SU471701A3 - Способ получени стимул тора иммуногенеза - Google Patents

Description

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СТИМУЛЯТОРА ИММУНОГЕНЕЗА

I

Изобретение относитс  к области медицины и касаетс  стимул торов иммуногенеза.

Известен снособ получени  стимул тора иммуногенеза путем гомогенизации микроорганизмов тина Mycobacteria или jMocardia и обработки гомогената органическими растворител ми .

Целью изобретени   вл етс  снижеиие токсичности нренарата.

Дл  достн/кени  поставленной цели гомогеиат перед делинидизацией обрабатывают протеолитическими ферментами, лиофилизируют , обрабатывают ацетатом аммони , повторно подвергают обработке протеолитическими фермеитами н лиофилизации, а затем раствор ют в воде и фракционируют, например, с использованием сефадекса G-50.

Пример 1. Штамм Mycobacterium smegmatis, культивируют в скл нках Рюкса на среде Саутона в течение 12 дней, при 37°С, отфильтровывают, промывают дистиллированной водой и до непосредственного использовани  выдерживают при 20°С.

100 г клеток суспензируют в 500 мл дистиллированной воды путем смешивани  при низких температурах в смесителе Уариига, который предварительно охлаждают до тех пор.

пока суспензи  не становитс  гомогенной. Затем эти клетки расщепл ют в предварительно охлаждаемом французском ирессовом устройстве , работающем в услови х комнатной темнературы при давленнн 420 кг/см. После первоначального прохождени  через прессовое устройство добавл ют 1 мг DNA-зы дл  снижени  в зкости, и затем эту сусиензию вторично ироиускают через то устройство.

Кроме расщеилени  клеток иутем воздействи  механического давлени , они могут быть расщеплены также звуковым колебанием 30 мл суспензии в течеиие 25 мнн в звуковом осцнлл торе , иредварительно охлажденном и работающем с частотой колебаний 70 кгц/сек, а также замораживанием оттаиваиием при обработке их цеолитом, встр хиванием их вместе со стекл нными шариками или обычными средствами, исиользуемыми дл  расщеплени  микробиых клеток.

Получаемую в результате суспензию цеитрифугируют три раза в течение 15 мин в количестве 800 г в охлаждаемой центрифуге. Шарики, состо щие из нерасщепленных клеток , удал ют. Получаемую всплывшую на поверхность жидкость центрифугируют в течеиие 1 час в количестве 27500 г. Шарики из

вещества стенки клеток превращают в суспензию 750 мл буферного раствора фосфата натри  (0,066 М; рН 7,8), в которую добавл ют 125 мл трипсина, 125 мл химотрипсина и небольшое количество антисептического агента (например, толуол), чтобы предотвратить какое-либо бактериальное загр знение. Этот продукт выдерживают в инкубаторе в течение ночи при обычной комнатной температуре с помощью магнитной мещалки, и после этого смесь центрифугируют 1 час. Шарики, состо щие из вещества стенки клеток, промывают, помеща  их снова в суспензию, центрифугиру  три раза вместе с холодным буферным раствором фосфата и три раза вместе с холодной дистиллированной водой.

Далее вещество стенки клеток делипидируют при обычной комнатной температуре с помощью нейтральных растворителей. С этой целью материал помещают в суспензию примерно в 30 объемов растворител , который может воздействовать примерно в течение одного дн  при перемещивании. Вещество стенки клетки, таким образом, делипидируют три раза ацетоном, три раза этанолом-эфиром (1 : 1), три раза хлороформом и три раза хлороформом-метанолом (2:1), затем это вещество высущивают с помощью ацетона. Делипидированное и высушенное вещество стенки клетки до его непосредственного использовани  можно выдерживать при комнатной температуре .

100 г делипидированного вещества стенки клетки суспензируют в 250 мл 0,1 М-ного раствора ацетата аммони , с рН 6,2 и выдерживают эту суспензию в течение ночи в холодном состо нии, добавл   несколько капель толуола. Вещество фильтруют, использу  фильтр из сплавленного стекла, промывают этанолом и хлороформом. Промытый материал помещают снова в суспензию в 150 мл ацетата аммони  (0,1 М; рН 6,2), к которому добавлено 12 мг лизозима и несколько капель толуола; этот продукт выдерживают в течение ночи в инкубаторе при 37°С и перемещивапии . После фильтрации с помощью сплавленного стекла остаток обрабатывают еще раз лизозимом в тех же услови х, что и первоначально.

Оба фильтрата смешивают, лиофилизируют, снова раствор ют в во/ч,е и лиофилизируют до удалени  ацетата аммони . Выход: примерно 90 мг сырого растворимого в воде продукта на 1 г высушенного делинидированного вещества стенки клетки.

Растворимый в воде сырой продукт (500 мг) фильтруют через колонку, наполненную Sephadex G-50 (высота колонки 80 см, диаметр 2,5 см) в равновесии с 0,1 N-ной уксусной кислотой.

Первый иик выход щего из колонки продукта , хорошо отделенного от оставшегос  продукта, содержит рассматриваемый в данном описании агент в чистом виде (150 мг).

Фильтраци  через колонку, наполненную Sephadex G-75, приводит к более размытому пику выхода, включающему плечо.

Этот пик выхода продукта содержит две фракции одинакового состава, различающиес  лишь по молекул рному весу.

Франкции, соответствующие второму пику выхода продукта при фильтрации через колонку , наполненную Sephadex G-50 содержат вещества с более низким молекул рным весом .

Предмет изобретени 

Способ получени  стимул тора иммуногенеза путем гомогенизации микроорганизмов типа Mycobacteria или Nocardia и делипидизации гомогената, отличающийс  тем, что, с целью снижени  токсичности препарата, гомогенат перед делипидизацией обрабатывают протеолитическими ферментами, лиофилизируют , обрабатывают ацетатом аммони , повторно нодвергают обработке протеолитическими ферментами и лиофилизации, а затем раствор ют в воде и фракционируют, например , с использованием сефадекса G-50.