SK537190A3

SK537190A3 - Method of the factor viii isolation

Info

Publication number: SK537190A3
Application number: SK5371-90A
Authority: SK
Inventors: Per Kaersgaard
Original assignee: Novo Nordisk As
Priority date: 1989-11-09
Filing date: 1990-11-01
Publication date: 1997-12-10
Also published as: BG61231B1; IE904022A1; CN1044121C; DE69017050D1; PL287703A1; HUT60511A; YU47524B; AU6747090A; CA2073012C; EP0524172A1; PT95830B; HU9201551D0; FI922105L; JP2509407B2; NO180741C; NO921839D0; DK162233C; ES2068404T3; HU214905B; BG96316A

Description

SPÔSOB IZOLÁCIE FAKTORIÄ VIII

Oblasť techniky

Vynález sa týka spôsobu izolácie faktory VIII z telesných tekutín ako plazmy pri použití filtrácie na géli ako prvého izolačného stupňa.

Doterajší stav techniky

Faktor VIII, známy tiež ako antihemofilický faktor A alebo AHF, je bielkovina plazmy, ktorá sa zúčastňuje vnútorného mechanizmu zrážania krvi.

Faktor VIII je prítomný v krvnej plazme vo veľmi nízkych koncentráciách vo forme nekovalentného komplexu dvoch bielkovín s koagulačnou účinnosťou faktoru VIII (Faktor VIII : C) a s účinnosťou ristocetínu ako pomocného faktoru (z Willebrandovho faktoru (vWF), komplex má molekulovú hmotnosť 1 až 20 x 10θ.

Faktor VIII chýba alebo je ho veľmi málo u osôb, trpiacich na hemofíliu A, ide približne o 5 osôb zo 100 000.

Faktor von Willenbradov sa viaže na aktivované krvné doštičky takým spôsobom, že podporuje zhlukovanie aktivovaných doštičiek. Tento účinok je možné preukázať in vitro zhlukovaním doštičiek indukovaným ristocetínom. Z tohto dôvodu je možné pozorovať v prípade Willebrandovej choroby predĺženú dobu krvácania v dôsledku toho, že chýba alebo je znížené množstvo Willebrandovho faktoru.

Chorí, trpiaci na hemofíliu A a s ťažkými príznakmi Willebrandovej choroby, sú dnes liečení koncentrátmi s obsahom faktoru VIII: C/vWF, táto liečba zvýši kvalitu ich života a ich práceschopnosť podstatným spôsobom a prispieva tiež k predĺženiu ich života.

Farmaceutické prostriedky, ktoré obsahujú faktor VIII (faktor VIII:C a/alebo vWF), je možné získať z krvi alebo z krvnej plazmy. Tieto prostriedky je možné vyrábať rôznym spôsobom, avšak vždy je výroba spojená s nízkym výťažkom, hlavne v prípade faktorCVVIIľC. Takmer všetky postupy vyžadujú počiatočné čistenie vrátane kryoprecipitácie, pri tomto čistení sa plazma rozmrazí pri teplote 0 až 4 °C, čim dôjde k vzniku zrazeniny, ktorá obsahuje faktor VIII, ktorý je možné oddeliť napríklad odstredením. I keď ide o pomerne jednoduchý postup, má tento postup veľké nevýhody pri použití vo veľkom meradle, napríklad u zmesí plazmy s hmotnosťou viac ako 5 kg poskytuje tento postup nízke výťažky faktorcvVIII.C (30 až 45 % obsahuje v plazme), čo znamená, že konečný výťažok je nízky bez ohľadu na to, aké čistiace postupy sa potom použijú.

Okrem toho sa pri výrobe faktora/VIII zvyčajne zaraďuje stupeň, pri ktorom dochádza k inaktivácii vírusov. Tieto stupne zvyšujú bezpečnosť použitia týchto prostriedkov, avšak vo väčšine prípadov tiež znižujú ešte viac výťažok faktora VIII.C.

Celkovo veľmi nízke výťažky faktortVVIII viedli k jeho nedostatku v rôznych miestach. Je zrejmé, že by boli potrebné nové postupy na čistenie faktoru VIII kvôli jeho získaniu vo väčších množstvách pre potreby hemofilikov.

Najvhodnejšie nové metódy na izoláciu faktorfl/VIII by boli priamo z plazmy,vzhľadom k tomu, že až 70 % obsahu tohto faktora v plazme sa stráca v počiatočných stupňoch, t.j. pri kryoprecipitácii alebo ešte pred ňou.

V súčasnosti boli vykonávané pokusy izolovať faktor VIII z plazmy priamo pri použití afinitnej chromatografie podľa publikácie Thromb. Haemost. 61 (2), 234 až 237 (1989), bol však dosiahnutý výťažok menej ako 60 % a špecifická účinnosť 1 IU (medzinárodná jednotka) faktora Vlll/mg bielkoviny vo frakcii s obsahom faktoru VIII.

Gélová filtrácia alebo chromatografia na géli, pri ktorej zvyčajne dochádza tiež k deleniu podľa veľkosti molekúl, je riadený postup, ktorý sa používa na delenie rozpustených látok podľa ich veľkosti. Rozpustené materiály sa nechajú prejsť poréznymi časticami gélu s veľkosťou pórov, vylučujúcou najväčšie molekuly, pričom menšie molekuly difundujú do stacionárnej fázy vo vnútri častíc gélu. To znamená, že najväčšie častice, celkom vylúčené z gólových častíc, sa vymývajú ako prvé spolu s prázdnym objemom, pričom malé molekuly sa vymývajú až po dlhšej dobe podľa svojej zmenšujúcej sa veľkosti so zvyšujúcim sa eluačným objemom.

Filtráciu na géli je možné vykonávať dvoma rôznymi spôsobmi:

1. Delenie do skupín

Pri tomto postupe sa rozpustené látky delia do dvoch skupín s veľkým rozdielom v molekulových rozmeroch, jedna z týchto skupín sa vymýva už na začiatku s prázdnym objemom, pričom druhá oveľa neskôr v objeme, ktorý často zodpovedá celkovému objemu použitej vrstvy. Tento postup sa používa predovšetkým na delenie bielkovín od rozpustených solí alebo na výmenu pufra a niekedy sa označuje ako odsolenie. Na tento účel sa používajú pevné gély s malým rozmerom pórov a postup je možné vykonávať pri použití veľkého množstva materiálu (objem vzorky môže byť 20 až 30 % objemu vrstvy) a veľkých prietokových rýchlostí (približne objem vrstvy za hodinu), kapacita stĺpca je teda vysoká.

2. Frakcionácia

Pri tomto postupe sa delia rozpustené látky s podobnou veľkosťou molekúl. Ide často o delenie bielkovín. Na tento účel sa používajú častice gélu s veľkými pórmi a materiál pre filtráciu gélom sa použije tak, aby bielkoviny boli vymývané medzi prázdnym objemom a objemom, ktorý je rovný celkovému objemu vrstvy. Jednotlivé látky sa vymývajú veľmi blízko seba a môžu sa prekrývať. Vysoká rýchlosť prietoku je nežiaduca, pretože pri nej nedochádza k účinnému deleniu bielkovín a zaťaženie stĺpca má byť malé, aby bolo možné dosiahnuť dostatočné oddelenie jednotlivých bielkovín. Tento postup je preto odporúčaný pri delení bielkovín až ako posledný čistiaci stupeň, v ktorom už objem, v ktorom sa frakcionácia vykonáva, je malý (Jagschies, Ullmanns Encyclopedia of Industríal Chemistry, zv. B3(10), 1988 a Bio/Technol., 4, 954 až 958 (1986)).

Boli vykonané pokusy izolovať faktor VIII z plazmy pri použití filtrácie na géli podľa J. Lab. Clin. Med., 72 (6), 1968, 1007 - 1008 a J. Clin. Invest. 48, 1969, 957 - 962. Získal sa veľmi čistý produkt, avšak výťažok bol iba 40 až 50 %. Zistilo sa, že čistota frakcií s obsahom faktora VIII závisí od východiskovej plazmy tak, že veľký počet chylomikrónov a vysoký obsah lipidov dáva vznik zakaleným frakciám s obsahom faktora VIII s nízkou špecifickou účinnosťou. Tiež sa pozorovalo, že použitý postup gélovej filtrácie neumožňoval použitie väčších objemov plazmy, hoci predbežné pokusy ukazcvc!:, že by týmto spôsobom bolo možné získať oveľa koncentrovanejšiu Cohnovu frakciu I.

Okrem toho sa v publikácii Paulssen a ďalší, Thromb. Diathes. Haemorr. 22, 1969, 577 - 583 uvádza, že faktor VIII by bolo zrejme možné oddeliť od iných plazmatických bielkovín pri použití gélu Sepharose 6B, avšak že by zrejme chromatografiu na géli bolo možné použiť vo väčšom meradle len v tom prípade, ak by sa ako východiskový materiál použila zrazenina po kryoprecipitačnom stupni po svojom opätovnom rozpustení.

V US patentovom spise č. 3 637 489 sa popisuje postup na delenie krvných zložiek pri použití filtrácie na géli a poréznych sklenených guličiek. Postup je určený najmä na delenie imunologický aktívnych materiálov od iných zložiek krvnej plazmy alebo séra.

Vykonal sa ešte rad pokusov pre použitie filtrácie na géli na čistenie faktora VIII, avšak tieto pokusy sa sústredili na filtráciu čiastočne čistených frakcií plazmy (znova rozpustenej zrazeniny po kryoprecipitácii a iných čistiacich frakcií). Všetky pokusy boli vykonávané pri použití malého objemu vzorky vzhľadom k objemu stĺpca a/alebo malej rýchlosti prietoku alebo pri kombinácii obidvoch týchto opatrení.

Filtrácia na géli ako prostriedok pre frakcionáciu bielkovín je známa od roku 1959 a je široko využívaná v biochemických výskumných laboratóriách ako postup na zisťovanie vlastností bielkovín a čistenie bielkovín zo vzoriek s malým objemom, napríklad menším ako 1 liter. Až doteraz nebol tento postup použitý vo veľkom meradle pre frakcionáciu plazmy alebo delenia bielkovín, jediným použitím bolo odstránenie solí z etanolu a z albumínových roztokov. Uvádza sa napríklad: Hlavným dôvodom, prečo sa nestala filtrácia na géli hlavným postupom pri frakcionácii plazmy, je nízky prietok bielkoviny v pomere k objemu stĺpca - J. H. Berglôf: Fractionation by gel filtration, str. 163 až 173 v J. M. Curling: Methods in Plasma Protein Fractionation, Academic Press, Londýn 1980.

Inde sa uvádza:

Nanešťastie je množstvo bielkoviny, ktoré je možné spracovať pomocou stĺpcov s rozumným objemom, malé a nie je možné zanedbať zriedenie vzorky. Z týchto dôvodov nie je postup príliš využívaný pri frakcionácii plazmy - J. J. Morganthaler a ďalší: Preservation of structure and function during isolation of human plasma proteins, str. 127 - 138 v Smit Sibinga a ďalší: Plasma fractionation and Blood transfusion, Martinus Nijhoff Publishers, Boston 1985.

V US patentovom spise č. 4 675 385 sa popisuje spôsob izolácie faktoru VIII (protokoagulačné bielkoviny) z plazmy s obsahom faktortWI11 alebo z preparátu plazmy, spôsob izolácie vysokomolekulárnych zložiek a nízkomolekulárnych zložiek postupnou vysoko účinnou chromatografiou tak, že sa v prvom stupni pripraví vo vodnom pufre roztok frakcie plazmy a nízkomolekulárne zložky sa oddelia na chromatografickom stĺpci vysokotlakovou kvapalinou chromatografiou pri použití častíc materiálu s rozmerom 13 až 35 pm, ako eluačné činidlo sa použije vodný pufor. Aby sa zaistilo dobré oddelenie, odporúča sa použitie stĺpca s pomerom dĺžky k šírke 10 až 40, čo znižuje kapacitu, avšak nezaručuje dobrú izoláciu faktorttVIII od nízkomolekulárnych zložiek plazmy. Táto prvá izolácia teda nezaistí dobré oddelenie bielkovín s účinnosťou faktoro/VIII:C od iných bielkovinových zložiek plazmy, toto je možné dosiahnuť iba vykonaním ďalšej vysokotlakovej kvapalinovej chromatografie.

Je teda zrejmé, že až doteraz je všeobecne prijímaná skutočnosť, že filtrácia na géli nie je vhodným postupom pre delenie bielkovín pri frakcionácii plazmy, hlavne v prípade použitia väčších objemov, napríklad nad 5 litrov.

V súčasnosti sa neočakávane zistilo, že v prípade, že sa volí materiál pre filtráciu na géli z prostriedkov, určených pre rýchle prietoky, je možné izolovať faktor VIII vo forme čistej frakcie a vo veľmi vysokom vvťažku priamo z plazmy veľmi šetrným mechanickým delením bez toho, aby bola potrebná zvyčajná počiatočná kryoprecipitácia.

Podstata vynálezu

Vynález sa týka spôsobu izolácie faktorcuVIII vo forme komplexu faktoru VIII:C a vWF od iných bielkovín krvnej plazmy pri použití filtrácie na géli.

Spôsob podľa vynálezu spočíva v tom, že sa izolovaná plazma a/alebo čerstvo rozmrazená plazma podrobí filtrácii na géli za podmienok, zvyčajných pre delenie do skupín pri použití veľkého zaťaženia stĺpca a vysokej rýchlosti prietoku,t.j., že objem pridanej plazmy je rovný aspoň 5 % objemu vrstvy materiálu pre filtráciu na géli pri rýchlosti prietoku aspoň 0,3 objemu vrstvy materiálu pre filtráciu na géli za hodinu, pričom gélové filtračné prostredie sa volí z častíc, inertných k faktor&A/lll s frakcionačným rozmedzím 1 x 10^ až 1 x 10⁸, s výhodou 1 x 10^ až 8 x 10?. Frakcionačné rozmedzie môže byť napríklad 5 x 10^ až 4 x 10?

Objem pridanej plazmy je podľa vynálezu aspoň 5 % objemu vrstvy v stĺpci, vo výhodnom vyhotovení je objem plazmy 15 až 40 % tohto objemu.

Spôsob podľa vynálezu sa s výhodou vykonáva pri použití rýchlosti prietoku aspoň 0,3 objemu vrstvy za hodinu, obzvlášť výhodne 0,5 až 2 objemy vrstvy za hodinu.

Pre účely vynálezu má mať prostriedok pre filtráciu na géli rigiditu, ktorá umožní rýchlu eluáciu. Okrem toho musí byť použitý gél chemicky a imunologický inertný vzhľadom k faktoru Vili v priebehu filtrácie. Pokusy ukázali, že spôsob podľa vynálezu je možné vykonávať pri použití bežne dodávaných gélov ako sú Sepharose CL-4B, Sepharose CL-6B, Sepharose 4FF, Sepharose 6FF, Sephacryl S-400, Sephacryl S-500, Fractogel TSK HW65 (F) a Matrex Cellufine CGL 2000. Všetky tieto prostriedky je možné použiť pre účely vynálezu. Tieto typy gélov majú zvyčajne za vlhka veľkosť častíc v rozmedzí 32 až 200 pm.

Podľa jedného vyhotovenia spôsobu podľa vynálezu sa zmrazená plazma nechá : ' 'a zaistí sa rozpustenie všetkého množstva faktorcuVIII, načo sa plazma s výhodou nanesie na stĺpec bezprostredne po rozpustení všetkého množstva faktorcuVIII. S výhodou sa nenechá teplota vystúpiť príliš vysoko, aby nedošlo k príliš veľkej degradácii faktorcuVIII. Plazmu je možné predbežne spracovávať napríklad pridaním heparínu, citrátu, sacharózy, aminokyselín, solí alebo iných stabilizátorov a prípadne sfiltrovať, odstrediť, zahustiť ultrafilträciou, vopred zrážať pri použití bežných zrážacích činidiel alebo vopred spracovávať iným spôsobom pred nanesením na stĺpec, pokiaľ toto spracovanie nemá podstatný vplyv na obsah faktortVVI11 v plazme.

Neočakávane sa zistilo, že spôsob podľa vynálezu poskytuje veľmi vysoké výťažky faktorozVI11. Je možné získať viac ako 70 % pôvodného obsahu faktoru VIII v plazme, okrem toho metóda poskytuje veľmi čisté produkty so špecifickou účinnosťou 1 až 4 IU faktora VIII: C/mg bielkoviny.·Túto skutočnosť je možné čiastočne vysvetliť tým, že spôsobom podľa vynálezu je faktor VIII izolovaný tiež od proteolytických enzýmov, ktoré za zvyčajných okolností spôsobujú pokles obsahu faktorú/VllľC už v skorých štádiách izolácie.

Spôsob podľa vynálezu umožňuje spracovanie veľkých objemov plazmy tak, že je možné naniesť veľké množstvo naraz pri vysokej rýchlosti prietoku pri vysokom výťažku a tiež vysokej čistote. Ide teda o veľmi účinný postup, ktorý je možné priemyselne využiť.

Frakcie z filtrácie na géli, ktoré obsahujú faktor VIII alebo spojené frakcie z väčšieho množstva filtráciou je potom možné koncentrovať a ďalej čistiť pri použití známych postupov ako sú ultrafiltrácia, zrážanie, ionomeničové postupy, afínitná chromatografia a podobne.

Zvyšné plazmatické bielkoviny ako albumín, imunoglobulíny, komplex protrombínu, antitrombín III a ďalšie je možno rovnako izolovať z ďalších frakcií filtrácie na géli pri použití známych postupov ako sú zrážanie alkoholom, zrážanie polyetylénglykolom, chromatografiou a podobne.

Stanovenie účinnosti faktora/ VlIkC je možno vykonávať ako jednostupňové alebo dvojstupňové. Je známe, že každý z týchto postupov môže poskytovať trochu odlišné výsledky v tej istej vzorke. Okrem toho je známe, že pri opakovanom stanovení rovnakým spôsobom môže rovnako dôjsť k určitému rozptylu nameraných hodnôt pre účinnosť faktora VlIkC.

Pod pojmom plazma sa v priebehu prihlášky rozumie krv, z ktorej boli odstránené všetky druhy krviniek a doštičky napríklad odstredením.

Pod pojmom faktor VllkAg sa chápe antigén, vzťahujúci sa k faktoru VIII a vWF-Ag je zodpovedajúci antigén pre Willebrandov faktor.

Pod pojmom objem vrstvy sa chápe objem vrstvy použitého gélu v naplnenom stĺpci spolu s objemom kvapalného prostredia, ktoré táto vrstva obsahuje. Prázdny objem je definovaný ako objem pufra medzi časticami gélu, eluačný objem je objem pufra, použitého na eluáciu špecifického materiálu. Pod pojmom zaťaženie stĺpca sa chápe objem materiálu, naneseného na stĺpec, prepočítaný na objem vrstvy a uvedený v percentách. Pod pojmom frakcionačné rozmedzie sa chápe rozmedzie molekulových hmotností (globulárnych) bielkovín alebo väčších molekúl, pre ktoré je gél odporučený výrobcom.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Spôsob podľa vynálezu bude ďalej vysvetlený s prihliadnutím k priloženým výkresom, ktoré rovnako ako príklady slúžia na objasnenie spôsobu podľa vynálezu.

Na obr. 1 je znázornený graf, ktorý ilustruje eluáciu faktora VIII pri filtrácii na géli spôsobom podľa vynálezu pri stanovení rôznym spôsobom.

Na obr. 2 je znázornené poradie eluácie rôznych bielkovín plazmy pri filtrácii na géli spôsobom podľa vynálezu.

Príklady vyhotovenia vynálezu

Príklad 1

Filtrácia plazmy na géli pre izoláciu faktora VIII

Stĺpec s priemerom 2,6 cm bol naplnený prostriedkom Sepharose CL-4B do výšky 60 cm.

Zmrazená plazma z dánskej krvnej banky bola rozmrazená pri teplote 25 ^§fvo vodnom kúpeli. Potom sa pridalo 1 IU heparínu/ml, 50 ml (16 % objemu vrstvy) plazmy bolo nanesené na stĺpec, rýchlosť prietoku bola 100 ml za hodinu a potom bol stĺpec vymývaný pod tlakom množstvom 200 ml pufra za hodinu, čo zodpovedá rýchlosti 0,63 objemu vrstvy za hodinu. Dosiahnutie rovnovážneho stavu a eluácia boli vykonávané pri použití pufra (0,02 M citrát, 0,15 M NaCl, pH 7,4). K pufru bolo ďalej pridaných 2,55 ml 1 M CaCl2 na liter, to znamená, koncentráciu voľných vápenatých iónov približne 7 x 10^-5 M. Koncentrácia voľných vápenatých iónov bola overená použitím elektródy, selektívne citlivej na vápnik (Ingold GmbH, Frankfurt nad Mohanom, SRN). Boli odoberané frakcie a pre každú frakciu bolo stanovené OD28O. množstvo faktora VIII:C (pri použití jednostupňovej koagulácie i dvojstupňového chromogénneho stanovenia), faktor VIII:Ag albumín, IgG, fibrinogén, IgM, a-2makroglobulín, faktor IX, faktor X, bielkovina C a antitrombín III. Bielkovina, meraná pri OD28O. bola vymývaná pri prázdnom objeme (frakcia 10 až 18), potom nasledoval veľký a široký vrchol (frakcia 19 až 50, obr. 1). Dvojstupňovou chromogénnou skúškou sa zistilo 82 °^Ä. faktorCU VlllzC, jednostupňovou koagulačnou skúškou 91 % faktora/VIII:C, a to v jedinom vrchole spoločne s malým vrcholom pre bielkoviny. Zvyšok faktora Vili bol vymytý ako malý následný vrchol bezprostredne po hlavnej frakcii (frakcie 19 až 25). Faktory Vlll:Ag a vWF:Ag boli vymyté spoločne s faktorom VlllzC, avšak mali širšie následné vrcholy. Všetky ostatné bielkoviny plazmy, ktoré boli stanovené, boli vymyté vo frakcii, nasledujúcej po frakcii s obsahom faktoru VIII spolu s veľkým a širokým vrcholom pre bielkoviny, ako je znázornené na obr. 2. Plazmatické bielkoviny, ktoré boli oddelené od faktora VlllzC, mali nasledujúce molekulové hmotnosti:

Antitrombín III 65 000

Bielkovina C 62 000

Faktor X 59 000

Faktor IX 57 000 α-2-makroglobulín 718 000

IgM 900 000

Fibrinogén 340 000

IgG 150 000

Albumín 67 000

Stanovenie účinnosti faktora/ VlllzC pri použití dvojstupňovej chromogénnej skúšky bolo vykonané pri použití chromogénneho substrátu (KABI Coatest Factor VIII), pôvodná metóda s použitím skúmaviek bola modifikovaná tak, aby bolo možné použiť mikrotitračné platne pri nižšom množstve reakčných zložiek. Skúška sa vykonáva pri 37 °C. Použije sa vzorka s objemom 50 μΙ alebo štandard s tým istým objemom, po premiešaní so 75 μΙ roztoku fosfolipidu, faktoroJXa, faktord/X a CaCÍ2 sa zmes inkubuje pri 37 °C 15 minút, potom sa pridá 50 μΙ substrátu. Po ďalších 20 minútach inkubácie pri 37 °C sa reakcia zastaví pridaním 50 μΙ 1M kyseliny citrónovej. Vzniknuté zafarbenie sa odpočíta pri 405 nm, kontrola pri 492 nm.

Stanovenie účinnosti faktora/ Vlll:C jednostupňovým spôsobom sa vykonáva pri použití metódy APTT (Activated Partia! Thromboplastin Time). 100 pl vzorky alebo štandardu sa napipetuje do kyvety, potom sa pridá 100 μΙ deficientnej plazmy (chudobnej na faktor VIII, General Diagnostic) a roztok sa uloží do termostatu pri 37 °C na 5 minút. Potom sa pridá 100 0,03 M chloridu vápenatého a stanoví sa čas do vzniku koagulácie.

Pre kvantitatívne stanovenie boli pripravené kalibračné krivky na základe zrieďovacieho radu vnútorného štandardu proti štandardu WHO (3. medzinárodný štandard F VIII, ľudská plazma, 3,9 IU/M1). Dvojstupňová skúška má približne 10x nižšiu medzu detekcie ako skúška jednostupňová. V prípade pridania heparínu je vhodné použiť dvojstupňovú skúšku vzhľadom k tomu, že je možné ľahko riedením vylúčiť akýkoľvek prípadný vplyv heparínu.

Faktor VlllzAg bol stanovený pri použití skúšky ELISA s použitím protilátok chorého s ínhibítorom faktora/VIII ako povlaku na mikrotitračných platniach (Nunc, Kamstrup, 4000 Roskilde, Dánsko) a pri použití fragmentov F(AB)₂, značených peroxidázou z toho istého chorého pre stanovenie viazaného faktoru VIII (Thromb. Haemost., 53 (3), 1985, 346 - 350. Štandardné krivky boli pripravené s použitím zmesí normálnej plazmy, kalibrovanej proti štandardu WHO (1. IRP, 1982).

Faktor vWF:Ag bol rovnako stanovený pri použití skúšky ELISA, avšak pri použití králičej protilátky proti ľudskému vWF (DÁKO, Dánsko) ako povlaku a peroxidázou značenej králičej protilátky proti ľudskému vWF (DÁKO, Dánsko) kvôli stanoveniu viazaného vWF. Štandardné krivky sa získali pri použití tej istej normálnej plazmy ako v prípade skúšky ELISA na faktor VIII:Ag.

Faktor IX bol stanovený pomocou jednostupňovej koagulačnej skúšky podobným spôsobom ako faktor VIII.’C s tým rozdielom, že bola použitá plazma, deficientná na faktor IX. IgG bol stanovený pomocou radiálnej imunodifúzie (Immunochemistry, 2,1965, 235 - 254) a albumín, fibrinogén, a-2makroglobulín, faktor X, bielkovina C a antitrombín III boli stanovené pomocou špeciálnej imunoelektroforézy (Anál. Biochem. 15, 1966, 45 - 52). OD28O bola stanovená pri použití spektrofotometra (Spectronic 601, Milron Roy Company) a bielkoviny pomocou Kjeldahlovej skúšky boli stanovené podľa Ph. Eur., 2. vydanie, I, zv. 3.5.2 bez zrážania TCA. Špecifické účinnosti čistených frakcií sa vypočítali ako pomer koncentrácie faktoru VIII:C buď k OD28O alebo ku koncentrácii bielkoviny Kjeldahlovou metódou. Pri použití OD28O P^revypočítanie špecifickej účinnosti nie sú výsledky rôznych pokusov priamo porovnateľné vzhľadom k tomu, že frakcie, obsahujúce faktor VIII, sú často zakalené, ako je uvedené tiež v publikácii Ratnoff a ďalší, J. Clin. Invest. 48, 1969, 957-962.

Rôzne prostriedky pre filtráciu na géli sa získali od nasledujúcich firiem: Sepharose CL-6B, Sepharose CL-4B, Sepharose CL-2B, Sepharose 6FF, Sepharose 4FF, Sephacryl S-400 a Sephacryl S-500 boli získané od Pharmacia (Hillerod, Dánsko), Biogél, A-5m, Fine bol získaný od BioRad (Bie a Berntsen, Rodovre, Dánsko), Fractogel TSK HW-65 (F) bol získaný od Merck (Struers, Rodovre, Dánsko) a Matrex Cellufine GCL2000 bol získaný od Amicon (Helsingborg, Švédsko).

Príklad 2

Filtrácia plazmy na géli pre izoláciu faktord/VIII pri použití rôznych prostriedkov pre filtráciu na géli

Stĺpec s priemerom 2,6 cm bol naplnený rôznymi prostriedkami pre filtráciu na géli s rôznym rozmedzím frakcionácie a rôznou štruktúrou. Vo všetkých prípadoch bola konečná výška náplne 60 cm. Plazma bola rozmrazená rovnakým spôsobom ako v príklade 1 a bola pridaná 1 IU heparínu na ml. Pri použití každého prostriedku pre filtráciu bolo na stĺpec nanesené 50 ml plazmy, t.j. 16 % vrstva. Zaťaženie stĺpca a eluácia pufrom boli vykonávané podľa príkladu 1. Prietoky boli vo všetkých prípadoch rovnaké ako v príklade 1 s výnimkou použitia prostriedku Biogel A-5m, kde bola rýchlosť prietoku znížená na 50 ml za hodinu vzhľadom k zvýšenému spätnému tlaku. Frakcie sa zhromažďovali a pre každú frakciu bola stanovená hodnota OD28O a faktor VIII:C pri použití prostriedku Coatest. Špecifická účinnosť hlavnej frakcie s obsahom faktoru VIII bola vypočítaná ako pomer množstva faktoru VIII:C/ml k OD28O· Pokusy sa opakovali n-krát pri použití rôznych druhov plazmy v každom jednotlivom prípade a boli vypočítané priemerné hodnoty pre výťažky a pre špecifickú účinnosť. Hlavná frakcia s obsahom faktorQ/VIII bola oddelená rovnakým spôsobom ako v príklade 1 a výťažok bol stanovený ako obsah faktortvVllkC v hlavnej frakcii s obsahom faktoru VIII v percentách obsahu faktorCuVlILC v spracovávanej plazme.

Frakcionačné rozmedzie a rozmery častíc pre rôzne prostredie a pre filtráciu na géli spolu s priemernými hodnotami pre výťažok a špecifickú účinnosť sú uvedené v tabuľke 1.

Pre jednotlivé materiály sú v tabuľke 1 použité nasledujúce skratky:

A: Sepharose C1-6B

B: Sepharose CL-4B,

C. Sepharose CI-2B

D: Sepharose 6FF

E: Sepharose 4FF

F: Sephacryl S-500

G: Biogel A-5m Fine

H: Fractogel TSK HW-65 (F)

I: Matrex Cellufine GCL 2000

J: Sephacryl S-400

Tabuľka I

Prostriedok	Frakcionačné				Priemer
pre filtráciu	rozmedzie	Počet	Výťažok	Špecif.	častíc za
na géli	mol. hmotnosti	pokusov	%	účinnosť vlhka pm
A	1χ10⁴-4χ10θ	3	95	0.16	40-165
B	6x10⁴-2x10⁷	4	82	0.88	40-165
C	7x10⁵-4x10⁷	3	68	0.24	60-200
D	1x10⁴-4x10®	3	96	0.71	40-165
E	6x10⁴-2x10⁷	3	86	1.35	40-165
F	6x10⁴-8x10⁷	3	91	0.28	40-105
G	1x10⁴-5x10⁶	1	71	0.12	40- 80
H	5χ10⁴-5χ10θ	2	84	0.18	32- 63
I	1χ10⁴-3χ10θ	2	92	0.18	45-105
J	1χ10⁴-8χ10θ	3	101	0.75	40-105

Príklad 3

Filtrácia plazmy na géli pre izoláciu faktorCbVIII pri použití rôzneho zaťaženia stĺpca

Stĺpec s priemerom 2,6 cm bol naplnený prostriedkom Sepharose 4FF do konečnej výšky vrstvy 60 cm. Plazma bola rozmrazená spôsobom podľa príkladu 1. Po rozmrazení bolo pH plazmy upravené na 7,0 pridaním 0,5 M HCI, bola pridaná 1 IU heparínu na ml a plazma bola sfíltrovaná cez filter s priemerom otvorov 10 pm z nylonu. Na stĺpec bolo nanesených 30, 40, 50, 60 a 70 ml plazmy. Použili sa podmienky z príkladu 1 s tým rozdielom, že pH pufra bolo upravené na 7,0. Odoberali sa frakcie a pre každú frakciu bolo stanovené OD28O ^a množstvo faktora VIII:C (Coatest). Špecifická účinnosť faktoru Vili v hlavnej frakcii bola stanovená ako pomer fa kto rozvili :C/ml k hodnote OD28O·

Pokusy boli trikrát zopakované pri použití troch rôznych vzoriek plazmy pre každé zaťaženie a vypočítali sa priemerné hodnoty (x). Objem hlavnej frakcie s obsahom faktora Vili v ml je ten objem uvedenej frakcie, ktorý je možné odobrať pred vymytím širokého hlavného vrcholu pre bielkoviny (OD280). táto frakcia sa odoberá rovnakým spôsobom ako v príklade 1. Výťažok sa stanoví ako obsah faktora VIII:C v hlavnej frakcii s obsahom faktorq/VIII a uvádza sa v percentách obsahu faktora_vVIII:C v spracovávanej plazme.

Takto získané výsledky sú uvedené v nasledujúcej tabuľke II.

Tabuľka II

Množstvo plazmy v ml v % č. pokusu vrstvy a priemer	Hl. frakcia faktoru Vlll-ml	Výťažok %	Špecifická účinnosť
30	9.4	1	70	88	0,81
		2	70	95	0.18
		3	70	90	0.63
		x	70	91	0.54
40	12.6	1	70	76	0.68
		2	70	85	0.17
		3	70	93	0.61
		x	70	85	0.49
50	15.7	1	80	91	0.57
		2	80	90	0.20
		3	80	85	0.53
		x	80	89	0.43
60	18.8	1	80	79	0.81
		2	80	85	0.16
		3	90	95	0.61
		x	83	86	0.53
70	22.0	1	80	85	0.82
		2	100	90	0.21
		3	100	93	0.53
		x	93	89	0.52

Príklad 4

Filtrácia plazmy na géli pre izoláciu faktorcuVIUpri použití rôznej rýchlosti eluácie

Na ten istý stĺpec ako v príklade 3, bolo nanesených 50 ml plazmy, rozmrazenej rovnakým spôsobom. Po rozmrazení bolo pH plazmy upravené na 7,0 pri použití 0,5 M HCI, bola pridaná 1 IU heparínu/ml a plazma bola sfiltrovaná cez nylonový filter s priemerom otvorov 10 pm. Pri použití troch rôznych vzoriek plazmy sa použila rýchlosť prietokov 100, 200 a 300 ml/h. Tá istá rýchlosť bola použitá ako v priebehu pridávania plazmy, tak pri následnej eluácii. Eluácia bola vykonáva pri použití toho istého pufra ako v príklade 3. Odoberali sa frakcie a pre každú frakciu bola stanovená hodnota OD28O ^amnožstvo faktora VIII (Coatest). Špecifická účinnosť a výťažok hlavnej frakcie s obsahom faktorcuVI II boli vypočítané rovnakým spôsobom ako v príklade 3. Boli vypočítané tiež priemerné hodnoty (x) pre objem hlavnej frakcie s obsahom faktorcQ/lll, výťažok a špecifickú účinnosť. Výsledky sú uvedené v nasledujúcej tabuľke III.

I*

Tabuľka Itl

Rýchlosť prietoku v ml/h v podieli vrstvy/h	Vzorka plazmy č.	Hl. frakcia f. Vlll-ml	Výťažok %	Špecifická účinnosť
100	0.31	1	80	89	0.75
		2	80	88	0.17
		3	80	80	0.65
		x	80	86	0.52
200	0.63	1	80	84	0.99
		2	80	88	0.18
		3	80	89	0.79
		x	80	87	0.65
300	0.94	1	70	85	0.72
		2	80	96	0.18
		3	80	83	0.44
		x	77	88	0.45

Príklad 5

Filtrácia plazmy na géli pre izoláciu faktora,VIII pri použití rôzneho zaťaženia stĺpca

Stĺpec s priemerom 10 cm bol naplnený prostriedkom Sepharose 4FF do konečnej výšky náplne 60 cm. Zmrazená plazma z dánskej krvnej banky bola rozmrazená pri teplote 30 °C na vodnom kúpeli. Na stĺpec bolo nanesených 925, 1 497 a 2 000 g plazmy. Prietok bol udržiavaný na hodnote 4 200 ml/h v priebehu pridávania plazmy i eluácie pri použití čerpadla Masterfiex (Buch & Holm, Herlev. Dánsko), rýchlosť prietoku bola 0,89 objemu vrstvy za hodinu. Na eluáciu bol použitý ten istý pufor ako v príklade 1. OD28O bola kontinuálne zaznamenávaná pri použití Pharmacia Monitor UV-1. Len čo došlo k stúpaniu hodnoty OD28O. začala sa odoberať hlavná frakcia s obsahom faktorcvVIII. Odoberanie tejto frakcie bolo skončené v okamihu, kedy z hodnoty OD28O bolo zrejmé, že začína dochádzať k eluácii hlavného širokého vrcholu pre bielkoviny. V hlavnej frakcii s obsahom faktorQ,VIII bol stanovený obsah faktorcvVIII :C pri použití jednostupňového koagulačného postupu, obsah bielkovín bol stanovený podľa Kjeldahla. Špecifická účinnosť bola vypočítaná ako pomer celkového počtu jednotiek faktora VIII:C v hlavnej frakcii s obsahom faktora VIII k celkovému počtu mg bielkoviny v hlavnej frakcii s obsahom VIII. Výťažok faktora VIII:C bol vypočítaný ako obsah faktorCV VIII:C v hlavnej frakcii s obsahom faktora VIII v percentách obsahu faktorCVVIII:C v spracovávanej plazme.

Výsledky týchto pokusov sú uvedené v nasledujúcej tabuľke IV.

Tabuľka IV

Množstvo nanesenej plazmy v g v % objemu vrstvy	Hl. frakcia f. VIII v g	Výťažok %	Špecifická účinnosť lU/mg
925 19.6	1 192	74	2.50
1 497 31.8	1 860	73	2.24
2 000 42.2	2 220	81	1.08

Príklad 6

Filtrácia plazmy na géli pre izoláciu faktoriíj/lll pri použití stĺpca priemyselných rozmerov

Stĺpec s priemerom 29 cm bol naplnený prostriedkom Sepharose 4FF. Po dosiahnutí rovnovážneho stavu pri použití toho istého pufra ako v príklade 1 bola výška vrstvy gélu 53 cm. 10 kg zmrazenej plazmy z dár.sksj krvnej banky bolo rozmrazené a zahriate na 30 °C a potom nanesené na stĺpec. Nanesené množstvo predstavovalo 28,8 % objemu vrstvy. Pri použití čerpadla Masterflex bol udržiavaný prietok 30 litrov/h, čo zodpovedá 0,86 objemu vrstvy za hodinu, a to v priebehu pridávania plazmy i v priebehu eluácie, ktorá bola vykonávaná pufrom, použitým na dosiahnutie rovnovážneho stavu. Hodnota OD28O bola kontinuálne sledovaná pri použití prístroja Pharmacia Monitor UV-1 kontinuálnym spôsobom, a len čo došlo k prvým známkam stúpania OD28O· začala sa odoberať hlavná frakcia s obsahom faktora VIII. Získalo sa celkom 11,73 kg hlavnej frakcie s obsahom faktora VIII. Obsah faktora VIII:C bol stanovený pomocou jednostupňového koagulačného postupu, bielkovina bola stanovená podľa Kjeldahla. V hlavnej frakcii s obsahom faktora VIII sa zistilo celkom 8 798 IU faktora VlIkC a menej ako 2 346 mg bielkoviny, výťažok faktora VlIkC je teda 880 lU/kg plazmy, čo zodpovedá výťažku 88 % vo forme produktu so špecifickou účinnosťou vyššou ako 3,75 lU/mg bielkoviny.

Takto získaný faktor VIII v hlavnej frakcii je možné ďalej čistiť spôsobom, analogickým zvyčajnému čisteniu znova rozpusteného kryoprecipitátu, napríklad ďalším chromatografickým čistením a lyofilizáciou pri použití bežných prostriedkov za získania stáleho prostriedku. Tento prostriedok sa pred použitím rekonštituuje vo vhodnom bežnom nosiči.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Spôsob izolevama faktora VIII od iných bielkovín krvnej plazmy za použitia filtrácie na géli, vyznačujúci sa tým, že pa fittráeia i la géli vykundva

- tak, žcrobjem pridanej plazmy je rovný aspoň 5 % objemu vrstvy materiálu pre H filtráciu na géli pri rýchlosti prietoku aspoň 0,3 objemu vrstvy materiálu pre filtráciu na géli za hodinu, pričom sa ako prostriedok pre filtráciu použije materiál s časticami, inertnými voči faktoru VIII s frakcionačným rozmedzím 1 x 10³ až1 x 10®.
2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že ^^^prostriedjstkútM^ pre filtráciu na géli£5B$je materiál s frakcionačným rozmedzím od 1 x 10⁴ do 8 x 107.
3. Spôsob podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že áa=sd^prostried£kM£/ pre filtráciu na géli použije materiál s frakcionačným rozmedzím od 5 x 10⁴ do 4 x 107.
4. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že objem plazmy, nanesenej na stĺpec, sa rovná 15 až 40 % obj. vrstvy materiálu pre filtráciu na géli.
5. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že rýchlosť prietoku sa pohybuje v rozmedzí 0,5 až 2 objemy vrstvy materiálu pre filtráciu na géli za hodinu.