PL164894B1

PL164894B1 - Sposób izolowania c zynnika krzepniecia VIII PL PL PL PL PL PL PL PL

Info

Publication number: PL164894B1
Application number: PL90287703A
Authority: PL
Inventors: Per Kaersgaard
Original assignee: Novo Nordisk As
Priority date: 1989-11-09
Filing date: 1990-11-09
Publication date: 1994-10-31
Also published as: BG61231B1; IE904022A1; CN1044121C; DE69017050D1; PL287703A1; HUT60511A; YU47524B; AU6747090A; CA2073012C; EP0524172A1; PT95830B; HU9201551D0; FI922105L; JP2509407B2; NO180741C; NO921839D0; DK162233C; ES2068404T3; HU214905B; BG96316A

Abstract

1. Sposób izolowania Czynnika krzepniecia VIII od innych bialek znajdujacych sie w osoczu krwi przy uzyciu zelowego medium filtrujacego, znamienny tym, ze wyizolowane osocze lub swiezo rozmrozone osocze, ewentualnie poddane wstepnej obróbce, nie wywie- rajacej znaczacego wplywu na zawartosc Czynnika krzepniecia VIII w osoczu, poddaje sie bezposrednio filtrowaniu na zelu w warunkach rozdzielania grupowego, przy czym objetosc wprowadzonego osocza wynosi co najmniej 5% objetosci wypelnienia, a szybkosc przeplywu wynosi co najmniej 0,3 objetosci wypelnienia na godzine, zas jako medium filtrujace stosuje sie czastki obojetne wzgledem Czynnika VIII, o zakresie frakcjonowania od 1 x 103 do 1 x 10 , i gromadzi sie frakcje, zawierajaca glównie Czynnik VIII, po czym ewentualnie wyizolowany Czynnik VIII oczyszcza sie dalej analogicznie do znanych sposobów oczysz- czania ponownie rozpuszczonego krioprecypitatu, zwlaszcza przez dalsze oczyszczanie chromatograficzne i liofilizacje, po czym tak otrzymany liofilizowany produkt laczy sie ze znanymi zaróbkami w postaci trwalego preparatu. PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób izolowania Czynnika VIII w postaci kompleksu Czynnik VIII t C oraz Czynnika von Willebranda - vRF od innych białek obecnych w osoczu krwi przy zastosowaniu filtrowania na żelu.

Sposób izolowania Czynnika krzepnięcia VIII od innych białek znajdujących się w osoczu krwi przy użyciu żelowego medium filtrujęcego według wynalazku polega na tym, że wyizolowane osocze lub świeżo rozmrożone osocze, ewentualnie poddane wstępnej obróbce nie wywierającej zasadniczego wpływu na zwartość Czynnika krzepnięcia VIII w osoczu, poddaje się bezpośrednio filtrowaniu na żelu w warunkach rozdzielania grupowego, przy czym objętość wprowadzanego osocza wynoei co najmniej 5% objętości wypełnienia, a szybkość przepływu wynosi co najmniej 0,3 objętości wypełnienie na godzinę, zaś jako medium filtrujące stosuje się cząstki obojętne względem Czynnika VIII, o zakresie frakcjonowania od 1 x 10do 1 x 10, i gromadzi się frakcję, zawierającą głównie Czynnik VIII, po czyn ewentualnie wyizolowany Czynnik VIII oczyszcza się dalej analogicznie do znanych sposobów oczyszczania ponownie rozpuszczonego krioprecypitatu, zwłaszcza przez dalsze oczyszczanie chromatograficzne i liofilizację, po czym tek otrzymany liofilizowany produkt łączy się ze znanymi zaróbkami w postaci trwałego preparatu.

Korzystnie stosuje się żelowe medium filtrujące stanowiące żel o zakresie frakcjonowania wynoszącym od 1 x 104 do 8 x 10?, zwłaszcza 5 x 104 4 χ 10?.

Objętość wprowadzonego osocza korzysznie wynosi 15 - 40% objętości wypełnienia.

Korzystnie stosuje się szybkość przepływu wynoszącę 0,5 - 2 objętości wypełnienia na godzinę.

W sposobie według wynalazku stosuje się medium filtrujące o sztywności pozwalającej na szybkę elucję. Ponadto stosowany żel musi być chemicznie i immunologicznie obojętny wobec Czynnika VIII w trakcie filtrowania.

Przeprowadzone doświadczenia wykazały, że w sposobie według wynalazku można zastosować przemysłowe żele, takie jak Sepharose CL-48, sepharose CL-6B, Sepharose 4FF, Sepharose 6FF, Sephaeryl S-400, Sephaeryl S-500, Fractogel TSK HW-65 /F/ i Matrex Cellufine CGL 2000. Wszystkie one nadaję się do stosowania w sposobie według wynalazku. Rozmiar cząstki /mokrej/ takich żeli wynosi na ogół od około 32 /um do około 200 /um.

W jednej z wersji sposobu według wynalazku zamrożone osocze rozmraża elęi po upewnieniu się, że całe ilość Czynnika VIII uległe rozpuszczeniu, zamrożone osocza korzystnie wprowadza się do kolumny bezzwłocznie po rozpuszczeniu się całej ilości Czynnika VIII. Korzystnie nie pozwala się na zbyt duży wzrost temperatury, aby uniknąć zbyt eksteneywnej degradacji Czynnika VIII. Osocze można przed wprowadzeniem do kolumny poddać wstępnej obróbce przez dodanie przykładowo heparyny, cytrynianu, sacharozy, aminokwasów, soli lub innych stabilizatorów i ewentualnie przez sączenie, odwirowywanie, zatężenia przez ultrafiltrację, wstępne wytracanie przy zastosowaniu zwykłych środków strącających, lub stosując inne metody, pod warunkiem, że ewentualna obróbka wstępna nie wpływa znacząco na zawartość Czynnika VIII w osoczu.

164 894

Nieoczekiwanie okazało się, że sposób według wynalazku zapewnia bardzo wysoką wydajność Czynnika VIII· Na ogół więcej niż 70% zawartości Czynnika VIII w osoczu odzyskuje się w produkcie. Ponadto sposób według wynalazku pozwala na wytworzenie produktów bardzo czystych o aktywności właściwej wynoszącej od 1 do około 4 IU Czynnika VIII i C na 1 ag białka. Fakt ten można częściowo przypisać temu, że przy zastosowaniu sposobu według wynalazku. Czynnik VIII zostaje oddzielony również od enzymów proteolitycznych, które zwykle powoduję bardzo wczesny rozpad kompleksu Czynnik VIII t C.

Sposób według wynalazku umożliwia obróbkę dużych ilości osocza przy zastosowaniu wysokich obciążeń i dużych szybkości przepływu filtrowania na żelu, dzięki czemu osiąga się bardzo wysoki odzysk Czynnika VIII o wysokiej czystości. Tak więc sposób według wynalazku stanowi wydajną metodę o zastosowaniu przemysłowym. Frakcje zawierajęce Czynnik VIII otrzymane w wyniku filtrowania na żelu, lub połączone frakcje z kilku filtrowali można następnie zatężać i dalej oczyszczać stosując znane metody takie jak ultraflltracja, wytrącanie, wymiana jonowa, chromatografia powinowactwa lub podobne. Pozostałe białka osoczowe, takie jak albumina, immunoglobuliny, kompleks protrombiny, antytrombina III i inne nożna również izolować z późniejszych frakcji otrzymanych w wyniku filtrowania na żelu przy zastosowaniu takich znanych technik jak wytrącanie alkoholem, wytrącanie poliatylanogilkolem /PEG/, chromatografia lub podobne.

Określenia aktywności kompleksu Czynnik VIII t C przeprowadza się przy zastosowaniu oznaczania dwu- lub jadnostopniowθgo· Oznaczanie dwu- i jednostopniowe może dawać różna wyniki aktywności kompleksu Czynnik VIII i C w próbce, co jest dowiedzione. Ponadto wiadomo, że kilkakrotne oznaczania za pomocę takiej samej próby tej samej próbki może dawać odchylenia w oznaczaniu aktywności kompleksu Czynnik VIII t C. Stosowane tu wyrażenie osocze oznacza krew, z której usunięto wszystkie ciałka krwi oraz płytki krwi, przykładowo przez odwirowanie·

Czynnik VIII t Ag oznacza antygen związany z Czynnikien VIII, a vWf:Ag - antygen związany z Czynnikiem von Wlllabranda· Objętość wypełnienia oznacza objętość wypełniającego żelu i cieczy znajdującej się wewnątrz jego cząstek. Objętość zerowa oznacza objętość buforu znajdującego się pomiędzy cząstkami żelu, a objętość alucji* oznacza objętość buforu stosowanego do eluowania określonej substancji. Wyrażenie obciążenie kolumny stosuje się do określenia objętości substancji wprowadzonej do wypełnienia, obliczonej jako procent objętości wypełnienia. Wyrażenie zakres frakcjonowania określa zakres mas cząsteczkowych /globularnych/ białek lub większych częsteczek, dla których dany żel polecany jest przez dostawcę.

Sposób według wynalazku zostanie bliżej wyjaśniony za pomocą rysunku i przykładów. Przykłady mają charakter ilustracyjny i nie ograniczają zakresu wynalazku, który jest określony w załączonych zastrzeżeniach patentowych. Na załączonym rysunku poszczególne figury przedstawiają.

Fig. 1 - wykres elucji Czynnika VIII filtrowanego na żelu, oznaczanego różnymi metodami, Jak podano w opisie. U/frakcja oznacza ilość IU Czynnika VIII t C/frakcję.

Fig. 2 - kolejność elucji różnych białek osoczowych filtrowanych na żelu sposobem według wynalazku.

Przykład I. Filtrowania osocza na żelu w celu wyizolowania Czynnika VUUI· Kolumnę o średnicy równej 2,6 cm wypełniono żelem Sepharose CI-48 do wysokości równej 60 cm.

Zamrożone osocze pochodzące z duńskiego banku krwi rozmrożono do temperatury 25°C na łaźni wodnej. Po dodaniu do osocza 1 IU heparyny/ml, 50 ml /16% objętości wypełniania/, osocza wprowadzono do kolumny z szybkością przepływu wynoszącą 100 nl/godzinę. Następnie kolumnę eluowano stosując wymuszony przepływ o szybkości 200 ml buforu/godziną, co odpowiada 0,63 objętości wypełnienia na godzinę. Do zrównoważenia kolumny i do elucjl stosowano bufor zawierajęcy 0,02 M cytrynianu, 0,15 M NaCl o pH równym 7,4. Do buforu dodano +2 ponadto 2,55 ml IM CaCl’ na 1 litr, co dało stężenie wolnych jonów Ca’ wynoszące około 7x10-5 m. Stężenie wolnych jonów Ca+2 określono przy użyciu elektrody firmy Ingold GmbH /Frankfurt, RFN/, selektywnej względem wapnia. Zebrano frakcje. Ola każdej frakcji oznaczono

164 894

OO₂6q /absorbancja przy długości fali równej 280 nm/, kompleks Czynnik VIII t C, /stosując zarówno jednostopniowy próbę krzepnięcia jak i dwustopniowy próbę chronogenowy/, Czynnik VIII i Ag, albuminę, IgC, fibrynogen, IgM, -2-makroglobulinę, Czynnik IX, Czynnik X, białko C oraz antytrombinę III. Białko określane wielkością 00₂80 eluowało dając mały pik w objętości zerowej, /frakcje 10-18/, po którym następował bardzo duży, szeroki pik /frakcje 19-50, porównaj fig. 1/. 82% aktywności kompleksu Czynnik VIIItC określonej dwustopniową próbę krzepnięcia i 91% aktywności kompleksu Czynnik VIII<C określonej jednostopnlowy próbę krzepnięcia aluowało dając jeden zespolony pik w objętości zerowej /główna frakcja Czynnika VIII/ połączony z wcześniejszym małym pikiem białka. Reszta Czynnika VIII eluowała dając mniejszy, kolejny pik końcowy, zaraz po głównej frakcji Czynnika VIII /frakcja 19-26/. Czynnik VIIItAg i vWFtAg eluował razem z kompleksem Czynnik VIII: Cdając nieco szarsze, kolejne piki końcowe.

Wszystkie inne oznaczone białka eluowały we frakcji naetępujęcej po głównej frakcji Czynnika VIII, dając duże, szerokie piki białkowe /fig. 2/. Białka osoczowe oddzielone od Czynnika VIII mają następujące masy cząsteczkowe i

Antytrombina III	65.000
Białko C	62.000
Czynnik X	59.000
Czynnik IX	57.000
oć -2-makroglobulina	718.000
IgM	900.000
Fibrynogen	340.000
IgC	150.000
Albumina	67.000

Oznaczenie aktywności kompleksu Czynnik VIIItC za pomocy dwustopniowej próby chromogenowej przeprowadzono, stosując metodę chromogenicznego substratu /KABI Coatest Factor VIII/, przy czym oryginalny metodę, w której stosuje się próbówki w temperaturze 37°C zmodyfikowano tak, że stosowano płytki do mikromiareczkowania, co zredukowało zużycie reagentów. Stosowano próbkę lub wzorzec o objętości 50 μl, które po zmieszaniu z 75 μ 1 roztworu fosfolipidy. Czynnika IXa, Czynnika X i CaCl? inkubowano w temperaturze 37°C w ciągu 15 minut, po czym dodano 50 μl substratu. Po dalszych 20 minutach inkubacji w temperaturze 37°C, reakcję zakończono dodając 60 μl IM kwasu cytrynowego. Narastanie barwy odczytano przy 405 nm w odniesieniu do 492 no.

Aktywność kompleksu Czynnik VIIIiC określono za pomocy próby jednostopniowej stosując metodę APTT /Activated Partial Thromboplastin Time/. Próbkę lub wzorzec o objętości 100 μ1 pipetowano do kuwet, po czy· dodano 100 ^ul niekompletnego osocza /osocze pozbawiona Czynnika VIII, General Oiagnostic/. Roztwór termostatowano w temperaturze 37°C w ciągu 5 minut. Po dodaniu 100 μ! 0,03M CaC^ mierzono czas do momentu skrzepnięcia roztworu.

0o oznaczeń ilościowych wykonano krzywe wzorcowe w oparciu o serie rozcieńczeń wewnętrznego wzorca skalibrowanego w oparciu o standard Światowej Organizacji Zdrowia /3rd Int. Standard of FVIII, Human Plasma, 3,9 IU/ml/. Dwustopniowa próba opisana powyżej na niższy /około 10 razy/ granicę wykrywalności, niż próba jednosfopniowa. Stosowane próby dwustopniowej Jest korzystna w przypadku, jeśli dodaje się heparynę. Jakikolwiek ewentualny wpływ heparyny na próbę można wówczas o wiele łatwiej zniwelować poprzez rozcieńczenie.

Czynnik VIIIiAg oznaczono na płytkach do mikromiareczkowania metody ELISA, stosując jako substancję opłaszczającą przeciwciała pacjenta, któremu podano inhibitor Czynnika VIII i stosując do oznaczania związanego Czynnika VIII fragmenty F/AB/2 znakowane parokaydazy pochodzące od tego samego pacjenta. /Nuhc, Kamstrup, 4000 Roskilde, Dania/ oraz /Thromb. Haemost., 53 /3/, 1985, 346-350/. Krzywe wzorcowe wykonano przy zastosowaniu zebranego normalnego osocza ekallbrowanego w oparciu o standard Światowej Organizacji Zdrowia /lst.IRP, ustanowiony w 1982 r./.

VWFiAg oznaczono również metody ELISA, stosując króliczy przeciwludzki vWF /0ako, 0ania/, jako substancję opłaszczającą oraz króliczy przeciwludzkl vWF znakowany peroksydazy

164 894 /Oako, Dania/ do oznaczenia związanego vWF. Krzywe wzorcowe wykonano przy zastosowaniu tego samego normalnego osocza, które użyto do oznaczenia kompleksu Czynnik VIII:Ag metodę ELISA. Czynnik IX oznaczono stosując jednostopniową próbę krzepnięcia w analogiczny sposób.

Jak przy oznaczaniu kompleksu Czynnik VIII iC z tą różnicą, że stosowano osocze pozbawione Czynnika IX.

IgC oznaczono metodę radialnej immunodyfuzjl /Imniunocheinistry, 2, 1965, 235-254/. Albuminę, fibrynogen, -2-makroglobullnę, Czynnik X, białko C oraz antytrombinę III oznaczono metodę immunoelektroforezy rzutowej. /Anal. Biochem., 15, 1966, 45-52/. OD280 mierzono za pomocą spektrofotometru /Spectronlc 601 firmy Milton Roy Company/, a białka oznaczono stosując metodę Kieldanla według Pn.Eur., 2-gie wydanie. I, V, 3,5,2 bez wytrącania za pomocą kwasu trójchlorooctowego /TCA/. Aktywność właściwą oczyszczonych frakcji obliczono Jako stosunek stężenia kompleksu Czynnik VIII>C do OD2q^ lub do stężenia białka oznaczonego metodę KJeldahla. W przypadku obliczania aktywności właściwej przy zastosowaniu OD28q· w/nn<i riżnynh doświadczeń nie są bezpośrednio porównywalne, poza przypadkiem, gdy stosowano to samo osocze wyjściowe, ponieważ frakcje zawierające Czynnik VIII są często mętne, - patrz wyniki Ratnoffa i współpracowników /J.Clin. In/est., 4b, 1969, 957-962/. Stosowano różne żele filtrujące, pochodzące z różnycn źródeł, a mianowicie S^h^ose CL-68, Sepharose CI-4B, Sephanosr CI-2B, Sepharose 6FF, Sepharose 4FF, Sephacryl S-400 i Sephacryl S-500 firmy Pharmacia /Hiller/d, Dania/, Biogel A-5m Fine firmy BioRad /Ble 1 Brnntsrn, R0dovre, Dania/, Fractogel TSK HW-65/F/ firmy Merck /Struers, R0dovre, Dania/ i Matrex ^Kufine CCI 2000 firmy Amicon /Helslngtorg, Szwecja/.

Przykład II. Filtrowanie osocza na żelu w celu wyizolowania Czynnika VIII przy zastosowaniu różnych mediów filtrujących.

Kolumnę o średnicy 2,6 co wypełniono kolejno różnymi mediami filtrującymi o różnych zakresach frakcjonowania i o różnej strukturze. We wszystkich przypadkach końcowa wysokość wypełnienia wynosiła 60 cm. Osocze rozmrożono Jak opisano w przykładzie I i dodano 1 IU heparyny na 1 ml. Do kolumny z różnymi wypełnianiami wprowadzano 60 ml osocza /16% objętości wypełnienia kolumny/. Dodawanie buforu i elucję prowadzono tak, jak opisano w przykładzie I. Stosowano szybkość przepływu takę samą, jak w przykładzie I, poza przypadkiem, w którym stosowano jako medium filtrujące Biogel A-5n, gdzie szybkość przepływu zmniejszono do 50 ml/ godzinę z powodu zwiększonego przeciw^ścim^. Zebrano frakcje. Mierzono OD2qq każdej frakcji. W każdej frakcji oznaczono kompleks Czynnik VIII:C stosując Coatest. Aktywność właściwą głównej frakcji Czynnika VIII obliczono Jako stosunek Czynnika VIIItC/ml do O&280* ^.miadczeeia powtarzano n-krotnla stosując różne osocze dla każdego wypełnienia i obliczono średnie wartości wydajności i aktywności właściwej. Główną frakcję Czynnika VIII oddzielono w teki sposób. Jak opisano w przykładzie I i obliczono wydajność jako zawartość kompleksu Czynnik VIIItC w głównej frakcji Czynnika VIII, określoną jako procent zawartości Czynnika VIII:C w osoczu. Obliczone dane umieszczono w poniższej tablicy 1.

Tablica 1

Γ Medium l· f^rujce

Zakres frakcjonowania - masa cząsteczkowa

I

I μι

I o

u.

a a

a r* a

a r· .1.

A

B

C

O

E

1x104 - 4x106 6x10⁴ - 2x107

7x10⁵ - 4x107

1x104 - 4x106

6x104 - 2x107 i Numer 'Wydaj· 1 doświad- 1 ność ] czenia ! % ‘ η I

L__3______

I I } 3 2 95 i 3

I a

! 3

68 r—— 1 ! 96

T

Aktywność właściwa	1— a a a 1 0 1	Średnica mokrej I
cząstki /urn	a a ł
5		6
0,16	a - .1 ..	40-166	ł a
0,88	a a a	40-165
0,24	i a a	60-200

a

J 86 a

			1 a
0,71	a a	40-165
1,35	a a a 1	40-165	... . _J1

164 894

Tablica 1 - ciąg dalszy

i a

1

_u_.

2

—--3

3

---_r_ a

4

—j— a

5

~ 1—

6 i

u—«

F

1 1 1 a

6x10⁴ - 8x10⁷

1 1 1 a

3

a a a a

91

! a 1

0.28

a a a

40-105

i

—X—·—

--χ·-·

G

I 1

1x10⁴ - 5x106

a 1

1

a

71

a 1

0,12

a a a

40-80

1

a

1 .

|

i

-•--•χ-

--χ—

t

H

a 1

5x104 - 5x106

1 2

2

a a 1

84

1 a 1

0,18

32-63

1

L

-1

1 -

p··

--χ-

r

l '

I

1x104 - 3x106

I

2

1 a

92

1 a

0,18

1 a

45-105

L-

_L

L

Ł -

_ —1

P”“

r

- r

a

□

1x104 - 8x106

a a

3

a a

101

0,75

a a

40-105

-J-.

Ai Sepharose CL-6B; Bi Sepharose CL-4B|

Ci Sepharose CL-2B; Di Sepharose 6FF|

Ei Sepharose 4FF| Fi Sephacryl S-500|

Gi Biogal A-5h Finaj Hi Fractrogel TSK HW-65 /F/j

Ii Matrex Cellufine GCL 2000, Di Sephacryl S-400·

Przykład III. Filtrowanie osocza na żelu w celu wyizolowania Czynnika VIII przy zastosowaniu różnych obciążeń kolumny.

Kolumnę o średnicy 2,6 cm wypełniono Sepharose 4FF do końcowej wysokości równej 60 cm. Osocze rozmrożono Jak opisano w przykładzie I. Po rozmrożeniu pH osocza doprowadzono do 7 stosując 0,5M HCl. Dodano 1 IU heparyny na 1 al, a następnie osocze przesączono przez nylonowy filtr 10 μα, Do kolumny wprowadzano kolejno 30 ml, 40 ml, 50 ml, 60 ml i 70 ml osocza. Wprowadzanie buforu i elucję przeprowadzano tak samo. Jak w przykładzie 1, stosując również taką samą szybkość przepływu. Bufor doprowadzano do pH równego 7. Zabrano frakcje. Ola każdej frakcji mierzono OD|Q0· i każdej frakcji oznaczono Czynnik VIII iC stosując Coatest, Aktywność właściwą głównej frakcji Czynnika VIII obliczano Jako stosunek Czynnika VIIIiC/ml do OD28q· Oośwledczenia powtórzono 3-krotnie stosując różna osocza dla każdego obciążenia i obliczono średnie wartości /1/. Objętość głównej frakcji Czynnika VIII /ml/ stanowi objętość frakcji zawierającej Czynnik VIII, którą zbiera się przed wystąpieniem w trakcie elucji dużego, szerokiego pika białkowego /°θ280/* Głównę frakcję Czynnika VIII oddzielono tak samo, Jak w przykładzie I. Obliczono wydajność, jako zawartość kompleksu Czynnik VIIIiC w głównej trakcji Czynnika VIII, określonę Jako procent zawartości Czynnika VIIIiC w osoczu. Obliczone dana umieszczono poniżej w tablicy 2.

Tablica 2

Γ“ 1

Ilość

wprowadzonego

osocza

a a

Główna

V a

Wydajność

1 1

Aktywność

ml

T |

% objętości

r

numer doś-

•“1 1

frakcja Czynnika VIII

1 a

%

a a

właściwa

a 1

wypełnienia

1

wiadczenia

a a

a 1

t a

1

a 1

a

a > .

1

a

Γ

1

1 1

2

a . 1

3

a . 1

4

}

5

t

6

Γ

1

a“

1

ΐ

a 1

1

70

a

88

0,81

a a

a 1 a a

2

a a

70

a a

95

a a

0,18

30

a 1 a

9,4

3

a a a

70

a 1 a a

90

a 1

0,63

1 a

a a

X

a a

70

91

a a

0,54

p-

a a

1

a a

70

a a

76

a

0,68

a 1 1

a a

2

1 a

70

a a

85

a 1 a a

0,17

40

a a

12.6

1 a

3

1 a

70

a a

93

0,61

j

a a

X

a a

70

1 1

85

a a

0,49

r-

a

___L.

__u.

164 894

Tablica 2 - dalszy ciąg

	1	Ϊ	2	ł	3	-----_T-----4-------	5	---6—	6 S
		1 \|		1 1	1	1 1	80	r a a	91	*^«	0,67	a a
j		1 1 1 I		1 1	2	1 1	80	a a	90		0,20	a a
50	15,7	1 \|	3	1 1	80	1 \|	85		0,53	a 1 a
		1 1		1 1	X	a a	80	a a	89		0,43
		1		j		a
		ί 1 \|		i 1 \|	1	a a a	80	a a a	79		0,81	a a a
		1 1		1 1	2	a a	80	a a	85		0,16	a a
	60	1 1	16,8	1 1 \|	3	a a \|	90	a a \|	95		0,61	a a
		1 1 1		1 1 1	X	a I a	83	a 1 }.	86	1 a	0,53	1 a ą
		1 1		1 1	1	1 a	80	i a	85	1 a 1	0,82	a' 1
		1 1		1 1	2	a a	100	a a	90	a a	0,21	a a
	70	1 1	22,0	1 1	3	a a	100	a a	93	a a	0,53	a a
		1 1 1		1 1 1	X	a a a	93	a 1 a	89	a a a	0,52	a a a
	P	r z y k a	a d IV .	Fittroaania	soocaβ aa	żel u β	ellu y^^^amia zzn^r^r^k^a β VIII ,	pzz y

zastosowaniu różnych szybkości elucji.

Do kolumny takiej samej, jak opisano w przykładzie III dodano 50 ml osocza rozmrożonego jak opisano powyżej. Po rozmrożeniu doprowadzono pH osocza do 7 stosując 0,5 M HCl. Dodano 1 IU heparyny na 1 ml i osocze przesączono przez filtr nylonowy 10 μα. Badano szybkości przepływów wynoszące 100, 200 i 300 ml/godzinę, stosując trzy różne porcje osocza. W czasie dodawania osocza i elucji stosowano tę aaną szybkość przepływu. Elucję prowadzono przy zastosowaniu takiego buforu. Jaki opisano w przykładzie III. Zebrano frakcje. Dla każdej frakcji mierzono OD2₈q. W każdej frakcji oznaczono Czynnik VIII iC stosując Coatest. Aktywność właściwą i wydajność głównej frakcji Czynnika VIII obliczono Jak w przykładzie III. Obliczono średnie wartości /X/ objętości głównej frakcji Czynnika VIII, wydajności i aktywności właściwej. Wyniki podano poniżej w tablicy 3.

Tablica 3

	a		i	1	a a	80	a	89	a \|	0,75
	a a		a a	2	a a	80	a a	88	1 a	0,17
100	a 1	0,31	a a \|	3	1 a	80	a a	80	1 1 I	0,65
	a a		a a	X	a a	80	I a	86	1 1	0,52
	1 1		1	1	a 1	80	1	84	i 1	0,99
	1 a		1 a	2	a I	80	1 a	88	1	0,18
200	1 1	0,63	a a	3	1 a	ω	1 a a	89	1 1 a	0,79
	a 1		a a	X	1 a	80	a a	87	a a	0,65
,«.«.««	—ł-	.»·»..«****«	—μ—	··——««w	.W.J····		—p-	««mm·*»·.	-----	«««·«.
	1		a	1	i	70	a	86	a \|	0,72
	I t		1 1	3	a 1	810	1 a	96	a 1	0,18
300	a 1 \|	0,94	a \|	3	1 a	80	a a	83	a a	0,44
	a _		i 1	x	a 1	77	1	88	a 0	0,45

Przykład V. Filtrowanie na żelu osocza w celu wyizolowania Czynnika VIII, przy zastosowaniu różnych obciężert kolumny,

Kolumną o średnicy 10 cm wypełniono Sepharose 4FF do wysokości równej 60 cm. Zenro164 894 żone osocze z duńskiego banku krwi rozmrożono w temperaturze 30°C na łaźni wodnej· Do kolumny wprowadzano kolejno następujęce ilości osocza: 925 g, 1497 g i 2000 g. Podczas wprowadzania osocza i podczas elucji utrzymywano szybkość przepływu wynoszącę 4200 ml/godzinę, co odpowiada wartości równaj 0,89 objętości wypełnienie/godzinę. W tym celu stosowano pompkę wodnę Masterflex /Buch 1 Holm, Herlev, Dania/. Stosowano bufor do elucji taki. Jak opisano w przykładzie I. OD₂8q kontrolowano w sposób ciągły stosując Pharmacia Monitor UV-1. Zbieranie głównej frakcji Czynnika VIII rozpoczęto, gdy wartość OD280 zaczęła rosnąć w objętości zerowej, a zakończono, gdy wykazywała pojawienie się dużego pika eluowanego białka. Określono zawartość Czynnika VIIItC w głównej frakcji Czynnika VIII stosując jednostopniową próbę krzepnięcia, a białko oznaczono metodę Kjeldehla. Aktywność właściwą obliczono jako stosunek całkowitej Ilości Jednostek Czynnika VIIItC w głównej frakcji Czynnika VIII do całkowitej ilości miligramów białka w głównej frakcji .CCynnika VIII. Wydajność obliczono jako zawartość kompleksu Czynnika VIIItC w głównej frakcji określonę jako procent zawartości Czynnika VIII w osoczu. Wyniki podano poniżej w tablicy 4.

Tablice 4

Ilość wprowadzonego osocza	1 1 1 1 1 1 1	— — — ————τ- Główna frakcje J Czynnika VIII !	Wydajność %	—Τ- ι 1 a 1 1 t 1 i	Aktywność właściwa IU/mg	j
9 l_ - . - . ... --	i % objętości * wypełnienia	g	I 1 1 f
925	* 19,6	i 1	1192	1	74	--r- 1 a	2,50
1497	J 31,8	1 t	1860	1 1	73	a a	2,24
2000	i¹ 42,4	1	2200	1	81	a	1,08
__- . ... -	___<________________			_L_

Przykład VI. Filtrowanie osocza na żelu w celu wyizolowania Czynnika VIII przy zastosowaniu kolumny o wymiarach przemysłowych.

Kolumnę o średnicy 29 cm wypełniono Sepharose 4FF. Po zrównoważeniu buforem takim, jak opisano w przykładzie I, wysokość żelu wynosiła 53 cm. 10 kg zamrożonego osocza z duńskiego banku krwi rozmrożono 1 ogrzano do temperatury 30°C, po czym wprowadzono do kolumny. Wprowadzona ilość stanowiła 28,8% objętości wypełnienia. Podczas wprowadzania i elucji za pomocą buforu stosowanego również do zrównoważenia kolumny, utrzymywano, za pomocą pompki wodnej Masterflex, szybkość przepływu wynoszącą 30 litrów/godzinę, co stanowi 0,86 objętości wypełnienia/godzinę. OD?^ kontrolowano w sposób ciągły stosując Pharmacia Monitor UV-1. Zaczęto zbierać główną frakcję Czynnika VIII w momencie pierwszego wzrostu wartości OD₂80 w objętości zerowej. Zebrano łącznie 11,73 kg głównej frakcji Czynnika VIII. Następnie oznaczono zawartość kompleksu Czynnik VIIItC stosując jednoetopnlową próbę krzepnięcia, a białko oznaczono metodę Kjeldalla. W głównej trakcji Czynnika VIII uzyskano ogółem 8798 IU Czynnika VIIItC i mniej niż 2346 mg białka, co dało wydajność Czynnika VIIItC wynoszącę 880 lU/kg osocza. Wartość ta odpowiada wydajności równej 88% postaci produktu o aktywności właściwej większej niż 3,75 lU/mg białka.

Głównę frakcję Czynnika VIII wyizolowaną sposobem według wynalazku poddaje się dalszemu oczyszczaniu w sposób analogiczny do znanych sposobów oczyszczania ponownie rozpuszczonego krioprecypitatu, polegający przykładowo na dalszym oczyszczaniu chromatograficznym i liofilizacji. W celu wytworzenia trwałego preparatu stosuje się znane zaróbki. Preparat przed użyciem roztwarza się stosując znany odpowiedni nośnik.

Przyk ład VIII. Filtrowanie osocza na żelu w celu wyizolowanie Czynnika VIII przy zastosowaniu dużych szybkości przepływu. Kolumnę o średnicy 5,0 cm wypełniono Sepharoee 4 FF /wytwarzanego przez firmę Pharmacio, Aller0d, Dania/ do końcowej wysokości równej 40,5 cm. Zamrożone osocza z duńskiego banku krwi rozmrażano i doprowadzono na łaźni wodnej do temperatury 27°C. Dodano 1 IU heparyny na 1 ml 1 następnie do kolumny wprowadzono 175 ml osocza /22% objętości złoża/, stosując różna szybkoścl przepływu. Kolumnę zrównoważono i eluowano stosując bufor zawierający 0,02M cytrynian, 0,15M NaCl, 2,55 mM CaC^· pH 7,0. Zbierano frakcje 1 w każdej z nich oznaczano OD₂g_Q i Czynnik VIII. Czynnik VIII

164 694 oznaczano stosując dwustopniowy próbę chromogenową /Coateet, Chromogenie, Aller0d, Dania/. Aktywność właściwą głównej frakcji Czynnika VIII obliczano jako stosunek Czynnika VIII do OD280* Badania prowadzono, stosując trzy różna porcje osocza o szybkości przepływu, odpowiednio, 690 ml/godzinę, 1440 ml/godzinę i 1740 ml/godzinę. W przypadku najwyższej szybkości przepływu, przed naniesieniem na kolumnę osocze wirowano w ciągu 10 minut przy szybkości 4000 obrotów/minutę. Dla wszystkich szybkości przepływu ca^goięto dużę wydajność Czynnika VIII i we wszystkich przypadkach główna frakcja Czynnika VIII była dobrze oddzielona od głównego piku białka. Wyniki podano niżej w tablicy 5·

Tablica 5

u-—------------- I _____	—r-—1	Główna frakcja	—t““ 1	Wydajność	••T 1	Aktywność
		—w	Czynnika VIII	w %	1	właściwa
\| ml/godzinę \| - -	I 1	objętość	1 1	ml			1 \|
złoża/godzinę	1 1				1 1
1 690			--fl— —-		1		Ί
1 1	0,87	1 1 1 1	230	77	1 1	0,41
} 1440	1	1.81	230		82	I 1 i	0,84
S 1740	1 1	2,19	1 1	230		96	1	0,13
U............	1 1		f i				i 1

I l

i

I

164 894

Biplko. C...

Czynnik X Czynnik .....

oC-2 - makroglobulina

IgM.......

.....Fibrynogen........

Główna frakcja ..............

czynnika ΏΕ Albumina ~ * ...... - .......... 1 .. .

10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

Nr frakcji

164 Θ94

Główna frakcja 26jOD 280 czynnika 3ΖΠΙ 24

U/frakcja 6.5 6.0

5.5 5.0

4.5 4.0

3.5

3.0

2.5 +2.0

1.5

1.0 0.5 .0.0

15 20 25 30 35 40 45 50 55 Nr frakcji — OD 280

F VEJ Ctpróba krzepnięcia) ·*·· F vin C( próba chromogenowa)

FVIII^:Ag —o—vWF^:Ag^y

Fig.1

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 10 000 zł

Claims

Zastrzeżenie patentowe

1. Sposób izolowania czynnika krzepnięcia VIII od innych białek znajdujących się w osoczu krwi przy użyciu żelowego medium filtrującego, znamienny tym, że wyizolowane osocze lub świeżo rozmrożone osocze, ewentualnie poddane wstępnej obróbce, nie wywierającej znaczącego wpływu na zawartość Czynnika krzepnięcia VIII w osoczu, poddaje się bezpośrednio filtrowaniu na żelu w warunkach rozdzielania grupowego, przy czyn objętość wprowadzonego osocza wynosi co najmniej 5% objętości wypełnienia, a szybkość przepływu wynosi co najmniej 0,3 objętości wypełnienia na godzinę, zaś jako medium filtrujęce stosuje się cząstki obojętne względem Czynnika VIII, o zakresie frakcjonowania od 1 x 103 do 1 x 10°, i gromadzi się frakcję, zawierającą głównie Czynnik VIII, po czym ewentualnie wyizolowany Czynnik VIII oczyszcza się dalej analogicznie do znanych sposobów oczyszczenia ponownie rozpuszczonego krioprecypitetu, zwłaszcza przez dalsze oczyszczanie chromatograficzne i liofilizację, po czym tak otrzymany liofilizowany produkt łączy się ze znanymi zaróbkami w postaci trwałego preparatu.
2. Ssoeóó według zastrz. 1, znaminnny tym. Za stosuje się żelowe uadium

4 7 filtrujęce stanowiące żel o zakresie frakcjonowania wynoszącym od 1 x 10 do 8 x 10 .
3. Spoosó według zastrz. 2, zneciien'! tym , es sosui^ a ię. ealowa eedSum filtrujące stanowiące żel o zakresie frakcjonowanla wynoszącym od 5 x 104 do 4 x 107.
4. esposó według zastrz. l , znamiθnny ' y m , e β doprowadzasią osocze w objętości wynoszącej co najmniej 15 - 40% objętości wypełnienia.
5. Ssposó według zastrz. 4 , znaniθnny ' y m , Os a ię ę sy^^^oś ó pre-pływu wynoszącą 0,5 - 2 objętości wypełnienia na godzinę.

* * *

Przedmiotom wynalazku jest sposób izolowania Czynnika krzepnięcia VIII od innych białek znajdujących się w osoczu krwi, przy użyciu żelowego medium filtrującego.

Czynnik VIII znany J ako antyhemofiłowy Czynnik A lub AHF jest białkiem osoczowyn tt-nowiącym ważny składnik układu krzepnięcia krwi.

Czynnik VIII krąży w osoczu krwi w ekstremalnie niskim stężeniu w postaci niekaoαlencnanega kompleksu dwóch białek, wykazując odpowiednio działanie koagulac^ne czynnika VIII - /czynnik VIII i C/ oraz działania ^faktora r^to^^ny /czynnik von Willebranda - VWF/. Kompleks ton na masę cząsteczkową wynoszącą 1 - 20 x 10®.

Kompleks Czynnik VIII: C jest nieobecny lub wadliwy u osób cierpiących na zaburzenie krwawienia zwane hemofilią A, którą to chorobą dotkniętych jest około 5 na 100 000 osób.

Czynnik von Więlebpanea wiąże się z aktywowanymi płytkami krwi w taki sposób, że następuje przyspieszenie ich agregacji. Można to wykryć in vjepo przez agregację płytek indukowanych pyseaceenną. W przypadku choroby Wjalebpanda obserwuje się przedłużony czas krwawienia spowodowany brakiem występowania biologicznej aktywności czynnika Wjaęebpanda, lub obniżonym poziomem tej aktywności.

Osoby cierpiąca na hemofilię A i pi^(^J^^l^t^«( cierpiących na ciężkie przypadki choroby von Willebranda leczy się obecnie koncentratami zawierającymi kompleks Czynnik VIII: C/vWF. Leczenie to poprawia znacznie ich jakość życia i wydajność produkcyjną, a ponadto przyczynia się do zwiększenia długości ich życia.

164 894

Środki farmaceutyczne zawierająca Czynnik VII! /Czynnik VIIIi C i/lub VWF/ wytwarza elf z krwi lub z osocza krwi, przy zastosowaniu różnych znanych sposobów. Wszystkie te sposoby charakteryzuję się niskimi wydajnościani, szczególnie w przypadku otrzymywania kompleksu Czynnik VII!t C. Wspólna cechę prawie wszystkich tych sposobów Jest etap oczyszczania wstępnego polegający na krioprscypitacji. Zamrożone osocze rozmraża alg w temperaturze 0-4°C, co powoduje powstanie osadu zawierającego Czynnik VIII. Osad tan zbiera się, przykładowo poprzez odwirowywanie. Chociaż metoda krioprecypltacjl Jest stosunkowo prosta, na ona istotną wadę, a mianowicie, w przypadku stosowania jej na większą skalę, to jest w przypadku ilości osocza większej, niż 5 kg, deje ona niskę wydajność kompleksu Czynnik VIIIi C /30 -45% zawartości osocza/. Oznacza to, że końcowa wydajność jest niska, bez względu na to, jakie stosuje się dalsze etapy oczyszczania.

Ponadto, w trakcie wytwarzania środków zawierajęcych Czynnik VIII na ogół stosuje się etap inaktywowania zarazków. Znacznie zwiększa to bezpieczeństwo stosowania tych środków, lecz powoduje w większości przypadków dalsze obniżenie wydajności kompleksu Czynnik VIII i C

Uzyskiwane dotychczas bardzo niskie wydajności wytwarzania Czynnika VIII doprowadziły do niedoboru środków zawierających ten Czynnik. Aby zaspokoić popyt na Czynnik VIII potrzebny do leczenia chorych na hemofilię należałoby znaleźć nowe, wysokowydajne sposoby oczyszczania Czynnika VIII.

Nowa sposoby izolowania Czynnika VIII bezpośrednio z osocza charakteryzujące się duże wydajnością są bardzo interesująca, ponieważ przy zastosowaniu znanycn metod traci się do 70% zawartości w osoczu Czynnika VIII już w trakcie, lub jeszcze przed krioprecypitację.

Ostatnio próbowano izolować Czynnik VIII bezpośrednio z osocze przy zastosowaniu chromatografii powinowactwa /Thromb, Haemost., 61, /2/, 234-237 /1989//. Uzyskano jednak wydajność mniejszą niż 60% i aktywność właściwą wynoszącą 1 IU Czynnika VIII na 1 mg białka frakcji zawierajęcej Czynnik VIII. /IU oznacza międzynarodowy jednostkę aktywności/.

Filtrowanie na żelu nazywane również chromatografię żelowo-sączeniową, lub chromatografię rozdziału substancji według wielkości cząsteczek jest procesem kontrolowanej dyfuzji stosowanym do rozdzielania substancji rozpuszczonych według ich wielkości. Substancje rozpuszczone przepuszcza się przez kolumnę wypełnioną obojętnymi, porowatymi cząstkami żelu. Cząstki te mają taki rozmiar porów, że mniejsze cząsteczki substancji przepuszczanych przez kolumnę dyfunduję do fazy stałej, do wnętrza cząstek żelu, a większe cząsteczki nie zatrzymują się w fazie stałej. Tak więc, większe cząsteczki, które nie zatrzymuję się w cząstkach żelu, eluują najpierw w tak zwanej objętości zerowej, podczas gdy mniejsze cząsteczki potrzebuję dłuższego czasu na przejście przez kolumnę i eluuję kolejno według aalajęcych wielkości wraz ze wzrostem objętości elucji. Filtrowania na żelu można przeprowadzić dwoma różnymi sposobami.

1. Sposób rozdzielania na grupy.

W tym sposobie rozdziela się rozpuszczono cząsteczki na dwie grupy o dużej różnicy rozmiarów cząsteczkowych. Jedna grupa eluuje w objętości zerowej, a druga grupa eluuje później w o wiele większej objętości elucji, często bliskiej całkowitej objętości wypełnienia . Tę procedurę stosuje się wstępnie do oddzielenia białek od rozpuszczonych soli, lub w celu wymiany buforu. Określa się ją jako odsalanien Do odsalanie stosuje się twarda żele o małych porach. Odsalania prowadzi się przy zactosowaniu dużych ilości substancji /objętości próbki stanowiące 20 - 30% objętości wypełnienia/ i wysokich szybkości przepływu /około jedna objętość wypełnienia buforu na godzinę/. Tak więc wydajność kolumny jest wysoka.

2. Sposób frakcjonowania·

W sposobie frakcjonowania rozdziela się rozpuszczone substancje o podobnej masie cząsteczkowej i tę procedurę stosuje się do rozdzielania białek, w tym celu stosują się cząstki żalu o większych porach oraz takie eedium filtrujące, aby białka eluowały w objętości pomiędzy objętością zerową a objętością alucji odpowiadającę całkowitej objętości wypełniania. Substancje eluują w bliższych odstępach, niż przy zastosowaniu warunków rozdzielania grupowego i mogę na siebie nachodzić. Wysokie szybkości przepływu nie są pożądane.

164 894 ponieważ ich stosowanie nie pozwala na skuteczne rozdzielenie białek. Stosuje się małe obciążenie kolumny w celu rzeczywistego rozdzielenie poszczególnych białek. Dlatego filtrowanie na żelu stosowane do frakcjonowania zaleca się do rozdzielania białek w ostatnim, wykańczającym etapie, w którym objętość przeznaczona do frakcjonowania jest mała. /Jagechiee, Ullmana Encyklopedia of Industrial Chemistry, tom B3 /10/, 198B i Bio/ Technol., 4, 954-58 /1986//.

Próbowano izolować Czynnik VIII z osocza stosując filtrowanie na żelu /D. Lab. Clin. Mad., 72, /6/, 1968, 1007-1008 oraz J. Chin. Invest. 48, 1969, 959-962/. W trakcie doświadczeń osiągnięto wysoki stopień oczyszczenia, lecz wydajności wahały się w granicach tylko około 40-50%. Czystość otrzymanej frakcji zawierającej Czynnik VIII zależna była od wyjściowego osocza, jako że duża zawartość lipidów i chylomikronów powodowała powstawania mętnej frakcji Czynnika VIII o niższej aktywności właściwej. Zauważono, że stosowana technika filtrowania na żelu nie pozwalała na frakcjonowanie dużych ilości osocza, chociaż doświadczenia wstępna wskazywały na to, że filtrowanie na żelu o wiele bardziej stężonej frakcji I Cohna wydawało się być możliwe.

Ponadto Paulssen i współpracownicy /Thromb. Oiathes. Heemorr. 22, 1969, 577-583/ stwierdzili, że można oddzielić Czynnik VIII od innych białek osocza, stosując żel Sepharose 6B. Jednakże, rozdzielanie przy zastosowaniu Jedynie filtrowania na żelu było możliwa na dużę skalę w przypadku stosowania Jako substancji wyjściowej ponownie rozpuszczonego krioprecypitatu.

W opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3 637 489 ujawniono sposób rozdzielania składników krwi za pomocę filtrowania na żelu i przy zastosowaniu porowatych kulek szklanych. Sposób ten przeznaczony jest szczególnie do oddzielania substancji czynnych immunologicznie od innych składników surowicy lub osocza.

Od tego czasu przeprowadzono szereg prób wykorzystania chromatografii żelowej do oczyszczania czynnika VIII. Próby te koncentrowały się na filtrowaniu żelowym częściowo oczyszczonych frakcji osocza /ponownie rozpuszczonego krioprecypitatu i jego dalej oczyszczonych frakcji/. Wszystkie próby przeprowadzano przy małych obciążeniach i/lub przy małych szybkościach przepływu, ewentualnie przy różnych koabinacjach tych warunków.

Filtrowanie na żelu. Jako sposób frakcjonowania białka, jest znane od 1959 roku i jest szeroko stosowane w badawczych laboratoriach biochemicznych do oznaczania białek i do ich oczyszczania, przy czym stosuje się próbki o małych objętościach, przykładowo mniejszych niż 1 litr. Oo chwili powstania niniejszego wynalazku nie stosowano filtrowania żelowego do frakcjonowania osocza w celu rozdzielania białek, a jedynie do odsalania roztworów albuminy z etanolu i soli. Tak więc, jak stwierdzono w literaturze: Najważniejszym powodem tego, że filtrowanie na żelu nie stało alę głównę technikę frakcjonowanie osocza, są niskie wydajności białka na objętość kolumny /J. H. Berglafi Fractionation by Cel Filtration, 163-173, wydana przez J.M. Curling: Methods of Plazaa Brotaen Fractionation, Academic Press, Londyn, 1980/. Niestety, ilości białek, które można przerabiać w kolumnach o rozsądnych rozmiarach są małe, a rozcieńczenie próbki nie może być pominięte. Dlatego ta metoda nie jest szeroko stosowana do frakcjonowania osocza /J.J. Morgenthaler i współpracownicy: Preservation of Structure and function during isolation of human plasma proteinę, 127-138, wydane przez Smit Sibinga i współpracowników: Plasma Fractionation and Blood Transfusion, Martinus Nijhoff Publishers, Boston, 1985/.

W opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 675 385 ujawniono sposób izolowania białka prokoagulatora Czynnika VIII z preparatu osocza zawierającego Czynnik VIII oraz składniki o wysokiej i niskiej masie czasteczkowej poprzez kolejne rozdzielania przy zastosowaniu wysokosprawnej chromatografii rozdziału w zależności od wielkości. W pierwszym etapie przygotowuje się wodną mieszaninę buforową preparatu osocza i oddziela się składniki o niskiej masie cząsteczkowej przez wprowadzenie mieszaniny do kolumny chromatograficznej zawierającej porowate kulki stosowane w wysokosprawnej chromatografii cieczowej, o rozmiarze od około 13 do około 15 jim. Kolumnę eluuje się buforowanym wodnym eluen164 894 tera. W celu osiągnięcie właściwego rozdzielanie proponuje się stosowanie kolumn o współczynniku kształtu wynoszącym nie mniej niż 10-40, co obniża wydajność, lecz nie zapewnia właściwego oddzielenia składników Czynnika VIII od białek osoczowycn o niskiej masie cząsteczkowej. Tak więc pierwsze rozdzielanie nie zapewnia właściwego oddzielenia białek wykazujących działanie kompleksu Czynnik VIII t C od innycn składników białkowych preparatu osocze. Osiąga się to dopiero po zastosowaniu drugiego etapu rozdzielania za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej.

Zatem, do chwili powstania niniejszego wynalazku powszechny był pogląd, że filtrowanie na żelu nie stanowi odpowiedniej metody do rozdzielania białek w przypadku frakcjonowania osocza, gdy obróbce poddaje się większe objętości, przykładowo powyżej 5 litrów. Nieoczekiwanie okazało się, że w przypadku zastosowania odpowiednich żeli filtrujących przeznaczonych dla wysokich szybkości przepływu, możliwe jest wyizolowanie bezpośrednio z osocza Czynnika VIII w postaci czystej frakcji z bardzo wysoką wydajnością przez bardzo łagodne oddzielenie mechaniczne, bez konieczności stosowania pomocniczej krioprecypitacji wstępnej.