[go: up one dir, main page]

SK287914B6 - Chimeric monoclonal antibody and its use in the preparation of medicament for the treatment of malignant tumors, cell line and pharmaceutical composition - Google Patents

Chimeric monoclonal antibody and its use in the preparation of medicament for the treatment of malignant tumors, cell line and pharmaceutical composition Download PDF

Info

Publication number
SK287914B6
SK287914B6 SK1226-2003A SK12262003A SK287914B6 SK 287914 B6 SK287914 B6 SK 287914B6 SK 12262003 A SK12262003 A SK 12262003A SK 287914 B6 SK287914 B6 SK 287914B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
human
antibody
mab
monoclonal antibody
sequences
Prior art date
Application number
SK1226-2003A
Other languages
English (en)
Other versions
SK12262003A3 (sk
Inventor
De Acosta Del Rio Cristina Maria Mateo
Valladares Josefa Lombardero
Navarro Lourdes Tatiana Roque
Requena Alejandro Lopez
Original Assignee
Centro De Inmunologia Molecular
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centro De Inmunologia Molecular filed Critical Centro De Inmunologia Molecular
Publication of SK12262003A3 publication Critical patent/SK12262003A3/sk
Publication of SK287914B6 publication Critical patent/SK287914B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C07K16/4208—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7032—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a polyol, i.e. compounds having two or more free or esterified hydroxy groups, including the hydroxy group involved in the glycosidic linkage, e.g. monoglucosyldiacylglycerides, lactobionic acid, gangliosides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/739—Lipopolysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001169—Tumor associated carbohydrates
    • A61K39/001171—Gangliosides, e.g. GM2, GD2 or GD3
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39566—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against immunoglobulins, e.g. anti-idiotypic antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3076—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3076—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
    • C07K16/3084—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties against tumour-associated gangliosides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C07K16/4208—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig
    • C07K16/4241—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C07K16/4208—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig
    • C07K16/4241—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig
    • C07K16/4258—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig against anti-receptor Ig
    • C07K16/4266—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig against anti-receptor Ig against anti-tumor receptor Ig
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • C12N5/0694—Cells of blood, e.g. leukemia cells, myeloma cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G01N33/686—Anti-idiotype
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/16—Animal cells
    • C12N5/163—Animal cells one of the fusion partners being a B or a T lymphocyte
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/70—Mechanisms involved in disease identification
    • G01N2800/7023—(Hyper)proliferation
    • G01N2800/7028—Cancer
    • G01N33/57515—

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

A chimeric monoclonal antibody derived from murine anti-idiotype monoclonal antibody 1E10, which recognizes the MAb P3 and which is produced by the hybridoma cell line with deposit number ECACC 97112901, wherein constant region of heavy chain contains the amino acid sequence of gamma-1 chain and constant region of light chain contains the amino acid sequence of kappa chain, whereby both derived from human immunoglobulins, hypervariable domains of their heavy and light chains comprise specific sequences and framework regions residues FR of their heavy and light chains also contain specific sequences defined in description. Use of the antibody for the manufacture of a medicament for the treatment of malignant tumors, a pharmaceutical composition containing the antibody and a cell line producing thereof.

Description

Oblasť techniky
Predložený vynález sa týka oblasti biotechnológie, hlavne nových rekombinantných protilátok získaných génovým inžinierstvom, konkrétne chimérických a humanizovaných protilátok získaných z myšej monoklonálnej protilátky P3 (MAb P3) a jej antiidiotypovej myšej monoklonálnej protilátky 1E10 (MAbai 1E10).
Konkrétnejšie sa vynález týka protilátok, ktoré sa viažu na gangliozidy obsahujúce N-glykolylovú kyselinu sialovú, ale neviažu sa s acetylátovými formami gangliozidov ani s neutrálnymi glykolipidmi. Gangliozidy obsahujúce A-glykolylovú kyselinu sialovú sú antigény s početnou expresiou pri rakovine prsníka a melanómoch. Na experimentálnych modeloch bol tiež preukázaný protinádorový účinok MAbai 1E10.
Predložený vynález sa tiež týka použitia tejto protilátky na výrobu lieku na liečbu malígnych nádorov, farmaceutickej kompozície s obsahom tejto protilátky a bunkovej línie, ktorá ju produkuje.
Doterajší stav techniky
Gangliozidy sú glykosfingolipidy, ktoré obsahujú kyselinu sialovú a sú prítomné v plazmatickej membráne buniek stavovcov (Stults a spol. (1989): Glycosphingolipids: structure, biological source and properties, Methods Enzymology, 179: 167 - 214). O niektorých z týchto molekúl sa v literatúre referovalo ako o antigénoch súvisiacich s nádormi alebo markérmi nádora (Hakomori a spol. (1991): Possible functions of tumor associated carbohydrate antigens. Curr. Opin. Immunol., 3: 646 - 653), a preto sa použitie protilátok proti gangliozidom opisovalo ako užitočné pre diagnózu a liečenie rakoviny (Hougton a spol. (1985): Mouse monoclonal antibody IgG3 antibody detecting GD3 ganglioside: to phase I trial in patients with malignant melanoma, PNAS USA, 82: 1242 - 1246; Zhang a spol. (1997): Selection of carbohydrate tumor antigens as targets for immune attack using immunohistochemistry. I. Focus on gangliosides, Int. J. Cancer, Ί2: 42 - 49). Kyseliny sialové častejšie exprimované pri zvieratách sú TV-acetylové (NeuAc) a A'-glykolylové (NeuGc) (Corfield a spol. (1982): Occurrence of sialic acids, Celí. Biol. Monogr., 10: 5 - 50). Všeobecne sa NeuGc neexprimuje v normálnych ľudských a kuracích tkanivách, ale všeobecne sa vyskytuje u iných stavovcov (Leeden a Yu, (1976): Chemistry and analysis of sialic acid. In: Biological Role of Sialic Acid. Rosemberg A. a Shengtrund C. L. (editori). Plénum Press, New York, 1 - 48; Kawai a spol. (1991): Quantitative determination of N-glycolylneuraminic acid expression in human cancerous tissues and avian lymphoma celí lines as a tumor associated sialic acid by gas chromatography-mass spectrometry, Cancer Research, 51: 1242 - 1246). Ale existujú štúdie, ktoré ukazujú, že protilátky proti NeuGc rozpoznávajú určité ľudské nádory a nádorové bunkové línie (Higashi a spol. (1988): Detection of gangliosides as V-glycolylneuraminic acid specific tumorassociated Hanganutziu-Deicher antigén in human retinoblastoma cells, Jpn. J. Cancer Res., 79: 952 až 956; Fukui a spol. (1989): Detection of glycoproteins as tumor associated Hanganutziu-Deicher antigén in human gastric cancer celí line, NUGC4, Biochem. Biophys. Res. Commun., 160: 1149 - 1154). Zvýšené koncentrácie GM3 (NeuGc) gangliozidov sa našli pri ľudskej rakovine prsníka (Marquina a spol. (1996): Gangliosides expressed in human breast cancer, Cancer Research, 56: 5165 - 5171), čím sa tento výsledok stal príťažlivý pre použitie tejto molekuly ako terča pri liečbe rakoviny.
Monoklonálna protilátka (MAb) P3 je myšia monoklonálna protilátka s IgM izotypom, ktorá sa získa, keď sa spoja myšie splenocyty z myši BALB/c imunizovanej lipozómami obsahujúcimi GM3 (NeuGc) a tetanový toxoid s bunkovou líniou P3-X63-Ag8.653; ktorá je myším myelómom. Táto protilátka MAb P3 výrazne reaguje s gangliozidmi, ktoré obsahujú TV-glykolylovú sialovú kyselinu, ale nereaguje s acetylovými formami gangliozidov ani s neutrálnymi glykolipidmi. Pomocou imunocytochemických a imunohistochemických štúdií uskutočnených na bunkových líniách a tkanivách a tkanivách z benígnych a neoplastických nádorov sa preukázalo, že MAb P3 rozpoznáva rakovinu prsníka (Vázquez a spol. (1995): Generation of a murine monoclonal antibody specific for TV-glycolylneuraminic acid-containing gangliosides that also recognizes sulfated glycolipids, Hybridoma, 14: 551 - 556) a melanóm. Monoklonálna protilátka MAb P3 indukovala antiidiotypovú imunitnú odpoveď (Ab2) pri myši BALB/c (syngenetický model), dokonca aj bez adjuvans a proteínového nosiča (Vázquez a spol. (1998): Syngeneic anti-idiotypic monoclonal antibodies to an anti-NeuGc-containing ganglioside monoclonal antibody, Hybridoma, 17: 527 - 534). Úloha elektronegatívnych skupín, sialovej kyseliny (pre gangliozidy) a SO3 (pre sulfatidy), v rozpoznávacích vlastnostiach tejto protilátky bola navrhnutá pomocou imunochemických analýz (Moreno a spol. (1998): Delineation of epitope recognized by an antibody specific for TV-glycolylneuraminic acid-containing gangliosides, Glycobiology, 8: 695 - 705).
Antiidiotypová MAb 1E10 (MAbai 1E10) subtypu IgGl sa získala z myši BALB/c imunizovanej s MAb P3 viazaným na KLH (US patent 6 063 379, bunková línia uložená pod prístupovým číslom ECACC 97112901). MAbai 1E10 rozpoznávala MAb P3 a neviazala iné protilátky IgM proti gangliozidom. Okrem toho MAbai 1E10 inhibovala špecifickú väzbu MAb P3 na GM3 (NeuGc) a na bunkovú líniu MDA-MB-435 získanú z karcinómu prsných kanálikov (pozitívnych na väzbu MAb P3). MAbai 1E10 stimulovala silnú imunitnú odpoveď protilátok Ab3, keď sa imunizovali myši zo syngenetických a alogenetických modelov, pričom tieto protilátky Ab3 nevykazovali rovnakú špecifickosť ako MAb P3, aj keď niesli idiotypy podobné tým, ktoré niesla protilátka Abl (Vázquez a spol. (1998): Syngeneic anti-idiotypic monoclonal antibodies to an anti-NeuGc-containing ganglioside monoclonal antibody, Hybridoma, 17: 527 - 534). MAbai 1E10 stimulovala silný protinádorový účinok pri syngenetickej, ako aj alogenetickej myši. Rast bunkovej línie karcinómu žliaz prsníka F3I1 sa významne znížil opakovanou dávkou MAbai 1E10 viazanej na KLH vo Freundovej adjuvancii, keď sa myš BALB/c vakcinovala. Po vakcinácii sa tiež znížil počet spontánnych pľúcnych metastáz. Intravenózna aplikácia MAbai 1E10 naočkovanej myši C57BL/6, 10 až 14 dní po intravenóznom naočkovaní melanómovými bunkami B16, spôsobilo dramatické zníženie počtu pľúcnych metastáz pri porovnaní s myšou ošetrenou irelevantným IgG. Tieto výsledky naznačujú, že sa spúšťa viacej ako jeden mechanizmus protinádorového účinku (Vázquez a spol. (2000): Antitumor properties of an anti-idiotypic monoclonal antibody in relation to íV-glycolyl-containing gangliosides, Oncol. Rep., 7: 751 - 756). V CA 2308142 je opísaná myšia anti-idiotypická monoklonálna protilátka 1E10, ktorá rozpoznáva monoklonálnu anti-gangliozidovú protilátku P3.
Aj keď sa hybridómová technológia v priebehu 15 rokov rozvinula (Kohler a Milstein (1975): Continuos cultures of fused cells secreting antibody of predefined specifity, Náture, 256: 495 - 497), a keď sú monoklonálne protilátky stále veľmi osožné pri diagnózach, ako aj vo výskume, nepreukázala sa ich terapeutická účinnosť u ľudí. Spôsobuje to hlavne ich krátky polčas života v krvi a to, že myšie efektorové funkcie zlyhávajú pre ľudský imunitný systém a tiež kvôli ľudskej imunitnej odpovedi na myšie protilátky (HAMA odpoveď). Prevrat v eventuálnej užitočnosti MAb spôsobila technológia génového inžinierstva, pretože manipuláciou s génmi imunoglobulínov je možné získať modifikované protilátky so zníženou antigenitou a takisto zlepšiť efektorové funkcie pri liečení alebo diagnózach určitých patológií. Spôsoby zníženia imunogenity imunoglobulínu majú zásadný cieľ zmenšiť rozdiely medzi myšou protilátkou a ľudským imunoglobulínom bez toho, aby sa zmenila špecifickosť rozpoznávania antigénu (Morrison a Oi (1989): Genetically engineered antibody molecules, Adv. Immunol., 44: 65 - 92).
V poslednom čase bolo vyvinutých niekoľko spôsobov humanizácie myších alebo potkanových protilátok, a tým zníženia xenogénnej imunitnej odpovede proti cudzím proteínom, keď sa vpichnú ľuďom. Jedným z prvých prístupov ku zníženiu antigenity boli chimérické protilátky, v ktorých sa variabilné domény myšieho proteínu vložili do konštantných domén ľudských molekúl, ktoré majú rovnakú špecifickosť, ale zníženú imunogenitu pri porovnaní s ich myšími partnermi, pričom sa zachovali ľudské efektorové funkcie chimérických protilátok, (Morrison a spol. (1984): Chimeric human antibody molecules: Mouse antigen-binding domains with human constant región domains, PNAS USA, 81: 6851 - 6855). Aj keď majú chimérické protilátky rovnakú špecifickosť ako myší partneri, bežne sa pozorovala imunitná odpoveď na variabilné oblasti hlodavcov. Pri pokuse o ďalšie zníženie imunogenity chimérických protilátok sa transplantovali len oblasti determinujúce komplementaritu (CDR) z monoklonálnej protilátky hlodavca do oblastí ľudských základných zvyškov a táto hybridná variabilná oblasť sa exprimovala s ľudskými konštantnými oblasťami (Jones a spol. (1986): Replacing the comlemntary-determining regions in a human antibody with those from a mouse, Náture, 321: 522 - 524; Verhoeyen a spol. (1988): Reshaping human antibodies: grafting an antilysozyme activity, Science, 239: 1534 - 1536). Ale tento postup mal niekoľko nedostatkov: výsledná protilátka mala bežne zníženú afinitu a rad základných zvyškov sa musel pre obnovenie väzby spätne mutovať na zodpovedajúce myšie systémy (Rietchmann a spol. (1988): Reshaping human antibodies for therapy, Náture, 332: 323 - 327; Queen a spol. (1989): A humanized antibody that binds to the interleukin 2 receptor, PNAS USA, 86: 10029 - 10033; Tempest a spol. (1991): Reshaping a human monoclonal antibody to inhibit human respirátory syncytial vírus infection in vivo, Biotechnology, 9: 266 - 272). Okrem toho sa bežne pozorovalo, že imunogenita pretrvávala v CDR-očkovaných protilátkach,
Mateo a spolupracovníci (US patent číslo US 5 712 120) opísali spôsob zníženia imunogenity myších protilátok. Podľa tohto spôsobu sa modifikácie obmedzujú na variabilné domény a konkrétne na myšie oblasti základných zvyškov (FR) chimérických protilátok. Okrem toho sa zámena uskutočňuje len v tých oblastiach FR, ktoré majú amfifilické sekvencie, a preto sú možnými epitopmi rozpoznateľnými T bunkami. Spôsob zahrnuje uvážlivú zámenu niekoľkých málo zvyškov aminokyselín lokalizovaných v potenciálnych imunogenitných epitopoch za zodpovedajúce zvyšky z ľudskej sekvencie s najvyššou homológiou. Musia sa však zachovať aminokyseliny, ktoré hlavne zodpovedajú za kánonické štruktúry a tiež zvyšky v bezprostrednom susedstve oblasti CDR alebo vo Vemierovej zóne. Výsledná protilátka si zachováva svoju špecifickosť väzby antigénu a je menej imunogenitná, ako buď jej myší alebo chimérický predchodca (Mateo a spol. (2000): Removal of T celí epitopes from genetically engineered antibodies: Production of modified immunoglobulins with reduced immunogenicity, Hybridoma, 19: 463 - 471), čo sú vlastnosti, ktoré zvyšujú ich terapeutickú užitočnosť. Použitím tohto nového spôsobu sa musí urobiť len niekoľko málo mutácií a samozrejme menej génových manipulácií.
Podstata vynálezu
Predmetom predloženého vynálezu sú všeobecne rekombinantné protilátky získané technológiou génového inžinierstva.
Konkrétnym predmetom vynálezu je chimérická monoklonálna protilátka odvodená z myšej antiidiotypovej monoklonálnej protilátky 1E10, ktorá rozpoznáva myší MAb P3 a ktorá je produkovaná hybridomálnou bunkovou líniou s depozitným číslom ECACC 97112901, kde konštantná oblasť ťažkého reťazca obsahuje sekvenciu aminokyselín gama-1 reťazca a konštantná oblasť ľahkého reťazca obsahuje sekvenciu aminokyselín kapa reťazca, pričom obidve sú odvodené z ľudských imunoglobulínov, hypervariabilné domény ich ťažkých a ľahkých reťazcov obsahujú nasledujúce sekvencie:
ŤAŽKÝ REŤAZEC
CDR1: SYDIN
CDR2: WIFPGDGSTKYNEKFKG
CDR3: EDYYDNSYYFDY
ĽAHKÝ REŤAZEC
CDR1: RASQDISNYLN
CDR2: YTSRLHSG
CDR3: QQGNTLPWT, oblasti základných zvyškov FR ich ťažkých a ľahkých reťazcov obsahujú nasledujúce sekvencie:
ŤAŽKÝ REŤAZEC
FR1: QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFT
FR2: WVRQRPEQGLEWIG
FR3: KATLTTDKSSSTAYMQLSRLTSEDSAVYFCAR
FR4: WGQGTTLTV a
ĽAHKÝ REŤAZEC
FR1: DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISC
FR2: WYQQKPDGTVKLLIY
FR3: VPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFC
FR4: FGGGTKLESK.
V prednostnom uskutočnení je predmetom vynálezu definovaná monoklonálna protilátka, ktorá pre svoju humanizáciu a zachovanie väzobných vlastností k antigénu vo variabilnej oblasti zahrnuje prinajmenšom jednu z nasledujúcich substitúcií:
ĽAHKÝ REŤAZEC pozícia 7: Thr za Ser pozícia 8: Thr za Pro pozícia 15: Leu za Val
ŤAŽKÝ REŤAZEC pozícia 5: Gin za Val pozícia 40: Arg za Ala pozícia 42: Glu za Gly pozícia 87 (83 podľa Kabatovho číslovania): Thr za Arg.
Predmetom vynálezu je aj bunková línia produkujúca ktorúkoľvek z monoklonálných protilátok podľa vynálezu.
Predmet vynálezu zahŕňa aj farmaceutickú kompozíciu obsahujúcu ktorúkoľvek z monoklonálných protilátok podľa vynálezu v kombinácii s excipientmi.
Predmetom vynálezu je tiež ktorákoľvek z monoklonálných protilátok podľa vynálezu na použitie na liečbu malígnych nádorov prsníka a melanómov, ich metastáz a relapsov alebo na „in vivo lokalizáciu a identifikáciu malígnych nádorov prsníka a melanómov, ich metastáz a relapsov.
Predmetom vynálezu je navyše aj použitie monoklonálnej protilátky podľa vynálezu na výrobu lieku na liečbu malígnych nádorov prsníka a melanómov, ich metastáz a relapsov, ako aj monoklonálna protilátka podľa vynálezu na použitie na liečbu malígnych nádorov prsníka a melanómov, ich metastáz a relapsov.
Syntéza cDNA a amplifikácia génu pomocou PCR (reťazovej polymerázovej reakcie) variabilných oblastí MAb P3 aMAbai 1E10
Cytoplazmatická RNA sa extrahovala asi z 106 buniek hybridómu P3 (myšia IgM MAb, ktorá rozpoznáva GM3 V-glykolový gangliozid) alebo 1E10 (protilátka antiidiotypu proti P3). RNA sa extrahovala s použitím reagencie TRIZOL (GIBCO BRL, Grand Island, NY), podľa inštrukcií výrobcu.
Reakcia syntézy cDNA sa uskutočnila zmiešaním 5 pg RNA, 25 pmolov VH (komplementárne ku konštantnej oblasti myšej IgM pre VH P3 a ku konštantnej oblasti myšej IgGl pre VH 1E10) alebo VK (komplementárnej ku konštantnej myšej kapa oblasti pre obidve protilátky), 2,5 mM každého dNTP, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 75 mM KC1, 10 mM DTT, 8 mM MgCl2 a 15 jednotiek inhibítora RNA polymerázy v 50 pL reakčnej zmesi. Desať minút sa zmes zahrievala na 70 °C a pomaly sa ochladila na 37 °C. Potom sa pridalo 100 jednotiek enzýmu MLV reverznej transkriptázy a inkubácia pokračovala pri 42 °C jednu hodinu.
Variabilné oblasti VK a VH cDNA sa amplifikovali pomocou PCR. Krátko, 5 pL cADN VH alebo VK sa zmiešalo s 25 pmolami špecifických primérov, 2,5 mM každej dNTP, 5 pL zložiek 10X pufra Taq DNA polymerázy a 1 jednotkou tohto enzýmu. Vzorky sa podrobili 25 teplotným cyklom pri 94 °C, 30 sekúnd; 50 °C 30 sekúnd; 72 °C, 1 minútu a posledná inkubácia pri 72 °C počas 5 minút.
Klonovanie a sekvenovanie amplifikovanej cDNA
PCR produkty VH a VK (z P3 a z 1E10) sa klonovali do TA vektora (TA klonovacia súprava, Promega, USA). Výsledné klony sa sekvenovali pomocou dideoxy spôsobu s použitým T7 DNA polymerázy (T7 sekvenovacia súprava, Pharmacia, Švédsko).
Konštrukcia chimérických génov
Gény VH a VK sa vystrihli z TA vektorov enzymatickou digesciou a klonovali sa do zodpovedajúcich expresných vektorov (Coloma a spol. (1992): Novel vectors for the expression of antibody molecules using variable regions generated by polymerase chain reaction, J. Immunol. Meth., 152: 89 - 104).
Gény VH sa vystrihli z TA vektora pomocou enzymatickej digescie s EcoRV a Nhel a klonovali sa do expresného vektora (PAH 4604), ktorý zahrnoval variabilný región ľudskej IgGl a gény rezistentné k histidinolu. Výsledné konštrukcie boli P3VH-PAH4 604 a 1E10VH-PAH4604. Gény VK sa vystrihli z TA vektora pomocou enzymatickej digescie s EcoRV a Sali a klonovali sa do expresného vektora (PAG4622). Tento vektor obsahoval rezistentné gény ku kyseline mykofenolovej a ľudskú kapa konštantnú oblasť. Výsledné konštrukcie boli P3VK-PAG4622 a 1E10VK-PAG4622.
Expresia chimérických protilátok získaných z MAb P3 a MAbid 1E10
Bunky NS-0 sa podrobili elektroporácii s 10 pg P3VK-PAG4622 alebo 1E10VK-PAG4622, klony exprimujúce ľudské kapa ľahké reťazce sa transfektovali s 10 pg P3VH-PAH4604 alebo 1E10VH-PAH4604.
DNA sa linearizovali digesciou s enzýmom Pvul, vyzrážali etanolom a rozpustili v 50 pL PBS. Odstredenim sa pozbieralo približne 107 buniek a resuspendovali sa v 0,5 mL PBS spoločne s digestovanou DNA v kyvete pre elektroporáciu. Desať minút sa nechali na ľade a potom sa bunky vystavili impulzu 200 Voltov a 960 pF a ponechali sa na ľade ďalších desať minút. Bunky sa distribuovali na 96 jamkovou platničku s D'MEM F12 s 10 % fetálnym teľacím sérom. Po dvoch až štyroch dňoch sa pridalo selektívne médium (D'MEM F12 s 0,45 pg/mL kyseliny mykofenolovej alebo s 10 mM histidinolu). Transfektované klony boli po 14 dňoch viditeľné voľným okom.
Prítomnosť ľudskej protilátky v médiu jamiek obsahujúcich trasfektované klony sa merala pomocou ELISA. Jamky mikrotitračnej platničky sa zmočili kozími protilátkami proti ľudskému kapa ľahkému reťazcu (pre klony produkujúce ľudský kapa reťazec) alebo protilátkami proti ľudskému IgG (špecifický pre gama reťazec) (pre klony produkujúce kompletnú protilátku). Po premytí s PBST (slaný fosfátom tlmený roztok obsahujúci 0,05 % Tweenu 20) sa na jednu hodinu pri 37 °C pridalo do každej mikrotitračnej jamky zriedené kultivačné médium z jamiek obsahujúcich transfektanty. Jamky sa premyli s PBS-T a pridala sa kozia protilátka proti ľudskému kapa ľahkému reťazcu konjugovaná chrenovou peroxidázou alebo kozia anti-ľudská IgG (špecifická pre gama reťazec) konjugovaná alkalickou fosfatázou a jednu hodinu sa inkubovali pri 37 °C. Jamky sa premyli PBS-T a pridal sa substrátový pufor obsahujúci o-fenyléndiamín alebo p-nitrofenylfosfát. Po pol hodine sa merala absorbancia pri 492 alebo 405 nm.
Konštrukcie humanizovaných protilátok P3hu a ÍElOhu pomocou humanizácie epitopov T buniek. Predikcia epitopov T buniek
Sekvencie variabilných oblastí P3 a 1E10 sa analyzovali algoritmom AMPHI (Margalit a spol. (1987): Prediction of immunodominant helper T celí antigenic sites from the primary sequence, J. Immunol., 138: 2213 - 2229). Vyhľadávali sa špirálovité amfifilické segmenty so 7 alebo 11 zvyškami aminokyselín, ktoré boli spojené s T imunogenitou. Program SOHHA tiež predpovedal špirálovité hydrofóbne segmenty. (Elliot a spol. (1987): An hypothesis on the binding of an amphipathic, alpha helical sequence in Ii to the desotope of class II antigén, J. Immunol., 138: 2949 - 2952). Obidva programy predpovedajú, ktoré segmenty zo sekvencií variabilnej oblasti protilátky P3 a 1E10 by mohli byť prezentované T pomocným bunkám v kontexte molekúl MHC triedy II.
Analýza homológie s ľudskými imunoglobulínmi
Sekvencie aminokyselín myších variabilných oblastí sa porovnali so sekvenciami imunoglobulínov v databázach GeneBank a EMBL (prístupných po internete). Pre každú protilátku sa stanovili ľudské variabilné oblasti s najvyššou homológiou. Na vyhľadávanie homológie sekvencií sa použil softvér PC-TWO HIBIO PROSIS 06-00.
Analýza zníženia imunogenity
Cieľom spôsobuje zníženie imunogenity zmiernením alebo humanizáciou potenciálnych imunogenitných T epitopov s minimálnymi zmenami. Spôsob zahrnuje uvážlivé nahradenie niekoľkých málo zvyškov aminokyselín umiestnených v špirálovitých amfifilických segmentoch. Aminokyseliny, ktoré sú hlavne zodpovedné za kánonické štruktúry a tiež zvyšky v bezprostrednom susedstve so sekvenciami CDR alebo vo Vemierovej zóne, sa musia zachovať.
Sekvencie myšej variabilnej oblasti sa podľa tohto spôsobu porovnali s ľudskými sekvenciami s najvyššou homológiou a identifikovali sa rozličné zvyšky aminokyselín v každej pozícii medzi myšou MAb a ľudskou sekvenciou s najvyššou homológiou, pričom sa brali do úvahy len zvyšky vo FR (Kabat a spol. (1991), Sequences ofproteins of immunological interest, piate vydanie, National Inštitúte of Health) a predtým definované zvyšky sa nahradili tými zvyškami, ktoré sa nachádzajú v ľudskej sekvencii s najvyššou homológiou. Náhrada sa uskutočňovala riadenými technikami mutagenézie.
Zvyšky zapojené do trojrozmernej štruktúry väzobného miesta sa nemutovali; mohli by ovplyvniť rozpoznanie antigénu. Ďalšie informácie o vplyve náhrad v terciámej štruktúre sa môžu získať molekulárnym modelovaním väzobného miesta antigénu.
Musí sa pamätať na prítomnosť zvyškov prolínu v špirálovitom amfifilickom segmente a na skutočnosť, že určité myšie zvyšky sa neobjavia v rovnakej pozícii v ľudskej sekvencii s najvyššou homológiou, ale sú početné v ďalších ľudských imunoglobulínoch. Z tohto dôvodu neexistuje jedinečný súbor myších aminokyselín, ktorý by sa vymenil v systémoch. Je možné získať rozličné verzie modifikovanej protilátky s rozličným počtom náhrad. Mutácie sa uskutočňovali prekrývajúcimi sa reakciami PCR.
Klonovanie a expresia humanizovaných protilátok P3hu a ÍElOhu
Genetické konštrukcie zodpovedajúce P3hu a ÍElOhu sa klonovali expresnými vektormi spôsobom opísaným pre chimérické protilátky. Výsledné konštrukcie boli P3VKhu-PAG4622 alebo lE10VKhu-PAG4622 a P3VHhu-PAH4604 a lE10VHhu-PAH4604. Tieto konštrukcie sa transfektovali do buniek NS-O podľa skôr opísaného protokolu pre chimérické protilátky.
Čistenie rekombinantných protilátok
Rekombinantné protilátky sa čistili s použitím afinitnej chromatografie s proteínom A (Pharmacia, Upssala, Švédsko).
Biologická aktivita
Biologická aktivita rekombinantných protilátok sa testovala meraním špecifickej väzby na antigén pomocou ELISA.
Pre rekombinantné MAb P3 sa mikrotitračná platnička zmočila GM3(NeuGc) gangliozidom v metanole. Po jednohodinovom sušení sa nešpecifické väzby blokovali 1 % hovädzím sérovým albumínom (BSA) v Tris-HCl pufre inkubáciou počas jednej hodiny pri 37 °C. Jamky sa premyli PBS a jednu hodinu inkubovali pri 37 °C s vyčistenou rekombinantnou MAb P3. Jamky sa premyli Tris-HCl a pridala sa kozia antiľudská protilátka konjugovaná s alkalickou fosfatázou a jednu hodinu sa inkubovali pri 37 °C. Nakoniec sa jamky premyli a pridal sa substrátový pufor obsahujúci p-nitrofenylfosfát. Po pol hodine sa zmerali absorbancie pri 405 alebo 492 nm.
Pre rekombinantné MAbai 1E10 bola skúška ELISA podobná, s výnimkou, že sa jamky zmočili MAb P3 a premývanie sa uskutočňovalo v PBS s 0,05 % Tweenu 20.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obr. 1: VHP3 DNA a dedukované sekvencie aminokyselín. Sekvencie sú zoradené podľa Kabatovho číslovania (Kabat a spol. (1991): Sequences of proteins of immunological interest. piate vydanie, National Inštitúte of Health), príslušné sekvencie CDR sú vyznačené čiarami.
Obr. 2: VKP3 a dedukované sekvencie aminokyselín. Sekvencie sú zoradené podľa Kabatovho číslovania (Kabat a spol. (1991): Sequences of proteins of immunological interest, piate vydanie, National Inštitúte of Health), príslušné sekvencie CDR sú vyznačené čiarami.
Obr. 3: VHP3 sa pridali k ľudskej sekvencii s najvyššou homológiou. Amfifílické segmenty sú podčiarknuté a sekvencie CDR sú zvýraznené tučné.
Obr. 4: VKP3 sa pridali k ľudskej sekvencii s najvyššou homológiou. Amfifílické segmenty sú podčiarknuté a sekvencie CDR sú zvýraznené tučné.
Obr. 5: Špecifická väzba chimérickej MAb P3 k GM3(NeuGc). Rozličné koncentrácie MAb P3 a MAb Tl (negatívna kontrola) sa testovali pomocou ELISA. Mikrotitračné platničky sa zmočili s gangliozidmi GM3(NeuGc) a GM3(NeuAc) (negatívna kontrola) v metanole a merala sa špecifická väzba. (Značenie bodov: ♦ - GM3-P3, - chimérická GM3(NeuGc)-P3, ▲ - chimérická GM3(NeuGc)- Tl, · - chimérická GM3-Tl)
Obr. 6: VH1E10 DNA a dedukované sekvencie aminokyselín. Sekvencie sú zoradené podľa Kabatovho číslovania (Kabat a spol. (1991): Sequences of proteins of immunological interest, piate vydanie, National Inštitúte of Health), príslušné sekvencie CDR sú vyznačené čiarami.
Obr. 7: VK1E10 a dedukované sekvencie aminokyselín. Sekvencie sú zoradené podľa Kabatovho číslovania (Kabat a spol. (1991): Sequences ofproteins of immunological interest, piate vydanie, National Inštitúte of Health), príslušné sekvencie CDR sú vyznačené čiarami.
Obr. 8: VH1E10 sa pridali k ľudskej sekvencii s najvyššou homológiou. Amfifílické segmenty sú podčiarknuté a sekvencie CDR sú zvýraznené tučné.
Obr. 9: VK1E10 sa pridali k ľudskej sekvencii s najvyššou homológiou. Amfifílické segmenty sú podčiarknuté a sekvencie CDR sú zvýraznené tučné.
Obr. 10: Špecifická väzba myšej MAb P3 chimérickou MAb 1E10. Rozličné koncentrácie MAb 1E10 a MAb C5 (negatívna kontrola) sa testovali pomocou ELISA. Mikrotitračné platničky sa zmočili s MAb P3 a MAb A3 (negatívna kontrola) a merala sa špecifická väzba. (Značenie bodov: ♦ - chimérická MAb P3-1E10, - chimérická MAb A3-1E10, ▲ - chimérická MAb P3-C5, x - chimérická MAb A3-C5).
Príklady uskutočnenia vynálezu
V nasledujúcich príkladoch sa všetky použité enzýmy, ako aj reagencie a materiály získali z komerčných zdrojov, pokiaľ sa neuvádza niečo iné.
Príklad 1: Získanie chimérickej MAb P3
Syntéza cDNA sa uskutočnila reakciou s enzýmom reverznej transkriptázy, keď sa vychádzalo z RNA z hybridómu, ktorý produkuje MAb P3, ako sa opisuje skôr. Sekvencie špecifických primérov použitých v tejto reakcii boli:
Pre VH:
5' AGGTCTAGAA (CT) CTCCACACACAGG (AG) (AG) CCAGTGGATAGAC 3'
Pre VK:
5' GCGTCTAGAACTGGATGGTGGGAAGATGG 3' cDNA VHP3 a cDNA VKP3 sa amplifikovali pomocou PCR s použitím Taq polymerázy a špecifických primérov. Reštrikčné miesta zahrnuté v priméroch boli ECORV/NHEI pre VH a ECORV/SALI pre VK. Použité sekvencie primérov boli nasledujúce:
Pre VH:
Primér 1 (signálny peptid):
5' GGGGATATCCACCATGG (AG)ATG (CG) AGCTG (TG) GT (CA)AT (CG) CTCTT 3'
Primér 2 (CH1):
5' GGGGCTAGCTGCAGAGACAGTGACCAGAGT 3'
Pre VK:
Primér 1 (signálni peptid):
5' GGGGATATCCACCATGGAG(TA)CACA(GT)(TA)CTCAGGTCTTT(GA)T 3'
Primér 2 (Ck):
5’ AGCGTCGACTTACGTTT(TG)ATTTCCA(GA)CTT(GT)GTCCC 3'
PCR produkty sa klonovali do TA vektora (TA klonovacia súprava, Invitrogen). Dvanásť nezávislých klonov sa sekvenovalo dideoxy spôsobom s použitím T7 DNA Pol (Pharmacia). Analýzou vyhľadávania homológie sa stanovila sekvenčná skupina s najvyššou homológiou pre VHP3 a VKP3. Sekvencie VHP3 a VKP3 (obr. 1 a 2) majú vysokú homológiu so zodpovedajúcimi skupinami IB a V podľa Kabátovej klasifikácie.
Po digescii s reštrikčnými enzýmami ECORV a NHEI pre VHP3 a ECORV a SALI pre VKP3 sa klonovali v expresných vektoroch, ktoré sa predtým digestovali s rovnakými enzýmami, PAH4 604 pre VH a PAG4 622 pre VK. Tieto expresné vektory vhodné pre expresiu imunoglobulínov v bunkách cicavcov boli darom od Sherie Morrison (UCLA, Kalifornia, USA). Vektor PAH 4 604 zahrnoval ľudskú konštantnú oblasť IgGl a vektor PAG 4 622 ľudskú variabilnú oblasť (Coloma a spol. (1992): Novel vectors for the expression of antibody molecules using variable regions generated by polymerase chain reaktion, J. Immunol. Meth., 152: 89 - 104). Výsledné konštrukty boli P3VH-PAH4 604 a P3VK-PAG4 622.
Bunky NA-0 sa transfektovali s 10 pg P3VK-PAG4622, kloň exprimujúci ľahký reťazec sa transfektoval s 10 pg P3VH-PAH4 604, v obidvoch prípadoch sa DNA pred transfekciou linearizovala s Pvul, vyzrážala etanolom a rozpustila v 50 pL PBS.
Približne 107 buniek sa pozbieralo odstredením a resuspendovalo sa v 0,5 mL PBS spoločne s digestovanou DNA v kyvete pre elektroporáciu. Po uložení na desať minút na ľad boli bunky vystavené pulzu 200 V a 960 pF a ponechali sa v ľade ďalších desať minút. Bunky sa rozdelili do 96 jamiek platničky s D'MEM F12 plus s 10 % fetálnym teľacím sérom. Po dvoch alebo štyroch dňoch sa pridalo selektívne médium (D'MEM F12 s 0,45 pg/mL kyseliny mykofenolovej alebo 10 mM histidinolu). Transfektované klony boli viditeľné po 14 dňoch voľným okom.
Prítomnosť ľudskej protilátky v médiu jamiek obsahujúcich trasfektované klony sa merala pomocou ELISA. Jamky mikrotitračnej platničky sa zmočili kozími protilátkami proti ľudskému kapa ľahkému reťazcu (pre klony produkujúce ľudský kapa reťazec) alebo protilátkami proti ľudskému IgG (špecifický pre gama reťazec) (pre klony produkujúce kompletnú protilátku). Po premytí s PBST (slaný fosfátom tlmený roztok obsahujúci 0,05 % Tweenu 20) sa do každej mikrotitračnej jamky na jednu hodinu pri 37 °C pridalo zriedené kultivačné médium z jamiek obsahujúcich transfektanty. Jamky sa premyli PBST a pridala sa kozia protilátka proti ľudskému kapa ľahkému reťazcu konjugovaná chrenovou peroxidázou alebo kozí anti-ľudský IgG (špecifický pre gama reťazec) konjugovaný s alkalickou fosfatázou a jednu hodinu sa inkubovali pri laboratórnej teplote. Jamky sa premyli PBS-T a pridal sa substrátový pufor obsahujúci o-fenyléndiamín alebo p-nitrofenylfosfát. Po pol hodine sa merala absorbancia pri 492 alebo 405 nm.
Príklad 2: Získanie rozličných verzií humanizovanej protilátky P3
Sekvencie myších VHP3 a VKP3 (obr. 1 a 2) sa porovnali s ľudskými sekvenciami. Na obr. 3 a 4 sú ukázané ľudské sekvencie s najvyššou homológiou. Špirálovité amfifilické oblasti alebo potenciálne T bunkové epitopy sa vyhľadávali v sekvenciách myšej P3 variabilnej oblasti a v zhode so spôsobom uvážlivej stratégie sa stanovili náhrady aminokyselín, aby sa narušili alebo humanizovali potenciálne T bunkové epitopy v myších sekvenciách.
Analýza VHP3 poskytla (obr. 3) dva amfifilické segmenty, prvý zahrnoval CDR1, FR2 a niekoľko zvyškov CDR2, druhý zahrnoval koniec FR3 a CDR3. Hlavné rozdiely myších sekvencii pri porovnaní s ľudskými sekvenciami s najvyššou homológiou boli nájdené v sekvenciách CDR alebo vo zvyškoch zapojených do trojrozmernej štruktúry väzobného miesta. Z tohto dôvodu bolo rozhodnuté nenahradzovať žiadnu aminokyselinu v myšom VHP3.
Analýza VKP3 poskytla tiež dva amfifilické segmenty (obr. 4), prvý zahrnoval FR1, druhý zahrnoval CDR2 a niekoľko zvyškov FR3. Bolo rozhodnuté nahradiť zvyšky v pozíciách 8, 9, 10, 11a 13 za zvyšky v rovnakých pozíciách v ľudskej sekvencii s najvyššou homológiou. Aminokyseliny His, Lys, Phe, Met a Thr sa nahradili Pro, Ser, Ser, Leu a Ala. Nahradenie sa uskutočnilo prekrývajúcou sa PCR (Kammann a spol. (1989): Rapid insertional mutagenesis of DNA by polymerase chain reaction (PCR), Nucleic Acids Res., 17: 5404) s použitím primérov 1,2, 3, 4, sekvencie ktorých sú nasledujúce:
Primér 1:
5' ATGACCCAGTCTCCTTCTTCTCTTTCCGCGTCAGTAGGAGAC 3'
Primér 2:
5' AGCGTCGACTTACGTTT(TG)ATTTCCA(GA)CTT(GT)GTCCC 3'
Primér 3:
5' GTCTCCTACTGACGCGGAAAGAGAAGAAGGAGACTGGGTCAT 3'
Primér 4:
5'GGGGATATCCACCATGGAG(TA)CACA(GT)(TA)CTCAGGTCTTT(GA)T3'
Body mutácie sa verifikovali sekvenovaním. Výsledný konstrukt bol P3VK.hu a klonoval sa do expresného vektora PAG 4662. Výsledný konštrukt bol P3VKhu-PAG4 622. Pre expresiu humanizovanej protilátky P3 sa bunky NS-0 transfektovali s P3VH-PAH4 604 a P3VKhu-PAG4622.
Protilátka P3hu sa transfektovala podľa rovnakého postupu elektroporácie a detekcie, ako sa opisuje pre chimérické protilátky.
Príklad 3: Biologická aktivita chimérickej MAb P3
Biologická aktivita chimérickej MAb P3 sa testovala meraním špecifickej väzby na antigén pomocou ELISA.
Pre rekombinantnú MAb P3 sa mikrotitračnú platnička zmočila gangliozidom GM3(NeuGc) v metanole. Po jednohodinovom sušení pri 37 °C sa nešpecifické väzby blokovali 1 % hovädzím sérovým albumínom (BSA) v Tris-HCl pufŕe inkubáciou počas jednej hodiny pri 37 °C. Jamky sa premyli PBS a jednu hodinu inkubovali pri 37 °C s vyčistenou rekombinantnou MAb P3. Jamky sa premyli Tris-HCl a pridala sa kozia antiľudská protilátka konjugovaná s alkalickou fosfatázou a jednu hodinu sa inkubovali pri 37 °C. Nakoniec sa jamky premyli s Tris-HCl a pridal sa substrátový pufor obsahujúci p-nitrofenylfosfát. Po pol hodine sa zmerala absorbancia pri 405 nm.
Ako negatívna kontrola sa použila chimérická MAb TI. Špecifickú väzbu chimérickej MAb P3 na antigén ukazuje obr. 5.
Príklad 4: Získanie chimérickej MAb 1E10
Syntéza cDNA sa uskutočnila reakciou s enzýmom reverznej transkriptázy, keď sa vychádzalo z RNA z hybridómu, ktorý produkuje MAb 1E10, ako sa opisuje. Sekvencie špecifických primérov použitých v tejto reakcii boli:
Pre VH:
5' GGGGCTAGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGT 3'
Pre VK:
5' GCGTCTAGAACTGGATGGTGGGAAGATGGA 3' cDNA VH1E10 a cDNA VK1E10 sa amplifikovali pomocou PCR s použitím Taq Pol a špecifických primérov.
Pre VH:
Primér 1 (signálny peptid):
5' GGGGATATCCACCATGG(AG)ATG(CG)AGCTG(TG)GT(CA)AT(CG)CTCTT 3’
Primér 2 (CH 1):
5' GGGGCTAGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGT 3’
Pre VK:
Primér 1 (signálny peptid):
5’ GGGGTTAACCACCATGAGG(GT)CCCC(AT)GCTCAG(CT)T(CT)CT(TG)GG(GA) 3'
Primér 2 (Ck):
5' AGCGTCGACTTACGTTT(TG)ATTTCCA(GA)CTT(GT)GTCCC 3'
PCR produkty sa klonovali do TA vektora (TA klonovacia súprava, Invitrogen). Dvanásť nezávislých klonov sa sekvenovalo (obr. 7 a 8) dideoxy spôsobom s použitím T7 DNA Pol (Pharmacia). Analýzou vyhľadávania homológie sa stanovila sekvenčná skupina s najvyššou homológiou pre VH1E10 a VK1E10. Sekvencie VH1E10 a VK1E10 majú vysokú homológiu so zodpovedajúcimi rôznorodými skupinami a V podľa Kabátovej klasifikácie.
Po digescii s reštrikčnými enzýmami ECORV a NHEI pre VH1E10 a s HincII a SALI pre VK1E10 sa klonovali v expresných vektoroch po predchádzajúcej digescii s rovnakými enzýmami, PAH4 604 pre VH a PAG4 622 pre VK. Tieto expresné vektory vhodné pre expresiu imunoglobulínov v cicavčích bunkách boli darom od Sherie Morrison (UCLA, Kalifornia, USA). Vektor PAH 4604 zahrnoval ľudskú konštantnú oblasť IgGl a PAG 4622 ľudskú variabilnú oblasť (Coloma a spol. (1992): Novel vectors for the expression of antibody molecules using variable regions generated by polymerase chain reaktion, J. Immunol. Meth., 152: 89 - 104). Výsledné konštrukty boli 1E10VH-PAH4604 a 1E10VK-PAG4622.
Bunky NA-0 sa transfektovali s 10 pg 1E10VK-PAG4622, kloň exprimujúci ľahký reťazec sa transfektoval s 10 pg 1E10VH-PAH4604, v obidvoch prípadoch sa DNA pred transfekciou linearizovala s Pvul, vyzrážala etanolom a rozpustila v 50 pL PBS.
Približne 107 buniek sa pozbieralo odstredením a resuspendovalo sa v 0,5 mL PBS spoločne s digestovanou DNA v kyvete pre elektroporáciu. Po uložení na desať minút na ľad sa bunky vystavili pulzu 200 V a 960 pF a ponechali sa v ľade ďalších desať minút. Bunky sa rozdelili do 96 jamiek platničky s D'MEM F12 plus s 10 % fetálnym teľacím sérom. Po dvoch alebo štyroch dňoch sa pridalo selektívne médium (D'MEM F12 s 0,45 pg/mL kyseliny mykofenolovej alebo 10 mM histidinolu). Transfe kto vane klony boli viditeľné po 14 dňoch voľným okom.
Prítomnosť ľudskej protilátky v médiu jamiek obsahujúcich trasfektované klony sa merala pomocou ELISA. Jamky mikrotitračnej platničky sa zmočili kozími protilátkami proti ľudskému kapa ľahkému reťazcu (pre klony produkujúce ľudský kapa reťazec) alebo protilátkami proti ľudskému IgG (špecifický pre gama reťazec) (pre klony produkujúce kompletnú protilátku). Po premytí s PBST (slaný fosfátom tlmený roztok obsahujúci 0,05 % Tweenu 20) sa na jednu hodinu pri 37 °C do každé jamky mikrotitračnej platničky pridalo zriedené kultivačné médium jamiek obsahujúcich transfektanty. Jamky sa premyli PBST a pridala sa kozia protilátka proti ľudskému kapa ľahkému reťazcu konjugovaná chrenovou peroxidázou alebo kozí anti-ľudský IgG (špecifický pre gama reťazec) konjugovaný s alkalickou fosfatázou a jednu hodinu sa inkubovali pri laboratórnej teplote. Jamky sa premyli PBS-T a pridal sa substrátový pufor obsahujúci o-fenyléndiamín alebo p-nitrofenylfosfát. Po pol hodine sa merala absorbancia pri 492 alebo 405 nm.
Príklad 5: Získanie rozličných verzií humanizovanej protilátky 1 El0
Sekvencie myších VH1E10 a VK.1E10 (obr. 6 a 7) sa porovnali s ľudskými sekvenciami. Ľudské sekvencie s najvyššou homológiou ukazujú obr. 8 a 9. Špirálovité amfifilické oblasti alebo potenciálne T bunkové epitopy sa vyhľadávali v sekvenciách myšej 1E10 variabilnej oblasti a v zhode so spôsobom uvážlivej stratégie sa stanovili náhrady aminokyselín, aby sa narušili alebo humanizovali potenciálne T bunkové epitopy v myších sekvenciách.
Analýza VH1E10 poskytla (obr. 8) tri amfifilické segmenty, prvý zahrnoval FR1, druhý zahrnoval FR2 a tretí zahrnoval FR3. Bolo rozhodnuté nahradiť zvyšky v pozíciách 5, 40, 42 a 87 (83 podľa Kabatovho číslovania) zvyškami v rovnakých pozíciách v ľudskej sekvencii s najvyššou homológiou. Aminokyseliny Gin, Arg, Glu a Thr sa nahradili Val, Ala, Gly a Arg. Nahradenie sa uskutočnilo prekrývajúcou sa PCR (Kammann a spol. (1989): Rapid insertional mutagenesis of DNA by polymerase chain reaction (PCR), Nucleic Acids Res., 17: 5404) s použitím rozličných súprav primérov.
Priméry pre mutáciu v pozícii 5 ťažkého reťazca boli 1, 2, 3 a 4, sekvencie ktorých sú nasledujúce:
Primér 1:
5' CAGGTTCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCT 3'
Primér 2:
5' GGGGCTAGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGT 3'
Primér 3:
5' AGCTCCAGACTGCACCAGCTGAACCTG 3'
Primér 4:
5' GGGGATATCCACCATGG(AG)ATG(CG)AGCTG(TG)GT(CA)AT(CG)CTCTT 3’
Po overení pomocou sekvencie bodu mutácie v pozícii 5 sa zaviedli mutácie v pozíciách 40 a 42.
Primér pre mutácie v pozíciách 40 a 42 ťažkého reťazca:
Primér 1:
5' TGGGTGAGGCAGGCGCCTGGGCAGGGACTTGAG 3'
Primér 2:
5' GGGGCTAGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGT 3'
Primér 3:
5' CTCAAGTCCCTGCCCAGGCGCCTGCCTCACCCA 3'
Primér 4:
5' GGGGATATCCACCATGG(AG)ATG(CG)AGCTG(TG)GT(CA)AT(CG)CTCTT 3'
Po overení pomocou sekvencie bodu mutácie v pozíciách 40 a 42 sa zaviedla mutácia v pozícii 87 (83 podľa Kabatovho číslovania).
Primér pre mutácie v pozícii 87 (83 podľa Kabatovho číslovania) ťažkého reťazca:
Primér 1:
5' CTCAGCAGGCTGCGGTCTGAGGACTCT 3'
Primér 2:
5' GGGGCTAGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGT 3'
Primér 3:
5' AGAGTCCTCAGACCGCAGCCTGCTGAG 3'
Primér 4:
5' GGGGATATCCACCATGG(AG)ATG(CG)AGCTG(TG)GT(CA)AT(CG)CTCTT 3'
Ďalšie náhrady sa neuskutočnili, pretože zvyšky boli zapojené do trojrozmernej štruktúry väzobného miesta.
Body mutácie sa verifikovali sekvenovaním. Výsledný konštrukt bol lElOVHhu a klonoval sa v PAH4604 expresnom vektore. Výsledný konštrukt bol 1E10VH-PAH4604.
Analýza pre VK1E10 poskytla tiež tri amfifilické segmenty (obr. 9), prvý zahrnoval FR1, druhý zahrnoval CDR1 a tretí zahrnoval FR3. Bolo rozhodnuté nahradiť zvyšky v pozíciách 7, 8 a 15 zvyškami v rovnakých pozíciách v ľudskej sekvencii s najvyššou homológiou. Aminokyseliny Thr, Thr a Leu sa nahradili aminokyselinami Ser, Pro a Val. Nahradenie sa uskutočnilo prekrývajúcou sa PCR (Kammann a spol. (1989): Rapid insertional mutagenesis of DNA by polymerase chain reaction (PCR), Nucleic Acids Res., 17: 5404) s použitím primérov 1, 2, 3 a 4, ktorých sekvencie sú nasledujúce:
Priméry pre mutáciu v pozíciách 7, 8 a 15 ľahkého reťazca:
Primér 1:
5' CAGATGACACAGTCTCCTTCCTCCCTGTCTGCCTCTGTGGGAGACAGAGTC 3 '
Primér 2:
5’ AGCGTCGACTTACGTTT(TG)ATTTCCA(GA)CTT(GT)GTCCC 3'
Primér 3:
5' GACTCTGTCTCCCACAGAGGCAGACAGGGAGGAAGGAGACTGTGTCATCTG 3 '
Primér 4:
5'GGGGTTAACCACCATGAGG(GT)CCCC(AT)GCTCAG(CT)T(CT)CT(TG)GG(GA) 3'
Body mutácií sa overili sekvenovaním. Výsledný konštrukt bol lElOVKhu a klonoval sa v expresnom vektore PAG 4622. Výsledný konštrukt bol lE10VKhu-PAG4 662.
Pre expresiu humanizovanej protilátky 1E10 sa bunky NS-0 transfektovali lE10VHhu-PAH4 604 a lE10VKhu-PAG4 662.
Protilátka lElOhu sa transfektovala rovnakým postupom elektroporácie a detekcie, ako sa opísalo pre chimérické protilátky.
Príklad 6: Biologická aktivita chimérickej MAb 1E10
Biologická aktivita chimérickej MAb 1E10 sa testovala meraním špecifickej väzby na antigén pomocou ELISA.
Pre rekombinantná MAb 1E10 sa mikrotitračná platnička zmočila MAb P3. Po premytí s PBST (roztok soľného fosfátového pufra obsahujúci 0,05 % Tweenu 20) sa nešpecifické väzby blokovali 1 % hovädzím sérovým albumínom (BSA) v PBST inkubáciou počas jednej hodiny pri 37 °C. Jamky sa premyli a jednu hodinu inkubovali pri 37 °C s vyčistenou rekombinantnou MAb 1E10. Jamky sa premyli PBST a pridala sa antiľudská kozia protilátka konjugovaná s alkalickou fosfatázou a jednu hodinu sa inkubovali pri 37 °C. Nakoniec sa jamky premyli PBST a pridal sa substrátový pufor obsahujúci /?-nitrofenylfosfát. Po pol hodine sa zmerali zodpovedajúce absorbancie pri 405 nm.
Ako negatívna kontrola sa použila chimérická MAb C5. Špecifickú väzbu chimérickej MAb 1E10 na MAb P3 ukazuje obr. 10.

Claims (1)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Chimérická monoklonálna protilátka odvodená z myšej anti-idiotypovej monoklonálnej protilátky 1E10, ktorá rozpoznáva myší MAb P3 a ktorá je produkovaná hybridomálnou bunkovou líniou s depozitným číslom EC ACC 97112901, kde konštantná oblasť ťažkého reťazca obsahuje sekvenciu aminokyselín gama-1 reťazca a konštantná oblasť ľahkého reťazca obsahuje sekvenciu aminokyselín kapa reťazca, pričom obidve sú odvodené z ľudských imunoglobulínov, hypervariabilné domény ich ťažkých a ľahkých reťazcov obsahujú nasledujúce sekvencie:
SK1226-2003A 2001-04-06 2002-04-08 Chimeric monoclonal antibody and its use in the preparation of medicament for the treatment of malignant tumors, cell line and pharmaceutical composition SK287914B6 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CU2001008420010084A CU23007A1 (es) 2001-04-06 2001-04-06 Combinaciones inmunoterapéuticas para el tratamiencombinaciones inmunoterapéuticas para el tratamiento de tumores que sobre-expresan gangliósidos to de tumores que sobre-expresan gangliósidos
PCT/CU2002/000003 WO2002081496A2 (es) 2001-04-06 2002-04-08 Anticuerpos recombinantes asociados a gangliósidos. su uso en el diagnóstico y tratamiento de tumores

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK12262003A3 SK12262003A3 (sk) 2004-08-03
SK287914B6 true SK287914B6 (sk) 2012-03-02

Family

ID=40291118

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1226-2003A SK287914B6 (sk) 2001-04-06 2002-04-08 Chimeric monoclonal antibody and its use in the preparation of medicament for the treatment of malignant tumors, cell line and pharmaceutical composition
SK1216-2003A SK287783B6 (sk) 2001-04-06 2002-04-08 Imunoterapeutická kombinácia na imunoterapiu nádorov, ktoré nadmerne exprimujú gangliozidy, a jej použitie

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1216-2003A SK287783B6 (sk) 2001-04-06 2002-04-08 Imunoterapeutická kombinácia na imunoterapiu nádorov, ktoré nadmerne exprimujú gangliozidy, a jej použitie

Country Status (36)

Country Link
US (3) US20040253233A1 (sk)
EP (3) EP1798243B1 (sk)
JP (2) JP4366080B2 (sk)
KR (3) KR100946168B1 (sk)
CN (3) CN100349920C (sk)
AR (2) AR033123A1 (sk)
AT (3) ATE378356T1 (sk)
AU (3) AU2002308348B2 (sk)
BG (2) BG66293B1 (sk)
BR (3) BR0208675A (sk)
CA (2) CA2441845C (sk)
CU (1) CU23007A1 (sk)
CZ (2) CZ304424B6 (sk)
DE (2) DE60223547T2 (sk)
DK (2) DK1384726T3 (sk)
EA (2) EA006936B1 (sk)
EC (2) ECSP034787A (sk)
ES (2) ES2296986T3 (sk)
HR (2) HRP20030805B1 (sk)
HU (2) HU228106B1 (sk)
IL (2) IL158246A0 (sk)
IS (2) IS6965A (sk)
MX (2) MXPA03008738A (sk)
MY (3) MY145703A (sk)
NO (2) NO20034437L (sk)
NZ (2) NZ528598A (sk)
PE (1) PE20020972A1 (sk)
PL (2) PL371770A1 (sk)
PT (2) PT1384726E (sk)
SG (1) SG161737A1 (sk)
SI (2) SI1384726T1 (sk)
SK (2) SK287914B6 (sk)
UA (3) UA75393C2 (sk)
UY (2) UY27243A1 (sk)
WO (2) WO2002081496A2 (sk)
ZA (2) ZA200307585B (sk)

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7297336B2 (en) * 2003-09-12 2007-11-20 Baxter International Inc. Factor IXa specific antibodies displaying factor VIIIa like activity
CN103143004A (zh) * 2005-02-04 2013-06-12 萨瓦克公司 存活蛋白肽疫苗
FI20055398A0 (fi) * 2005-07-08 2005-07-08 Suomen Punainen Risti Veripalv Menetelmä solupopulaatioiden evaluoimiseksi
CN105017423B (zh) * 2005-08-11 2019-06-04 阿皮·马托西安-罗杰斯 用于自身免疫性疾病治疗和诊断的TCR-V-β相关肽
WO2007024535A2 (en) * 2005-08-19 2007-03-01 Wyeth Antagonist antibodies against gdf-8 and uses in treatment of als and other gdf-8-associated disorders
ITFI20060163A1 (it) * 2006-06-29 2006-09-28 Menarini Internat Operations Luxembourg Sa Composizione farmaceutica contenente un anticorpo monoclonale anti idiotipico anti-ca-125 ed alluminio
TWI434855B (zh) * 2006-11-21 2014-04-21 Hoffmann La Roche 結合物及其在免疫分析中作為參考標準之用途
EP2255787A4 (en) * 2008-02-22 2014-08-27 Katayama Chemical Ind Co Ltd SYNTHETIC GLYCOLIPIDE-BASED LIPOSOMES
EP2166085A1 (en) 2008-07-16 2010-03-24 Suomen Punainen Risti Veripalvelu Divalent modified cells
TWI445716B (zh) 2008-09-12 2014-07-21 Rinat Neuroscience Corp Ｐｃｓｋ９拮抗劑類
CN102421801B (zh) * 2009-03-10 2016-03-16 比奥根Ma公司 抗-bcma抗体
SG174992A1 (en) 2009-04-01 2011-11-28 Genentech Inc Anti-fcrh5 antibodies and immunoconjugates and methods of use
CU23736A1 (es) * 2009-05-04 2011-11-15 Centro Inmunologia Molecular Anticuerpos que reconocen sulfatidos y proteoglicanos sulfatados y su uso
WO2011026242A1 (en) * 2009-09-03 2011-03-10 Vancouver Biotech Ltd. Monoclonal antibodies against gonadotropin-releasing hormone receptor
CA2824389A1 (en) * 2011-01-10 2012-07-19 Emory University Antibodies directed against influenza
CU24070B1 (es) * 2011-12-27 2015-01-29 Ct De Inmunología Molecular Composiciones farmacéuticas para el tratamiento de tumores que expresan regf y gangliósidos n-glicolilados gm3 (neugcgm3)
EP2641916A1 (en) 2012-03-23 2013-09-25 Centre National de la Recherche Scientifique (C.N.R.S) Novel antibodies anti-sPLA2-IIA and uses thereof
JP6433889B2 (ja) 2012-06-15 2018-12-05 ファイザー・インク Ｇｄｆ−８に対する改善された拮抗抗体およびその使用
TWI725931B (zh) 2013-06-24 2021-05-01 美商建南德克公司 抗ｆｃｒｈ５抗體
HRP20240939T1 (hr) 2013-12-17 2024-10-25 Genentech, Inc. Anti-cd3 protutijela i metode uporabe
SG11201607258SA (en) * 2014-04-10 2016-10-28 Obi Pharma Inc Antibodies, pharmaceutical compositions and uses thereof
TWI715587B (zh) 2015-05-28 2021-01-11 美商安可美德藥物股份有限公司 Ｔｉｇｉｔ結合劑和彼之用途
JP6871874B2 (ja) 2015-06-16 2021-05-19 ジェネンテック， インコーポレイテッド ＦｃＲＨ５に対するヒト化親和性成熟抗体及び使用方法
WO2018017864A2 (en) * 2016-07-20 2018-01-25 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Pvrig-binding agents and uses thereof
EP3548071A4 (en) 2016-11-30 2020-07-15 OncoMed Pharmaceuticals, Inc. CANCER TREATMENT METHODS INCLUDING TIGIT BINDING AGENTS
CU20170173A7 (es) * 2017-12-27 2019-11-04 Ct Inmunologia Molecular Nano-partículas que contienen el gangliósido gm3 como inmunomoduladoras

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2754206B2 (ja) * 1987-11-17 1998-05-20 メクト株式会社 α２→３結合を認識するモノクローナル抗体
US6051225A (en) * 1988-10-19 2000-04-18 The Dow Chemical Company Family of high affinity, modified antibodies for cancer treatment
ES2144440T3 (es) * 1992-08-18 2000-06-16 Centro Inmunologia Molecular Anticuerpos monoclonales que reconocen el receptor del factor de crecimiento epidermico, celulas y metodos para su produccion y compuestos que los contienen.
JPH07101999A (ja) * 1993-10-06 1995-04-18 Hagiwara Yoshihide 抗癌ヒトモノクローナル抗体に対する抗イデイオタイプ抗体のアミノ酸配列およびそれをコードするｄｎａ塩基配列
CU22702A1 (es) * 1997-10-21 2001-07-31 Centro Inmunologia Molecular Anticuerpos monoclonales anti - idiotipo, su uso en la inmunoterapia activa de tumores malignos, hibridoma que los produce y composiciones que los contienen
US6063379A (en) * 1993-12-09 2000-05-16 Centro De Inmunologia Molecular Anti-idiotypic monoclonal antibodies and compositions including the anti-idiotypic monoclonal antibodies
ES2166770T3 (es) * 1993-12-09 2002-05-01 Centro Inmunologia Molecular Anticuerpos monoclonales contra gangliosidos y sus utilizaciones en la inmunoterapia activa especifica de tumores malignos.
CU22420A1 (es) * 1993-12-29 1996-01-31 Centro Inmunologia Molecular Composicion vacunal para el desarrollo de una respuesta contra gangliosidos n glicolilados y su uso para el tratamiento del cancer
US6149921A (en) * 1993-12-29 2000-11-21 Centro De Inmunologia Molecular Vaccine compositions for eliciting an immune response against N-acetylated gangliosides and their use for cancer treatment
CU22615A1 (es) * 1994-06-30 2000-02-10 Centro Inmunologia Molecular Procedimiento de obtención de anticuerpos monoclonales murinos menos inmunogénicos. anticuerpos monoclonales obtenidos
CU22731A1 (es) * 1998-02-05 2002-02-28 Centro Inmunologia Molecular Anticuerpo monoclonal que reconoce el oligosacárido ácido siálico n´glicolilado-galactosa-glucosa (ngcneu-gal-glu) en tumores malignos y composiciones farmacéuticas que los contienen
US7442776B2 (en) * 1999-10-08 2008-10-28 Young David S F Cancerous disease modifying antibodies

Also Published As

Publication number Publication date
CA2441845C (en) 2011-06-07
AU2002308347B2 (en) 2006-09-14
JP2004525953A (ja) 2004-08-26
KR20030092048A (ko) 2003-12-03
HK1066818A1 (en) 2005-04-01
KR100946168B1 (ko) 2010-03-11
ZA200307585B (en) 2004-09-16
WO2002081661A3 (es) 2003-01-03
NZ528598A (en) 2005-03-24
HUP0401355A3 (en) 2012-05-29
KR20030087053A (ko) 2003-11-12
WO2002081661A2 (es) 2002-10-17
DE60228561D1 (de) 2008-10-09
CN1535282A (zh) 2004-10-06
HU228105B1 (en) 2012-11-28
EP1798243A3 (en) 2007-10-17
MY157372A (en) 2016-06-15
NO331533B1 (no) 2012-01-23
UA75393C2 (en) 2006-04-17
CN1507452A (zh) 2004-06-23
CN101054417B (zh) 2012-07-11
CU23007A1 (es) 2004-12-17
IL158246A (en) 2010-05-31
EP1411064A2 (en) 2004-04-21
AR033123A1 (es) 2003-12-03
EP1384726A2 (en) 2004-01-28
CZ296276B6 (cs) 2006-02-15
MY137078A (en) 2008-12-31
HK1070080A1 (zh) 2005-06-10
HU228106B1 (en) 2012-11-28
IS6965A (is) 2003-09-23
EP1798243B1 (en) 2010-08-11
PL371770A1 (en) 2005-06-27
HRP20030806B1 (hr) 2011-11-30
CZ20032641A3 (cs) 2004-07-14
EP1384726B1 (en) 2008-08-27
SK12162003A3 (sk) 2004-05-04
EP1411064B1 (en) 2007-11-14
AR033122A1 (es) 2003-12-03
IS2701B (is) 2010-11-15
WO2002081496A2 (es) 2002-10-17
KR100863509B1 (ko) 2008-10-15
EA006936B1 (ru) 2006-06-30
EP1798243A2 (en) 2007-06-20
BR0208676B1 (pt) 2017-11-14
CA2441845A1 (en) 2002-10-17
NO20034436L (no) 2003-12-02
ECSP034788A (es) 2004-01-28
BRPI0208675B1 (pt) 2018-03-13
BG66304B1 (bg) 2013-03-29
DK1384726T3 (da) 2008-12-15
NO20034437L (no) 2003-12-02
CZ304424B6 (cs) 2014-04-30
UA86768C2 (ru) 2009-05-25
ES2312610T3 (es) 2009-03-01
NO20034437D0 (no) 2003-10-03
ECSP034787A (es) 2004-01-28
ES2296986T3 (es) 2008-05-01
SG161737A1 (en) 2010-06-29
PT1384726E (pt) 2008-12-05
PE20020972A1 (es) 2003-01-02
BR0208676A (pt) 2008-04-08
CN101054417A (zh) 2007-10-17
SK12262003A3 (sk) 2004-08-03
UA76745C2 (uk) 2006-09-15
DK1411064T3 (da) 2008-03-25
SK287783B6 (sk) 2011-09-05
DE60223547T2 (de) 2008-09-18
HRP20030806A2 (en) 2005-08-31
AU2007231687B2 (en) 2010-09-30
HRP20030805A2 (en) 2005-08-31
CZ20032668A3 (cs) 2004-07-14
UY27242A1 (es) 2002-07-31
WO2002081496A3 (es) 2004-02-19
IL158246A0 (en) 2004-05-12
CN1319991C (zh) 2007-06-06
KR100919617B1 (ko) 2009-09-29
HRP20030805B1 (hr) 2011-11-30
US8758753B2 (en) 2014-06-24
EA200301097A1 (ru) 2004-02-26
JP2004528033A (ja) 2004-09-16
ATE477279T1 (de) 2010-08-15
NZ528599A (en) 2005-03-24
MXPA03008739A (es) 2003-12-11
HUP0401695A3 (en) 2012-05-29
SI1411064T1 (sl) 2008-04-30
US20040253233A1 (en) 2004-12-16
BG66293B1 (en) 2013-02-28
EA200301098A1 (ru) 2004-04-29
SI1384726T1 (sl) 2009-04-30
DE60223547D1 (de) 2007-12-27
US20100297008A1 (en) 2010-11-25
MXPA03008738A (es) 2003-12-11
ZA200307679B (en) 2005-03-30
CA2443372A1 (en) 2002-10-17
PL371937A1 (en) 2005-07-11
HUP0401695A2 (en) 2006-08-28
JP4366080B2 (ja) 2009-11-18
UY27243A1 (es) 2002-09-30
CN100349920C (zh) 2007-11-21
US20050069535A1 (en) 2005-03-31
AU2007231687A1 (en) 2007-11-22
KR20080080680A (ko) 2008-09-04
BR0208675A (pt) 2004-08-03
MY145703A (en) 2012-03-30
PT1411064E (pt) 2008-02-12
EA006310B1 (ru) 2005-10-27
ATE406386T1 (de) 2008-09-15
ATE378356T1 (de) 2007-11-15
BG108227A (bg) 2005-04-30
BG108228A (bg) 2005-04-30
IS6964A (is) 2003-09-23
HUP0401355A2 (hu) 2004-10-28
CA2443372C (en) 2013-05-28
NO20034436D0 (no) 2003-10-03
PL208109B1 (pl) 2011-03-31
HK1109160A1 (en) 2008-05-30
AU2002308348B2 (en) 2007-11-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2007231687B2 (en) Ganglioside-associated recombinant antibodies and the use thereof in the diagnosis and treatment of tumors
EP1623997B1 (en) Recombinant antibodies and fragments recognising ganglioside n-glycolyl-gm3 and use thereof in the diagnosis and treatment of tumours
JP5631733B2 (ja) 抗ＥｐＣＡＭ抗体およびその使用
JP2011209287A (ja) ヒトｂリンパ芽腫細胞系から分泌される抗ガングリオシド抗体
CN114929733A (zh) 调节性t细胞表面抗原的表位和与其特异性结合的抗体
TW201906869A (zh) 抗globo h之人類化抗體及其於治療癌症之用途
HK1109160B (en) Ganglioside-associated recombinant antibodies and the use thereof in the diagnosis and treatment of tumours
JP2001520034A (ja) 抗イディオタイプモノクローナル抗体、悪性腫瘍の能動免疫療法におけるそれらの使用、およびそれらを含有する組成物

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of maintenance fees

Effective date: 20120120