[go: up one dir, main page]

SU1618761A1 - Способ получени пептидов и белков в бесклеточной системе трансл ции - Google Patents

Способ получени пептидов и белков в бесклеточной системе трансл ции Download PDF

Info

Publication number
SU1618761A1
SU1618761A1 SU4239148K SU4239148K SU1618761A1 SU 1618761 A1 SU1618761 A1 SU 1618761A1 SU 4239148 K SU4239148 K SU 4239148K SU 4239148 K SU4239148 K SU 4239148K SU 1618761 A1 SU1618761 A1 SU 1618761A1
Authority
SU
USSR - Soviet Union
Prior art keywords
cell
translation system
atp
gtp
synthesis
Prior art date
Application number
SU4239148K
Other languages
English (en)
Inventor
Юлий Борисович Алахов
Владимир Иванович Баранов
Сергей Юрьевич Оводов
Любовь Анатольевна Рябова
Александр Сергеевич Спирин
Original Assignee
Институт Белка Ан Ссср
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Институт Белка Ан Ссср filed Critical Институт Белка Ан Ссср
Application granted granted Critical
Publication of SU1618761A1 publication Critical patent/SU1618761A1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Изобретение относитс  к молекул рной биологии и биотехнологии, а именно к использованию бесклеточных систем трансл ции дл  синтеза биологически активных полипептидов in vitro . Целью изобретени   вл етс  повышение выхода целевого продукта за счет увеличени  срока работы системы трансл ции. Способ препаративного синтеза полипептидов и белков в бесклеточной системе трансл ции непрерывного действи  предполагает непрерывный отвод из реакционной смеси продуктов реакции и непрерывное восстановление исходной концентрации низкомолекул рных веществ, расходующихс  в процессе трансл ции.

Description

Изобретение относитс  к молекул рной биологии и биотехнологии,а именно к использованию бесклеточных систем трансл ции дл  синтеза биологически активных полипептидов in vitro.
Целью изобретени   вл етс  повышение выхода целевого продукта за счет увеличени  срока работы системы трансл ции .
На фиг.1 и 2 приведены схемы, по-  сн юпще способ.
Разработан целый р д бесклеточных систем трансл ции на основе клеточных экстрактов из различных прокари- отическйх и эукариотических организмов . Все эти системы характеризуютс  низкой эффективностью процесса и обычно обеспечивают синтез лишь нескольких молекул полипептида на рибосому. Основные причины столь низкой эффективности бесклеточных систем трансл ции
состо т в том, что бесклеточные системы трансл ции содержат ограниченное количество субстратов реакции, в первую очередь источников энергии (АТР и ОТР). Повышение содержани  этих компонентов в системах имеет определенные пределы, при превышении которых наблюдаетс  ингибирование системы трансл ции. Продукты распада субстратов реакции, в первую очередь
ADP, AMP, CDP, фосфаты и пирофосфаты,  вл ютс  ингибиторами системы трансл ции . Сами продукты синтеза (поли- пептиды) также могут быть .ингибиторами отдельных стадий бесклеточной системы трансл ции.
Описанные причины устран ютс  за счет непрерывного отвода из реакционной смеси продуктов реакции и непрерывного восстановлени  исходной конЈЈШы&
центрации низкомолекул рных веществ, расходующихс  в процессе трансл ции.
Основна  реакци  (синтез) полипеп тида протекает в блоке 1 (фиг.1). В результате ее расходуютс  свободные аминокислоты, АТР и GTP и образуют полипептид, AMP, GDP и неорганический фосфат. Дп  предотвращени  остановки процесса из блока 1 происходит одно- временно отбор GDP, AMP и Р и подач iGTP, АТР и аминокислот из блока 2. Отбор синтезируемого полипептида происходит (в блоке 3) через мембрану в резервуар, из которого буферный ;раствор с полипептидом поступает в колонку с аффинным иммуносорбентом. На колонке происходит адсорбци  полипептида на иммунном сорбенте, специфичном к целевому полипептиду. Дд  более экономичной работы системы в блоке 4 происходит превращение образовавшихс  AMP и GDP в АТР и GTP. Буферный раствор из блока 3 после ад- сорбции полипептида также проходит через систему регенерации АТР и GTP и через полупроницаемую мембрану вновь поступает в реакционную смесь.
Пример 1. Синтез белка оболочки вируса мозаики костра (BMV) на матрице BMV РНК 4 в эукариотической системе трансл ции из зародышей пшеницы в стандартной системе и в установке непрерывного действи .
Раствор (А) состоит из 20 мМ НЕ
PES, рН 7,6, 2,1 мМ Mg(oAc)2, 115 мМ КоАс, 1 мМ АТР, 25 мкМ GTP, 250 мкМ спермидина, 25 мкМ Ј IIJ лейцина с удельной радиоактивностью 24 Ки/ммоль и 25 мкМ каждой из остальных 19 аминокислот . 3 мл инкубационной смеси, приготовленной на растворе (А), содержит 80 пмоль 08 S рибосом, 20 пмоль BMV РНК 4, 3,7 оп.ёд. A2gg белковой фракции S100, 150 ед. активности ингибитора рибонуклеаз из плаценты человека , 0,1 мкг лейпептина, 0,1 мкг ап- ротенина, 0,1 мкг пепстатина,0,1 мкг химостатина. t
Кинетика синтеза белка оболочки в стандартной системе при 25 С представлена на фиг.2 (крива  1).
В параллельном эксперименте в установке непрерывного действи  к 3 мл той же инкубационной смеси непрерывно подаетс  раствор (А) со скоростью 0,6 мл/ч, а продукты реакции отвод тс  из реакционной смеси с той же скоростью через ультрафильтрационную
0 5
0
5
0
5
0
5
мембрану ХМ-50. В результате в камеру , содержащую бесклеточную систему трансл ции, непрерывно подаютс  субстраты реакции (АТР, GTP, аминокислоты ) и отвод тс  из нее продукты реакции (AMP, GDP, Р ., синтезированный белок оболочки) .
Кинетика синтеза -белка оболочки в такой системе при 25°С в течение 15ч представлена на фиг.2 (крива  2).
Из сравнени  кинетических кривых 1 и 2 (фиг.2) можно сделать следующие выводы.
Стандартна  бесклеточна  система трансл ции выходит на плато по синтезу белка через 1,5 ч.Количество синтезированного белка при этом составл ет 0,76 пмоль белка оболочки на 1 пмоль рибосом.
В установке непрерывного действи  синтез белка оболочки идет линейно в течение исследованного интервала времени (15 ч), количество синтезированного белка за 15 ч 40 пмоль на 1 пмоль рибосом.
В целом дл  предложенной модели установки непрерывного действи  эффективность синтеза белка за 15ч возрастает более чем в 50 раз.
Пример 2. Синтез белка оболочки фага MS 2 на матрице 2 MS 2 РНК в прокариотической системе трансл ции Е. col i в стандартной системе и в установке непрерывного действи .
Раствор (А) содержит 20 мМ трис- - НС.1, рН 7,4, 10 мМ MgCl2, 100 мМ NH4G1, 1 мМ APT, 0,2 мМ GTP, 5 мМ креатин фосфата, 10 мкг/мл кр. фос- фаткиназы, 25 мМ Ј с лейцина с удельной радиоактивностью 348 мКи/ /ммоль и 25 мкМ каждой из остальных аминокислот. 3 мл инкубационной смеси, приготовленной на буфере (А), содержат 1 нмоль рибосом 70S, 1 нмоль MS2 РНК, 3,5 ед. &.г80 белковой фракции S100.
.
В параллельном эксперименте в установку непрерывного действи  к 3 мл той же инкубационной смеси непрерывно подают раствор (А) со скоростью 0,5 мл/ч, а продукты реакции отвод тс  из реакционной смеси с той же скоростью через ультрафильтрационную мембрану РМ-ЗО.В результате в камеру , содержащую бесклеточную систему трансл ции, непрерывно подают субстраты реакции (АТР, GTP,aMHHOKHcnoты ) и отвод т продукты реакции (ЛИГ. GDP, Р-, синтезированный белок).
Стандартна  бесклеточна  система трансл ции выходит на плато по синтезу белка через 2 ч. Количество синтезированного белка при этом составл ет i,1 лмоль белка на 1 пмоль рибосом.
Сравнивают кинетику синтеза белка оболочки в такой системе при 37°С в течение 15 ч с кинетикой синтеза в стандартной бесклеточной системе.
В установке непрерывного действи  в течение 15ч синтезировано 11 пмоль белка на 1 пмоль рибосом.
Таким образом, предлагаемый способ синтеза полипептидов в бесклеточной системе трансл ции обеспечивает многократное повышение скорости реакции и функционирование системы в длительном режиме. В результате этого выход целевого продукта повышаетс  в несколько дес тков раз (по сравнению с прототипом).
.Достигаема  эффективность процесса позвол ет использовать способ дл  препаративного синтеза активных полипептидов .и белков. Особо важное хоз йственное значение может получение этим способом полипептидов длиной 15-50 аминокислотных остатков, поскольку производство их химическим путем  вл етс  крайне дорогосто щим, а дл  методов генной инженерии - во многих случа х малодоступным.

Claims (1)

  1. Q Формула изобретени 
    Способ получени  пептидов и белков в бесклеточной системе трансл ции с использованием матричных РНК с после- дукпцим выделением и очисткой конечного продукта, отличающийс  тем, что, с целью повышени  выхода целевого , продукта за .счет увеличени  срока работы системы трансл ции,осуществл ют непрерывное удаление из реакционной смеси синтезированного продукта , непрерывное восстановление концентрации расходуемых низкомолекул рных веществ аминокислот, АТР, GTP, 5 регенерацию АТР и GTP из образующихс  AMP и ППР с последую щм возвращением регенерированных АТР и GTP в систему тра нсл ции.
    5
    0
    ffs uftff#ufjrv r. ОГРч
    Omfaf Лир ,Г)
    f Йе Йрат 8 ргалчУвчнум
    ff/rrSep cvxmtbapytttcrt fwrnrvmi
    Зародышей пшеницы
    40
    30
    20
    10
    Фиг. 2
SU4239148K 1987-04-29 1987-04-29 Способ получени пептидов и белков в бесклеточной системе трансл ции SU1618761A1 (ru)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SU874239148A SU1441787A1 (ru) 1987-04-29 1987-04-29 Способ получени пептидов и белков в бесклеточной системе трансл ции

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SU1618761A1 true SU1618761A1 (ru) 1991-01-07

Family

ID=21301977

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SU874239148A SU1441787A1 (ru) 1987-04-29 1987-04-29 Способ получени пептидов и белков в бесклеточной системе трансл ции
SU4239148K SU1618761A1 (ru) 1987-04-29 1987-04-29 Способ получени пептидов и белков в бесклеточной системе трансл ции

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SU874239148A SU1441787A1 (ru) 1987-04-29 1987-04-29 Способ получени пептидов и белков в бесклеточной системе трансл ции

Country Status (8)

Country Link
EP (1) EP0312617B1 (ru)
JP (1) JPH07110236B2 (ru)
AT (1) ATE86306T1 (ru)
DE (1) DE3878821D1 (ru)
FI (1) FI886002L (ru)
HU (1) HUT54420A (ru)
SU (2) SU1441787A1 (ru)
WO (1) WO1988008453A1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2169154C2 (ru) * 1999-03-25 2001-06-20 Институт белка РАН Способ получения полипептидов в бесклеточной системе

Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991002074A1 (fr) * 1989-07-31 1991-02-21 Institut Belka Akademii Nauk Sssr Procede d'obtention de polypeptides dans un systeme de translation exempt de cellules
WO1991002075A1 (en) * 1989-07-31 1991-02-21 Institut Belka Akademii Nauk Sssr Method for obtaining polypeptides in a cell-free translation system
CA2064754C (en) * 1989-07-31 1996-06-18 Vladimir Ivanovich Baranov Method of preparing polypeptides in a cell-free translation system
DE4124132A1 (de) * 1990-08-07 1992-02-13 Bendzko Peter Verfahren zur herstellung von peptiden und polypeptiden in einem zellfreien translationssystem
AU4930993A (en) * 1992-09-24 1994-04-12 Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc., The Coupled replication-translation methods and kits for protein synthesis
CA2133355A1 (en) * 1993-10-04 1995-04-05 Itaru Nitta Method for producing polypeptide
US6537776B1 (en) 1999-06-14 2003-03-25 Diversa Corporation Synthetic ligation reassembly in directed evolution
GB9722131D0 (en) 1997-10-20 1997-12-17 Medical Res Council Method
DE10011209A1 (de) 2000-03-08 2001-09-13 Roche Diagnostics Gmbh Matrix-Reaktor und Verfahren zur Herstellung von Produkten in diesem Reaktor
JP4061043B2 (ja) 2000-12-28 2008-03-12 株式会社ポストゲノム研究所 ｉｎｖｉｔｒｏ転写／翻訳系によるペプチド等の製造方法
GB0115841D0 (en) 2001-06-28 2001-08-22 Medical Res Council Ligand
DE10137792A1 (de) * 2001-08-06 2003-02-27 Erdmann Volker Verfahren zur Genexpression
ES2401425T3 (es) 2001-10-25 2013-04-19 Medical Research Council Moléculas
ATE450544T1 (de) 2002-03-01 2009-12-15 Volker A Erdmann Streptavidin-bindungspeptid
US9321832B2 (en) 2002-06-28 2016-04-26 Domantis Limited Ligand
US20060002935A1 (en) 2002-06-28 2006-01-05 Domantis Limited Tumor Necrosis Factor Receptor 1 antagonists and methods of use therefor
JP4441170B2 (ja) 2002-11-28 2010-03-31 独立行政法人理化学研究所 Ｓ１２リボソームタンパク質に変異を有する大腸菌細胞抽出液及びそれを用いる無細胞系によるタンパク質の製造方法
JP4477923B2 (ja) 2003-05-22 2010-06-09 独立行政法人理化学研究所 無細胞タンパク質合成用抽出液の製造方法及びその方法により製造される細胞抽出液
JPWO2005075660A1 (ja) * 2004-02-03 2007-10-11 東洋紡績株式会社 改良された無細胞タンパク質合成用組成物
US7459290B1 (en) 2004-03-30 2008-12-02 Iowa State University Research Foundation, Inc. Methods of using functional 30S subunits
DE102004032460B3 (de) * 2004-06-30 2005-08-18 Rina-Netzwerk Rna Technologien Gmbh Verfahren zur präparativen in vitro Proteinbiosynthese
CN101724071A (zh) 2004-10-08 2010-06-09 杜门蒂斯有限公司 抗肿瘤坏死因子受体1的单域抗体及其使用方法
JP2008029204A (ja) * 2004-11-12 2008-02-14 Cellfree Sciences Co Ltd 無細胞タンパク質合成方法
JP4868731B2 (ja) 2004-11-17 2012-02-01 独立行政法人理化学研究所 哺乳動物培養細胞由来の無細胞タンパク質合成システム
JP4787488B2 (ja) 2004-11-19 2011-10-05 独立行政法人理化学研究所 直鎖状鋳型ｄｎａを用いた無細胞タンパク質合成方法及びそのための細胞抽出液
AU2006226192A1 (en) 2005-03-19 2006-09-28 Medical Research Council Improvements in or relating to treatment and prevention of viral infections
US20110294782A1 (en) 2006-11-10 2011-12-01 Massachusetts Institute Of Technology Small molecule pak inhibitors
EP2213747B1 (en) 2007-11-05 2021-06-30 Riken Method for producing membrane protein
SG157299A1 (en) 2008-05-09 2009-12-29 Agency Science Tech & Res Diagnosis and treatment of kawasaki disease
WO2017022696A1 (ja) 2015-07-31 2017-02-09 国立研究開発法人理化学研究所 膜タンパク質の製造方法およびその利用
CN113365661A (zh) 2019-01-31 2021-09-07 新加坡科技研究局 用于治疗或预防癌症的cnx/erp57抑制剂
JP7531199B2 (ja) 2019-07-19 2024-08-09 大陽日酸株式会社 タンパク質の製造方法及び無細胞タンパク質合成系キット
RU199182U1 (ru) * 2019-12-10 2020-08-19 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт белка Российской академии наук (ИБ РАН) Устройство для синтеза белков в бесклеточной системе

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5748958A (en) * 1980-09-08 1982-03-20 Nippon Chemiphar Co Ltd Cyclohexanecarboxylic acid esters and their acid addition salts
DE3379506D1 (en) * 1983-08-22 1989-05-03 Kyowa Hakko Kogyo Kk Process for producing peptide
JPH0636746B2 (ja) * 1985-08-24 1994-05-18 味の素株式会社 Ｌ―グルタミン酸の製造方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Roberts В.Е. and Paterson B.M. PNAS. 1973, v.70, N 8, р.2330-2334. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2169154C2 (ru) * 1999-03-25 2001-06-20 Институт белка РАН Способ получения полипептидов в бесклеточной системе

Also Published As

Publication number Publication date
SU1441787A1 (ru) 1990-09-23
JPH01503119A (ja) 1989-10-26
DE3878821D1 (de) 1993-04-08
EP0312617B1 (de) 1993-03-03
JPH07110236B2 (ja) 1995-11-29
EP0312617A1 (de) 1989-04-26
HUT54420A (en) 1991-02-28
ATE86306T1 (de) 1993-03-15
WO1988008453A1 (fr) 1988-11-03
FI886002A7 (fi) 1988-12-28
FI886002L (fi) 1988-12-28
EP0312617A4 (en) 1990-07-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SU1618761A1 (ru) Способ получени пептидов и белков в бесклеточной системе трансл ции
SU1705302A1 (ru) Способ препаративной экспрессии генов в бесклеточной системе сопр женной транскрипции/трансл ции
Pascal et al. From the prebiotic synthesis of α-amino acids towards a primitive translation apparatus for the synthesis of peptides
Ponnamperuma et al. Current status of chemical studies on the origin of life
Yamada et al. A high concentration of SecA allows proton motive force-independent translocation of a model secretory protein into Escherichia coli membrane vesicles
Coletti-Previero et al. Alumina-phosphate complexes for immobilization of biomolecules
IS6607A (is) Aðferð við framleiðslu peptíða með notkun umritunar-/þýðingarkerfa í tilraunaglasi
Grosjean et al. Guanosine modifications in runoff transcripts of synthetic transfer RNA-Phe genes microinjected into Xenopus oocytes
Ajmera et al. DNA degradation by bleomycin: evidence for 2'R-proton abstraction and for carbon-oxygen bond cleavage accompanying base propenal formation
Kung et al. Studies on the Role of Ribosomal Proteins L7 and L12 in the in Vitro Synthesis of β-Galactosidase
Liu et al. 5 (4H)-Oxazolones as effective aminoacylation reagents for the 3′-terminus of RNA
Haldane Data needed for a blueprint of the first organism
Weeks et al. Role of ribosomal subunits in eukaryotic protein chain initiation
von der Haar et al. Target Directed Drug Synthesis: The Aminoacyl‐tRNA Synthetases as Possible Targets
IDA et al. Assignment of catalytically essential cysteine residues in aspartase by selective chemical modification with N-(7-dimethylamino-4-methylcoumarynyl) maleimide
Gardner et al. Enzymatic regeneration of ATP from AMP and ADP part i. thermodynamics, kinetics, and process development
Gao et al. Intermolecular Phosphoryl Transfer of N‐Phosphoryl Amino Acids
EP0485608A1 (en) Method for obtaining polypeptides in a cell-free translation system
Dose Prebiotic evolution and the origin of life: Chemical and biochemical aspects
Raacke Chemical aspects of recent hypotheses on protein synthesis
Suto et al. Synthesis of γ-phosphate-linked nucleoside affinity chromatography resins for protein purification, including ribonucleoside triphosphate reductase
Kobayashi Origins of life: the Garakuta world
Gan et al. Discharge plasma for prebiotic chemistry: Pathways to life’s building blocks
Profy et al. Synthesis of 2′(3′)-O-DL-alanyl hexainosinic acid using T4 RNA ligase: suppression of the enzymic reverse transfer reaction by alkaline phosphatase
Iwase et al. A new method for the synthesis of capped oligoribonucleotides by use of an appropriately protected 7-methylguanosine diphosphate derivative as a donor for the triphosphate bond formation