SK43097A3 - Method for purifying keratinocyte growth factors - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Prezentovaný vynález sa vzťahuje k oblasti purifikácie proteínov. Konkrétne sa predkladaný vynález vzťahuje k oblasti purifikácie keratinocytových rastových faktorov.

Doterajší stav techniky

Polypeptidové rastové faktory sú dôležitými prostredníkmi medzibunkovej komunikácie (Rubin et. al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 802-806). Tieto molekuly sú všeobecne uvoľňované jedným typom buniek a ovplyvňujú množenie (proliferáciu) iných typov buniek.

Jednu rodinu rastových faktorov tvoria fibroblastové rastové faktory. V súčasnosti je známych osiem členov rodiny FGF (fibroblast growth factors), ktoré vykazujú príbuznosť v primárnej štruktúre: základný fibroblastový rastový faktor (basic fibroblast growth factor), bFGF (Abraham et al. (1986), EMBO J., 5:2523-2528); kyslý fibroblastový rastový fajctor (acidic fibroblast growth factor), aFGF (Jaye et al. (1986), Science, 233:541-545); produkt int-2 génu, int-2 (Dickson & Peters (1987), Náture, 326:833);'hst/kFGF (Delli-Bovi et al. (1987), Celí, 50:729-737 a Yoshida et al. (1987), Proc. Natl. Acad..Sci. USA, 84:7305-7309); FGF-5 (Zhan et al. (1988), Mol. Celí. Biol., 8:3487-3495), FGF-6 (Marics et al. (1989), Oncogene, 4:335-340); keratinocytový rastový faktor (keratinocyte growth factor) (Finch et al. (1989) Science, 24:752-755; Rubin et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:802-806; Ron et al. (1993), The Journal of Biological Chemistry, 268(4):2984-2988 a Yan et al. (1991), In Vitro Celí. Dev. Biol., 27A:427-438) a hisactophilin (Habazzettl et al. (1992), Náture, 359:855-858).

V rodine FGF proteínov je keratinocytový rastový faktor jedinečným efektorom proliferácie nefibroblastových epiteliálnych (najmä keratinocytových) buniek odvodených z mezenchymáIných pletív. Pojem natívny KGF sa vzťahuje k prírodnému ľudskému (hKGF) alebo rekombinantnému (rKGF) polypeptidu (so signálnou sekvenciou alebo bez nej), ako je znázornené sekvenciou aminokyselín uvedených v SEQ ID NO:2 alebo v jeho alelickom variante. [Pokiaľ to nie je uvedené inak, číslovanie aminokyselín pre molekuly opísané v tomto dokumente bude zodpovedať prezentovanej konečnej forme prirodzenej molekuly (tzn. bez signálnej sekvencie), ak je to znázornené aminokyselinami 32-194 SEQ ID N0:2.]

Natívny KGF môže byt izolovaný z prirodzených zdrojov. Napríklad hKGF môže byť izolovaný z média upraveného líniou embryonálnych pľúcnych fibroblastov (embryonic lung fibroblast) (Rubín et al. (1989), pozri predchádzajúci text). Na prípravu purifikovaného hKGF preparátu boli použité tri chromatografické kroky, menovite afinitná chromatografia na heparín-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ, USA), HPLC gélová filtrácia a HPLC v reverznej fáze. Z 10 litrov upraveného média bolo takto získaných zhruba 6 mg hKGF. Tieto chromatografické kroky umožňujú získať iba 0,8 % celkového množstva hKGF (stanoveného skúškou mitogénnej aktivity). Ďalší príklad ukazuje použitie iného chromatografického kroku - použitie afinitnej chromatograf ie (heparín-Sepharose) a iónomeničovej chromatografie (Mono-S- Pharmacia, Piscataway, NJ, USA) na izoláciu rKGF produkovaného v baktériách (Ron et al. (1993), Journal of Biological Chemistry, 268:2984-2988).

Vlastnosti keratinocytových rastových faktorov naznačujú možnosti ich aplikácie, ako napríklad liečiv na podporu špecifickej stimulácie rastu epiteliálnych buniek. Bolo by preto žiadúce mat k dispozícii metódu alebo metódy získania relatívne velkého množstva homogénnych keratinocytových rastových faktorov, na získanie dostatočného množstva materiálu na komplexné in vitro a in vivo biologické hodnotenie a na potenciálne terapeutické použitie.

Predmetom tohto vynálezu je opis novej metódy purifikácie keratinocytových rastových faktorov.

Podstata vynálezu

Prezentovaný vynález je zameraný na prvú metódu purifikácie keratinocytového rastového faktoru (KGF), ktorá zahŕňa:

a) získanie roztoku obsahujúceho KGF

b) väzbu KGF v roztoku (krok a) na katiónový iónomeničový nosič

c) vymytie KGF elučným roztokom z katiónového iónomeničového nosiča

d) rozdelenie eluovaného roztoku (krok c) na matrix molekulového vylučovacieho sita (gélovou chromatografiou)

e) opätovné získanie KGF z matrix molekulového vylučovacieho sita. ^:

Vynález je ďalej zameraný na druhú metódu purifikácie keratinocytového rastového faktoru (KGF), ktorá zahŕňa:

a) získanie roztoku obsahujúceho KGF

b) väzbu KGF na katiónový iónomeničový nosič

c) vymytie KGF elučným roztokom z katiónového iónomeničového nosiča

d) hydrofóbnu chromatografiu eluovaného roztoku (krok c)

e) opätovné získanie KGF po hydrofóbnej chromatografii (krok d)

Všeobecne, krok katiónovej výmennej chromatografie prvej i druhej metódy môže byť vykonaný s akýmkoľvek vhodným tlmivým roztokom (napríklad fosfátovým tlmivým roztokom - PBS, tlmivým roztokom octanu sodného alebo Tris-HCl) najlepšie pri pH medzi 6,8 a 7,5. Medzi vhodné kolóny na tento krok patrí karboxymetylcelulóza (carboxymethyl cellulose), karboxymetylagaróza (carboxymethyl agarose) a sulfátovaná agaróza (sulfated agarose) a celulózové kolóny (napríklad kolóny s nosičmi S-Sepharose Fast Flow , Mono-S a CMcellulose™, komerčne dostupné od Pharmacia, Piscataway,

NJ, USA). Rýchlosť prietoku kolónou bude závislá od rozmeru kolóny.

Krok gélovej filtrácie prvého postupu môže byť vykonávaný s akýmkoľvek vhodným tlmivým roztokom (napríklad fosfátový tlmivý roztok - PBS) najlepšie pri pH medzi 7,0 - 7,5. Medzi vhodné kolóny na tento krok patria nosiče na rozlíšenie podľa veľkosti založenej na akrylamidu (acrylamide-based), kremičitanoch (silica-based) alebo polyméroch (polymer-based) (napríklad kolóny s nosičom Sephadex G-15 ,

Superdex-75™ komerčne dostupné od firmy Pharmacia).

Pri použití druhej metódy je možné začleniť oxidácie voľných SH skupín pred krokom využívajúcim hydrofóbne interakcie (pozri ďalší text). Na to môže byt využitá akákoľvek metóda. Napríklad proteín môže byt vystavený prime5 raný čas pôsobeniu atmosférického kyslíka. Alebo môžu byt použité iné oxidačné postupy. Jedna taká metóda je osobitne vhodná pre keratinocytový rastový faktor, keď je jeden alebo viac cysteínových zvyškov (pri porovnaní s prirodzenou molekulou keratinocytového rastového faktoru) odstránený alebo nahradený. Pri tomto postupe sa môže pôsobit oxidačným činidlom pridaným do vhodnej konečnej koncentrácie (napr. cystamín dihydrochloridom alebo iným vhodným oxidačným činidlom, napríklad cystínom, oxidovaným glutatiónom alebo dvojmocnou meďou; upraví sa tiež pH najlepšie na hodnotu 7,0 až 9,5 - pre cystamín hydrochlorid je najvhodnejšie pH 9,0 ± 0,3) pri teplote najlepšie medzi 10 až 30’C, po príslušne vhodný čas. Druhý postup môže byt použitý na oxidáciu cysteínových zvyškov prirodzeného KGF a ostatných keratinocytových rastových faktorov rovnakým spôsobom. Pri tomto postupe môže byt oxidácia dosiahnutá pridaním vhodného množstva látky upravujúcej iónovú silu (napr. síranu amónneho) a úpravou pH najlepšie na hodnotu v rozmedzí 7,5 až 9,5 s teplotou udržovanou medzi 23 ± 5’C po príslušný čas.

Krok hydrofóbnych interakcií pri druhej metóde môže byt vykonaný s využitím vhodného tlmivého roztoku (napr. tlmivý roztok fosfátu sodného) najlepšie pri pH v rozmedzí 6,0 až 8,0 (najlepšie 7,0) a pri použití klesajúceho lineárneho gradientu vymývacieho roztoku síranu amónneho v koncentráciách 2 až 0 M. Na tento krok sú vhodné nosiče so substituovanými alkylovými alebo fenylovými skupinami (napríklad Butyl-650M Toyopearl , komerčne dostupný od Tosohaas, Inc., Montgomeryville, PA°, USA a kolóny phenyl Sepharose™ a phenyl Superose^A , komerčne dostupných od Pharmacia).

Postup predkladaného vynálezu môže byt použitý na purifikáciu keratinocytového rastového faktoru KGF. Malo by byt jasné, že termíny keratinocytový rastový faktor a KGF používané v tomto opise je možné (pokial to nie je uvedené inak) zameňovat; natívny KGF a analógy proteínov KGF (alebo muteíny) sú charakterizované sekvenciou peptidov, ktorá je v podstate rovnaká ako sekvencia natívneho KGF. Vykazujú tiež niektoré alebo všetky biologické aktivity natívneho KGF, najmä proliferáciu nefibroblastických epiteliálnych buniek (napríklad vykazujú aspoň 500x väčšiu stimuláciu keratinocytových buniek BALB/MK ako NIH/3T3 fibroblastových buniek a aspoň 50x väčšiu stimuláciu BALB/MK buniek ako epi· teliálnych buniek BS/589 alebo epiteliálnych buniek CC1208 pri stanovení testom inkorporácie H-tymidínu). Frázou charakterizované peptidovou sekvenciou v podstate zhodnou so sekvenciou natívneho KGF sa rozumie peptidová sekvencia, ktorá je kódovaná sekvenciou DNA schopnou hybridizácie k nukleotidom 201 až 684 SEQ ID NO:1, prednostne za stringentných hybridizačných podmienok.

Zodpovedajúca pozícia aminokyseliny medzi dvoma sekvenciami aminokyselín môže byt určená pripojením dvoch sekvencií tak, aby sa maximalizovala zhoda rezíduí vrátane posunu amino a/alebo karboxy konca, zavedením potrebných medzier a/alebo odstránením rezíduí prítomných vo forme inzertov pri možných kandidátoch. Vyhľadávanie v databázach analýza sekvencie a spracovanie údajov sa môže vykonať pri použití niektorého dobre známeho algoritmu - programu bežne používaného na prehľadávanie na homológie/totožnosť v sekvencii (napríklad Pearson a Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:2444-2448; Altschul et al. (1990),

J. Mol. Biol., 215:403-410; Lipman and Pearson (1985), Science, 222:1435 alebo Devereux et al. (1984), Nuc.

Acids Res., 12:387-395).

Stringentné podmienky (týkajúce sa hybridizácie) sa dosiahnu kombináciou koncentrácie solí, teploty, organic kých rozpúšťadiel a ostatných parametrov bežne kontrolovaných v hybridizačných reakciách. Vzorové hybridizačné pod7 mienky predstavuje hybridizácia v 4x SSC pri 62 až 67°C, nasledovaná premývaním v O,lx SSC pri 62 až 67°C počas asi jednej hodiny. Alebo ďalšie vzorové hybridizačné podmienky predstavuje hybridizácia v 45 až 55% formamide, 4x SSC pri 40 až 45°C. [pozri T. Maniatis et al., Molecular Cloning (A laboratory manual); Cold Spring Harbor Laboratory (1982), Str. 387 - 389].

Proteíny zahŕňajú variácie alel, alebo deléciu (delécie), substitúciu (substitúcie) či inzerciu (inzercie) aminokyselín, vrátane fragmentov, chimerických alebo hybridných molekúl prirodzeného (natívneho) KGF. Jeden príklad KGF zahŕňa proteíny majúce rezíduá zodpovedajúce Cysl a Cysl5 SEQ ID NO:2 nahradené alebo odstránené, pričom výsledná molekula má pri porovnaní s materskou molekulou zlepšenú stabilitu (ako je to uvedené v bežne prístupnom U.S.S.N. 08/487, 825, zaradeným 7. júla 1995). Iný príklad KGF zahŕňa polypeptid so zmeneným nábojom, kde jeden alebo viac aminokyselinových zvyškov na pozíciách 141-154 natívneho KGF (najlepšie rezíduá Arg41, Gln43, Lys55, Lys95, Lysl28, Asnl37, Glnl38, Lysl39, Argl44, Lysl47, Glnl52, Lysl53 alebo Thrl54) je odstránený alebo vymenený neutrálnym alebo negatívne nabitým zvyškom s cielom ovplyvniť proteín redukovaním pozitívneho náboja (ako je to uvedené v bežne prístupnom U.S.S.N. 08/323, 337, zaradeným 13. októbra 1994). Ešte ďalší príklad KGF predstavuje proteín vytvorený substituovaním aspoň jednej aminokyseliny s veikým potenciálom tvoriť slučku alebo aspoň jednej aminokyseliny vnútri oblasti tvoriacej slučku (Asnll5 - Hisll6 - Tyrll7 - Asnll8 - Thrll9) natívneho KGF (ako je to uvedené v bežne prístupnom U.S.S.N. 08/323, 473, zaradeným 13. októbra 1994). Ešte ďalší príklad zahŕňa proteíny majúce nahradenú jednu alebo viac aminokyselín vnútri oblasti 123-133 (aminokyseliny 154-164 SEQ ID NO:2) natívneho KGF nahradenú, odstránenú alebo pridanú; tieto proteíny môžu mat agonistickú alebo antagonistickú aktivitu.

Špeciálne objavené proteíny zahŕňajú nasledujúce KGF molekuly (uvedené s ohíadom na zvyšok nájdený v mieste natívneho proteínu (bez signálnej sekvencie) uvedenom v SEQ ID NO:2, nasledovanom pozíciou aminokyseliny v zátvorkách a potom bud substituujúcim rezíduom alebo na označenie delécie): C(1,15)S, ΔΝ15-4Ν24, AN3/C(15)S, AN3/C(15)-, AN8/C(15)S, ΔΝ8/0(15)-, C(1,15)S/R(144)E, C(1,15)S/R(144)Q,

ÁN23/R( 144 )Q, C(1,1-5,40 )S, C( 1,15,102)S , C(1,15,102,106)S, ΔΝ23/Ν( 137 )E, ΔΝ23/Κ( 139 )E, ΔΝ23/Κ(139)Q, ÔN23/R( 144 )A,

AN23/R(144)E, aN23/R(144)L, δΝ23/Κ( 147 ) E , £ N23/K( 147 ) Q, AN23/K(153)E, £N23/K(153)Q, £N23/Q(152)E/K(153 )E; R(144)Q a H(116)G.

Ako odborníci v tejto problematike ocenia, na expresiu sekvencie kódujúcej KGF proteín môže byt použitý rad systémov hostite! - vektor. Tie zahŕňajú (ale nie sú obmedzené iba na nich) systémy eukariotických buniek, ako napríklad systémy cicavčích buniek infikovaných vírusom (napríklad vírusom kiahní, adenovírusom a podobne); hmyzie bunkové^;systémy infikované vírusom (napríklad bacilovírusom); mikroorganizmy - napríklad kvasinky obsahujúce kvasinkové vektory; alebo prokaryotické bunkové systémy ako napríklad baktérie transformované bakteriofágovou DNA, plazmidovou DNA alebo kozmidovou DNA. Expresné prvky týchto vektorov sa líšia čo do sily a špecifity. V závislosti od toho, aký systém vektor-hostite! je použitý, môže byt použitý akýkolvek z velkého počtu vhodných transkripčných a translačných prvkov

Ako náhle je proteínový produkt expresie KGF izolovaný, purifikovaný a otestovaný na KGF aktivitu (pri použití postupov odborníkom všeobecne známych), môže byt použitý v radu farmaceutických výrobkov. Typicky takýto výro9 bok zahŕňa vhodný, spravidla chemicky definovaný nosič pre terapeutickú látku a (v závislosti od zamýšľanej formy aplikácie) tiež ďalšie látky. Výrobok môže zahŕňať vodné nosiče alebo sa môže skladať z pevnej fázy, kde je KGF začlenený dó nevodných nosičov, ako je napríklad kolagén, kyselina hyalurónová (hyaluronic acid) a alebo najrôznejšie polyméry. Zloženie môže byt vhodne upravené pre aplikáciu najrôznejšími spôsobmi, vrátane podávania injekčného, orálneho, lokálneho, intranazálneho alebo pľúcneho.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1 ukazuje nukleotidové (SEQ ID NO:1) a aminokyselinové (SEQ ID NO:2) sekvencie natívneho KGF (nukleotidy kódujúce konečnú formu natívneho KGF sú opísané bázami 201 až 684 SEQ ID NO:1 a konečná forma KGF je určená amínokyselinovými zvyškami 32 až 194 SEQ ID NO:2).

Obrázky 2A, 2B a 2C ukazujú mapy plazmidov pCFM1156, pCFM1656 a pCFM3102.

Obrázok 3 ukazuje nukleotidové (SEQ ID NO:3) a aminokyselinové (SEQ ID NO:4) sekvencie konštruktu obsiahnutého v konštrukte RSH-KGF.

Obrázok 4 ukazuje nukleotidové (SEQ ID NO:5) a aminokyselinové (SEQ ID NO:6) sekvencie konštruktu obsiahnutého v plazmide KGF.

Obrázok 5 ukazuje chemicky syntetizované OLIGY (OLIGO 6 až OLIGO 11; SEQ ID NO:12-17) použité na náhradu DNA sekvencie medzi miestami KpnI a EcoRI od miesta KpnI (pozícia aminokyselín 46 až 85 SEQ ID NO:6) v konštrukte plazmidu KGF, aby sa tak vytvoril konštrukt plazmidu KGF (dsd).

Obrázok 6 ukazuje chemicky syntetizované OLIGY (OLIGO 12 až 24; SEQ ID NO:18-30) použité na tvorbu KGF (optimalizovaný kodón). ₍

Obrázok 7 ukazuje nukleotidovú (SEQ ID NO:31) a aminokyselinovú (SEQ ID NO:32) sekvenciu C(1,15)S, analógu KGF so substitúciou serínu miesto cysteínu v pozícii aminokyselín 1 a 15 natívneho KGF.

Obrázok 8 ukazuje nukleotidovú (SEQ ID NO:33) a aminokyselinovú (SEQ ID NO:34) sekvenciu C(1,15)S/R(144)E, analógu KGF so substitúciou serínu miesto cysteínu v pozíciách aminokyselín 1 a 15 a substitúciou glutámovej kyseliny za arginín na aminokyselinovej pozícii 144 natívneho KGF.

Obrázok 9 ukazuje nukleotidovú (SEQ ID NO:35) a aminokyselinovú (SEQ ID NO:36) sekvenciu C(1,15)S/R(144)Q, analógu KGF so substitúciou serínu za cysteín na pozíciách 1 a 15 a substitúciou glutamínu za arginín na aminokyselinovej pozícii 144 natívneho KGF.

i Obrázok 10 ukazuje nukleotidovú (SEQ ID NO:37) a aminokyselinovú (SEQ ID NO:38) sekvenciu N15, analógu KGF s deléciou prvých 15 aminokyselín na N-konci natívneho KGF.

Obrázok 11 ukazuje sekvenciu nukleotidov (SEQ ID NO:39) a aminokyselín (SEQ ID NO:40) analógu KGF2 N23 s deléciou prvých 23 aminokyselín na N-konci natívneho KGF.

Obrázok 12 ukazuje nukleotidovú (SEQ ID NO:41) a aminokyselinovú (SEQ ID NO:42) sekvenciuJSN23/R(144)Q, analógu KGF s deléciou prvých 23 aminokyselín na N-konci a náhradou glutamínu za arginín na aminokyselinovej pozícii 144 natívneho KGF.

Príklady rozpracovania vynálezu

Štandardné metódy veľa procedúr opísaných v nasledujúcich príkladoch (alebo vhodných alternatívnych postupoch) , sú opísané v bežne rozšírených molekulárne biologických manuáloch, ako je napríklad Molecular Cloning, Second Edition, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1987) a Current Protocols in Molecular Biology, Ausabel et al., Greene Publishing Associates/Wiley-Interšcience, New York (1990).

Príklad 1

Príprava DNA kódujúcej KGF a analógy KGF

Klonovanie celého génu ludského KGF (kódujúceho polypeptid so sekvenciou natívneho KGF) bolo uskutočnené jednak polymerázovou reťazovou reakciou (PCR) s RNA zo zvieracích buniek a pomocou PCR chemicky syntetizovaných (optima1izovaný kodón E. coli) oligonukleotidov (OLIGY). Obidve procedúry sú opísané ďalej:

Bola vykonaná amplifikácia s použitím RNA izolovanej z buniek (o ktorých vieme, že produkujú polypeptid) pomocou PCR. Najskôr sa urobí rozrušenie buniek z bunkovej línie ľudských fibroblastov AG1523A (získané od Human Gehetic Mutant Celí Culture, Repository Inštitúte For Medical Research, Camden, New Jersey) pomocou guanidín tiokyanátu; potom nasleduje extrakcia RNA (podľa metódy opísanej v práci Chomzynski et al. (1987), Anál. Biochem., 172:156). S použitím štandardného protokolu na reverznú transkripciu bola z celkovej RNA vytvorená cDNA pre KGF. PCR amplifikácia (PCR 1) génu KGF bola vykonaná pri použití cDNA KGF ako templátu a prajmerov OLIGO 1 a OLIGO 2, ktoré kódujú DNA sekvencie bezprostredne na 5' a 3' génu KGF [teplotný cyklátor model 9600 (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT); 28 cyklov, každý zahŕňajúci denaturáciu - jednu minútu pri 94 °C, annealing - dve minúty pri 60°C a elongáciu - tri minúty pri 72°C].

Malé alikvotné časti produktu prvej PCR reakcie boli potom použité ako templát na druhú KGF PCR amplifikáciu (PCR 2) za podmienok zhodných s prvou reakciou okrem teploty na annealing, ktorá bola 50°C. Na expresné klonovanie génu KGF boli dalej použité prajmery na nested PCR generujúce vhodné reštrikčné miesta na obidvoch koncoch génu KGF - na modifikáciu KGF DNA produktu z PCR 2 boli tak použité OLIGO 3 a OLIGO 4 (začlenenie reštrikčných miest pre Mlul a BamHI na 5' a 3' konci génu) [PCR 3; 30 cyklov, každý zahŕňajúci denaturáciu - jedna minúta pri 94°C, annealing - dve minúty pri 60°C a elongáciu - tri minúty pri 72°C]. Táto DNA bola následovne štiepená reštrikčnými enzýmami Mlul a BamHI, extrahovaná fenolom a precipitovaná etanolom. Potom bola rozpustená a ligovaná (pri použití T4 ligázy) do plazmidu pCFM1156 (obrázok 2A), ktorý obsahuje RSH signálnu sekvenciu, čím vznikol konštrukt RSH-KGF (obrázok 3). Týmto ligačným produktom boli transformované (podlá metódy opísanej Hanahanom (1983) J. Mol. Biol., 166:557) bunky E. coli (kmeň FM5 - ATCC:53911) a následne bolo týmito bunkami inokulované LB médium s kanamycínom pri 28°C. Niekoľko vybraných transformantov bolo dalej pestovaných v malých tekutých kultúrach obsahujúcich kanamycín v koncentrácii 20 μ9/πι1.

Z každej kultúry bol izolovaný RSH-KGF plazmid a jeho DNA bola sekvenovaná. Vzhľadom na vnútorné Ndel reštrikčné miesto v géne KGF nebolo možné priamo klonovať natívnu sekvenciu génu do príslušného expresného vektoru do miest ohraničených Ndel a BamHI. To sa dosiahlo trojcestnou ligáciou. Plazmid RSH-KGF bol štiepený v jedinečných reštrikčných miestach Bsml a SstI a fragment DNA asi 3 kb veľký (obsahujúci 3' koniec KGF génu) bol izolovaný následnou elektroforézou v 1% agarózovom géli. Ďalšia PCR (PCR 4) bola vykonaná za rov13 nakých podmienok ako PCR 3 s prajmerom OLIGO 5 miesto OLIGO 3. DNA produkt PCR reakcie bol potom štiepený enzýmami Ndel a Bsml a pomocou elektroforézy v 4% agaróze bol izolovaný DNA fragment 311 párov báz dlhý. Tretí fragment použitý v ligácii bol fragment DNA 1,8 kilobáz dlhý z pCFM1156 vyštiepený s Ndel a SstI a izolovaný elektroforézou v 1% agarózovom géli. Po nasledujúcej ligácii (T4 ligáza), transformácii, selekcii na kanamycínu a sekvenovaní DNA (ako je to opísané hore) bol vybraný kloň obsahujúci konštrukt na obrázku 4 a tento plazmid bol označený ako KGF. Vzhľadom na interné ribozomálne väzbové miesto, ktoré vedie k tvorbe skrátených produktov, bola sekvencia KGF DNA medzi jedinečnými KpnI a EcoRI miestami nahradená chemicky syntetizovanými OLIGY (OLIGO 6 až OLIGO 11) tak, aby sa minimalizovalo použitie interného štartovacieho miesta pre začiatok syntézy proteínov (obrázok 5).

OLIGO#1 (SEQ ID NO:7): 5'-CAATGACCTAGGAGTAACAATCAAC-3'

OLIGO#2 (SEQ ID NO:8): 5'-AAAACAAACATAAATGCACAAGTCCA-3'

OLIGO#3 (SEQ ID N0:9): 5’-ACAACGCGTGCAATGACATGACTCCA-3' OLIGO#4 (SEQ ID NO:10):

5' -ACAGGATCCTATTAAGTTATTGCCATAGGAA-3 '

OLIGO#5 (SEQ ID NO:11):

5'-ACACATATGTGCAATGACATGACTCCA-3 ’

OLIGO#6 (SEQ ID NO:12):

5' -CTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCC-3 '

OLIGO#7 (SEQ ID NO:13):

' -AAGAGATGAAAAACAACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTT-3 ' OLIGO#8 (SEQ ID NO:14):

’ -GCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTTGAATCTG-3 '

OLIGO#9 (SEQ ID NO:15):

5' -TCTTGGGTGCCCTTGACTTTGCCGCGTTTGTCGATACGCAGGTAC-3 ' OLIGO#10 (SEQ ID NO:16):

’ -ACAGCAACAGTACGGATTTCCATAATATTGTAGTTGTTTTTCATC-3 '

OLIGO#11 (SEQ ID NO:17):

5'-AATTCAGATTCAACACCTTTGATTGCAACGATACCA-3'

OLIGY boli fosforylované T4 polynukleotid kinázou a potom tepelne denaturované. Pomalým znížením teploty na úroveň laboratória potom táto jednoprameňová (ss - single stranded) OLIGA vytvorila dvojprameňové (ds) fragmenty DNA. Potom bola použitá T4 ligáza na kovalentné pripojenie ako interných OLIGO zhodných (sticky) koncov tak celého ds OLIGO fragmentu do KGF plazmidu štiepeného enzýmami KpnI a EcoRI. Nový plazmid bol označený ako KGF(dsd).

KGF gén s úplne optimalizovaným E. coli kodónom bol vytvorený amplifikáciou pomocou PCR s chemicky syntetizovanými OLIGO 12 až 24.

OLIGO#12 (SEQ ID NO:18): 5'-AGTTTTGATCTAGAAGGAGG-3'

OLIGO#13 (SEQ ID NO:19): 5'-TCAAAACTGGATCCTATTAA-3’

OLIGO#14 (SEQ ID NO:20):

' -AGTTTTGATCTAGAAGGAGGAATAACATATGTGCAACGACATGACTCCGGAACAGATGGCTACCAACGTTAACTGCTCCAGCCCGGAACGT- 3 '

OLIGO#15 (SEQ ID NO:21):

5'-CÄCACCCGTAGCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGTGTTCGTCGTCTGTTCTGCCGTACCCAGTGGTACCTGCGTATCGACAAA- 3 '

OLIGO#16 (SEQ ID NO:22):

5' -CGTGGTAAAGTTAAAGGTACCCAGGAAATGAAAAACAACTACAACATCATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGC AATCAAA- 3 '

OLIGO#17 (SEQ ID NO:23):

5' -GGTGTTGAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCAAAAAAAGAATGCAACGAAGACTGCAACTTCAAAGAA- 3 '

OLIGO#18 (SEQ ID NO:24):

5' -CTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCATCTGCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAAGGT-3'

OLIGO#19 (SEQ ID NO:25):

5' -ATCCCGGTTCGTGGTAAAAAAACCAAAAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCAATCACTTAATAGGATCCAGTTTTGA-3 '

OLIGO#20 (SEQ ID NO:26) OLIGO#21 (SEQ ID NO:27) OLIGO#22 (SEQ ID NO:28) OLIGO#23 (SEQ ID NO:29) OLIGO#24 (SEQ ID NO:30)

5'-TACGGGTGTGACGTTCCGGG-3' 5'-CTTTACCACGTTTGTCGATA-3' 5'-ATTCAACACCTTTGATTGCA-3' 5'-CCAGGATCAGTTCTTTGAAG-3' 5'-GAACCGGGATACCTTTCTGG-3'

OLIGY 12 až 24 boli navrhnuté tak, aby celá DNA šekvencia kódujúca natívny KGF bola reprezentovaná OLIGMI z Watsonovho alebo Crickovho prameňa a aby PCR poskytla žiadanú dvojprameňovú DNA sekvenciu (obrázok 6) [PCR 5, teplotný cyklátor model 9600 (Perkin-Elmer Cetus); 21 cyklov skladajúcich sa z denaturácie - 31 sekúnd pri 94 °C, annealingu - 31 sekúnd pri 50’C a elongácie - 73’C počas 31 sekúnd; po týchto 21 cykloch bola PCR reakcia zakončená záverečným siedmi minútovým elongačným krokom]. Po PCR amplifikácii bol výsledný DNA fragment štiepený enzýmami Xbal a BamHI a fragment 521 bp bol ligovaný do expresného plazmidu pCFM1156, ktorý bol štiepený rovnakými enzýmami. PCR 5 používala ako vonkajšie prajmery (100 pmolov/100 μΐ rxn) OLIGO 12 a OLIGO 13 a 1 μ1/100 μΐ rxn KGF templátu odvodeného ligáciou (T4 ligázou) OLIGO 14 až 19 (OLIGO 15 až 18 boli fosforylované T4 polynukleotid kinázou) pri použití OLIGO 20 až 24 ako pomocných oligonukleotidov (band-aid oligos) na ligáciu (Jayraman et al. (1992), Biotechniques, 12:392). Konečný produkt bol označený ako KGE (optimalizovaný kodón).

Všetky tu opísané analógy KGF sú zložené z častí sekvencií DNA nachádzajúcich sa v KGF (dsd) alebo KGF (optimalizovaný kodón) alebo z kombinácie obidvoch. Tieto sekvencie sú dalej modifikované inzerciou do vhodných reštrikčných miest DNA sekvencií, ktoré kódujú špecifické aminokyselinové

KGF analógy, pri použití jednej alebo viacerých techník na syntézu DNA fragmentov opísaných hore. Akýkoívek analóg môže byť vytvorený v celom svojom rozsahu jednou z hore opísaných techník. Všeobecne sa pri konštrukcii OLIGO používali optima 1 i zované E. coli kodóny tam, kde to bolo vhodné, i keď prítomnosť optima1izovaných E. coli kodónov (v časti alebo v celku akéhokoľvek z génov, kde bol tento vplyv zisťovaný) nezvýšila významne výnos proteínu, ktorý mohol byť získaný z kultivovaných bakteriálnych buniek. Obrázky 7-12 sú vhodným príkladom konštrukcie nukleotidových a aminokyselinových šekvencií konkrétnych KGF analógov: C(1,15)S (obrázok 7);

C(1,15)S/R(144)E (obrázok 8); C(1,15)S/R(144)Q (obrázok 9); AN15 (obrázok 10) /IN23 (obrázok 11) a AN23/R(144)Q (obrázok 12). DNA sekvencia všetkých konštruktov KGF analógov tu opísaných bola overená sekvenovaním.

Príklad 2

Purifikácia z E. coli

Pri klonovaní analógov génu KGF boli použité tri rôzne expresné plazmidy. Išlo o pCFM1156 (ATCC 69702), pCFM1656 (ATCC 69576) a pCFM3102 (obrázky 2A, 2B a 2C). Plazmid p3102 môže byt odvodený z plazmidu pCFM1656 sériou miestnych mutagenéz (zmien báz) pomocou PCR s presahujúcimi oligo (PCR overlaping oligo mutagenesis). Začína sa na BglII mieste (v plazmide pCFM1656 180 párov báz) bezprostredne pri 5' replikačného promotoru plazmidu, PcopB, a pokračuje sa smerom ku génom replikácie plazmidu, pričom dochádza k týmto zmenám:

PCFM1656 bp #	bp in PCFM1656	bp changed to in pCFM3lO2
# 204	T/A	C/G
# 428	A/T	G/C
# 509	G/C	A/T

# 617	—	insert two G/C bp
# 677	G/C	T/A
# 978	T/A	C/G
# 992	G/C	A/T
# 1002	A/T	C/G
# 1005	C/G	T/A
# 1026	A/T	T/A
# 1045	C/G	T/A
# 1176	G/C	T/A
# 1464	G/C	T/A
·# 2026	G/C	bp deletion
# 2186	C/G	T/A
# 2479	A/T	T/A
# 2498-2501	AGTG	GTCA
	TCAC	CAGT
# 2641-2647	TCCGAGC	bp deletion

AGGCTCG

#	3441		G/C A/T
#	3452		G/C A/T
#	3649		A/T T/A
#	4556		insert bps
	(SEQ	ID	NO:4 3 ) 5'-GAGCTCACTAGTGTCGACCTGCAG-
	(SEQ	ID	N0:4 4) 5'-CTCGAGTGATCACAGCTGGACGTC-

Ako je patrné z hore uvedeného, plazmidy pCFM1156, PCFM1656 a pCFM3102 sú si vzájomne velmi podobné a obsahujú vela rovnakých reštrikčných miest. Plazmidy boli vybrané podlá ich vhodnosti a časti vektorovej DNA môžu byt jednoducho zmenené pre potreby nových konštruktov. Hostitelským organizmom použitým na všetky klonovania bola E. coli, kmeň FM5 (ATCC: 53911) a transformácia bola vykonaná podlá metódy Hanahana (1983, pozri predchádzajúci text) alebo elektroelúciou s použitím prístroja Gene Pulser transfection apparatus (BioRad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA), podlá protokolu dodaného výrobcom.

Najskôr bolo pripravené malé čerstvé inokulum žiadaného rekombinantného klonu E. coli, obsahujúceho na jednom z troch pCFM vektorov žiadaný konštrukt. 0,1 ml zmrazenej rezervnej kultúry vhodného kmeňa v glycerole bol prenesený do dvojlitrovej fľaše obsahujúcej 500 ml Luriovho bujónu. Kultúra bola trepaná pri 30°C počas 16 hodín. Potom bola kultúra prenesená do 15 1 fermentoru obsahujúceho 8 1 sterilného média používaného na fermentácie vo väčších objemoch (Tsai, et al.(1987), J.Industrial Microbiol., 2:181-187).

Na začiatku fermentácie bolo dodávané živné médium Feed #1 (Tsai, et al. (1987), pozri predchádzajúci text).

V okamihu, keď hodnota OD600 dosiahla hodnotu 35, bola rýchlym zvýšením teploty kultúry na 37 °C indukovaná expresia žiadaného analógu KGF. Pri tejto teplote sa plazmid amplifikuje. Po dvoch hodinách pri 37°C bola teplota kultúry ďalej rýchlo zvýšená na 42 °C, čím bol denaturovaný Cl represor. Pridávanie Feed 1 bolo prerušené a miesto nej bolo potom pridávané živné médium Feed 2 v množstve 300 ml za hodinu. Feed 2 obsahovalo 175 g/1 peptónu (trypticase-peptone), 87,5 g/1 kvasničného extraktu a 260 g/1 glukózy. Po jednej hodine kultivácie pri 42°C bola teplota kultúry znížená na 36°C a táto teplota bola ďalej udržovaná po nasledujúcich šesť hodín.

Fermentor bol potom zastavený a bunky boli koncentrované centrifugáciou v plastikových vreckách vložených do jednolitrových centrifugačných kyviet. Médium bolo centrifugované 60 minút pri 400 otáčkach za minútu. Supernatant bol potom odobraný a peleta (sedimentované bunky) bola zmrazená pri -90°C.

Nasledujúcim spôsobom bola purifikované tieto analógy KGF (získané expresiou v E. coli)i prirodzený KGF,

C(1,15)S, C(1,15)S/R(144)E, C(1,15)S/R(144)Q, AN15, />N23 a AN23/R(144)Q. Peleta (hustá bunková suspenzia) získaná centrifugáciou z vysokohustotnej fermentácie bola resuspendovaná pomocou vhodného výkonného (poskytujúceho veľké strihové sily) mixéru pri 4°C v roztoku 0,2 M NaCI v 20 mM NaPO₄ pH 7,5 tak, aby výsledná suspenzia bola 10-20 % (hm./obj.). Resuspendované bunky boli potom lyzované trojitým homogenizovaním v homogenizátore (APV Gaulin, Inc., Everett, MA, USA). Homogenát vytekajúci z homogenizátoru bol ochladzovaný na 4-8⁶C pomocou vhodného chladiaceho zariadenia. Zvyšky buniek boli odstránené centrifugáciou lyzátu pri 4200 ot./ min., 4°C, počas 30-60 minút v centrifúge J-6B (Beckman Instruments, Inc., Brea, CA, USA, použitý rotor JS 4.2). Supernatant bol potom opatrne dekantovaný a nanesený na vopred pripravenú kolónu (450 ml, 5 cm x 23 cm) S-Sepharosy Fast Flow (Pharmacia). Kolóna bola ekvilibrovaná roztokom 0,2 M NaCI v 20 mM NaPO₄, pH 7,5, pri 4°C. Kolóna bola potom premytá 2250 ml (päťnásobný objem kolóny) roztoku 0,4 M NaCI v 20 mM NaPO₄, pH 7,5, pri 4’C. Purifikovaný proteín bol eluovaný z kolóny 5 1 roztoku 0,5 M NaCI v 20 mM NaP0₄, pH 7,5. Absorbancia eluátu pri 280 nm bola kontinuálne zaznamenávaná a eluát bol zachytávaný do frakcií s objemom 50 ml. Frakcie obsahujúce eluované látky (identifikované pomocou absorbancie pri 280 nm) boli ďalej analyzované pomocou SDSPAGE elektroforézy (14% gél). Touto metódou bola potvrdená prítomnosť požadovaného proteínu vo frakciách.

Frakcie obsahujúce purifikované proteíny boli spojené a následne k nim bola pridaná destilovaná voda v pomere 1:1. Zriedený roztok bol potom nanesený na vopred pripravenú kolónu'(450 ml, 5 cm x 23 cm) S-Sepharosy Fast Flow ekvilibrovanú roztokom 0,4 M NaCI v 20 mM NaP0₄, pH 6,8, pri 4’C. Kolóna bola potom premytá 2250 ml roztoku 0,4 M NaCI v 20 mM NaP0₄, pH 6,8. Proteíny boli potom eluované dvadsaťnásobným objemom kolóny pomocou lineárneho gradientu roztoku

NaCI v 20 mM NaPO₄, pH 6,8 od 0,4 M do 0,6 M NaCI. Opäť boli zachytávané 50 ml frakcie, pri súčasnom meraní absorbancie eluátu pri 280 nm. Frakcie obsahujúce purifikovaný proteín (stanovené pomocou 14% SDS PAGE) boli spojené a skoncentrované filtráciou cez membránu (YM-10, 10000 molecular weight cutoff) v 350 ml nádobách za súčasného miešania (Amicon,

Inc. Mayberry, MA, USA) na výsledný objem 30-40 ml.

Koncentrát bol potom nanesený na kolónu Superdex-75 (Pharmacia) (1300mi, 4,4cm x 85cm) ekvilibrovanou tlmivým roztokom obsahujúcim IX PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, D-PBS, bez obsahu vápenatých a horečnatých iónov) alebo roztokom 0,15 M NaCI v 20 mM NaPO₄, pH 7,0. Po nanesení vzorky boli proteíny eluované z kolóny použitím kolónového tlmivého roztoku. Desaťmililitrové frakcie boli zachytávané a tie, ktoré obsahovali požadovaný analóg (stanovené pomocou 14% SDS-PAGE) boli spojené. Koncentrácia proteínov v takto získanej frakcii bola bežne asi 5-10 mg/ml. Pokial to nie je uvedené inak boli všetky hore uvedené kroky vykonávané pri 4 až 8’C.

Alternatívny postup purifikácie bol použitý v prípade prirodzeného KGF, C(1,15)S aAN23. Pokial to nie je uvedené inak boli všetky kroky vykonávané pri 23 ± 5°C, túto teplotu mali aj všetky použité roztoky a zariadenia.

Po dokončení produkčnej fázy bakteriálnej fermentácie bola bunková kultúra ochladená na 4 až 8° C a bunky boli izolované centrifugáciou alebo iným podobným spôsobom. Na základe očakávaného výťažku proteínu na jednotku bunkovej hmoty a množstva požadovaného purifikovaného proteínu bolo primerané množstvo bunkovej hmoty resuspendované v päťnásobku (váhovo) slabého tlmivého roztoku (0,2 M NaCI, 20 mM NaPO₄, pH 7,5). Bunky boli resuspendované na homogénnu suspenziu pomocou vysokoobrátkového (high shearing) mixéru.

Teplota bunkovej suspenzie bola behom homogenizácie udržovaná na 4 až 8°C.

Bunky boli potom lyzované tlakom, napr. dvojnásobnou homogenizáciou bunkovej suspenzie vo vhodne veľkom bunkovom homogenizátore. Homogenizát bol udržovaný chladný (5 ± 3°C). Na vyčistenie bunkového lyzátu bol použitý vopred pripravený hĺbkový filter (depth filtr housing, Cuno, Inc., Meriden. CT, USA) opatrený filtrom so zodpovedajúcou plochou. Filter bol ekvilibrovaný primeraným množstvom 0,2 M NaCl, pripraveného v 20 mM NaPO₄, pH 7,5. Ekvilibrácia a premytie bolo vykonávané pri 5 ± 3°C. Po vyčistení lyzátu filtráciou cez vhodne upravený filter bol tento premytý roztokom 0,2 M NaCl v 20 mM NaPO₄, pH 7,5. Filtrát a všetky ďalšie premývacie roztoky boli zachytené do chladenej nádoby zodpovedajúceho objemu. Všetky operácie boli vykonávané pri teplote nižšej ako 10’C.

Lyzát bol ďalej prečistený na vopred pripravenej kolóne SP-Sepharosy Fast Flow obsahujúcej minimálne 1 ml Sepharosy na 2 g buniek. Kolóna SP-Sepharosy Fast Flow bola ekvilibrovaná vychladeným (5 ± 3°C) roztokom 0,2 M NaCl v 20 mM NaPO₄, pH 7,5. Teplota kolóny bola udržovaná na hodnote nižšej ako 10°C. Prečistený lyzát (5 ± 3°C) bol potom nanesený na kolónu iónomeniča a absorbancia eluátu bola kontinuálne monitorovaná pri 280 nm. Po nanesení vzorky bola kolóna premytá vychladeným roztokom 0,2 M NaCl v 20 mM NaP0₄, pH 7,5 a následne ešte premytá roztokom 0,3M NaCl v 20 mM NaPO₄, pH 7,5 pri teplote 23 ± 5°C.

Požadovaný proteín bol eluovaný pomocou lineárneho gradientu s koncentráciou 0,2 až 1 M NaCl pripraveného v 20 mM NaPO₄, pH 7,5. Prevažná časť produktu bola zobraná v niekoľkých frakciách na základe merania absorbancie pri 280 nm.

- 22 Na oxidáciu volných SH skupín bol vykonaný oxidačný krok. Pre proteíny so zmeneným obsahom cysteínu, (v porovnaní s prírodným KGF) bolo pridané oxidačné činidlo (napr. cystamín dihydrochlorid, alebo iné vhodné oxidačné činidlo, napríklad cysteín, oxidovaný glutatión alebo ióny Cu²⁺) tak, aby výsledná koncentrácia bola 1 až 20 mM a pH bolo upravené na 7 až 9,5. V prípade, že bol použitý cystamín dihydrochlorid, bolo pH upravené na 9,0 0,3. Oxidácia bola vykonávaná pri 10 až 30’C po vhodný čas. V prípade prírodného KFG bola oxidácia uskutočňovaná prídavkom vhodného množstva (NH₄)₂SO₄, napr. 1 až 2 M (NH₄).₂SO₄ a pH bolo upravené na hodnotu 7,5 až 9,5, pričom teplota bola udržovaná na 23 ± 5°C po primeraný čas. V prípade potreby bol do roztoku pridaný pevný (NH₄)₂S0₄ tak, aby výsledná koncentrácia bola 2 M. Roztok bol zbavený pevných častíc prečistením filtráciou cez vhodný filter.

Filtrát - oxidovaný produkt bol ďalej delený pomocou HIC (hydrophobic interaction chromátography). Ako matrica na HIC bol použitý Butyl-650M Toyopearl (Tosohaas,

Inc., Montgomeryville, PA, USA). Roztok obsahujúci proteín bol nanesený na kolónu, ktorá bola vopred ekvilibrovaná roztokom obsahujúcim 2 M (NH₄)₂SO₄, 0,15 M NaCl, 20 mM NaPO₄, pH 7,0. ’· Po nanesení vzorky bola kolóna premytá roztokom 2 M (NH₄)₂SO₄, 0,15 M NaCl a 20 mM NaPO₄, pH 7,0. Požadovaný proteín bol potom eluovaný znižujúcim sa lineárnym gradientom 2 až 0 M (NH₄)₂SO₄, ktorý bol rozpustený v roztoku 0,15 M NaCl a 20 mM NaP0₄, pH 7,0. V okamihu, keď sa začal požadovaný proteín z kolóny vymývať, čo bolo indikované zvyšujúcou sa absorbanciou eluátu pri 280 nm, boli zachytávané frakcie, časť každej frakcie bola potom analyzovaná pomocou SDS-PAGE. Frakcie obsahujúce požadovaný proteín boli spojené, dobre premiešané a bol stanovený objem takto získanej spojenej frakcie a tiež koncentrácia proteínov v tejto frakcii.

Spojený eluát po HIC, obsahujúci proteín, bol potom skoncentrovaný a elučný tlmivý roztok vymenený. Bežne boli proteíny skoncentrované na 5,0 až 10,0 mg/ml. Ultrafiltrácia bola vykonaná pri použití ultrafiltračného zariadenia opatreného kazetovým systémom Pellicon (Millipore, Inc., Bedford, MA, USA) s membránami s vhodnou velkosťou pórov.

Po skoncentrovaní bola vzorka dialyzovaná (diafiltered) vo vhodnom tlmivom roztoku obsahujúcom 0,15 M NaCl a 20 mM NaPO^, pH 7,0, a to tak dlho, kým sa nelíšila vodivosť koncentrátu od vodivosti roztoku 0,15 M NaCl a 20 mM NaPO^, pH 7,0 o menej ako 5 %.

Okrem toho bola koncentrovaná vzorka obsahujúca proteíny prefiltrovaná cez filtre Posidyne s velkosťou pórov 0,1 μη (Pall, Inc., Cortland, NY, USA). Dôvodom bolo odstránenie vyzrážaného materiálu a bakteriálnych endotoxínov, ktoré sa môžu vo vzorke vyskytovať. Po stanovení koncentrácie proteínov v roztoku a na základe požiadavky na konečnú koncentráciu produktu bol roztok zriedený roztokom 0,15 M NaCl a 20 mM fosforečnanu draselného, pH 7,0. Záverom bola vykonaná sterilizácia filtráciou cez 0,22 μη filter. Konečný produkt bol prenesený do apyrogénnej nádoby na skladovanie (cca pri 5°C) pred dalším spracovaním.

Príklad 3

Purifikácia z bunkovej kultúry cicavca

Tento príklad opisuje expresiu, izoláciu a charakterizáciu dvoch biologicky aktívnych rekombinantných KGF (rKGF), produkovaných v expresnom systému cicavca.

Ľudský gén pre KGF bol izolovaný pomocou PCR, amplifikáciou cDNA získanej z buniek normálnych kožných ludských fibroblastov (Clonetec, Inc., Palo Alto, CA, USA). cDNA bola pripravená pomocou reverznej transkriptázy a potom bola použitá PCR na amplifikáciu génu pre KGF. OLIGO25 a OLIGO26 boli použité na amplifikáciu génu z cDNA a OLIGO27 a OLIGO28 boli pomocou druhej PCR amplifikácie použité na vnesenie reštrikčných miest Hindlll a Bglll na konce fragmentu, tak ako je to vidieť na obrázku 1.

OLIGO#25	(SEQ	ID	NO:45):	5'
OLIGO#26	(SEQ	ID	NO:46):	5'
OLIGO#27	(SEQ	ID	NO:47) :	5'
OLIGO#28	(SEQ	ID	N0:48):	5'

-CAATCTACAATTCACAGA-3'

-TTAAGTTATTGCCATAGG-3'

-AACAAAGCTTCTACAATTCACAGATAGGA-3' -AACAAGATCTTAAGTTATTGCCATAGG-3'

Nasledovalo klonovanie a potvrdenie sekvencie DNA. Potom bol gén pre KGF použitý. Amplifikácia bola vykonaná pri použití dvoch prajmerov:

OLIGO#29 (SEQ. ID. NO:49):

5'-CGGTCTAGACCACCATGCACAAATGGATACTGACATGG-3'

OLIGO#30 (SEQ. ID. NO:50):

5’-GCCGTCGACCTATTAAGTTATTGCCATAGGAAG-3' , Prajmer - OLIGO 29 - (sense primer) obsahoval miesto Xbal a Kozákovu translačnú sekvenciu (5'-CCACC-3') (consensus Kozák translation sequence) pred štartovacím kodónom ATG v smere k 5' koncu. Antisence prajmer - OLIGO 30 - obsahoval klonovacie miesto Sali a ďalší stop kodón. Po 18 cykloch amplifikácie PCR (30 sekúnd denaturácie pri 94°C, 40 sekúnd annealing pri 55°C a 40 sekúnd elongácie pri 72°C) bol produkt štiepený Xbal a Sali a ligovaný s rovnako vyštiepenou DNA z pDSRa2 (podlá metódy Bourdrela et al. (1993), Protein Exp. and Purif, 4:130-140 a Lu et al. (1992), Árch. Biochem. Biophys.298: 150-158). Výsledkom bol plazmid KGF/pDSRa2, v ktorom bol ludský gén pre KGF umiestnený medzi časný promótor SV40 a α-FSH polyadenylovú sekvenciu. Boli vybrané dva klony a analýzou sekvencie DNA sa potvrdila konštrukcia žiadaného vektoru. Dva mikrogramy DNA KGF/pDSRa2 boli potom linearizované pri použití Pvul. CHO bunky (Chinese hamster ovary cells) boli deň pred použitím naočkované v množstve 0,8 x 10⁶ buniek na 60 mm Petriho misku. Takto pripravené bunky boli transfekované pripravenou DNA s použitím štandardnej metódy vyzrážaním pomocou vápenatých a fosfátových iónov (Bourdrel et al., pozri predchádzajúci text). Po dvoch týždňoch boli vybrané jednotlivé kolónie a prenesené na 24 jamkové doštičky. Upravené médiá sa po dosiahnutí konfluencie považovali za prosté séra a alikvóty boli analyzované s využitím Western blotov a s použitím polyklonálneho králičieho antiséra proti ľudskému KGF exprimovanému v E. coli.

Western bloty boli urobené nanesením vzorky na 12,5 % (w/v) SDS polyakrylamidové gély a následnou elektroforézou. Potom nasledovalo prenesenie proteínov pomocou sémidry elektroblotovacieho zariadenia (Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, CA, USA) na nitrocelulózovú membránu. Prenesenie prebiehalo jednu hodinu pri 400 mA.

Ako prenosový tlmivý roztok bol použitý 20 mM Tris, 150 mM glycín a 20% metanol. Nitrocelulózové membrány boli blokované inkubáciou v roztoku 10% normálneho kozieho séra v PBS. Ako primárna protilátka bolo použité králičie antisérum pripravené proti KGF z E. coli. Protilátky boli riedené pre použitie 1 : 10000 v normálnom kozom sére v PBS a inkubované 12 hodín pri izbovej teplote s blokovanými nitrocelulózovými membránami. Nenaviazané protilátky boli potom odstránené tromi 30 minútovými premytiami v PBS.

Nitrocelulózové membrány boli potom inkubované v 100 ml roztoku 1% normálneho kozieho séra v PBS obsahujúceho sekundárne protilátky (Vectastain biotinylované kozie protilátky proti králičiemu IgG, Vector Labs, Burlingame, USA). Inkubácia prebiehala 30 minút pri izbovej teplote.

Nasledovalo trojnásobné desaťminútové premytie v PBS a potom 30 minútová inkubácia pri izbovej teplote s 100 ml roztoku 1% normálneho kozieho séra obsahujúceho streptavidín a biotinylovanú peroxidázu, pripravenú podlá návodu výrobca (Vector Labs). Opäť nasledovalo trojnásobné premytie v PBS. Látky krížovo reagujúce s protilátkami proti KGF boli vizualizované inkubáciou membrán v zmesi 60 1 30% (hm./obj.) H₂O₂ v 100 ml PBS a 50 mg 4-chlórnaftolu v 20 ml metanolu. Reakcia bola zastavená po 10 minútach opláchnutím membrán vo vode.

Analýza blotov ukázala, že špecifické protilátky proti KGF reagujú s tromi zretelne oddelenými prúžkami proteínov. Dva z nich boli blízko seba s molekulovou hmotnosťou okolo 25 až 29 kDa a jeden mal približnú molekulovú hmotnosť 17 kDa, pričom predpokladaná molekulová hmotnosť konečného proteinu s 163 aminokyselinami bola 18,8 kDa. Niekoťko vysoko exprimovaných klonov sekretujúcich viac ako 2,0 mg rKGF na liter (ako to bolo možné odhadnúť z analýzy Western blotov), bolo ďalej vyčlenených a prenesených (podía metódy Lu, et al., pozri predchádzajúci text) do flaší, kde boli pestované tak, aby výsledkom bolo velké množstvo média bez séra, vhodného na purifikáciu KGF pomocou iónomeničovej chromatografie s využitím katexu a následne gélovej chromatografie podía postupu opísaného ďalej.

KGF bolo purifikované z troch litrov upraveného bezsérového média tak, že médium bolo priamo nanesené na iónomeničovú kolónu (5 x 24 cm) naplnenú 450 ml sulfoetyl SP-Sepharosy Fast Flow (Pharmacia), ekvilibrovanú 20 mM fosforečnanom sodným, pH 7,5. Po premytí kolóny päťnásobným objemom kolóny roztokom 20 mM fosforečnanu sodného, 0,2M NaCI, pH 7,5 bol rKGF vymytý lineárnym gradientom od 0,2 do 1,0 M NaCI rozpusteného v 20 mM fosforečnane sodnom (pH 7,5). Objem použitého roztoku sa rovnal dvadsaťnásobku objemu ko- 27 Ióny. Boli zberané 50 ml frakcie a absorbancia pri 280 nm bola priebežne monitorovaná. Proteín KGF bol detektovaný analýzou alikvótov každej frakcie pomocou SDS-PAGE. SDS-PAGE bola vykonávaná pri použití elektroforetického systému (Novex, San Diego, CA, USA) a pri použití vopred pripravených 14% Tris-glycín gélov (pódia metódy Laemliho (1970), Náture, 227:680-685). Vzorky boli zmiešané s neredukujúcim SDS vzorkovým tlmivým roztokom bez zahrievania pred nanášaním. Proteíny boli detektované farbením Coomassie blue alebo farbením striebrom. Dva piky, ktoré boli eluované neskoršie obsahovali proteínové prúžky zodpovedajúce molekulovej hmotnosti 25-29 kDa a prúžok s hmotnosťou 17 kDa, ktorý bol detektovaný Western blotom. Frakcie obsahujúce každý z týchto dvoch pikov boli separátne koncentrované na objem menší ako 1 ml a potom boli ďalej delené gélovou filtráciou.

Na gélovú filtráciu boli použité kolóny Superdexu75 (HR 10/30, Pharmacia) ekvilibrované PBS s pH 7,2. Kolóna bola nakalibrovaná pri použití nasledujúcich známych štandardov molekulových hmotností (BioRad, San Francisco, CA, USA): tyroglobulín (670 kDa), gama-globulín (158 kDa), ovalbumín (44 kDa), myoglobín (17 kDa) a vitamín B-12 (1,4 kDa). Tieto purifikačné kroky viedli k približne 2000 násobnému obohateniu o rKGF, najmä o 17 kDa a 30kDa proteíny, ako ukázalo farbenie striebrom.

V prípade látky s vyššou molekulovou hmotnosťou, bol rKGF eluovaný ako velký symetrický pik, ktorý bol nazývaný KGF-a. Keď bolo pomocou SDS-PAGE analyzované menšie množstvo látok z tejto frakcie (3 g/líniu oproti 6 g/líniu) objavili sa dva prúžky s rozdielom molekulových hmotností cca 1 až 2kDa. V prípade látok s nižšou molekulovou hmotnosťou, ktoré boli nazývané KGF-b, viedla gélová filtrácia k príprave proteínu majúceho predpokladanú pohyblivosť. Pre obidva typy proteínov (KGF-a i KGF-b) bola celková výťažnosť purifikácie asi 30-40 %.

Ďalej bolo analyzované aminokyselinové zloženie KGF-a a KGF-b. Tiéto analýzy boli uskutočnené na automatickom sekvenátore (Model 477A alebo 470A, Applied Biosystm. Inc., Foster City, CA, USA) opatrenom on-line PTH aminoanalyzátorom (Model 120A) a systémom zberu dát (Model 900A) (podľa metódy Lu et al., (1997), J.Biol Chem., 266: 81028107). Edmanove sekvenačné analýzy KGF-a ukázali N-terminálnu sekvenciu X₁-N-D-M-T-P-E-Q-M-A-T-A-V-X₂-X₃-S- (SEQ ID N0:51). Minoritné sekvencie začínajúce od tretej N-terminálnej aminokyseliny - kyseliny aspartámovej - boli prítomné v množstve 1,6 % celkového sekvenovateľného protexnu. X_1# X₂ a X₃ neboli určené z dôvodov neprítomnosti PTH (fenyltiohydantoinyl) aminokyselinového signálu behom sekvenčnej analýzy.

Je zaujímavé, že analýza sekvencie N-terminálového konca KGF-b odhalila sekvenciu S-Y-D-Y-M-E-G-G-D-I-R-V- (SEQ ID NO:52), naznačujúcu, že ide o formu KGF skrátenú na Nterminálovom konci, kde bol KGF proteolyticky rozštiepený v peptidovej väzbe Arg^-ser^⁴.

Na ďalšiu charakterizáciu purifikovaných KGF-a a KGF-b boli proteíny pri použití známych techník vystavené pôsobeniu glykozidáz (neuraminidáze, O-glykanáze a/alebo Nglykanáze) (Sasaki et al. (1987), J. Biol. Chem, 262: 1205912076 Takuchi et al. (1988), J.Biol. Chem., 263: 3657-3663, Zsebo et al. (1990), Celí, 63:195-201). Výsledky ukazujú, že KGF-a obsahuje N- a O-viazané cukry, hoci forma KGF-a s nižšou molekulovou hmotnosťou obsahuje pravdepodobne iba N-viazané cukry. Použitie glykozidáz nespôsobilo znížení molekulovej hmotnosti pri KGF-b, čo naznačuje, že molekula je neglykozylovaná.

Príklad 4

Biologická aktivita

Každý z analógov KGF bol zriedený a meraním príjmu [³H] tymidínu bunkami Balb/MK (podlá metódy Rubína et al. (1989, pozri predchádzajúci text) bola zmeraná jeho biologická aktivita. Vzorky boli najskôr nariedené pomocou média zloženého z 50 % Eagle's MEM média (pripraveného na objednávku) , 50 % F12 rovnako pripraveného na objednávku, 5A,g/ml transferínu, 5 ng/ml seleničitanu sodného, 0,0005 % HSA a 0,005 % Tween 20. Vzorky KGF boli potom pridané do 96jamkových doštičiek Falcon Primeria, v ktorých boli už Balb/MK bunky. Bolo merané zabudovanie [³H] tymidínu behom syntézy DNA. Táto inkorporácia bola potom prerátaná na vplyv prirodzeného KGF porovnaním so štandardnou krivkou pre prirodzený KGF. Všetky testované analógy vykazovali mitogénnu aktivitu.

Interakcia s receptorom pre KGF bola stanovená pri použití izolovaných receptorových membrán pre KGF pripravených z myších epidermálnych keratinocytov Balb/MK (bol použitý postup opísaný Massague (19932), J. Biol. Chem., 258: 13614-13620). Rôzne formy KGF boli nariedené 50 mM Tris-HCl tlmivým roztokom s pH 7,5, obsahujúcim 0,2% hovädzí sérumalbumín a to tak, aby výsledné koncentrácie boli od 0,8 ng do 100 ng/50 μΐ. Potom boli individuálne inkubované s membránovým preparátom (75 ng/ml) a ¹²⁵I-značeným KGF (1,5 ng) získaným z E. coli. Väzbové a kompetitívne experimenty boli robené pri 4°C počas 16 hodín. Po tomto čase boli vzorky centrifugované a premyté dvakrát hore uvedeným riediacim tlmivým roztokom tak, aby bol odstránený nenaviazaný a nešpecifický viazaný značený KGF. Potom bola vo vzorkách meraná zvyšná rádioaktivita.

Kompetitívne krivky pre väzbu na receptor medzi vzorkami KGF a značeným KGF boli vynesené ako percentá nevytesnenej väzby versus koncentrácia každej zo vzoriek KGF. Kompetičné testy pri použití značeného KGF ukázali, že KGF z E. coli, KGF-a a KGF-b majú podobnú väzbovú aktivitu.

Predkladaný vynález bol hore opísaný všeobecne aj na konkrétnych príkladoch. Je zrejmé, že odborníci odhalia ďalšie obmeny a modifikácie hore opísaných postupov.

I

ZOZNAM SEKVENCIÍ (1) Základné informácie:

(i) Žiadate!: Amgen Inc.

(ii) Názov vynálezu: Spôsob purifikácie keratinocytových rastových faktorov (iii) Počet sekvencií: 52 (iv) Korešpondenčná adresa:

(A) Adresát: Amgen nc.

(B) Ulica: 1840 DeHavilland Drive (C) Mesto: Thousand Oaks (D) Štát: Kalifornia (E) Zem: U.S.A.

(F) ZIP: 91320-1789 (v) Médium vhodné na počítačové spracovanie (A) Typ média: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilný (C) Operačný systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (ii) Súčasné údaje o žiadosti (A) Číslo žiadosti: US 008/48,830 (B) Dátum registrácie:

(C) Klasifikácia: neznáma (1) Informácie o SEQ ID N0:l:

(i) Charakteristika sekvencie (A) Dĺžka: 862 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina i (C) Počet reťazcov: neznámy (D) Topológia: neznáma (ii) Typ-molekuly: cDNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID N0:l:

CAATCTACAA	TTCACAGATA	GGAAGAGGTC	AATGACCTAG	GAGTAACAAT	CAACTCAAGA	60
TTCATTTTCA	TTATGTTATT	CATGAACACC	CGGAGCACTA	CACTATAATG	CACAAATGGA	120
TACTGACATG	GATCCTGCCA	ACTTTGCTCT	ACAGATCATG	CTTTCACATT	ATCTGTCTAG	180
TGGGTACTAT	ATCTTTAGCT	TGCAATGACA	TGACTCCAGA	GCAAATGGCT	ACAAATGTGA	240
ACTGTTCCAG	CCCTGAGCGA	CACACAAGAA	GTTATGATTA	CATGGAAGGA	GGGGATATAA	300
GAGTGAGAAG	ACTCTTCTGT	CGAACACAGT	GGTACCTGAG	GATCGATAAA	AGAGGCAAAG	360
TAAAAGGGAC	CCAAGAGATG	AAGAATAATT	ACAATATCAT	GGAAATCAGG	ACAGTGGCAG	420
TTGGAATTGT	GGCAATCAAA	GGGGTGGAAA	GTGAATTCTA	TCTTGCAATG	AACAAGGAAG	480
GAAAACTCTA	TGCAAAGAAA	GAATGCAATG	AAGATTGTAA	CTTCAAAGAA	CTAATTCTGG	540
AAAACCATTA	CAACACATAT	GCATCAGCTA	1 AATGGACACA	CAACGGAGGG	GAAATGTTTG	600
TTGCCTTAAA	TCAAAAGGGG	ATTCCTGTAA	GAGGAAAAAA	AACGAAGAAA	GAACAAAAAA	660
CAGCCCACTT	TCTTCCTATG	GCAATAACTT	AATTGCATAT	GGTATATAAA	GAACCCAGTT	720
CCAGCAGGGA	GATTTCTTTA	AGTGGÄCTGT	TTTCTTTCTT	CTCAAAATTT	TCTTTCCTTT	780
TATTTTTTAG	TAATCAAGAA	AGGCTGGAAA	AACTACTGAA	AAACTGATCA	AGCTGGACTT	840
GTGCATTTAT	GTTTGTTTTA	AG				862

(2) Informácie o SEQ ID NO:2:

(i) Charakteristika sekvencie (A) Dĺžka: 194 aminokyselín (B) Typ: aminokyseliny (C) Počet reťazcov: neznámy (D) .Topológia: neznáma (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:2:

Met 1

Kis

Lys

Trp

íle 5

Leu

Thr

Trp

íle

Leu 10

Pro

Thr

Leu

Leu

Tyr 15

Arg

Ser

Cys

Phe

His 20

íle

íle

Cys

Leu

Val 25

Gly

Thr

íle

Ser

Leu 30

Ala

Cys

Asn

Asp

Met 35

Thr

Pro

Glu

Gin

Met 40

Ala

Thr

Asn

Val

Asn 45

Cys

Ser

Ser

Pro

Glu 50

Arg

His

Thr

Arg

Ser 55

Tyr

Asp

Tyr

Met

Glu 60

Gly

Gly

Asp

íle

Arg 65

Val

Arg

Arg

Leu

Phe 70

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp 75

Tyr

Leu

Arg

íle

Asp 80

Lys

Arg

Gly

Lys

Val 85

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu 90

Met

Lys

Asn

Asn

Tyr 95

Asn

íle

Met

Glu

íle 100

Arg

Thr

Val

Ala

Val 105

Gly

íle

Val

Ala

íle 110

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Glu

Phe

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

115 120 125

Ala

Lys 130

Lys

Glu

Cys

Asn

Glu 135

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys 140

Glu

Leu

íle

Leu

Glu 145

Asn

His

Tyr

Asn

Thr 150

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys 155

Trp

Thr

His

Asn

Gly 160

Gly

Glu

Met

Phe

Val 165

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys 170

Gly

íle

Pro

Val

Arg 175

Gly

Lys

Lys

Thr

Lys 180

Lys

Glu

Gin

Lys

Thr 185

Ala

His

Phe

Leu

Pro 190

Met

Ala

íle Thr (2) Informácie o SEQ ID NO:3:

(i) Charakteristika sekvencie (A) Dĺžka: 595 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: neznámy (D) Topológia: neznáma (ii) Typ.molekuly: cDNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:3:

ATCGATTTGA	TTCTAGAAGG	AGGAATAACA	TATGAAAAAG	CGCGCACGTG	CTATCGCCAT	60
TGCTGTGGCT	CTGGCAGGTT	TCGCAACTAG	TGCACACGCG	TGCAATGACA	TGACTCCAGA	120
GCAAATGGCT	ACAAATGTGA	ACTGTTCCAG	CCCTGAGCGA	CACACAAGAA	GTTATGATTA	180
CATGGAAGGA	GGGGATATAA	GAGTGAGAAG	ACTCTTCTGT	CGAACACAGT	GGTACCTGAG	240
GATCGATAAA	AGAGGCAAAG	TAAAAGGGAC	CCAAGAGATG	AAGAATAATT	ACAATATCAT	300
GGAAATCAGG	ACAGTGGCAG	TTGGAATTGT	GGCAATCAAA	GGGGTGGAAA	GTGAATTCTA	360
TCTTGCAATG	AACAAGGAAG	GAAAACTCTA	TGCAAAGAAA	GAATGCAATG	AAGATTGTAA	420
CTTCAAAGAA	CTAATTCTGG	AAAACCATTA	CAACACATAT	GCATCAGCTA	AATGGACACA	480
CAACGGAGGG	GAAATGTTTG	TTGCCTTAAA	TCAAAAGGGG	ATTCCTGTAA	GAGGAAAAAA	540
. AACGAAGAAA	GAACAAAAAA	CAGCCCACTT	TCTTCCTATG	GCAATAACTT	AATAG	595

(2) Informácie o SEQ ID NO:4:

(i) charakteristika sekvencie (A) Dĺžka: 186 aminokyselín (B) Typ: aminokyseliny (C) Počet reťazcov: neznámy (D) Topológia: neznáma (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:4:

Met 1

Lys

Lys

Arg

Ala 5

Arg

Ala

íle

Ala

íle 10 ,

Ala 9

Val

Ala

Leu

Ala 15

Gly

Phe

Ala

Thr

Ser 20

Ala

His

Ala

Cys

Asn 25

Asp

Met

Thr

Pro

Glu 30

Gin

Met

Ala

Thr

Asn 35

Val

Asn

Cys

Ser

Ser 40

Pro

Glu

Arg

His

Thr 45

Arg

Ser

Tyr

Asp

Tyr 50

Met

Glu

Gly

Gly

Asp 55

íle

Arg

Val

Arg

Arg 60

Leu

Phe

Cys

Arg

Thr 65

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg 70

Xle

Asp

Lys

Arg

Gly 75

Lys

Val

Lys

Gly

Thr 80

Gin

Glu

Met

Lys

Asn 85

Asn

Tyr

Asn

íle

Met 90

Glu

íle

Arg

Thr

Val 95

Ála

Val

Gly

íle

Val 100

Ala

íle

Lys

Gly

Val 105

Glu

Ser

Glu

Phe

Tyr 110

Leu

Ala

Met

Asn

Lys 115

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr 120

Ala

Lys

Lys

Glu

Cys 125

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn 130

Phe

Lys

Glu

Leu

íle 135

Leu

Glu

Asn

His

Tyr 140

Asn

Thr

Tyr

Ala

Ser 145

Ala

Lys

Trp

Thr

His 150

Asn

Gly

Gly

Glu

Met 155

Phe

Val

Ala

Leu

Asn 160

Gin

Lys

Gly

íle

Pro 165

Val

Arg

Gly

Lys

Lys 170

Thr

Lys

Lys

Glu

Gin 175

Lys

Thr

Ala

His

Phe 180

Leu

Pro

Met

Ala

íle 185

Thr

(2) Informácie o SEQ ID NO:5:

(i) Charakteristika sekvencie (A) Dĺžka: 499 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet retazcov: neznámy (D) Topológia: neznáma (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:5:

TATGTGCAAT GACATGACTC CAGAGCAAAT GGCTACAAAT GTGAACTGTT CCAGCCCTGA

GCGACACACA AGAAGTTATG ATTACATGGA AGGAGGGGAT ATAAGAGTGA GAAGACTCTT

CTGTCGAACA CAGTÚGTACC TGAGGATCGA TAAAAGAGGC AAAGTAAAAG GGACCCAAGA

120

180

GATGAAGAAT	AATTACAATA	TCATGGAAAT	CAGGACAGTG	GCAGTTGGAA	TTGTGGCAAT	240
CAAAGGGGTG	GAAAGTGAAT	TCTATCTTGC	AATGAACAAG	GAAGGAAAAC	TCTATGCAAA	300
GAAAGAATGC	AATGAAGATT	GTAACTTCAA	AGAACTAATT	CTGGAAAACC	ATTACAACAC	360
ATATGCATCA	GCTAAATGGA	CACACAACGG	AGGGGAAATG	TTTGTTGCCT	TAAATCAAAA	420
GGGGATTCCT	GTAAGAGGAA	AAAAAACGAA	GAAAGAACAA	AAAACAGCCC	ACTTTCTTCC	480
TATGGCAATA	ACTTAATAG					499

(2) Informácie o SEQ ID NO:6:

(i) Charakteristika sekvencie (A) Dĺžka: 164 aminokyselín (B) Typ: aminokyseliny (C) Počet reťazcov: neznámy (D) Topológia: neznáma (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:6:

Met 1

Cys

Asn

Asp

Met 5

Thr

Pro

Glu

Gin

Met 10

Ala

Thr

Asn

Val

Asn 15

Cys

Ser

Ser

Pro

Glu 20

Arg

His

Thr

Arg

Ser 25

Tyr

Asp

Tyr

Met

Glu 30

Gly Gly

Asp

íle

Arg 35

Val

Arg

Arg

Leu

Phe 40

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp 45

Tyr

Leu

Arg

íle

Asp 50

Lys

Arg

Gly

Lys

Val 55

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu 60

Met

Lys

Asn

Asn

Tyr 65

Asn

íle

Met

Glu

íle 70

Arg

Thr

Val

Ala

Val 75

Gly

íle

Val

Ala

íle 80

Lys

Gly

Val

Glu

Ser 85

Glu

Phe

Tyr

Leu

Ala 90

Met

Asn

Lys

Glu

Gly 95

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys 100

Lys

Glu

Cys

Asn

Glu 105

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys 110

Glu

Leu

íle

Leu

Glu 115

Asn

His

Tyr

Asn

Thr 120

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys 125

Trp

Thr

His

Asn

Gly Gly 130

Glu

Met

Phe

Val 135

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys 140

Gly

íle

Pro

Val

Arg 145

Gly Lys

Lys

Thr

Lys 150

Lys

Glu

Gin

Lys

Thr 155

Ala

His

Phe

Leu

Pro 160

Met

Ala

íle

Thr

(2) Informácie o SEQ ID NO:7:

(i) Charakteristika sekvencie (A) Dĺžka: 25 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: neznámy (D) Topológia: neznáma (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:7:

CAATGACCTA GGAGTAACAA TCAAC 25 (2) Informácie o SEQ ID NO:8:

(i) Charakteristika sekvencie (A) DÍžka: 26 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: neznámy (D) Topológia: neznáma (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:8:

AAAACAAACA TAAATGCACA AGTCCA 26 (2) Informácie o SEQ ID NO:9:

(i) Charakteristika sekvencie (A) DÍžka: 26 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: neznámy (D) Topológia: neznáma (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:9:

ACAACGCGTG CAATGACATG ACTCCA (2) Informácie o SEQ ID NO:10:

(i) Charakteristika sekvencie (A) DÍžka: 31 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: neznámy (D) Topológia: neznáma (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:10:

ACAGGATCCT ATTAAGTTAT TGCCATAGGA A 31 (2) Informácie o SEQ ID NO:11:

(i) Charakteristika sekvencie (A) Dĺžka: 27 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: neznámy (D) Topológia: neznáma (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:11:

ACACATATGT GCAATGACAT GACTCCA 27 (2) Informácie o SEQ ID NO:12:

(i) Charakteristika sekvencie (A) Dĺžka: 37 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: neznámy (D) Topológia: neznáma (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:12:

CTGCGTATCG ACAAACGCGG CAAAGTCAAG GGCACCC 3(2) Informácie o SEQ ID NO:13:

(i) Charakteristika sekvencie (A) Dĺžka: 44 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: neznámy (D) Topológia: neznáma (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:13:

AAGAGATGAA AAACAACTAC AATATTATGG AAATCCGTAC TGTT 44 (2) Informácie o SEQ ID NO:14:

(i) Charakteristika sekvencie (A) DÍžka: 37 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: neznámy (D) Topológia: neznáma (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:14:

GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT GAATCTG (2) Informácie o SEQ ID NO:15:

(i) Charakteristika sekvencie (A) Dĺžka: 45 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: neznámy (D) Topológia: neznáma (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:15:

TCTTGGGTGC CCTTGACTTT GCCGCGTTTG TCGATACGCA GGTAC 45 (2) Informácie o SEQ ID NO:16:

(i) Charakteristika sekvencie (A) Dĺžka: 45 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: neznámy (D) Topológia: neznáma (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:16:

ACAGCAACAG TACGGATTTC CATAATATTG TAGTTGTTTT TCATC . .

(2) Informácie o SEQ ID NO:17:

(i) Charakteristika sekvencie (A) Dĺžka: 36 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: neznámy (D) Topológia: neznáma (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:17:

AATTCAGATT CAACACCTTT GATTGCAACG ATACCA (2) Informácie o SEQ ID NO:18:

(i) Charakteristika sekvencie (A) Dĺžka: 20 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: neznámy (D) Topológia: neznáma (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:18:

AGTTTTGATC TAGAAGGAGG (2) Informácie o SEQ ID NO:19:

(i) Charakteristika sekvencie (A) Dĺžka: 20 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: neznámy (D) Topológia: neznáma (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:19:

TCAAAACTGG ATCCTATTAA (2) Informácie o SEQ ID NO:20:

(i) Charakteristika sekvencie (A) Dĺžka: 91 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: neznámy (D) Topológia: neznáma (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:20:

AGTTTTGATC TAGAAGGAGG AATAACATAT GTGCAACGAC ATGACTCCGG AACAGATGGC

TACCAACGTT AACTGCTCCA GCCCGGAACG T (2) Informácie o SEQ ID NO:21:

(i) Charakteristika sekvencie (A) Dĺžka: 90 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: neznámy (D) Topológia: neznáma (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:21:

CACACCCGTA GCTACGACTA CATGGAAGGT GGTGACATCC GTGTTCGTCG TCTGTTCTGC

CGTACCCAGT GGTACCTGCG TATCGACAAA (2) Informácie o SEQ ID NO:22:

(i) Charakteristika sekvencie (A) Dĺžka: 90 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: neznámy (D) Topológia: neznáma (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:22:

- 43 CGTGGTAAAG TTAAAGGTAC CCAGGAAATG AAAAACAACT ACAACATCAT GGAAATCCGT ACTGTTGCTG TTGGTATCGT TGCAATCAAA (2) Informácie o SEQ ID NO:23:

(i) Charakteristika sekvencie (A) Dĺžka: 90 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: neznámy (D) Topológia: neznáma (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:23:

GGTGTTGAAT CTGAATTCTA CCTGGCAATG AACAAAGAAG GTAAACTGTA CGCAAAAAAA GAATGCAACG AAGACTGCAA CTTCAAAGAA (2) Informácie o SEQ ID NO:24:

(i) Charakteristika sekvencie (A) Dĺžka: 90 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: neznámy (D) Topológia: neznáma (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:24:

CTGATCCTGG AAAACCACTA CAACACCTAC GGATCTGCTA AATGGACCCA CAACGGTGGT GAAATGTTCG TTGCTCTGAA CCAGAAAGGT

- 44 (2) Informácie o SEQ ID NO:25:

(i) Charakteristika sekvencie (A) Dĺžka: 88 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: neznámy (D) Topológia: neznáma (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:25:

ATCCCGGTTC GTGGTAAAAA AACCAAAAAA GAACAGAAAA CCGCTCACTT CCTGCCGATG GCAATCACTT AATAGGATCC AGTTTTGA (2) Informácie o SEQ ID NO:26:

(i) Charakteristika sekvencie (A) Dĺžka: 20 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: neznámy (D) Topológia: neznáma (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:26:

TACGGGTGTG ACGTTCCGGG (2) Informácie o SEQ ID NO:27:

(i) Charakteristika sekvencie (A) Dĺžka: 20 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: neznámy (D) Topológia: neznáma (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:27

CTTTACCACG TTTGTCGATA (2) Informácie o SEQ ID NO:28:

(i) Charakteristika sekvencie (A) DÍžka: 20 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: neznámy (D) Topológia: neznáma (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:28:

ATTCAACACC TTTGATTGCA (2) Informácie o SEQ ID NO:29:

(i) Charakteristika sekvencie (A) DÍžka: 20 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: neznámy (D) Topológia: neznáma (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:29:

CCAGGATCAG TTCTTTGAAG 20 (2) Informácie o SEQ ID NO:30:

(i) Charakteristika sekvencie (A) .DÍžka: 20 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: neznámy (D) Topológia: neznáma (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:30:

GAACCGGGAT ACCTTTCTGG (2) Informácie o SEQ ID NO:31:

(i) Charakteristika sekvencie (A) Dĺžka: 495 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: neznámy (D) Topológia: neznáma (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:31:

(xi)Popis sekvence: SEQ ID NO :31:

ATGTCTAATG ATATGACTCC GGAACAGATG GCTACCAACG TTAACTCCTC CTCCCCGGAA 60

CGTCACACGC GTTCCTACGA CTACATGGAA GGTGGTGACA TCCGCGTACG TCGTCTGTTC 120

TGCCGTACCC AGTGGTACCT GCGTATCGAC AAACGCGGCA AAGTCAAGGG CACCCAAGAG 180

ATGAAAAACA ACTACAATAT TATGGAAATC CGTACTGTTG CTGTTGGTAT CGTTGCAATC 240

AAAGGTGTTG AATCTGAATT CTACCTGGCA ATGAACAAAG AAGGTAAACT GTACGCAAAA 300

AAAGAATGCA ACGAAGACTG CAACTTCAAA GAACTGATCC TGGAAAACCA CTACAACACC 360

TACGCATCTG CTAAATGGAC CCACAACGGT GGTGAAATGT TCGTTGCTCT GAACCAGAAA 420

GGTATCCCGG TTCGTGGTAA AAAAACCAAA AAAGAACAGA AAACCGCTCA CTTCCTGCCG 480

ATGGCAATCA CTTAA 495 (2) Informácie o SEQ ID NO:32:

(i) Charakteristika sekvencie (A) Dĺžka: 168 aminokyselín (B) Typ: aminokyseliny (C) Počet reťazcov: neznámy (D) Topológia: neznáma (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:32:

Met Ser Asn Asp Met Thr Pro Glu Gin Met Ala Thr Asn Val Asn Ser

1

5

10

15

Ser

Ser

Pro

Glu 20

Arg

His

Thr

Arg

Ser 25

Tyr

Asp

Tyr

Met

Glu 30

Gly

Gly

Asp

íle

Arg 35

Val

Arg

Arg

Leu

Phe 40

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp 45

Tyr

Leu

Arg

íle

Asp 50

Lys

Arg

Gly

Lys

Val 55

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu 60

Met

Lys

Asn

Asn

Tyr 65

Asn

íle

Met

Glu

íle 70

Arg

Thr

Val

Ala

Val 75

Gly

íle

Val

Ala

íle 80

Lys

Gly

Val

Glu

Ser 85

Glu

Phe

Tyr

Leu

Ala 90

Met

Asn

Lys

Glu

Gly 95

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys 100

Lys

Glu

Cys

Asn

Glu 105

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys 110

Glu

Leu

íle

Leu

Glu 115

Asn

His

Tyr

Asn

Thr 120

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys 125

Trp

Thr

His

Asn

Gly 130

Gly

Glu

Met

Phe

Val 135

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys 140

Gly

íle

Pro

Val

Arg

Gly

Lys

Lys

Thr

Lys

Lys

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

145	150	155	160
Met Ala íle Thr
1 Informácie o	SEQ ID NO:33:

(i) Charakteristika sekvencie (A) Dĺžka: 495 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: neznámy (D) Topológia: neznáma (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:33:

ATGTGCAATG ATATGACTCC TGAACAAATG GCTACCAATG TCAACTGTTC CTCTCCGGAG CGCCACACCC GGAGTTACGA TTACATGGAA GGTGGGGATA TTCGCGTACG TCGTCTGTTC

TGCCGTACCC AGTGGTACCT GCGTATCGAC AAACGCGGCA AAGTCAAGC-G CACCCAAGAG

120

180 ť'

ATGAAAAACA	ACTACAATAT	TATGGAAATC	CGTACTGTTG	CTGTTGGTAT	CGTTGCAATC	240
AAAGGTGTTG	AATCTGAATT	CTATCTTGCA	ATGAACAAGG	AAGGAAAACT	CTATGCAAAG	300
AAAGAATGCA	ATGAAGATTG	TAACTTCAAA	GAACTAATTC	TGGAAAACCA	TTACAACACA	360
TATGCATCTG	CTAAATGGAC	CCACAACGGT	GGTGAAATGT	TCGTTGCTCT	GAACCAGAAA	420
GGTATCCCTG	TTCAAGGTAA	GAAAACCAAG	AAAGAACAGA	AAACCGCTCA	CTTCCTGCCG	480
ATGGCAATCA	CTTAA				•	495

(2) Informácie o SEQ ID NO:34:

(i) Charakteristika sekvencie (A) Dĺžka: 164 aminokyselín (B) Typ: aminokyseliny (C) Počet reťazcov: neznámy (D) Topológia: neznáma (ii) Typ molekuly: proteín

(xi) Opis

sekvencie:

SEQ ID NO

:34

•

Met 1

Cys Asn

Asp

Met 5

Thr

Pro

Glu

Gin

Met 10

Ala

Thr

Asn

Val

Asn 15

Cys

Ser

Ser Pro

Glu 20

Arg

His

Thr

Arg

Ser 25

Tyr

Asp

Tyr

Met

Glu 30

Gly

Gly

Asp

íle Arg 35

Val

Arg

Arg

Leu

Phe 40

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp 45

Tyr

Leu

Arg

íle

Asp Lys 50

Arg

Gly

Lys

Val 55

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu 60

Met

Lys

Asn

Asn

Tyr 65

Asn íle

Met

Glu

íle 70

Arg

Thr

Val

Ala

Val 75

Gly

íle

Val

Ala

íle 80

Lys

Gly Val

Glu

Ser 85

Glu

Phe

Tyr

Leu

Ala 90

Met

Asn

Lys

Glu

Gly 95

Lys

Leu

Tyr Ala

Lys 100

Lys

Glu

Cys

Asn

Glu 105

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys 110

Glu

Leu

íle

Leu Glu 115

Asn

His

Tyr

Asn

Thr 120

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys 125

Trp

Thr

His

Asn

Gly Gly 130

Glu

Met

Phe

Val 135

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys 140

Gly

íle

Pro

Val

Gin 145

Gly Lys

Lys

Thr

Lys 150

Lys

Glu

Gin

Lys

Thr 155

Ala

His

Phe

Leu

Pro 160

Met Ala íle Thr (2) Informácie o SEQ ID NO:35:

(i) Charakteristika sekvencie (A) Dĺžka: 495 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: neznámy (D) Topológia: neznáma (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:35:

atgtctaatg atatgactcc ggaacagatg gctaccaacg TTAACTCCTC CTCCCCGGAA 60

CGTCACACGC GTTCCTACGA CTACATGGAA GGTGGTGACA TCCGCGTACG TCGTCTGTTC 120

TGCCGTACCC AGTGGTACCT GCGTATCGAC AAACGCGGCA AAGTCAAGGG CACCCAAGAG 180

ATGAAAAACA ACTACAATAT TATGGAAATC CGTACTGTTG CTGTTGGTAT CGTTGCAATC 240

AAAGGTGTTG AATCTGAATT CTATCTTGCA ATGAACAAGG AAGGAAAACT CTATGCAAAG 300

AAAGAATGCA ATGAAGATTG TAACTTCAAA GAACTAATTC TGGAAAACCA TTACAACACA 360

TATGCATCTG CTAAATGGAC CCACAACGGT GGTGAAATGT TCGTTGCTCT GAACCAGAAA 420

GGTATCCCTG TTCAAGGTAA GAAAACCAAG AAAGAACAGA AAACCGCTCA CTTCCTGCCG 480

ATGGCAATCA CTTAA 495 (2) Informácie o SEQ ID NO:36:

(i) Charakteristika sekvencie (A) Dĺžka: 164 aminokyselín (B) Typ: aminokyseliny (C) Počet reťazcov: neznámy (D) Topológia: neznáma (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:36

Met 1

Ser

Asn

Asp

Met 5

Thr

Pro

Glu

Gin

Met 10

Ala

Thr

Asn

Val

Asn 15

Ser

Ser

Ser

Pro

Glu 20

Arg

His

Thr

Arg

Ser 25

Tyr

Asp

Tyr

Met

Glu 30

Gly

Gly

Asp

íle

Arg 35

Val

Arg

Arg

Leu

Phe 40

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp 45

Tyr

Leu

Arg

íle

Asp 50

Lys

Arg

Gly

Lys

Val 55

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu 60

Met

Lys

Asn

Asn

Tyr 65

Asn

íle

Met

Glu

íle 70

Arg

Thr

Val

Ala

Val 75

Gly

íle

Val

Ala

íle 80

Lys

Gly

Val

Glu

Ser 85

Glu

Phe

Tyr

Leu

Ala 90

Met

Asn

Lys

Glu

Gly 95

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys 100

Lys

Glu

Cys

Asn

Glu 105

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys 110

Glu

Leu

íle

Leu

Glu 115

Asn

His

Tyr

Asn

Thr 120

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys 125

Trp

Thr

His

Asn

Gly 130

Gly

Glu

Met

Phe

Val 135

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys 140

Gly

íle

Pro

Val

Gin 145

Gly

Lys

Lys

Thr

Lys 150

Lys

Glu

Gin

Lys

Thr 155

Ala

His

Phe

Leu

Pro 160

Met Ala íle Thr (2) Informácie o SEQ ID NO:37:

(i) Charakteristika sekvencie (A) DÍžka: 450 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: neznámy (D) Topológia: neznáma (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:37:

ATGTCTTCTC CTGAACGTCA

GTACGTCGTC TGTTCTGCCG

AAGGGCACCC AAGAGATGAA

GGTATCGTTG CAATCAAAGG

AAACTGTACG CAAAAAAAGA

AACCACTACA ACACCTACGC

GCTCTGAACC AGAAAGGTAT

GCTCACTTCC TGCCGATGGC

TACGCGTTCC TACGACTACA TACCCAGTGG TACCTGCGTA

AAACAACTAC AATATTATGG

TGTTGAATCT GAATTCTACC

ATGCAACGAA GÄCTGCAACT

ATCTGCTAAA TGGACCCACA

CCCGGTTCGT GGTAAAAAAA

AATCACTTAA

TGGAAGGTGG TGACATCCGC

TCGACAAACG CGGCAAAGTC

AAATCCGTAC TGTTGCTGTT

TGGCAATGAA CAAAGAAGGT

TCAAAGAACT GATCCTGGAA

ACGGTGGTGA AATGTTCGTT

CCAAAAAAGA ACAGAAAACC

120

180

240

300

360

420

450 (2) Informácie o SEQ ID NO:38:

(i) Charakteristika sekvencie (A) Dĺžka: 149 aminokyselín (B) Typ: aminokyseliny (C) Počet reťazcov: neznámy (D) Topológia: neznáma (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:38:

Met Ser Ser Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly

5 io 15

Gly Asp íle Arg Val Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu ^{25 30} Arg íle Asp Lys Arg Gly Lys Val Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn

40 45

Asn

Tyr 50

Asn

íle

Met

Glu

íle 55

Arg

Thr

Val

Ala

Val 60

Gly

íle

Val

Ala

íle 65

Lys

Gly.

Val

Glu

Ser 70

Glu

Phe

Tyr

Leu

Ala 75

Met

Asn

Lys

Glu

Gly 80

Lys

Leu.

Tyr

Ala

Lys 85

Lys

Glu

Cys

Asn

Glu 90

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys 95

Glu

Leu

íle

Leu

Glu 100

Asn

His

Tyr

Asn

Thr 105

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys 110

Trp

Thr

His

Asn

Gly 115

Gly

Glu

Met

Phe

Val 120

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys 125

Gly

íle

Pro

Val Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gin Lys Thr Ala His Phe Leu 130 135 140

Pro Met Ala íle Thr

145 (2) Informácie o SEQ ID NO:39:

(i) Charakteristika sekvencie (A) Dĺžka: 426 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: neznámy (D) Topológia: neznáma (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:39:

ATGTCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC ATCCGCGTAC GTCGTCTGTT CTGCCGTACC 60

CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC 120

AACTACAATA TTATGGAAAT CCGTACTGTT GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT 180

GAATCTGAAT TCTACCTGGC AATGAACAAA GAAGGTAAAC TGTACGCAAA AAAAGAATGC 240

AÄCGAAGACT GCAACTTCAA AGAACTGATC CTGGAAAACC ACTACAACAC CTACGCATCT 300

GCTAAATGGA CCCACAACGG TGGTGAAATG TTCGTTGCTC TGAACCAGAA AGGTATCCCG 360

GTTCGTGGTA AAAAAACCAA AAAAGAACAG AAAACCGCTC ACTTCCTGCC GATGGCAATC 420 i

ACTTAA 426 (2) Informácie o SEQ ID NO:40:

(i) charakteristika sekvencie (A) Dĺžka: 141 aminokyselín (B) Typ: aminokyseliny (C) Počet reťazcov: neznámy (D) Topológia: neznáma (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID N0:40:

Met 1

Ser

Tyr

Asp

Tyr 5

Met

Glu

Gly

Gly

Asp 10

íle

Arg

Val

Arg Arg 15

Leu

Phe

Cys

Arg

Thr 20

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg 25

íle

Asp

Lys

Arg

Gly 30

Lys

Val

Lys

Gly

Thr 35

Gin

Glu

Met

Lys

Asn 40

Asn

Tyr

Asn

íle

Met 45

Glu

íle

Arg

Thr

Val 50

Ala

Val

Gly

íle

Val 55

Ala

íle

Lys

Gly

Val 60

Glu

Ser

Glu

Phe

Tyr 65

Leu

Ala

Met

Asn

Lys 70

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr 75

Ala

Lys

Lys

Glu

Cys 80

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn 85

Phe

Lys

Glu

Leu

íle 90

Leu

Glu

Asn

His

Tyr 95

Asn

Thr

Tyr

Ala

Ser 100

Ala

Lys

Trp

Thr

His 105

Asn

Gly

Gly

Glu

Met 110

Phe

Val

Ala

Leu

Asn 115

Gin

Lys

Gly

íle

Pro 120

Val

Arg

Gly

Lys

Lys 125

Thr

Lys

Lys

Glu

Gin 130

Lys

Thr

Ala

His

Phe 135

Leu

Pro

Met

Ala

íle 140

Thr

(2) Informácie o SEQ ID NO:41:

(i) Charakteristika sekvencie (A) Dĺžka: 426 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: neznámy (D) ’Topológia: neznáma (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:41:

ATGTCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC ATCCGCGTAC GTCGTCTGTT CTGCCGTACC 60

CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC 120

aactacaata	TTATGGAAAT	CCGTACTGTT	GCTGTTGGTA	TCGTTGCAAT	CAAAGGTGTT	180
GAATCTGAAT	TCTATCTTGC	AATGAACAAG	GAAGGAAAAC	TCTATGCAAA	GAAAGAATGC	240
AATGAAGATT	GTAACTTCAA	AGAACTAATT	CTGGAAAACC	ATTACAACAC	'ATATGCATCT	300
GCTAAATGGA	CCCACAACGG	TGGTGAAATG	TTCGTTGCTC	TGAACCAGAA	AGGTATCCCT	360
GTTCAAGGTA	AGAAAACCAA	GAAAGAACAG	AAAACCGCTC	ACTTCCTGCC	GATGGCAATC	420
ACTTAA						426

(2) Informácie o SEQ ID NO:42:

(i) Charakteristika sekvencie (A) Dĺžka: 141 aminokyselín (B) Typ: aminokyseliny (C) Počet reťazcov: neznámy (D) Topológia: neznáma (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:42

Met 1

Ser

Tyr

Asp

Tyr 5

Met

Glu

Gly Gly

Asp 10

íle

Arg

Val

Arg

Arg 15

Leu

Phe

Cys

Arg

Thr 20

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg 25

íle

Asp

Lys

Arg

Gly 30

Lys

Val

Lys

Gly

Thr 35

Gin

Glu

Met

Lys

Asn 40

Asn

Tyr

Asn

íle

Met 45

Glu

íle

Arg

Thr

Val 50

Ala

Val

Gly

íle

Val 55

Ala

íle

Lys

Gly

Val 60

Glu

Ser

Glu

Phe

Tyr 65

Leu

Ala

Met

Asn

Lys 70

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr 75

Ala

Lys

Lys

Glu

Cys 80

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn 85

Phe

Lys

Glu

Leu

íle 90

Leu

Glu

Asn

His

Tyr 95

Asn

Thr

Tyr

Ala

Ser 100

Ala

Lys

Trp

Thr

His 105

Asn

Gly

Gly

Glu

Met 110

Phe

Val

Ala

Leu

Asn 115

Gin

Lys

Gly

íle

Pro 120

Val

Gin

Gly

Lys

Lys 125

Thr

Lys

Lys

Glu

Gin 130

Lys

Thr

Ala

His

Phe 135

Leu

Pro

Met

Ala

íle 140

Thr

(2) Informácie o SEQ ID NO:43:

(i) Charakteristika sekvencie (A) DÍžka: 24 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: neznámy (D) Topológia: neznáma (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:43:

GAGCTCACTA GTGTCGACCT GCAG (2) Informácie o SEQ ID NO:44:

(i) Charakteristika sekvencie (A) DÍžka: 24 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: neznámy (D) Topológia: neznáma (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Vlastnosti:

(A) Meno/kíúč: (B) Umiestnenie: doplnková (1..24) (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:44:

CTGCAGGTCG ACACTAGTGA GCTC (2) Informácie o SEQ ID NO:45:

(i) Charakteristika sekvencie (A) Dĺžka: 18 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: neznámy (D) Topológia: neznáma (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:45:

CAATCTACAA TTCACAGA (2) Informácie o SEQ ID NO:46:

(i) Charakteristika sekvencie (A) Dĺžka: 18 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: neznámy (D) Topológia: neznáma (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:46:

TTAAGTTATT GCCATAGG (2) Informácie o SEQ ID NO:47:

(i) Charakteristika sekvencie (A) Dĺžka: 29 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: neznámy (D) Topológia: neznáma (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:47:

AACAAAGCTT CTACAATTCA CAGATAGGA 29 (2) Informácie o SEQ ID NO:48:

(i) Charakteristika sekvencie (A) Dĺžka: 27 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: neznámy (D) Topológia: neznáma (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:48:

AACAAGATCT TAAGTTATTG CCATAGG (2) Informácie o SEQ ID NO:49:

(i) Charakteristika sekvencie (A) DÍžka: 38 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: neznámy (D) Topológia: neznáma (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:49:

CGGTCTAGAC CACCATGCAC AAATGGATAC TGACATGG 38 (2) Informácie o SEQ ID NO:50:

(i) Charakteristika sekvencie (A) Dĺžka: 33 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: neznámy (D) Topológia: neznáma (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:50:

GCCGTCGACC TATTAAGTTA TTGCCATAGG AAG (2) Informácie o SEQ ID NO:51:

(i) Charakteristika sekvencie (A) Dĺžka: 16 aminokyselín (B) Typ: aminokyseliny (C) Počet reťazcov: neznámy (D) Topológia: neznáma (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:51:

Xaa Asn Asp Met Thr Pro Glu Gin Met Ala Thr Asn Val Xaa Xaa Se 15 10 15 (2) Informácie o SEQ ID NO:52:

(i) Charakteristika sekvencie (A) DÍžka: 12 aminokyselín (B) Typ: aminokyseliny (C) Počet reťazcov: neznámy (D) Topológia: ne známa (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:52:

Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp íle Arg Val 1 5 10

Claims (11)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Spôsob purifikácie keratinocytových rastových faktorov (KGF), vyznačujúci sa tým, že sa

   a) získa roztok obsahujúci KGF

   b) naviaže KGF v roztoku (krok a) na katiónový iónomeničový nosič

   c) vymyje KGF elučným roztokom z katiónového iónomeničového nosiča

   d) rozdelí eluovaný roztok (krok c) na matrix molekulového vylučovacieho sita (gélovou chromatografiou)

   e) opätovne získa KGF z matrix molekulového vylučovacieho sita.
2. 2. Spôsob podlá nároku 1, vyznačujúci tým, že sa KGF produkuje v prokaryotických bunkách.
3. 3. Spôsob podlá nároku 1, vyznačujúci tým, že sa KGF produkuje v E. coli.
4. 4. Spôsob podlá nároku 1,vyznačujúci tým, žé sa KGF produkuje v bunkách cicavcov.
5. 5..Spôsob podlá nároku 4, vyznačujúci sa t ý m, že sa KGF produkuje v CHO (Chinese hamster ovary) bunkách.
6. 6. Spôsob purifikácie keratinocytových rastových faktorov (KGF), vyznačujúci sa tým, že sa

   - 60 a) získa roztok obsahujúci KGF

   b) naviaže KGF v roztoku (krok a) na katiónový iónomeničový nosič

   c) vymyje KGF elučným roztokom z katiónového iónomeničového nosiča

   d) eluovaný roztok (krok c) rozdelí hydrofóbnou chromatografiou

   e) KGF opätovne získa po hydrofóbnej chromatografii (krok d).
7. 7. Spôsob podía nároku 6, vyznačujúci sa t ý m, že sa oxidujú voiné SH skupiny v KGF.
8. 8. Spôsob podía nároku 6, vyznačujúci sa t ý m, že sa KGF produkuje v prokaryotických bunkách.
9. 9. Spôsob pódia nároku 7, vyznačuj úci s á t ý m, že sa KGF produkuje v E. coli.
10. 10. Spôsob pódia nároku 6, vyznačujúci sa t ý m, že sa KGF produkuje v bunkách cicavcov.
11. 11. Spôsob pódia nároku 4, vyznačuj úci sa t ý m, že sa KGF produkuje v CHO (Chinese hamster ovary) bunkách.