SK862017A3

SK862017A3 - Spôsob použitia fetálnej frakcie a chromozómovej reprezentácie pri určovaní aneuploidného stavu v neinvazívnom prenatálnom testovaní

Info

Publication number: SK862017A3
Application number: SK86-2017A
Authority: SK
Inventors: Marian Grendár; Dušan Loderer; Zora Lasabová; Ján Danko
Original assignee: Grendar Marian Doc Mgr Phd; Loderer Dusan Rndr; Lasabova Zora Doc Rndr Phd; Danko Jan Prof Mudr Csc
Priority date: 2017-08-24
Filing date: 2017-08-24
Publication date: 2020-05-04
Also published as: EP3447153A1; EP3447153B1

Abstract

Opísaná je metóda na určenie aneuploidného stavu v neinvazívnom prenatálnom testovaní na základe fetálnej frakcie f a chromozómovej reprezentácie t. Metóda používa trojuholník neurčitosti pre trizómiu a trojuholník neurčitosti pre monozómiu, t. j. množiny hodnôt dvojíc (f, t), pre ktoré nie je možné rozhodnúť o aneuploidnom stave.

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka neinvazívneho prenatálneho testovania (medzinárodná klasifikácia G06F19/10, G06F19/24, C12Q1/68). Konkrétne ide o spôsob ako využiť fetálnu frakciu a chromozómovú reprezentáciu pri určení aneuploidného stavu a zvýšiť tak detekčnú schopnosť neinvazívneho prenatálneho testovania.

Doterajší stav techniky

Ak je fetálna frakcia vyššianeždetekčnámedza, je možné pomocou neinvazívneho prenatálneho testovania stanoviť prítomnosť aneuploídie na základe chromozómovej reprezentácie získanej celogenómovým masívnym paralelným sekvenovaním (US2016224724, EP2981921). Ak je však fetálna frakcia nižšia než detekčná medza, tak je analyzovaná vzorka prehlásená za nerozhodnú, bez ohľadu na hodnotu chromozómovej reprezentácie [1].

[1] Tamminga S, a kol. Matemal Plasma DNA and RNA Sequencing for Prenatal Testing. Advances in clinical chemistry. 2016;74:63-102.

Hlavným cieľom tohto vynálezu je poskytnúť metódu na určenie aneuploidného stavuv pienatálnomneinvazívnom testovaníbežných anuploídií, ktorá berie do úvahy fetálnu frakciu /ako aj chromozómovú reprezentáciu t.

Podstata vynálezu

Opísaná je metóda, ktorá na určenie aneuploidného stavuv neinvazívnom prenatálnom testovaní používa fetálnu frakciu ako aj chromozómovú reprezentáciu. Podľa opísanej metódy aneuploidný stav nie je možné určiť vtedy, keď fetálna frakcia /a chromozómová reprezentácia t patria do Trojuholníka Neurčitosti pre Trizómiu (TNT) alebo do Trojuholníka Neurčitosti pre Monozómiu (TNM). Výsledkom tejto metódy je zvýšenie detekčnej schopnostineinvazívneho prenatálneho testovania.

Pojmy a definície • DNA - dcoxyribonukleová kyselina • Voľná cirkulujúca DNA (cfDNA) -fragmenty DNA s rôznou dĺžkou, ktoré sa nenachádzajú v jadre buniek, ale sú lokalizované v telových tekutinách (moč, plazma, sérum) • Voľná cirkulujúca fetálna DNA (cfíDNA) - DNA fragmenty fetálneho pôvodu, ktoré sa nachádzajú v plazme tehotných žien • Fetálna frakcia (f) - množstvo cfíDNA, ktoré sa nachádza v celkovom množstve cfDNA (vyjadrené v percentách) • Nukleotid - základná stavebná jednotka nukleových kyselín (DNA) • Sekvenovanie - určenie primárnej štruktúry DNA, t. j. presného poradia nukleotido v v DNA • Masívne paralelné sekvenovanie (MPS) - simultánne, masívne, paralelné sekvenovanie extrémne veľkého množstva DNA molekúl, ktorého výsledkom sú tzv. sekvenačné čítania • Čítanie - úsek DNA pochádzajúci z konkrétneho chromozómu, osekvenovaný pomocou MPS s určitou dĺžkou • Chromozóm - útvar v bunkovomjadre, pozostávajúciz jednej alebo dvoch molekúl DNA • Autozóm - chromozóm, ktorý nepatrí medzi pohlavné chromozómy (u človeka 22 rôznych typov) • Haploidný stav (n) - počet chromozómov v pohlavnýchbunkách (23 v ľudských pohlavných bunkách) • Euploídia - štandardný počet chromozómov v bunke (ľudská telová bunka má 46 chromozómov) • Aneuploídia - počet chromozómov je zmenený, čo má vo väčšine prípadov za následok vznik vážnych vývinových porúch • Určiť aneuploidný stav - stanoviť, či plod je euploidný alebo aneuploidný • Monozómia - počet chromozómov je 2n-l (45 chromozómov) • Trizómia - počet chromozómov je 2n+l (47 chromozómov) • Euploidný na chromozóme - daný chromozóm je prítomný v bunke v dvoch kópiách • Trizomický na chromozóme - daný chromozóm je prítomný v bunke v troch kópiách • Monozomický na chromozóme - daný chromozóm je prítomný v bunke v jednej kópii • Bežné aneuploídie-trizómia 21 (prítomnosť troch chromozómov 21), trizómia 18 (prítomnosť troch chromozómov 18), trizómia 13 (prítomnosť troch chromozómov 13), monozómia 21 (prítomnosť jedného chromozómu 21), monozómia 18 (prítomnosť jedného chromozómu 18), monozómia 13 (prítomnosť jedného chromozómu 13)

S K 86-2017 Α3 • Chromozómová reprezentácia (t) - počet čítaní, ktoré pochádzajú z konkrétneho chromozómu, alebo subregiónov daného chromozómu. Nazýva satiež chromozómový počet čítaní • Detekčná medza - anglicky, Limit of Detection (LoD). Hodnotafetálnej frakcie, pod ktorou sa podľa štandardnej metódy na určenie aneuploidného stavu nedá tento stav určiť. Detekčná medza sa dá stanoviť napríklad experimentálne. Typicky sapovažuje za blízku k 4 percentám • Nerozhodná vzorka, nerozhodný prípad, ‘no calľ -to isté čo plod, uktorého saneinvazívnymprenatálnym testovaním nevie stanoviť jeho aneuploidný stav • Štandardná metóda na určenie aneuploidného stavu - metóda neinvazívneho prenatálneho testovania, pri ktorej sa vzorka považuje za nerozhodnú, ak fetálna frakcia je nižšia než detekčná medza; a to bez ohľadu na chromozómovú reprezentáciu.

Hlavným cieľom tohto vynálezu je poskytnúť metódu na určenie aneuploidného stavu v prenatálnomneinvazívnom testovaníbežnýchanuploídií, ktorá berie do úvahy fetálnu frakciu/ako aj chromozómovú reprezentáciu t.

Tento cieľ je dosiahnutý pomocou tohto vynálezu, ktorý zahŕňa stanovenie, či dvojica (f, t) patrí do Trojuholníka Neurčitosti pre Trizómiu (TNT), alebo do Trojuholníka Neurčitosti pre Monozómiu (TNM). TNT a TNM sú založené na korešpondenen medzi chromozómovou reprezentáciou a kompozíciou materskej voľnej DNA, ktorá je základom neinvazívneho prenatálneho testovania. Ak kompozícia cfDNA je taká, že pre trizo mické tehotenstvo trojica chromozómov plodu tvorí/percent, a dvojica chromozómov matky tvorí/-/percenf potomvýslednáchromozómová reprezentácia t je t = (l-f)*t^E + 1.5 (*) kde t^E je chromozómová reprezentácia euploidnej matky. V dôsledku technickej variability MPS varírujú hodnoty t^E v určitom rozmedzí [t^_ŕn, ί„_αχ]. Táto variabilita sa prostredníctvom (*) prenáša do variability trizomických vzoriek. Z tohto dôvodu môže pre trizomickú vzorku, pre určité hodnoty fetálnej frakcie / ležať jej chromozómová reprezentácia t v rozsahu t^_ax]. Takže, pre určité hodnoty (f, t) nie je možné určiť aneuploidný stav. Tieto hodnoty tvoria TNT. Analogickou úvahou sa dospeje k TNM.

Trojuholník Neurčitosti pre Trizómiu je tvorený všetkými takými dvojicami (/ t) hodnôt fetálnej frakcie / a chromozómovej reprezentácie t, pre ktoré:

fj* t^E

J J rmn (la) (lb) ľ — ^max (lc)

Pričom, ff_oD je detekčná medza pre trizómiu, t^_n je minimálna hodnota chromozómovej reprezentácie v euploidných vzorkách, a t^_iax je maximálna hodnotachromozómovej reprezentácie v euploidných vzorkách. Detekčná medza pre trizómiu ff_oD je stanovená pomocou nasledovného vzorca: ít^E i r T _ I ^Lmax _ ₁ I 9 /í on — f i I * Z (4) ' min '

Trojuholník Neurčitosti pre Monozómiu je tvorený všetkými takými dvojicami (f t) hodnôt fetálnej frakcie /a chromozómov ej reprezentácie t, pre ktoré:

f j * t^EJ J max (5a) (5b) t tmin(5c)

Pričom, f™_D detekčná medza pre monozómiu, t^_n je minimálna hodnota chromozómovej reprezentácie v euploidných vzorkách, a t^_iax je maximálna hodnotachromozómovej reprezentácie v euploidných vzorkách. Detekčná medza pre monozómiu ff_tD je stanovená pomocou nasledovného vzorca:

í t^E \

Aon =(^--1) *2(6)

Chromozómová reprezentácia sadá určiť pomocou čítaní z celogenómového masívneho paralelného sekvenovania, ktoré súnamapované k referenčnému ľudskému genómu, s možným následnýmfiltrovanim, predspracovaním (napr. pomocou GC korekcie), normalizáciou (napr. podelením počtomčítaní nachádzajúcich sa v autozómoch).

Chromozómová reprezentácia samôže týkať celého chromozómu alebo jeho dizjunktných podúsekov,t. j. segmentov. Odhad minimálnej a maximálnej hodnoty chromozómovej reprezentácie v euploidnej populácn je možné získať na základe vzoriek z euploidnej populácie. Fetálna frakcia sa dá stanoviť laboratórne alebo pomocou in silico algoritmov, napríklad seqFF.

Ak sú obdržané nasledovné údaje o vzorke: i) chromozómová reprezentácia t chromozómu alebo jeho dizjuntkných podúsekov,n) fetálnafrakcia/ a in) minimálna a maximálna hodnotachromozómovej reprezentácie vo vzorkách s potvrdenýmeuploidným stavom, tak potom na stanovenie aneuploidného stavu môže byť použitý nasledovný rozhodovací strom

Ak (f, t) sú také, že:

a) (t > potom aneuploidný stav je stanovený ako trizo mický

b) (t > tL;_n) potom aneuploidný stav je stanovený ako mo no zomrelý

S K 86-2017 Α3

c) (f, t) patria do TNT, potom nie je možné stanoviť aneuploidný stav,

d) (f, t) patria do TNM, potemnie je možné stanoviť aneuploidný stav,

e) ináč; potom aneuploidný stav je stanovený ako euploidný na danom chromozóme.

TNT je možné ekvivalentne formulovať pomocou z-skóre, t. j., škálovanej chromozómovej reprezentácie. Vznikne tak z-skórový Trojuholník Neurčitosti pre Trizómiu (zTNT), daný súčasnýmsplnením nasledovných troch podmienok:

f < fLoD._z(7a) z >k_f * z^_n + (k_f — ľ) * μ^Ε /σ^Ε(7b) z < z^_ax(7c)

Pričom, zje z-skóre vzorky, dané ako z = (t — μ^Ε)/σ^Ε kde t je chromozómová reprezentácia, μ^Ε je odhad polohy rozdelenia chromozómovej reprezentácie (typicky, priemer alebo medián) v populácii euploidnej na danom chromozóme, a σ^Ε je odhad škály rozdelenia chromozómovej reprezentácie (typicky smerodajná odchýlka alebo interkvartilový rozsah) v populácii euploidnej na danom chromozóme. Ďalej, k_f = 1 + 0.5 * /, a z-skórová detekčná medza pre trizómiu na danom chromozóme f[_{oD z} je 2 * (z^E — z^E ) γ v^max ^minJ jLoD ,z z^E· + μ^Ε/σ^Ε a je minimálna hodnota z-skóre na danom chromozóme v euploidný ch vzorkách, z^_ax je maximálna hodnota z-skóre na danom chromozóme v euploidných vzorkách.

Obdobne sa dá TNM ekvivalentne vyjadriť pomocou z-skóre. Vznikne tak z-skórový Trojuholník Neurčitostipre Monozómiu (zTNM).

Horeuvedený rozhodovací strom je možné ekvivalentne formulovať pomocou zTNT a zTNM, a to nasledovným spôsobom Ak z-skóre z a fetálna frakcia / sú také, že:

a)

b) (z > z’énax), potom aneuploidný stav je stanovený ako trizomický, (z < Zmin)> potom aneuploidný stav je stanovený ako mono zo inický.

c) (/ z) patria do zTNT, potemnie je možné stanoviť aneuploidný stav,

d) (f, z) patria do zTNM, potom nie je možné stanoviť aneuploidný stav,

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1: schematické zobrazenie Trojuholníka Neurčitosti pre Trizómiu. Vrcholy TNT sú:(O, t^_ŕn), (0, t^E 1 (f^T t^E 1 ^ιτηαχΛ \JLoD’ 'max JObrázok 2: Z-skórový Trojuholník Neurčitosti pre Trizómiu. Štvorčekom ačíshcou ‘ľ je označená vzorka z Príkladu 1

Obrázok 3: Z-skórový Trojuholník Neurčitosti pre Trizómiu. Štvorčekom a číslicou ‘2’ je označená vzorka, z Príkladu 2

Obrázok 4: Z-skórový Trojuholník Neurčitosti pre Trizómiu. Štvorčekom ačíshcou ‘3’ je označená vzorka z Príkladu 3

Príklaity uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Krok 1) Masívne paralelné sekvenovanie, bioinformatické spracovanie: namapovanie čítaní, filtrovanie, binning, chromozómová reprezentácia

Voľná cirkulujúca DNA zo vzorky krvi tehotnej ženy bola osekvenovanátechnológiou masívneho paralelného sekvenovania. Výsledné čítania boh namapovanék ľudskému genómuhgl9 pomocou algoritmu bowtie2.

Z týchto čítaní boh následne vyfiltrované tie čítania, ktoré boh duplikátne, alebo nekvalitne namapované. Následne boh čítania rozdelené dobinov o veľkost50 kbp (kilo bázových párov). Celkový počet čítaní vo vybranej podmnožine binov bol normalizovaný celkovým počtom čítaní namapovaných na všetky autozómy. Takto bola získaná chromozómová reprezentácia pre chromozóm 21, rovná t = 0.007476537.

Krok 2) Stanovenie minimálnej a maximálnej chromozómovej reprezentácie v podmnožine euploidných tehotenstiev

S K 86-2017 Α3

V sade 99 vzoriek s potvrdenou euploídiou na chromozóme 21 bola minimálna hodnota chromozómovej reprezentácie v tej istej podmnožine binov, ako v Kroku 1, rovná t%_n = 0.007282826. Maximálna hodnota bola Lý_ax = 0.007416512. Čo podľa vzorca (2) dáva detekčnú medzu pre trizómiu 21,//,/ = 0.03671255, t. j., 3.67 %.

Krok 3) Stanovenie ľetálnej frakcie

Fetálna frakcia pre analyzované tehotenstvo bola odhadnutá metódou seqFF, vyvinutou firmou Sequenom Hodnotafetálnej frakcie bola/= 0.02899, t. j., 2.9 %.

Krok 4) Určenie aneuploidného stavu

Hodnota fetálnej frakcie / je nižšia než detekčná medza ///nakoľko 0.02899 < 0.03671255. Takže táto vzorka by podľa tradičného postupu na určovanie aneuploidného stavu bola prehlásená za nerozhodnú; ‘no calľ.

Keď použijeme rozhodovací strom, ktorý sme zaviedh vyššie, tak zistíme, že analyzovaná vzorka patrí do prípadu a), nakoľko chromozómová reprezentácia t = 0.007476 5 37 je vyššia než t/_as. = 0.007416512. To znamená, že danú vzorku rozhodovací strom prehlási za trizomickú.

Ten istý záver získame, v prípade, že použijeme ekvivalentné vyjadrenie rozhodovacieho stromu, využívajúce namiesto chromozómovej reprezentácie z-skóre. Keďže μ^Ε21 = 0.007355081 a σ®²¹ = 2.787415e -05, tak z-skóre uvažovanej vzorky je 4.357. Maximálna hodnota z-skóre vo vzorkách euploidných na chromozóme 21 je 2.203878, takže uvažovaná vzorka spĺňa prvú podmienku z > z^_nax rozhodovacieho stromu, a tedaaneuploidný status vzorky je trizomický; pozri Obr. 2 a na ňom bod označený ‘ľ. Poznamenajme, že u analyzovanej vzorky bola potvrdenátrizómia.

Zhrnutie. Príklad 1 poukazuje na situáciu, kedy tradičný spôsob rozhodovania o aneuploidnom stave nedokáže odhaliť chromozómovú abnormalitu, kvôli nízkej fetálnej frakcn. Tradičný spôsob ale ignoruje informáciu o chromozómovej reprezentácu. Predkladaný vynálezberie túto informáciu do úvahy, ato prostredníctvom rozhodovacieho stromu, založeného na Trojuholníku Neurčitosti pre Trizómiu, alebo ekvivalentne z-skórovom Trojuholníku Neurčitosti pre Trizómiu. U danej vzorky by použitím tradičného spôsobu rozhodovania došlo k tomu, že by nebol rozpoznaný trizomický stav vzorky. Predkladaný vynález by tento stav rozpoznal.

Príklad 2

Pre inú vzorku bola v Kroku 1) získaná chromozómová reprezentácia t = 0.007333882. Fetálna frakcia bola v Kroku 3) odhadnutá/= 0.0323785. Keďže fetálna frakcia /je nižšia než čo v tradičnom postupe na určovanie aneuploidného stavu znamenalo, že daná vzorka je nerozhodná.

Keď použijeme rozhodovací strom uvedený vyššie, zistíme, že nastal prípad e), nakoľko ani jedna z možností a) - d) nie je u tejto vzorky splnená. Následne náš rozhodovací strom stanoví aneuploidný stav vzorky ako euploidný na chromozóme 21.

Ten istý záver získame, v prípade, že použijeme ekvivalentné z-skórové vyjadrenie rozhodovacieho stromu. Keďže z-skóre vzorky je z =-0.760519, kf = 1.016189, z/_ŕn = -2.592162, tak (/,' z) nepatrí do zTNT; pozri Obr. 3, na ktorom je analyzovaná vzorka označená ako ‘2’. Podobne sa zistí, že vzorka nepatrí ani do zTNM. Takže aneuploidný stav vzorky je euploidnosť na chromozóme 21. Poznamenajme, že u vzorky bol potvrdený euploidný stav na chromozóme 21.

Zhrnutie: Príklad 2 ukazuje situáciu, kde tradičný spôsob rozhodovania o aneuploidnom stave nedokáže tento stav stanoviť, kvôli nízkej fetálnej frakcn. Tradičný spôsob ale ignoruje informáciu o chromozómovej reprezentácu. Predkladaný vynález berie túto informáciu do úvahy, a to prostredníctvom rozhodovacieho stromu, založeného na TNT, TNM, alebo ekvivalentne zTNT, zTNM. U danej vzorky by použitím tradičného spôsobu rozhodovania došlo k tomu, že by nebol rozpoznaný euploidný stavvzorky. Predkladaný vynález by tento stav rozpoznal.

Príklad 3

Pre inú vzorku bola v Kroku 1) získaná chromozómová reprezentácia t = 0.007355957.

Fetálna frakcia bola v Kroku 3) odhadnutá/= 0.011386 56. Keďže fetálna frakcia /je nižšia než f^E2jý, tak v tradičnom postupe na určovanie aneuploidného stavu plodu by daná vzorka bola nerozhodná.

Keď použijeme rozhodovací strom uvedený vyššie, tak zistíme, že nastalprípad c), nakoľko / < ff_oD [0.01138656 < 0.03671255], a t > (1 + 0.5 */) * tmin, [0.007355957 > 0.00732429], a t <t!^_ax, [0.007355957 < 0.007416512],

Takže pre danú vzorku nie je možné navrhovanou metódu stanoviť jej aneuploidný stav na chromozóme 21.

K tomu istému záveru dospejeme pomocou ekvivalentného, z-skórového rozhodovacieho stromu. Keďže z-skóre vzorky je z = 0.03144595, ff_{oD z} = 0.03671255, a kf= 1.005693, tak

S K 86-2017 Α3

J — JLoD.Z _μΕ z>k_f* z^_n + (^ - 1) * — < ^zmax tak vzorka patrí do zTNT, pozri Obr. 4 a na ňom bod označený ako ‘3’.

[0.01138656 < 0.03671255] [0.03144595 > -1.104649] [0.03144595 < 2.203878], Analyzovaná vzorka patrí do Trojuholníka Neurčitosti pre Trizómiu, a preto nie je možné stanoviť, či je trizómická alebo euploidná na chromozóme 21. Poznamenajme, že analyzovaná vzorka bola potvrdená ako euploidná.

Zhrnutie: Príklad 3 ukazuje situáciu, kde ani tradičný spôsob rozhodovania o aneuploidnomstave ani predkladaný vynález nedokážu určiť aneuploidný stav. Tradičný spôsob ale ignoruje informáciu o chromozómov ej reprezentácii. Z toho dôvodu je počet vzoriek, u ktorých nedokáže tradičný spôsob stanoviť aneuploidný stav výrazne vyšší, než počet vzoriek, ktoré sa nedajú rozhodnúť predkladaným vynálezom. V analyzovanej sade vzoriek tradičný spôsob zlyhal u 12 vzoriek, zatiaľčo u predkladaného vynálezu to boli iba 4 vzorky. Je to vďaka tomu, že predkladaný vynález berie do úvahy fetálnu frakciu ako aj chromozómovú reprezentáciu, a to prostredníctvom rozhodovacieho stromu, založeného na TNT, TNM, alebo ekvivalentne zTNT, zTNM.

Priemyselná využiteľnosť

Tento vynález ukazuje metódu použitia fetálnej frakcie a chromozómovej reprezentácie pri stanovovaní aneuploidného stavu v neinvazívnom prenatálnom testovaní, založenú na Trojuholníku Neurčitosti pre Trizómiu, a Trojuholníku Neurčitosti pre Monozómiu. Použitie predstavenej metódy môže viesť k výraznému zníženiu zastúpenia nerozhodných prípadov.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Spôsob použitia fetálnej frakcie a chromozómovej reprezentácie pri určovaní aneuploidného stavu v neinvazívnom prenatálnom testovaní, vyznačujúci sa tým, žeza nerozhodný prípad sa prehlási akýkoľvek prípad, u ktorého chromozómový počet čítaní, označený t, a fetálna frakcia, označená / patria do Trojuholníka Neurčitosti pre Trizómiu na danom chromozóme (TNT), ktorý je daný súčasným splnením nasledovných troch podmienok:

J — JLoD t > (1 + 0.5 */) * tmin t t max’ kdeje detekčná medza pre trizómiu na danomchromozóme, určená formulou

Λί A

Ílod = í^-l)*2;

t^nin j^e minimum chromozómového počtu čítaní na danom chromozóme v množine vzoriek euploidných na danomchromozóme, a t^_nax je maximum chromozómového počtu čítaní na danom chromozóme v množine vzoriek euploidných nadanomchromozóme.
2. Spôsob použitia fetálnej frakcie a chromozómovej reprezentácie pri určovaní aneuploidného stavu v neinvazívnom prenatálnom testovaní, vyznačujúci sa tým, žeza nerozhodný prípad sa prehlási akýkoľvek prípad, u ktorého chromozómový počet čítaní na danom chromozóme, označený t, a fetálna frakcia, označená/ patria do Trojuholníka Neurčitosti pre Monozómiu na danomchromozóme (TNM), ktorý je daný súčasnýmsplnením nasledovných troch podmienok:

t < (1 - 0.5 */) * t^_ax t >t^Ekde f^_D je detekčná medza pre monozómiu na danom chromozóme, určená formulou z t^E \ fkoD = 1 - -FH*2;

X '-max·' ^-min J^e minirrrum chromozómového počtu čítaní na danom chromozóme v množine vzoriek euploidných na danom chromozóme, a t^_nax maximum chromozómového počtu čítaní na danom chromozóme v množine vzoriek euploidných na danom chromozóme.
3. Spôsob podľa nároku 1, s chromozomálnou reprezentáciou t nahradenou z-skórom z _z = ^ ^Δ F ’ kde μ^£ je odhad polohy (napr. priemer alebo medián) rozdelenia chromozómového počtu čítaní v populácii euploidnej nadanom chromozóme, σ® je odhad škály (napr. smerodajná odchýlka alebo interkvartilový rozsah) rozdelenia chromozómového počtu čítanív populácii euploidnej na danomchromozóme, vyznačujúci sa tým, že za nerozhodný prípad sa prehlási akýkoľvek prípad, u ktorého z-skóre z, a fetálna frakcia f, patria do Z-skórového Trojuholníka Neurčitosti pre Trizómiu na danom chromozóme (zTNT), ktorý je daný súčasnýmsplnením nasledovných troch podmienok:

^Z — f.o D ,z z > kj * z^_ín + (fcj - 1) * μ^Ε/σ^Ε ^z — ^zmax>

kde _T 2 * (Z^_ax - Z^) ÍLOD,Z ~ E _+μΕ/_σΕ min ' ť- / kj = (1 + 0.5 * /) a je minimálne z-skóre v množine vzoriek euploidných na danom chromozóme, z^_nax je maximálne z

-skóre v množine vzoriek euploidných na danom chromozóme.
4. Spôsob podľa nároku 2, s chromozomálnou reprezentáciou t nahradenou z-skórom z t - μ^Ε ^Z= σ^Ε kde μ^£ je odhad polohy (napr. priemer alebo medián) rozdelenia chromozómového počtu čítaní v populácii euploidnej nadanom chromozóme, / je odhad škály (napr. smerodajná odchýlka alebo interkvartilový rozsah) rozdelenia chromozómového počtu čítanív populácii euploidnej na danomchromozóme, vyznačujúci sa tým, že za nerozhodný prípad sa prehlási akýkoľvek prípad, u ktorého z-skóre z, a fetálna frakcia / patria do Z-skórového Trojuholníka Neurčitosti pre Monozómiu na danom chromozóme (zTNM), ktorý je daný súčasnýmsplnením nasledovných troch podmienok:

^Z < ÍLOD ,z z > k_f ^M * z^_n + (k_f ^M — 1~)*μ^Ε/σ^Ε

S K 86-2017 Α3 kde ,E ‘max· fM

JLoD ,z /J’

2 * fz^E — z^E í _ vmax min J ’^max + V^E/O^E = (1 + 0.5 * f) a z^_ln je minimálne z-skóre v množine vzoriek euploidných na danom chromozóme, z^_(1J je maximálne z

-skóre v množine vzoriek euploidných nadanom chromozóme.
5. Spôsob stanovenia aneuploidného stavu v neinvazívnom prenatálnom testovaní, vyznačujúci satým, že aneuploidný stav je určený pomocou nasledovného rozhodovacieho stromu: ak fetálna frakcia f, a chromozómová reprezentácia t, sú také, že,

a)

b)

c)

d)

e) (í > potom aneuploidný stav je stanovený ako trizomický, (t < t^_ŕn jpotom aneuploidný stav je stanovený ako monozomický, (f, Opatria do TNT, potom nie je možné stanoviť aneuploidný stav, (f, Opatria do TNM, potom nie je možné stanoviť aneuploidný stav, ináč; potom aneuploidný stav je stanovený ako euploidný na danom chromozóme.
6. Spôsob stanovenia aneuploidného stavu v neinvazívnom pienatálnom testovaní, vyznačujúci satým, že aneuploidný stav je určený pomocou nasledovného rozhodovacieho stromu: ak fetálna frakcia f, a z-skóre z, sú také, že,

a)

b)

c)

d)

e) (z > zý_ax), potom aneuploidný stav je stanovený ako trizomický.

(z < Zmŕn), potom aneuploidný stav je stanovený ako monozomický, (f, z) patria do zTNT, potemnie je možné stanoviť aneuploidný stav, (f, z) patria do zTNM, potom nie je možné stanoviť aneuploidný stav, ináč; potom aneuploidný stav je stanovený ako euploidný na danom chromozóme.
7. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že na stanovenie detekčnej medze pie trizómiu na danom chromozóme, f^EoD, sapoužije t^ŕn,t.j., minimum chromozómového počtu čítaní na danom chromozóme vmnožine vzoriek euploidných na danom chromozóme, a L^Ena_XA.ý. maximum chromozómového počtu čítaní na danom chromozóme vmnožine vzoriek euploidných na danom chromozóme, a to podľa formuly ít^E \ f T _ '-max _ JLoD ~ \ f-E J. j * Δ
8. Spôsob podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že na stanovenia detekčnej medze pie monozómiu, sa použije t^_n, t. j., minimum chromozómového počtu čítaní na danom chromozóme v množine vzoriek euploidných na danom chromozóme, a t^_ax, t. j., maximum chromozómového počtu čítaní na danom chromozóme vmnožine vzoriek euploidných na danom chromozóme, a to podľa formuly / t^E- \ f M _ ^Lmm * n

JLoD l -t .£ j \ ''max z
9. Spôsob podľa niektorého z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že namiesto chromozómového počtu čítaní t sapoužije počet čítaní v digunktných subregiónoch daného chromozómu.