[go: up one dir, main page]

SU1664845A1 - Method for obtaining peptides - Google Patents

Method for obtaining peptides Download PDF

Info

Publication number
SU1664845A1
SU1664845A1 SU867774327A SU7774327A SU1664845A1 SU 1664845 A1 SU1664845 A1 SU 1664845A1 SU 867774327 A SU867774327 A SU 867774327A SU 7774327 A SU7774327 A SU 7774327A SU 1664845 A1 SU1664845 A1 SU 1664845A1
Authority
SU
USSR - Soviet Union
Prior art keywords
ala
nitroanilide
leu
asp
yield
Prior art date
Application number
SU867774327A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Корн Ульрих
Андрей Львович Остерман
Валентин Михайлович Степанов
Татьяна Львовна Воюшина
Людмила Ароновна Люблинская
Грунов Райнер
Original Assignee
Научный Центр По Биотехнологии (Инопредприятие)
Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Научный Центр По Биотехнологии (Инопредприятие), Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов filed Critical Научный Центр По Биотехнологии (Инопредприятие)
Application granted granted Critical
Publication of SU1664845A1 publication Critical patent/SU1664845A1/en

Links

Landscapes

  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение относитс  к способу получени  пептидов, особенно Z-ALA-ALA-LEN-P-нитроанилида и Z-L-ASP-L-PHEOME (аспартама) в присутствии металлопротеиназ. Цель изобретени  - повышение выхода трипептидов (Z-аспартама). Способ заключаетс  в св зывании Z-ALA-ALA с LEN-P-нитроанилидом и Z-L-ASP с L-PHEOME-HCL в присутствии протеиназы из BACILLUS CEREUS ZIMET 10700. МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗУ ИСПОЛЬЗУЮТ В ВИДЕ ФИЛЬТРАТА КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ ИЛИ ОЧИЩЕННОГО АФИННОЙ ХРОМАТОГРАФИЕЙ С БАЦИТРАЦИН-СИЛОХРОМОМ.This invention relates to a method for producing peptides, especially Z-ALA-ALA-LEN-P-nitroanilide and Z-L-ASP-L-PHEOME (aspartame) in the presence of metalloproteinases. The purpose of the invention is to increase the yield of tripeptides (Z-aspartame). A way to connect Z-ALA-ALA .

Description

1 (89) DD 257174 (48) 08.06.881 (89) DD 257174 (48) 08.06.88

(21)7774327/13(21) 7774327/13

(22)03.11.86(22) 11/03/86

(31JWPC 12 Р/284889(31JWPC 12 P / 284889

(32)20.12.85(32) 12.20.85

(33) DD(33) DD

(46)23.07.91. Бюл. №27(46) 07.23.91. Bul №27

(71)Научный центр по биотехнологии (DD), Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов(51)5(71) Biotechnology Research Center (DD), All-Union Scientific Research Institute of Genetics and Selection of Industrial Microorganisms (51) 5

(72)Ульрих Корн (DD), А.Л. Остерман, В.М. Степанов, Т.Л. Воюшина. Л.А. Люблинска  (SU), Райнер Грунов (DD)(72) Ulrich Korn (DD), A.L. Osterman, V.M. Stepanov, T.L. Voyushin L.A. Lublin (SU), Rainer Grunov (DD)

(53) 668.392 (088.8)(53) 668.392 (088.8)

(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ (57) Изобретение относитс  к способу получени  пептидов, особенно Z-Ala-A a-Leu-p- нитроанилида и Z-L-Asp-L-Phe OMe (аспартама) в присутствии металлопротеи- наз. Цель изобретени  - повышение выхода трипептидов (Z-аспартама). Способ заключаетс  в св зывании Z-Ala-Aia с Leu-p-нитро- анилидом и Z-L-Asp с L-PheOMe-HCI в присутствии протеиназы из Bacillus cereus ZIMET 10700 Металлопротеиназуиспользуют в виде фильтрата культуральной жидкости или очищенного афинной хроматографией с бацитрацин-силохромом. 1 з.п ф-лы(57) METHOD FOR OBTAINING PEPTIDES (57) The invention relates to a method for producing peptides, especially Z-Ala-A a-Leu-p-nitroanilide and Z-L-Asp-L-Phe OMe (aspartame) in the presence of metalloprotein. The purpose of the invention is to increase the yield of tripeptides (Z-aspartame). The method involves binding Z-Ala-Aia with Leu-p-nitro-anilide and ZL-Asp with L-PheOMe-HCI in the presence of a proteinase from Bacillus cereus ZIMET 10700 Metalloproteinase used in the form of a filtrate of culture liquid or purified by bacinitacin-silochrom affinity chromatography . 1 z p f-ly

Изобретение относитс  к способу по получению пептидов, особенно Z-Ala-Ala- Leu-p-нитроанилида и Z-L-Asp-L-PheoMe (аспартама), в присутствии металлопротеи- наз.The invention relates to a process for the preparation of peptides, especially Z-Ala-Ala-Leu-p-nitroanilide and Z-L-Asp-L-PheoMe (aspartame), in the presence of metalloproteinis.

Из обзора ISOWA, V, Vu ki Case Kagaku Kycka aishi, 36, 1978, 195-20 известен способ получени  пептидов с использованием протеиназ в качестве катализаторов. При этом используютс  серинпротеи- назы и металлопротеиназы разного биологического происхождени  из Bacillus polymyxa, Bacillus subtilis, Bacillus thermoproteolyticus и др.From the review of ISOWA, V, Vu ki, Case Kagaku Kycka aishi, 36, 1978, 195-20, there is known a method for producing peptides using proteinases as catalysts. In this case, serine proteinases and metalloproteinases of different biological origin from Bacillus polymyxa, Bacillus subtilis, Bacillus thermoproteolyticus, etc. are used.

Недостатком данного способа  вл етс  то, что эти ферменты требуют глубокой очистки .The disadvantage of this method is that these enzymes require deep cleaning.

Из описани  патента ФРГ № 3203292, кл. С 12 Р 21/00, опублик 1985 известен способ получени  пептидов путем св зывани  Z-Ala-Ala с Leu-p-нитроанилидом и Z-L (ЛFrom the description of the patent of Germany No. 3203292, cl. C 12 P 21/00, published 1985, a method for producing peptides by binding Z-Ala-Ala to Leu-p-nitroanilide and Z-L (L

СWITH

Asp с Zthe-оме-НС в присутствии металлопротеиназы .Asp with Zthe-ome-NS in the presence of metalloproteinase.

Недостатком этого способа  вл етс  .о, что при этом образуетс  незначительное количество трипептидовThe disadvantage of this method is that it produces a small amount of tripeptides.

Целью изобретени   вл етс  повышение выхода целевых продуктовThe aim of the invention is to increase the yield of target products.

Металлопротеиназа из В.cereus ZIMET 10700 примен етс  дл  получени  пептида Z-Ala-Ala-Leu-р-нитроанилида или пептида Z-L-Asp-L-PheOMe, при этом установлено, что этот ферментможноиспользоватьтакже в виде фильтрата культуральной жидкости или очищенного аффинной хроматографией с бацитрацин-силохромомThe metalloproteinase from B. cereus ZIMET 10700 is used to prepare the peptide Z-Ala-Ala-Leu-p-nitroanilide or the peptide ZL-Asp-L-PheOMe, and it has been established that bacitracin-silochrome

Эффективность синтеза выше, если примен етс  очищенный фермент. Действенным методом очистки дл  металлопротеиназы из Вас. cereus ZIMET 10700  вл етс  аффинна  хроматографи  с бацитрацин-силохромом В результате очистки получаютThe efficiency of the synthesis is higher if the purified enzyme is used. An effective purification method for metalloproteinases from you. cereus ZIMET 10700 is a bacitracin-silochrome affinity chromatography. As a result of purification,

оabout

4four

оэoh

4 СЛ4 SL

фермент, почти свободный от углеводов и чужих протеинов. Этот фермент позвол ет повысить скорость реакции и выход конечного продукта.an enzyme almost free of carbohydrates and foreign proteins. This enzyme improves the reaction rate and the yield of the final product.

Пример 1. 74 мг Z-A a-Ala и 62 мг Leu-p-нитроанилида раствор ют в 250 мкл диметилформамида и смешивают с 500 мклExample 1. 74 mg of Z-A a-Ala and 62 mg of Leu-p-nitroanilide are dissolved in 250 µl of dimethylformamide and mixed with 500 µl

50мМ трис-HCI, рН 7,5, с 1 мм Са-ацетата, при 35°С и добавл ют 180 мкл фильтрата культуральной жидкости из Вас. cereus ZIMET 10700, содержащего 140 мкг фермента . Концентраци  субстратов при этом составл ет по 200 мкмоль. При перемешивании в течение 25 ч при 35°С получено50 mM Tris-HCl, pH 7.5, with 1 mm Ca-acetate, at 35 ° C and 180 µl of the culture fluid filtrate from you is added. cereus ZIMET 10700, containing 140 μg of enzyme. The concentration of the substrates is 200 µmol each. With stirring for 25 h at 35 ° C obtained

51% продукта. Качественный анализ конеч- ного продукта провод т тонкослойной хроматографией на силикагельных пластинках51% of the product. Qualitative analysis of the final product is carried out by thin layer chromatography on silica gel plates.

в системе н-бутанол : пиридин : уксусна  кислота : вода в соотношении 10:15:3:12, а детектирование в ультрафиолетовом свете после обработки нингидрином и с помощью KJ после хлорировани . Кроме этого , дл  качественного и количественного определени  конечного продукта примен ют HPLC. Детектирование провод т у аб- сорбционного максимума р-нитроанилина (315 нм) после отделени  субстрата от продукта в С18-коло нке в ацетонитрильном градиенте . Дополнительно определ ют выход Z-Ala-Ala-Leu-р-нитроанилида гравиметри- ческим методом после повторной промывки NaHCO, и водой.in the system n-butanol: pyridine: acetic acid: water in the ratio 10: 15: 3: 12, and detection in ultraviolet light after treatment with ninhydrin and using KJ after chlorination. In addition, HPLC is used for the qualitative and quantitative determination of the final product. Detection is carried out at the absorption peak of p-nitroaniline (315 nm) after separation of the substrate from the product in the C18 column in the acetonitrile gradient. Additionally, the yield of Z-Ala-Ala-Leu-p-nitroanilide is determined by a gravimetric method after repeated washing with NaHCO3 and water.

Пример 2. 74 мг Z-Ala-Ala и 62 мг Leu-p-нитроанилида раствор ют в 250 мкл диметилформамида и смешивают с 300 мкл 50 мМ трис-HCI, рН 7,5, с 1 мМ Са-ацетата. Общий объем составл ет 900 мкл, а концентраци  субстратов по 250 мкмоль. После чего довод т температуру до 35 °С, добавл ют 10 мкг фермента из Вас, cereus ZIMET 10700, очищенного аффинной хроматографией , и перемешивают 18 ч при 35°С. Выход Z-Ala-Ala-Leu-р-нитроанилида составл ет 72%.Example 2. 74 mg of Z-Ala-Ala and 62 mg of Leu-p-nitroanilide are dissolved in 250 µl of dimethylformamide and mixed with 300 µl of 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, with 1 mM Ca-acetate. The total volume is 900 µl and the substrate concentration is 250 µmol. Then bring the temperature to 35 ° C, add 10 µg of the enzyme from you, cereus ZIMET 10700, purified by affinity chromatography, and stir for 18 hours at 35 ° C. The yield of Z-Ala-Ala-Leu-p-nitroanilide is 72%.

Пример 3. 24,4 мг Z-Asp раствор ют в 30 мкл 6 н. NaOH и 42,2 мг PheOMe-HCI, раствор ют в 200 мкл диметилформамида и смешивают с 300 мкл 50 мМ трис-HCI, рНExample 3. 24.4 mg of Z-Asp are dissolved in 30 µl of 6N. NaOH and 42.2 mg of PheOMe-HCl is dissolved in 200 µl of dimethylformamide and mixed with 300 µl of 50 mM Tris-HCl, pH

7,5, с 1 мМ Са-ацетата. После нагрева до 35°С добавл ют 100 мкл фильтрата культуральной жидкости, содержащего 110 мкг фермента. После перемешивани  в течение 24 ч выход составл ет 38%, Качественное и количественное определение Z-аспартама соответствует методу примера 1, причем детектирование разделенного HPLC продукта провод т у 220 нм.7.5, with 1 mM Ca-acetate. After heating to 35 ° C, 100 µl of the culture fluid filtrate containing 110 µg of the enzyme is added. After stirring for 24 hours, the yield is 38%. The qualitative and quantitative determination of Z-aspartame corresponds to the method of Example 1, and the HPLC-separated product is detected at 220 nm.

Пример 4, 122 мг Z-Asp раствор ют в 160 мкл 6н. NaOH и 211 мг PheOMe-HCI в 800 мкл 50 мМ трис-HCI, рН 7,5, с 1 мМ Са-ацетата. После нагрева до 35 С добавл ют 1 мг фермента, очищенного аффинной хроматографией, в 100 мкл 50 мМ трис-HCI, рН 7,5, с 1 мМ Са-ацетата. В результате перемешивани  в течение 24 ч получают выход Z-аспартама 54%.Example 4, 122 mg of Z-Asp is dissolved in 160 µl of 6N. NaOH and 211 mg of PheOMe-HCI in 800 μl of 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, with 1 mM Ca-acetate. After heating to 35 ° C, 1 mg of an enzyme purified by affinity chromatography is added in 100 µl of 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, with 1 mM Ca-acetate. As a result of stirring for 24 hours, a yield of Z-aspartame of 54% is obtained.

Пример 5. Способ осуществл ют как в примере 4, причем четвертное количество реактандов раствор ют в 2,5 мл 50 мМ трис- HCI-ном буфере, рН 7,0, с 1,0 м.М Са-ацетата . После повышени  температуры до 35°С добавл ют 3 мг фермента, очищенного аффинной хроматографией. Через 5 ч перемешивани  твердый осадок удал ют центрифугированием, а надосадочную жидкость снова инкубируют. Образующийс  в течение следующих 5 ч осадок оп ть центрифугируют и определ ют количество Z-аспартама . Общий выход составл ет 85%.Example 5. The method is carried out as in Example 4, with a quarter amount of reagents being dissolved in 2.5 ml of 50 mM Tris-HCl buffer, pH 7.0, with 1.0 mM Ca-acetate. After raising the temperature to 35 ° C, 3 mg of the enzyme purified by affinity chromatography is added. After 5 hours of stirring, the solid precipitate is removed by centrifugation, and the supernatant is again incubated. The precipitate formed over the next 5 hours is centrifuged again and the amount of Z-aspartame determined. The overall yield is 85%.

Claims (2)

1.Способ получени  пептидов Z-Ala-Ala- Leu-p-нитроанилида или Z-L-Asp-PheOMe путем св зывани  Z-Ala-Ala с Leu-p-нит- роанилидом или соответственно Z-L-Asp с L-PheOMe-HCI в присутствии металло- протеиназы из Bacillus cereus, отличающийс  тем, что, с целью повышени  выхода целевых продуктов, используют ме- таллопротеиназу из Bacillus cereus ZIMET 10700. .1. A method for producing Z-Ala-Ala-Leu-p-nitroanilide peptides or ZL-Asp-PheOMe by linking Z-Ala-Ala to Leu-p-nitroanilide or ZL-Asp, respectively, with L-PheOMe-HCI in the presence of metalloproteinases from Bacillus cereus, characterized in that, in order to increase the yield of the target products, the metalloproteinase from Bacillus cereus ZIMET 10700 is used. 2.Способ по п.1, о т ли чающийс  тем, что, металлопротеиназу используют в виде фильтрата культуральной жидкости или очищенную афинной хроматографией с бацитрацин-силох ромом.2. The method according to claim 1, wherein metalloproteinase is used as a filtrate of the culture fluid or purified by affinity chromatography with bacitracin-silochrom.
SU867774327A 1985-12-20 1986-11-03 Method for obtaining peptides SU1664845A1 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DD28488985A DD257174A3 (en) 1985-12-20 1985-12-20 PROCESS FOR PREPARING THE PEPTIDES Z ALA ALA LON P NITRANILIDE OR Z ASP ASP PHE OME WITH METALOPROTEASE

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SU1664845A1 true SU1664845A1 (en) 1991-07-23

Family

ID=5574763

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SU867774327A SU1664845A1 (en) 1985-12-20 1986-11-03 Method for obtaining peptides

Country Status (2)

Country Link
DD (1) DD257174A3 (en)
SU (1) SU1664845A1 (en)

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6342476B1 (en) 1994-05-24 2002-01-29 Yeda Research & Development Company Limited Copolymer-1 improvements in compositions of copolymers
US7163802B2 (en) 1998-09-25 2007-01-16 Yeda Research And Development Co., Ltd. Copolymer 1 related polypeptides for use as molecular weight markers and for therapeutic use
US7279172B2 (en) 1998-07-23 2007-10-09 Yeda Research And Development Co., Ltd. Treatment of autoimmune conditions with copolymer 1 and related copolymers
US7425332B2 (en) 1998-07-23 2008-09-16 Yeda Research And Development Co., Ltd. Treatment of autoimmune conditions with Copolymer 1 and related Copolymers
US7429374B2 (en) 2001-12-04 2008-09-30 Teva Pharmaceutical Industries, Ltd. Process for the measurement of the potency of glatiramer acetate
US7495072B2 (en) 2004-09-09 2009-02-24 Teva Pharmaceutical Industries, Ltd. Process for preparation of mixtures of polypeptides using purified hydrobromic acid
US7560100B2 (en) 2004-09-09 2009-07-14 Yeda Research And Development Co., Ltd. Mixtures of polypeptides, compositions containing and processes for preparing same, for treating neurodegenerative diseases
US8536305B2 (en) 2004-10-29 2013-09-17 Sandoz Ag Processes for preparing a polypeptide

Cited By (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7625861B2 (en) 1994-05-24 2009-12-01 Yeda Research And Development Co., Ltd. Copolymer-1 improvements in compositions of copolymers
US6362161B1 (en) 1994-05-24 2002-03-26 Yeda Research & Development Company Limited Copolymer-1 improvements on compositions of copolymers
US6620847B2 (en) 1994-05-24 2003-09-16 Yeda Research And Development Co., Ltd. Copolymer-1 improvements in compositions of copolymers
US6939539B2 (en) 1994-05-24 2005-09-06 Yeda Research & Development Copolymer-1 improvements in compositions of copolymers
US6342476B1 (en) 1994-05-24 2002-01-29 Yeda Research & Development Company Limited Copolymer-1 improvements in compositions of copolymers
US7199098B2 (en) 1994-05-24 2007-04-03 Yeda Research And Development Co., Ltd. Copolymer-1 improvements in compositions of copolymers
US8367605B2 (en) 1994-05-24 2013-02-05 Yeda Research And Development Co. Ltd. Copolymer-1 improvements in compositions of copolymers
US7279172B2 (en) 1998-07-23 2007-10-09 Yeda Research And Development Co., Ltd. Treatment of autoimmune conditions with copolymer 1 and related copolymers
US7425332B2 (en) 1998-07-23 2008-09-16 Yeda Research And Development Co., Ltd. Treatment of autoimmune conditions with Copolymer 1 and related Copolymers
US7163802B2 (en) 1998-09-25 2007-01-16 Yeda Research And Development Co., Ltd. Copolymer 1 related polypeptides for use as molecular weight markers and for therapeutic use
US7615359B2 (en) 1998-09-25 2009-11-10 Yeda Research And Development Co., Ltd. Copolymer 1 related polypeptides for use as molecular weight markers and for therapeutic use
US8399211B2 (en) 1998-09-25 2013-03-19 Yeda Research And Development Co., Ltd. Copolymer 1 related polypeptides for use as molecular weight markers and for therapeutic use
US7923215B2 (en) 2001-12-04 2011-04-12 Teva Pharmaceutical Industries, Ltd. Process for the measurement of the potency of glatiramer acetate
US7429374B2 (en) 2001-12-04 2008-09-30 Teva Pharmaceutical Industries, Ltd. Process for the measurement of the potency of glatiramer acetate
US8389228B2 (en) 2001-12-04 2013-03-05 Teva Pharmaceutical Industries, Ltd. Process for the measurement of the potency of glatiramer acetate
US7560100B2 (en) 2004-09-09 2009-07-14 Yeda Research And Development Co., Ltd. Mixtures of polypeptides, compositions containing and processes for preparing same, for treating neurodegenerative diseases
US7495072B2 (en) 2004-09-09 2009-02-24 Teva Pharmaceutical Industries, Ltd. Process for preparation of mixtures of polypeptides using purified hydrobromic acid
US8536305B2 (en) 2004-10-29 2013-09-17 Sandoz Ag Processes for preparing a polypeptide

Also Published As

Publication number Publication date
DD257174A3 (en) 1988-06-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kam et al. Biotinylated isocoumarins, new inhibitors and reagents for detection, localization, and isolation of serine proteases
Shimkets et al. Induction of coordinated movement of Myxococcus xanthus cells
JP2848461B2 (en) Protein purification method
SU1664845A1 (en) Method for obtaining peptides
Buttle et al. Affinity purification of the novel cysteine proteinase papaya proteinase IV, and papain from papaya latex
MXPA05006836A (en) Protein arrays.
EP0004256A1 (en) Easily split substrates for the quantification of proteases, a process for their production and a method for the quantification of proteases
JPH09504778A (en) Fluorescent energy transfer substrate
CA2436049A1 (en) A serpin in bifidobacteria
JP2008253251A (en) Nucleic acid analog, diagnostic agent and method for using the same in analysis method
CA2447818A1 (en) Method for purifying an enzyme and purified enzyme produced according to this method, as well as use of the enzyme
KR100876518B1 (en) Oligosaccharide Asparagine Derivatives And Preparation Method thereof
CA2075987A1 (en) Method for generating and screening useful peptides
JPS6023087B2 (en) Angiotensin converting enzyme inhibitor
Morcelle et al. Comparative behaviour of proteinases from the latex of Carica papaya and Funastrum clausum as catalysts for the synthesis of Z-Ala-Phe-OMe
Nakata et al. Escherichia coli mutants deficient in the production of alkaline phosphatase isozymes
Stepanov Proteinases as catalysts in peptide synthesis
AU598452B2 (en) Method and apparatus for enzymatic synthesis
JPS60217894A (en) Novel protease and production thereof
US4100028A (en) Method for purification of proteolytic enzymes
ATE113991T1 (en) PROCESS FOR PURIFICATION OF HIGH PURITY HEPARINASE IN BULK.
CA1339874C (en) Dna clone of human type iv collagenase
JPH03251543A (en) Angiotensin conversion enzyme-inhibiting agent
Petkov et al. Amidase Activity of Urokinase I. Hydrolysis of aN-Acetyl-L-Lysine p-Nitroanilide
JP3325107B2 (en) Aqueous two-phase separation method