam olarak hümanize durumdaki FcyR (homozigot) ve yabanil tip farelerin dalaklari toplanmis ve FAC çalismalari için hazirlanmistir (yukarida tarif edildigi gibi). Sonuçlar Sekil 7 içerisinde gösterilir. Tam olarak hümanize edilmis FcyR homozigot farelerde insan FcvRIIIA, insan FcvRIIIB, insan FcvRIIA, insan FcvRIIB, insan FcyRIIC ya da bunlarin bir kombinasyonunu ifade eden ayri lenfosit hücre popülasyonlarinin yüzdesi, Tablo 5 içerisinde gösterilir. Lenfosit Soyu hFcvRllI hFcyRII hFcvRll I hFcvRIll B hücreleri 100 NK hücreleri 30 - - Makrofajlar <1 55 26 Nötrofiller - 100 Bu Ornek içerisinde gösterildigi üzere, Ornek 5'e uygun olarak üretilen genetigi degistirilmis fareler (hem heterozigot hem de homozigot genotipler), insan FcvRlllA reseptörünü NK hücreleri ve makrofajlar üzerinde, insan FcvRIIIB reseptörünü nötrofiller üzerinde, insan FclelA reseptörünü nötrofiller ve makrofajlar üzerinde, insan FcyRIIB reseptörünü B hücreleri üzerinde ve insan FclelC reseptörünü ise NK hücreleri üzerinde ifade etmistir. Bu Ornekte gösterildigi üzere insan FcyR genlerinin ekspresyon motifi, bu genlerin insan aksesuar hücrelerindeki ekspresyon motifi ile tutarlidir. Ornek 8: Hümanize FcvR Farelerinde Antikora Bagimli Hücre Aracili Sitotoksisite FcyR geninden yoksun (yani nakavt), FclellA/ FcyRIlA (homozigot), FcyRIIlA / FcyRIIIB / FclelA/ FcyRIIB / FcyRIIC (homozigot) ve yabanil tip farelerden izole edilen splenositler, bir hücre öldürme testinde antikora bagimli hücre aracili sitotoksisite (ADCC) gerçeklestirme becerileri yönünden analiz edilmistir (yukarida Ornek 2 içerisinde tarif edildigi gibi). Ozetle, hücre popülasyonlari izole edilmis ve MACS® Technology (Miltenyi Biotec) kullanilarak ayrilmistir. Ozetle, T ve B hücresi tüketilmis splenositler, fare lL-2 (500 U/mL) varliginda iki hafta kültürlenmistir. Meydana gelen yayilmis NK hücreleri, ADCC testlerinde 50 : 1'Iik (NK : Raji) bir oranda efektör hücreler olarak kullanilmistir. Raji hücreleri, 10 ug/mL Ab 168 ya da Ab 735 ile kaplanmistir (yukarida Ornek 3 içerisinde tarif edildigi gibi). Sonuçlar Tablo 6 içerisinde gösterilir. Yabanil tip 89 72 Fare FcvR KO 13 14 Insan FcyRIIIA-IIA HO 78 85 Insan FcyRIIIA-IIIB-IIA-IIB-IIC HO 81 59 DIZI LISTESI <110 MACDONALD, Lynn TU, Naxin GURER, Cagan STEVENS, Sean MURPHY, Andrew J. <120 HUMANIZE FCyR FARELERI <130 3070A-WO <140 Bilahare atanacak <141 <160 38 <170 Windows Sürüm 4.0 için FastSEQ <210 1 <211 21 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 sentetik <400 1 <210 2 <211 21 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 sentetik <400 2 <210 3 <211 65 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 sentetik <400 3 <210 4 <211 21 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 sentetik <400 4 <210 5 <211 23 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 sentetik <400 5 <210 6 <211 21 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 sentetik <400 6 <210 7 <211 21 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 sentetik <400 7 <210 8 <211 21 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 sentetik <400 8 <210 9 <211 42 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 sentetik <400 9 <210 10 <211 42 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 sentetik <400 10 <210 11 <211 22 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 sentetik <400 11 <210 12 <211 22 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 sentetik <400 12 <210 13 <211 21 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 sentetik <400 13 <210 14 <211 19 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 sentetik <400 14 <210 15 <211 24 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 sentetik <400 15 <210 16 <211 21 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 sentetik <400 16 <210 17 <211 21 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 sentetik <400 17 <210 18 <211 21 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 sentetik <400 18 <210 19 <211 42 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 sentetik <400 19 <210 20 <211 42 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 sentetik <400 20 <210 21 <211 42 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 sentetik <400 21 <210 22 <211 21 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 sentetik <400 22 <210 23 <211 20 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 sentetik <400 23 <210 24 <211 22 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 sentetik <400 24 <210 25 <211 22 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 sentetik <400 25 <210 26 <211 23 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 sentetik <400 26 <210 27 <211 21 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 sentetik <400 27 <210 28 <211 21 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 sentetik <400 28 <210 29 <211 22 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 sentetik <400 29 <210 30 <211 42 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 sentetik <400 30 <210 31 <211 42 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 sentetik <400 31 <210 32 <211 317 <212 PRT <213 Yapay Dizi <220 <223 sentetik <400s 32_ <210 33 <211303 <212 PRT <213 Yapay Dizi <220 <223 sentetik <400 33 <210 34 <211 323 <212 PRT <213 Yapay Dizi <220 <223 sentetik <400? 34 <210 35 <211 290 <212 PRT <213 Yapay Dizi <220 <223 sentetik <400 35 <210 36 <211 233 <212 PRT <213 Yapay Dizi <220 <223 sentetik <4OQ_ 36 <210 37 <211 40 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 sentetik <400 37 <210 38 <211 40 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 sentetik <400 38 TR TR TR TR TR TR TR

Claims

1.