SK16852000A3 - Insekticídy na báze rekombinantného bakulovírusu - Google Patents
Insekticídy na báze rekombinantného bakulovírusu Download PDFInfo
- Publication number
- SK16852000A3 SK16852000A3 SK1685-2000A SK16852000A SK16852000A3 SK 16852000 A3 SK16852000 A3 SK 16852000A3 SK 16852000 A SK16852000 A SK 16852000A SK 16852000 A3 SK16852000 A3 SK 16852000A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- recombinant
- toxin
- insect
- insecticidal composition
- baculovirus
- Prior art date
Links
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 title claims abstract description 81
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 title abstract description 10
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims abstract description 79
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 75
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 claims abstract description 65
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims abstract description 65
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims abstract description 64
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 61
- 241000500437 Plutella xylostella Species 0.000 claims abstract description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 28
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 claims abstract description 16
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 83
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 71
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 claims description 65
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 52
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 48
- 101800002326 Adipokinetic hormone Proteins 0.000 claims description 42
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 23
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 22
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 22
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 21
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 21
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 20
- 101150031823 HSP70 gene Proteins 0.000 claims description 20
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 20
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 20
- 101100125027 Dictyostelium discoideum mhsp70 gene Proteins 0.000 claims description 18
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 18
- 101150052825 dnaK gene Proteins 0.000 claims description 18
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 claims description 13
- 101150042515 DA26 gene Proteins 0.000 claims description 13
- 101000634158 Androctonus australis Beta-insect excitatory toxin 1 Proteins 0.000 claims description 12
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 11
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 11
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 11
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 11
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 claims description 9
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 9
- 230000004077 genetic alteration Effects 0.000 claims description 9
- 231100000118 genetic alteration Toxicity 0.000 claims description 9
- 101000634177 Androctonus australis Beta-insect excitatory toxin 2 Proteins 0.000 claims description 8
- 101710164760 Chlorotoxin Proteins 0.000 claims description 8
- QPAKKWCQMHUHNI-GQIQPHNSSA-N chlorotoxin Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)N2CCC[C@H]2C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H]4CSSC[C@@H](C(N[C@@H](CCSC)C(=O)N5CCC[C@H]5C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(N)=O)NC4=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N3)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C1=CC=C(O)C=C1 QPAKKWCQMHUHNI-GQIQPHNSSA-N 0.000 claims description 8
- 229960005534 chlorotoxin Drugs 0.000 claims description 8
- 108010080576 juvenile hormone esterase Proteins 0.000 claims description 8
- 108091058550 ω-conotoxin Proteins 0.000 claims description 8
- 241000255601 Drosophila melanogaster Species 0.000 claims description 7
- 101710166052 Apolipophorin Proteins 0.000 claims description 6
- 101000876787 Drosophila melanogaster Esterase-6 Proteins 0.000 claims description 6
- 241000255908 Manduca sexta Species 0.000 claims description 6
- 241000255791 Bombyx Species 0.000 claims description 4
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 claims description 3
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 claims description 3
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 claims description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 claims 3
- 206010061217 Infestation Diseases 0.000 abstract description 5
- 238000009472 formulation Methods 0.000 abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 41
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 41
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 26
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 22
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 20
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 16
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 15
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 15
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 14
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 11
- 101000658304 Pyemotes tritici Toxin TxP-I Proteins 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 241000201370 Autographa californica nucleopolyhedrovirus Species 0.000 description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 10
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 10
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 10
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 7
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 6
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 5
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 5
- 230000034994 death Effects 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 5
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 4
- 241000537219 Deltabaculovirus Species 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- 108091036060 Linker DNA Proteins 0.000 description 4
- 241001599018 Melanogaster Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 4
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 4
- 150000002061 ecdysteroids Chemical class 0.000 description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 4
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 4
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 3
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 3
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 3
- 102000000340 Glucosyltransferases Human genes 0.000 description 3
- 108010055629 Glucosyltransferases Proteins 0.000 description 3
- 101000798956 Hadronyche versuta Omega-hexatoxin-Hv1a Proteins 0.000 description 3
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 3
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 239000002435 venom Substances 0.000 description 3
- 231100000611 venom Toxicity 0.000 description 3
- 210000001048 venom Anatomy 0.000 description 3
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 3
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 2
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 2
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 2
- 102100029796 Protein S100-A10 Human genes 0.000 description 2
- 101710110950 Protein S100-A10 Proteins 0.000 description 2
- 241001646398 Pseudomonas chlororaphis Species 0.000 description 2
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 239000004927 clay Substances 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001418 larval effect Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 241000239290 Araneae Species 0.000 description 1
- 241000238421 Arthropoda Species 0.000 description 1
- 241001203868 Autographa californica Species 0.000 description 1
- 241001012589 Babycurus centrurimorphus Species 0.000 description 1
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 description 1
- 241000701412 Baculoviridae Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000142468 Bracon Species 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 108090000312 Calcium Channels Proteins 0.000 description 1
- 102000003922 Calcium Channels Human genes 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 240000007790 Donax canniformis Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- VEPBEGNDJYANCF-QWRGUYRKSA-N Gly-Lys-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCCN VEPBEGNDJYANCF-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- 241000238894 Hadronyche versuta Species 0.000 description 1
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001147381 Helicoverpa armigera Species 0.000 description 1
- 108700001097 Insect Genes Proteins 0.000 description 1
- 102100024319 Intestinal-type alkaline phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 101710184243 Intestinal-type alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 239000005909 Kieselgur Substances 0.000 description 1
- 241000239268 Leiurus quinquestriatus Species 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 108090000189 Neuropeptides Proteins 0.000 description 1
- 101100065105 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) egt-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710138657 Neurotoxin Proteins 0.000 description 1
- 241001126829 Nosema Species 0.000 description 1
- 108010036939 Occlusion Body Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N Orthosilicate Chemical compound [O-][Si]([O-])([O-])[O-] BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 241000238709 Pyemotes tritici Species 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 101100425557 Rattus norvegicus Tle3 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000035415 Reinfection Diseases 0.000 description 1
- 241000239226 Scorpiones Species 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 241000219793 Trifolium Species 0.000 description 1
- 230000006750 UV protection Effects 0.000 description 1
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000010775 animal oil Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 229940097012 bacillus thuringiensis Drugs 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000000853 biopesticidal effect Effects 0.000 description 1
- VEMKTZHHVJILDY-UXHICEINSA-N bioresmethrin Chemical compound CC1(C)[C@H](C=C(C)C)[C@H]1C(=O)OCC1=COC(CC=2C=CC=CC=2)=C1 VEMKTZHHVJILDY-UXHICEINSA-N 0.000 description 1
- 150000004657 carbamic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000010410 dusting Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 230000000967 entomopathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 230000002964 excitative effect Effects 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 235000012631 food intake Nutrition 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000087 hemolymph Anatomy 0.000 description 1
- 239000008241 heterogeneous mixture Substances 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 1
- 235000021388 linseed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000000944 linseed oil Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002581 neurotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000618 neurotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 231100001184 nonphytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 210000004492 nuclear pore Anatomy 0.000 description 1
- -1 nucleic acid sequences acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000001769 paralizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011814 protection agent Substances 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 150000003219 pyrazolines Chemical class 0.000 description 1
- 150000003233 pyrroles Chemical class 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000005245 sintering Methods 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 102000008538 voltage-gated sodium channel activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040002416 voltage-gated sodium channel activity proteins Proteins 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
- C07K14/43513—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae
- C07K14/43531—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae from mites
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/40—Viruses, e.g. bacteriophages
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/14011—Baculoviridae
- C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
- C12N2710/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Insects & Arthropods (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Description
INSEKTICÍDY ΝΑ BÁZE REKOMBINANTNÉHO BAKULOVÍRUSU
Oblasť techniky
Predkladaný vynález sa týka vylepšených Plutella xylostella bakulovírusov použiteľných ako biologické insekticídy. Vynález poskytuje rekombinantné bakulovírusy, ktoré boli geneticky upravené tak, aby obsahovali gény kódujúce insekticídne toxíny.
Doterajší stav techniky
Bakulovírusy sú hmyzie vírusy, ktoré sú použiteľné ako biologické insekticídy. Bolo popísaných viac ako 400 izolátov bakulovírusov. Vírus jadrovej polyhedrózy Autographa californica (AcMNPV), typický predstaviteľ čeľade Baculoviridae, bol pôvodne izolovaný z Autographa californica, nočného motýľa bežne známeho ako ďatelinová húsenica. Tento vírus infikuje 12 čeľadí a viac ako 30 druhov hmyzu radu Lepidopteran (Granados a kol., The Biology of Baculoviruses, I, 99 (1986)). Nie je známe, že by AcMNPV produktívne infikoval akýkoľvek druh mimo tento rad.
Životný cyklus bakulovírusov, ako je napríklad AcMNPV, má dve štádiá. Každé štádium životného cyklu je reprezentované špecifickou formou vírusu: vyvinuté virióny (BV), ktoré sú neuzatvorené, a oklúzne telieska (OB).
V prirodzenej forme infikujúcej hmyz sú početné virióny nachádzajúce sa vo forme zanorenej do parakryštalickej proteínovej matrice známej ako oklúzne teliesko (OB), ktoré sa tiež označuje ako polyhedrálne inklúzne teliesko (PIB). Proteínové vírusové obaly sa označujú ako polyhedrá. Polyhedrínový proteín majúci molekulovú hmotnosť 29 kD je hlavný vírus kódovaný štrukturálnym proteínom vírusovej oklúzie (U.S. patent č. 4 745 051).
Vírusové oklúzie sú významnou časťou prirodzeného životného cyklu bakulovírusu, pretože poskytujú prostriedok pre horizontálny (z hmyzu na hmyz) prenos medzi citlivými druhmi hmyzu. V prostredí požije citlivý hmyz (zvyčajne v larválnom štádiu) vírusové oklúzie v kontaminovanej potrave, ako je rastlina.
587/B ·· ···· • · ··· ·
Kryštalické oklúzie disociujú v čreve citlivého hmyzu za uvoľnenia infekčných vírusových častíc. Tieto vírusy vzniknuté z oklúzie (ODV) sa replikujú v bunkách tkaniva stredného čreva.
Predpokladá sa, že vírusové častice vstupujú do buniek endocytózou alebo fúziou a že vírusová DNA je neobalená v mieste jadrového póru alebo jadra. Replikácia vírusovej DNA sa detekuje v priebehu 6 hodín. 10-12 hodín po infekcii (p. i.) sa sekundárna infekcia šíri do iných tkanív hmyzu prostredníctvom extracelulárneho šírenia vírusu (BV) z povrchu buniek. BV forma vírusu je zodpovedná za šírenie vírusu medzi bunkami u infikovaného hmyzu, rovnako ako za prenos infekcie v bunečnej kultúre.
Neskôr, v infekčnom cykle (12 hodín p. i.) môže byť v infikovaných bunkách detekovaný polyhedrínový proteín. Za 18 - 24 p. i. sa polyhedrínový proteín skladá v jadre infikovanej bunky a vírusové častice sa zanorujú do proteínových oklúzií. Vírusové oklúzie sa akumulujú vo veľkom počte 4-5 dní, do lýzie bunky. Tieto polyhedrá nemajú aktívnu úlohu v šírení infekcie v larve. BV sa v hemolymfe množia a šíria, čo vedie k smrti larvy.
Po smrti infikovanej larvy zostávajú milióny polyhedier v rozkladajúcom sa tkanive, zatiaľ čo BV sa degradujú. Keď iná larva požrie polyhedrá, napríklad v kontaminovanom rastlinnom materiáli alebo inej potrave, cyklus sa opakuje.
Na záver, uzatvorená forma vírusu je zodpovedná za prvotnú infekciu hmyzu v čreve, rovnako ako za stabilitu vírusu v prostredí. ODV sú v podstate neinfekčné pri podaní infekciou, ale sú vysoko infekčné pri orálnom podaní. Neuzatvorená forma vírusu (t.j. BV) je zodpovedná za sekundárnu infekciu a infekciu medzi bunkami. BV sú vysoko infekčné pre bunky v kultúre alebo pre vnútorné tkanivá hmyzu pri injekcii, ale sú v podstate neinfekčné pri orálnom podaní.
Hlavnou prekážkou intenzívneho použitia insekticídnych bakulovírusov v poľnohospodárstve je doba medzi prvotnou infekciou hmyzu a jeho smrťou. Táto doba môže byť rádovo dni až týždne. Počas tohto obdobia hmyz pokračuje v príjme potravy, čo ďalej poškodzuje rastliny. Kvôli skráteniu tohto stavu sa pripravili rekombinantné bakulovírusy, ktoré exprimujú substancie kontrolujúce alebo modifikujúce hmyz, ako sú toxíny, neuropeptidy, hormóny alebo enzýmy (Tomalski,
587/B ·· ···· • · · · · · ··· · ·· ·· ·
M. D. a kol., Náture, 352, 82 - 85 (1991), Federici, In Vitro, 28, 50A (1992), Martens a kol., App. and Envir. Microbiology, 56, 2764 - 2770 (1990), Menn a kol., Agric. Food Chem., 37, 271 - 278 (1989), Eldridge a kol., Insect Biochem., 21, 341 - 351 (1992), Hammock a koľ, Náture, 344, 458-461 (1990)).
Druhou hlavnou prekážkou použitia insekticídnych bakulovírusov je obmedzený rozsah ich hostiteľov. Hoci obmedzený rozsah hostiteľov pre bakulovírusy ich robí bezpečnými pre iné ako cieľové organizmy, znemožňuje im tiež kontrolu rôznych škodcov čeľade Lepidopteran prítomných na poli. Toto hlavne platí vtedy, keď komplex hmyzu čeľade Lepidopteran, ktorý sa má kontrolovať, zahrňuje hmyz, ktorý je buď nepermisívny alebo semipermisívny na infekciu použitým insekticídnym bakulovírusom. Hmyz, ktorý je nepermisívny pre infekciu, je taký hmyz, ktorý nemôže byť produktívne infikovaný akoukoľvek dávkou; hmyz, ktorý je semipermisívny pre infekciu, je taký hmyz, ktorý môže byť produktívne infikovaný dávkou vírusu, ktorá je aspoň o jeden, častejšie však o dva alebo viac rádovo vyššia ako dávka nutná pre produktívnu infekciu citlivých hostiteľov, t.j. permisívnych hostiteľov. Pred predkladaným vynálezom nebol identifikovaný žiaden bakulovírus rodu Nucleopolyhedrovírus, pre ktorý je pradiarka poľná, Plutella xylostella, permisívnym hostiteľom. Tento hmyz je významný škodca na mnohej zelenine a vyvinula sa u neho rezistencia ako na chemické, tak na biologické insekticídy.
Preto existuje potreba biologických insekticídov, ktoré majú (i) lepšiu účinnosť a kratšiu dobu medzi infekciou a mortalitou a (ii) väčší rozsah hostiteľov, ktorý umožní kontrolu širokého rozsahu hmyzích škodcov čeľade Lepidopteran, vrátane, napríklad Plutella xylostella.
Podstata vynálezu
Predkladaný vynález poskytuje rekombinantné bakulovírusy pre Plutella xylostella (PxNPV), ktoré majú lepšiu insekticídnu aktivitu proti Plutella xylostella ako iné prirodzené a rekombinantné bakulovírusy.
Rekombinantné PxNPV podľa predkladaného vynálezu sú PxNPV obsahujúce jednu alebo viacero genetických alterácií vzhľadom k prirodzenému PxNPV. Medzi
587/B ·· ···· ·· ···· genetické alterácie patrí napríklad vloženie alebo delécia jedného alebo viacerých reštrikčných miest; modifikácia, delécia alebo duplikácia jedného alebo viacerých génov kódovaných vírusom; a vloženie jedného alebo viacerých génov kódujúcich heterológne proteíny, t.j. proteíny, ktoré nie sú kódované vírusom alebo sú kódované iným vírusom.
Výhodne obsahujú rekombinantné PxNPV vo svojich genómoch sekvenciu nukleovej kyseliny kódujúcu substanciu ovplyvňujúcu hmyz, ako je napríklad insekticídny toxín, peptidový hormón, enzým alebo receptor, ktorá je operatívne naviazaná na promótor schopný aktivovať transkripciu v cieľovom hmyze. Najlepšie je substanciou ovplyvňujúcou hmyz insekticídny toxín. Predpokladá sa, že rekombinantný bakulovírus kódujúci insekticídny toxín v kontexte s PxNPV genómom bude mať výrazne lepšie insekticídne vlastnosti.
Príkladmi insekticídnych toxínov sú AalT, AaHITI, AaHIT2, LqhlT2, LqqlTI, LqqlT2, BjlT1, BjlT2, LqhP35, LqhalfalT, SmplT2, SmpCT2, SmpCT3, SmpMT, DK9.2, DK11, DK12, μ-agatoxín, King Kong toxín, Pt6, NPS-326, NPS-331, NPS373, Tx4(6-1), TxP-1, omega-atratoxíny, alfa-konotoxíny, μ-konotoxíny, chlorotoxín a omega-konotoxíny. V niektorých vyhotoveniach sa použil prirodzený sekrečný signálny peptid, t.j. signálny peptid asociovaný s toxínom; v iných vyhotoveniach sa použil heterológny signálny peptid na navodenie sekrécie toxínu z infikovaných hmyzích buniek. Príkladmi použiteľných heterológnych signálnych peptidov sú peptidy odvodené od pBMHPC-12 signálnej sekvencie z Bombyx mori; signálna sekvencia adipoklnetického hormónu z Mandura sexta; apolipoforínová signálna sekvencia z Manduca sexta; choriónová signálna sekvencia z Bombyx mori; kutikulová signálna sekvencia zDrosophila melanogaster; signálna sekvencia esterázy-6 z Drosophila melanogaster; a pohlavne špecifická signálna sekvencia z Bombyx mori.
Vynález tiež zahrňuje priame ligačné vektory, ktoré sú navrhnuté kvôli uľahčeniu konštrukcie v rekombinantných PxNPV genómov pomocou ligácie DNA fragmentov in vitro. Vloženie DNA vzniknutej pri takejto ligácii do vhodného hostiteľa vedie k produkcii rekombinantných PxNPV.
587/B ·· ···· ·· ····
V inom aspekte vynález poskytuje expresné kazety kódujúce insekticídne toxíny. Expresné kazety obsahujú promótorovú sekvenciu, výhodne odvodenú od Drosophila meianogaster hsp70 promótora, ktorá je operatívne naviazaná na sekvenciu nukleovej kyseliny kódujúcej toxín. Expresné kazety podľa predkladaného vynálezu môžu byť tiež obsiahnuté v plazmidových vektoroch, ktoré sú navrhnuté ako modulárne expresné vektory.
V ešte inom vyhotovení vynález poskytuje gény s optimalizovanými kodónmi kódujúce hmyzie toxíny, ako sú napríklad gény uvedené na obr. 10 a 11, ďalej. Gény s optimalizovanými kodónmi sú tie gény, v ktorých boli jednotlivé kodóny prítomné v prirodzenej sekvencií kódujúcej toxín substituované alternatívnymi kodónmi, ktoré sú účinnejšie využívané aparátom syntetizujúcim proteíny v hmyzej bunke.
V ešte inom aspekte vynález poskytuje insekticídne kompozície a prípravky obsahujúce aspoň jeden rekombinantný PxNPV podľa predkladaného vynálezu a poľnohospodársky prijateľný nosič.
V ešte inom aspekte vynález poskytuje spôsob ničenia hmyzích škodcov a redukcie zamorenia škodcami, ktorý obsahuje aplikáciu insekticídne účinného množstva insekticídnej kompozície alebo prípravku obsahujúceho PxNPV do danej oblasti.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obr. 1 je schematické znázornenie postupov použitých na prípravu pmd 205.1, pmd 216.1 a pmd 220.2 vektorov na produkciu rekombinantných PxNPV s deletovaným génom pre vírusovú ecdysteroid glukózytransferázu (egt).
Obr. 2 je schematické znázornenie postupov použitých na prípravu vektoru LAB 50.2.
Obr. 3 je schematické znázornenie štruktúry pMEV modulárnych expresných vektorov.
587/B ·· ···· ·· ···· ···· ·· ·· · ·
Obr. 4 je schematické znázornenie pMEV vektorov obsahujúcich rôzne promotory.
Obr. 5 je schematické znázornenie klonovania sekvencií do modulárnych expresných vektorov.
Obr. 6 ukazuje D. melanogaster hsp70 promótorový modul v pMEV5 a amplifikačné priméry použité na izoláciu sekvencie.
Obr. 7 ukazuje D. melanogaster hsp70 promótorový modul v pMEV6 a amplifikačné priméry použité na izoláciu sekvencie.
Obr. 8 je ilustrácia DNA sekvencie s optimalizovanými kodónmi kódujúcej AalT a ukazuje oligonukleotidy a amplifikačné priméry použité na syntézu sekvencie.
Obr. 9 je schematické znázornenie štruktúry pMEV/ADK modulárnych expresných vektorov.
Obr. 10 je ilustrácia DNA sekvencie s optimalizovanými kodónmi kódujúcej LqhlT2 toxín a ukazuje oligonukleotidy a amplifikačné priméry použité na syntézu sekvencie.
Obr. 11 je ilustrácia DNA sekvencie s optimalizovanými kodónmi kódujúca omega-ACTX-HV1 toxín a ukazuje oligonukleotidy a amplifikačné priméry použité na syntézu sekvencie.
Podrobný popis vynálezu
Pri vykonávaní predkladaného vynálezu sa môže použiť veľa techník molekulárnej biológie, mikrobiológie, rekombinantnej DNA, proteínovej biochémie a hmyzej virológie známych odborníkom v odbore, ako sú plne vysvetlené v, napríklad, Sambrook a kol., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vy d., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Gold Spring Harbor, New York; Oligonucleotide Synthesis, 1984 (M. L. Gait, ed.); Ausubel a kol., Current Protocols in Molecular Biology, 1997 (John Wíley and Sons); séria Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Protein Purification: Principles and Practice, 2. vyd. (Springer-Verlag, N.Y.); Summers a kol., A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Celí
587/B ·· ···· ·· ····
···· ·· ·· ·· ·
Culture Procedures, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin č. 1555, 1987, a O'Reilly a kol., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, 1994 (Oxford Univ. Press, N.Y.).
Predkladaný vynález poskytuje izolované, prečistené, rekombinantné Plutella xylostella bakulovírusy (PxNPV), ktoré sú použiteľné ako biologické insekticídy. PxNPV, ako je tu použitý, označuje izolát bakulovírusu rodu Nucleopolyhedrovirus (NPV), ktorého prirodzená verzia bola izolovaná z infikovaných lariev Plutella xylostella a ktorý je geneticky odlišný od iných známych bakulovírusov a ktorý vykazuje vyššiu infektivitu pre larvy Plutella xylostella ako ostatné bakulovírusy. Genómové sekvencie rekombinantných PxNPV podľa predkladaného vynálezu, s vylúčením heterológnych sekvencií, vykazujú aspoň 90 % identitu sekvencie, a lepšie aspoň 95 % identitu sekvencie, s genómovou sekvenciou PxNPV uloženou ako ATCC VR-2607. PxNPV spadajúci do rozsahu predkladaného vynálezu sa môže identifikovať:
(i) Meraním infektivity pre larvy Plutella xylostella. PxNPV podľa predkladaného vynálezu zvyčajne vykazuje infektivitu pre larvy Plutella xylostella, ktorá je aspoň o dva rády vyššia ako je infektivita V8 kmeňa AcMNPV uloženého ako ATCC VR-2465.
(ii) Trávením vírusovej genómovej DNA Hindlll, Xhol a/alebo Pstl a porovnaním vzniknutých reštrikčných fragmentov s fragmentmi produkovanými trávením genómovej DNA odvodenej od PxNPV a non- PxNPV bakulovírusov. PxNPV podľa predkladaného vynálezu, s vylúčením fragmentov vzniknutých v dôsledku genetických zmien, má reštrikčné fragmenty charakteristické pre PxNPV, t.j. fragmenty, ktoré vznikajú pri trávení PxNPV a nevznikajú pri trávení DNA iných bakulovírusov.
Vynálezcovia zistili, že rekombinantný PxNPV podľa predkladaného vynálezu má lepšiu insekticídnu aktivitu na larvy Plutella xylostella v porovnaní s prirodzenými PxNPV a/alebo rekombinantnými NPV odvodenými od iných druhov bakulovírusov. Rekombinantné PxNPV podľa predkladaného vynálezu sú PxNPV, ktoré obsahujú jednu alebo viacero genetických alterácií vzhľadom k prirodzenému PxNPV. Termín „genetická alterácia,, označuje akúkoľvek zmenu v sekvencii genómu PxNPV, vrátane, napríklad, vloženia alebo delécie jedného alebo viacerých reštrikčných
587/B ·· ···« ·· ···· • · · · · · • · · · · • · · · · · • · · · · · · ···· ·· ·· ·· ·· • · · ·· miest; modifikácie, delécie alebo duplikácie jedného alebo viacerých génov kódovaných vírusom; a vloženia jedného alebo viacerých génov kódujúcich heterológne proteíny, t.j. proteíny, ktoré nie sú kódované vírusom alebo sú kódované iným vírusom. Napríklad, modifikované PxNPV, ktorých genómy obsahujú reštrikčné miesta neprítomné v prirodzených PxNPV, alebo naopak, ktoré neobsahujú jedno alebo viacero reštrikčných miest prítomných v prirodzenom PxNPV, spadajú do rozsahu predkladaného vynálezu. Termín „reštrikčné miesto,, označuje sekvenciu nukleovej kyseliny, ktorá je rozpoznávacím miestom pre reštrikčnú endonukleázu. Zvyčajne sa vykoná adícia a/alebo delécia jedného alebo viacerých reštrikčných miest kvôli vytvoreniu klonovacieho miesta neprítomného v prirodzenom PxNPV, t.j. kvôli vytvoreniu sekvencie obsahujúcej aspoň jedno jedinečné reštrikčné miesto na vloženie heterológneho génu do genómu PxNPV. Výhodne obsahuje rekombinantný PxNPV vo svojom genóme aspoň jeden heterológny gén, vrátane napríklad génov kódujúcich substancie ovplyvňujúce hmyz, ako sú napríklad insekticídne toxíny, hormóny, enzýmy alebo receptory.
Najlepšie obsahuje rekombinantný PxNPV heterológny gén kódujúci insekticídny toxín. Medzi vhodné insekticídne toxíny patria napríklad toxíny uvedené v nasledujúcej tabuľke:
| Toxín | Odkaz |
| AalT, AaHITI, AaHIT2 | Darbon a kol., Int. J. Peptide Proteín Res., 20, 320 - 330, 1982; Loreta kol., Biochem., 29, 142- 1501, 1990 |
| LqhlT2 | Zlotkin a koľ, Biochem., 30, 4814 - 4821, 1991; Zlotkin a kol., Európska patentová prihláška EP 0374753 A2, 1990 |
| LqqlTI, LqqlT2 | Zlotkin a kol., Árch. of Biochem. and Biophys., 240, 877 - 887, 1985; Zlotkin a kol., Európska patentová prihláška EP 0374753A2, 1990 |
| BjlT1, BjlT2 | Loret a kol., Biochem. Biophys. Acta, 701, 370 - 387, 1982; Zlotkin a kol., Európska patentová prihláška, EP 0374753 A2, 1990 |
| LqhP35 | Zlotkin a kol., Európska patentová prihláška EP 0374753 |
587/B ·· ···· ·· ···· ···· ·· ·· ·· ·· ·
| A2, 1990 | |
| LphalfalT | Eitan a kol., Biochem., 29, 5941 - 5947, 1990 |
| SmplT2 | Zlotkin a kol., Európska patentová prihláška EP 0374753 A2, 1990 |
| SmpCT2 | Zlotkin a koľ, Európska patentová prihláška EP 0374753 A2, 1990 |
| SmpCT3 | Zlotkin a kol., Európska patentová prihláška EP 0374753 A2, 1990 |
| SmpMT | Zlotkin a kol., Európska patentová prihláška EP 0374753 A2, 1990 |
| DK9.2 | Krapcho a kol., Medzinárodná patentová prihláška WO 92/15195, 1992 |
| DK11 | Krapcho a kol., Medzinárodná patentová prihláška WO 92/15195, 1992 |
| DK12 | Krapcho a kol., Medzinárodná patentová prihláška WO 92/15195, 1992 |
| μ-agatoxín | Skinner a kol., J. Biol. Chem., 264, 2150 - 2155, 1989; Adams a kol., J. Biol. Chem., 265, 861 - 867, 1990 |
| King Kong toxín | Hillyard a kol., Biochem., 28, 358 - 361, 1989 |
| Pt6 | Leisy a kol., Európska patentová prihláška EP 0556160 A2, 1993 |
| NPS-326 | Krapcho a kol., Medzinárodná patentová prihláška WO 93/15192, 1993 |
| NPS-331 | Krapcho a kol., Medzinárodná patentová prihláška WO 93/15192, 1993 |
| NPS-373 | Krapcho a kol., Medzinárodná patentová prihláška WO 93/15192, 1993 |
| Tx4(6-1) | Figueriredo a kol., Toxicon, 33, 83 - 93,1995 |
| TxP-1 | Tomalski a koľ, Toxicon, 27, 1151 - 1167, 1989 |
| omega - atrakotoxíny | Atkinson a kol., Medzinárodná patentová prihláška WO 93/15108, 1993 |
587/Β ·· ···· ·· ···· ·· • · · · • · B • · · B ···· BB ·· B ·· BB
| alfa-konotoxíny | Gray a kol., J. Biol. Chem., 256, 4734 - 4740, 1981; Gray a kol., Biochem., 23, 2796-2802, 1984 |
| μ-konotoxíny | Cruz a kol., J. Biol. Chem., 260, 9280 - 9288, 1989; Cruz a kol., Biochem., 28, 3437- 3442, 1989 |
| chlorotoxín | Debin a kol., Am. J. Physiol., 264, 361 - 369, 1993 |
| omega - konotoxíny | Olivera a kol., Biochem., 23, 5087 - 5090, 1984; Riviér a koľ, J. Biol. Chem, 262, 1194-1198, 1987 |
Sekvencia kódujúca toxín je operatívne naviazaná na promótor, t.j. promótorová sekvencia je umiestnená pred sekvenciou kódujúcou toxín tak, že expresia toxínu je pod kontrolou promótora. Promótor môže byť promótor odvodený od bakulovírusu, ako je napríklad DA26, 35K, 6,9K a polyhedrínový (polh) promótor (O'Reilly a kol., J. Gen. Virol, 71, 1029 (1990); Friesen a kol., J. Virol, 61, 2264, 1987; Wilson a kol., J. Virol., 61, 661 -666, 1987; Hooft van Iddekinger a kol., Virol., 131, 561, 1983; a všeobecne pozri Miller, ed., The Baculoviruses, Plénum Press, New York, 1997). Alternatívne sa môže použiť promótor hostiteľskej bunky, ako je napríklad hmyzí hsp70 promótor alebo aktinový promótor. Môže sa použiť akýkoľvek prirodzený alebo syntetický promótor aktívny v navodení transkripcie v cieľových hmyzích bunkách.
Ďalej, DNA sekvencia kódujúca toxín môže obsahovať pred sebou sekvenciu kódujúcu signálny peptid, ktorý - vo svojej pôvodnej bunke - riadi sekréciu toxínu. Alternatívne môže byť sekvencia kódujúca toxín fúzovaná v rámci s predchádzajúcou DNA sekvenciou kódujúcou heterológnu signálnu sekvenciu, t.j. sekvenciu odvodenú z iného zdroja, vrátane napríklad sekvencii odvodených zpBMHPC-12 signálnej sekvencie z Bombyx mori; signálnu sekvenciu adipokinetického hormónu z Mandura sexta; apolipoforínové signálne sekvencie z Manduca sexta; choriónové signálne sekvencie z Bombyx mori; kutikulové signálne sekvencie z Drosophila melanogaster; signálne sekvencie esterázy-6 z Drosophila melanogaster; a pohlavne špecifické signálne sekvencie z Bombyx mori, ktoré sú všetky popísané v U.S. patente č. 5 547 871.
587/B ·· ···· ·· ···· ···· ·· ·· ·· • · • · · · • · · • · · · ·· ·
V niektorých vyhotoveniach obsahujú PxNPV podľa predkladaného vynálezu vo svojom genóme gén kódujúci prirodzenú alebo mutantnú esterázu juvenilného hormónu (JHE), ktorej expresia môže spôsobiť ireverzibilné ukončenie príjmu potravy a zakuklenie, a tak môže viesť k smrti cieľového hmyzu, pozri napríklad WO 94/03588.
Rekombinantné PxNPV sa môžu tiež pripraviť genetickým upravením prirodzeného alebo preexistujúceho rekombinantného PxNPV kmeňa tak, že výsledkom je modifikácia jednej alebo viacerých funkcií kódovaných vírusom. Napríklad jeden alebo viacero vírusových génov, ako sú napríklad gény kódujúce vírusový polyhedrínový proteín, ecdysteroid glukozyltransferázu (EGT) alebo p10 proteín, sa môžu modifikovať, deletovať alebo duplikovať. Okrem toho môžu byť vložené sekvencie odvodené od iných bakulovírusov, ako je napríklad región V8 kmeňa AcMNPV, ktorý obsahuje determinant vedúci k fenotypu s rýchlejším usmrcovaním, ako je popísané v U.S. patente č. 5 662 897.
Príklady rekombinantných PxNPV podľa predkladaného vynálezu sú tie, ktoré majú ATCC prírastkové č. VR-2607, VR-2608 a VR-2609.
Predkladaný vynález poskytuje spôsoby a prípravky pre konštrukciu rekombinantných PxNPV. Na prípravu rekombinantných PxNPV sa môže použiť akákoľvek metóda známa v odbore. Napríklad, súčasná infekcia vhodnej hostiteľskej bunky dvoma kmeňmi PxNPV môže viesť k homológnej rekombinácii medzi dvoma príbuznými sekvenciami in vivo, ktorá môže viesť k vzniku rekombinantného PxNPV. Podobne môže homológna rekombinácia prebehnúť in vivo v bunkách súčasne transfektovaných prečistenou genómovou DNA PxNPV vírusu a druhou nukleovou kyselinou obsahujúcou PxNPV sekvencie. Alternatívne môže byť rekombinantný PxNPV pripravený vložením izolovanej vírusovej genómovej DNA, ktorá bola vopred modifikovaná in vitro, do buniek.
V jednej sérii vyhotovenia sú rekombinantné PxNPV pripravené za použitia vektorov na priamu ligáciu a modulárnych expresných vektorov. Tieto zložky a spôsoby ich použitia na prípravu rekombinantných PxNPV sú popísané ďalej.
587/B ·· ···· • · ···· • · · • · • · • · e ···· ·· • · · • · · • · · · • · · · ·· *· ·· • · · • · • · · • · ·· ·
Vektory na priamu ligáciu odvodené od PxNPV
Vírusové vektory na priamu ligáciu obsahujú prečistené genómové DNA PxNPV vírusy, ktoré sa môžu použiť pre konštrukciu rekombinantných PxNPV genómov pomocou DNA ligácie in vitro. Vektory na priamu ligáciu riadia produkciu rekombinantných PxNPV viriónov po vnesení do vhodnej hostiteľskej bunky. V niektorých vyhotoveniach obsahujúcich PxNPV vektory na priamu ligáciu PxNPV genómovú DNA, ktorá bola modifikovaná tak, aby obsahovala aspoň jedno klonovacie miesto, ktoré nie je prítomné v prirodzenom PxNPV. Klonovacie miesto obsahuje jedno alebo viacero reštrikčných miest, ktoré buď nie sú prítomné v genóme prirodzeného PxNPV alebo nie sú prítomné v nukleovej kyseline kódujúcej alebo regulujúcej základné funkcie PxNPV vírusu. V druhom prípade sú vektory na priamu ligáciu podľa predkladaného vynálezu upravené tak, aby mali deletované akékoľvek reštrikčné miesta, ktoré sú mimo klonovacie miesto, takže klonovacie miesto obsahuje jedno jedinečné reštrikčné miesto. Trávenie vektoru na priamu ligáciu jedným alebo viacerými reštrikčnými enzýmami špecifickými pre klonovacie miesto potom vedie k zisku DNA prípravku, do ktorého sa môže vložiť heterológny segment nukleovej kyseliny, zvyčajne v jednom ligačnom kroku, bez narušenia základných vírusových funkcií. Po ligácii heterológnej nukleovej kyseliny do vektoru na priamu ligáciu môže byť vzniknutý DNA prípravok vložený do vhodnej hostiteľskej bunky kvôli propagácii rekombinantného PxNPV. Priame ligačné vektory zjednodušujú produkciu rekombinantných PxNPV tým, že eliminujú závislosť od rekombinácii in vivo tvoriacich rekombinantné vírusy, pozri napríklad Medzinárodná patentová prihláška WO 94/28114.
Klonovacie miesta na použitie v PxNPV priamych ligačných vektoroch sú navrhnuté najprv pomocou výberu jedného alebo viacerých reštrikčných enzýmov, ktoré buď (i) netrávia PxNPV DNA vôbec alebo (ii) rozpoznávajú malý počet miest, ktoré neležia v nukleovej kyseline kódujúcej alebo regulujúcej základné funkcie PxNPV vírusu. Selekcia sa vykoná (i) počítačovým prehľadávaním PxNPV DNA sekvencie alebo (ii) trávením PxNPV DNA enzýmom a detekciou prítomnosti alebo neprítomnosti produktov trávenia. Pokiaľ enzým rozpoznáva malý počet miest, tak môžu byť tieto miesta narušené, za použitia bežných techník (ako je napríklad
587/B ·· ···· ·· ···· • · · • · • · • · · ···· ·· • · · • · · • · · • · · · ·· ·« • · • · ·· · trávenie reštrikčným enzýmom nasledované zakončením lepivými koncami a religáciou) za zisku PxNPV DNA, ktorá neobsahuje tieto miesta, ale zachováva si vírusovú replikáciu a infektivitu.
Po selekcii jedného alebo viacerých reštrikčných miest sa klonovacie miesto vloží akýmikoľvek vhodnými prostriedkami, vrátane homológnej rekombinácie in vivo alebo ligácie in vitro, do PxNPV DNA (či prirodzenej alebo modifikovanej, ako je popísané vyššie pre inaktiváciu jedného alebo viacerých reštrikčných miest). Výhodne obsahuje klonovacie miesto aspoň neprekrývajúce sa reštrikčné miesta kvôli umožneniu (i) priameho klonovania inzertu nukleovej kyseliny a/alebo (ii) nezávislej inzercie mnohých inzertov nukleovej kyseliny.
Na prípravu priamych ligačných vektorov z PxNPV sa môžu vložiť ďalšie modifikácie, vrátane napríklad modifikácií, ktoré vedú k inaktivácii vírusového génu, ako je napríklad gén kódujúci polyhedrín, ecdysteroid glukozyltransferázu (EGT) alebo p10 proteín. V niektorých vyhotoveniach je klonované miesto vložené v mieste, v ktorom spôsobí takúto inaktiváciu.
Modulárne expresné vektory a expresné kazety
Modulárne expresné vektory na použitie v predkladanom vynáleze sú plazmidové vektory obsahujúce expresnú kazetu, ktorá sa môže excidovať z modulárneho expresného vektoru a ligovať do PxNPV priamych ligačných vektorov popísaných vyššie. Zvyčajne expresná kazeta obsahuje v smere 5'-3': promótorovú sekvenciu operatívne naviazanú na 5' netranslatovaný región (UTR), ktorá obsahuje štart miesto pre transkripciu; sekvenciu obsahujúcu jedno alebo viacero reštrikčných miest kvôli uľahčeniu inzercie heterológneho génu (táto sekvencia je označená „inzerčné miesto,,); a 3' UTR sekvenciu obsahujúcu aspoň miesto na spracovanie 3' terminálnej mRNA a polyadenyláciu. Expresná kazeta susedí na jednom z koncov s vhodnými reštrikčnými miestami kompatibilnými s PxNPV priamym ligačným vektorom.
587/B ·· ···· ·· ···· ·· • · ··· ···· • · · · · · · • ···· ···· ···· ·· ·· ·· ·· ···
Medzi vhodné promótory na použitie v modulárnych expresných vektoroch patria bakulovírusové promótory a promótory hostiteľských buniek. Medzi vhodné bakulovírusové promótory patria napríklad DA26, 35K, 6.9K a polyhedrínový (polh) promótor. Medzi vhodné promótory hostiteľskej bunky patrí napríklad hsp70 a aktívny promótor, výhodne odvodený od hmyzu. Sekvencia „odvodená od„ promótorovej sekvencie je sekvencia obsahujúca modifikácie, vrátane delécií, inzercií, substitúcií a duplikácií prirodzenej promótorovej sekvencie. Jedinou požiadavkou je účinnosť konečného promotoru v cieľových hmyzích bunkách v zmysle riadenia expresie heterológneho génu, na ktorý je operatívne naviazaná.
Expresné kazety môžu tiež obsahovať sekvencie kódujúce signálne sekvencie, ktoré riadia sekréciu heterológneho proteínu. Signálne sekvencie môžu byť sekvencie asociované s heterológnym proteínom alebo môžu byť odvodené od iného proteínu. Medzi vhodné signálne sekvencie patria napríklad sekvencie odvodené od pBMHPC-12 signálnej sekvencie z Bombyx mori; od signálnej sekvencie adipokinetického hormónu z Mandura sexta; od apolipoforínovej signálnej sekvencie z Manduca sexta; od choriónovej signálnej sekvencie z Bombyx mori; od kutikulovej signálnej sekvencie z Drosophila melanogaster; od signálnej sekvencie esterázy-6 z Drosophila melanogaster; a od pohlavne špecifickej signálnej sekvencie z Bombyx mori. Sekvencia nukleovej kyseliny kódujúcej signálny peptid je inzertovaná medzi 5-UTR a začiatok zrelého heterológneho proteínu. Spoj medzi 3'koncom sekvencie kódujúcej signálny peptid a začiatkom zrelého heterológneho proteínu je navrhnutá tak, aby inzercia heterológnej sekvencie viedla k vzniku fúzneho proteínu medzi signálnym peptidom a heterológnou sekvenciou v čítacom rámci. Sekvencia „odvodená od„ známej signálnej sekvencie je sekvencia obsahujúca modifikácie, vrátane delécií, inzercií a substitúcií aminokyselinových zvyškov v signálnej sekvencii. Jedinou požiadavkou je účinnosť vzniknutej signálnej sekvencie v cieľových hmyzích bunkách v zmysle riadenia sekrécie heterológnej sekvencie, na ktorú je naviazaná, z hmyzích buniek.
Heterológne sekvencie na použitie v predkladanom vynáleze zahrňujú, napríklad, sekvencie kódujúce substancie ovplyvňujúce hmyz, ako sú napríklad insekticídne toxíny, hormóny, enzýmy a receptory. Medzi vhodné insekticídne toxíny
587/B ·· ···· ·· ···· • · · · · ···· • · · · · · ·
4Γ · ········ ι u ········· ···· ·· ·· ·· ·· · patria napríklad AalT, AaHITI, AaHIT2, LqhlT2, LqqlTI, LqqlT2, BjlT1, BjlT2,
LqhP35, LqhalfalT, SmplT2, SmpCT2, SmpCT3, SmpMT, DK9.2, DK11, DK12, μagatoxín, King Kong toxín, Pt6, NPS-326, NPS-331, NPS-373, Tx4(6-1), TxP-1, omega-atratoxíny, alfa-konotoxíny, μ-konotoxíny, chlorotoxín a omega-konotoxiny.
Sekvencie nukleovej kyseliny kódujúce substanciu ovplyvňujúcu hmyz a/alebo signálne peptidy môžu zodpovedať prirodzeným sekvenciám nukleovej kyseliny kódujúcim tieto peptidy. Alternatívne môžu byť sekvencie zmenené tak, aby využívali optimálne kodóny pre známe gény vo vírusovom vektore (alebo v blízkych príbuzných kmeňoch) a/alebo v hmyze, ktoré sú cieľom insekticídnych vírusov podľa predkladaného vynálezu. Sekvencie s optimalizovanými kodónmi, t.j. sekvencie, v ktorých bola sekvencia nukleovej kyseliny kódujúca určitú aminokyselinu modifikovaná bez zmeny aminokyseliny kódovanej v tejto pozícii, sa môžu navrhnúť s použitím metód dobre známych v odbore, ako je napríklad porovnanie využitia kodónov v známych génových sekvenciách vírusu a/alebo cieľového hmyzu a v sekvenciách nukleovej kyseliny kódujúcich signálne peptidy a substancie ovplyvňujúce hmyz podľa predkladaného vynálezu. Vhodne odráža použitie kodónov v sekvenciách kódujúcich signálne peptidy a substancie ovplyvňujúce hmyz použitie kodónov vo vírusovom vektore alebo v cieľovom hmyze. Príklady sekvencii toxínu s optimalizovanými kodónmi sú uvedené na obr. 10 a 11.
Produkcia rekombinantných PxNPV
Rekombinantné PxNPV sa môžu produkovať buď (i) súčasnou transfekciou PxNPV DNA a heterológnej sekvencie do vhodnej hostiteľskej bunky kvôli umožneniu homológnej rekombinácie in vivo, alebo (ii) in vitro ligáciou heterológnej sekvencie do priameho ligačného vektoru, po ktorej nasleduje vloženie konštruktu do vhodnej hostiteľskej bunky kvôli umožneniu propagácie vírusu. Vhodnou hostiteľskou bunkou je akákoľvek bunka podporujúca replikáciu bakulovírusu, vrátane napríklad Sf9 buniek, Sf21 buniek a High Five™ buniek (Invitrogen, Carlsbad, CA). Izolovaný vírus podľa predkladaného vynálezu je vírus, ktorý bol klonovaný, napríklad pomocou prečistenia plakov v tkanivovej kultúre alebo ktorý bol inak pripravený z jedného vírusového genotypu.
587/B • e • ··· ···· »· ···· • ···· ···· ··· · · · · ·· ···· ·· ·· · ·· ·
Zvyčajne je modulárny expresný vektor konštruovaný tak, aby obsahoval expresnú kazetu, v ktorej je vhodná promótorová sekvencia operatívne naviazaná na sekvenciu kódujúcu heterológny proteín, t.j. expresia heterológneho proteínu je pod kontrolou promótora. Expresná kazeta je excidovaná z modulárneho expresného vektora a je inzertovaná do PxNPV priameho ligačného vektoru DNA ligáciou in vitro. Ligačná zmes sa potom prenesie do vhodnej hostiteľskej bunky. Rekombinantné PxNPV sú získané z kultivačného média a akoukoľvek vhodnou metódou sú stanovené LC50 a LT50, vrátane napríklad testu postreku potravy, testu inkorporácie do potravy a testov namočenia listov.
LC5o je koncentrácia vírusu, pri ktorej hynie 50 % infikovaných lariev v priebehu trvania testu. ĽT50 je čas po infekcii, kedy 50 % infikovaných lariev hynie po expozícii určitej dávke vírusu.
Výhodne má PxNPV podľa predkladaného vynálezu LC50 približne 1 x 105 OBs/16 cm2 alebo menej pre larvy Plutella xylostella pri meraní štandardným testom nanesenia vírusu na potravu, ktorý je popísaný v príklade 6. Iné bakulovírusové izoláty majú zvyčajne vyššie l_C5o pre larvy Plutella xylostella, t.j. sú menej účinné, vzhľadom k ich infektivite pre iné druhy hmyzu.
Insekticídne kompozície a prípravky
Predkladaný vynález poskytuje insekticídne kompozície a prostriedky, ktoré obsahujú jeden alebo viacero rekombinantných PxNPV. Výhodne usmrcuje rekombinantný PxNPV podľa predkladaného vynálezu larvy Plutella xylostella účinnejšie ako prirodzený PxNPV alebo rekombinantné verzia iných bakulovírusov (pozri napríklad príklad 11 ďalej).
Insekticídna kompozícia podľa predkladaného vynálezu obsahuje aspoň jeden rekombinantný PxNPV. Insekticídny prípravok obsahuje aspoň jeden rekombinantný PxNPV v insekticídne účinnom množstve a poľnohospodársky prijateľný nosič. Insekticídne účinné množstvo je množstvo, ktoré spôsobuje detekovateľné zníženie zamorenia, ako sa prejaví množstvom alebo počtom hmyzích škodcov v danej oblasti alebo v danom množstve plodín; poškodením spôsobeným hmyzími
587/B ·· ···· ·· ···· ·· · ·· · ·· · ···· • · ··· ··· • ···· · · · · · • ·· · · · · ·· · ···· ·· ·· ·· ·· ··· škodcami; alebo akýmkoľvek iným vhodným parametrom zamorenia. Prípravok môže byť vo forme zmáčavých práškov, dispergovateľných granúl, granúl, suspenzií, emulzií, roztokov pre aerosóly, návnad a iných bežných formách insekticídnych prípravkov. Vhodnými nosičmi sú, napríklad, voda, alkohol, uhľovodíky alebo iné organické rozpúšťadlá alebo minerálne, živočíšne alebo rastlinné oleje alebo prášky ako je mastenec, hlinka, silikát alebo kremelina. Tiež môžu byť obsiahnuté zmáčavé činidlá, poťahovacie činidlá, činidlá na ochranu pred UV žiarením, disperzné činidlá a spojivá. Živiny ako je cukor sa môžu pridať kvôli zvýšeniu príjmu hmyzom a/alebo na prilákanie hmyzu. Činidlá zvyšujúce tekutosť, ako sú napríklad činidlá zvyšujúce tekutosť na báze hlinky, sa môžu pridať kvôli minimalizácii spekania zmáčavých práškov alebo iných suchých prípravkov. Prípravok sa môže vyrobiť vo forme potiahnutých častíc alebo vo forme mikroenkapsulovaného materiálu. Prostriedok musí byť nefytotoxický a nesmie poškodzovať integritu rekombinantného PxNPV obsiahnutého v prípravku tak, aby žiadne zložky prípravku nezhoršovali príjem prípravku hmyzom alebo akúkoľvek funkciu vírusu. Príklady prípravkov sú popísané v EP publikovanej prihláške 0 697 170 A1; PCT prihláške WA 92/191025 a v U.S. patente č. 4 948 586.
Insekticídne prípravky podľa predkladaného vynálezu môžu obsahovať jeden alebo viacero chemických insekticídov a/alebo jedno alebo viacero biologických kontrolných činidiel iných ako PxNPV. Medzi chemické insekticídy patria napríklad pyretroidy, pyrazolíny, organofosfáty, karbamáty, formadíny a pyroly, ktoré sú všetky dobre známe v odbore. Príklady zlúčenín sú popísané v PCT prihláškach 96/03048, 96/01055 a 95/95741. Medzi biologické kontrolné činidlá patria napríklad nonPxNPV bakulovírusy (prirodzené alebo rekombinantné); Bacillus thuringiensis, Nosema polyvora, M. grandis, Bracon mellitor, entomopatogénne huby a členovce.
Predkladaný vynález tiež poskytuje spôsob na ničenie hmyzích škodcov. Spôsob obsahuje kontaktovanie hmyzu s insekticídne účinným množstvom kompozície alebo prípravku podľa predkladaného vynálezu. Vynález tiež poskytuje spôsob na zníženie zamorenia plodín hmyzom, ktorý obsahuje aplikáciu insekticídne účinného množstva kompozície alebo prípravku podľa predkladaného vynálezu do danej oblasti. Insekticídne prípravky sa aplikujú za použitia bežných techník ako je napríklad postrek alebo práškovanie plodín. Zvyčajne sa prípravky aplikujú v dávke
587/B ·· ···· ·· ···· medzi približne 2,4 x 108 a približne 2,4 x 1012 OB/hektár (OB sú oklúzne telieska).
Účinné dávky závisia napríklad od cieľového hmyzu, použitého rekombinantného
PxNPV a od plodiny, ktorá sa ošetruje. Dávka obsahujúca insekticídne účinné množstvo sa môže určiť odborníkom v odbore za použitia bežných metód.
• · ·· · · · · · · ··· · ··· · ···· ·· ·· ·· ·· ·
Príklady uskutočnenia vynálezu
Nasledujúce príklady dokresľujú, ale neobmedzujú predkladaný vynález.
Príklad 1
Konštrukcia rekombinantného PxNPV obsahujúceho beta-galaktozidázu s deletovaným Egt
Nasledujúce pokusy boli vykonané pre prípravu rekombinantného PxNPV, v ktorom je gén pre vírusovú ecdysteroid glukozyltransferázu (egt) deletovaný a nahradený markerovým génom E. coli pre beta-galaktozidázu (beta-gal).
Zásoba prirodzeného PxNPV, ktorý bol pasážovaný na hmyze, sa plakovo prečistila s použitím bežných postupov popísaných v O' Reilly a kol., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, Oxford University Press, New York, NY, 199) kvôli príprave klonálnej zásoby vírusu pre genetické úpravy. Integrita tejto zásoby, označenej PxNPV-3, bola potvrdená porovnaním charakteru reštrukčných fragmentov s charakterom pôvodnej zásoby PxNPV. Biotesty proti panelu hmyzích druhov tiež potvrdili, že virulencia zodpovedá neklonovanému pôvodnému vírusu.
Obr. 1 ilustruje postup použitý pre konštrukciu prenosového vektoru pre narušenie egt génu v PxNPV inzerciou génu pre beta-galaktozidázu. Blízka podobnosť charakteru reštrikčných fragmentov AcNPV a PxNPV ukazuje na homológiu na úrovni DNA, ktorá umožňuje použitie prenosových vektorov na báze V8 kmeňa AcNPV, ktorý je popísaný v U.S. patente č. 5 662 897. Vektor obsahujúci beta-gal kazetu, označený pmd 216.1, bol pripravený nasledujúcim spôsobom. BamHl-až-Xbal fragment obsahujúci beta-gal gén pod kontrolou Drosophila melanogaster hsp70 promótoru sa izolovať z pAcDyl (Zuidema a kol., J. Gen. Virol., 71, 2201 (1990)). Tento fragment sa potom subklonoval do pBluescript™Sk+. (Stratagene, La Jolla, CA) medzi BamHi a Xbal miesta polylinkéra. Pst „G„ fragment
587/B ·· ·· ··· · · · · ·· ···· ·· ···· ······ ·· ·· ··
AcNPV kmeňa V8vEGTDEL, ktorý obsahuje egt gén a susedný región (pozri U.S. patent č. 5 662 897) sa potom subklonoval do polylinkéra pUC9 v PstI mieste. Vzniknutý plazmid sa označil pmd 205.1.
Konečný prenosový vektor sa pripravil vyhotovením štvorfragmentovej ligácie medzi (i) pBluescript™Sk+ tráveným BamHI a PstI, ktorý bol defosforylovaný teľacou črevnou fosfatázou; (ii) 0,975 kb Bg1 II- až Pvull fragmentom pmd 205.1; (iii) 3,86 kb Smal-až-Xbal beta-gal fragmentom pmd 216.1 a (iv) 1,6 kb Xbal-až-Pstl fragmentom pmd 205.1. Výsledný prenosový vektor, označený pmd 220.2, obsahoval markerový beta-gal gén riadený hsp70 klonovaný do miesta egt delécie.
Beta-gal označený PxNPV s deletovaným egt génom sa pripravil homológnou rekombináciou medzi pmd 220.2 a PxNPV-3 DNA súčasne transfektovanými do kultivovaných Sf-9 buniek. 1 μg pmd 220.2 DNA a 250 ng PxNPV-3 DNA sa miešali s 252 pg Lipofectinu (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) v konečnom objeme 200 μΙ TNMFH (JRH Biosciences, Lenexa, KS). Po inkubácii pri teplote okolia po dobu 15 minút sa zmes preniesla do konečného objemu 2,0 ml TNM-FH kompletného média (TNMFH plus 10 % fetálne hovädzie sérum a 1 % plurinic F68 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD)). Zmes sa prevrstvila cez 2,75 x 105 Sf-9 buniek, ktoré sa potom kultivovali v jamkách štandardnej 6-jamkovej tkanivovej kultivačnej platne. Bunkám sa menilo médium každých 24 hodín a vyvinutý vírus sa odoberal po ďalších 96 hodinách. Rekombinantné vírusy boli pozitívne na oklúzne telieska (occ+) a exprimovali betagal gén. Rekombinanty (occ+/modré plaky) sa identifikovali troma kolesami plakového prečistenia za prítomnosti 100 pg/ml 5-bróm-4-chlór-3-indolyl-beta-Dgalaktopyranozidu (X-gal). Výsledný vírus sa označil T96-19.1.1.1.
Príklad 2
Konštrukcia priameho ligačného PxNPV vírusového vektora s deletovaným egt génom
587/B ·· ···· ·· ···· ·· · ·· ··· · · · ·· ·· ··· ··· • ···· · · · · · • · · ···· ·· · ···· ·· ·· ·· ·· ···
Nasledujúce pokusy boli vykonané na prípravu priameho ligačného vektoru odvodeného od PxNPV (pozri Medzinárodná patentová prihláška US 94/06079). Tento vektor obsahuje poly-spojovaciu sekvenciu (označenú „Bsu-Sse spojovacia sekvencia,,) inzertovanú do PxNPV genómu v egt mieste.
Na prípravu Bsu-Sse spojovacej sekvencie boli syntetizované dva oligonukleotidy, ktoré mali sekvencie:
5'-CCTCAGGGCAGCTTAAGGCAGCGGACCGGCAGCCTGCAGG-3' (Oligo 32) a
5'-CCTGCAGGCTGCCGGTCCGCTGCCTTAAGCTGCCCTGAGG-3' (Oligo 33).
Po tepelnom spracovaní kódujú tieto dva oligoméry niekoľko miest pre reštrikčné endonukleázy, vrátane Bsu 361 a Sse 83871 miest, ktoré sú použiteľné pri konštrukcii rekombinantných vírusov. Každý sa riedil na koncentráciu 30 pmól/μΙ do pufra kvôli tepelnému spracovaniu obsahujúceho 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM NaCl a 1 mM EDTA. Zmes sa zahriala na 95 °C na dobu 10 minút a potom sa pomaly ochladila na teplotu okolia v priebehu niekoľkých hodín.
Tepelne spracované oligonukleotidy sa inzertovali do pmd 205.1 prenosového vektora nasledujúcim spôsobom. Pmd 205.1 vektor sa trávil Spel, ktorý ho trávi v jedinom mieste umiestnenom tesne pred egt deléciou (obr. 2). Konce tráveného plazmidu sa doplnili Klenowovým fragmentom DNA polymerázy I za prítomnosti všetkých štyroch nukleotidov. 100 ng linearizovaného plazmidu sa potom ligovalo do 15 pmól dvojreťazcovej spojovacej sekvencie pomocou T4 DNA ligázy v celkovom objeme 10 μΙ. Po skončení ligačnej reakcie sa T4 ligáza inaktivovala teplom a zmes sa spracovala polynukleotid kinázou. 8,8 kb DNA prúžok sa prečistil elektroforézou v 1 % agarózovom géli preparatívnej čistoty s nízkou teplotou topenia (BioRad, Richmond, VA). Prúžok gélu obsahujúci 8,8 kb lineárnej DNA sa nechal roztopiť pri 65 °C a ligácia v géli za použitia približne 1/10 gólového prúžku sa použila pre recirkularizáciu DNA, ktorá sa potom použila na transformáciu DH5alfa, E. coli buniek.
587/B ·· ···· ·· ···· ·· ·· · · · ···· • · · · · e · • · · · · ···· ··· ···· · · ···· ·· ·· ·· ·· ·
Vzniknuté plazmidy sa vyšetrovali polymerázovou reťazovou reakciou (PCR) kvôli určeniu orientácie Bsu-Sse spojovacej sekvencie vzhľadom k egt génu. Oligo a 33 boli samostatne párované s oligomérom EGT 1 (5’GCGGCCAATATATTGGCCGTGTTT-3'), ktorý je špecifický pre región egt génu 5' na deléciu. Orientácia Bsu-Sse spojovacej sekvencie v LAB 50.2 je uvedená na obr. 2.
Priamy ligačný vektor PxNPV sdeletovaným egt génom sa pripravil homológnou rekombináciou medzi LAB 50.2 a T96-19.1.1.1 PxNPV vírusovou DNA, ktoré boli súčasne transfektované do kultivovaných Sf9 buniek spôsobom popísaným v príklade 1 za použitia 1 pg LAB 50.2 a 250 ng T96-19.1.1.1 vírusovej DNA. V tomto prípade boli rekombinantné vírusy pozitívne na oklúzne telieska a neexprimovali beta-gal gén. Rekombinantné (occ+/biele) vírusy boli identifikované troma kolesami plakového prečistenia za prítomnosti 100 μg/ml X-gal. Získaný vírus bol označený T97-8.1.1.1 (ATCC prírastkové č. VR-2608).
Príklad 3
Konštrukcia modulárnych expresných vektorov použiteľných na produkciu rekombinantných PxNPV A. pMEV 1-4
Návrh, konštrukcia a použitie vektorov pMEV1, pMEV2, pMEV3 a pMEV4 na expresiu cudzorodých génov pod kontrolou bakulovírusových promótorov sú popísané v Medzinárodnej patentovej prihláške US 94/06079. Tieto vektory majú všeobecnú štruktúru uvedenú na obr. 3. Každý vektor bol odvodený od pBluescript SK+ plazmidu (Stratagene, La Jolla, CA) substitúciou regiónu medzi Sstl a Xhol miestami v pBluescript poly-spojovacej sekvencie expresnou kazetou zloženou z nasledujúcich prvkov: (i) krátkej syntetickej spojovacej DNA s rozpoznávacími miestami pre reštrikčné enzýmy Sstl, Sse 8387I a Stul; (ii) promótorového modulu, ktorý sa skladá z promotoru a kompletného 5' netranslatovaného regiónu (UTR) vybraného AcMNPV vírusového génu; (iii) poly-spojovacieho modulu, ktorý uľahčuje inzerciu požadovaného regiónu kódujúceho proteín; (iv) 3' UTR modulu, ktorý sa
587/B «· ···· ·· ···· ·· · • · ··· ····· • · · · · ··· • ···· ···· · • · · · · · · · · · ···· ·· ·· ·· ·· ··· skladá z kompletného 3'-netranslatovaného regiónu AcMNPV 6.9K génu (základný proteín); a (v) krátkej syntetickej spojovacej DNA s rozpoznávacími miestami pre reštrikčné enzýmy Stul, Bsu36l a Xhol.
Ako je uvedené na obr. 4, promótorové moduly vo vektoroch pMEV1 až pMEV4 sú odvodené z génov, ktoré sú exprimované v rôznych štádiách životného cyklu vírusu. Promótorový modul DA26 génu v pMEV1 a promótorový modul 35K génu v pMEV4 sú odvodené z génov, ktoré sú exprimované v životnom cykle vírusu skoro; to znamená pred zahájením syntézy DNA. Promótorový modul 6.9K génu v pMEV2 je odvodený od „neskorého,, štrukturálneho génu, ktorý je exprimovaný po zahájení syntézy DNA, a promótorový modul polyhedrínového (polh) génu v pMEV3 je odvodený z „veľmi neskorého,, génu, ktorý kóduje hlavnú štrukturálnu zložku vírusových oklúznych teliesok.
Polylinkerový modul bol navrhnutý tak, aby umožnil umiestnenie regiónu kódujúceho proteín do bezprostredného susedstva 5' UTR promótorového modulu bez vloženia ďalších spojovacích sekvencií. Ako je uvedené na obr. 5, polylinkér obsahuje Esp3l miesto, ktoré je umiestnené tak, že trávenie vektoru Esp3l ho štiepi medzi pozíciami -4 a -5 v hornom reťazci promótorového modulu a v spojení medzi promótorovým a polylinkérovým modulom v dolnom reťazci. Spracovanie DNA trávenej Esp3l DNA polymerázou za prítomnosti štyroch štandardných 2'deoxynukleozid trifosfátov (dNTP) vytvorí linearizovaný vektor, ktorý je zakončený lepivým koncom v presnom 3' konci promótorového modulu. Tento segment môže byť naviazaný na 5' fragment zakončený lepivými koncami, ktorého sekvencia začína ATG iniciačným kodónom požadovaného regiónu kódujúceho proteín. Kvôli uľahčeniu priameho klonovania fragmentu kódujúceho proteín je 3' koniec fragmentu pripravený tak, aby obsahoval rozpoznávacie miesto pre jeden z enzýmov, ktoré štiepi polylinkérový modul (ako je ilustrované BamHI na obr. 5) a ako fragment kódujúci proteín, tak vektor sú trávené týmto enzýmom pred ligáciou.
Kľúčovou vlastnosťou týchto vektorov je prítomnosť rozpoznávacích miest pre reštrikčné enzýmy Sse8387l a Bsu36l na jednom z koncov expresnej kazety. Toto umožňuje excíziu inzertovaných sekvencií z modulárneho expresného vektoru a ich
587/B ·· ···· ·· ·· ··· • · · • · • · · • · · ··· · ·· • · · • · · • · · · • · · · ·· ·· ligáciu do priamych ligačných PxNPV vektorov podľa predkladaného vynálezu (pozri napríklad príklad 2, vyššie).
B. pMEV5 a pMEV6
Dva vektory, pMEV5 a pMEV6, boli pripravené tak, aby obsahovali D. melanogaster promótor génu hsp70 (hlavný proteín teplotného šoku). pMEV5 obsahuje 724 bp segment D. melanogaster hsp70 promótora/5' UTR (označený hsp70Bam na obr. 4) v rozsahu od pozície -493 do pozície +231 vzhľadom k štart miestu pre transkripciu hsp70 génu. pMEV6 obsahuje 475 bp segment rovnakého promótora/5' UTR (označený hsp70Xba na obr. PD2), v rozsahu od pozície -244 do pozície +231.
Promótorové moduly použité na prípravu pMEV5 a pMEV6 boli syntetizované PCR amplifikáciou za použitia plazmidu phcHSP70PL (Morris a kol., J. Virol., 66, 7397 (1992)) ako templátu. Oligonukleotidové priméry pre každú reakciu a sekvencie amplifikovaného produktu sú uvedené na obr. 6 a 7 (pre pMEV5 a pMEV6, v príslušnom poradí). Každý z primérov má dvojdielnu štruktúru. 5' časť nemá žiadnu homológiu sekvencie s phcHSP70PL templátom a používa sa na inkorporáciu špecifických reštrikčných miest do koncov konečného PCR produktu. Medzi tieto miesta patria Sstl, Sse8387l a Stul miesta na 5' konci PCR produktu a Esp3 a Xbal miesta na 3' konci PCR produktu (pozri obr. 6 a 7). 3’-časť každého priméru obsahuje sekvencie homologické s phcHSP70PL templátom a definuje jednu hranicu hps70 - špecifickej sekvencie v každom module.
Pred PCR reakciami bol primér (-) reťazca (HSP70Esp) fosforylovaný na svojom 5' konci inkubáciou 200 pmól priméru po dobu 30 minút pri 37 °C v 10 ml reakčnej zmesi obsahujúcej 70 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCb, 5 mM DTT, 1 mM ATP a 10 jednotiek T4 polynukleotid kinázy (New England Biolabs, Beverly, MA). PCR reakcie sa potom vykonali v samostatných Micro Amp skúmavkách (Perkin Elmer, Norwalk, CT) s použitím nasledujúceho postupu. 50 pmól každého priméru sa zmiešalo s 0,25 - 1,0 ng phcHSP70PL DNA v 50 μΙ reakčnej zmesi obsahujúcej 200 μΜ dNTP, 1X klonovaný Pfu polymerázový pufor (Stratagene, La Jolla, CA) a 5 jednotiek klonovanej Pfu DNA polymerázy (Stratagene, La Jolla, CA). Vzorky sa umiestnili do Perkin Elmer Model 9600 termocyklovača (Perkin Elmer,
587/B ·· ··· ·· ···· ·· ·· ··· · · · • · · · · · · • · · · · ···· ···· ·· ·· ·· ··
Norwalk, CT) a spracovali sa v dvoch cykloch pri 1 minúte pri 94 °C (denaturačný stupeň), 1,5 minúte pri 50 °C (stupeň tepelného spracovania) a 3 minútach pri 72 °C (stupeň rozšírenia), po ktorých nasledovalo 28 cyklov 1 minúta pri 94 °C, 1,5 minúty pri 55 °C a 3 minúty pri 72 °C. Pri poslednom cykle bola rozširovacia reakcia vykonávaná po dobu ďalších 7 minút a reakčná zmes sa ochladila na 4 °C. Produkty amplifikácie boli extrahované raz fenolom : chloroformom : izoamylalkoholom (25 : 24 : 1) upraveným na 0,3 M octanom sodným a vyzrážali sa etanolom.
Po rozpustení vo vhodnom reakčnom pufre sa DNA trávila PstI (ktorá ju štiepi v Sse8387l mieste) a fragmenty obsahujúce predpokladané hsp70 promótorové moduly sa prečistili elektroforézou na 1,2 % agarózovom géli s nízkou teplotou topenia s preparatívnym stupňom čistoty (BioRad, Richmond, CA). Základný vektor pre konštrukciu pMEV5 a pMEV6 bol pripravený štiepením pMEV1 EcoRI a doplnením koncov Klenowovým fragmentom DNA polymerázy I za prítomnosti všetkých štyroch nukleotidov. Po sekundárnom štiepení vektoru Sse8387l a defosforylácii koncov pomocou teľacej črevnej alkalickej fosfatázy sa veľký (3,1 kb) fragment obsahujúci pBluescript skelet a 3' UTR a polylinkérové moduly prečistil na agarózovom géli s nízkou teplotou topenia a ligoval sa individuálne s prečistenými hsp70 promótorovými modulmi za vzniku pMEV5 a pMEV6.
C. pMEV5/ADK-AalT a pMEV6/ADK-AalT pMEV5 a pMEV6 vektory popísané vyššie boli ďalej spracované tak, aby obsahovali gén kódujúci AalT, toxín špecifický pre hmyz, ktorý je prítomný v jede východoafrického škorpióna Andoctuonus australi (Hector) (Zlotkin a kol., Biochimie, 53, 1073 (1971)). Keď je AalT injikovaný do telesnej dutiny hmyzej larvy, viaže sa selektívne na napäťovo senzitívne sodíkové kanály a spôsobuje prechodnú kontraktilnú paralýzu. Chronické podávanie toxínu, ktoré sa môže dosiahnuť infekciou lariev bakulovírusmi produkujúcim AalT, je spojené s predĺžením paralýzy a prípadne so smrťou (Stewart a koľ, Náture, 352, 85 (1991); Maeda a kol., Virol., 184, 777 (1991); McCutchen a kol., Biotechnol., 9, 848 (1991)). U.S. patent 5 547 871 popisuje sekvenciu ADK-AalT génu s optimalizovanými kodónmi, v ktorej je sekrécia AalT toxínu riadená signálnym peptidom z génu pre adipokinetický hormón (ADK) Manduca sexta. Inzercia ADK-AalT kódujúceho regiónu do vektorov pMEV1 31 587/B ·· ···· ·· ···· ···· ·· pMEV4 (kvôli získaniu plazmidov pMEV1/ADK-AalT - pMEV4/ADK-AalT) je popísaná v Medzinárodnej patentovej prihláške US 94/06079.
Na konštrukciu pMEV5 a pMEV6 derivátov kódujúcich ADK-AalT sa syntetizoval fragment obsahujúci sekvenciu ADK-AalT génu pomocou PCR za použitia pMEV3/ADK-AalT ako templátu. Primér (+) reťazca, označený PD30, začínal v iniciátorovom ATG kodóne ADK signálneho peptidu. Primér (-) reťazca, označený 69K3UT, bol vybraný tak, aby navodil syntézu DNA za polylinkérovým modulom; to znamená, v 3' UTR pMEV3/ADK-AalT. Sekvencia primérov a amplifikovaného DNA fragmentu sú uvedené na obr. 8.
Pred amplifikáciou bol 5' koniec priméru (+) reťazca defosforylovaný spôsobom uvedeným vyššie pre HSP70Esp. PCR reakcia sa tiež vykonala spôsobom popísaným vyššie, s tou výnimkou, že amplifikácia bola vykonaná pri 25 cykloch 1 minútu pri 94 °C, 1,5 minúty pri 52 °C a 3 minúty pri 72 °C. Po syntéze bola DNA trávená BamHI, ktorý ju štiepi v polylinkérovom module a 274 bp 5'lepivý/3'-BamHI fragment obsahujúci ADK-AalT kódujúci región sa inzertoval do pMEV5 a pMEV6. Štruktúry vzniknutých plazmidov pMEV5/ADK-AalT a pMEV6/ADK-AalT boli potvrdené analýzou reštrikčnými enzýmami a čiastočným určením sekvencie DNA.
D. MEVS vektory obsahujúce modul ADK signálneho peptidu
Nasledujúce pokusy boli vykonané na prípravu série modulárnych expresných vektorov, ktoré obsahujú DNA kódujúcu ADK signálny peptid (pozri vyššie), ktoré sa môžu použiť na riadenie sekrécie akejkoľvek inzertovanej sekvencie. Pripravila sa séria vektorov (označených pMEV1/ADK až pMEV6/ADK), v ktorých bola 57 bp sekvencia optimalizovaných kodónov pre ADK signálny peptid (zvyšky 1 - 57 na obr. 8) umiestnená medzi promótorové a polylinkérové moduly. Expresné kazety v týchto vektoroch majú všeobecnú štruktúru uvedenú na obr. 9.
Na prípravu série pMEVx/ADK vektorov bol DNA fragment obsahujúci promótorový modul a naviazaný ADJ signálny peptid získaný z príslušných pMEVx/ADK-AalT vektorov pomocou PCR. Primér pre (+) reťazec pre každú reakciu bol oligonukleotid špecifický pre promótor, ktorý navodzuje syntézu DNA na 5' konci promótorového modulu a vkladá reštrikčné miesta pre Sstl, Sse8387l a Stul do 5'
587/B ·· ···· • · · · · · konca amplifikovaného fragmentu. Templáty a priméry pre (+) reťazec pre každú reakciu sú uvedené v nasledujúcej tabuľke.
• * · ···· ·· • · · • · · · ·· ·· • · • · ·· ·
| Templat | Primer | Sekvence |
| pMEVl/ADK- AalT | DA26FZ | 5’- AGCAGCGAGCTCCTGCAGGCCTACGCGT AATTCGATATAGAC -3* |
| pMEV2/ADK- AalT | 69KFZ | 5'-AGCAGCGAGCTCCTGCAGGCCTATGCCG TGTCCAATTGCAAG -3’ |
| pMEV3/ADK- AaTT | PHF | 5’- AGCAGCGAGCTCCTGCAGGCCTGACGCA CAAACTAATATCAC -3' |
| pMEV4/ADK- AalT | 35KPRO1 | 5*- AGCAGCGAGCTCCTGCAGGCCTCITGAT GTCTCCGATTTC -3' |
| pMEV5/ADK- AalT | HSP70Bam | 5'- AGCAGCGAGCTCCTGCAGGCCTGATCCT TAAATTGTATCCTA -3’ |
| pMEV6/ADK- AaTT | HSP70Xba | 5'- AGCAGCGAGCTCCTGCAGGCCTAGAATC CCAAAACAAACTGG -3' |
Primér pre (-) reťazec pre každú reakciu, označený ADKRev (5'CGGATCTAGACACGTCTCGGGCCTCAGCGATAATCACGAAGGC-3') navodzuje syntézu od 3' konca ADK signálneho peptidu a vkladá miesta pre Esp3l a Xbal do 3' konca amplifikovaného fragmentu. PCR reakcia sa tiež vykonala spôsobom popísaným vyššie pre pMEV5-6 s tou výnimkou, že amplifikácia sa vykonala pri 25 cykloch 1 minúta pri 94 °C, 1,5 minúty pri 52 ’C a 3 minúty pri 72 °C. DNA syntetizovaná zo všetkých templátov s výnimkou pMEV5/ADK-AalT, bola trávená Pstl, ktorý ju štiepi v Sse8387l mieste pred promótorom a Xbal, ktorý ju štiepi za ADK signálnym peptidom, a fragment obsahujúci promótorový modul a signálny peptid bol inzertovaný medzi Pstl (Sse8387) a Xbal miesta v jednom z existujúcich pMEVx vektorov, ako je pMEV1.
Pretože hspľOBam promótorový modul vpMEV5 obsahuje vnútorné Xbal miesto, musí byť hsp70Bam/ADK modul inzertovaný do pMEVx pracovného rámca v dvoch častiach. Preto bola jedna časť DNA syntetizovaná z pMEV5/ADK-AalT templátu trávená Pstl a Xhol a druhá časť bola trávená Xhol a Xbal. Pstl/Xhol
587/B ·· ···· • · · • · • · • r · ···· ·· ·· ···· ·· ·· ·· · fragment predstavujúci 5' segment hsp70Bam/ADK modulu bol kombinovaný sXhol/Xbal fragmentom predstavujúcim 3' segment hsp70Bam/ADK modulu a bol ligovaný do Pstl/Xbal fragmentu vektoru pripraveného z pMEV1.
Každý pripravený pMEVx/ADK vektor mal identickú štruktúru s príslušným pMEVx vektorom s výnimkou inzercie 57 bp ADK signálneho peptidu medzi promótorom a polylinkérovým modulom.
Príklad 4
Konštrukcia modulárnych expresných vektorov kódujúcich insekticídne toxíny
Nasledujúce pokusy sa vykonali kvôli príprave modulárnych expresných vektorov kódujúcich insekticídne toxíny vhodné na vloženie do rekombinantných PxNPV podľa predkladaného vynálezu.
A. Txp-I
Toxín zákožky svrabovej TxP-l je paralytický neurotoxín izolovaný z jedu zákožky svrabovej, Pyemotes tritici (Tomalski a kol., Toxicon, 27, 151 (1989)). Tox34 gén kóduje prekurzorový proteín s 291 aminokyselinami (Tomalski a kol., Náture, 352, 82(1991)).
Pre testovanie účinnosti tox34 génu v rekombinantných PxNPV sa pripravili tri rôzne Txp-1 konštrukty, ktoré sa odlišovali v aminoterminálnej signálnej sekvencií riadiacej sekréciu toxínu z buniek. Jeden konštrukt obsahoval prirodzenú tox34 aminoterminálnu sekvenciu; jeden obsahoval ADK signálny peptid namiesto aminoterminálnych 40 zvyškov tox34 preproteínu; a jeden obsahoval ADK signálny peptid namiesto aminoterminálnych 26 zvyškov tox34 preproteínu.
Tri rôzne segmenty tox34 génu zodpovedajúce kodónom 1 - 291 (označený tox34), 27 - 291 (označený tox34L) a 40 - 291 (tox34S) sa syntetizovali PCR a upravili na klonovanie do jedného alebo viacerých modulárnych expresných vektorov popísaných vyššie. Templátom pre amplifikačné reakcie bol plazmid pHSP70tox34 (Lu a kol., Biological Control, 7, 320 (1996)). Priméry (+) reťazca pre každú amplifikáciu sú uvedené v nasledujúcej tabuľke.
587/B ·· ···· • · · · · ·
| Fragment | Primér | Sekvence |
| tox34 | TOX34ATG | 5’ - ATGAAAATTTGTACATmTTATTCC -3' |
| tox34L | TOX34NT1 | 5* - gttaaaccititaggtcttttaataatatttcc -3* |
| tox34S | TOX34NT2 | 5' - GATAATGGCAATGTCGAATCTGTA - 3' |
Primér (-) reťazca označený TOX34CT2, 5'-GTACCCCCGGGATCCAATTT AACACAGTCTTGAATCACTT-3' navodzuje syntézu od 3'-konca tox34 kódujúceho regiónu a vkladá reštrikčné miesta pre BamHl a Xmal (Smal) do 3' konca amplifikovaného fragmentu. Pred amplifikáciou bol 5' koniec každého priméru (+) reťazca fosforylovaný za použitia postupu popísaného vyššie pre primér HSPľOEsp v príklade 3. PCR reakcie boli vykonané spôsobom popísaným v príklade 3, s tou výnimkou, že cykly sa skladali z 2 cyklov 1 minúta pri 94 °C, 1,5 minúty pri 45 °C a 3 minúty pri 72 °C a potom 28 cyklov 1 minúta pri 94 °C, 1,5 minúty pri 55 °C a 3 minúty pri 72 °C.
Po syntéze bola DNA trávená Xmal a 5'-lepivý/3'-Xmal fragmenty tox34 kódujúceho regiónu (označené tox34, tox34L a tox34S) sa prečistili a klonovali do MEV vektorov spôsobom popísaným v príklade 3, s tou výnimkou, že polylinkér bol štiepený Xmal (ktorý ho štiepi v Smal mieste) namiesto BamHl.
Nasledujúca tabuľka zahrňuje zložky, z ktorých bol každý MEVS vektor exprimujúci TxP-l pripravený.
| Konstrukt | Vektor | Fragment kóduj ící Txp-I |
| pMEVl/Tox34 | pMEVl | tox34 |
| pMEV5/Tox34 | pMEV5 | tox34 |
| pMEV6/Tox34 | pMEVÓ | tox34 |
| pMEVl/ADK-Tox34L | pMEVl/ADK | tox34L |
| pMEVl/ADK-Tox34S | pMEVl/ADK | tox34S |
| pMEV2/ADK-Tox34L | pMEV2/ADK | tox34L |
| pMEV2/ADK-Tox34S | PMEV2/ADK | tox34S |
587/B • · · · · · · · ···· ·· • · · · · · · · • · · · · · · • · · · · ···· ···· ·· ·· ·· ·· ·
B. LqHIT2
Okrem excitačných toxínov, ako je AalT, obsahuje mnoho jedov škorpiónov Buthinae druhý typ toxínu špecifického pre hmyz, ktorý spôsobuje polou, progresívnu atonickú paralýzu (Zlotkin a kol., Biochemistry, 30, 4814 (1991)). Najlepšie preštudovaným členom tejto skupiny je toxín LqhlT2, ktorý sa izoloval od škorpióna Leiurus quinquestriatus hebreaeus. Klonované cDNA pre LghlT2 ukázala prítomnosť 21 aminokyselinového signálneho peptidu a troch C-terminálnych aminokyselín (GlyLys-Lys), ktoré sú odstránené z peptidu post - translačne (Zlotkin a kol., Árch. Insect. Biochem. Physiol., 22, 55 (1993)).
Kvôli výskumu schopnosti LqhlT2 toxínu zlepšovať insekticídnu aktivitu PxNPV bola DNA sekvencia kódujúca zrelý LqhlT2 toxín zostavená a klonované do štyroch rôznych pMEVx/ADK expresných vektorov: pMEV1/ADK, pMEV2/ADK, pMEV5/ADK a pMEV6/ADK. Sekvencia kódujúceho regiónu toxínu uvedená na obr. 10 sa odlišuje od prirodzenej cDNA sekvencie v 27 zo 61 kodónov; tieto zmeny boli vložené tak, aby využitie kodónov v syntetickom kódujúcom regióne pre LqhlT2 odrážalo celkové využitie kodónov v AcMNPV genóme (Ayres a kol., 1994).
Zostavenie DNA fragmentu obsahujúceho kódujúci región pre LqhlT2 sa vykonalo v niekoľkých krokoch. Najprv sa syntetizovali štyri nukleotidy, ktoré spolu predstavujú oba reťazce LqhlT2 kódujúceho regiónu a malú časť 3' susediacej spojovacej DNA sekvencie (obr. 10). Pred použitím boli 5' konce oligonukleotidov LqhlT2F2 (obsahujúce 3' časť (+) reťazca) a LqhlT2R3 (obsahujúce 3' časť (-) reťazca) fosforylované za použitia postupu popísaného v príklade 3. 40 μιτιόΙ každého oligonukleotidu bolo tepelne spracované v 10 μΙ 50 mM NaCI krátkym zahriatím na 95 °C a potom pomalým ochladením zmesi na 60 °C. Celkový objem zmesi sa upravil na 40 μΙ a dve polovice LqhlT2 kódujúceho regiónu (LqhlT2F1 : LqhlT2R3 a LqhlT2F2 : LqhlT2R4) sa ligovali. Z dôvodu prítomnosti produktov neúplnej syntézy v každom oligonukleotide viedla prvotná ligácia k zisku heterogénnej zmesi fragmentov dĺžky 200 - 1000 bp. Požadovaný produkt sa izoloval z tejto zmesi PCR, za použitia 0,5 μΙ ligačnej reakčnej zmesi ako zdroja templátu a oligonukleotidov LqhlT2 PCRF (fosforylovaného na jeho 5' konci) a
587/B ·· ···· ·· ···· • · · · · · B · • · · · · ···· ···· ·· ·· ·« «·
LqhlT2 PCRR ako primérov (obr. 10). Amplifikácia bola vykonaná v 25 cykloch 1 minúta pri 94 °C, 1,5 minúty pri 55 °C a 3 minúty pri 72 °C, ako je popísané v príklade 3. Po syntéze bola DNA trávená BamHI, ktorý štiepi spojovací segment susediaci sterminačným kodónom, a požadovaný 190 bp 5'-lepivý/3'-BamHI fragment sa prečistil gélovou elektroforézou a klonoval sa do MEV vektorov pMEV1/ADK, pMEV2/ADK, pMEV5/ADK a pMEV6/ADK, ako je uvedené v príklade 3 a na obr. 5. Sekvencia LqhlT2 kódujúceho regiónu v každom vektore bola potvrdená sekvenovaním DNA.
B. Omega-ACTX-HV1
Omega - atrakotoxíny sú rodinou insekticídnych peptidových toxínov izolovaných od austrálskych pavúkov. Najlepšie preštudovaným členom tejto rodiny je omega-atrakotoxín-HV1 (omega-ACTX-HV1), 37 - zvyškový peptidový toxín izolovaný z jedu pavúka Hadronyche versuta (Medzinárodná patentová prihláška AU 93/00039). Omega-ACTX-HV1 inhibuje hmyzie vápnikové kanály závislé od napätia a je letálny pre larvy Helicoverpa armigera, ale je neškodný pre novorodené myši.
Na základe aminokyselinovej sekvencie omega-ACTX-HV1 boli navrhnuté dva oligonukleotidy, ktoré predstavujú dva reťazce omega-ACTX-HV1 kódujúceho regiónu a malú časť 3' susediacej spojovacej DNA. Použitie kodónov v omegaACTX-HV1 kódujúcom regióne je navrhnuté tak, aby zodpovedalo použitiu kodónov vAcMNPV genóme (Ayres a kol., 1994). Sekvencie týchto oligonukleotidov sú uvedené na obr. 11. Z dôvodu dĺžky oligonukleotidov ACTXHV1F a ACTXHV1R je značne pravdepodobné, že každý bude významne kontaminovaný produktmi nekompletnej syntézy. Preto bola PCR stratégia podobná stratégii použitej pre LqhlT2 použitá tiež na syntézu fragmentu omega-ACTX-HV1 kódujúceho regiónu vhodného na klonovanie do MEVS vektorov. V tomto prípade sa zmiešalo 0,1 pmól každého oligonukleotidu a zmes sa použila ako templát pre PCR amplifikáciu omega-ACTX-HV1 produktu požadovanej dĺžky. Priméry pre reakciu boli ACTXPCRF (fosforylovaný na svojom 5' konci) a ACTXPCRR. PCR reakcia bola vykonaná spôsobom uvedeným vyššie, stou výnimkou, že amplifikácia sa vykonala v 15 cykloch 1 minúta pri 94 °C, 1,5 minúty pri 55 °C a 3 minúty pri 72 °C. Po amplifikácii bola DNA štiepená BamHI, ktorá štiepi spojovací segment susediaci s terminačným
587/B • · · · · · • · · • · • « · • · · • · · · · · • · ···· ·· • · · • · • · · ·· ·· kodónom a požadovaný 118 bp 5'-lepivý/3'-BamHI fragment sa prečistil gólovou elektroforézou a klonoval sa do MEV vektorov pMEV1/ADK, pMEV2/ADK, pMEV5/ADK a pMEV6/ADK. Sekvencia omega-ACTX-HV1 kódujúceho regiónu v každom vektore bola potvrdená sekvenovaním DNA.
Príklad 5
Konštrukcia rekombinantných PxNPV
Nasledujúce pokusy boli vykonané pre konštrukciu rekombinantných PxNPV kódujúcich insekticidne toxíny.
Vírusová DNA bola pripravená zoklúznych teliesok (O'Reilly a koľ, 1994). Prečistená DNA bola trávená Bsu36l a Sse8387l za použitia približne 5 jednotiek enzýmu/gg DNA. Chromatografia s vylučovaním podľa veľkosti alebo prečistenie gradientom sacharózy sa použilo na separáciu vírusovej genómovej DNA z excidovaného fragmentu. Získaná linearizovaná vírusová DNA sa zrážala etanolom a resuspendovala sa v 10 ml Tris-HCl pH 8,0/1 mM EDTA v koncentrácii 0,2 - 1 μg/μl.
0,5 gg linearizovanej DNA sa potom ligovalo s 15 ng prečisteného Bsu36l/Sse8387l tráveného fragmentu z vhodného MEV vektor v reakčnom objeme 5 μΙ cez noc pri 15 °C. Zmes sa potom použila na transfekciu Sf-9 buniek, ako je popísané v príklade 1. Kultivačné médium sa obmenilo 24 hodín po transfekcii. Po ďalších 72 hodinách sa odobral supernatant kultúry, zriedil sa a použil sa pre reinfekciu Sf-9 buniek kvôli izolácii plakov. Náhodné plaky boli zoškriabané a použili sa na infikovanie jamiek 48-jamkovej platne obsahujúcej 6 x 104 Sf-9 buniek/jamka v 0,5 ml TNM-FH kompletného média. Rekombinanty sa identifikovali za použitia primérov špecifických pre inzertovaný gén. Vírus z plakov dávajúcich pozitívne jamky sa prečistil dvoma ďalšími kolesami plakového prečistenia.
Nasledujúca tabuľka uvádza informácie pre rôzne rekombinantné PxNPV, ktoré boli pripravené.
587/B • · · · · « ·· ····
·· · ···· ·· ··
| Vírus | Použitý M EV |
| PxEGTDEL/35K ADK-AalT | PMEV4/ADK-AalT |
| PxEGTDEL/hspľOBam ADK-Aa | PMEV5/ADK-AalT |
| PxEGTDEL/DA26 tox34 | PMEV1/tox34 |
| PxEGTDEL/hspľOBam tox34 | PMEV5/tox34 |
| PxEGTDEL/hspľOXba tox34 | PMEV6/tox34 |
| PxEGTDEL/DA26 ADK-tox34S | PMEV1/ADK-tox34S |
| PxEGTDEL/DA26 ADK-tox34L | PMEV1/ADK-tox34L |
| PxEGTDEL/6.9K AD-tox34S | PMEV2/ADK-tox34S |
| PxEGTDEL/6.9K ADK-tox34L | PMEV2/ADK-tox34L |
| Ac(V8)EGTDEL/DA26 ADK-AalT | PMEV4/ADK-AalT |
| PxEGTDEL/DA26 ADK-LqhlT2 | PMEV1/ADK-LqhlT2 |
| PxEGTDEL/6.9K ADK-LqhlT2 | PMEV2/ADK-LqhlT2 |
| PxEGTDEL/hspľOBam ADK-LqhlT2 | PMEV5/ADK-LqhlT2 |
| PxEGTDEL/hspľOXba ADK-LqhlT2 | PMEV6/ADK-LqhlT2 |
| PxEGTDEL/DA 26 ADK-omega-ACTX-HV1 | PMEV1 /ADK-omega-ACTX-H V1 |
| PxEGTDEL/6.9K ADK-omega-ACTX-HV1 | PMEV2/ADK-oemga-ACTX-HV1 |
| PxEGTDEL/hspľOBam ADK-omega-ACTX- HV1 | PMEV5/ADK-omega-ACTX-HV1 |
| PxEGTDEL/hspľOXba ADK-omega-ACTX- HV1 | PMEV5/ADK-omega-ACTX-HV1 |
587/B · ···· ···· ·« • · ··· · « · · ···· ·· ·· ·· ·· ·
Príklad 6
Účinnosť rekombinantných PxNPV exprimujúcich insekticídne proteíny
Nasledujúce pokusy boli vykonané kvôli testovaniu insekticídnej účinnosti rekombinantných PxNPV podľa predkladaného vynálezu.
Štandardný test nanesenia vírusu na potravu sa vykonal na druhom instarštádiu lariev Plutella xylostella (vek 2-3 dni, 0,15 - 0,3 mg) kvôli stanoveniu dávky nutnej na dosiahnutie 50 % mortality v testovanej hmyzej populácii (t.j. LC50). Zásoby vírusu boli sériovo riedené v 0,01 % dodecylsíranu sodnom a použili sa 50 μΙ podiely vírusových suspenzií na povrchovú kontamináciu 15 mm okrúhlych oblastí obsahujúcich ľanovým olejom posilnenú Stoneville potravu (Southland Products Incorporated, Lake Village, AK). Jednotlivé larvy boli umiestnené do každej oblasti a kŕmili sa kontaminovanou potravou po dobu trvania testu. Mŕtve larvy sa spočítali dvakrát denne v priebehu prvých troch dní testu a potom aspoň raz denne do nástupu kuklenia v šiestom alebo siedmom dni. Dáta z opakovaných pokusov sa zhrnuli a analyzovali probit analýzou (Finney, 1952). Medián času pre letalitu (LT50) sa stanovil z probit analýzy času do úhynu pri jednej dávke.
Výsledky sú uvedené v nasledujúcich tabuľkách. Kvôli porovnaniu sú koncentrácie oklúznych teliesok (OB) uvedené ako OB/16 cm2 potravy.
| rPxNPV | LC50 (OB/16 cm2) | LT50 (dni) kone. 4,5 x 104 |
| PxEGTDEL/35K ADK-AalT | 9,34 x 102 | 2,69 |
| wt PxNPV | 5,97x104 | 4,39 |
587/B ·· ···· ·· ···· • ··· ···· • · · · · · · • ···· ···· • ·· · · ·· ··· ·· ·· ·· ·· ·
Probit hodnoty sa určili zo štyroch vyhotovení s približne 32 larvami/dávka.
| rPxNPV | LC50 (OB/16cm2) | TL50 (dni) kone. 4,5 x 103 | ĽT5o (dni) kone. 4,5x104 |
| PxEGTDEL/35K ADK-AalT | 7 x 102 | 3,7 | 3,0 |
| PxEGTDEL/hsp70 ADK-AalT | 6 x 102 | 3,7 | 2,7 |
| Ac(V8)EGTDEL/DA26 ADK- AalT | 6,3 x 105 | ND* | 4,0 |
* ND - nie je stanovené
Probit hodnoty boli určené zo štyroch vyhotovení s približne 32 larvami/dávka.
Tieto výsledky ukazujú, že (i) adícia génu pre toxín k PxNPV genómu nielen zvyšuje rýchlosť usmrtenia vírusom, ale tiež výrazne znižuje účinnú LC50 pre larvy Plutella xylostella; a (ii) rekombinantný PxNPV má výrazne nižší ĽC50 s oveľa vyššou rýchlosťou zabíjania v porovnaní s blízko príbuzným rekombinantným AcNPV. Pretože Plutella xylostella je významný škodca na rastlinách, má toto zistenie zásadný význam pri voľbe rekombinantného bakulovírusu pre použitie ako biopesticídu na poľnohospodárskom trhu.
Nasledujúce tabuľky uvádzajú dáta z testov rekombinantných PxNPV exprimujúcich druhý toxín selektívny pre hmyz, tox34.
| rPxNPV | LT50 (dni) kone. 4,5 x 103 | ĽT50 (dni) kone. 4,5 x 104 |
| PxEGTDEL/DA6 tox34 | 4,5 | 3,4 |
| PxEGTDEL/hsp70Bam tox34 | 2,6 | 1,9 |
| PxEGTDEL/hspľOXba tox34 | 2,0 | 1,8 |
| PxEGTDEL/DA26 ADK-tox34S | 3,7 | 2,7 |
587/B ·· ···· ·· ···· ·· • · · · · ···· • · · · · ···· · • · · ···· ·· · ···· ·· ·· ·· ·· ···
| PxEGTDEL/DA26 ADK-tox34L | 3,1 | 2,4 |
| PxEGTDEL/6.9K ADK-tox34S | 2,9 | 1,6 |
| PxEGTDEL/6.9K ADK'tox34L | 3,2 | 1,8 |
| PxEGTDEL/hspľOBam ADK-AalT | 3,0 | 2,2 |
Probit hodnoty sa určili zo štyroch vyhotovení s približne 32 larvami/dávka.
| rPxNPV | Priemerná LC50 (OB/16cm2) | ĽT50 (dni) kone. 4,5 x 103 |
| PxEGTDEL/hsp70 Xba tox34 | 0,8x102 | 2,4 |
| PxEGTDEL/hsp70Bam ADK-AalT | 2,9x102 | 3,3 |
| wt PxNPV | 165 x102 | 4,6 pri kone. 4,5 x 104 |
Dáta naznačujú, že zvýšená účinnosť rekombinantných PxNPV nie je obmedzená na konštrukty exprimujúce AalT. PxNPV exprimujúce tox34 majú rovnako nízku LT50 a LC50 ako rekombinanty exprimujúce AalT. V niektorých prípadoch (t.j. PxEGTDEL/hspľOXba tox34) vedie expresia tox34 rekombinantným PxNPV k významne nižšej ĽC50 ako rekombinanty exprimujúce AalT.
Všetky patenty, patentové prihlášky, články, publikácie a spôsoby testov tu uvedené sú uvedené ako odkazy vo svojej úplnosti.
Odborníkom v odbore budú po prečítaní uvedeného popisu jasné mnohé variácie predkladaného vynálezu. Takéto jasné variácie spadajú do rozsahu predkladaného vynálezu.
Claims (57)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Izolovaný rekombinantný bakulovírus pre Plutella xylostella (PxNPV) majúci genetickú alteráciu vzhľadom k prirodzenému PxNPV, kde uvedená alterácia je vybraná zo skupiny zahrňujúcej (a) vloženie alebo deléciu reštrikčného miesta; (b) modifikáciu, deléciu alebo duplikáciu génu kódovaného vírusom; (c) vloženie génu kódujúceho heterológny proteín; a (d) akékoľvek kombinácie vyššie uvedených aiterácií.
- 2. Rekombinantný bakulovírus podľa nároku 1, ktorý má do svojho genómu vloženú sekvenciu nukleovej kyseliny kódujúcej substanciu ovplyvňujúcu hmyz operatívne naviazanú na promótor schopný aktivácie transkripcie v hmyzej bunke.
- 3. Rekombinantný bakulovírus podľa nároku 2, kde uvedenou substanciou ovplyvňujúcou hmyz je insekticídny toxín.
- 4. Rekombinantný bakulovírus podľa nároku 3, kde uvedený toxín je vybraný zo skupiny zahrňujúcej AalT, AaHITI, AaHIT2, LqhlT2, LqqlTI, LqqlT2, BjlT1, BjlT2, LqhP35, LqhalfalT, SmplT2, SmpCT2, SmpCT3, SmpMT, DK9.2, DK11, DK12, μagatoxín, King Kong toxín, Pt6, NPS-326, NPS-331, NPS-373, Tx4(6-1), TxP-1, omega-atratoxíny, alfa-konotoxíny, μ-konotoxíny, chlorotoxín a omega-konotoxíny.
- 5. Rekombinantný bakulovírus podľa nároku 4, kde uvedený toxín je vybraný zo skupiny zahrňujúcej AalT, TxP-1, LqhlT2 a omega-atrakotoxín.
- 6. Rekombinantný bakulovírus podľa nároku 4, ktorý ďalej obsahuje sekvenciu kódujúcu heterológny signálny peptid, kde uvedená sekvencia kódujúca signálny peptid je fúzovaná v pracovnom rámci so sekvenciou kódujúcou uvedený toxín.
- 7. Rekombinantný bakulovírus podľa nároku 6, kde uvedený signálny peptid je vybraný zo skupiny zahrňujúcej pBMHPC-12 signálnu sekvenciu z Bombyx mori; signálnu sekvenciu adipokinetického hormónu zMandura sexta; apolipoforínovú signálnu sekvenciu z Manduca sexta; choriónovú signálnu sekvenciu z Bombyx mori;31 587/B ·· ···· ·· ···· • · · · · · · · • · · · · · · • ···· ···· ···· ·· ·· ·· ·· kutikulovú signálnu sekvenciu z Drosophila melanogaster; signálnu sekvenciu esterázy-6 z Drosophila melanogaster; a pohlavne špecifickú signálnu sekvenciu z Bombyx mori.
- 8. Rekombinantný bakulovirus podľa nároku 2, kde uvedený promótor je hsp70 • promótor.
- 9. Rekombinantný bakulovirus podľa nároku 8, kde uvedený promótor je vybraný zo skupiny zahrňujúcej hsp70Bam a hsp70 Xba.
- 10. Rekombinantný bakulovirus podľa nároku 3, kde uvedený promótor je vybraný zo skupiny zahrňujúcej DA26, 35K, 6.9K, polyhedrínový, hsp70 a aktínové promótory.
- 11. Rekombinantný bakulovirus podľa nároku 3, kde uvedený genóm bol ďalej modifikovaný na inaktiváciu vírusového egt génu.
- 12. Rekombinantný bakulovirus podľa nároku 3, ktorý ďalej obsahuje sekvenciu nukleovej kyseliny kódujúcej esterázu juvenilného hormónu (JHE) operatívne naviazanú na promótor schopný aktivácie transkripcie v hmyzej bunke.
- 13. Rekombinantný bakulovirus podľa nároku 5, kde uvedený promótor je hsp70 promótor.
- 14. Rekombinantný bakulovirus pre Plutella xylostella majúci do svojho genómu vloženú sekvenciu kódujúcu TsP-1 operatívne naviazanú na Drosophilla hsp70 promótor.
- 15. Rekombinantný bakulovirus pre Plutella xylostella majúci do svojho genómu vloženú sekvenciu kódujúcu AalT operatívne naviazanú na Drosophila hsp70 promótor.31 587/B ·· ···· ·· ···· • t • · · · · • · · · • · · · · ···· ·· ·· ·· ·· ·
- 16. Rekombinantný bakulovírus podľa nároku 1, kde uvedená genetická alterácia tvorí klonovacie miesto neprítomné v prirodzenom PxNPV.
- 17. Rekombinantný bakulovírus podľa nároku 16, ktorý má do uvedeného klonovacieho miesta vloženú sekvenciu nukleovej kyseliny kódujúcej substanciu ovplyvňujúcu hmyz operatívne naviazanú na promótor schopný aktivácie transkripcie v hmyzej bunke.
- 18. Rekombinantný bakulovírus podľa nároku 17, kde uvedenou substanciou ovplyvňujúcou hmyz je insekticídny toxín.
- 19. Rekombinantný bakulovírus podľa nároku 18, kde uvedený toxín je vybraný zo skupiny zahrňujúcej AalT, AaHITI, AaHIT2, LqhlT2, LqqlTI, LqqlT2, BjlT1, BjlT2, LqhP35, LqhalfalT, SmplT2, SmpCT2, SmpCT3, SmpMT, DK9.2, DK11, DK12, μagatoxín, King Kong toxín, Pt6, NPS-326, NPS-331, NPS-373, Tx4(6-1), TxP-1, omega-atratoxíny, alfa-konotoxíny, μ-konotoxíny, chlorotoxín a omega-konotoxíny.
- 20. Rekombinantný bakulovírus podľa nároku 19, kde uvedený promótor je vybraný zo skupiny zahrňujúcej DA26, 35K, 6.9K, polyhedrínový, hsp70 a aktínové promótory.
- 21. Rekombinantný bakulovírus podľa nároku 20, kde uvedený genóm bol ďalej modifikovaný na inaktiváciu vírusového egt génu.
- 22. Rekombinantný bakulovírus podľa nároku 21, ktorý ďalej obsahuje sekvenciu nukleovej kyseliny kódujúcej esterázu juvenilného hormónu (JHE) operatívne naviazanú na promótor schopný aktivácie transkripcie v hmyzej bunke.
- 23. Rekombinantný bakulovírus pre Plutella xylostella vybraný zo skupiny zahrňujúcej ATCC VR-2607, ATCC VR-2608 a ATCC VR-2609.31 587/B • t ···· ·· ···· ·· ·· ··· ··· • · · · · · · • · · · · ···· ···· ·· ·· ·· ··
- 24. Priamy ligačný vektor obsahujúci genómovú DNA izolovanú z rekombinantného bakulovírusu podľa nároku 1.
- 25. Priamy ligačný vektor podľa nároku 24, v ktorom uvedená DNA ďalej obsahuje DNA kódujúcu substanciu ovplyvňujúcu hmyz operatívne naviazanú na promótor schopný aktivácie transkripcie v hmyzej bunke.
- 26. Priamy ligačný vektor podľa nároku 25, kde uvedená substancia ovplyvňujúca hmyz obsahuje insekticídny toxín vybraný zo skupiny zahrňujúcej AalT, AaHITI, AaHIT2, LqhlT2, LqqlTI, LqqlT2, BjlT1, BjlT2, LqhP35, LqhalfalT, SmplT2, SmpCT2, SmpCT3, SmpMT, DK9.2, DK11, DK12, μ-agatoxín, King Kong toxín, Pt6, NPS-326, NPS-331, NPS-373, Tx4(6-1), TxP-1, omega-atratoxíny, alfa-konotoxíny, μ-konotoxíny, chlorotoxín a omega-konotoxíny.
- 27. Priamy ligačný vektor podľa nároku 26, ktorý ďalej obsahuje sekvenciu kódujúcu heterológny signálny peptid, kde uvedená sekvencia kódujúca signálny peptid je fúzovaná v pracovnom rámci so sekvenciou kódujúcou uvedený toxín.
- 28. Priamy ligačný vektor podľa nároku 27, kde uvedený signálny peptid je vybraný zo skupiny zahrňujúcej pBMHPC-12 signálnu sekvenciu z Bombyx mori; signálnu sekvenciu adipokinetického hormónu zMandura sexta; apolipoforínovú signálnu sekvenciu z Manduca sexta; choriónovú signálnu sekvenciu z Bombyx mori; kutikulovú signálnu sekvenciu z Drosophila melanogaster; signálnu sekvenciu esterázy-6 z Drosophila melanogaster; a pohlavne špecifickú signálnu sekvenciu z Bombyx mori.
- 29. Priamy ligačný vektor podľa nároku 25, kde uvedený genóm bol ďalej modifikovaný na inaktiváciu vírusového egt génu.
- 30. Priamy ligačný vektor podľa nároku 25, ktorý ďalej obsahuje sekvenciu nukleovej kyseliny kódujúcej esterázu juvenilného hormónu (JHE) operatívne naviazanú na promótor schopný aktivácie transkripcie v hmyzej bunke.
- 31 587/B ·· ···· ·· ···· • · · · · ···· • · · · · s · >1Π · ···· ···· · · · ···· ·· ···· ·· ·· ·· ·· ·31. Priamy ligačný vektor obsahujúci genómovú DNA izolovanú z rekombinantného bakulovírusu podľa nároku 16.
- 32. Priamy ligačný vektor obsahujúci genómovú DNA izolovanú z rekombinantného bakulovírusu podľa nároku 19.
- 33. Priamy ligačný vektor obsahujúci genómovú DNA izolovanú z rekombinantného bakulovírusu podľa nároku 23.
- 34. Insekticídny prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje rekombinantný bakulovírus pre Plutella xylostella (PxNPV) majúci genetickú alteráciu vzhľadom k prirodzenému PxNPV a poľnohospodársky prijateľný nosič, kde uvedená alterácia je vybraná zo skupiny zahrňujúcej (a) vloženie alebo deléciu reštrikčného miesta; (b) modifikáciu, deléciu alebo duplikáciu génu kódovaného vírusom; (c) vloženie génu kódujúceho heterológny proteín; a (d) akékoľvek kombinácie vyššie uvedených alterácií.
- 35. Insekticídny prípravok podľa nároku 34, vyznačujúci sa tým, že uvedený rekombinantný bakulovírus má do svojho genómu vloženú sekvenciu nukleovej kyseliny kódujúcej substanciu ovplyvňujúcu hmyz operatívne naviazanú na promótor schopný aktivácie transkripcie v hmyzej bunke.
- 36. Insekticídny prípravok podľa nároku 35, vyznačujúci sa tým, že uvedenou substanciou ovplyvňujúcou hmyz je insekticídny toxín, vybraný zo skupiny zahrňujúcej AalT, AaHITI, AaHIT2, LqhlT2, LqqlTI, LqqlT2, BjlT1, BjlT2, LqhP35, LqhalfalT, SmplT2, SmpCT2, SmpCT3, SmpMT, DK9.2, DK11, DK12, μ-agatoxín,King Kong toxín, Pt6, NPS-326, NPS-331, NPS-373, Tx4(6-1), TxP-1, omegaatratoxíny, alfa-konotoxíny, μ-konotoxíny, chlorotoxín a omega-konotoxíny.
- 37. Insekticídny prípravok podľa nároku 36, vyznačujúci sa tým, že uvedený rekombinantný bakulovírus ďalej obsahuje sekvenciu kódujúcu heterológny signálny peptid, kde uvedená sekvencia kódujúca signálny peptid je fúzovaná v pracovnom rámci so sekvenciou kódujúcou uvedený toxín.31 587/B ·· ···· ·· ···· • · · · · ···· • · · · · · ·Λ 4 · ······· · ········· ·«·« ·· ·· ·· ·· ·
- 38. Insekticídny prípravok podľa nároku 37, vyznačujúci sa tým, že signálny peptid je vybraný zo skupiny zahrňujúcej pBMHPC-12 signálnu sekvenciu zBombyx mori; signálnu sekvenciu adipokinetického hormónu zMandura sexta; apolipoforínovú signálnu sekvenciu z Manduca sexta; choriónovú signálnu sekvenciu z Bombyx mori; kutikulovú signálnu sekvenciu z Drosophila melanogaster; signálnu t sekvenciu esterázy-6 z Drosophila melanogaster; a pohlavne špecifickú signálnu sekvenciu z Bombyx mori.I
- 39. Insekticídny prípravok podľa nároku 36, vyznačujúci sa tým, že uvedený genóm bol ďalej modifikovaný kvôli inaktivácii vírusového egt génu.
- 40. Insekticídny prípravok podľa nároku 36, vyznačujúci sa tým, že uvedená genetická alterácia tvorí klonovacie miesto neprítomné v prirodzenom PxNPV.
- 41. Insekticídny prípravok podľa nároku 40, vyznačujúci sa tým, že uvedený bakulovírus má do uvedeného klonovacieho miesta vloženú sekvenciu nukleovej kyseliny kódujúcej substanciu ovplyvňujúcu hmyz operatívne naviazanú na promótor schopný aktivácie transkripcie v hmyzej bunke.
- 42. Insekticídny prípravok podľa nároku 41, vyznačujúci sa tým, že uvedenou substanciou ovplyvňujúcou hmyz je insekticídny toxín.
- 43. Insekticídny prípravok podľa nároku 42, vyznačujúci sa tým, že uvedený * toxín je vybraný zo skupiny zahrňujúcej AalT, AaHITI, AaHIT2, LqhlT2, LqqlTI, . LqqlT2, BjlT1, BjlT2, LqhP35, LqhalfalT, SmplT2, SmpCT2, SmpCT3, SmpMT,DK9.2, DK11, DK12, μ-agatoxín, King Kong toxín, Pt6, NPS-326, NPS-331, NPS373, Tx4(6-1), TxP-1, omega-atratoxíny, alfa-konotoxíny, μ-konotoxíny, chlorotoxín a omega-konotoxíny.
- 44. Insekticídny prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje rekombinantný bakulovírus pre Plutella xylostella podľa nároku 2 a poľnohospodársky prijateľný nosič.31 587/B ·· ···· ·· ···· • · · · • · · • · · · • · · · ···· ·· ·« ·· • · · · · • · · · • · « · · • · · · · ·· ·· ·
- 45. Insekticídny prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje rekombinantný bakulovírus pre Plutella xylostella podľa nároku 4 a poľnohospodársky prijateľný nosič.
- 46. Insekticídny prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje rekombinantný bakulovírus pre Plutella xylostella podľa nároku 7 a poľnohospodársky prijateľný nosič.
- 47. Insekticídny prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje rekombinantný bakulovírus pre Plutella xylostella podľa nároku 14 a poľnohospodársky prijateľný nosič.
- 48. Insekticídny prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje rekombinantný bakulovírus pre Plutella xylostella podľa nároku 15 a poľnohospodársky prijateľný nosič.
- 49. Insekticídny prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje rekombinantný bakulovírus pre Plutella xylostella podľa nároku 20 a poľnohospodársky prijateľný nosič.
- 50. Insekticídny prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje rekombinantný bakulovírus pre Plutella xylostella podľa nároku 23 a poľnohospodársky prijateľný nosič.
- 51. Spôsob ničenia hmyzu, vyznačujúci sa tým, že obsahuje kontaktovanie uvedených škodcov s insekticídne účinným množstvom insekticídneho prípravku podľa nároku 44.
- 52. Spôsob ničenia hmyzu, vyznačujúci sa tým, že obsahuje kontaktovanie uvedených škodcov s insekticídne účinným množstvom insekticídneho prípravku podľa nároku 45.31 587/B
·· • a ···· • aa aaa a a • • a a a aa • • • • · • a a a a a a • • · • • • · a a a • 4·· a· • a aa a a aaa - 53. Spôsob ničenia hmyzu, vyznačujúci sa tým, že obsahuje kontaktovanie uvedených škodcov s insekticídne účinným množstvom insekticídneho prípravku podľa nároku 46.
- 54. Spôsob ničenia hmyzu, vyznačujúci sa tým, že obsahuje kontaktovanie uvedených škodcov s insekticídne účinným množstvom insekticídneho prípravku podľa nároku 47.
- 55. Spôsob ničenia hmyzu, vyznačujúci sa tým, že obsahuje kontaktovanie uvedených škodcov s insekticídne účinným množstvom insekticídneho prípravku podľa nároku 48.
- 56. Spôsob ničenia hmyzu, vyznačujúci sa tým, že obsahuje kontaktovanie uvedených škodcov s insekticídne účinným množstvom insekticídneho prípravku podľa nároku 49.
- 57. Spôsob ničenia hmyzu, vyznačujúci sa tým, že obsahuje kontaktovanie uvedených škodcov s insekticídne účinným množstvom insekticídneho prípravku podľa nároku 50.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US8470598P | 1998-05-08 | 1998-05-08 | |
| PCT/US1999/009914 WO1999058705A1 (en) | 1998-05-08 | 1999-05-07 | Recombinant baculovirus-based insecticides |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK16852000A3 true SK16852000A3 (sk) | 2001-10-08 |
Family
ID=22186700
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK1685-2000A SK16852000A3 (sk) | 1998-05-08 | 1999-05-07 | Insekticídy na báze rekombinantného bakulovírusu |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1076717A1 (sk) |
| JP (1) | JP2002514435A (sk) |
| KR (1) | KR20010043627A (sk) |
| CN (1) | CN1310767A (sk) |
| AU (1) | AU753930B2 (sk) |
| BR (1) | BR9910515A (sk) |
| CA (1) | CA2331853A1 (sk) |
| HU (1) | HUP0101684A3 (sk) |
| ID (1) | ID28101A (sk) |
| IL (1) | IL139401A0 (sk) |
| NZ (1) | NZ507918A (sk) |
| PL (1) | PL345242A1 (sk) |
| SK (1) | SK16852000A3 (sk) |
| TR (1) | TR200003245T2 (sk) |
| WO (1) | WO1999058705A1 (sk) |
| ZA (1) | ZA200006301B (sk) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7279547B2 (en) | 2000-02-10 | 2007-10-09 | University Of Connecticut | Insecticidal compounds and methods for selection thereof |
| US6583264B2 (en) | 2000-02-10 | 2003-06-24 | University Of Connecticut | Insecticidal compounds and methods for selection thereof |
| KR100594353B1 (ko) * | 2002-05-28 | 2006-07-03 | 주식회사 엠디바이오알파 | 신규한 인삼잎 및 줄기 다당체, 그 제조방법 및 그를활성성분으로 함유하는 항암제 및 항암보조제 조성물 |
| CN1313604C (zh) * | 2004-09-22 | 2007-05-02 | 山西大学 | 一种含有双价抗虫基因的重组杆状病毒 |
| WO2007035382A2 (en) * | 2005-09-16 | 2007-03-29 | University Of Connecticut | Acaricidal compositions and methods of use thereof |
| US20110201086A1 (en) | 2010-02-12 | 2011-08-18 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Method for producing recombinant virus |
| GB201105418D0 (en) * | 2011-03-31 | 2011-05-18 | Univ Durham | Pesticide |
| CN103409430B (zh) * | 2013-08-19 | 2014-08-20 | 南京师范大学 | 小菜蛾泛素基因ubl40及在治理小菜蛾的溴氰菊酯抗性中的应用 |
| GB201321938D0 (en) | 2013-12-11 | 2014-01-22 | Univ Durham | Pesticidal fusion protein improvements |
| CN105441469B (zh) * | 2016-01-15 | 2018-08-07 | 西南大学 | 重组昆虫蜕皮激素失活基因Bbsp::egt及其杀虫真菌剂 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5674485A (en) * | 1988-11-01 | 1997-10-07 | The Regents Of The University Of California | Insect diagnostic and control compositions with truncated JHE |
| US5461032A (en) * | 1991-03-01 | 1995-10-24 | Fmc Corporation | Insecticidally effective peptides |
| IL104419A0 (en) * | 1992-01-24 | 1993-05-13 | Fmc Corp | Insecticidally effective peptides |
| US5457178A (en) * | 1993-07-07 | 1995-10-10 | Fmc Corporation | Insecticidally effective spider toxin |
-
1999
- 1999-05-07 JP JP2000548496A patent/JP2002514435A/ja active Pending
- 1999-05-07 CA CA002331853A patent/CA2331853A1/en not_active Abandoned
- 1999-05-07 HU HU0101684A patent/HUP0101684A3/hu unknown
- 1999-05-07 WO PCT/US1999/009914 patent/WO1999058705A1/en not_active Ceased
- 1999-05-07 NZ NZ507918A patent/NZ507918A/en unknown
- 1999-05-07 CN CN99807162A patent/CN1310767A/zh active Pending
- 1999-05-07 KR KR1020007012790A patent/KR20010043627A/ko not_active Withdrawn
- 1999-05-07 PL PL99345242A patent/PL345242A1/xx unknown
- 1999-05-07 BR BR9910515-2A patent/BR9910515A/pt not_active IP Right Cessation
- 1999-05-07 EP EP99921724A patent/EP1076717A1/en not_active Withdrawn
- 1999-05-07 SK SK1685-2000A patent/SK16852000A3/sk unknown
- 1999-05-07 AU AU38856/99A patent/AU753930B2/en not_active Ceased
- 1999-05-07 TR TR2000/03245T patent/TR200003245T2/xx unknown
- 1999-05-07 ID IDW20002404A patent/ID28101A/id unknown
- 1999-05-07 IL IL13940199A patent/IL139401A0/xx unknown
-
2000
- 2000-11-03 ZA ZA200006301A patent/ZA200006301B/xx unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HUP0101684A2 (hu) | 2001-08-28 |
| AU753930B2 (en) | 2002-10-31 |
| JP2002514435A (ja) | 2002-05-21 |
| ID28101A (id) | 2001-05-03 |
| KR20010043627A (ko) | 2001-05-25 |
| PL345242A1 (en) | 2001-12-03 |
| ZA200006301B (en) | 2001-06-06 |
| EP1076717A1 (en) | 2001-02-21 |
| HUP0101684A3 (en) | 2003-08-28 |
| AU3885699A (en) | 1999-11-29 |
| CA2331853A1 (en) | 1999-11-18 |
| BR9910515A (pt) | 2003-04-15 |
| NZ507918A (en) | 2002-07-26 |
| CN1310767A (zh) | 2001-08-29 |
| IL139401A0 (en) | 2001-11-25 |
| WO1999058705A1 (en) | 1999-11-18 |
| TR200003245T2 (tr) | 2001-03-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2093335C (en) | Insect-specific paralytic neurotoxin genes for use in biological insect control: methods and composition | |
| AU692290B2 (en) | Insect viruses, sequences, insecticidal compositions and methods of use | |
| US5547871A (en) | Heterologous signal sequences for secretion of insect controlling proteins | |
| US6235278B1 (en) | Biological insect control agents expressing insect-specific toxin genes, methods and compositions | |
| AU753930B2 (en) | Recombinant baculovirus-based insecticides | |
| EP0621337A1 (en) | Codon optimized DNA sequence for insect toxin AaIT | |
| AU743526B2 (en) | Transgenic virus | |
| US6130074A (en) | Recombinant insect virus with reduced capacity for host-to-host transmission in the environment and methods to produce said virus | |
| CA2141206A1 (en) | Gene insertion by direct ligation in vitro | |
| AU675939B2 (en) | Recombinant insect virus with reduced capacity for host-to-host transmission in the environment and methods to produce said virus | |
| US6355240B1 (en) | Enhanced insecticidal insect virus through the expression of heterologous proteins with early promoters | |
| MXPA00010981A (es) | Insecticidas con base en basculovirus recombinantes | |
| CZ20004156A3 (cs) | Insekticidy na bázi rekombinantního bakuloviru | |
| AU720082B2 (en) | Heterologous signal sequences for secretion of insect controlling toxins | |
| AU721364B2 (en) | Codon optimized DNA sequence for insect toxin AaIT | |
| MXPA98000646A (en) | Transgen virus |