TR201807926T4 - Koagülasyon faktörlerinin çökeltme yoluyla etkisizleştirilmesine/çıkarılmasına yönelik usul. - Google Patents

Abstract

Kandan, kan plazmasından, plazma fraksiyonlarından türetilen veya rekombinant vasıtalarla türetilen protein içeren çözeltilerde veya çözeltilerden koagülasyon faktörleri FII, FVII, FVIIa, FIX, FIXa, FX, FXI veya FXIa'nın, protein içeren çözeltinin bir taraftan karıştırılarak organik asit veya bunun tuzuyla temas ettirilmesi yoluyla etkisizleştirilmesine veya çıkarılmasına yönelik bir usul açıklanmıştır.

Description

TARIFNAME KOAGÜLASYON FAKTÖRLERININ ÇÖKELTME YOLUYLA ETKISIZLESTIRILMESINE/ÇIKARILMASINA YÖNELIK USUL Bu bulus kandan, kan plazmasindan türetilen veya rekombinant usullerle türetilen protein terkiplerinde mevcut koagülasyon (pihtilasma) faktörlerinin etkisizlestirilmesine yönelik bir usul saglar.

Koagülasyonun kaskadinin temas aktivasyonun veya yapisinda bulunan yolagin bir parçasi olarak koagülasyon faktörleri kan pihtilasmasinda ve pihti olusumunda önemli bir rol oynar. Bazi koagülasyon faktörlerinin, ör. FXI°nin farmasötiklerin imalati sirasinda etkinlestirilebildigini kanitlayan ispatlar mevcut oldugu için, bu tür etkinlestirilmis koagülasyon faktörlerinin bertaraf edilmesi veya en azindan etkisizlestirilmesinin gerekli oldugu görülmektedir. Hastalarda trombotik vakalar formunda istenmeyen ve saglik açisindan tehlikeli pihti olusumunun Önlenmesi için deri içi ve deri alti uygulamalara yönelik terapötik terkiplerden mümkün oldugunca çok koagülasyon faktörünün çikarilmasi daha da fazla tercih edilir.

Immünoglobünler veya albümin gibi baska proteinlerle karistirilmis çözelti içinde olusan FXIa veya FXI°nin çikarilmasina yönelik usuller bilinmektedir, ancak bunlar ayrica spesifik reçineler kullanildiginda büyük çapta yatirimlari temsil eden kromatografi temelinde zaman alici usulleri kapsar. kromatografi adimiyla kan plazmasindan ölçülebilir olmayan miktarda (0.01 U/mliden az) FXIa içeren FXIinin saflastirilmasi gösterilmistir; adimlar DEAE kromatografisi ile baslar, bunu QAE- ve SP- kromatografisi ve SP-Sephadex ile ikinci bir kromatografi adimi izler.

Bazi durumlarda gamma globülinin (immünoglobin G) bertaraf edilmesi için konkanavalin A-Sefaroz afinite jeli üzerinde ilave bir kromatografik saflastirma gerçeklestirilmistir. yönlendirilmis, devinimsiz kilinmis antikorlarin yardimiyla trombosit konsantrelerinden F XI/F XIa*nin çikarilmasina yönelik bir usul açiklanmistir.

EP l 816 201 A1 'de 8.5 leda sodyum kaprilat içeren bir tampon içinde F Xa yoluyla FVII”nin FVIIa olarak etkinlestirilmesi açiklanmistir. FVIIa proteini 200 mM sodyum sitratin ilave edilmesiyle ve lein 5.0,e düsürülmesiyle etkisiz hale getirilebilir.

GB 906 860 Alda adsorpsiyon ortami olarak çözünmez baryum sülfat üzerinde koagülasyon faktörleri II, VII, IX ve Xlin adsorpsiyonu açiklanmistir. Sonuçta elde edilen çökelti çikarilir ve koagülasyon faktörleri sitrik asit içeren bir tampon kullanilarak çökeltiden özütlenir.

EP 0 987 274 A1`de etkinlestirilmis koagülasyon faktörü VIIa”nin tersinir inhibisyonu yoluyla güçlü bir antitrombotik etkiye sahip bilesiklerin hazirlanmasi açiklanmistir.

Ganzimmun Diagnostics AG ("Allgemeine Hinweise"; http://WWW.ganzimmun.de/item doc/lv/allgemeine hinweisepdf; n 2012-08-07,de alinmis) tarafindan yapilan açiklamada kanin herparinat ile karistirilmasiyla heparinplazma hazirlanmasina yönelik bir usul bildirilmistir.

Steinbuch ve digerleri (Revue Francaise D'Etudes Cliniques Et Biologiques, Editions kaprilik asit çökeltisinin insan plazmasindan IgG, IgA, seruloplazmin ve osmomukoidi çikarabildigi açiklanmistir. kaprilat kullanilarak IgG olmayan proteinlerin çökeltilmesi yoluyla imminoglobülinlerin hazirlanmasi açiklanmistir, burada kaprilat iki, anyon degisim kromatografisi adimiyla çikarilir. Lebing ve digerleri, ayrica albümin, lgA, lgM, prekallikrein aktivatörü ve lipoid proteinini açikça belirtir. Koagülasyon faktörleri belirtilmemistir. saflastirilmasi açiklanmistir. edilen faktörlerin (ör. HGF, PDGF, TGF-(x) saflastirilmasina yönelik bir islemle silikat bazli emici maddelerin faktör Xll`yi sogurabildigi belirtilmistir. tarafindan çözeltiden koagülasyon faktörlerinin çikarilmasi için kromatografik adsorpsiyon veya etanol çökelmesi önerilmistir.

Wiliams ve digerleri (J. Allergy Clin. Immunol.; tarafindan kaprilatin kullanildigi IVIG ürünü Gamunex®-C°nin imalati sirasinda koagülasyon faktörlerinin çikarilmasi degerlendirilmistir. Bu da 2013 yilinda teknikte uzman bir kisin hala IVIG ürünlerinde koagülasyon faktörlerinin tamamen etkisizlestirilmesinin ve IVIG ürünlerinden koagülasyon faktörlerinin çikarilmasinin bu alanda bir sorun olusturacagini düsündügünü gösterir. teknikte bilinen ve Radosevich ve digerlerinde gözden geçirilmis IVIG terkiplerinin imalatina yönelik usuller karsilastirilmis ve bu usullerin plazma terkiplerinden koagülasyon faktörlerini tamamen çikarainadigi açiklanmistir.

Bulusun Özeti Bu bulusun konusu kan, kan plazmasi veya plazma fraksiyonlardan, özellikle terapötik aktif proteinler olarak agirlikli olarak immünoglobinler veya albümin içeren plazma fraksiyonlarindan türetilen protein ihtiva eden çözeltilerde etkinlesmis koagülasyon faktörleri FXla ve/veya FlXainin, protein içeren çözeltinin bir taraftan karistirilarak organik asit veya bunun bir tuzuyla temas ettirilerek etkisiz hale getirilmesi için butirik (C4), valerik (C5), kaproik (C6), enantik (C7), kaprilik (C8), pelargonik (C9) ve kaprik (Cl 0) asitten olusan gruptan seçilen bir organik asidin veya bunun bir tuzunun kullanimidir.

Sasirtici bir sekilde, bir taraftan karistirilirken immünoglobülin G (IgG) içeren bir koagülasyon faktörünün yaklasik 0°C ila yaklasik 40°C sicaklikta, yaklasik 3.5 ila yaklasik 6.0 pH araliginda bir organik asit veya bunun bir tuzuyla teinas ettirilmesinin yalnizca FXIa,yi etkisizlestirmedigi, ancak ayni zamanda FIXa`yi da etkisizlestirdigi bulunmustur.

Organik asit bir C4 ila Cio, doymus veya doymamis organik asit veya bunun tuzlari, özellikle sodyum tuzlari gibi alkalin toprak metallerin tuzlari olabilir.

Bulusun bir düzenlemesinde organik asit butirik (C4), valerik (C5), kaproik (C6), enantik (C7), kaprilik (C8), pelargonik (C9) ve/veya caprik (C10) asit veya bunun sodyum tuzlari gibi tuzlaridir. Özellikle organik asit kaprilik asit veya bunun sodyum tuzu, sodyum kaprilattir, ancak valerik asidin ve kaprik asidin tuzlarinin da tam olarak uygunluk sagladigi bulunmustur.

Organik asit veya bunun tuzunun uygulanan konsantrasyonlari 5 to 50 mmol/l araligindadir. Proteinler ve organik asit veya bunun tuzlari 45 ila 180 dakikalik, özellikle 55 ila 120 dakikalik bir süre karistirilmis ve olusan çökelti yüzeyde yüzey sividan (süpernatant) ayrilmistir. Silikatlar, ör. dogal olarak olusan veya diyatomlu toprak, isli silis, perlitler veya zeolitlerden seçilen sentezlenmis silikatlar gibi filtrelemeye yardimci maddeler de istege bagli olarak karistirma sirasinda mevcut olabilir. Bu etkisizlestirme adimi faydalidir, zira uygun oldugu her durumda kandan türetilen proteinlerin saflastirilmasina yönelik herhangi bir isleme dahil edilebilir. Sonuçta olusan protein çözeltileri daha ileri olarak teknikte bilindigi sekilde kullanilmistir. Bulusa göre organik asitlerin kullanimi özellikle immünoglobülin G terkiplerinin imalatina uygundur.

Bulusun Detayli Açiklamasi Bu bulus butirik (C4), valerik (C5), kaproik (C6), enantik (C7), kaprilik (C8), pelargonik (C9) ve kaprik (C10) asitten olusan gruptan seçilen bir organik asidin veya bunun bir tuzunun protein içeren çözeltilerde koagülasyon faktörleri FIXa ve/veya FXIasnin etkisizlestirilmesine yönelik kullanimini saglar. Bu tür çözeltilerin örnekleri agirlikli olarak immünoglobülinler, özellikle immünoglobülin G (IgG) veya albümin içeren protein çözeltileridir. Koagülasyon faktörleri Fll, FVll, FVlla, FIX, FlXa, FX, FXl ve FXla9nin çikarilmasi için kromatografik islemler bu bulusla önlenebilir. Tabii ki kromatografik saflastirma adimlari ilaveten baska nedenlerle kullanilabilir.

Sasirtici bir sekilde, plazma fraksiyonundan veya karsilastirilabilir fraksiyonlardan koagülasyon faktörlerinin, özellikle Fraksiyon I+II+III°ün bir kompleks karisimini içeren bir çözeltinin bir organik asitle veya bunun tuzuyla, bilhassa sodyum tuzuyla yaklasik 1°C ila yaklasik 40°C, özellikle 2°C ila 30°C sicaklikta ve yaklasik 4.0 ila yaklasik 6.0'lik genis bir pH araliginda, özellikle 4.2 ila 5.6,lik bir pH,da temas ettirilmesiyle etkisizlestirilmis koagülasyon faktörleri FIXa ve/veya FXIa`nin saptama limitinin çok ötesinde oldugu bulunmustur. Buna ilaveten çözelti en az 20 mmol/lilik bir konsantrasyonda kaprilik asit veya bunun tuzuyla temas ettirildiginde faktör Xl-antijen (FXlzAg) degerlerinin 5 mIU/mg IgG altina düstügü gözlemlenmistir.

Organik asit veya bunun tuzuyla isleme tabi tutma sirasinda pH degeri söz konusu aralik dahilinde degisebilir veya sabit bir degerden +/- 0.3°lük bir sapma ile bu aralik dahilinde esasen sabit tutulabilir. Organik asit veya bunun tuzunun, özellikle sodyum kaprilatin uygulanan konsantrasyonlari 5 ila 50 mmol/l, özellikle 10 ila 22 mmol/l araligindadir.

Proteinler ve organik asidin veya bunun tuzunun sabit karistirma altinda 45 ila 180 dakika, özellikle 55 ila 120 dakika temas etmesine izin verilir. Silikatlar, ör. dogal olarak olusan veya diyatomlu toprak, isli silis, perlitler veya zeolitlerden seçilen sentezlenmis silikatlar gibi filtrelemeye yardimci bir madde de istege bagli olarak karistirma islemi sirasinda mevcut olabilir ve temas ettirme isleminden sonra olusan çökelti ile birlikte çikarilir. Çökelti ve yüzeyde yüzen sivinin ayirilmasi genel bilinen usullerle gerçeklestirilebilir ve filtreleme, santrifüjleme veya çökeltme yoluyla gerçeklestirilebilir ve genel olarak bir 60 ila 120 dakika daha gerektirir. Çökeltme yoluyla ayrilma daha uzun sürebilir. Buna göre çökeltme ve ayirmanin bir döngüsü çökeltmenin baslamasindan ayirmanin sonuna kadar en fazla 5 saat sürer. Özellikle koagülasyon faktörleri FIXa ve/veya FXIa°nin tamamen etkisizlestirilmesi için birinci etkisizlestirme yeterli olmayabilir. Bu faktörlerin kalinti miktarlari saptama sinirinin üzerinde olusabildiginden ikinci bir etkisizlestirme adiminin uygulanmasi tavsiye edilir. Çökelti ve üstte kalan sivinin ayirilmasi iyi bilinmektedir ve sedimantasyon, filtreleme veya santrifüjleme veya bunlarin bir kombinasyonunu içerir.

Böylece, organik asitle veya bunun tuzuyla ikinci bir etkisizlestirine bir seçenek olarak dahil edilebilir. Bu etkisizlestirme adimi uygun oldugu durumlarda kandan elde edilen proteinlerin saflastirilmasina yönelik herhangi bir bilinen islemle uygulanabilir. Sonuçta ortaya çikan protein çözeltileri önceki teknikten bilindigi sekilde daha ileri isleme tabi tutulur. Geleneksel islemden geçirme organik asit veya bunun tuzunun kalinti miktarlarinin çikarilmasi için anyon kromatografisi, çözücü/deterjan islemi (S/D islemi), ultra- ve diafiltreleme, formüle etme, steril filtreleme ve nihai kaplara doldurmayi kapsar. Ayrica ürün de bir seçenek olarak liyotilizasyona tabi tutulabilir. Nihai IgG ürününün konsantrasyonu çogunlukla %5-%16 IgG araligindadir, ancak ayni zamanda yaklasik içinden uygulandiklarinda viskozite nedeniyle spesifik formülasyon gerektirdigi belirtilmelidir. IgG kazaniminin 20-40°C,lik oda sicakliklarinda farkli bir organik asit veya bunun tuzu kullanilarak çökeltinin ayirilmasini takip eden yaklasik 2-8°C”lik düsük sicakliklarda bir organik asit veya bunun tuzunun kullanimindan faydalandigi bulunmustur.

Bu tür bir isleme örnek, çökeltinin ayirilmasindan sonra çözeltinin 20-40°C,da sodyum valerat veya sodyum kaprat ile isleme tabi tutulmasiyla birlestirilen 2-8°C,da sodyuin kaprilat ile islemdir.

Analitik Usuller Imalat islemi sirasinda koagülasyon faktörlerinin etkinlesmemesini veya yogunlasmamasini saglamak için süreç içi numuneler tüm islemden çekilmis ve yukarida açiklanan koagülasyon faktörleri üzerinde incelenmistir. Tüm süreç içi numuneler, bunlarin yani sira nihai kaptaki ürünler koagülasyon faktörlerinin olusumu açisindan test edilmistir. Organik asit veya bunun tuzuyla ikinci isleme tabi tutma sonunda, çikarilma veya etkisizlestirmeye bagli olarak koagülasyon faktörlerinin saptanmasi mümkün olmamistir. Konsantre nihai ürünlerde dahi koagülasyon faktörlerinin saptanma sinirina ulasilamamistir veya bu sinir asilmistir. Buna ek olarak, nihai ürünlerde pihti olusumunu baslatma aktivitesi NATEM ve trombin olusumu testiyle (TGA) incelenmistir. Nihai ürünlerin hiçbirinde pihtilasma aktivitesi saptanmamistir.

Pihti olusumunu baslatma aktivitesi Pihti olusumunu baslatma aktivitesi, faktör XI'in eksik oldugu plazmada NATEM® testi ve ROTEM®,den temin edilebilen star-tem® reaktif maddeleriyle trombelastografî prensipleri temelinde PENTAPHARM®ldan temin edilebilen ROTEG® Koagülasyon Çözümleyici üzerinde ölçülmüstür. Tüm testler nihai ürünle yürütülmüs (lgG sonra durdurulmustur, herhangi bir pihti olusumunu baslatma aktivitesi ortaya çikmamistir.

Trombin Olusumu Testi Trombin olusumu testleri (TGA) faktör XFin eksik oldugu plazmada, yani sira havuzda toplanmis normal plazmada Technoclone çikisli TECHNOTHROMBIN® TGA üzerinde gerçeklestirilmistir. Gecikme süresi, yani trombin olusumunun baslangici, trombin tepe noktasi ve TTP, yani tepe noktasina ulasma süresi belirlenmistir. Sonuçlar Tablo lide özetlenmistir, Faktör XFin eksik oldugu plazmada (FXl-PD) bir dereceye kadar uzun gecikme süreleri ve TTP ortaya çikmistir ve havuzdaki plazma degerlerinde yaklasik TGA plazma havuzu TGA FXI-DP gecikme trombin tepe TTP gecikme trombin tepe TTP süresi noktasi süresi noktasi 29.1 45 .1 Fll, FVII, Fviia, FIX, FIXa, FX, FXI ve FXla'nin Analizleri Söz konusu faktörlerin pihtilasma aktiviteleri, BIOPHEN® Faktör IXa test kiti (HYPHEN® BioMed) ile incelenmis ve modifiye edilmis olan FIXa ve FXIa hariç, ilgili test kitleriyle Werfen Group”un ACL 10000 koagülasyon çözümleyicisi ile belirlenmistir.

FXIa,nin pihtilasma aktivitesi BIOPHEN® Factor IXa test kiti, rekombinant FIXHn ilave edilmesi ve bir FXla konsantresi ile kalibrasyon temelinde Ölçülmüstür. FlXa için baslangiç kalibrasyon egrisi sadece 1.0 mIU/mlilik düsük bir saptama sinirina kadar analize izin verirken ikinci bir kalibrasyon egrisi ("düsük kalibrasyon konsantrasyon egrisi") 0.32 mlU/ml”lik düsük bir saptama sinirina kadar analize izin vermistir. Sonuç olarak her iki sinir da analitik sonuçlar tablosunda bulunabilir. Sonuçlar asagidaki tablolarda özetlenmistir. "<" olarak verilen degerler saptama sinirina ulasilmadigini belirtir, Tablo 2`deki bazi ortalama degerler saptama limitinden düsük bir degeri gösterir, bu da tüm degerlerin saptama limitinin altinda olmadigina isaret eder; bu ortalama degerler bulunan gerçek degerin toplami olarak hesaplanmistir. Saptaina sinirinin yarsiyla hesaplanan söz konusu degerlere alternatif olarak, en kötü durum senaryosu olarak saptama siniri degeriyle bir hesaplama yapilmistir, bu da sonuç olarak 0.015 lU/ml FVll, 8.4 mlU/ml FVIIa, 0.016 IU/ml FIX, 1.12 mIU/ml FIXa ve 1.0 mIU/ml FXla ortaya çikarinistir. 0.014 IU/mlllik saptama sinirindan daha düsük konsantrasyonlarda Fll9nin kalinti miktarlarinin mevcut olmasi durumunda bu miktarin 0.001 ila 0.014 IU/ml Fll araliginda aralikla F Vll için, 8.4 mlU/ml saptama siniri ve 0.1 ila 8.4 mlU/ml aralikla F Vlla için, aralikla FXI için geçerlidir. Ayrica FXIa için düsük konsantrasyon kalibrasyon egrisi ile 0.32 mIU/ml saptama siniri ve 0.01 ila 0.32 mIU/m aralik saptanmistir, buna karsin baslangiçta kullanilan kalibrasyon egrisi yalnizca 1.0 mIU/ml'lik bir saptama sinirina izin vermistir, bunun sonucu olarak aralik 0.01 ila 1.00 mlU/mldir. Örnekler: Örnek 1 (sodyum kaprilat): Plazma fraksiyonasyonundan Fraksiyon l+ll+lll çözünmüs ve 2-8°C”a sogutulmustur ve numune A çözeltiden çikarilip alindiginda pH 4.80-4.95 araliginda sabit tutulmustur. 20 mmol/l nihai konsantrasyona sodyum kaprilat eklenmis ve çözelti filtrelemeden önce 90 dakika karistirilmistir. Numune B çikarilip alindiktan sonra filtreden geçmis çözelti 21-27°C”a isitilmistir, pH verilen aralikta yaklasik 4.9”da tutulmustur ve kaprilat yine 20 mmol/l7lik konsantrasyona eklenmistir. 60 dakika karistirma ve santrifüjlemeden sonra numune C yüzeyde yüzen sividan çikarilip alinmis ve tüm numuneler tahlil edilmistir. Yüzeyde yüzen sivi daha ileri olarak anyon kromatografisi, virüs inaktivasyonu (S/D islemi), ultra- ve dia filtrasyon, formüle etme, steril filtrasyon ve nihai ürünün doldurulmasi islemine tabi tutulmustur. Örnek 2: Esas olarak örnek 1'deki ayni islem gerçeklestirilmistir, yalnizca ikinci çökeltme için 20mmol/lilik Ölçü yerine bir litre çözelti basina 10 mmol”lik bir Örnek 3 ve 4: Valerik asit ve kaprik asidin sodyum tuzlariyla örnek 2°deki ayni islem gerçeklestirilmistir.

Tablo 2: Pihtilasma aktivitelerinde hiçbir önemli farkliligin gözlemlenmedigi örnek 1 ve 23ye göre islem. Her ne kadar daha sonraki deneyler (bakiniz tablo 4 ila 7) çökeltmw maddesi ilave edilmeden önce kaynak malzemede koagülasyon faktörlerinin önemli derecede yüksek miktarlarini ortaya çikardiysa da, burada sunulan bulusun kullanimiyla bu faktörlerin etkisizlestirilmesi basarilmistir. %10 IgG konsantrelerinde dahi, ölçülebilen hiçbir koagülasyon faktörü aktivitesi yoktur.

Numune A _ (yemdenPSkWa Numune B (im Numune C (2““1 alinmis traksiyon çökeltmeden sonra) çökcltmcdcn sonra) thkîglleîîyon Ortalama Aralik Oitalama Aralik Ortalama Aralik (karsilastirmali) FVIIlU-'lm'l 5.-ih' 3.-9--9 S ::i iiiiz iziiiizis-iiiizzia ._- i::.::i-.s ::i.i:ii: (karsilasiirmali) FVlla [mIU/ml] (karsilastirmali) 1477. 3 ii'iun-z mi& s ›i c'H -i-izti.: «: M ,_- ii -i FlXl'U/m'] ;_ii_i :w :i i_ii;i cu igia-u uia -: i:.;i'.'›_ .; ;i IJlti (karsilastiriiiali (kaisilastii'mali) . _ FXl'”=""“” :::is iiiîz-ri 1;' `- canin am: < ina:: `- ani: (karsilastirmali) (karsilastirmalil . . . (karsilastirmali) Tablo 2 (devam) Numune D Numune E (%7 lgGSye Nihai kap- %10 yogunlastirilmis) lgG) Koagülasyon ' _ # faktörleri Ortalama Aralik ortalama Aralik FVII [iuziiii] . _ . ` ' ` (karsilaslinnali) '5 l.: . L". 5 '1 U . U: 'D 'I U. Ul': '-' 541.". 5 FVlIa [mlU/ml] FIXllU/mlJ _ i” . _ .. ,_i_ . 4 e i., ,. _ t.. "i' v. (karsilaslirmalû " ~' "J-'3' '^ L" " ' i: " "l' " 1,5` " ~' * " "5 FIXa [inlU:"ii1l] ` ` FX [lUs'mI] (karsilastirmali) `1 II..'_'|`. i; `î 'ILI-'I r; `__ 'Iki-ll .3 `__ *IÜI 5 FXla [mUi'inl] _ _ _ _ (kaisilaslirmzili) ` l'l'i ' l-U ' l l-l ' lvl-l Koagülasyon faktörleri (karsilastirmali) FVII [IU/ml] (karsilastirmali) FVlla [mlU/ml] (karsilastirmali) FIX [IU/ml] (karsilastirmali) FIXa [mIU/ml] FX [IU/ ml] (karsilastirmali) Tablo 3: Örnek 3 ve 4,6 göre islem ( gscrilgângslî: a . Numune B Numune C alînmiS fraksisîfon (im Çökeltmeden (ZM) Çökelîmeden Kaprik . L... _ . .ßî ... .v m n. .... `. .U n. 5..... E __uEE a.. ...3. .9. 35 2..... m5.? - . m... m mâ. H., - 08.... .AS mak.: :...s.....w..__ês_. 2 .m r. m a E N S L ..isa N?... I . 09; N S .. gü NT.: m._ M 5.5.& ...EBE .5: v m7, Ã..., . R? q.? . v. , . . ?en :7 ...mi . 2.2. ?:...Eî ?î 1..: 9.. 2... Q..., .R _ .1: _3. ic u..., . MG 1: H.. ic?.. _ um _ ._C____._: Cu m." U.: 3 ?EL Igni 3 3 ?o ..m 3 _G_ w 2 un 5 .(1. cm .25 ::2: Q.. 0 Nmm 5.....? 2,. v 3....? ww... :[5: ...assîaêc 1..: c..., ... . .... : ..4... :v . En_ ç..., . :v y_ mn.: TC::. [g 2 ...n E E 2 cm .::L 2.2; .y MMS.. avm". . mim \ wânm .i_E_.._.._CL îaEHNMKaG . ..3 m ...R .. .m_....n - _Ün _._CEL _ _wa_ â . x..`.vr\ ?HEK . __.7› m TEL::.. Xn_ mm u Ç» N_ A r $ %225: NH N v w. w h. P` N .... .sn .x ... m ... .m :m F.. 55525255: .` m R K .m n. H-” nH :::aci .2 CN CH DN .ESL :::ma mm; In..? Na m En..? .2 ua m3. :[5: ::gagêâ 9.....? 2 o var. n. @E R m SI.? .tüm Tr::: 1”. .q 1. .L 4 Z .Q 2::::7. .3. ve Z. :â U 2 < u _m < 2 03 oo E 2.:: 05552 .25:95: m 2 h ,Ham n com.. h mom NT.? - ..mn :ESEH _:5_ 2 0 is.. ..::3 2.0 5 v Iman”. wma _ESL ::Eaîêâ 2... o”. 3. _u_ um... mum ç... 9”, m En& u. Ea w: ...Kai ::555.53 mâcv @5.0 En musa”. ms «J 9.. F. Ece”. 0:..“ mm.? ..[52 3 h _. S 3. _In :v :3.2. :a u n ..i c n 2 ...n .::L :52 02.0 maçi. 3:... 2.0 or. m 26 :ne :[5: lgâal .w S.. ._..i .`50 . ..mâ .._ n V . 2..: Tim:: ^__«E._:»a__w..î_v Ertan. mean_ Now mind... 0... v god... 5.2.0 00.”. :[5: ciggêâ :?.. 3 3 I. 3 3. En::: 2 0_ cm 2 cm .25 ::2: QEEuawaiwêg 4:.../i.. lc ..... . .r. h... ....: ...... . Zac..., . z: ... E..? en.. :::5 3. S I. I.. 3 maûdfv mTU.OV DO..” mgüdvi maçûv ......NN :::3: 355:?..Pêg 00 mm mm 00 _”CFCA_ «Eaawîuz N 8. N . GL . 535 3. am 2 #m . . ama.. ._ Tablo 7: Kaprik asit/tuzlu çökeltiler Organik asit/tuz Organik asit/tuz [mM] pH degeri Sicaklik [°C] Karistirma [dak] FVIIa (karsilastirmali) [mIU/ml] FIX (karsilastirmali) [IU/ml] FIXa [mIU/ml] FX (karsilastirmali) [IU/ml] FXI (karsilastirmali) [IU/ml] FXIa [mU/ml] 4.960 <1 . 12 0.4 <0.014 4.3 0.32 2805 173 3.2 0.084 150 7.31 1.95 <0.014 107.9 3 <1. 12 Tablo 8: Ayni baslangiç malzemesiyle gerçeklestirilen kaprilik asitli çökeltiler; pH degerleri ve konsantrasyonlarinin etkisi Organik asit/tuz kaprilik kaprilik kaprilik kaprilik kaprilik kaprilik kaprilik kaprilik kaprilik Numune B B B B B B B B B

Claims (14)

ISTEMLER

1. Kandan, kan plazmasindan, plazma fraksiyonlarindan türetilen veya rekombinant vasitalarla türetilen protein içeren çözeltilerde koagülasyon faktörleri F lXa ve/veya FXIa,nin, protein içeren çözeltinin bir taraftan karistirilarak organik asit veya bunun tuzuyla temas ettirilmesi yoluyla etkisizlestirilmesi için butirik (C4), valerik (C5), kaproik (C6), enantik (C7), kaprilik (C8), pelargonik (C9) ve kaprik (C 10) asitten olusan gruptan seçilen bir organik asidin veya bunun bir tuzunun kullanimi.

2. Istem 1'deki kullanim olup, burada organik asit bir C4 ila Cio, doymus veya doymamis organik asit veya bunun tuzlaridir.

3. Istem 1 veya 27nin herhangi birindeki kullanim olup, burada organik asit kaprilik asit veya kaprik asit veya bu asitlerin bir tuzudur.

4. Istem 1 ila 39ün herhangi birindeki kullanim olup, burada çözelti yaklasik 1°C ila yaklasik 40°Calik bir sicaklikta bir organik asit veya bunun tuzuyla temas ettirilir.

5. Istem 1 ila 4'ün herhangi birindeki kullanim olup, burada çözelti ilk olarak yaklasik 2°C ila yaklasik 8°C”lik bir sicaklikta bir organik asit veya bunun tuzuyla temas ettirilir ve ikinci olarak yaklasik 20°C ila yaklasik 3OOC'lik bir sicaklikta ayni asit veya bunun tuzuyla ya da farkli bir asit veya bunun tuzuyla temas ettirilir.

6. Istem 1 ila 57in herhangi birindeki kullanim olup, burada temas ettirme islemi 4.0 ila 60 araliginda bir pH9da gerçeklesir.

7. Istem 6,daki kullanim olup, burada temas ettirme islemi 4.2 ila 5.6 araliginda bir leda gerçeklesir.

8. Istem 1 ila 7'nin herhangi birindeki kullanim olup, burada organik asit veya bunun tuzu protein içeren çözeltiye 5 ila 50 mmol/Plik bir konsantrasyonda eklenir.

9. Istem 1 ila 89in herhangi birindeki kullanim olup, burada organik asit veya bunun tuzu protein içeren çözeltiye 10 ila 22 mmol/Flik bir konsantrasyonda eklenir.

10. Istem 1 ila 9,11“ herhangi birindeki kullanim olup, burada organik asit veya bunun tuzunu içeren protein çözeltisi 45 ila 180 dakika karistirilir.

11. Istem 1 ila lOlun herhangi birindeki kullanim olup, burada organik asit veya bunun tuzunu içeren protein çözeltisi 55 ila 120 dakika karistirilir.

12. Istem 1 ila ll,in herhangi birindeki kullanim olup, burada organik asit veya bunun tuzunu içeren protein çözeltisi dogal olarak olusan veya sentezlenmis silikatlar mevcudiyetinde karistirilir.

13. Istein 1 ila 12,nin herhangi birindeki kullanim olup, burada yüzeyde yüzen sivi, filtreleme, çökeltme veya santrifûjleme arasindan seçilen ayirma usulleriyle karistirildiktan sonra organik asit veya bunun tuzunu içeren protein çözeltisinden ortaya çikar.

14. Istem 1 ila 13iün herhangi birindeki kullanim olup, burada ayrica anyon degisim kromatografisi, 8/ D islemi, nanofîltrasyon, ultrafîltrasyon, diafiltrasyon, formüle etme, steril filtrasyon, nihai kaplara doldurma ve istege bagli olarak liyofilizasyon gerçeklestirilir.