SU508162A3 - Способ получени инсулина - Google Patents

Description

1

.

Изобретение относитс  к фармацевтичес кой промышленности.

Известен способ получени  комплекса цинкова  соль инсулина - протамин путем прибавлени  к раствору кристаллического

инсулина цинка хлорида,и протамин-сульфата .

Дл  повышени  быстрагы и длительности действи  вещества смешивают натриевую соль инсулина в соотношении, на каждые

1ОО ед. инсулина 0,2 - 1,5 мг протамиНа И раствор ют в воде при рН 6,5-8,0.

Соль Инсулина приготавливают путем щелочной кристаллизации инсулина, примен   едкий натр, гидроокись шелочного металлаИЛИ гидроокись аммони . После кристаллизаиии кристаллы промывают и сушат до тех пор, пока содержание влаги будет, менее 10%. Соль инсулина мгновенно раствор етс  в воде при нейтральном рН и может хранитьс  в растворе до 3 кгес цев без существенного ухудшени ,

Соль инсулина и протамин соедин ют в ВОДНОЙ среде так, чтобы образовалс  комп- леке соль инсулина-протамин5 рН

среды 6,5-8,0., Комплекс соль инсулина-пртамнн может быть легко отделен от жидкой среды фильтрованием и высушен. Комплекс в сухой форме может хранитьс  год и более. ЕСЛИ примен ют комплекс соль инсу- лина-протамин, -то его раствор ют в водной среде, предпочтительно в изотоническом разбавителе при рН 6,5-8,0. После растворени  комплекс готов дл  инъекииИо Комплекс характеризуетс  быстро наступающим И длительно продолжающимс  действием.

Изготовление комплекса соль инсулина-протамин СОСТОИТ в приготовлении натриевой СОЛИ инсулина, почти не содержащей цинка, т.е. менее О,О5% (натриевв  соль в кристаллическом внде, но растворима в воде ИЛИ в изотоническом разбавителе). Затем натриевую соль раствор ют Б жидкой среде в таком количестве, чтобы на 1ОО мл жидкой среды приходилось ед. Затем к ЖИДКОЙ среде добавл ют требуемое коли--, чество протамин-сульфата. Образуетс  нерастворимый комплекс в виде очень тонкого осадка. Тонко распределенный осадок хорошо суспендируетс  в жидкой среде, так

; что инъекци  производитс  лето. Если ком плекс хр)ннтс  ;в жидкой среде, то ои

остаетс  стабильным и ве тер етг/автйввоёт

в течение года.

ь Натриевую соль инсулина получают путем i обработки неочишенного инсулина едким

натром в водном растворе, причем едкий .. натр п$«сутствует в количестве, необходимом дл  получени  рН 8-8,5. Нат жева 

соль инсулина осаждаетс  в растворе и : легко отдел етс  декантированием,цектри фугированием, фильтрованием. Натриеваг f

сдль MolkeT быть очищена последующим : растворением и перекристаллизацией. Анализ показывает, что при применении натриевой соли инсулина на 1 моль натри  присутствует 1 моль инсулина. Кристаллы натриевого инсулина могут содержать обычный или свиной инсулин и легко растворимы в воде-И изотонических растворах при рН около 7.

Протамин обычно присутствует в виде протамин-сульфата или в другой водораст воримой форме.

Если примен ют изотонический оаэбави- гель в качеств е среды дл  протамин-суль-;

фата и соли инсулина, необходимо чтобы разбавитель содержал консервирующее среДгстбо . Консервирующим средством  вл етс  фенол и метил- п -гидрооксибензоат.

Биологическую активжжть комплекса протамин инсул  определ ют на кролшсах.

36 кроликов (2 равные группы) выдерживают голодными 24 часа перед испыта аием. В течение всего испытани  им не да уг ни BOjEibr, ни пиши. Дл  определени  перфо начального содержани  сахара в крови про крови берут из концевой ушной вены. Ко нтрольной группе кроликов впрыскивают назначени -ю г ДОЗУ нейтрального протамин-инсулина Хагедорн (NPH), испытываемой группе инъецируют комплекс протами№-натиевый инсулин (PSИ). Первую пробу крови у каждого кролика берут через ЗО мин. Последующие пробы берут через 1,5, 3, 5, 7 и 9 час после инъекции. Каждую пробу анализируют на содержание сахара в крови , результаты выражают в миллиграмм/ процентах глюкозы. Дли обеих групп вычисл ют- среднее содержание aeatetpst дл  каждого отбора проб,

Если примен ют перекрестное испытание, кроликов, которые лопучакуе контрольную пробу, :иньецируют комплексом протаминнатриевый инсулин iii наоборот. Эти испытани  провод т через неделю; по окончании  ервоначальных испь таквй.

Полученные результату вь1раженные как среднее содержание сахара в крови в миллиграмм/процентах , представлены в табл. 1.

Таблица

Комплекс протамин-натриевый инсулин действует более быстро более продолжительно , чем продукт NPH.

Комплекс PS 3 (протамив иатриёвьтй и сулин ) сравнивают со смесью AiJ3 (кислот ный обычный инсулин) и NPH # соотнощении 1:1 (на базе активности). Концентр 55 ци  протамнн-сульфата О,8 мг/мл.

При этом перекрестном испытании ио польЕ ют 36 кроликовс Каждому впрыскивают ОД мл инсулинового продукта, т.е. 1 ед. инсулина на инъекцию. 60Результаты представлены в табл.2.

Провод т сравнение трех типов нейтральных продуктов протамин-натриев 1й инсулин е комбинации с 0,02 мг цинка «а ДООед.

.5 ; - iffK;,.-....

инсулина. Каждый инсулиновый продукт содержит О,О2 мг цинка, на ЮО ед. инсулина.

При добавлении цинка определ ют его вли ние на быстро наступающее и долго продолжающеесн действие комплекса протаю .мик йатриевый инсулин. Неблагопри тного

. Свиной инсулин действует быстро, хот  продолжительность его действи  не така  длительна , как других инсулиновых продуктов . Бычий и смешанный прюдукты действуют быстро и долго.

П р и м .е р 1. Приготорление комплек- са протамин-инсулин в дозированной форме.

Кристаллический бычий натриевый инсулин приготавливают следующим образом.

Инсулин экстрагируют из бычьей поджелудочной железы, подкисленной водной спирТа б л и ц а 2

действи  не наблюдаетс .

Сравнивают три продукта: свиной и быП чий инсулинь, а также смесь, сА ержащую 75% бычьего и 25% свиного инсулина.

Испытание провод т над 6 кроликами, каждому впрыс сивают О,О1 мл, т.е. дозу в i ед. инсулина.

Результаты пз едставпены в табл. Я. ТаблицаЗ

товой средой,- концентрируют под вакуумсм;и 4iacTH4Ho очищают дробным осаждением . с хлористым натрием и изоэлектрическим осаждением. Затем инсулин очищают щелочной .кристаллизацией при рН 8. Полученные кристаллы раствор ют в разбавленной уксуо .ной кислоте (0,5 н) и далее фракционируют фильтрованием на Софадексе Г-5О.

Элюат, состо вший из О,5 н. уксусной кислоты и инсулина, нейтрализуют 1 н. едкйм натром и перемешивакэт 1 час при ком нач-ной температур®. Затем кристаллы натри евого инсулина отдел ют фильтрованием и промывают 2%™ным хлористым натрием. После чего промытие кристаллы внос т в избыток абсолютного спирта нри сильном перемешивании, отфильтровывают и собирают . После второй промывки абсолютным спиртом кристаллы промывают эфиром и вь сушивают е вакууме., Получают кристаллический бычий натриевый инсулин со следующей жарактеристикой:активностъ -25,8 ед./мг азот - 15,82%; 8,О%; uBeTHquj индекс. - О,О05 дл  1%-ного раствора при 34О ммкм, ,. Йорцию сухого натриевого инсулина в количестве 8,98 г раствор ют в 990 мл свободной -от пирогена воды,. содержащей 2,27 г фенола и 1J5 мл 1О%-ной НСб . Затем с помошью 1,7 мл 10%чногоКаОН довод т до 7,4, Испытани  показали, что активность инсулина 1О1,3 ед./мл. Этот раствор подвергают стерильной фильтрации и разливают в флаконы по 1 мл, высушйва ют при температуре ниже в асептичеок;их услови х и получают б каждом флаконе сухой, натриевый инсулин, который и сохран етс  в таком виде до испытаний.

Данные таблицы показывают, что даже после хранени  комплекса, суспендированного в изотоническом разбавителе, при 25°С сохран етс  активность инсулина: он действует быстро и длительно.

П р и м е р 3. Образование и применение коктлекса протамина с аммонийным, литиевым и калиевым инсулином, а также натриевым инсулином примера 1.

Каждую из этих, инсулиновых солей получают по методике примера 1, смешивают с изотоническим раствором, содержащим 0,4 мг протам н-сульфата/мл, и впрыо-; кивают так, как о;шсано в примере 1, 18 KpoTi KaM.

Результаты приведены в табл.5. в каждый флакон добавл ют изотоничеокий разоавитель в тшсом количестве, чтобы жидка  среда содержала 1О1,3 ед. и сулина /МП. Этот изотонический разбавитель-содержит0 ,4 мг протамин-сульфата/ /мл, 1,6% глицерина и О,25 вес.% фенола, рН изотонического раствора 7,4. После добавлени 1изотонического раствора к су хому натриевомуИ юулину происходит мгновенное образование комплекса протами -на1 риевый ишзулин. комплекс находитс  в флаконе в виде тонко р«юпределенного осадка. Осадок остаетс  достаточно равномерно суспендированным в водном разбавителе , так что при вз тий инъекционным шприцем каждь й раз отбирают одинаковое количество инсулина. П р и м е р 2. Нейтральный комплекс ригЬтавливают .аналогично 1 за исключением того, что изотонический разбавитель содержит 1,2 мг протамина/мл. Каждое испытание провод т над 9 кроликами . Между испытани ми комплекс, суспендированный в изотоническом разбавителе, хранитс  при 25°С. Кроликам впрыскивают по 0,01 мл инсулинового продукта. Результаты приведены в табл.. 4. Таблица4

9 Натриевый инсулин действует длительнба другие же составы вызывают значительное снижение содержани  сахара в крови. П р и м е .р 4. Стабильность комплекса протамин-натриевый инсулин. Комплекс приготавливают аналоАчно примеру 1, примен   0,4 мг/мл протамин-сульфата в изотоническом разбавителе. После приготовлени  комплекс помеишют в проби{ ки центрифуги, центрифугирз ют- и выделившуюс  жидкость декантируют. Отделенный осадок промывают 15 мл абсолютного спирта и затем 15 мл абсолютного эфира. lipoКаждый из выс/шенных инсулиновых составов раствор ют и инъецируют, что выаы- . вает значительное снижение содержани  , сахара в крови..

S08162

10 Таблицаб

Claims (1)

1. Формула изобретени  Способ получени  препарата инсулина путем смешивани  соли инсулина с протамин-сульфатом , отличаюшийс  мь7тый осадок зйтем высушивают в вакууме при комнатной температуре. Высушенный материал снова суспенд1фу- ют в нейтральном разбавителе, не содержащем протамин.-сульфата, СуспенАрованный материал анализируют на активность. Активность 88-95 ед./мл, что показывает легкую потерю инсулина при промывке перед сушкой. Испытани  провод т на 9 кроликах. Данные приведены в табл. 6. Испытани  с высушенным при низкой температуре материалом провод т с материалом, снова суспендированным в воде и затем высушенным при низкой температуре. Таблица 6

   ,.508162

   TeM.nqrok с аелыо повышени  быстроты нкаждые ОО ед. инсулина 0,2-1,5 мг продлнтельности действи  вешествд, смешивают тамина и раствор ют в воде при рН 6,5натриевую соль инсулина в соотношении на8,0.