SK63998A3

SK63998A3 - Quinoline derivatives, method for the preparation thereof, pharmaceutical composition containing same, and their use

Info

Publication number: SK63998A3
Application number: SK639-98A
Authority: SK
Inventors: Rainer Luond; Villar E Pombo
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 1995-11-14
Filing date: 1996-11-13
Publication date: 1998-10-07
Also published as: BR9611504A; PL326636A1; EP0873338A1; KR19990067574A; TR199800851T2; WO1997018208A1; GB9523267D0; HUP9903492A3; CO4770973A1; CN1202170A; HUP9903492A2; JPH11515000A; CA2235126A1; MX9803839A; AU7570996A; CZ149498A3; PE17598A1

Description

Sú opísané 8-(benzo[c]tiadiazolyl, benzo[c]furazanyl alebo 2-metyl-2H-benzo[d]tiazolyl)chinolíny všeobecného vzorca (I), kde X je atóm -0-, -S- alebo -N(CH₃)-, R¹ je vodík alebo (C|.4)alkyl, R² je (Ci.4)alkyl alebo pyridylová skupina, vo voľnej forme, vo forme N-oxidu alebo adičnej soli s kyselinou, alebo amóniovej soli; spôsob prípravy týchto zlúčenín, farmaceutické prostriedky s ich obsahom a ich použitie ako inhibítorov PDE IV alebo na liečenie astmy.

C31 - Ί$ í

Deriváty chinolínu, spôsob ich prípravy, farmaceutický prostriedok, ktorý ich obsahuje a ich použitie

Oblasť techniky

Vynález sa týka nových derivátov chinolínu, spôsobov ich prípravy, ich použitia ako liečiv a farmaceutických prostriedkov, ktoré ich obsahujú.

Podstata vynálezu

Zistilo sa, že deriváty chinolínu substituované v polohe 8 benzo[c]tiadiazolylovým, benzo[c]furazanylovým alebo 2-metyl-2H-benzo [d]triazolylovým zvyškom (ktoré tvoria celkom novú skupinu zlúčenín), vykazujú veľmi žiaduce a užitočné vlastnosti, ako je opísané nižšie, najmä dobrú účinnosť pri orálnom podaní, zlepšený profil z hľadiska vedľajších účinkov a výraznú selektívnu inhibičnú účinnosť na PDE IV.

Podľa najširšieho uskutočnenia vynález opisuje 8-(benzo-(c)tiadiazolyl, benzo[c]furazanyl alebo 2-metyl-2H-benzo[d]-triazolyl)chinolín vo voľnej forme, vo forme N-oxidu, adičnej soli s kyselinou alebo amóniovej soli. Tento 8-(benzo[c]tiadiazolyl, benzo[c]furazanyl alebo 2-metyl-2H-benzo[d]triazolyl)chinolín je prípadne substituovaný na chinolínovom jadre, napríklad v polohách 3 a/alebo 6. Medzi vhodné substituenty v polohe 3 patrí alkylová skupina s 1 až 4 atómami uhlíka, napríklad metylová skupina, v prítomnosti ktorej ide o 3-alkyl-8-(benzo[c]tiadiazolyl, benzo[c]furazanyl alebo 2-metyl2H-benzo[d]triazolyl)chinolín s 1 až 4 atómami uhlíka v alkylovej časti. Substituenty v polohe 6 sú výhodne naviazané cez atóm uhlíka, t.j. ide o 8-(benzo-[c]tiadiazolyl, benzo[c]furazanyl alebo 2-metyl-2H-benzo[d]triazolyl)-6-karbochinolín alebo 8-(benzo[c]tiadiazolyl, benzo[c]furazanyl alebo 2-metyl-2H-benzo[d]triazolyl)-3-alkyl-6-karbochinolín s 1 až 4 atómami uhlíka v alkylovej časti. Najmä výhodným substituentom v polohe 6 je pyridylmetylová skupina, napríklad pyridín-4-ylmetylová skupina. Medzi výhodné zlúčeniny patrí napríklad

8-(benzo[c]tiadiazolyl, benzo[c]furazanyl alebo 2-metyl-2H-benzo[d]triazolyl)-6-(pyridylmetyl)chinolíny alebo 8-(benzo[c]tiadiazolyl, benzo[c]furazanyl alebo 2-metyl-2H-benzo[d]triazolyl)-3-alkyl-6-(pyridylmetyl)chinolíny s 1 až 4 atómami uhlíka v alkylovej časti, vo voľnej forme, vo forme N-oxidu, adičnej soli s kyselinou alebo amóniové soli.

Benzo[c]tiadiazolylovým zvyškom je zvyšok nasledujúceho vzorca:

Benzo[c]furazanylovým zvyškom je zvyšok nasledujúceho vzorca:

2-metyl-2H-benzo[d]triazolylovým zvyškom je zvyšok nasledujúceho vzorca:

8-(benzo[c]tiadiazolyl, benzo[c]furazanyl alebo 2-metyl-2H-benzo[d]triazolyl)chinolínom podlá vynálezu je výhodne zlúčenina všeobecného vzorca I

N-X (I) v ktorom

X predstavuje atóm kyslíka, atóm síry alebo skupinu

-N(CH₃)- (výhodne atóm kyslíka alebo atóm síry),

R^x znamená atóm vodíka alebo alkylovú skupinu s 1 až 4 atómami uhlíka (výhodne metylovú skupinu alebo atóm vodíka), a

R² predstavuje alkylovú skupinu s 1 až 4 atómami uhlíka alebo pyridylovú skupinu (výhodne 4-pyridylovú skupinu), vo volnej forme alebo vo forme N-oxidu alebo vo forme farmaceutický prijateľnej adičnej soli s kyselinou alebo amóniovej soli.

Vynález napríklad zahŕňa zlúčeniny všeobecného vzorca I, kde X predstavuje atóm kyslíka alebo atóm síry, R^x znamená atóm vodíka alebo alkylovú skupinu s 1 až 4 atómami uhlíka a R² predstavuje alkylovú skupinu s 1 až 4 atómami uhlíka alebo pyridylovú skupinu vo forme volnej zásady alebo adičnej soli s kyselinou.

8-(benzo[c]tiadiazolyl, benzo[c]furazanyl alebo 2-metyl-2H-benzo[d]triazolyl)chinolín podľa vynálezu je výhodne

8-benzo[c]tiadiazolyl-3- alebo -4-yl)- alebo 8-(benzo[c]furazán-3- alebo 4-yl)- alebo 8-(2-metyl-2H-benzo[d]triazol-4 alebo -5-yl)chinolín, výhodne 8-(benzo[c]tiadiazol-4-yl)- ale bo 8-(benzo[c]furazán-4-yl)- alebo 8-(2-metyl-2H-benzo[d]-triazol-4-5-yl)chinolín, napríklad zlúčenina všeobecného vzorca la:

(la) v ktorom majú symboly X, R¹ a R² vyššie definované významy, vo voľnej forme alebo vo forme N-oxidu alebo vo forme farmaceutický prijateľnej adičnej soli s kyselinou alebo amóniovej so- li.

Alkylové skupiny môžu byt s rozvetveným alebo priamym reťazcom, výhodne s priamym reťazcom, pričom výhodná je metylová skupina.

Zlúčeniny podľa vynálezu môžu byť vo voľnej forme alebo môžu byť .asociované s kyselinou pri vzniku adičnej soli s kyselinou alebo s alkylhalogenidom pri vzniku amóniovej soli, alebo môžu byť N-oxidované, pričom tieto rôzne formy molekuly sú považované za farmaceutický prijateľné. Medzi vhodné farmaceutický prijateľné adičné soli s kyselinami na použitie podľa vynálezu ipatria soli s anorganickými kyselinami, napríklad hydrochloridy (soli s kyselinou chlorovodíkovou), a soli s organickými kyselinami, napríklad hydrogénmaleináty (soli s kyselinou maleínovou), alebo oxaláty (soli s kyselinou šťavelovou). Zlúčeniny podľa vynálezu sú vo forme amóniových solí a N-oxidov najmä pokiaľ R² predstavuje pyridylovú skupinu, pričom atóm dusíka v pyridylovom kruhu je alkylovaný alebo oxidovaný, takže medzi amóniové soli patria napríklad N-alkylované (napríklad N-metylované) pyridíniové soli a medzi N-oxidy patria zlúčeniny všeobecného vzorca I alebo la, kde R² predstavuje N-oxopyridylovú skupinu, napríklad 1-oxopyri dín-4-ylovú skupinu.

Podľa ďalšieho uskutočnenia vynález opisuje spôsob prípravy 8-(benzo[c]tiadiazolyl, benzo[c]furazanyl alebo 2-metyl-2H-benzo[d]triazolyl)chinolínu, pri ktorom sa (i) 3—Q- alebo 4-Q-benzo[c]tiadiazol, -benzo[c]furazán alebo -2-metyl-2H-benzo[d]triazol podrobí reakcii s 8-Q’-chinolínom (napríklad prípadne 3-alkylsubstituovanou skupinou s 1 až 4 atómami uhlíka a/alebo 6-karbosubstituovaným), pričom symboly Q a Q’ predstavujú odstupujúce skupiny schopné podieľať sa na krížovej reakcii (napríklad pokiaľ jeden zo symbolov Q a Q' predstavuje atóm halogénu (napríklad brómu) alebo trifluórmetánsulfonylovú skupinu, potom druhý z týchto symbolov znamená výhodne kovovú alebo organokovovú odstupujúcu skupinu (napríklad skupinu B(OH)₂, (CH₃(CH₂)₃)₃Sn-, Li-, CIZn- alebo BrMg-), (ii) produkt sa prípadne N-alkyluje (napríklad reakciou s alkylhalogenidom, napríklad metyljodidom) alebo N-oxiduje (napríklad reakciou s peroxidovým činidlom, napríklad m-chlórperbenzoovou kyselinou), takto získaná zlúčenina sa izoluje vo voľnej forme, vo forme N-oxidu alebo vo forme farmaceutický prijateľnej adičnej soli s kyselinou alebo amóniovej soli.

Reakcia sa účelne uskutočňuje v prítomnosti katalyzátora na báze paládia alebo niklu, prípadne s pridaním ďalších kovov, ako je meď, napríklad v analógii so známymi reakciami, pri ktorých prichádza k spájaniu arylových zoskupení, napríklad Stillovou, Suzukiho, Negishiho alebo Hečkovou reakciou, napríklad ako je opísané v príklade 1. Takto získaný 8-(benzo[c]tiadiazolyl, benzo[c]furazanyl alebo 2-metyl-2H-benzo[d]triazolyl)chinolín je možné izolovať a vyčistit pomocou štandardných spôsobov, napríklad pomocou chromatografických alebo kryštalizačných postupov.

Zlúčeniny všeobecného vzorca I alebo la sa výhodne pripravia napríklad reakciou chinolínu všeobecného vzorca II

(II) v ktorom majú symboly

R¹ vyššie až a R² a Y predstavuje alkylovú skupinu s s. benzo[c]tiadiazolom, benzo[c]furazánom -benzo[d]triazolom všeobecného vzorca III definované významy, atómami uhlíka, alebo 2-metyl-2H-

(III) v ktorom má X vyššie definovaný význam a Z znamená atóm brómu, atóm jódu alebo skupinu SO₃CF₃, a takto získaná zlúčenina sa izoluje vo forme volnej zásady alebo vo forme adičnej soli s kyselinou.

V zlúčeninách všeobecného vzorca II symbol Y výhodne predstavuje butylovú skupinu, napríklad n-butylovú skupinu. V zlúčeninách všeobecného vzorca III symbol Z výhodne znamená atóm brómu.

Východiskové zlúčeniny všeobecného vzorca II je možné pripraviť pomocou známych spôsobov zo zlúčenín všeobecného vzorca IV

R² (IV) v ktorom R² má vyššie definovaný význam, alebo zo zlúčenín (V) všeobecného vzorca V

v ktorom majú symboly R^x a R² vyššie definované významy. Zlúčeniny všeobecného vzorca V je možné získať s použitím 2-R^x-akroleínu v prítomnosti kyseliny. Pokiaľ R^x znamená atóm vodíka, potom je možné akroleín pripraviť in situ (syntéza chinolínu podľa Skraupa).

Zlúčeniny všeobecných vzorcov III a IV sú známe alebo sa dajú pripraviť pomocou známych spôsobov. Napríklad zlúčeninu všeobecného vzorca IV, v ktorom R² predstavuje pyridín-4-ylovú skupinu, je možné pripraviť ako je opísané v medzinárodnej patentovej prihláške WO 94/22852.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Vynález ilustrujú nasledujúce príklady.

Príklad 1

8- (benzo [ c ] f urazan-4-yl) -6- (pyridín-4-ylmetyl) chinolín

I

a) 8-bróm-6-(pyridín-4-ylmetyl)chinolín

Zlúčenina uvedená v názve sa získa Skraupovou syntézou chinolínu, ako opísal Manske R.H.F., Organic Reactions, 7, 59 (1953) s použitím 2-bróm-4-(pyridín-4-ylmetyl)fenylamínu (ako zlúčeniny všeobecného vzorca IV).

R_£ silikagél, zmes hexánu, etylacetátu a etanolu v pomere : 35 : 10) : 0,25

Teplota topenia produktu: 96-99’C

b) 6-(pyridín-4-ylmetyl)-8-tributylstanylchinolín

2»⁵ 9 (8,36 mmol) 8-bróm-6-(pyridín-4-ylmetyl)chinolínu,

5,33 g (9,2 mmol) hexabutyldistananu a 485 mg (0,42 mmol) tetrakis(trifenylfosfín)paládia sa suspenduje v 40 ml toluénu, zmes sa zohrieva do varu pod spätným chladičom v atmosfére argónu počas 24 hodín, a potom sa reakčná zmes nechá vychladnúť na laboratórnu teplotu a sfiltruje sa. Filtrát sa zriedi etylacetátom, premyje sa vodným uhličitanom sodným, vysuší sa síranom sodným a odparí, pričom vzniká žltý olej, ktorý sa potom chromatograficky spracuje sa silikagéli s použitím zmesi hexánu a etylacetátu v pomere 2:1 ako elučného činidla, čím sa získa produkt uvedený v názve vo forme žltého oleja.

R_f (silikagél, zmes hexánu a etylacetátu v pomere 2 : 1): 0,18 Hmotnostná spektrometria ( ionizácia rýchlymi neutrálnymi časticami - fast atóm bombardment (FAB)): 510 (MH+)

c) 8-(benzo[c]furazan-4-yl)-6-(pyridín-4-ylmetyl)chinolín

Suspenzia 420 mg (2,1 mmol) 4-brómbenzo[c]furazánu, 1, 0 g (1,96 mmol) 8-tributylstanyl-6-(pyridín-4-ylmetyl)chinolínu a 20 mg (0,017 mmol) tetrakis(trifenylfosfín)paládia v 15 ml dimetylformamidu sa zohrieva do varu pod spätným chladičom počas 8 hodín, potom sa zmes nechá vychladnúť, zriedi sa etylacetátom a extrahuje sa vodnou kyselinou chlorovodíkovou. Zmiešané vodné extrakty sa zalkalizujú vodným uhličitanom sodným, a extrahujú sa etylacetátom. Organické extrakty sa vysušia síranom sodným, čím sa získa hnedý olej, z ktorého sa kryštalizuje zlúčenina uvedená v názve.

Teplota topenia produktu je 154-157‘C.

Hmotnostná spektrometria (FAB): 339 (MH+)

Príklad 2

8-(benzo[c]tiadiazol—4-yl)-6-(pyridín-4-ylmetyl)chinolín

Zlúčenina uvedená v názve sa získa analogickým spôsobom ako je opísaný v príklade lc), s tým rozdielom, že sa použije

4-brómbenzo[c]tiadiazol. Hydrochlorid produktu má teplotu topenia 150-155°C.

Hmotnostná spektrometria (FAB): 391 (MH+)

Príklad 3

6-(pyridin-4-ylmetyl)-8-(benzo[c]furazan-3-yl)chinolín

Zlúčenina uvedená v názve sa získa analogickým spôsobom äko je opísaný v príklade lc, s tým rozdielom, že sa použije 3-brómbenzo[c]furazán. Teplota topenia produktu je 183-188’C.

Hmotnostná spektrometria (FAB): 339 (MH+)

Príklad 4

8-(benzo[c]furazan-4-yl)-3-metyl-6-(pyridín-4-ylmetyl)chinolín

a) 8-bróm-3-metyl-6- (pyridín-4-ylmetyl) chinolín

Roztok 6,0 g (22,8 mmol) 2-bróm-4-(pyridín-4-ylmetyl)fenylamínu, 4,3 g (22,8 mmol) p-toluénsulfónovej kyseliny a 20,0 ml (228 mmol) metakroleínu v 200 ml toluénu sa zohrieva do varu pod spätným chladičom, v zariadení vybavenom Dean-Starkovou aparatúrou, počas 8 hodín. Reakčná zmes sa nechá vychladnúť cez noc a toluén sa oddekantuje. Živicový zvyšok sa mieša so 150 ml dichlórmetánu a 80 ml nasýteného vodného roztoku uhličitanu draselného, až sa rozpustí. Organická fáza sa oddelí a premyje sa 50 ml roztoku chloridu sodného. Vodná fáza sa extrahuje dvakrát vždy 50 ml dichlórmetánu. Zmiešané organické extrakty sa vysušia síranom horečnatým a odparia, čím sa získa hnedý olej. Produkt sa chromatografic ky izoluje na silikagéli s použitím zmesi hexánu, etylacetátu a etanolu v pomere 65:35:10 ako elučného činidla, pričom R^fproduktu je 0,25. Produkt sa získa vo forme kryštalickej pevnej látky s teplotou topenia 108 až 109’C.

Hmotnostná spektrometria (chemická ionizácia (Cl), C₂H_s):313, 315 (100, MH+)

b) 3-metyl-6-(pyridín-4-ylmetyl)-8-tributylstanylchinolín

Zlúčenina uvedená v názve sa pripraví z 3-metyl-6-(pyridín-4-ylmetyl)-8-brómchinolínu analogickým spôsobom ako je opísaný v príklade lb. Produktom je žltý olej.

R (silikagél, zmes hexánu, etylacetátu a etanolu v pomere 65 : 35 : 10) : 0,5.

Hmotnostná spektrometria (FAB): 523 (M+)

c) 8-(benzo[c]furazan-4-yl)-3-metyl-6-(pyridín-4-yl-metyl)chinolín

Zlúčenina uvedená v názve sa získa z 3-metyl-6-(pyridín-4-ylmetyl)-8-tributylstanylchinolínu a 4-brómbenzo[c]furazanu analogickým spôsobom ako je opísaný v príklade lc).

R_f (silikagél, zmes hexánu, etylacetátu a etanolu v pomere 65 : 35 : 10) : 0,25

Hmotnostná spektrometria (ionizácia nárazom elektrónov - electron impact (El)): 352 (MH+)

Teplota topenia produktu: 193-194'C

Príklad 5

8-(benzo[c]tiadiazol-4-yl)-3-metyl-6-(pyridín-4-ylmetyl)-chinolín

Zlúčenina uvedená v názve sa získa analogickým spôsobom ako je opísaný v príklade 4, s tým rozdielom, že sa použije

4-brómbenzo[c]tiadiazol.

Hmotnostná spektrometria (EI): 367 (100, (M-H)+), 276

Hydrogénmaleinát produktu vykazuje teplotu topenia 147 až 148°C.

Príklad 6

8-(2-metyl-2H-benzo[ ď] triazol-5-yl)-6-(pyridín-4-ylmetyl)-chinolín

a) 5-bróm-2-metyl-2H-benzotriazol (Sandmeyerova reakcia)

K 1,64 g (11 mmol) 5-amino-2-metyl-2H-benzo[d]triazolu (Eur. J. Med. Chem. 1992, 161) sa v 30 ml koncentrovanej kyseliny sírovej pri teplote 10°C pridá 830 mg (12 mmol) dusitanu sodného. Po uplynutí 30 minút sa tento roztok pri teplote 5’C pridá k 1,66 g (11,6 mmol) bromidu meďného v 9 ml 48% kyseliny bromovodíkovej a 9 ml vody, a potom sa zmes zohrieva počas 15 minút na teplotu 90’C. Po extrakcii etylacetátom sa surový olej podrobí velmi rýchlej chromatografii na silikageli s použitím zmesi hexánov a etylacetátu v pomere 2:1 ako elučného činidla. 5-bróm-2-metyl-2H-benzo[d]triazol kryštalizuje vo forme bieložltých ihličiek s teplotou topenia 51-54°C.

^XH-NMR (perdeuterodimetylsulfoxid): 8,25 (s, 1H), 7,93 (d,

1H), 7,55 (d, 1H), 4,50 (s, 3H)

b) 2-metyl-2H-benzo[d]triazol-5-boronová kyselina

500 mg (2,4 mmol) 5-bróm-2-metyl-2H-benzo[d]triazolu a 500 mg (2,6 mmol) triizopropylborátu sa pri teplote -78°C rozpustí v 20 ml tetrahydrofuránu a pridá sa 1,6 ml (2,6 mmol) n-butyllítia v hexánoch. Reakčná zmes sa mieša počas 30 minút pri teplote -78°C a potom počas 3 hodín pri laboratórnej te plote. K reakčnej zmesi sa pridá 20 ml vody, zmes sa okyslí 4N kyselinou chlorovodíkovou a extrahuje sa trikrát vždy 50 ml etylacetátu. Organická fáza sa vysuší nad síranom sodným, sfiltruje sa a odparí, čím sa získa zlúčenina uvedená v názve vo forme bielej pevnej látky s teplotou topenia viac ako 260’0.

^XH-NMR (perdeuterodimetylsulfoxid): 8,39 (s, 1H), 8,24 (s,

2H), 7,88-7,75 (AB-systém, 2H), 4,51 (s, 3H)

c) 8- (2-metyl-2H-benzo [ d ] triazol-5-yl )-6-( pyridín-4-yl-me- týl)chinolín

240 mg (1,36 mmol) 2-metyl-2H-benzo[d]triazol-5-boronovej kyseliny a 470 mg (1,56 mmol) 8-bróm-6-(4-metylpyridyl)chinolínu sa pri teplote 90 ‘C počas 20 hodín udržiava v 40 ml toluénu s prítomnosťou 12 mg paládiumdiacetátu, 17 mg tri-(o-tolyl)fosfínu, 1,8 ml 2M roztoku uhličitanu sodného a 0, 5 ml etanolu. Studená reakčná zmes sa sfiltruje, zriedi sa 80 ml roztoku chloridu sodného a extrahuje sa trikrát vždy 50 ml etylacetátu, vysuší sa nad síranom sodným, sfiltruje sa a odparí. Surový produkt sa vyčistí na silikagéli s použitím etylacetátu ako elučného činidla, čím sa získa nažltlý olej. Teplota topenia oxalátu produktu je 98-103’C.

^XH-NMR (deuterochloroform, voľná zásada): 8,91 (dd, 1H), 8,55 (d, 2H), 8,18 (dd, 1H), 8,08 (s, 1H), 7,92 (d, 1H), 7,71 (dd, 1H), 7,62 (s, 2H), 7,42 (dd, 1H), 7,20 (d, 2H), 4,53 (s, 3H) ,

4,20 (s, 2H)

Hmotnostná spektrometria (EI): 351 (70, M+), 350 (100), 259 (64)

Analýza pre CH NO:

vypočítané: 65,29 % C, 4,30 % H, 15,86 % N, nájdené: 65,17 % C, 4,61 % H, 15,84 % N.

8-(benzo[c]tiadiazolyl, benzo[c]furazanyl alebo 2-metyl13

-2H-benzo[d]triazolyl)chinolíny, napríklad všeobecného vzorca I alebo la, a najmä zlúčeniny z vyššie uvedených príkladov, vo voľnej forme, vo forme N-oxidu, farmaceutický prijateľné adičné soli s kyselinou alebo amóniové soli, ďalej označované ako činidlá podľa vynálezu, vykazujú farmakologickú účinnosť a môžu sa použiť ako liečivá, napríklad na použitie na liečenie ochorení a stavov uvedených ďalej.

činidlá podľa vynálezu sú selektívnymi inhibítormi izoenzýmovej rodiny cAMP-fosfodiesterázy typu IV, a vykazujú relatívne malý účinok na fosfodiesterázové izoenzýmy typov I, II, III a V. V dôsledku toho je možné činidlá podľa vynálezu použiť v prípade stavov, pri ktorých je vhodné zvýšenie hladín cAMP pomocou selektívnej inhibície fosfodiesterázových izoenzýmov typu IV. Pretože zvýšenie hladín cAMP v zápalových bunkách, ako sú eozinofily, inhibuje ich aktiváciu, sú činidlá podľa vynálezu vhodné na použitie pri zápalových stavoch, pri ktorých hrá úlohu aktivácia eozinofilov.

Činidlá podľa vynálezu sú v dôsledku svojho inhibičného účinku na fosfodiesterázu typu IV v ľudských eozinofiloch vhodné na liečenie atopickej a neatopickej astmy, ako dokazujú nižšie opísané modely inhibície PDE (fosfodiesterázy), inhibícia aktivácie eozinofilov a bronchodilatačné modely.

Inhibícia izoenzýmov PDE

Schopnosť zlúčenín podľa vynálezu selektívne inhibovať cAMP-fosfodiesterázu (PDE) typu IV demonštruje nasledujúci test:

Test inhibície ľudskej fosfodiesterázy

Všetky preparáty izoenzýmov sa získajú z ľudských zdrojov. Preparáty typu III a IV sa získajú s využitím toho, že v doštičkách prevládajú izoenzýmy typu III a v neutrofiloch izoenzýmy typu IV, pomocou nasledujúceho postupu:

Odoberie sa ľudská krv, ošetrí sa citrátom, a neutrofily sa oddelia dextránovou sedimentáciou, centrifugáciou podľa hustotného gradientu na zmesi Histopaque 1077 a 1119, s konečnou hustotou 1,089 g/1 a hypotonickou lýzou erytrocytov. Ľudské doštičky z rovnakého zdroja sa premyjú PBS (fosfátom pufrovaným soľným roztokom, so zložením: 140 mM chlorid sodný, .2,7 mM chlorid draselný, 1,5 mM dihydrogénfosforečnan draselný a 8,1 mM hydrogénfosforečnan sodný, pH 7,4). Neutrofily a doštičky sa suspendujú v 10 ml pufru (0,24 M sacharóza, 1 mM EDTA (kyselina etyléndiamíntetraoctová), 1 mM ditiotreitol a 10 mM tris-HCl (tris = tris(hydroxymetyl)aminometán), pH 7,4), ktorý obsahuje nasledujúce roztoky inhibítorov proteáz: roztok fenylmetylsulfonylfluoridu v koncentrácii 5 μΐ/ml (7 mg/ml V 2-propanole), roztoky lepeptínu a pepstatínu A v koncentrácii 1 μΐ/ml (vždy 1 mg/ml v etanole). Po sonikácii počas 15 sekúnd pri teplote 4’C s použitím sonikátora na sonikáciu vzoriek sa homogenáty centrifúgujú pri 2200 g. Sediment sa resuspenduje v 10 ml pufru a sonikácia sa opakuje. Zmiešané su- i pernatanty sa skladujú pri teplote -20’C.

Ďalšie izoenzýmy sa čiastočne purifikujú s použitím chromatografických postupov, ktoré sú opísané v odbore (typy I a V z ľudských pľúcnych buniek, a typ II z ľudských doštičiek). Aktivita PDE (fosfodiesteráz) sa testuje v prítomnosti alebo neprítomnosti testovanej látky pri rôznych koncentráciách pomocou metódy na iónomeničovej kolóne, ako ju opísali Thompson a kol., Nucleotide Res., 10. 69-92 (1979), s použitím 1 μΜ [³H]-cyklického AMP ako substrátu (typy III a IV) alebo 0,5 μΜ draslíka, 0,125 μΜ kalmodulínu a 1,0 μΜ [³H]-cyklického AMP (typ I) alebo 100 μΜ [ ³H]-cyklického AMP (typ II) alebo 1,0 μΜ [³H]-cyklického GMP (typ V).

V tomto teste inhibujú činidlá podľa vynálezu prevažne izoenzýmy PDE typu IV, pričom vykazujú relatívne malý účinok na typy I, II, III a V. V rámci izotypu PDE IV sa činidlá podľa vynálezu ďalej vyznačujú selektivitou voči PDE IV D, pričom napríklad zlúčenina z príkladu 2 inhibuje PDE IV D v nižších ako nanomolárnych koncentráciách.

Protizápalová účinnosť

Inhibícia aktivácie eozinofilov

Neatopickým laboratórnym pracovníkom sa odoberú vzorky krvi s objemom 50 ml, v ktorých sa počty eozinofilov pohybujú v rozsahu 0,06 a 0,47 x 10® l^-1 (Microcellcounter F300, Sysmex). Krv zo žily sa odoberie do centrifugačných kyviet obsahujúcich 5 ml 3,8 % trinátriumacetátu (pH 7,4, Sigma).

Antikoagulačne ošetrená krv sa zriedi v pomere 1 : 1 (objem : objem) fosfátom pufrovaným soľným roztokom (neobsahujúcim ani vápnik ani horčík, Gibco) a v centrifugačnej kyvete s objemom 50 ml (Falcon) sa navrství na 15 ml izotonického Percollu (hustota 1,082 - 1,085 g/ml, pH 7,4, Pharmacia). Po centrifugácii vykonávanej počas 30 minút pri 1000 g a 20 ’C sa jednojadrové bunky na rozhraní plazma/Percoll opatrne odsajú a odstránia.

Sediment neutrofilov, eozinofilov a erytrocytov s objemom asi 5 ml sa opatrne resuspenduje v 35 ml izotonického roztoku chloridu amónneho (155 mM chloridu amónneho,10 mM hydrogénuhličitanu draselného, 0,1 mM EDTA) s teplotou 0 až 4 ⁰C. Po uplynutí 15 minút sa bunky dvakrát premyjú (10 minút, 400 g, teplota 4 ’C) v PBS (fosfátom pufrovanom soľnom roztoku) obsahujúcom fetálne teľacie sérum (2 %, FCS, Gibco).

Na separáciu eozinofilov a neutrofilov sa použije magnetický systém na separáciu buniek (Miltenyi Biotec). Tento systém je vyvinutý na separáciu buniek v suspenzii podľa povrchových markerov, a zahŕňa permanentný magnet, do ktorého je umiestnená kolóna, ktorá obsahuje magnetovateľný oceľový matrix. Pred použitím sa kolóna ekvilibruje počas 1 hodiny s PBS/FCS a potom sa spätne prepláchne ľadovo chladným PBS/FCS s použitím striekačky s objemom 20 ml. Na základňu kolóny sa napojí hypodermická ihla (21G) a touto ihlou sa nechajú odtiecť 1 - 2 ml ľadovo chladného pufru.

Po centrifugácii granulocytov sa odsaje supernatant a bunky sa opatrne resuspendujú so 100 μΐ magnetických častíc (monoklonálna protilátka anti-CD16, konjugovaná so superparamagnetickými časticami firmou Miltenyi Biotec, SRN). Zmes eozinofilov, neutrofilov a magnetických častíc anti-CD16sa inkubuje na ľade počas 40 minút a potom sa zriedi na objem 5 ml ľadovo chladným PBS/FCS. Suspenzia buniek sa pomaly nanesie na horný koniec kolóny a otvorí sa ventil, čím sa umožní pomalý pohyb buniek do oceľového matrixu. Kolóna sa potom premyje 35 ml PBS/FCS, pričom roztok sa opatrne pridáva na horný koniec kolóny tak, aby sa nerozvirovali magneticky označené neutrofily už zachytené v oceľovom matrixe. Neoznačené eozinofily sa izolujú v centrifugačnej kyvete s objemom 50 ml a premyjú sa (10 minút, 400 g, teplota 4 ’C). Výsledný sediment sa resuspenduje v 5 ml Hankovom vyváženom soľnom roztoku (HBSS), takže je možné pred použitím stanoviť počet buniek a čistotu. Separačná kolóna sa odstráni z magnetu a netrofilová frakcia sa vymyje. Kolóna sa potom premyje 50 ml PBS a absolútnym etanolom, a skladuje sa pri teplote 4 ’C.

Celkový počet buniek sa stanoví zariadením na počítanie buniek microcellcounter (Sysmex). K vzorke sa pridá jedna kvapka lyzovacieho roztoku (Sysmex), a po uplynutí 30 sekúnd sa znova spočíta počet buniek na stanovenie kontaminácie erytrocytmi. Uskutoční sa odstredenie na prístroji Shandon Cytospin 2 cytospinner (vzorky s objemom 100 μΐ, 3 minúty pri 500 otáčkach za minútu). Tieto preparáty sa odfarbia (Diff, Quick, Baxter) a svetelnou mikroskopiou sa stanovia diferenciálne počty buniek, pričom sa skúma aspoň 500 buniek. Životaschopnosť buniek sa stanoví vylučovaním trypánovej modrej.

Eozinofily sa zriedia v HBSS a pipetujú sa do mikrotitračných doštičiek s 96 jamkami v množstve 1 - 10 x 10³ buniek na jamku. Každá jamka obsahuje 200 μΐ vzorky, obsahujúcich:

100 μΐ suspenzie eozinofilov, μΐ HBSS, μΐ lucigenínu, μΐ aktivačného stimulátora, a μΐ testovanej zlúčeniny.

Vzorky sa inkubujú s testovanou zlúčeninou alebo nosičom počas 10 minút pred pridaním aktivačného stimulátora fMLP (10 μΜ) rozpusteného v dimetylsulfoxide a potom zriedeným pufrom, takže najvyššia použitá koncentrácia rozpúšťadla predstavuje 1 % (pri 100 μΜ testovanej zlúčeniny). Mikrotitračné doštičky sa trepú na mixéri Titertek MTP (Flow) na uľahčenie premiešania buniek a média, a mikrotitračné doštičky sa umiestnia do luminometra Hamamatsu. Počas 20 minút sa súčasne meria celková chemiluminiscencia a časový profil každej jamky, a výsledky sa vyjadria v relatívnych jednotkách alebo ako percento chemiluminiscencie indukovanej fMLP bez prítomnosti testovanej zlúčeniny. Výsledky sa spracujú Hillovou rovnicou a automaticky sa vypočítajú hodnoty IC_so.

Činidlá podľa vynálezu sú vo vyššie uvedenom teste účinné v koncentráciách rádovo od 0,0001 do 0,5 μΜ, v prípade zlúčenín uvedených v príkladoch všeobecne rádovo asi 1 nM. Napríklad zlúčenina z príkladu 2 vykazuje v tomto teste hodnotu IC_SO 1,9 nM, zatiaľ čo zlúčenina z príkladu 4 vykazuje hodnotu IC 0,71 nM.

„50 ’

Bronchodilatačná účinnosť

Relaxácia ľudskej priedušky

Vzorky ľudských pľúc vybraných v priebehu chirurgického zákroku z dôvodu rakoviny sa získajú v priebehu 3 dní po vybraní. Vyrežú sa malé priedušky s vnútorným priemerom asi 2 až 5 mm, rozrežú sa na časti a umiestnia sa do ampuliek na skladovanie v tekutom dusíku s objemom 2 ml, naplnených fetálnym teľacím sérom (FCS), s obsahom 1,8 M dimetylsulfoxidu (DMSO) a 0,1 M sacharózy ako kryoprotektívnych činidiel. Ampulky sa umiestnia do polystyrénovej krabice s rozmermi 11 x 11 x 22 cm a pomaly sa mrazia priemernou rýchlosťou chladenia asi 0,6 ’C/min v mraziacom zariadení chladiacom na teplotu -70 ’C. Po uplynutí 3-15 hodín sa ampulky prenesú do kvapalného dusíka (teplota -196 ’C), kde sa skladujú až do použitia. Pred použitím sa tkanivá vystavia na 30 - 60 minút pôsobeniu teploty -70 ’C, a potom sa roztavia v priebehu

2,5 minúty umiestnením ampúl do vodného kúpeľa s teplotou 37 ’C. Potom sa časti priedušiek premyjú umiestnením do misky obsahujúcej Krebs-Henseleitov roztok (so zložením: 118 mM chlorid sodný, 4,7 mM chlorid draselný, 1,2 mM síran horečnatý, 1,2 mM chlorid vápenatý, 1,2 mM dihydrogénfosforečnan draselný, 25 mM hydrogénuhličitan sodný, 11 mM glukóza a 0, 03 mM EDTA) s teplotou 37 ’C, narežú sa na krúžky a suspendujú v roztoku na uchovávanie orgánov s objemom 10 ml na meranie izometrického tlaku, s predpätím asi 1 g. Kumulatívnym pridávaním sa vytvoria krivky odpovedí na koncentráciu, pričom koncentrácia sa zvyšuje vždy v okamihu, kedy sa dosiahol maximálny účinok predchádzajúcej koncentrácie. Na konci vytvárania krivky odpovedí na koncentráciu sa pridá 300 pM papaverínu, na vyvolanie úplnej relaxácie krúžkov priedušiek. Tento účinok je považovaný za 100 % relaxáciu.

Vo vyššie uvedenom teste vyvolávajú činidlá podľa vynálezu relaxáciu krúžkov ľudských priedušiek ktorá závisí na koncentrácii pri koncentráciách od 0,001 do 1,0 pM.

Potlačenie bombezínom indukovanej bronchokonstrikcie

Samci morčiat Dunkin-Hartley s hmotnosťou 400 - 800 g, ktorí mali pred pokusom voľný prístup k potrave a vode, sa anestetizujú intraperitoneálnym podaním nátrium-fenobarbitalu v množstve 100 mg/kg a tiež intraperitoneálnym podaním nátrium-pentabarbitalu v množstve 30 mg/kg, a potom sa paralyzujú intramuskulárnym podaním galamínu v množstve 10 mg/kg. Zvieratá, ktorých teplota sa udržiava na 37 ’C pomocou zohrievanej prikrývky, pri riadení rektálnym teplomerom, sa ventilujú tracheálnou kanylou (asi 8 ml/kg, 1 Hz) zmesou vzduchu a kyslíka v pomere 45 : 55 (objem/ob jem). Ventilácia sa monitoruje na priedušnici pneumotachografom (Fleisch,typ 0000), napojeným na diferenciálny transduktor tlaku (MP 4514871, Va lidyne, USA) spojený s respiračnou pumpou. Zmeny tlaku v hrudníku sa priamo monitorujú pomocou intratorakálnou kanylou, s použitím diferenciálneho transduktora tlaku (MP 4524, Validyne, USA), takže je možné merať a zobrazovať rozdiely v tlaku medzi priedušnicou a hrudníkom. Z týchto meraní prietoku vzduchu a transpulmonálneho tlaku sa pre každý dýchací cyklus vypočítava pomocou digitálneho elektronického analyzátora respirácia (PMS 300, Mumetd Ltd., Veľká Británia) rezistencie • dýchacích ciest (R_l, cmH₂0/l/s) a poddajnosť (C^ ). Na krčnej tepne sa meria krvný tlak a srdcová frekvencia s použitím • transduktora tlaku (P23Dd, Gould, USA).

Akonáhle sú hodnoty bazálnej rezistencie a poddajnosti stále, vyvolá sa kontinuálnou intravenóznou infúziou bombezínu v množstve 100 ng/kg/min trvalá bronchokonstrikcia. Bombezín sa užíva rozpustený v 100 % etanole a zriedený fosfátom pufrovaným soľným roztokom.

Testované zlúčeniny sa podávajú keď je reakcia na bombezín maximálna a stabilná (asi 2 minúty po začiatku infú- • zie bombezínu). Pôsobenie proti bronchokonstrikcii sa stanovuje počas 1 hodiny po intratracheálnej alebo intraduodenálnej • inštalácii intravenóznej bolusovej injekcie. Bronchospazmolytická účinnosť sa vyjadrí ako % inhibicie počiatočnej maximálnej rezistencie (R ) po infúzii bombezínu. Vypočítajú sa hodnoty ED_so, ktoré predstavujú dávku spôsobujúcu 50 % redukciu zvýšenia rezistencie vyvolanej bombezínom. Trvanie pôsobenia je definované ako doba v minútach, počas ktorej je bronchokonstrikcia znížená o 50 % alebo viac. Účinky na krvný tlak a srdcovú frekvenciu sú charakterizované hodnotami ED , teda

0 dávkami, ktoré znižujú krvný tlak alebo srdcovú frekvenciu o 20 % (5 minút po podaní).

Testované zlúčeniny sa podávajú buď vo forme roztokov, alebo v prípade intratracheálnej alebo intraduodenálnej instilácie, tiež vo forme vodných suspenzií obsahujúcich v prípade nerozpustných zlúčenín 0,5 % tragantu. Suspenzie sa sonikujú pred aplikáciou počas 5 minút na dosiahnutie malej velkosti častíc.

Každé liečivo sa testuje v 2 až 4 rôznych dávkach (s počtom opakovaní (n) =3 - 4 pre každú dávku). Použije sa adekvátny počet kontrol (5 - 6).

Vo vyššie uvedenom teste vykazujú činidlá podľa vynálezu výraznú bronchodilatačnú účinnosť pri dávkach rádovo od 0,001 do 0,1 mg/kg (pri intravenóznom podaní) alebo 0,1 až 5,0 mg/kg (pri intraduodenálnom podaní).

V súlade s týmčo je uvedené vyššie sú činidlá podľa vynálezu vhodné na liečenie zápalových alebo obštruktívnych ochorení dýchacích ciest alebo iných stavov, ktoré zahŕňajú obštrukciu dýchacích ciest. Vhodné sú najmä na liečenie bronchiálnej astmy.

Vzhľadom na ich protizápalovú účinnosť, ich vplyv na hyperreaktivitu dýchacích ciest a ich profil vzhľadom na inhibíciu izoenzýmov PDE, najmä na ich pôsobenie ako selektívnych inhibítorov typu IV, sú činidlá podľa vynálezu vhodné na liečenie, najmä na profylaktické liečenie, obštruktívnych a zápalových ochorení dýchacích ciest. Tak pri kontinuálnom a pravidelnom podávaní počas dlhšej doby sú činidlá podľa vynálezu vhodné na dosiahnutie vopred pôsobiacej ochrany proti návratu bronchokonstrikcie alebo iného symptomatického ataku v dôsledku obštruktívneho alebo zápalového ochorenia dýchacích ciest alebo na kontrolu, zmiernenie alebo pôsobenie proti bazálnemu stavu takéhoto ochorenia.

Vzhľadom na ich bronchodilatačnú účinnosť sú činidlá podľa vynálezu vhodné ako bronchodilátory, napríklad na liečenie chronickej alebo akútnej bronchokonstrikcie, napríklad na symptomatické liečenie obštruktívneho alebo zápalového ochorenia dýchacích ciest.

Rozumie sa, že slovo liečenie¹’, ako je používané v opise a nárokoch vo vzťahu k obštruktívnym alebo zápalovým ochore niam dýchacích ciest, zahŕňa ako profylaktické tak aj symptomatické spôsoby terapie.

V súlade s tým, čo je uvedené vyššie, vynález ďalej opisuje:

A. Spôsob

a) liečenia hyperreaktivity dýchacích ciest,

b) vyvolania bronchodilatácie, alebo najmä

c) liečenia obštruktívneho alebo zápalového ochorenia dýchacích ciest, najmä astmy, u pacienta, ktorý takéto liečenie potrebuje, pričom tento spôsob zahŕňa podanie účinného množstva činidla podľa vynálezu uvedenému pacientovi.

Medzi obštruktívne alebo zápalové ochorenia dýchacích ciest, ktorých sa vynález týka, patrí astma, pneumokonióza, chronické obštruktívne ochorenia dýchacích ciest alebo chronické obštruktívne pulmonálne ochorenia (COAD alebo COPD) a syndróm respiračnej tiesne dospelých (adult respirátory distress syndróme, ARDS), ako i exacerbácia hyperreaktivity dýchacích ciest v dôsledku liečenia inými liečivami, napríklad aspirínom alebo β-agonistom.

Vynález je možné využiť na liečenie astmy ľubovoľného typu alebo pôvodu, vrátane vnútornej (intrinsic) a najmä vonkajšej (extrinsic) astmy. Je možné využiť ho na liečenie alergickej (atopickej/IgE-šprostredkovanej) astmy. Je možné ho taktiež využiť na liečenie neatopickej astmy, vrátane napríklad bronchitickej astmy, cvičením vyvolanej astmy alebo astmy z povolania, astmy v dôsledku bakteriálnej infekcie alebo nealergických typov astmy. Je možné ho ďalej využiť na liečenie syndrómu sipotu detí (wheezy infant syndróme, detskej, počiatočnej astmy).

Vynález je možné využiť na liečenie pneumokoniózy ľubovoľného typu alebo pôvodu, vrátane napríklad aluminózy, antraknózy, azbestózy, chalikózy, ptilózy, siderózy, silikózy, tobakózy a byssinózy.

Vynález je možné využiť na liečenie chronických obštruktívnych ochorení dýchacích ciest alebo chronických obštruktívnych pulmonálnych ochorení, vrátane chronickej bronchitídy, pulmonálneho emfyzému alebo dušnosti s nimi súvisiacej.

Vynález je možné taktiež využiť na liečenie bronchitídy ľubovoľného typu alebo pôvodu, vrátane napríklad akútnej, arachidickej, katarálnej, chronickej, krupóznej alebo ftinoidnej bronchitídy, atď..

Vzhľadom na ich účinnosť ako selektívnych inhibitorov uvoľňovania TNF-α, sú činidlá podľa vynálezu taktiež vhodné na znižovanie alebo inhibíciu uvoľňovania TNF-α, napríklad na liečenie ochorení alebo stavov, na ktorých sa podieľa uvoľňovanie TNF-α alebo pri ktorých hrá uvoľňovanie TNF-α sprostredkujúcu úlohu, napríklad ochorenia alebo stavy, ktorých etiológia zahŕňa chorobné, napríklad nežiaduce, nadmerné alebo neregulovateľné uvoľňovanie TNF-α, najmä na liečenie kachexie alebo endotoxického šoku a liečenie AIDS.

Spôsob podľa vynálezu je možné využiť na liečenie kachexie súvisiacej s chorobným uvoľňovaním TNF-α alebo chorobnými hladinami TNF-α v sére, ľubovoľného pôvodu, vrátane kachexie v dôsledku napríklad bakteriálnej, vírusovej alebo parazitárnej infekcie, alebo výpadku alebo zhoršení humorálnej alebo inej organickej, napríklad renálnej funkcie. Vynález je možné použiť napríklad na liečenie rakovinovej, malarickej a vermálnej kachexie, kachexie v dôsledku dysfunkcie hypofýzy, štítnej žľazy alebo brzlíka, ako i uremickej kachexie. Vynález je možné využiť najmä na liečenie kachexie súvisiacej s AIDS, napríklad kachexie v dôsledku infekcie HIV alebo súvisiacej s infekciou HIV.

Spôsob podľa vynálezu je možné taktiež využiť na liečenie septického šoku, napríklad šokových stavov v dôsledku bakteriálnej infekcie. V tomto ohľade je potrebné uviesť, že vynález sa týka spôsobu liečenia septického šoku, ako aj stavov, ktoré sú dôsledkom septického šoku alebo ktoré sú symptómami septického šoku, napríklad ARDS (syndrómu respiračnej tiesne dospelých - adult respirátory distress syndróme).

Spôsob podľa vynálezu je ďalej možné využiť na liečenie ochorenia, ktoré je dôsledkom infekcie HIV, napríklad AIDS, napríklad na zlepšenie alebo kontrolu rozvoja tohto ochorenia.

Vzhľadom na ich profil, pokiaľ ide o inhibíciu izoenzýmov PDE a/alebo inhibíciu uvoľňovania TNF-α, ako aj k ich imunosupresívnej činnosti, sú činidlá podľa vynálezu taktiež vhodné ako imunosupresívne činidlá, napríklad na liečenie autoimunitných ochorení,najmä na liečenie autoimunitných ochorení, na ktorých sa podieľajú zápalové procesy, alebo ktoré vykazujú zápalovú komponentu alebo etiológiu, alebo ako protizápalové činidlá na liečenie zápalových ochorení, najmä na liečenie zápalových ochorení na ktorých sa podieľajú autoimunitné reakcie, alebo ktoré vykazujú autoimunitnú komponentu alebo etiológiu.

Medzi príklady takých ochorení, na liečenie ktorých je možné využiť vynález, patria autoimunitné hematologické poruchy (napríklad hemolytická anémia, aplastická anémia, anémia iba červených krviniek a idiopatická trombocytopénia), systémový lupus erythematosus, polychondritída, sklerodermia, Wegenerova granulomatóza, dermatómyozitída, chronická aktívna hapatitída, myasténia gravis, Steven-Johnsonov syndróm, idiopatická sprue, autoimunitné zápalové ochorenie čriev (napríklad ulceratívna kolitída a Crohnova choroba), endokrinná oftalmopatia, Gravesova choroba, sarkoidóza, alveolitída, chronická hypersenzitívna pneumonitída, roztrúsená skleróza, primárna biliárna cirhóza, juvenilný diabetes (diabetes mellitus typu I), uveitída (anterior a posterior), suchá keratokonjunktivitída a vernálna keratokonjunktivitída, intersticiálna fibróza pľúc, psoriatická artritída a glomerulonefritída (s nefrotickým syndrómom alebo bez neho, napríklad vrátane idiopatického nefrotického syndrómu alebo nefropatie s minimálnou zmenou (minimal change nephropathy)), ako aj zápalové a/alebo hyperproliferatívne ochorenia kože, ako je psoriáza, atopická dermatitída, pemfigus a najmä kontaktná dermatitída, napríklad alergická kontaktná dermatitída.

Činidlá podľa vynálezu sú vhodné najmä na liečenie artritídy a iných reumatických alebo zápalových ochorení, najmä na liečenie reumatickej artritídy.

Ako imunosupresíva sú činidlá podľa vynálezu ďalej indikované na použitie na prevenciu odmietnutia štepov, napríklad na udržanie alogénneho orgánového transplantátu alebo podobne, napríklad pokiaľ ide o transplantát obličky, pečene, pľúc, srdca a pľúc, čreva, kostnej drene, kože alebo rohovky.

Vzhľadom na ich protizápalovú účinnosť, najmä pokiaľ ide o inhibíciu aktivácie eozinofilov, sú činidlá podľa vynálezu taktiež vhodné na liečenie porúch súvisiacich s eozinofilmi, napríklad eozinofílie, najmä porúch dýchacích ciest súvisiacich s eozinofilmi (napríklad zahŕňajúcich chorobnú eozinofilovú infiltráciu pulmonálnych tkanív), vrátane hypereozinofílie ovplyvňujúcej dýchacie cesty a/alebo pľúca, ako aj napríklad porúch dýchacích ciest súvisiacich s eozinofilmi, ktoré sú dôsledkom alebo sprievodným javom Lofflerovho syndrómu, eozinofílovej pneumónie, parazitického (najmä metazoálneho) napadnutia (vrátane tropickej eozinofílie), bronchopulmonálnej aspergilózy, uzlovítej polyarteriitídy (vrátane Churg-Straussovho syndrómu), eozinofÍlového granulómu a s eozinofilmi súvisiacich porúch ovplyvňujúcich dýchacie cesty, vyvolaných reakciou na liečivá (drogy).

Vzhľadom na ich schopnosť synergicky interagovať s imunosupresívami a/alebo protizápalovými liečivými látkami sú činidlá podľa vynálezu takisto vhodné ako koterapeutické činidlá na použitie v kombinácii s týmito liečivami, napríklad ako činidlá zosilňujúce terapeutickú účinnosť týchto liečiv alebo ako činidlá znižujúce potrebné dávky alebo potenciálne vedľajšie účinky týchto liečiv. Medzi liečivé látky, s ktorými je možné vhodne spolu podávať činidlá podľa vynálezu, patria napríklad cyklopeptidové, cyklopeptolidové alebo makrolidové imunosupresíva alebo protizápalové látky, napríklad liečivá patriace do skupiny cyklosporínov, napríklad cyklosporíny A alebo G, ďalej látky ako tacrolimus (taktiež známy ako FK .506), ascomycín a rapamycín, a ich rôzne známe podoby a deriváty, ako aj glukokortikosteroidové liečivá. Medzi ochorenia, pri ktorých je možné takúto kombinačnú terapiu (koterapiu) použiť, patria napríklad akékoľvek ochorenia alebo stavy, pri ktorých je potrebné liečenie imunosupresívami alebo protizápalovými liečivami, napríklad ako sú uvedené vyššie. Činidlá podľa vynálezu sú vhodné najmä na použitie v kombinačnej terapii ako je uvedená vyššie, napríklad na účely imunosupresívneho, protizápalového alebo antiastmatického liečenia, napríklad ria dosiahnutie úspory cyklosporínu, napríklad cyklosporínu A, makrolidu alebo steroidu.

Vzhľadom na ich profil pokiaľ ide o inhibíciu izoenzýmov PDE, najmä ich profil ako selektívnych inhibítorov typu IV, sú činidlá podľa vynálezu ďalej vhodné ako inhibítory PDE typu IV, napríklad na liečenie ochorení zahŕňajúcich stratu vápnika z tkaniva, najmä degeneratívnych ochorení kostí a kĺbov zahŕňajúcich stratu vápnika, najmä osteoporózy. V tomto ohľade sú ďalej vhodné na liečenie alergických zápalových ochorení, ako je rinitída, konjunktivitída, atopická dermatitída, žihľavka a gastrointestinálna alergia; ďalej ako vazodilátory, napríklad na liečenie angíny, hypertenzia, hromadeného zlyhania srdca a demencie v dôsledku viacerých infarktov, a na liečenie iných stavov a ochorení, pri ktorých je indikovaná inhibícia PDE IV, napríklad depresie, a stavov a ochorení vyznačujúcich sa zhoršenou kognitívnou funkciou, vrátane Alzheimerovej choroby, Parkinsonovej choroby a mŕtvice.

Účinnosť na centrálny nervový systém

Neuropatológia Parkinsonovej choroby sa vyznačuje degeneráciou dopaminergných neurónov y čiernej hmote. Zvýšenie hladín cAMP v dopaminergných neurónoch zlepšuje ich prežitie v kultúre a chráni ich pred účinkami neurotoxických činidiel. Inhibítory fosfodiesterázy typu IV podľa vynálezu znižujú in vivo úbytok dopamínu indukovaný MPTP (l-metyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridínom) v žíhanom telese (corpus striatum) myší C57BL/6. Ďalej tieto inhibítory čiastočne zabraňujú redukcii počtu neurónov pozitívnych na tyrozín-hydroxylázu, vyvolanej toxínom.

Bunková kultúra, príjem dopamínu alebo MPP* (l-metyl-4-fenylpyridíniového iónu) a prežitie dopaminergných neurónov

Primárne kultúry obsahujúce dopaminergné neuróny sa pripravia z ventrálneho mesencefalónu krysieho plodu E14 a príjem dopamínu alebo MPP* sa meria spôsobom, ktorý opísali Hartikka a kol., J. Neurosci. Res., 32, 190-201, 1992. Kultivačná jamka s priemerom 15 mm zvyčajne obsahuje 6xlO^sneurónov. Príjem dopamínu alebo MPP* sa meria s použitím tritiovaného dopamínu respektíve MPP* pri koncentráciách 50 nM (špecifická aktivita 45 Ci/mmol, New England Nuclear). Prežitie dopaminergných neurónov v kultúre sa stanoví spočítaním neurónov pozitívnych na tyrozínhydroxylázu (TH*), vopred zafarbených myší protilátkou proti tyrozínhydroxyláze (Boehringer Mannheim).

Myši injikované MPTP

Myšiam C57BL/6 sa subkutánne injikuje MPTP alebo fyziologický roztok. Druhá, a v niektorých pokusoch tretia, injekcia MPTP nasleduje o dve a štyri hodiny neskôr. V čase 0, 2 a 4 hodiny sa myšiam orálne podá testovaná zlúčenina vo fyziologickom roztoku alebo rovnaký objem samotného fyziologického roztoku. 0 sedem dní neskôr sa zvieratá usmrtia dekapitáciou a pomocou HPLC sa stanovia monoamíny (Schneider a kol., Science 256, 843-846 (1992)) alebo sa imunocytochemicky vyšetria mozgy na prítomnost tyrozín-hydroxylázy (TH). Na tento účel sa myši intrakardiálne perfundujú 4 % paraformaldehydom a celé mozgy sa ďalej fixujú cez noc v studenom 4 % paraformaldehyde. Z oblasti stredného mozgu sa vyrežú kryosekcie (40 μπι), blokujú sa z dôvodov endogénnych peroxidáz počas 15 minút 0,3% peroxidom v metanole a štiepia sa 0,1 % trypsínom v PBS (fosfátom pufrovanom fyziologickom roztoku) počas 10 minút.

Potom sa uskutočňuje počas 48 hodín pri teplote 4 ’C inkubácia s polyklonálnym králičím antisérom proti tyrozínhydroxyláze (Eugene Tech. International Inc., New Jersey), zriedeným v pomere 1:50 v PBS s 2 % kozieho séra a 0,2 % prípravku Triton-X. Kryosekcie sa ďalej vyvíjajú s použitím súpravy Vectastain Elite ABC Kit (Vector Laboratories, CA, USA) a zosilnia diaminobenzidínom nikelnatým (DAB). Pred reakciou s DAB sa sekcie inkubujú počas 10 minút v 2 % sírane nikelnatom v 0,1 M Tris-HCl s pH 7,4. Tento roztok sa odstráni a nahradí 0,05 % DAB, 0,2 % síranom nikelnatým a 0,3 % peroxidom vodíka v 0,1 M Tris.

Činidlá podľa vynálezu sú v tomto teste účinné. Napríklad myši injikované MPTP, ktorým bola perorálne podaná zlúčenina z príkladu 2 v dávke 4 mg/kg v čase 0, 2 a 4 hodiny, vykazujú hladiny dopamínu o 25 % väčšie oproti zisteným pri neošetrených kontrolách. Činidlá podľa vynálezu je možné teda použiť na inhibíciu straty dopamínu a zvýšeniu hladín dopamínu, a sú teda vhodné napríklad na liečenie Parkinsonovej choroby.

Činidlá podľa vynálezu ďalej podporujú prežitie noradrenergných ako i serotoninergných neurónov v kultúre. Činidlá podľa vynálezu sú teda vhodné na liečenie neurodegeneratívnych chorôb.

Medzi takéto neurodegeneratívne ochorenie patrí primárna degeneratívna demencia, napríklad senilná demencia, najmä senilná demencia Alzheimerovho typu, ako aj senilný mentálny pokles, napríklad senilný kognitívny pokles, a stavy zmätenosti u starších pacientov.

Činidlá podľa vynálezu ďalej zlepšujú prežitie motorických neurónov a senzorických neurónov v kultúre a potláčajú expresiu nádorových nekrotických faktorov (tumor necrosis factors).

Činidlá podlá vynálezu sú preto vhodné na liečenie roztrúsenej sklerózy, amyotrofnej laterálnej sklerózy a iných ochorení motorických neurónov alebo autoimunitných ochorení.

Naviac po injekcii činidiel podlá vynálezu do myší sú pomery DOPAC/dopamín ako aj 5-HIAA/serotonín v žíhanom telese (corpus striatum) zvyšované s faktorom 2 respektíve 1,5. Činidlá podľa vynálezu sú teda vhodné na liečenie depresie.

V súlade s tým, čo je uvedené vyššie, vynález ďalej opisuje:

B. Spôsob

a) znižovania alebo inhibície uvoľňovania TNF-a,

b) inhibície aktivity izoenzýmu PDE IV,

c) uskutočňovanie imunosupresie,

d) liečenie zápalových alebo autoimunitných ochorení alebo stavov,

e) liečenie depresie alebo stavov alebo ochorení vyznačujúcich sa zhoršenou kognitívnou funkciou, vrátane Alzheimerovej choroby, Parkinsonovej choroby a mŕtvice, alebo

f) liečenie ľubovoľného konkrétneho stavu alebo ochorení, ako sú opísané vyššie, u pacienta, ktorý takéto liečenie potrebuje, pričom tento spôsob zahŕňa podanie účinného množstva činidla podľa vynálezu uvedenému pacientovi.

Vynález taktiež opisuje:

C. podľa vynálezu na použitie ako liečivo, napríklad na použitie pri ľubovoľnom spôsobe alebo na liečenie ľubovoľného ochorenia alebo stavu, ako sú opísané vyššie, napríklad ako sú de29 finované vyššie pod bodmi A alebo B, a

D. Farmaceutický prostriedok, ktorý obsahuje činidlo podľa vynálezu, prípadne v kombinácii alebo v spojení s farmaceutický prijateľným riedidlom alebo nosičom pre toto činidlo, napríklad na použitie ľubovoľného spôsobu opísaného vyššie, napríklad ako je definovaný vyššie pod bodom A alebo B, napríklad farmaceutický prostriedok v inhalovateľnej forme alebo v orálnej dávkovacej forme.

Dávky používané pri využívaní vynálezu sa budú samozrejme odlišovať v závislosti napríklad na konkrétnom liečenom ochorení alebo stave, konkrétnom činidle podľa vynálezu, ktoré sa používa, spôsobe podania a požadovanom účinku. Všeobecne sa však indikuje, že uspokojivé výsledky, napríklad pri liečení obštruktívneho alebo zápalového ochorenia, napríklad pri liečení astmy, dosiahnu pri dávkach rádovo od asi 0,01 do 2,0 mg/kg pri perorálnom podaní. U väčších cicavcoch, napríklad ľudí, bude indikovaná denná dávka na orálne podanie, pri liečení hyperreaktivity dýchacích ciest alebo pri liečení zápalových stavov pri obštruktívnom alebo zápalovom ochorení dýchacích ciest, v rozsahu od asi 0,75 do 150 mg, pričom podanie sa vhodne uskutočňuje jedenkrát denne alebo v delených dávkach dva- až štyrikrát denne alebo vo forme s postupným uvoľovaním účinnej látky. Jednotkové dávkovacie formy na orálne podanie teda vhodne obsahujú od asi 0,2 do 75 alebo 150 mg, napríklad od asi 0,2 alebo 2,0 do 50, 75 alebo 100 mg činidiel podľa vynálezu, spolu s farmaceutický prijateľným riedidlom alebo nosičom.

Na použitie na liečenie chronického alebo obštruktívneho ochorenia dýchacích ciest, napríklad astmy, je možné činidlá podľa vynálezu taktiež podávať inhaláciou. Používané dávky sa budú taktiež líšiť napríklad v závislosti na konkrétnom ochorení alebo stave, konkrétnom činidle podľa vynálezu, ktoré sa používa, konkrétnom spôsobe podania (napríklad, či sa aplikácia uskutočňuje inhaláciou suchého prášku alebo inak) a požadovanom účinku. Všeobecne však inhalovaná denná dávka bude rá dovo od asi 2,5 do asi 130,0 /xg/kg/deň, napríklad od asi 13,0 do asi 60,0 Mg/kg/deň. V prípade väčších cicavcov, napríklad ľudí, bude indikovaná denná dávka na inhalačné podanie, napríklad na liečenie astmy, v rozsahu od asi 0,2 do asi 10,0 mg, napríklad od asi 1 do asi 5 mg, pričom aplikácia sa vhodne uskutočňuje jedenkrát denne alebo dvoma alebo troma oddelenými podaniami počas dňa. Zodpovedajúca dávka na každé podanie tak bude rádovo od asi 200 pg do asi 3,3 mg, pri podávaní až trikrát denne, pričom vhodne sa podanie uskutočňuje pomocou inhalačného zariadenia na suchý prášok sériou dvoch až ôsmich aplikácií pri každom podaní.

Podobne sa indikuje, že uspokojivé výsledky pri liečení Parkinsonovej choroby a iných neurodegeneratívnych ochorení, ochorení motorických neurónov alebo autoimunitných ochorení, ako sú ochorenia uvedené vyššie, a depresia, sa dosiahnu pri použití dávok rádovo od asi 0,5 do 5,0 mg/kg perorálne. U väčších cicavcov, napríklad ľudí, bude indikovaná denná dávka na orálne podanie, pri liečení uvedených neurodegeneratívnych ochorení a depresie, v rozsahu od asi 40 do 400 mg, pričom podania sa vhodne uskutočňujú jedenkrát denne alebo v delených dávkach dva- až štyrikrát denne alebo vo forme s postupným uvoľňovaním účinnej látky. Jednotkové dávkovacie formy na orálne podanie teda vhodne obsahujú od asi 10 do 200 alebo 400 mg činidiel podľa vynálezu, spolu s farmaceutický prijateľným riedidlom alebo nosičom.

Činidlá podľa vynálezu je možné ným iným vhodným spôsobom, napríklad liečení septického šoku, nasálne, rinitídy, okulárne, napríklad pri ochorení očí, dermálne, t.j. miestne taktiež podávať ľubovoľinfúziou, napríklad pri napríklad pri liečení liečení autoimunitných na kožu, napríklad pri liečení dermatózy alebo psoriázy, alebo rektálne, napríklad pomocou klystýru alebo čapíkov, napríklad pri liečení zápalového ochorenia čriev. Vhodné dávky na aplikáciu pomocou týchto spôsobov budú všeobecne nižšie, napríklad rádovo desaťkrát až stokrát nižšie, ako dávky potrebné pri orálnom podaní.

Farmaceutické prostriedky obsahujúce činidlá podľa vynálezu je možné pripraviť s použitím bežných riedidiel alebo nosných a pomocných činidiel, ako sú v odbore známe, a pomocou ľubovoľného z postupov známych v odbore vytvárania farmaceutických prostriedkov.

Medzi orálne dávkovacie formy môžu patriť tablety, kapsule a podobne. Prostriedky na inhaláciu môžu obsahovať aerosól alebo iné atomizovateľné formulácie, ako aj inhalovateľné suché prášky, pričom môže alebo nemusí byť prítomné riedidlo, na podanie pomocou ľubovoľného vhodného inhalačného systému na suchý prášok, ako sú' v odbore známe. Formulácie na dermálne podania môžu byť vo forme krémov, mastí, gélov, alebo transdermálnych aplikačných systémov, napríklad náplastí, a okrem inertných riedidiel alebo nosičov môžu vhodne obsahovať činidlá zvyšujúce penetráciu kožou, ako sú taktiež známe v odbore.

7\/

Claims

1. 8-(benzo[c]tiadiazolyl, benzo[c]furazanyl alebo 2-metyl-2H-benzo[d]triazolyl)chinolín vo voľnej forme, vo forme N-oxidu alebo farmaceutický prijateľnej adičnej soli s kyselinou alebo amóniovej soli.

2. 8-(benzo[c]tiadiazolyl, benzo[c]furazanyl alebo 2-metyl-2H-benzo[d]triazolyl)chinolín podľa nároku 1, všeobecného vzorca I v ktorom predstavuje atóm kyslíka, atóm síry alebo skupinu -N(CH₃)-,

R¹ znamená atóm vodíka alebo alkylovú skupinu s 1 až 4 atómami uhlíka, a R² predstavuje alkylovú skupinu alebo pyridylovú skupinu, s 1 až 4 atómami uhlíka vo voľnej forme alebo vo forme N-oxidu alebo vo forme

farmaceutický prijateľnej adičnej soli s kyselinou alebo amóniovej soli.

3. 8-(benzo[c]tiadiazolyl, benzo[c]furazanyl alebo

2-metyl-2H-benzo[d]triazolyl)chinolín podľa nároku 1 alebo 2 vybraný zo skupiny zahŕňajúcej

i) 8-(benzo[c]furazan-4-yl)-6-(pyridíη-4-yl)chinolín, ii) 8-(benzo[c]furazan-4-yl)-3-metyl-6-(pyridín-4-yl)- chinolín, iii) 8-(benzo[c]furazan-3-yl)-6-(pyridín-4-ylmetyl)chinolín, iv) 8-(benzo[c]tiadiazol-4-yl)-6-(pyridín-4-yl)chinolín,

v) 8-(benzo[c]tiadiazol-4-yl)-3-metyl-6-(pyridín-4-yl)-chinolín, a vi) 8-(2-metyl-2H-benzo[d]triazol-5-yl)-6-(pyridíη-4-ylmetyl)chinolín, vo voľnej forme alebo vo forme farmaceutický prijateľnej adičnej amóniovej soli.

N-oxidu alebo vo soli s kyselinou forme alebo

4. 8-(benzo[c]tiadiazolyl, benzo[c]furazanyl alebo 2-metyl-2H-benzo[d]triazolyl)chinolín podľa nároku 1, 2 alebo 3 na použitie ako liečivo.

5. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje 8-(benzo[c]tiadiazolyl, benzo[c]furazanyl alebo 2-metyl-2H-benzo[dJtriazolyl)chinolín podľa nároku 1, 2 alebo 3, prípadne v kombinácii s farmaceutický prijateľným nosičom alebo riedidlom.

6. Použitie 8-(benzo[c]tiadiazolyl, benzo[c]furazanyl alebo 2-metyl-2H-benzo[d]triazolylJchinolínu podľa nároku 1, 2 alebo 3 na prípravu liečiva na liečenie

a) obštruktívneho alebo zápalového ochorenia dýchacích ciest,

b) zápalových alebo autoimunitných ochorení alebo stavov, alebo

c) depresie, Alzheimerovej choroby, Parkinsonovej choroby alebo mŕtvice.

7. Spôsob liečenia

a) obštruktívneho alebo zápalového ochorenia dýchacích ciest,

b) zápalových alebo autoimunitných ochorení alebo stavov, alebo

c) depresie, Alzheimerovej choroby, Parkinsonovej choroby alebo mŕtvice, vyznačujúci sa tým, že sa pacientovi, ktorý takéto liečenie potrebuje, podá účinné množstvo 8-(benzo[c]tiadiazolyl, benzo[c]furazanyl alebo 2-metyl-2H-benzo[d]triazolyl)chinolínu podľa nároku 1, 2 alebo 3.

8. Spôsob prípravy 8-(benzo[c]tiadiazolyl, benzofcjfurazanyl alebo 2-metyl-2H-benzo[d]triazolylJchinolínu podľa nároku 1, 2 alebo 3,vyznačujúci sa tým, že sa (i) 3-Q- alebo 4-Q-benzo[c]tiadiazol, -benzo[c]furazán alebo -2-metyl-2H-benzo[d]triazol podrobí reakcii s 8-Q’-chinolínom, pričom symboly Q a Q' predstavujú odstupujúce skupiny'schopné podieľať sa na krížovej reakcii, (ii) produkt sa prípadne N-alkyluje alebo N-oxiduje, a takto získaný 8-(benzo[c]tiadiazolyl, benzo[c]furazanyl alebo 2-metyl-2H-benzo[d]triazolyl)chinolín sa izoluje vo voľnej forme, vo forme N-oxidu alebo vo forme farmaceutický prijateľnej adičnej soli s kyselinou alebo amóniovej soli.