SK150298A3

SK150298A3 - Monoclonal antibody to cea, conjugates comprising said antibody, and their therapeutic use in an adept system

Info

Publication number: SK150298A3
Application number: SK1502-98A
Authority: SK
Inventors: Clive G Copley; Michael D Edge; Stephen C Emery
Original assignee: Zeneca Ltd
Priority date: 1996-05-04
Filing date: 1997-04-29
Publication date: 1999-04-13
Also published as: EP0896626A1; IL126772A0; TR199802227T2; CA2250579A1; WO1997042329A1; ES2279539T3; HUP9901562A2; US20020142359A1; HUP9901562A3; AU2645597A; DE69737188T2; NZ331978A; US6903203B2; BR9708910A; US6277599B1; CN1217750A; NO985120L; CZ353698A3; ATE350478T1; PL329871A1

Description

Monoklonálna protilátka proti CEA, konjugát, obsahuje, polynukleotidová sekvencia kódujúca protilátky, vektor obsahujúci polynukleotidová hostiteľská bunka, hybridom, farmaceutický prípravok konjugát a spôsob prípravy protilátky alebo konjugátu ktorý ju polypeptid sekvenciu, obsahujúci

Oblasť techniky

Predkladaný vynález sa týka protilátok proti CEA (anti-CEA protilátok nazvaných protilátka 806.077 alebo skrátene 806.077 Ab) vhodných na diagnózu a liečenie rakoviny.

Doterajší stav techniky

Je známe, že transformácia normálnych buniek v tkanive na nádorové bunky je spojená so zmenou štruktúry na bunkovom povrchu. Zmenené štruktúry na bunkovom povrchu môžu slúžiť ako antigény a modifikované nádorové štruktúry predstavujú typ tzv. antigénu asociovaného s nádorom (pozri napr. Altered Glycosylation in Tumour Cells, eds. Reading, Hakamori and Marcus, 1988, Arthur Liss Publ.). Takéto antigény sa môžu využiť na vytváranie monoklonálnych protilátok pomocou hybridómovej technológie, čo je dnes odvtedy čo sa prvý krát publikovala, všeobecne dobre zavedená a známa technika, (Kohler a Milstein, Náture 256, 495-497, 1975) .

Jeden antigén asociovaný s nádorom je CEA (carcinomembrionic antigéne, karcinoembryonálny antigén), ktorý prvý krát opísali Gold a Freedman (J. Exp. Med. 121, 439, 1965) . Tento antigén je prítomný na povrchu nádorových buniek a môže sa dokázať v krvnom sére.

Už určitý čas sa využívaj,ú metódy využívajúce protilátky namierené proti antigénom asociovaným s nádorom na liečenie rakoviny (Herlyn a kol., 1980, Cancer Research 40: 717). Protilátky sa môžu použiť na zasiahnutie nádoru rôznymi chemickými a biologickými činidlami a takéto konjugáty sú potom mimoriadne užitočné ako základ pre mnohé spôsoby diagnostiky tak in vitro ako aj in vivo. Takisto sľubné je použitie imunokonjugátov na liečenie rakoviny (Lord a kol., 1985, Trends in Biotechnology 3, 175, Vitetta a kol., 1987, Science 238, 1098) . Tento prístup je technicky omnoho náročnejší ako jednoduché diagnostické využitie a vyžaduje, aby antigény asociované s nádorom, ktoré sú cieľom protilátok pri takejto imunoterapii, boli vysoko nádorovo špecifické a neexprimovali sa vo významnej hladine vo vitálnych ľudských tkanivách. Bez ohladu na teoretické požiadavky a nádorovo špecifickú distribúciu tkanív, v niektorých aplikáciách je žiaduce, aby protilátka zostala na povrchu bunky po naviazaní s antigénom namiesto, toho, aby sa rýchlo internalizovala. Tak napr. v systéme ADEPT (Antibody directed enzýme prodrug therapy, pozri US patenty č. 4975278 a 5405990) sa predpokladá, že je výhodné, ak protilátka zostáva na povrchu bunky, kde konjugát protilátka-enzým uľahčuje aktiváciu predlieku.

Konjugáty protilátok sa môžu tiež využiť v nádorovej imunoterapii. V nasledujúcich odsekoch je opísaný vedecký základ takýchto aplikácií.

T-bunky vyžadujú dva signály, aby mohli odpovedať na imunitné stimuly. Jeden takýto signál poskytuje to, že receptor T-bunky (TCR) rozpoznáva peptidy prezentované s MHC. Avšak ukázalo sa, že samotná stimulácia TCR vedie k neodpovedavosti Tbuniek alebo k anergii a na stimuláciu špecifickej aktivácie a proliferácie T-buniek je potrebný druhý alebo ko-stimulačný signál (pozri prehľad Schwartz R.H., J. Exp. Med., 1996, 184, 18) . Ak dostane obidva signály, výsledné cytotoxické T-bunky sprostredkujú imunitnú odpoveď usmrtením cieľovej bunky. Identifikovalo sa množstvo potenciálne kostimulačných molekúl, napr. B7, molekuly ICAM, ĹFA-1 a LFA-3, CD40, CD70 a CD24 (pozri prehľad Galea-Lauri, J. a kol., Cancer Gene Therapy, 1996, 3, 202-213). Hlavnú kostimulačnú funkciu majú zrejme príbuzné molekuly B7.1 (nazvané tiež CD80) a B7.2 (nazvané tiež CD86) _r ktoré môžu súčasne reagovať s dvoma receptormi CD28 a CTLA-4 (Hellstrom, K.E a kol., Immunol. Rev., 1995, 145, 123-145,

Lenschow, D.J. a kol., Änn. Rev. Immunol., 1996, 14, 233-258).

B7.1 a B7.2 sa exprimujú na bunkách prezentujúcich antigén (APC), ako sú napr. dendritové bunky, zatiaľ čo CD28 a CTLA-4 sa nachádzajú na T-bunkách. B7.2 je konštitutívne exprimovaný na povrchu APC, ale po kontakte s T-bunkou sa expresia B7.1 zvýši. Podobne sa exprimuje CD28 na povrchu T-buniek, ale po aktivácii sa jeho expresia utlmí a nahradí sa expresiou CTLA-4. Stimulácia CD28 a CTLA-4 pomocou B7.1 a B7.2 predstavuje zložitý vzorec signalizácie, ktorá riadi nielen aktiváciu T-bunky, ale tiež následnú proliferáciu, ktorá vedie k imunomodulácii imunitnej odpovede (Greene J. a kol., J. Biol. Chem., 1996, 271, 2676226771). Tento jav vysvetľuje niekedy rozporné údaje opisované pracovníkmi, ktorí študujú tieto kostimulačné molekuly.

Pri rakovine sa identifikovali lymfocyty infiltrujúce do nádoru, ale neprítomnosť imunitnej odpovede na nádor môže byť spôsobená anergiou T-buniek. Nádorové bunky môžu prezentovať na svojom povrchu špecifické alebo selektívne antigény, ale nemajú B7.1/B7.2, čo im umožňuje unikať imunologickému dozoru. In vivo pokusy skutočne dokázali, že nádorové bunky transfekované s B7.1/B7.2 sú menej tumorigénne ako netransfekované bunky tej istej línie, a že transfekované bunky sú schopné vyvolávať ochrannú imunitu proti opakovanej výzve rodičovskými bunkami (Townsend, S.E. a Allison, J.P., 1993, Science, 259, 368-370). Z uvedeného vyplýva, že ak je imunitná odpoveď už raz stimulovaná, môže sa stať nezávislou na B7.1/B7.2. Hellstrom navrhol, že expresia B7.1/B7.2 vnesená do nádorových buniek génovou terapiou má potenciál stimulovať odpoveď hostiteľa, ktorá môže obmedziť alebo aj eliminovať chorobu. Gajewski (J. Immunol., 1996, 156,

465-472) a Matulonis a kol., (J. Immunol., 1996, 156, 1126-1131) publikovali, že B7.1 je nadradená B7.2 v procese aktivácie Tbuniek. Použitie B7.1 v roztoku (vo forme konjugátu s konštantnou doménou protilátky) poskytuje iba miernu kostimuláciu T-buniek, ktoré dostávajú stimuláciu TCR z iného nezávislého zdroja (Linsley P.S. a kol., J. Exp. Med., 1991, 173, 721-730).

Existuje stála potreba ďalších a zlepšených protilátok proti CEA (anti-CEA protilátok) vhodných na diagnostiku a liečenie rakoviny.

Podstata vynálezu

Predkladaný vynález je založený na vynájdení novej protilátky proti CEA (anti-CEA protilátky) nazvanej protilátka 806.077.

Jeden aspekt predkladaného vynálezu poskytuje anti-CEA protilátku obsahujúcu úseky určujúce komplementaritu (CDR), ktoré majú nasledujúce sekvencie:

a) ťažký reťazec

CDR1 DNYMH (sekvencia SEQ ID NO: 29)

CDR2 WIDPENGDTE YAPKFRG (sekvencia SEQ ID NO: 31)

CD3 LIYAGYLAMD Y (sekvencia SEQ ID NO: 32)

b) lahký reťazec

CDR1 SASSSVTYMH (sekvencia SEQ ID NO: 26)

CDR2 STSNLAS (sekvencia SEQ ID NO: 27)

CDR3 QQRSTYPLT (sekvencia SEQ ID NO: 28)

Úseky určujúce komplementaritu (CDR) sú také sekvencie vo vnútri hypervariabilných slučiek vo variabilných doménach protilátky, ktoré sú rozhodujúce pre určenie špecificity interakcie antigén-protilátka (Kabat, E.A., Lu, T.T., ReiMiller, M., Perry, H.M., and Gottesman, K.S., 1987, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4^th edition, Washington D.C., United States Dept. Of Health and Human Services, tu môže čitateľ tiež nájsť podrobnosti k číslovaniu zvyškov protilátok podlá Kabata) . Úseky CDR sú tu definované tak, že zahrňujú aj zvyšky kostry (základné štruktúry) protilátky, pokial sa podieľajú na väzbe. Pre protilátku 806.077 sa úseky CDR stanovili pomocou homológie s hypervariabiInými úsekmi iných myšacích protilátok. Termíny VK a VH tu znamenajú variabilné úseky ľahkého a ťažkého reťazca protilátky. Anatómiu molekúl protilátok publikoval v prehľade Padlan, 1994 (Molecular Immunology 31, 160-217).

Úseky CDR ľahkého reťazca sú:

VK CDR1 zvyšky 23 až 34 vrátane podľa Kabata, SASSSVTYMH (SEQ ID NO: 26),

VK CDR2 zvyšky 50 až 56 vrátane podľa Kabata, STSNLAS (sekvencia SEQ ID NO: 27),

VK CDR3 zvyšky 89 až 97 vrátane podľa Kabata, QQRSTYPLT (sekvencia SEQ ID NO: 28).

Úseky CDR ťažkého reťazca sú:

VH ODRI zvyšky 31 až 35B vrátane podľa Kabata, DNYMH (sekvencia SEQ ID NO: 29), výhodné zvyšky VH CDR1 sú 27 až 35B vrátane FNIKDNYMH (sekvencia SEQ ID NO: 30),

VH CDR2 zvyšky 50 až 65 vrátane podľa Kabata, WIDPENGDTEYAPKFRG (sekvencia SEQ ID NO: 31),

VH CDR3 zvyšky 95 až 102 vrátane podľa Kabata, LIYAGYLAMDY (sekvencia SEQ ID NO: 32), výhodne zvyšky VH CDR3 sú 93 až 102 vrátane podľa Kabata HVLIYAGYLAMDY (sekvencia SEQ ID NO: 33) .

Výhodne je väzbová aktivita afinita pre antigén CEA aspoň 10^-5 M, výhodnejšie je väzbová aktivita afinita pre antigén CEA aspoň 10^-6M, je väzbová aktivita afinita pre antigén CEA aspoň 10'⁷ M, je väzbová aktivita afinita pre antigén CEA aspoň 10^-8 M, je väzbová aktivita afinita pre antigén CEA aspoň 10“⁹ M, je väzbová aktivita afinita pre antigén CEA aspoň 10¹⁰ M a mimoriadne výhodná je väzbová aktivita afinita pre antigén CEA aspoň 10¹¹ M.

Používaný termín imunoglobulínu (alebo konštrukciu protilátky protilátka znamená jej fragment ako napr. scFv všeobecne molekulu alebo modifikovanú , ktorá zachováva ktorá špecifickú antigénnu väzbu š CEA). Úseky CDR sú v podstate zodpovedné za väzbu antigénu, proteínová sekvencia mimo CDR je normálne odvodená z imunoglobulínu domény člena imunoglobulínovej nadrodiny.

Ďalší aspekt predkladaného vynálezu poskytuje CEA protilátku, ktorá obsahuje nasledujúce, prípadne humanizované štruktúry:

sekvencia variabilného úseku ťažkého reťazca (SEQ ID NO: 11):

EVQLQQSGAE LVRSGASVKL SCTASGFNIK DNYMHWVKQR 40 PEQGLEWIAW IDPENGDTEY APKFRGKATL TADSSSNTAY 80 LHLSSLTSED TAVYYCHVLI YAGYLAMDYW GQGTSVAVSS 120 a sekvencia variabilného úseku ľahkého reťazca (SEQ ID NO: 9):

DIELTQSPAI MSASPGEKVT ITCSASSSVT YMHWFQQKPG 40 TSPKLWIYST SNLASGVPAR FSGSGSGTSY SLTISRMEAE 80 DAATYYCQQR STYPLTFGAG TKLELKRA 108;

alebo ktorejkoľvek ich štruktúry z nasledovnej skupiny: F(ab')₂/ F(ab'), Fab, Fv, jednotlivý reťazec Fv a V-min.

Výhodné sú konštrukcie fragmentu F(ab')₂. Patria sem tiež akékoľvek fragmenty protilátok uchovávajúce si väzbové charakteristiky protilátky 806.077. Príkladom je nedávno publikovaný fragment protilátky L-F(ab)₂, ktorý opísal Zapata, 1995 (Protein Engineering, 8, 1057-1062) . Patria sem tiež fragmenty Fv viazané disulfidickými mostíkmi. Protilátka tvorí prípadne časť konjugátu, ako je opísané v nasledujúcom texte.

Výhodná humanizovaná protilátka obsahuje aspoň jednu z nasledovných sekvencii:

sekvenciu variabilného úseku ťažkého reťazca, t.j. sekvenciu VH1 (sekvencia SEQ ID NO: 55), sekvenciu variabilného úseku ľahkého reťazca, t.j. sekvenciu VK4 (sekvencia SEQ ID NO: 71), konštantný úsek CH1 ťažkého reťazca ľudského IgG3, úsek CL ľudského ľahkého reťazca kappa, a kĺbový úsek ľudského IgG3, prípadne vo forme fragmentu F(ab')₂

Ďalší aspekt predkladaného vynálezu poskytuje polynukleotidovú sekvenciu schopnú kódovať variabilný úsek ťažkého alebo ľahkého reťazca fúzovaný (výhodne prostredníctvom spojovacej sekvencie) s génom kódujúcim proteínovú efektorovú skupinu (ako časť konjugátu, pozri nasledujúci text), výhodná je fúzia prostredníctvom ťažkého reťazca protilátky. Pre konjugáty s B7 je výhodná fúzia s N-koncom reťazca protilátky.

CPB má na svojom N-konci pro-doménu, ktorá napomáha správne zložiť proteín pred tým, ako sa pro-doména odstráni, aby sa uvoľnil aktívny enzým. Ak je pro-CPB fúzovaná na C-konci s Nkoncom reťazca protilátky, umožňuje to odstránenie pro-domény (napr. pôsobením trypsínu) z N-konca fúzovanej konštrukcie. Ak sa naopak pro-CPB pripojil k C-koncu reťazca protilátky, vzniká problém, ako odstrániť pro-doménu zo stredu konštrukcie, aby sa pri tom nezničil celý fúzovaný proteín. Riešením je expresia (koexpresia) pro-domény samostatne (trans). Má to tú výhodu, že ak sa už raz bunková línia vytvorila, nie je potrebná aktivácia exprimovaného proteínu trypsínom na to, aby sa odstránila prodoména CPB. Konštrukcie s pro-CPB fúzovanou svojím C-koncom k Nkoncu reťazca protilátky majú tú výhodu, že nevyžadujú vytvorenie ko-exprimujúcich bunkových línií, čo vyžaduje vysokú úroveň expresie pro-domény spoločne s vysokou hladinou expresie ďalších proteínov.

V tomto opise sa diskutuje tiež o konzervatívnych analógoch aminokyselinových sekvencií, ktoré uchovávajú väzbové vlastnosti CEA protilátky podlá predkladaného vynálezu, ale líšia sa v sekvencií jednou alebo niekoľkými konzervatívnymi substitúciami, deléciami alebo adíciami aminokyselín. Typické konzervatívne substitúcie aminokyselín sú uvedené v nasledujúcej tabulke.

Konzervatívna substitúcia

pôvodná aminokyselina	príklad substitúcie	výhodná substitúcia
Ala (A)	Val, Leu, íle	Val
Arg (R)	Lys, Gin, Asn	Lys
Asn (N)	Gin, His, Lys, Arg	Gin
Asp (D)	Glu	Glu
Cys (C)	Ser	Ser
Gin (Q)	Asn	Asn
Glu (E)	Asp	Asp
Gly (G)	Pro	Pro
His (H)	Asn, Gin, Lys, Arg	Arg
íle (I)	Leu, Val, Met, Ala, Phe, norleucín	Leu
Leu (L)	norleucín, íle, Val, Met	íle
Lys (K)	Arg, Gin, Asn	Arg
Met (M)	Leu, Phe, íle	Leu
Phe (F)	Leu, Val, íle, Ala	Leu
Pro (P)	Gly	Gly
Ser (S)	Thr	Thr
Thr (T)	Ser	Ser
Tyr (Y)	Trp, Phe, Thr, Ser	Phe
Val (V)	íle, Leu, Met, Phe, Ala, norleucín	Leu

V tomto opise sa diskutuje tiež o variáciách nukleových kyselín (delécie, substitúcie a adície), špecifických sekvencií nukleovej kyseliny, ktoré si zachovávajú schopnosť hybridizovať pri stringentných (prísnych) podmienkach s príslušnou špecifickou sekvenciou. Hybridizačný test je v tejto prihláške opísaný v príklade 9. Avšak výhodné sú konkrétne tu vymenované sekvencie nukleovej kyseliny. Predpokladá sa, že nukleové kyseliny peptidov sú prijateľným ekvivalentom polynukleotidových sekvencií, minimálne na také účely, ktoré nevyžadujú transláciu na protein (Wittung, 1994, Náture, 368, 561).

Ďalší aspekt predkladaného vynálezu poskytuje protilátku alebo fragment protilátky, ktorá je v humanizovanej forme.

Humanizovaná protilátka, príslušný fragment alebo štruktúra viažuca protilátku, je polypeptid zložený hlavne zo štruktúrnej kostry sekvencií ľudského imunoglobulínu, nesúceho aminokyselinové sekvencie iného ako ľudského pôvodu vo väzbovom mieste pre antigén a v jeho okolí (t.j. úseky určujúce komplementaritu CDR, táto technika je známa ako štepenie CDR a často zahrňuje aj zmeny kostry protilátky, pozri nasledujúce príklady). Vhodná metodológia sa podrobne opísala napr. v WO 91/09967, EP 0328404 a Queen a kol. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 10029) a Montain a Adair, 1989 (Biotechnology and Genetic Engineering Review, 10,1, 1992), aj keď pripadajú do úvahy aj iné metódy humanizácie, ako je napríklad pokrývanie povrchových zvyškov s protilátkou (pozri EP 519596, Merck/NIH, Padlan a kol.). Výhodne humanizované protilátky sú ktorékoľvek protilátky uvedené tu v príkladoch 11 až 47 alebo 107 až 122. Výhodný humanizovaný variabilný úsek ťažkého reťazca je VH1 (pozri príklady). Výhodný humanizovaný variabilný úsek ľahkého reťazca je VK4 prípadne zahrňujúci ktorúkoľvek z dodatočných zmien opísaných v príkladoch 107 až 109. Výhodný konštantný úsek ľudského ťažkého reťazca je IgG3.

Chimérne humanizované protilátky predstavujú ďalší aspekt predkladaného vynálezu. Príprava humanizovaných chimérnych protilátkových fragmentov protilátky 806.077 je tu opísaná v príklade 8. Chimérne protilátky kombináciou variabilného úseku živočíšneho druhu.

sa všeobecne protilátky z pripravujú odlišného ako sa tu

Termín humanizovaný týkajúci sa protilátky, používa, zahrňuje všetky spôsoby humanizácie, ako je napr. štepenie CDR alebo príprava chimérnych protilátok alebo akýchkoľvek hybridov, napr. CDR štep ťažkého reťazca v kombinácii s chimérnym ľahkým reťazcom (pozri uskutočnenie v príklade 110).

Konkrétne, protilátky hlodavcov po opakovanom in vivo podávaní človeku, a to buď samotné alebo ako konjugát, vyvolajú imunitnú odpoveď príjemcu proti týmto protilátkam hlodavcov, tzv. odpoveď HAMA (Human Anti Mouse Antibody) . Odpoveď HAMA môže obmedziť účinnosť liečiva, pokiaľ sa vyžaduje opakované podávanie. Imunogenicita protilátky sa môže znížiť chemickou modifikáciou protilátky pomocou hydrofilného polyméru, ako je napr. polyetylénglykol, alebo metódami génového inžinierstva, keď je možné vytvoriť väzbové štruktúry protilátky viac podobnej ľudským. Tak napr. génové sekvencie pre variabilné domény protilátky hlodavca, ktoré viažu CEA, môžu nahradiť variabilné domény ľudského myeolómového proteínu, a tak sa vytvorí chimérna rekombinantná protilátka. Takéto postupy sú podrobne opísané v patentových prihláškach EP 0171496, EP 0173494 a WO 86/01533. Alternatívne sa môžu izolovať alebo syntetizovať génové sekvencie v géne pre homologickú ľudskú protilátku, čím vznikne ľudská protilátka so špecificitou pôvodnej protilátky hlodavca. Tieto postupy sú opísané v prihláškach EP 023940, WO 90/07861 a WO 91/09967. Prípadne sa môžu veľké množstvá povrchových rezíduí variabilnej domény protilátky hlodavca zmeniť na také rezíduá, ktoré sa normálne nachádzajú na homologickej ľudskej protilátke, čim sa vytvorí protilátka hlodavca obložená povrchovou vrstvou rezíduí, ktorá bude preto rozpoznávaná v ľudskom tele ako vlastné. Tento prístup publikoval Padlan a kol., 1991 (Mol. Immunol. 28, 489).

Ďalší aspekt predkladaného vynálezu poskytuje hostiteľskú bunku transformovanú transgénneho živočícha rastlinu, pochádzajúce sekvenciou alebo alebo transgénnu bunky, v ktorej polynukleotidovou (okrem človeka) z hostiteľskej polynukleotidová sekvencia kóduje prinajmenšom variabilný úsek ťažkého reťazca alebo ľahkého reťazca CEA protilátky podlá predkladaného vynálezu, prípadne vo forme konjugátu, ako sa tu opisuj e.

Ďalší aspekt predkladaného vynálezu poskytuje hybridom 806.077, uložený v ECACC pod č. 96022936, a varianty- tejto bunkovej línie.

Hybridómová protilátka 806.077 sa uložila v European Collection of Animal Celí Cultures (ECACC) , v PHLS Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 0JG, Veľká Británia 29. februára 1996 pod č. 30 96022936 v súlade s Budapeštianskou zmluvou.

Iný aspekt vynálezu poskytuje plazmid pNG3-Vkss-HuCk uložený v NCIMB pod č. 40798.

Plazmid pNG3-Vkss-HuCk sa uložil v The National Collections of Industrial and Marine Bacteria (NCIMB), 23 St. Machar Drive, Aberdeen AB2 1RY, Scotland, Veľká Británia 11. apríla 1996 pod č. NCIMB 40798 v súlade s Budapeštianskou zmluvou.

Iný aspekt vynálezu poskytuje plazmid pNG4-VHss-HuIgG2CHl uložený v NCIMB pod č. 40797.

Plazmid pNG4-VHss-HuIgG2CHl sa uložil v The National Collections of Industrial and Marine Bacteria (NCIMB), 23 St. Machar Drive, Aberdeen AB2 1RY, Scotland, Veľká Británia 11.

apríla 1996 pod č. NCIMB 40797 v súlade s Budapeštianskou zmluvou.

Iný aspekt vynálezu poskytuje plazmid pNG3-Vkss-HuCk-Neo uložený v NCIMB pod č. 40799.

Plazmid pNG3-Vkss-HuCk-Neo sa uložil v The National Collections of Industrial and Marine Bacteria (NCIMB), 23 St. Machar Drive, Aberdeen AB2 1RY, Scotland, Velká Británia 11. apríla 1996 pod č. NCIMB 40799 v súlade s Budapeštianskou zmluvou.

Ďalší aspekt predkladaného vynálezu poskytuje spôsob prípravy aspoň variabilného úseku ťažkého alebo ľahkého reťazca anti-CEA protilátky, ktorý spočíva v tom, že sa

a) transformuje hostiteľská bunka polynukleotidovou sekvenciou kódujúcou aspoň variabilný úsek ťažkého alebo ľahkého reťazca anti-CEA protilátky a prípadne transformovaná hostiteľská bunka nechá vyvinúť v transgénnom cicavcovi okrem človeka alebo v transgénnej rastline.

b) hostiteľská bunka, transgénny cicavec okrem človeka alebo transgénna rastlina sa vystavia takým podmienkam, ktoré spôsobia expresiu, prípadne sekréciu aspoň variabilného úseku, a prípadne

c) aspoň čiastočne purifikuje variabilný úsek.

Ďalší aspekt predkladaného vynálezu poskytuje spôsob prípravy protilátky alebo konjugátu, ktorý spočíva v tom, že sa

a) hostiteľská bunka, transgénny cicavec okrem človeka alebo transgénna rastlina, alebo hybridom 806.077 vystaví takým podmienkam, ktoré spôsobujú expresiu, prípadne sekréciu protilátky alebo konjugátu, a prípadne

b) aspoň čiastočne purifikuje protilátka alebo konjugát.

Výhodne sú variabilné úseky tak ľahkého ako aj ťažkého reťazca exprimované v jednej a tej istej bunke, čím sa zloží a vytvorí anti-CEA protilátka. Výhodne je variabilný úsek ťažkého alebo ľahkého fúzovaný (prípadne prostredníctvom spojovacej sekvencie) s génom kódujúcim proteínovú efektorovú skupinu (ako časť konjugátu, pozri nasledujúci text), výhodne fúzovaný prostredníctvom ťažkého reťazca protilátky. Všeobecne sa môže fúzovať tak N-koniec, ako aj C-koniec reťazca protilátky. Pre konjugáty s B7 je výhodná fúzia s N-koncom reťazca protilátky. CPB má na svojom N-konci pro-doménu, ktorá napomáha správne zložiť proteín pred tým, ako sa pro-doména odstráni, aby sa uvoľnil aktívny enzým. Ak je pro-CPB fúzovaný na C-konci s Nkoncom reťazca protilátky, umožňuje to odstránenie pro-domény (napr. pôsobením trypsínu) z N-konca fúzovanej konštrukcie. Ak sa naopak pro-CPB pripojil k C-koncu reťazca protilátky, vzniká problém, ako odstrániť pro-doménu samostatne (v trans). To má tú výhodu, že ak sa už raz bunková línia vytvorila, nie je potrebné aktivovať exprimovaný proteín trypsínom, aby sa odstránila prodoména CPB. Konštrukcie s pro-CPB fúzovaným svojím koncom Ckoncom s N-koncom reťazca protilátky majú tú výhodu, že nevyžadujú vytvorenie ko-exprimujúcich bunkových línií, čo vyžaduje vysokú expresiu pro-domény spoločne s vysokou hladinou expresie ďalších proteinov.

Ďalší aspekt predkladaného vynálezu poskytuje spôsob prípravy monoklonálnej protilátky 806.077, ktorý spočíva v tom, že sa

a) kultivuje hybridom protilátky 806.077 uložený v ECACC pod č. 96022936 v médiu pri podmienkach vhodných na expresiu protilátky

b) získa protilátka 806.077 z kultivačného média a prípadne

c) pripraví protilátkový fragment F(ab')₂ z protilátky 806.077 enzýmovým štiepením.

Ďalší aspekt predkladaného vynálezu poskytuje konjugát, ktorý obsahuje efektorovú skupinu a anti-CEA protilátku 806.077 podľa vynálezu, ako je tu opísaná. Efektorová skupina je skupina s takým účinkom, že prepožičiava protilátke 806.077 v konjugáte ešte inú aktivitu (napr. enzýmový, toxínový alebo rádioaktívny ligand).

Efektorová skupina v jednom uskutočnení predkladaného vynálezu je výhodne enzým vhodný na použitie v systéme ADEPT. V Medzinárodnej patentovej prihláške WO 96/20011, publikovanej 4. júla 1996, sme navrhli systém ADEPT s obrátenou polaritou založený na mutantnom ľudskom enzýme, ktorý má výhodu nízkej imunogenicity v porovnaní napríklad s bakteriálnym enzýmom. Konkrétny hostitelský enzým bola CPB z pankreasu (pozri príklad 15 uvedenej prihlášky, ľudská [D253K]CPB a príklad 16, ľudská [D253R]CPB) a predlieky (pozri príklady 18 a 19 uvedenej prihlášky). Hostitelský enzým je mutovaný tak, aby sa zmenil spôsob interakcie medzi enzýmom a predliekom v zmysle rozpoznania substrátu v porovnaní s natívnym hostiteľským enzýmom. V nasledujúcej Medzinárodnej patentovej prihláške PCT/GB96/01975 (publikovanej 6. marca 1997 ako WO97/07796) je opísaná ďalšia práca na mutovanej kombinácii enzým CPB/predliek pre systém ADEPT. Výhodným enzýmom vhodným pre ADEPT je ktorýkoľvek z enzýmov CPG2 alebo CPB s obrátenou polaritou, napr. ktorýkoľvek z [D253K]HCPB, [G251T,D253K]HCPB alebo [A248S,G251T,D253K]HCPB.

Konjugáty protilátky 806.077 sú využiteľné v nádorovej imunoterapii.

V ďalšom výhodnom uskutočnení predkladaného vynálezu efektorová skupina konjugátu je ko-stimulačná molekula, výhodne je táto ko-stimulačná molekula B7, výhodnejšie ľudská B7.1 alebo B7.2, a obzvlášť výhodná ľudská B7.1. Konjugát je výhodne vo forme fúzneho proteínu, výhodné takého, ktorý je vytvorený spojením C-konca ko-stimulačnej molekuly a N-konca reťazca protilátky, výhodne tak, že protilátka 806.077 neobsahuje úsek Fc, výhodnejšie fragment F(ab')₂ a najvýhodnejšie je protilátka humanizovaná alebo ľudská. Obzvlášť výhodný konjugát je opísaný v príklade 104 v nasledujúcom texte.

Predpokladá sa, že použitie protilátky na zacielenie kostimulačnej molekuly na nádorové bunky poskytne nádorovým bunkám funkciu prezentácie antigénu, takže T-bunky dostanú špecifickú stimuláciu TCR od samotných nádorových buniek a kostimulačný signál od molekuly zacielenej protilátkou. Použitie ľudských alebo humanizovaných protilátok je výhodné na liečenie ľudských nádorov, pretože myšacie protilátky môžu vyvolať imunitnú odpoveď, pokiaľ sa použijú u človeka, čo môže znížiť účinnosť opakovaného liečenia. Nové je použitie fúzneho proteínu kombinujúceho úsek viažuci nádorový antigén spojený s extracelulárnou časťou ko-stimulačnej molekuly. Hayden a kol. (Tissue Antigens, 1996, 48, 242-254) opísali použitie molekuly protilátky s dvojitou špecificitou, ktorá kombinuje väzbovú doménu anti-nádorového antigénu s väzbovou doménou anti-CD28. Zatiaľ čo táto molekula je schopná interagovať s CD28 na Tbunkách, signál, ktorý môže predať, má tú nevýhodu, že je kvalitatívne odlišný od signálu, ktorý poskytujú prirodzené ligandy CD28, napr. afinita väzby je vyššia ako medzi B7.1 a CD28. Medzidruhová homológia medzi B7.1, B7.2 a CD28, CTLA-4 ukazuje evolučnú konzerváciu sekvencii väzbových úsekov. V dôsledku týchto faktov sa berie do úvahy, že napr. B7.1 z človeka môže reagovať s CD28 z myši a môže predať podobný kostimulačný signál. Na liečenie chorôb človeka je výhodný ľudský alebo humanizovaný proteín. Avšak použitie ľudských alebo humanizovaných proteínov na zvieracom modeli by mohlo mať podobné účinky, aké sa očakávajú u človeka, a tak zvierací model by mal poskytnúť relevantné údaje o účinnosti ludských/humanizovaných protilátkových fúznych proteínov s ľudskými B7.1/B7.2 pri liečení chorôb človeka.

Konjugácia efektorovej skupiny a protilátky sa môže dosiahnuť akoukoľvek vhodnou metódou, ako je napr. chemická väzba prostredníctvom heterobifunkčnej spojky alebo technikami fúzie rekombinantných génov. Všeobecne fúzne proteíny sú výhodné konjugáty, obzvlášť konjugáty s HCPB alebo B7.

Výhodné konjugáty sú také, kde efektorová skupina je ktorákoľvek z nasledovných:

a) enzým, vhodný na použitie v systéme ADEPT

b) CPG2

c) [G251T,D253K]HCPB

d) [A248S,G251T,D253K]HPCB

e) ko-stimulačná molekula

f) extraceluláma doména B7

g) extraceluláma doména ludskej B7.1, a

h) extraceluláma doména ludskej B7.2 prípadne vo forme fúzneho proteínu.

Je známe, že konjugát podlá predkladaného vynálezu sa nemusí nutne skladať z jednej efektorovej molekuly a jednej molekuly protilátky. Konjugát môže napr. obsahovať viac ako jednu efektorovú molekulu na každú molekulu protilátky. Všeobecne protilátkové konjugáty s F(ab')₂, ktoré predstavujú spojenie medziprotilátkou a enzýmom alebo extracelulárnou doménou B7, majú 2 mol enzýmu alebo B7 na 1 mol protilátky.

Obzvlášť výhodné konjugáty sú ktorékoľvek fúzne proteíny vybrané z nasledujúcich konjugátov (sekvencie sú uvedené v smere od N-konca k C-koncu):

a) humanizovaný 806.077 F(ab') ₂-{ [A248S,G251T, D253K] HCPB}₂ fúzny proteín obsahujúci:

protilátkový reťazec Fď so štruktúrou VH1 (sekvencia SEQ ID NO:

55)/konštantný úsek CH1 z IgG3/kíbový úsek k N-koncu [A248S,G251T,D253K]HPCB a ľahký reťazec protilátky podľa vzorca VK4 (sekvencia SEQ ID NO: 71)/úsek CL z ľahkého reťazca kappa,

b) {A248S, G251T, D253K] HPCB }₂/humanizovaný 806.077 F(ab')₂ fúzny proteín obsahujúci:

[A248S,G251T,D253]HPCB, pričom HPCB je fúzovaný svojím C-koncom prostredníctvom spojky (GGGS)3 k N-koncu Fď reťazca protilátky so štruktúrou VH1 (sekvencia SEQ ID NO: 55)/konštantný úsek CH1 z IgG3/kíbový úsek z IgG3, a

c) (ľudská B7.1 extracelulárna doména)₂ ^- humanizovaný 806.077 F(ab')₂ fúzny proteín obsahujúci:

ľudskú extracelulárnu doménu B7.1, pričom B7.1 je fúzovaná svojím C-koncom k N-koncu Fd' reťazca protilátky so štruktúrou VH1 (sekvencia SEQ ID NO: 55)/konštantný úsek CH1 z IgG3/kíbový úsek z IgG3, a ľahký reťazec protilátky podlá vzorca VK4 (sekvencia SEQ ID NO: 71)/úsek CL z ľahkého reťazca kappa.

V tomto opise je kĺbový úsek protilátky vo vzťahu ku konjugátu definovaný podlá princípov, ktoré stanovil Padlan (1994) v Molecular Immunology 31, 169-217 (pozri konkrétne tabuľku 2 v uvedenej publikácii). V týchto výhodných konjugátoch sú 2 mol enzýmu alebo B7.1 na 1 mol F(ab')₂- Symbol lomené / je tu použitý ako oddelovač, aby boli viditeľné samostatné štruktúrne prvky spojené s peptidovými väzbami, ktoré tvoria zložky konjugátu.

Humanizované sekvencie variabilných úsekov VH1 alebo VK4 majú tú výhodu, že si uchovávajú dobré väzbové vlastnosti s minimálne ďalšími vyžadovanými zmenami na kostre ľudskej protilátky. Kĺbový úsek IgG3 má výhodu, že poskytuje dobrú produkčnú úroveň F(ab')₂ a dostatočne homogénny produkt.

V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu, ktoré sa týka mimoriadne výhodných konjugátov definovaných v predchádzajúcom texte, je fúzia ovplyvnená prostredníctvom ľahkého reťazca protilátky. V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu, ktoré sa osobitne týka výhodných konjugátov definovaných v predchádzajúcom texte, sa môže konštantný úsek CH1 zo štruktúrneho prvku IgG3/kíbový úsek XgG3 nahradiť zodpovedajúcim prvkom IgG2.

Pokiaľ je efektorová molekula toxín, toxínová skupina všeobecne obsahuje zložku, ktorá má cytotoxické vlastnosti a je teda schopná po internalizácii bunky usmrtiť.

Toxínová skupina a anti-CEA protilátka sa môžu navzájom spojiť priamo alebo nepriamo. Toxínová skupina a anti-CEA protilátka sú všeobecne spojené tak, aby sa anti-CEA protilátka naviazala na cieľovú bunku. Výhodné sú toxínová skupina a antiCEA protilátka spojené tak, že konjugát je extracelulárne stabilný a intracelulárne nestabilný, takže toxínová skupina a anti-CEA ostávajú spojené pokiaľ sú mimo cieľovej bunky, ale po internalizácii sa toxínová skupina uvoľňuje. Takže výhodný konjugát obsahuje intracelulárne štiepitelné/extracelulárne stabilné miesto.

Príklady konjugátov, kde je toxínová skupina priamo spojená s väzbovou skupinou pre cieľovú bunku, zahrňujú také konjugáty, kde toxínová skupina a anti-CEA protilátka sú spojené disulfidickým mostíkom vytvoreným medzi tiolovou skupinou toxínovej skupiny a tiolovou skupinou anti-CEA protilátky. Podrobnosti prípravy a vlastností imunotoxínov a ďalších konjugátov sú opísané v Európskej patentovej prihláške EP 528527, na ktorej obsah sa týmto odvolávame.

Ďalší aspekt predkladaného vynálezu poskytuje polynukleotidovú sekvenciu schopnú kódovať polypeptid protilátky alebo konjugátov podlá predkladaného vynálezu. Termín schopná kódovať je tu použitý tak, že zahrňuje také polynukleotidové sekvencie, kde je nutné brať do úvahy degeneráciu genetického kódu, pretože niektoré aminokyseliny sú kódované viac ako jedným kodónom.

Ďalší aspekt predkladaného vynálezu poskytuje vektor obsahujúci polynukleotid definovaný v predchádzajúcom texte.

Ďalší aspekt predkladaného vynálezu poskytuje hostiteľskú bunku transformovanú polynukleotidovou sekvenciou definovanou v predchádzajúcom texte alebo transgénne zviera okrem človeka alebo transgénnu rastlinu, ktoré sa vyvinú z hostiteľskej bunky.

Ďalší aspekt predkladaného vynálezu poskytuje farmaceutický prípravok obsahujúci konjugát podľa vynálezu v spojení s farmaceutický prijateľným riedidlom alebo nosičom, prípadne vo forme vhodnej na intravenózne podávanie.

Ďalší aspekt predkladaného vynálezu poskytuje konjugát opísaný v predchádzajúcom texte na použitie ako liečivo.

Ďalší aspekt predkladaného vynálezu poskytuje použitie konjugátu podľa vynálezu na prípravu liečiva na liečenie neoplastických ochorení.

Je zrejmé, že dávky a dávkový režim budú závisieť na konkrétnej efektorovej skupine, ktorá sa použila, na populácii cieľových buniek a na anamnéze pacienta. Podávaná dávka konjugátu bude typicky v rozsahu od 0,1 do 1 mg/kg hmotnosti pacienta.

Konjugát podľa predkladaného vynálezu sa môže normálne podávať vo forme liečivého prídavku. Takže predkladaný vynález poskytuje tiež farmaceutický prípravok obsahujúci konjugát v spojení s farmaceutický prijateľným riedidlom alebo nosičom. Príklad takéhoto prípravku je tu uvedený v príklade 10.

Farmaceutický prípravok podlá predkladaného vynálezu môže byť v rôznych liekových formách. Všeobecne konjugát podľa predkladaného vynálezu sa podáva parenterálne, výhodne intravenózne. Konkrétny parenterálny farmaceutický prípravok je prípravok, ktorého jednotková dávková forma je vhodná na injekčné podávanie. Takže osobitne výhodný prípravok obsahuje roztok, emulziu alebo suspenziu imunotoxínu v spojení s farmaceutický prijateľným parenterálnym riedidlom alebo nosičom. Medzi vhodné nosiče a rozpúšťadlá patrí vodný nosič, ako je voda alebo soľný (fyziologický) roztok, alebo iný nosič bez vody, ako sú fixované oleje alebo lipozómy. Prípravok môže tiež obsahovať činidlo, ktoré v prípravku zvyšuje stabilitu konjugátu.

Prípravok môže obsahovať napr. pufor (tlmivý roztok). Koncentrácia konjugátu bude rôzna, ale všeobecne bude konjugát v prípravku v koncentrácii približne od 1 do 10 mg/ml.

Ďalší aspekt predkladaného vynálezu poskytuje expresný vektor kódujúci anti-CEA protilátku podía vynálezu.

Ďalší aspekt predkladaného vynálezu poskytuje expresný vektor kódujúci minimálne variabilný úsek ťažkého alebo ľahkého reťazca anti-CEA protilátky podľa vynálezu.

Ďalší aspekt predkladaného vynálezu poskytuje bunku transformovanú vektorom podía vynálezu, kompatibilný s expresiou v tejto bunke.

hostiteľskú ktorý je

Ďalší aspekt predkladaného vynálezu poskytuje hostiteľskú bunku transformovanú polynukleotidovou sekvenciou podľa vynálezu.

Cicavčie bunky (CHO, COS, myelómové bunky) sa použili ako hostiteľské bunky na ko-expresiu cDNA ľahkého reťazca (L) a ťažkého (H) reťazca protilátky a ich fragmentov, aby sa vytvorila protilátka s požadovanou väzbovou aktivitou (Bebbington, C., Methods, Vol. 2, 136-145, Adair, J., 1992,

Reviews, Vol. 130). Bunky COS alebo CHO sú výhodným bunkovým expresným systémom na expresiu konštrukcií na priamu expresiu aktívnej CPB. V prípade buniek COS sa cDNA vloží do plazmidov a potom sa integruje do chromozómovej DNA. Plazmidy vyžadujú všeobecne nejaký selektovatelný marker na udržiavanie v transfekovanom hostiteľovi, účinný eukaryotický promótor, ktorý umožní vysokú úroveň transkripcie z cDNA, vhodné reštrikčné miesta na klonovanie a tiež polyadenylačné a terminačné signály transkripcie pre dobrú stabilitu mRNA. V literatúre sa už opísalo niekoľko takýchto vektorov (Bebbington, C. a kol., 1992, Biotechnology, vol. 2, 125-135), a navyše existujú tiež aj komerčne dostupné vhodné vektory (ako napr. pRc/CMV, Invitrogen Corp.).

Dobre dokumentovaná je expresia rôznych fragmentov protilátok v E. coli (pozri prehľad Pluckthun, A., Immunological Reviews, 1992, vol. 130, 151-188, Skerra, A., Current Opinion in Immunology, 1993, vol. 5, 256-262). Opísala sa intracelulárna expresia reťazcov ľd a L (Cabilly, S., 1989, Gene, vol. 85, 553557), ale tá vyžaduje nové zloženie molekuly in vitro a reasociáciu reťazcov (Buchner, J., Rudoph, R., 1991, Biotechnology, vol. 9, 157-162), aby boli schopné väzbovej aktivity. Účinnejší spôsob, ako získať aktívne fragmenty protilátky je prostredníctvom periplazmatickej sekrécie (Better, M. a kol., 1988, Science 240, 1041-1043). Jednotlivé zložky, reťazce H a L, fragmentu protilátky sú ko-exprimované z jediného plazmidu. Každý reťazec protilátky má pripojený bakteriálny vedúci peptid, ktorý nasmeruje reťazec do periplazmy E. coli, kde sa vedúci peptid odštiepi a voľné reťazce asociované, čím vytvorí rozpustné a aktívne fragmenty protilátky. Je zrejmé, že tento proces napodobňuje prirodzený proces v eukaryotickej bunke, kde sa exprimované reťazce dostávajú do lumen endoplazmatického retikula pred tým, ako sú asociované v kompletných protilátkach. Tento proces často spôsobuje to, že je väzbová aktivita prítomná aj v supernatante z bunkových kultúr.

Niektoré expresné systémy zahrňujú transformovanie hostiteľskej bunky vektorom, takéto systémy sú dobre známe napr. v E. coli, kvasinkách a cicavčích hostiteľoch (pozri Methods in Enzymology, 185, Academic Press, 1990). Do úvahy prichádzajú aj iné expresné vektory, ako napr. transgénne cicavce okrem človeka, kde je požadovaný gén výhodne vybraný z vektora a asociovaný s cicavčím promótorom z mliečnej žľazy, aby sa exprimovaný proteín nasmeroval do mlieka, alebo je vnesený do pronuklea cicavčej zygoty (obyčajne mikroinjekciou do jedného z dvoch jadier (obyčajne samčieho jadra) v pronukleu), ktorá sa potom implantuje náhradnej matke. Časť zvierat z potomstva náhradnej matky ponesie a bude exprimovať vnesený gén, ktorý sa integroval do chromozómu. Obyčajne sa integrovaný gén prenáša na potomstvo konvenčným šľachtením, čo umožňuje rýchlu expanziu kmeňa. Požadovaný protein sa výhodne jednoducho zbiera z mlieka samíc transgénnych zvierat. Čitateľovi odporúčame nasledujúce publikácie: Simons a kol., 1988, Biotechnology 6: 179-183,

Wright a kol., 1991, Biotechnology 9: 830-834, patentové prihlášky US 4 873 191 a US 5 322 775. Manipulácia s myšacími embryami je opísaná v Hogan a kol. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1986.

Tiež možno brať do úvahy technológie transgénnych rastlín, ako je opísané napr. v nasledujúcich publikáciách: Swain, W.F., 1991, TIBTECH 9, 107-109, Ma, J.K.C. a kol., 1994, Eur. J. Immunol. 24, 131-138, Hiatt, A. a kol., 1992, FEBS Letters, 307, 71-75, Hein, M.B. a kol., Biotechnology Progress, 7, 455-561, Duering, K., 1990, Plánt Molecular Biology, 15, 281-294.

Pokiaľ je to potrebné, gény hostiteľa sa môžu inaktivovať alebo modifikovať pomocou štandardných postupov, ako je prehľadne a stručne uvedené v nasledujúcom texte a ako je podrobne opísané napr. v Gene Targeting: A Practical Approach, IRL Press, 1993. Cieľový gén alebo jeho časť sa výhodne klonuje do vektora so selekčným markerom (ako je napr. Neo) vloženým do génu tak, že narušuje jeho funkciu. Vektor sa linearizuje a transformuje (obyčajne elektroporáciou) do embryonálnych kmeňových (ES) buniek (pochádzajúcich napr. z myšacieho kmeňa 129/Ola) a potom v určitej časti kmeňových buniek prebehne homologická rekombinácia. Kmeňové bunky obsahujúce porušený gén sa namnožia a injikujú do blastocysty (napr. z myši C57BL/6J), ktorá sa potom vloží do náhradnej matky na ďalší vývoj. Chimérne potomstvo sa identifikuje pomocou markerov pre farbu. Aby sa zaistil príspevok ES buniek k zárodočnej línii, chiméry sa ďalej šľachtia krížením s myšami s genetickými markermi, čo umožňuje odlíšiť gaméty pochádzajúce z ES a hostiteľské blastocysty. Polovica gamét pochádzajúcich z ES buniek ponesie génovú modifikáciu. Potomstvo sa vyšetruje (obyčajne pomocou

Southernovho prenosu) na prítomnosť porušeného génu (obyčajne 50% potomstva). Takto selektované potomstvo bude heterozygotne a preto sa môže krížiť s iným heterozygotným a homozygotným potomstvom potom selektovaným (približne 25% potomstva). Transgénne zvieratá s vyradeným génom (gene knockout) sa môžu krížiť s transgénnymi zvieratami, ktoré sa vytvorili známymi technikami, ako sú napr. mikroinjekcie DNA do pronuklea, fúzie sféroplastov (Jakobovits a kol., 1993, Náture, 362, 255-258) alebo transfekcia buniek ES sprostredkovaná lipidmi (Lamb a kol., Náture Genetics 5, 22-29), aby sa vytvorili transgénne zvieratá, kde je endogénny gén vyradený a nahradený cudzím génom.

ES bunky obsahujúce porušený cieľový gén sa môžu ďalej modifikovať transformáciou sekvencie cieľového génu obsahujúcou špecifické zmeny, ktorá je výhodne klonovaná do vektora a pred transformáciou linearizovaná. Po homologickej rekombinácii sa uvedený gén vnesie do chromozómu. Tieto embryonálne bunky sa potom môžu použiť na vytvorenie transgénneho organizmu.

Termín hostiteľská bunka znamená akúkoľvek prokaryotickú alebo eukaryotickú bunku vhodnú na technológiu expresie, ako sú napr. baktérie, kvasinky, rastlinné bunky, zygoty cicavcov okrem človeka, oocyty, blastocysty, embryonálne kmeňové bunky a akékoľvek ďalšie vhodné bunky na transgénnu technológiu. Pokial to kontext dovoľuje, termín hostiteľská bunka tiež zahrňuje transgénnu rastlinu alebo cicavca okrem človeka, ktoré sa vyvinuli z transformovaných zygot cicavca okrem človeka, oocytov, blastocystov, embryonálnych kmeňových buniek, rastlinných buniek a akýchkoľvek ďalších buniek vhodných na transgénnu technológiu.

Ďalší aspekt predkladaného vynálezu poskytuje spôsob liečenia človeka alebo zvieraťa, ktorí toto liečenie potrebujú, kde tento spôsob spočíva v tom, že sa podáva človeku alebo zvieraťu farmaceutický účinné množstvo konjugátu podľa vynálezu.

Ďalší aspekt predkladaného vynálezu poskytuje spôsob cielenia efektorovej skupiny do buniek prezentujúcich CEA antigén cicavcov, ktorí takéto cielenie vyžadujú, kde tento spôsob spočíva v tom, že sa podáva farmaceutický účinné množstvo konjugátu podlá vynálezu.

Ďalší aspekt predkladaného vynálezu poskytuje použitie protilátky podlá vynálezu v diagnostickej metóde.

Jednou z diagnostických metód je imunotest. Môže sa vytvoriť imunotest na in vitro testovanie založený na novej protilátke podlá predkladaného vynálezu v súlade s konvenčnými imunologickými technikami známymi v odbore, kde sa protilátka podľa vynálezu použije v značenej alebo neznačenej forme a stanovuje sa vytváranie komplexu protilátky s CEA v testovanej vzorke. V jednom prípade sa môže protilátka značiť detegovatelnou značkou, ako je značka rádioaktívna, chemiluminiscenčná, fluorescenčná alebo enzýmová. Alternatívne je protilátka detegovaná prostredníctvom komplexu, ktorý sa vytvára so značenou látkou alebo tiež spôsobmi bez značenia, napr. metódou biosenzorov, založenou napr. na povrchovej plazmónovej rezonancii. Vzorka môže byť napr. telová tekutina, ako je sérum, alebo tkanivový preparát (v prípade histochemického testu).

Na in vivo diagnostiku má protilátka podlá vynálezu vhodnú vonkajšiu detegovateinú značku, ako je napr. rádioznačka alebo atóm ťažkého kovu, a je podaná subjektu, čím sa môže stanoviť lokalizovaná akumulácia protilátky.

Na in vitro diagnostiku rakoviny sa môže anti-CEA protilátka konjugovať s enzýmom, ako je napr. chrenová peroxidáza a bakteriálna luciferáza, ktoré môžu tvoriť meratelný signál, alebo s fluorescenčnými markermi alebo rádioizotopmi, ktoré sa môžu detegovať a kvantifikovať priamo. V štandardnom imunoteste takéto konjugáty poskytujú prostriedok na meranie prítomnosti alebo neprítomnosti CEA v tkanive tela a teda poskytujú rýchly a pohodlný test na diagnózu nádorovej choroby. Základný opis metodológie enzýmových imunotestov možno nájsť v Enzýme Immunoassay, E.T. Maggio, CRC Press, a ďalej v patentových prihláškach US 3 690 8334, US 3 791 932, US 3 817 837, US 3 850 578, US 3 853 987, US 3 867 517, US 3 901 654, US 935 074, US 3 984 533, US 3 996 345 a US 4 098 876.

Na in vivo diagnostiku rakoviny sa anti-CEA protilátka môže konjugovať s izotopmi prvkov, ako je napr. ytrium, technécium alebo indium, alebo s izotopmi ťažkých kovov, ktoré sa môžu detegovať celotelovými snímacími kamerami (pozri Larson, S.M., 1987, Radiology, 165, 297-304).

Výhodné uskutočnenie vynálezu na liečenie rakoviny obsahuje anti-CEA protilátku, ktorá sa môže konjugovať s efektorovou skupinou, ktorá môže priamo usmrtiť nádorové bunky alebo prostredníctvom aktivácie vhodného predlieku v systéme ADEPT. V systéme ADEPT je selektívne usmrcovanie nádorových buniek dosiahnuté tým, že anti-CEA protilátka je konjugovaná s enzýmom, ktorý je schopný katalyzovať premenu netoxickej dávky predlieku na účinnú toxickú liečivú zlúčeninu. Podanie konjugátu umožňuje lokalizáciu enzýmovej aktivity do miesta nádoru. Následné podanie predlieku spôsobuje miestnu tvorbu toxickej zlúčeniny a selektívne usmrcovanie buniek v mieste nádoru. Tento prístup je opísaný v patentových prihláškach WO 88/07378, US 4 975 278, US 5 405 990 a WO 89/10140. Na nádorovú imunoterapiu sa môže tiež použiť protilátka 806.077 konjugovaná s ko-stimulačnou molekulou, ako sa už opísalo v predchádzajúcom texte.

Selektívne usmrcovanie nádorových buniek sa môže dosiahnuť konjugáciou anti-CEA protilátky buď priamo, alebo chemickým derivovaním s makrocyklickými chelatačnými činidlami obsahujúcimi vysokoenergetické izotopy ako napr. ⁹⁰Y, ¹³¹I a ^U1ln. Anti-CEA protilátka slúži na lokalizáciu izotopu do nádoru a rádioaktivita emitovaná izotopom ničí DNA okolitých buniek a usmrcuje nádor.

Selektívne usmrcovanie nádorových buniek sa môže tiež dosiahnuť konjugáciou anti-CEA protilátky s cytotoxickým alebo cytostatíckým liečivom, ako sú napr. metotrexát, chlorambucil, adriamycín, daunorubicín a vincristín. Tieto látky sa klinicky používajú už niekoľko rokov a liečenie s ich pomocou je často obmedzené ich nešpecifickou toxicitou. Konjugácia týchto látok s CEA protilátkou umožňuje, aby sa tieto látky lokalizovali v mieste nádoru bez neprijateľných vedľajších účinkov pôsobením týchto látok na iné tkanivá ako je napr. kostná dreň alebo nervový systém.

Účinnosť protilátky je v mnohých aplikáciách vylepšená znížením veľkosti väzbovej štruktúry protilátky, čím sa zvýši iné farmakodynamické vlastnosti penetrácia tkanív a farmaceutického prípravku, odstráni úsek Fc metódami génového

Dá sa to dosiahnuť tým, že sa z molekuly protilátky buď enzýmovo alebo inžinierstva a vytvorí sa rekombinantný fragment Fab' alebo F(ab')₂.

Metódy génového inžinierstva sa môžu využiť tiež na ďalšie zmenšenie veľkosti anti-CEA protilátky. Úsek Fv, obsahujúci úseky CDR, sa môže upraviť metódami génového inžinierstva, izolovane exprimovať a potom chemicky zosietiť napr. s použitím disulfidickým mostíkov. Alebo obe domény ľahkého a ťažkého reťazca, vytvárajúce štruktúru Fv, sa môžu exprimovať ako jeden polypeptidový reťazec (scFv) fúziou domén Fv so spojovacou peptidovou sekvenciou z prirodzeného C-konca jednej domény k Nkoncu druhej doméne (pozri patentové prihlášky PCT/US/87/02208 a US 4 704 692). Alebo sa môže exprimovať jediná izolovaná doména Fv vytvárajúca protilátku s jedinou doménou alebo dAb, ako publikovali Ward a kol., Náture, 1989, 341, 544). Iným typom anti-CEA protilátky, ktorý pripadá do úvahy, je tiež V-min konštrukcia, opísaná v Medzinárodnej

WO/12625 (autori Slater a Timms).

patentovej prihláške

Zoznam skratiek používaných v tomto texte:

ADEPT	terapia enzýmovým predliekom riadeným protilátkou (antibody directed enzýme prodrug therapy)
APC	bunka prezentujúca antigén
CDR	úsek(-y) určujúce komplementaritu
CEA	karcinoembryonálny antigén
CL	konštantná doména ľahkého reťazca protilátky
CPB	karboxypeptidáza B
CPG2	karboxypeptidáza G2
DAB	3,3'-diaminobenzidintetrahydrochlorid
DEPC	dietylpyrokarbonát
DMEM	Eaglove médium modifikované Dulbeccom
ECACC	Európska zbierka živočíšnych bunkových kultúr (European Collection of Animal Celí Cultures)
EIA	enzýmový imunotest
ELI SA	test s enzýmom naviazaným na imunosorbent
FCS	fetálne teľacie sérum
Fd	ťažký reťazec Fab, Fab' alebo F(ab')₂/ prípadne obsahujúci aj kĺbový úsek
HAMA	ľudská proti-myšacia protilátka
HCPB	ľudská karboxypeptidáza, výhodne z pankreasu
kĺb IgG	krátky peptid bohatý na prolín obsahujúci
(kĺbový úsek)	cysteíny, ktoré premosťujú 2 ťažké reťazce
HRPO	chrenová peroxidáza
NCA	nešpecifický krížovo reagujúci antigén
NCIMB	Národné zbierky priemyselných a morských baktérií (National Collections of Industrial and Marine

PBS

PCR preproCPB proCPB

SDS-PAGE

TBS

VH

VK

Bacteria) soľný (fyziologický) roztok pufrovaný fosfátom polymerázová reťazová reakcia proCPB s N-koncovou vedúcou sekvenciou

CPB s N-koncovou doménou elektroforéza v polyakrylamidovom géli s dodecylsulfátom sodným soľný roztok pufrovaný s Tris variabilný úsek ťažkého reťazca protilátky variabilný úsek ľahkého reťazca protilátky

Vynález je ilustrovaný pomocou príkladov (neobmedzujúcich) uvedených v nasledujúcom texte (vrátane referenčných príkladov), ktorých sa týkajú tiež obrázky 1 až 3.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 ukazuje protinádorovú aktivitu konjugátu protilátka 806. 077-CPG2 v modelovom systéme ADEPT.

Obr. 2 ukazuje mapu plazmidu pCF009.

Obr. 3 ukazuje údaje zo zariadenia BIAcore, ktoré sa týkajú fúzneho proteínu protilátka-B7.1 naviazaného na imobilizovaný CTLA4-Ig, kde plná čiara predstavuje testovanú väzbu a bodkovaná čiara je kontrola.

Pokial nie je uvedené výslovne inak, pre príklady platia nasledujúce údaje.

DNA sa izolovala a purifikovala pomocou súpravy GENECLEAN™ II (Stratech Scientific Ltd. alebo BiolOl Inc.). Táto súprava obsahuje 1) 6M jodid sodný, 2) koncentrovaný roztok chloridu sodného, Tris a EDTA na prípravu premývacieho roztoku soľ/etanol/voda, 3) Glassmilk, t.j. 1,25 ml suspenzie špeciálne pripraveného kremičitanového matrixu vo vode v 1,5 ml ampulke. Je to spôsob purifikácie DNA založený na metóde, ktorú publikovali Vogelstein a Gillespie, 1979 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, 76,, 615). Postup podía súpravy je stručne nasledovný. K jednému dielu objemu pásiku gélu sa pridajú 3 objemy roztoku jodidu sodného zo súpravy. Agaróza sa rozpustí zahriatím zmesi pri 55 °C na 10 minút, potom sa pridá Glassmilk (5 až 10 μΐ), všetko sa dobre premieša a nechá.postáť 10 minút pri teplote miestnosti. Glassmilk sa odstredí v centrifúge a premyje sa 3x s roztokom NEW WASH (0,5 ml) zo súpravy. Premývací pufor sa odstráni z Glassmilk a zvyšok sa ponechá na vzduchu uschnúť. DNA sa eluuje tým, že sa Glassmilk inkubuje 10 minút vo vode (5 až 10 μΐ) pri 55 °C. Centrifugáciou sa získa vodný supernatant obsahujúci eluovanú DNA. Elučné kroky sa môžu zopakovať a supernatanty sa následne spoja.

Kompetentné bunky E. coli DH5a sa získali od firmy Life Technologies Ltd. (kompetentné bunky MAX efficiency DH5a).

Minipreparácie dvojvláknovej plazmidovej DNA sa uskutočnili pomocou súpravy RPM™ DNA Preparation Kit od firmy BIO101 Inc. (katalóg, č. 2070-400) alebo s podobnou súpravou, obsahujúcou alkalický lytický roztok na uvolnenie plazmidovej DNA z bakteriálnych buniek a glassmilk v centrifugačnom filtri pre adsorpciu uvoľnenej DNA, ktorá sa potom eluuje sterilnou vodou alebo roztokom lOmM Tris-HCl, lmM EDTA, pH 7,5.

Použilo sa médium bez séra OPTIMEM™ Reduced Sérum Médium od firmy Gibco BRL, katalóg, č. 31985.

Činidlo LIPOFECTIN™ (Gibco BRL, katalóg, č. 18292-011) je 1:1 (hmotnosť/hmotnostj prípravok katiónového lipidu N-[1-(2,330 dioeoyloxy)propyl]-N,N,N-trimetylamonium-chlorid (DOTMA) a dioleoylfosfatidyletanolamin (DOPE) vo vode filtrovanej cez membránu. Spontánne sa viaže s DNA a vytvára komplexy lipid-DNA (pozri Felgner a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84, 7431) .

G418 (sulfát) je GENETICIN™ (GibcoBRL katalóg, č. 11811), čo je aminoglykozidové antibiotikum príbuzné gentamycínu, ktoré sa používa ako selekčné činidlo v molekulárno-genetických experimentoch.

AMPLITAQ™ je termostabilná DNA polymeráza od firmy PerkinElmer Cetus.

Všeobecné postupy molekulárnej biológie sa uskutočňovali podlá postupov publikovaných v Sambrook, Fritsch a Maniatis: Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Príprava hybridómovej bunkovej línie 806.077

Myši BALB/C staré 8 až 10 týždňov sa subkutánne imunizovali primárnou dávkou CEA (10 pg) v PBS (0,1 ml) a Freundovom úplnom adjuvans. O dva týždne neskôr a ešte znova o ďalšie dva týždne neskôr sa zvieratá stimulovali ďalšími dávkami CEA (10 gg) v PBS (0,1 ml) a Freundovom nekompletnom adjuvans. Po 32 týždňoch sa zvieratá naposledy imunizovali intravenózne dávkou CEA (10 pg) v PBS, a po ďalších troch dňoch sa usmrtili. Vybrali sa sleziny, z ktorých sa pripravené bunky fúzovali s bunkami NSO (získanými z European Collection of Animal Celí Cultures, č. 85110503) štandardným spôsobom (Kohler and Milstein, Náture, 1975, 256,

495). Výsledné bunky sa vysiali na 96-jamkové kultivačné misky a inkubovali 2 týždne. Supernatanty z výsledných hybridómov sa testovali metódou EIA (enzýme imunnoassay). Z celkového počtu 1824 jamiek vzniklo 5 fúzií, 102 jamiek bolo pozitívnych proti natívnemu CEA. Vo fúzii 806 sa zistilo sedemnásť pozitívnych jamiek. Bunky z týchto jamiek sa klonovali konečným riedením a výsledné klony sa testovali EIA. Línie z pôvodných jamiek 10/17 sa úspešne klonovali. Jedna línia, nazvaná 806.077, sa uložila v European Collection of Animal Celí Cultures pod č. 96022936. Nasledujúca tabulka uvádza prehľadne program generácie protilátok, ktorý viedol k vytvoreniu hybridómu 806.077.

Antigén	podmienky	týždne v pokoji	počet fúzii	počet testovaných jamiek	počet CEA* +ve metódou EIA	počet nakoniec vybraných
CEA bez úprav	normálne	8 až 20	28	13920	99	0
desialovaný CEA	normálne	8 až 12	14	5568	12	0
konj ugovaný CEA	normálne	10 až 12	8	3168	1	0
CEA bez úprav	izolátor	viac ako 30	5	1824	102	3

* testované proti CEA bez úprav, desialované imunizácie spôsobovali mnohé +ve, keď sa testovali proti imunogénu

Príklad 2

Príprava protilátky 806.077 z uloženej hybridómovej línie ECACC č. 96022936.

2.1. Príprava z média obsahujúceho sérum

Kryoprezervačná ampula s objemom lml sa vybrala z tekutého dusíka a rýchlo rozmrazila vo vodnom kúpeli s teplotou 37 ’C. Obsah sa aseptický preniesol do sterilnej 15ml centrifugačnej skúmavky. Bunky sa resuspendovali jemným miešaním a pridávaním 10ml kultivačného média po kvapkách, pričom kultivačné médium bolo Eaglove médium modifikované Dulbeccom (DMEM) obsahujúce 10% (objem/objem) fetálneho telacieho séra (FCS). Suspenzia sa 10 minút odstredila pri 50x g a supernatant sa aseptický odstránil a sediment sa resuspendoval v 5 ml DMEM, 10% FCS a 1% L-glutamín v 25ml kultivačných nádobách, ktoré sa dopredu opláchli a naplnili zmesou 95% vzduchu a 5% oxidu uhličitého. Nádoby sa potom inkubovali v tme pri 36,5 ’C.

Po 3 dňoch sa uskutočnila subkultivácia tak, že sa celý obsah nádoby nariedil do 75ml fľašky s médiom DMEM s 10% FCS a 1% L-glutamínom (tak aby výsledná hustota bola 2 až 3xl0⁵buniek/ml). Podobným spôsobom sa uskutočnila ďalšia expanzia do 162ml nádob.

Supernatanty z kultúr na purifikáciu sa pripravili v 500ml rolerových kultúrach v 850ml rolerových fľašiek. Kultúry sa vysiali s hustotou 2xl0⁵ živých buniek/1 ml do rolerových fľašiek dopredu naplnených vzduchom s 5% CO₂, inkubácia potom prebiehala s rotáciou 3 rpm pri teplote 36,5 ’C. Kultúry sa pestovali do zrelosti a zbierali sa typicky 500 až 800 hodín po inokulácii, keď životaschopnosť buniek bola menej ako 10% a koncentrácia IgG dosiahla maximum.

2.2. Ošetrenie kultúr po zbere

Po zbere sa supernatanty z kultúr prečistili pri 60x g 30 minút. Potom sa pridal azid sodný (0,02% (hmotnosť/objem)) ako konzervačná látka a čistý supernatant sa do purifikácie uložil pri 4 °C v tme.

2.3. Purifikácia protilátky 806.077

Supernatant z hybridómu protilátky 806.077 (objem 31) sa upravil na hodnotu pH 7,5 pomocou zriedeného roztoku hydroxidu sodného a potom sa filtroval cez 0,45 pm filter (MILLIDISK™, Millipore). Filtrovaný protilátkový supernatant sa naniesol na afinitnú kolónu s proteínom-G (napr. Protein G Fast Flow Sepharose™, Pharmacia, kat. č. 17.0618.03, vnútorný priemer 5 cm x 6,5 cm = 130 ml), ekvilibrovaný pufrovaným soľným (fyziologickým) roztokom (PBS, 8mM Na2HPO4, l,5mM KH2PO4, 150mM NaCl, 2,5mM KC1, pH 7,3, ktorý je dostupný napr. vo forme tabliet na prípravu roztoku od firmy Oxoid) pri rýchlosti prietoku 4ml/min a teplote 4 ’C. Kolóna sa premyla s PBS (260 ml) s rovnakou prietokovou rýchlosťou a protilátky sa eluovali so lOOmM citrátom sodným pH 2,6 tak, že sa zbierali frakcie a sledovala absorpcia v UV oblasti (280 nm). Frakcie absorbujúce v UV a obsahujúce protilátky sa spojili, pH sa ihneď upravilo na hodnotu pH 7 a ultrafiltráciou sa zakoncentrovali na približne 2 mg/ml pomocou filtračnej membrány s vylučovacím limitom cutoff 30 kDa (napr. Amicon YM30). Výťažok dialýzy pomocou poréznej membrány s vylučovacím limitom 6 kDa (napr. SPECTRAPOR™ YM30) do pufru 50mM Tris-HCl pH 7,0 bol 110 mg protilátky 806.077 s čistotou lepšou ako 95% (stanovenou pomocou SDS-PAGE).

Príklad 3

Selektivita protilátky 806.077

Na hodnotenie selektivity sa testovali mnohé ľudské normálne i nádorové tkanivá na reaktivitu s protilátkou 806.077, a to pomocou citlivého trojstupňového imunohistologického testu na kryostatových zmrazených rezoch fixovaným acetónom.

Imunohistológia sa uskutočňovala na rezoch z ludských tkanív získaných buď chirurgickým odstránením orgánu alebo post mortem. Aby sa zachovala optimálna morfológia a antigenicita, tkanivá sa získavali čo možno najčerstvejšie a narezali sa na malé kúsky (asi 0,5 cm³) a rýchlo sa zmrazili v tekutom dusíku pred uložením na -80 °C.

Sklíčka sa rozmrazili pri teplote miestnosti, kým sa rozbalili z fólie bezprostredne pred použitím. Každý rez sa na sklíčku vyznačil diamantovým opisovačom a ku každému rezu sa pridali 100 μΐ protilátky 806.077 nariedenej na 2 μς/πιΐ vo fyziologickom roztoku pufrovanom Trisom (TBS) alebo 100 μΐ CEA/NCA reaktívnej kontroly (protilátka A5B7) s koncentráciou 2 μg/ml v TBS, alebo 100 μΐ MOPC izotypovej kontroly (Sigma, St. Louis, USA, katalóg, č. 9269) s koncentráciou 2 μς/ιηΐ v TBS, alebo relevantná pozitívna kontrola, ako je napr. LP34 (Dáko). Všetky nasledujúce inkubácie prebiehali pri teplote miestnosti 30 minút vo zvlhčovacej komôrke, všetky oplachovacie kroky sa uskutočnili v TBS s dvoma výmenami. Po inkubácii sa sklíčka opláchli a ku každému rezu sa pridalo 100 μΐ druhého protilátkového činidla, obsahujúceho 1/50 králičieho protimyšacieho imunoglobulínu konjugovaného s chrenovou peroxidázou (Dáko Patts) a 1/5 normálneho ľudského séra (Sigma) v TBS.

Sklíčka sa opäť inkubovali a opláchli s TBS. Ku každému rezu sa pridala koncová detekčná protilátka, t.j. 100 μΐ prasacieho proti-králičieho imunoglobulínu konjugovaného s chrenovou peroxidázou (riedenie 1/50 s 1/5 normálneho ľudského séra v TBS) , sklíčka sa opäť inkubovali a potom sa dôkladne opláchli. Substrát DAB (3,3'-diaminobenzidíntetrahydrochlorid) sa pripravil rozpustením 1 tablety DAB (Sigma) so 17 μΐ peroxidu vodíka v TBS (17 ml) a pridávaním po kvapkách cez rýchly filtračný papier (Whattman č. 4). Po 3 minútovej inkubácii sa zvyšok DAB odstránil zo sklíčok a sklíčka sa opláchli s TBS. Po zafarbení hematoxylinom (napr. Mayerov hematoxvlin, Shandon) sa rezy odvodnili v alkohole a xyléne, a zafixovali sa na sklíčko syntetickou bezvodou montážnou hmotou (napr. E-Z Mountant, Shandon) pred tým ako prehliadali pod mikroskopom.

Miesta naviazania protilátky sa vizualizovali hnedým zafarbením na reze. Na hodnotenie väzby protilátky 806.077 na tkanivá sa použil nasledujúci bodovací systém.

+++ (silná) = protilátka sa viaže k > 75% nádorových buniek ++ (stredná) = protilátka sa viaže k 50% až 75% nádorových buniek + (slabá) = protilátka sa viaže k 25% až 50% nádorových buniek 1/- (minimálne) = väzba protilátky na malé kúsky povrchu nádorových buniek

- = žiadne zafarbenie.

Karcinoembryonálny antigén (CEA) je člen génovej superrodiny imunoglobulínov s jednou predpovedanou oblasťou podobnou variabilnej doméne (N doménou, 108 aminokyselín) a tromi súbormi úsekov podobných konštantnej doméne A1B1, A2B2 a A3B3 (92 aminokyselín v doméne A, 86 aminokyselín v doméne B, Hefta a kol., Cancer Research 52, 5647-5655). Okrem toho CEA obsahuje dva signálne peptidy, jeden na N-konci a jeden na Ckonci. Obidva sú počas posttranslačných úprav odstránené, pričom peptid na karboxylovom konci je nahradený glykozylfosfatidylinozitolovou skupinou (GPI).

Opísalo sa mnoho proteínov podobných CEA s rôznou mierou homológie s CEA (Thomson, 1991, J. of Clinical Laboratory Analysis, 5, 344-366). K nim patria tiež nešpecifický krížovo reagujúce antigény NCA 1 a 2. Tieto príbuzné proteíny sú exprimované v rade normálnych tkanív vrátane granulocytov a normálneho pľúcneho epitelu. Väčšina doteraz pripravených monoklonálnych protilátok anti-CEA reagovala s jedným z týchto proteínov a teda reagovala s radom normálnych tkanív a často reagovala tiež silno s granulocytmi alebo pľúcnym epitelom.

Zistilo sa, že protilátka 806.077 neprejavuje žiadnu krížovú reaktivitu s minimálne zafarbenie (4/14) testovaného tkaniva.

je CEA selektívna, granulocytmi a iba normálneho pľúcneho

Protilátka 806.077 sa na začiatku testovala na nádorovú a NCA selektivitu v supernatante tkanivovej kultúry. Testy sa uskutočňovali s použitím nezriedeného supernatantu a riedením 1:10 a ukazovali zhodnú väzbu protilátky k nádorom hrubého čreva ako A5B7, ale omnoho slabšiu väzbu k normálnemu tkanivu z pľúc a sleziny v porovnaní s rovnakou protilátkou. Protilátka sa afinitne purifikovala (ako je opísané v príklade 2) a skríning sa opakoval, aby zahrňoval aj ďalšie typy tkanív a nádorov.

Protilátka sa titrovala proti celému panelu rezov z kolorektálneho nádoru a tento skríning ukázal, že pre testy optimálna koncentrácia protilátky 806.077 je 2 μρ/ιηΐ. Všetky nasledujúce testy sa uskutočňovali s touto koncentráciou protilátky.

Výsledky testov sú uvedené v nasledujúcom prehľade. Reaktivita protilátky 806.077 sa porovnávala oproti A5B7 (použitá koncentrácia bola takisto 2 μg/ml) v nasledujúcich nádorových a normálnych bunkách.

Reaktivita protilátky 806.077 v tkanivách z nádorov

Nádory hrubého čreva (n=17) :

Mierna až silná reaktivita (++/+++ zhodná s A5B7) pozorovaná vo všetkých 17 testovaných nádoroch.

Nádory prsníka (n=6)

Stredne až silné zafarbenie (+/++) 2/6 nádorov, minimálne zafarbenie (+/-) 2/6 nádorov.

Nádory NSCLC (n=6):

Silné zafarbenie (+++) 1/2 nádorov, stredné zafarbenie (++) 1/6 nádorov a slabé zafarbenie (+) 2/6 nádorov.

Nádory žalúdka (n=2):

Silné zafarbenie (+++) 1/2 nádorov a slabé zafarbenie ( + ) 1/2 nádorov.

Nádory vaječníkov (n=3) a prostaty (n=3):

Žiadne zafarbenie sa nepozorovalo pri týchto nádoroch, vo všetkých prípadoch sa pozorovala rovnaká reaktivita s A5B7.

Reaktivita v normálnych tkanivách

Plúca (reaktivita NCA) (n=14):

Slabé zafarbenie (+) 4/14 tkanív, žiadne zafarbenie (-) 10/14 tkanív, protilátka A5B7 sa viazala stredne (++) v 1/14 pľúcnych tkanív, slabo (+) v 10/14 tkanív a minimálne (+/-) v 1/14 tkanív.

Slezina (reaktivita granulocyty/NCA) (n=6) :

Nepozorovalo sa žiadne zafarbenie v testovaných tkanivách, protilátka A5B7 sa viazala stredne (++) v 1/6 tkanív a slabo (+) v 5/6 tkanív.

Normálne tkanivá post mortem (n=13) :

Stredná až slabá reaktivita (++/+) sa pozorovala iba v tkanivách pažeráku, kože, hrubého čreva a pankreasu (normálne tkanivá exprimu'júce CEA) , podobná väzba sa pozorovala s protilátkou A5B7. Okrem pozitívnych tkanív hrubého čreva, kože, pažeráka a pankreasu boli ostatné tkanivá mozočku, stredného mozgu, mozgu, hladkého svalstva, pečene, obličiek, aorty, žalúdku a srdca negatívne.

Príklad 4

Príprava fragmentu F(ab') protilátky 806.077

Ficín (10 mg) sa resuspendoval v roztoku 50mM cysteínu (3ml, BHD 37218) a 50mM Tris-HCI, pH 7,0 a inkuboval 30 minút pri 37 ’C. Prebytočný cysteín sa odstránil vytesňovacou chromatograf iou (kolóna Sephadex™ G-25, 1,25 cm x 25 cm,

Pharmacia) v pufri 50mM Tris-HCI pH 7,0. Znížená koncentrácia ficínu sa určila monitorovaním absorbancie v UV pri 280 nm (za predpokladu, že roztok s koncentráciou 1 mg/ml má absorbanciu 2 v 1 cm kyvete) a stanovila sa na 1,65 mg/ml.

Roztok protilátky 806.077 (100 mg) v 50mM Tris-HCI, pH 7,0 (50 ml) a čerstvo redukovaný ficín (5 mg, 3 ml uvedeného roztoku) sa štiepil 20 minút pri 37 ’C. Po štiepení sa roztok nariedil rovnakým objemom PBS a naniesol na afinitnú kolónu s proteínom-G (Pharmacia SEPHAROSE™ Fast Flow, 5 cm vnútorný priemer x 6,5 cm = 125 ml, pred použitím ekvilibrovaný s pufrom s 50mM Tris-HCI, pH 7,0 pri 4 ’C), s konštantným prietokom 3 ml/min. Kolóna sa premyla s 50mM octanom sodný, pH 4,0 (250 ml), aby sa odstránili nízkomolekulové fragmenty, potom sa prepláchla s 50mM citrátom sodným, pH 2,8, aby sa eluovali fragmenty F(ab'), pričom sa sledovala UV absorbancia pri 280 nm. Eluát obsahujúci F(ab') sa nastavil na pH 7,0 a pufor sa vymenil dialýzou do roztoku lOOmM fosfát sodný/lOOmM chlorid sodný/ImM EDTA, pH 7,2 a zakoncentroval sa membránovou filtráciou na 8mg/ml pomocou 10 kDa cut-off filtra (napr. Amicon™ YM10), za predpokladu, že roztok s koncentráciou 1 mg/ml má absorbanciu 1,4 pri 280 nm v 1 cm kyvete. Dosiahol sa 65% výťažok, ktorý prestavuje 42 mg F(ab') s 95% čistotou.

Príklad 5

Príprava konjugátu F(ab')₂ protilátky 806.077 - karboxypeptidáza G2

Spojkou na derivovanie F(ab')₂ protilátky 806.077 bol SATA (N-hydroxysukcinylimidestér kyseliny S-acetyltioglykolovej, Sigma, kat. č. A 9043). Spojkou na derivovanie karboxypeptidázy

G2 (CPG2) bola SMPB (N-hydroxysukcinylimidester kyseliny 4-(pmaleinylimidofenyl) maslovej, Sigma, kat. č. M6139) .

5.1. Derivovanie F(ab')₂

K roztoku fragmentu F(ab')₂ (40 mg, pripravený postupom opísaným v príklade 4) v lOOmM fosfát/lOOmM NaCl/lmM EDTA, pH

7.2 (pufor A, 5 ml) sa pridal SATA (0,28 mg) v DMSO (28 μΐ) . PO 40 minútach pri teplote miestnosti sa výsledný roztok naniesol na odsolovaciu kolónu (SEPHADEX™ G-25, 15 cm vnútorný priemer x 50 cm = 100 ml, ekvilibrovaný v pufri A pri 4 ’C) s prietokom

1.2 ml/min, aby sa odstránili prebytočné reagencie. Eluát sa sledoval meraním UV absorpcie pri 280 nm. F(ab')₂ derivované so SATA sa spojili a zmiešali s 10% (objem/objem) 500mM hydroxylamín HCl/500mM fosfát sodný/30mM EDTA, pH 8,8 pri teplote miestnosti na 60 minút, aby sa deacetyloval derivovaný F(ab')₂. Koncentrácia proteínu sa stanovila meraním UV absorbancie pri 280 nm za predpokladu, že roztok s koncentráciou lmg/ml má absorbanciu 1,4 v 1 cm kyvete. Roztok sa nariedil na približne lmg/ml s pufrom A. Množstvo spojovacej zlúčeniny sa určilo SH skúškou podľa Ellmana a stanovilo sa na 1,8 až 2 mol· spojovacej zlúčeniny/ mol F(ab')₂.

5.2. Derivovanie CPG2

Purifikáciu CPG2 z Pseudomonas RS-16 vo veľkej škále opísali Sherwood a kol., 1985, Eur. J. Biochem. 148, 447-453. Príprava F(ab')₂ a IgG protilátok konjugovaných s enzýmom CPG sa môže ovplyvniť známymi prostriedkami a.opísala sa napr. v PCT/WO 89/10140. CPG možno získať z Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 0JG, Veľká Británia. CPG2 sa môže získať tiež rekombinantnými technikami. Nukleotidovú sekvenciu pre CPG2 publikoval Minton, N.P. a kol., Gene, 1984, 31, 31-38. Expresia kódujúcej sekvencie CPG2 v E. coli sa opísala (Chambers, S.P. a kol., Appl. Microbiol.

Biotechnol., 1988, 29, 572-578) a v Saccharomyces cerevisiae (Čiarke, L.E a kol., J. Gen. Microbiol., 1985, 131, 897-904).

Celkovú syntézu génov opísal Edwards, M., Am. Biotech. Lab., 1987, 5, 38-44. Expresiu heterologických proteínov v E. coli opísali v prehlade Marston, F.A.O., DNA Cloning, Vol. III, Practical Approach Šerieš, IRL Press (editor D..M. Glover) , 1987, 59-88. Expresia proteínov v kvasinkách je opísaná v Methods in Enzymology, Vol. 194, Academic Press 1991, ed. C.Guthrie a G.R. Fink.

Enzým CPG je dostupný od firmy SIGMA Chemical Company, Fancy Road, Poole, Dorset, Veľká Británia. Enzým CPG opísal Goldman, P., Levy, C.C., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 58: 12991306, 1967 a tiež Levy, C.C. a Goldman, P.J., J. Biol.' Chem.

242: 2933-2938, 1967. Enzým karboxypeptidázu opísali Yasuda, N.

a kol., Biosci. Biotech. Biochem. 56: 1536-1540. Enzým karboxypeptidáza G2 bol opísaný v Európskej patentovej prihláške 121 352.

CPG2 (50 mg, rekombinantný enzým z E. coli) sa dialyzoval do lOOmM fosfát sodný/lOOmM NaCl pH 7,2 (= pufor B) a nariedil sa na 8 mg/ml, za predpokladu, že roztok s koncentráciou 1 mg/ml má absorbanciu pri 280 nm 0,6 v 1 cm kyvete.

SMPB (Sigma) sa rozpustila v DMNO do výslednej koncentrácie 10 mg/ml. CPG2 (50 mg v pufri B s koncentráciou 8 mg/ml) sa potom zmiešala s roztokom SMPB (0,108 ml, 1,08 g) a 120 minút reagovala pri teplote miestnosti. Výsledný roztok sa naniesol na odsolovaciu kolónu (SEPHADEX™ G-25, 15 cm vnútorný priemer x 50 cm = 100 ml, ekvilibrovaný v pufri B pri 4 °C) s prietokom 1,2 ml/min, aby sa odstránili prebytočné reagencie. Derivované CPG2 sa spojili a stanovila sa koncentrácia meraním UV absorpcie pri 280 nm za predpokladu, že roztok s koncentráciou 1 mg/ml má absorbanciu 0,6 v 1 cm kyvete. Množstvo spojovacej zlúčeniny sa určilo reverznou SH Ellmanovou skúškou na nezreagované SH skupiny pridaním známeho množstva 2-merkaptoetanolu k maleinylimidoderivovanej CPG2. Stanovilo sa na 2 až 2,4 mol spojovacej zlúčeniny /mol CPG2.

5.3. Konjugácia

Rovnaké hmotnosti deacetylovaného a derivovaného F(ab')₂ a derivovanej CPG2 sa zmiešali v atmosfére dusíka a zmes (asi 80 ml, celková koncentrácia proteínu asi 1 mg/ml) sa ponechala 20 hodín reagovať pri teplote miestnosti. Reakcia sa zastavila pridaním 10% (objem/objem) vodného lOmM glycínu. Zmes hrubého konjugátu sa dialyzovala do pufru s nízkym obsahom soli (50mM octan sodný pH 6,0) a potom sa naniesla na afinitnú kolónu s farbivom a ligandom (pričom farbivo sa viaže na CPG2, napr. ACL Mimetic Green 1,25 cm vnútorný priemer x 10 cm = 50 ml) pri 4 ’C ekvilibrovanou rovnakým pufrom, aby sa odstránili nezreagované derivované F(ab')₂. Konjugát a derivované CPG2 sa eluovali zmesou 50mM octan/500mM NaCl pH 6,0 s prietokom 2,0 ml/min a elúcia sa sledovala UV detekciou (280 nm) .

Hrubý konjugát, ktorý stále ešte obsahuje derivovanú CPG2, sa koncentroval pomocou ultrafiltračného zariadenia s 10 kDA cut-off filtrom (napr. Amicon YM10™) asi na objem 12 ml s koncentráciou celkového proteínu 5 mg/ml a pridal sa 10% (objem/objem) lOmM síran zinočnatý vo vode (Sigma Z0251), aby sa doplnila strata zinku v CPG2 v priebehu celej procedúry. Následná chromatografia (napr. SEPHACRYL S-300HR™, Pharmacia, 2,5 cm vnútorný priemer x 25 cm = 500 ml) pri 4 °C v 50mM octan sodný/150mM NaCl pH 6,0 pri prietoku 1 ml/min, zber frakcií a monitorovanie v UV pri 280 nm umožnila frakcionáciu konjugátu a separáciu nezreagovanej derivovanej CPG2, čo sa. určilo SDS-PAGE elektroforézou frakcií z kolóny. Frakcie zodpovedajúce vrcholu konjugátu (s pomerom F(ab')₂:CPG2 1:1, 1:2 a 2:1) sa spojili a koncentrovali ultrafiltráciou na 1,3 mg/ml, pričom koncentrácia proteínu sa stanovila monitorovaním UV absorbancie pri 280 nm (za predpokladu, že 1 mg/ml má absorbanciu 1,0). Čistota konjugátu sa stanovila SDS-PAGE a zistilo sa, že celkové množstvo konjugátu 12 mg malo zloženie: 65% konjugátu s pomerom 1:1, 2 0% konjugátu s pomerom 1:2 alebo 2:1 <5% voľných derivovaných F(ab')₂ a <5% voľnej derivovanej CPG2.

Príklad 6

Protinádorová aktivita konjugátu F(ab')₂ protilátky 806.077 karboxypeptidáza G2 kombinovaného s predliekom

Protinádorová aktivita konjugátu F(ab')₂ protilátky 806.077 - karboxypeptidáza G2 pripraveného postupom podľa príkladu 5 sa hodnotila v kombinácii s predliekom N(4-[N,N-bis(2chloretyl)amino]-fenoxykarbonyl)-L-glutámovou kyselinou (skrátene PGP v tomto príklade, je opísaná v príklade 1 patentu US 5 405 990 a v Blakey a kol., Br. J. Cancer 72, 1038-1088,

1995) na modeli xenoštepu ľudského kolorektálneho nádoru.

Skupiny 8 až 10 samíc nahých beztýmusových myší sa injikovali dávkou 1 x 10⁷ buniek kolorektálneho nádoru LoVo (ECACC č. 87060101) . Ak mali nádory veľkosť 4 až 5 mm v priemere, intravenózne sa injikoval buď konjugát F(ab')₂protilátky 806.077 - karboxypeptidáza G2 (250 U enzýmovej aktivity CPG/kg) alebo PBS (soľný roztok pufrovaný fosfátom, 170mM NaCl, 3,4mM KC1, 12mM Na₂HPO₄, l,8mM KH₂PO₄, pH 7,2). PO 72 hodinách sa i.p. injikoval predliek PGP (3 dávky 40mg/kg v 1 hodinových intervaloch). Priemer nádoru v dvoch smeroch sa meral trikrát týždenne a vypočítal sa objem nádoru podľa vzorca: objem = π/6 x D² x d kde D je väčší priemer a d je menší priemer. Objem nádoru sa potom vyjadril relatívne k objemu nádoru na počiatku terapie s predliekom. Protinádorová aktivita sa porovnala s kontrolnými skupinami, ktorým sa podal PBS namiesto predlieku alebo konjugátu. Protinádorová aktivita sa vyjadrila ako oneskorenie rastu definované ako čas, ktorý je potrebný na 4 násobný nárast objemu liečeného nádoru bez času, ktorý je na to isté potrebuje kontrolný nádor a tiež ako T/C hodnota, definovaná ako objem liečeného nádoru delený objemom kontrolného nádoru 14 dní po podaní predlieku. Štatistická významnosť protinádorového pôsobenia sa hodnotila pomocou analýzy variácie (jednostrannej).

Protinádorová aktivita konjugátu F(ab')₂ protilátky 806.077 - karboxypeptidáza G2 kombinovaného s predliekom PGP je uvedená na obr. 1 a údaje zhrňujúce protinádorové pôsobenie sú uvedené v nasledujúcej tabuľke.

Konjugát	Dávka (U/kg)	T/C (%)	oneskorenie rastu (dni)	významnosť (P) .
806.077 F(ab')₂ - CPG2	250	16, 5	14	<0, 01
	500	4,7	22	<0, 01

Výsledky ukazujú, že konjugát F(ab')₂ protilátky 806.077 karboxypeptidáza G2 kombinovaný s predliekom PGP spôsobuje regresiu nádoru a predlžuje rastové oneskorenie, pričom tieto rozdiely sú štatisticky významné v porovnaní s kontrolnými skupinami.

Príklad 7

Klonovanie a sekvenovanie variabilných úsekov génov ťažkého a ľahkého reťazca 806.077.

7.1 Príprava RNA z cytoplazmy

Existuje niekoľko postupov na izoláciu polyA+mRNA z eukaryotických buniek (Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Second Edition, 1989, kapitola 8, str. 3). V tomto konkrétnom prípade sa RNA z cytoplazmy pripravila zo sedimentov zamrazených hybridómových buniek obsahujúcich 1 x 10⁹ buniek uchovávaných pri -80 ’C postupom, ktorý opísali Favoloro a kol., Methods in Enzymology 65, 718-749.

Bunky sa resuspendovali v 5 ml ľadovo vychladeného lytického pufru (140mM NaCl, l,5mM MgCl₂, lOmM Tris-HCl, pH 8,6 a 0,5% NP40 (neiónový detergent polyglykoléter, nonylfenoxypolyetoxyetanol, Sigma, katalóg. č. 127087-87-0)) obsahujúceho 400 U inhibítoru ribonukleázy (RNAguard, Pharmacia, katalóg, č. 27-0815-01) a 10 minút sa pretrepali na vortexe. Tento roztok sa prevrstvil rovnakým objemom ľadového lytického pufru obsahujúceho 24% (hmotnosť/objem) sacharózy a 1% NP-4% a ochladil sa 5 min na lade. Potom sa odstredil 30 minút pri 4000 rpm a 4 ’C v stolnej centrifúge (Sorval RT6000B), vrchná cytoplazmatická fáza sa odstránila a premiestnila do rovnakého objemu pufru 2xPK (200mM Tris-HCl, pH 7,5, 25mM EDTA, 300mM NaCl a 2% (hmotnosť/objem) SDS. Proteináza K (Sigma katalóg, č. P2308) sa pridala do výslednej koncentrácie 200 gg/ml a 'zmes sa potom inkubovala 30 minút pri 37 ’C.

Preparát sa ďalej extrahoval zmesou rovnakého objemu fenolu a chloroformu, odobrala sa vodná fáza, pridal sa k nej 2,5 x násobok objemu etanolu a premiešala sa. Tento roztok sa uchoval cez noc na -20 ’C. RNA sa potom získala odstredeným (4000 rpm, 30 minút, 4 °C, stolná centrifúga, Sorval RT6000B), supernatant sa odstránil a sediment sa vysušil vo vákuovom desikátore a 250 μΐ vody opracovanej s pripravenej podlá Sambrook, J., Molecular Cloning: A Laboratory

Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Second Edition, 1989. Obsah RNA sa stanovil a koncentrácia sa vypočítala za predpokladu, že absorbancia 1 pri 260nm zodpovedá koncentrácii 40 μg/ml.

potom sa rozpustil v dietylpyrokarbonátom (DEPC) Fritsch, E.F., Maniatis, T,

7.2. Príprava prvého reťazca variabilného úseku cDNA

Rad metód na syntézu cDNA prehľadne uvádza Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Second Edition, 1989 (kapitola 8) . Oligonukleotidové primery boli prevažne na základe tých, ktoré navrhol Marks a kol., Mol. Biol., 1991, 222, 581-597. cDNA sa v tomto konkrétnom prípade pripravila nasledujúcim postupom.

RNA (5 mg) sa v mikroskúmavke zmiešala s 10 μΐ 5x pufru pre reverznú transkriptázu (250mM Tris-HCl, pH 8,3, 40mM MgCl₂ a 50mM DTT) Ιμΐ predného primeru (25pM), 10 μΐ l,25mM zmesi všetkých dNTP, 5 μΐ lOmM DTT, 0,5μ1 RNAguard (Pharmacia) a doplnila sa vodou ošetrenou DEPC na celkový objem 50 μΐ. Reakčná zmes sa zahriala na 10 minút na 70 °C a potom sa pomaly ochladila na 37 ’C, potom sa pridalo 100 U (0,5 μΐ) reverznej transkriptázy M-MLV (Pharmacia, katalóg, č. 27-0925-01) a reakčná zmes sa inkubovala 1 hodinu pri 37 °C. Predný primer tu použitý na vytvorenie cDNA ľahkého reťazca bol oligonukleotid CK2FOR (sekvencia SEQ ID NO: 1), ktorý je navrhnutý tak, aby hybridizoval s konštantným úsekom CK génu pre lahký kappa reťazec myši. Pre cDNA ťažkého reťazca sa použil predný primer CG1FOR (sekvencia SEQ ID NO: 2), ktorý hybridizuje s konštantnou doménou CH1 myšacieho IgGl.

7.3. Sekvenovanie aminokyselín

Ťažký a lahký reťazec protilátky 806.077 sa izolovali pomocou SDS-PAGE a western prenosom a potom sa sekvenovali ich N-koncové aminokyseliny. Výsledky ukázali, že N-koniec ľahkého reťazca bol chemicky blokovaný, avšak sekvenčné údaje sa získali pre prvých 34 aminokyselinových zvyškov N-konca ťažkého reťazca (sekvencia SEQ ID NO: 7).

7.4. Izolácia fragmentov protilátok metódou PCR

Izolácia génov variabilných úsekov ťažkého a ľahkého reťazca protilátky 806.077 sa uskutočnila pomocou cDNA izolovanej ako sa opísalo v predchádzajúcom texte, ktorá sa použila ako templát. Všeobecne reakčné podmienky boli také, ako je uvedené v nasledujúcom odseku.

K 5 μΐ reakčnej zmesi cDNA sa pridalo 5 μΐ lOx enzýmového pufru (500mM KCl, lOOmM Tris-HCl, pH 8,3, 15mM MgC12 a 0,1% želatína) , 1 μΐ spätného priméru 25ρπιο1/μ1, 1 μΐ predného priméru 25ριηο1/μ1, 0,5 μΐ termostabilnej DNA polymerázy a objem sa doplnil na 50 μΐ vodou opracovanou s DEPC. Podmienky pre PCR boli: 25 cyklov 94 °C, 90 s, 55 °C, 60 s, 72 °C 120 s a posledný cyklus sa ukončil inkubáciou ďalších 10 minút pri 72 ’C.

V uvedených reakčných podmienkach sa na prípravu cDNA ľahkého reťazca použil oligonukleotid CK2FOR (sekvencia SEQ ID NO: 1) a pre cDNA ťažkého reťazca oligonukleotid CG1FOR (sekvencia SEQ ID NO: 7). Uskutočnilo sa mnoho reakcií s rôznymi spätnými primermi pre ťažké a ľahké reťazce, aby sa získal špecifický PCR produkt.

V prípade ľahkého reťazca protilátky 806.077 sa špecifické produkty získali so spätným primérom VKlback (sekvencia SEQ ID NO: 4) a VK4back (sekvencia SEQ ID NO: 5) . Podobne pre ťažký reťazec sa špecifické PCR produkty získali pomocou primérov VHlback (sekvencia SEQ ID NO: 6) a SPlback (sekvencia SEQ ID NO: 7). Produkty reakcie sa analyzovali na 2% agarózovom géli. Produkty s očakávanou dĺžkou sa vyrezali a DNA sa purifikovala.

7.5. Klonovanie PCR produktov do vektora Bluescript KS+

Do každého fragmentu protilátky sa pomocou oligonukleotidov vniesli reštrikčné miesta, a to tak do 5'-konca (spätný primer) ako aj do 3'-konca (predný primer). Samostatné produkty PCR tak z VH ako aj z VK PCR sa môžu klonovať do vektora Bluescript KS+ (Stratagene Cloning Systems) prostredníctvom vhodných reštrikčných miest a s použitím štandardných metód na manipuláciu s DNA (napr. PCR produkt VHlback/CGlFOR sa klonoval prostredníctvom Pstl/HindlII a VK4back/CK2FOR prostredníctvom SacI/HindlII). Zo získaných klonov sa pripravila DNA a pre každú konštrukciu sa sekvenovala DNA aspoň z 12 klonov pomocou automatického fluorescenčného sekvenovacieho zariadenia (Applied Biosystems). Sekvencie sa ďalej spracovali a porovnali pomocou vhodného počítačového softvéru. Získali sa súhlasné sekvencie génov VH a VK a preložili sa do zodpovedajúcich aminokyselinových sekvencií.

Sekvencia DNA a aminokyselinová sekvencia variabilného úseku ľahkého reťazca (VK) protilátky 806.077 sú tu uvedené ako sekvencie SEQ ID NO: 8 a NO: 9. Sekvencie DNA a aminokyselinové sekvencie variabilného úseku ťažkého reťazca (VH) protilátky 806.077 sú tu uvedené ako sekvencie SEQ ID NO: 10 a NO: 11. Kloň obsahujúci ľahký reťazec sa označil VK4 a kloň obsahujúci ťažký reťazec sa označil VH14A.

Príklad 8

Konštrukcia chimérnych génov ľahkého a ťažkého reťazca Fd

Gény ťažkého a ľahkého reťazca, ktoré sa klonovali do vektora Bluescript (VK4 a VH14A v príklade 7) sa izolovali pomocou PCR s primermi, ktoré umožnili špecifickú amplifikáciu iba variabilných úsekov príslušných génov a pritom vniesli nové jedinečné reštrikčné miesta. Tieto reštrikčné miesta umožnili to, že fragmenty génov variabilných úsekov sa klonovali v čítacom rámci s fragmentmi DNA kódujúcimi vhodné signálne sekvencie a sekvencie ľudských konštantných úsekov. Signálne sekvencie a sekvencie ľudských konštantných úsekov ťažkého a ľahkého reťazca Fd sa už skôr klonovali do pNG3 a pNG4, čo sú deriváty eukaryotického plazmidového expresného vektora pSG5.

Vektor pNG3 sa pripravil nasledovným spôsobom. Plazmid pSG5 (Stratagene, katalóg, č. 216201) sa naštiepil so Sali a Xbal, aby sa odstránili sekvencie promótora SV40 a polylinkera (viacnásobného klonovacieho miesta). Nový polylinker sa vniesol pomocou oligonukleotidov tu uvedených ako sekvencie SEQ ID NO: 34 a 35, ktoré sa hybridizovali a klonovali do plazmidu pSG5 naštiepeného enzýmami Sali a Xbal, čim vznikol plazmid pNGl. Plazmid pNGl sa štiepil s BglI a HindlII a promótorový BglIHindlII fragment CMV z pcDNA3 (Invitrogen, katalóg, č. V790-20) sa klonoval do tohto miesta, čím vznikol plazmid pNG2. Nakoniec sa izoloval úsek polyA z pSG5 pomocou PCR, ako je opísané v príklade 7 (odsek 7.4), ale pomocou oligonukleotidu so sekvenciou SEQ ID NO: 36 a NO: 37 a plazmidu pSG5. Produkt PCR sa štiepil s Xmal a. BamHI, purifikoval sa elektroforézou v 2% agarózovom géli, izoloval (napr. GENECLEAN, pozri príklad 7) a potom sa ligoval do plazmidu pNG2 štiepeného Xmal-BamHI, čím vznikol pNG3.

Vektor pNG4 sa pripravil nasledovným spôsobom. Vektor pNG3 sa ďalej modifikoval tak, že reštrikčné miesto Sací v klonovanom promótorovom fragmente CMV sa narušilo zmenou DNA sekvencie. Dosiahlo sa to s použitím dvojstupňovej PCR mutagenézy s vektorom pNG3 ako templátom. V PCR sa použili dve komplementárne oligonukleotidové primery (sekvencie SEQ ID NO: 38 a NO: 39) , aby sa mutovali Sací rozpoznávacie sekvencie a ďalej dvoch vonkajších primerov (sekvencie SEQ ID NO: 40 a NO: 41) na vlastnú amplifikáciu produktu. Dva páry primerov (sekvencie SEQ ID NO: 38 a NO: 41 a sekvencie SEQ ID NO: 39 a NO: 40) sa použili v štandardnej PCR na získanie 2 počiatočných PCR produktov, ktoré sa izolovali elektroforézou v 2% agarózovom géli. Ekvimolárne množstvo každého produktu sa zmiešalo a uskutočnila reamplifikácia pomocou vonkajších primerov (sekvencie SEQ ID NO: 40 a NO: 41) za štandardných podmienok PCR, aby sa spojil a amplifikoval výsledný produkt PCR. Tento produkt sa potom štiepil s reštrikčnými enzýmami Ncol a HindlII a klonoval do vhodne naštiepeného a pripraveného vektora pNG3, takže mutovaný fragment (bez Sací miesta) nahradil pôvodný Ncol49

HindlII fragment (plus Sací miesto) z pNG3. Tento nový vektor sa nazval pNG4.

Kloň myšacieho ľahkého reťazca protilátky 806.077 vo vektore Bluescript KS+ (VK4) sa použil na amplifikáciu pomocou primérov 077VK-UP (sekvencia SEQ ID NO: 12) a 077VK-DOWN (sekvencia SEQ ID NO: 13) . Podobne sa použil kloň ťažkého reťazca protilátky 806.077 (VH14A) na amplifikáciu pomocou primérov 077VH-UP (sekvencia SEQ ID NO: 14) a 077VH-DOWN (sekvencia SEQ ID NO: 15). PCR sa uskutočnila nasledovným spôsobom: k 100 ng plazmidovej DNA sa pridalo 5 μΐ zmesi všetkých dNTP (2,5mM), 5 μΐ lOx enzýmového pufru (pozri vyššie), 1 μΐ spätného priméru 25ριηο1/μ1, 1 μΐ predného priméru 25ρπιο1/μ1, 0,5 μΐ termostabilnej DNA polymerázy a objem sa doplnil na 50 μΐ vodou opracovanou s DEPO. Podmienky pre PCR boli: 15 cyklov 94 ’C, 90 s, 55 °C, 60s, 72 ’C, 120s a posledný cyklus sa ukončil ďalšou 10 min. inkubáciou pri 72 ’C. Produkty sa analyzovali elektroforézou na 2% agarózovom géli. DNA sa purifikovala a fragmenty DNA sa vyštiepili zodpovedajúcimi reštrikčnými enzýmami a pripravili sa na následné klonovanie.

Pre sekréciu ľahkého reťazca protilátky sa navrhla kazeta dvojvláknovej DNA obsahujúca tak Kozákovu rozpoznávaciu sekvenciu ako aj signálnu sekvenciu ľahkého reťazca. Kazeta obsahovala dva individuálne oligonukleotidy (sekvencie SEQ ID NO: 42 a NO: 43) , ktoré sa hybridizovali a potom sa klonovali medzi reštrikčné miesta HindlII a Sací plazmidu pNG3 (ktorý sa vhodným spôsobom naštiepil a izoloval sa štandardným spôsobom)_raby sa vytvoril vektor pNG3-Vkss. Sekvencia DNA tu uvedená ako sekvencia SEQ ID NO: 46, ktorá obsahuje sekvenciu konštantného úseku ľudského ľahkého reťazca kappa, sa naštiepila s Xmal a Xhol a vložila sa do pNG-Vkss naštiepeného s Xhol a Xmal, čim vznikol vektor pNG3-Vkss-HuCk (NCIMB č. 40798).

Ďalej sa do pNG3-Vkss-HuCk klonovala génová expresná kazeta pre rezistenciu voči neomycinu (z vektora pSG5-Neo, ktorý je variantom pSG3 a získal sa do S. Greena, Zeneca Pharmaceuticals, alternatívnym zdrojom je napr. pMClneo, Stratagene, kat. č. 213201) . Génová expresná kazeta pre rezistenciu voči neomycinu sa klonovala ako Xbal fragment do Xbal miesta pNG3-Vkss-HuCk a orientácia sa overila štiepením s reštrikčnými enzýmami. Tak vznikol plazmid pNG3-Vkss-HuCk-neo (NCIMB 40799).

Sekvencie ľahkého reťazca, opísané v predchádzajúcom texte, sa klonovaním vložili, v zhode s čítacím rámcom, priamo medzi Sací a Xhol miesta vektora pNG3-Vkss-HuCk-neo. Fragment PCR, získaný pre gén ľahkého reťazca, sa naštiepil s reštrikčnými enzýmami Sací a Xhol a klonoval do podobne naštiepeného expresného vektora obsahujúceho signálnu sekvenciu VK a kódujúcu sekvenciu konštantného úseku HuCK. Vytvorená chimérna sekvencia ľahkého reťazca protilátky 806.077 je tu uvedená ako sekvencie SEQ ID NO: 16 a NO: 17.

Podobne pre sekréciu ťažkého reťazca protilátky sa navrhla kazeta dvojvláknovej DNA obsahujúcej tak Kozákovu rozpoznávaciu sekvenciu ako aj signálnu sekvenciu ťažkého reťazca. Kazeta obsahovala dva individuálne oligonukleotidy (sekvencie SEQ ID NO: 44 a NO: 45), ktoré sa hybridizovali a potom sa klonovali medzi reštrikčné miesta HindlII a EcoRI plazmidu pNG4 (ktorý sa vhodným spôsobom naštiepil a izoloval štandardným spôsobom), aby sa vytvoril vektor pNG4-VHss.

Sekvencie génu ťažkého reťazca sa potom klonovaním priamo vložili, v zhode s čítacím rámcom, medzi EcoRI a Sací miesta vektora pNG4-VHss. Sekvencia DNA uvedená tu ako sekvencia SEQ ID NO: 47 obsahujúca kódujúcu sekvenciu konštantného úseku ľudského ťažkého reťazca IgG2CHľ (sekvencie SEQ ID NO: 22 a NO: 23) sa naštiepila so Sací a Xmal a klonovala do vektora pNG4-VHss štiepeného Sací a Xmal, čím vznikol vektor pNG4-VHss-HuIgG2CHl’ (NCIMB č. 40797).

Fragment PCR získaný pre gén ťažkého reťazca sa naštiepil s reštrikčnými enzýmami EcoRI a Sací a klonoval do podobne naštiepeného expresného vektora obsahujúceho signálnu sekvenciu VH a konštantného úseku HuIgG2CHľ. Vytvorená reťazca HuIgG2 Fd protilátky 806.077 je tu uvedená ako sekvencie SEQ ID NO: 18 a NO: 19.

pNG4-VHss-HuIgG2CHľ kódujúcu sekvenciu chimérna sekvencia

V niektorých prípadoch sa môžu výhodne použiť iné triedy chimérnych konštrukcií ťažkého reťazca Fd. Na tento účel sa vytvorili varianty vektorov ťažkého reťazca obsahujúce HuIgGlCHľ (sekvencie SEQ ID NO: 20 a NO: 21) alebo obsahujúce HuIgG3CHľ (sekvencie SEQ ID NO: 24 a NO: 25), ktoré nahradzujú gén HuIgG2CHľ (sekvencie SEQ ID NO: 22 a NO: 23) .

Sekvencie uvedené tu ako sekvencie SEQ ID NO: 46 a NO: 47 sa získali rôznymi postupmi, ktoré publikovali Edwards, 1987, Am. Biotech. Lab., 5, 38-44, Jayaraman a kol., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 4084-4088, Foguet a Lubbert, 1992, Biotechniques, 13, 674-675, a Pierce, 1994, Biotechniques 16,

708. Výhodne sa sekvencie SEQ ID NO: 46 a NO: 47 pripravia pomocou PCR podobnej tej, ktorú opísali Jayaraman a kol., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 4084-4088.

Keď sa skonštruovali jednotlivé sekvencie ťažkého a ľahkého reťazca, expresná kazeta ťažkého reťazca Fd, vrátane promótora a génu, sa vystrihla ako BglII/Sall fragment a klonovala sa medzi BglII a Sali miesta vektora ľahkého reťazca, aby sa vytvorila ko-expresná vektorová konštrukcia. Táto konštrukcia sa transfekovala do myelómových buniek NSO (ECACC č. 85110503) štandardným spôsobom elektroporáciou a transfekované bunky sa potom selektovali na základe rezistencie voči G418, čo je znak nesený plazmidovou konštrukciou ako selektovatelný marker.

Úplné gény ťažkého reťazca Fd a ľahkého reťazca sa môžu alternatívne jednoducho vystrihnúť z príslušných vektorov ako HindlII/Xmal fragmenty a potom klonovať do iných expresných vektorových systémov.

Príklad 9

Hybridizačný test variantov špecifických sekvencií nukleovej kyseliny

9.1. Hybridizačný test

Opísaný je spôsob detekcie variantných nukleových kyselín obsahujúcich sekvencie príbuzné so špecifickými sekvenciami protilátky 806.077. Variantné nukleové kyseliny môžu byť prítomné v rôznych formách ako je DNA z bakteriálnych kolónií alebo DNA/RNA z eukaryotických buniek fixovaných na membránu ako sa opísalo v predchádzajúcom texte týkajúcom sa skríningu cDNA knižnice alebo ako fragmenty purifikovanej nukleovej kyseliny separované gélovou elektroforézou a prenesené na vhodnú membránu ako sa používa v northern hybridizačnom prenose (pozri Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Second Edition, 1989, kapitola 9, str. 31).

9.2. Hybridizačná sonda

Hybridizačné sondy sa môžu vytvoriť z akéhokolvek fragmentu DNA alebo RNA kódujúceho sekvenciu špecifickú pre protilátku 806.077, konkrétne z variabilného úseku, osobitne z úseku CDR3. Syntetický oligonukleotid alebo jeho komplementárna sekvencia sa môže použiť ako špecifická sonda pre kódujúci úsek CD3.

Hybridizačná sonda sa môže vytvoriť zo syntetického oligonukleotidu 5' adíciou rádioaktívnej fosfátovej skupiny z [γ³²P]ATP pôsobením T4 polynukleotidkinázy. 20 pmol oligonukleotidu sa pridá do 20 μΐ reakcie obsahujúcej lOOmM Tris-HCl, pH 7,5, lOmM MgCl₂, 0,lmM spermidín, 20mM ditiotreitol (DTT), 7,55μΜ ATP a 2,5 U T4 polynukleotidkinázy (Pharmacia Biotechnology Ltd., Uppsala, Švédsko) . Reakcia sa inkubuje 30 minút pri 37 ’C a potom 10 minút pri 70 ’C pred tým, ako sa použije na hybridizáciu. Spôsoby prípravy hybridizačnej sondy z oligonukleotidu (kapitola 11) alebo z fragmentov DNA a RNA (kapitola 10) sú opísané v publikácii Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Second Edition, 1989. Existuje tiež rad dostupných súprav špeciálne vhodných na tento účel.

9.3. Hybridizačné podmienky

Filtre obsahujúce nukleovú kyselinu sa pre-hybridizujú v 100 ml roztoku obsahujúcom 6xSSC, 0,1% SDS a 0,25% sušené odstredené mlieko (Marvel™) pri 65 ’C počas najmenej 1 hodiny vo vhodnej uzavretej nádobe. Špeciálny hybridizačný prístroj ako je napr. HB-1 (Techne Ltd.) poskytuje reprodukovateľné podmienky pre takýto experiment.

Pre-hybridizačný roztok sa potom nahradil s 10 ml hybridizačného roztoku so sondou obsahujúcou 6 x SSC, 0,1% SDS, 0,25% sušené odstredené mlieko (Marvel™) a sondu, pripravenú postupom opísaným v predchádzajúcom texte. Filtre sa inkubujú v tomto roztoku 5 minút pri teplote 65 °C a potom sa nechá teplota pomaly klesať na 30 °C. Roztok so sondou sa potom odstráni a filtre sa 5 minút premývajú v 100 ml roztoku 6 x SSC, 0,1% SDS pri teplote miestnosti. Ďalšie premývanie sa opakuje v rovnakom roztoku pri 30 ’C a potom pri rastúcej teplote po 10 ’C až do 60 °C po 5 minútach.

Na premytie sa filtre usušia a exponujú sa na rôntgenové filmy, ako je napr., Hyperfilm™ MP (Amersham International) pri -70 ’C v kazete neprepúšťajúcej svetlo s použitím zosilňovacieho wolfrámového tienidla na zosilnenie fotografického obrazu. Film sa exponuje vhodne dlho (obyčajne cez noc) kým sa vyvolá, aby sa prejavil fotografický obraz rádioaktívnych oblastí na filtri. Príbuzné sekvencie nukleovej kyseliny sa identifikujú na základe prítomnosti fotografického signálu v porovnaní s úplne nepríbuznými sekvenciami, ktoré nadávajú žiadny signál.

Všeobecne príbuzné sekvencie budú pozitívne aj pri najvyššej teplote premývania (60 °C). Avšak príbuzné sekvencie sa môžu ukázať ako pozitívne pri nižších premývacích teplotách (50, 40 alebo 30 °C).

Výsledky budú tiež závislé na druhu použitej sondy. Sondy, ktoré sú tvorené dlhšími fragmentmi nukleovej kyseliny, vyžadujú dlhší čas a vyššiu teplotu na hybridizáciu, ale zostávajú hybridizované s príbuznými sekvenciami pri vyššej premývacej teplote alebo pri nižšej koncentrácii solí. Kratšie, zmiešané alebo degenerované oligonukleotidové sondy vyžadujú menej stringentné (prísne) premývacie podmienky, ako je napr. nižšia teplota alebo vyššia koncentrácia Na⁺. Diskusie týkajúce sa predpokladov na hybridizačné postupy možno nájsť v publikácii Sambrook, E.F., Fritsch, E.F., Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Second Edition, 1989 (kapitola 11) .

Príklad 10

Farmaceutické prípravky

Nasledujúci príklad ilustruje reprezentatívne farmaceutické liekové formy obsahujúce protilátku 806.077, ktoré sa môžu použiť na liečenie v kombinácii s vhodným predliekom.

Roztok pre injekcie pre systém ADEPT

Sterilný vodný roztok pre injekcie obsahuje na 1 ml roztoku:

konjugát protilátka 806.077-CPG2 1,0 mg trihydrát octanu sodného 6,8 mg chlorid sodný 7,2 mg

Tween 20

0,05 mg

Typická dávka konjugátu pre dospelého človeka je 30 mg, ktorá nasleduje po 3 dňoch tromi 1 g dávkami predlieku podávaného v hodinových intervaloch. Vhodným konjugátom CPG2 je ktorýkoľvek z konjugátov opísaných v príkladoch 105 a 106. Konjugáty HCPB môžu nahradiť CPG2 konjugáty v tabuľke. Vhodné HCPB konjugáty sú ktorékoľvek z konjugátov opísaných v príkladoch 48 až 101.

Roztok pre injekcie pre nádorovú imunoterapiu

Sterilný vodný roztok pre	inj ekcie	obsahuje na	1 ml
roztoku:
konjugát protilátka 806.077-	B7	1,0 mg
trihydrát octanu sodného		6,8 mg
chlorid sodný		7,2 mg
Tween 20		0,05 mg
Typická dávka konjugátu pre dospelého Vhodný konjugát je opísaný v príklade 104.	človeka je	30 mg.
Príklad 11
Konštrukcia počiatočných génov	ťažkého	a ľahkého	reťazca

humanizovanéj protilátky 806.077

V nasledujúcom texte je najskôr prehľadne uvedená stratégia humanizácie protilátok. Cieľom humanizácie protilátok je skombinovať väzbové miesto protilátky inej ako ľudskej s podpornou kostrou (základnou štruktúrou) ludskej protilátky, pričom sa uchová väzbová afinita pre charakteristický antigén pôvodnej protilátky. Uskutočniteľnosť takýchto úprav protilátok je dôsledkom silnej sekvenčnej a štruktúrnej homológie imunoglobulínov rôznych druhov cicavcov.

V základnej podobe takýto prístup zahrňuje prenos šiestich hypervariabilných úsekov alebo komplementaritu určujúcich úsekov (CDR) z úsekov Fv jednej protilátky do druhej protilátky, tak ako to prvýkrát opísali Jones a kol., Náture, 1986, 321, 522525. Ale skúsenosť ukázala, že okrem úsekov CDR je často potreba preniesť aminokyseliny kostry protilátky, aby bol celý proces úspešný, pretože tieto zvyšky kontaktujú a ovplyvňujú konformácie slučiek CDR.

V tomto počiatočná myšacích CDR prípade z humanizovaná a niekoľko sa vytvorila obsahujúca 6 protilátky 806.077 verzia protilátky substituovaných zvyškov z kostry protilátky. Táto konštrukcia sa použila ako templát, z ktorého sa vytvorili ďalšie varianty (pozri príklady 12 až 47) tak, že sa vniesli ďalšie substitúcie myšacích zvyškov. Ďalšia časť tohto príkladu podrobne opisuje počiatočnú humanizovanú konštrukciu.

Variabilný úsek ťažkého reťazca iudskej protilátky NEWM (Poljak, R.J. a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71, 3440-3444) a variabilný úsek ľahkého reťazca kappa REI (Palm, W a Hilschman, N.Z., 1975, Physiol. Chem., 356, 167-191) sa vybrali ako akceptorová kostra ľudskej protilátky. V literatúre sa opísali mnohé príklady úspešnej humanizácie s použitím tejto Fv kostry a vyriešili sa trojrozmerné štruktúry týchto dvoch proteínových domén. Na základe porovnania proteínových sekvencií variabilných úsekov ťažkého a iahkého reťazca myší 806.077 s najbližšie príbuznou podskupinou myších konsenzuálnych sekvencií podľa Kabata (s jednotlivými členmi) a ľudskými proteínovými sekvenciami NEWM a REI, sa navrhli jednotlivé sekvencie DNA kódujúce počiatočnú humanizovanú protilátku, ktoré obsahujú myšací CDR a akékoľvek ďalšie substitúcie v kostre, ktoré sú považované za dôležité.

Sekvencie CDR myšacej protilátky 806.077 sú tu uvedené ako sekvencie SEQ ID NO: 26, NO: 27 a NO: 28 pre variabilný úsek lahkého reťazca a nachádzajú sa v polohách 23 až 34 (CDR1), 50 až 56 (CDR2) a 89 až 97 (CDR3). Sekvencie CDR variabilného úseku ťažkého reťazca sú tu uvedené ako sekvencie SEQ ID NO: 29, NO: 30 a NO: 31 a vyskytujú sa v polohách 31 až 35 (CDR1)5O až 65 (CDR2) a 95 až 102 (CDR3) (podlá Kabátovej nomenklatúry) . Vo variabilnom úseku ťažkého reťazca sa uskutočnili ešte ďalšie zmeny v kostre NEWM, a to V24A, S27F, T28N, F29I, S30K, sekvencie SEQ ID NO: 54 a NO: 55) humanizovanej protilátky 806.077 sa klonovaním vložila, v súlade s čítacím rámcom, priamo do expresného vektora pNG4-VHss-HuIgG2CHľ (NCIMB č. 40797) . Na tento účel sa syntetický PCR fragment kódujúci humanizovaný gén ťažkého reťazca (sekvencia SEQ ID NO: 53) naštiepil s reštrikčnými enzýmami EcoRI a Sací a klonoval sa do podobne naštiepeného vektora pNG4-VHss-HuIgGCHľ obsahujúceho signálnu sekvenciu VH a kódujúcu sekvenciu konštantného úseku HuIgGCHľ. DNA sekvencia a proteínová sekvencia vzniknutého úplného humanizovaného ťažkého reťazca 806.077Fd (806.077HuVHlHuIgG2Fd), spoločne s jeho signálnou sekvenciou, sú tu uvedené ako sekvencie SEQ ID NO: 56 a NO: 57 a vektor sa nazval pNG4VHss-806.077HuVHl-HuIgG2CHľ.

Počiatočná konštrukcia humanizovanej protilátky sa pripravila tak, že sa skonštruoval ko-expresný plazmid obsahujúci obidva gény pre variabilné úseky ťažkého reťazca 806.077HuVHl a lahkého reťazca 806.077HuVKl protilátky. Plazmidový vektor pNG3-Vkss-806.077HuVKl-HuCK-Neo obsahujúci variabilný úsek HuVKl (sekvencie SEQ ID NO: 49 a NO: 50) humanizovaného lahkého reťazca sa naštiepil s reštrikčnými enzýmami BamHI a Sali, potom sa rozdelil v 1% agarózovom géli a pás s vektorom sa vyrezal a purifikoval. Plazmid pNG4-Vhss806.077HuVHl-HuIgG2CHľ, sekvencia SEQ ID NO: 56 a NO: 57) sa štiepil s reštrikčnými enzýmami BglI a Sali, reakčná zmes sa potom rozdelila elektroforézou v 2% agarózovom géli a pás zodpovedajúci fragmentu sa vyrezal a purifikoval. Takto získaný fragment DNA sa potom ligoval do pripraveného vektora pNG3-Vkss58

806.077HuVKl-HuCK-Neo, čím sa pripravili klony požadovaného koexpresného vektora HuVHl/HuVKl.

Tieto konštrukcie sa transfekovali do myelómových buniek NSO (ECACC č. 85110503) štandardnými technikami elektroporácie a transfekované bunky sa selektovali na rezistenciu voči antibiotiku G418. Získané klony sa testovali na expresiu protilátky v testoch ELISA s anti-ludskou Fd protilátkou a ELISA na väzbu s CEA, ktoré sú opísané v nasledujúcom texte.

Pre CEA-ELISA test sa všetkých 96 jamiek imunodoštičky (NUNC MAXISORB™) obalilo s 50 ng CEA v 50mM karbonát/bikarbonátovom obalovacom pufri pH 9,6 (pufrové tablety Sigma C3041) a inkubovali pri 4 °C cez noc. Doštičky sa potom opláchli trikrát v PSB + 0,05% Tween 20 a potom sa blokovali so 150 μΐ 1% BSA v PBS + 0?05% Tween 20 v každej jamke 1 hodinu pri 20 ^eC. Potom sa doštičky opláchli rovnako ako predtým a do každej jamky sa pridalo 100 μΐ testovaného roztoku a doštičky sa inkubovali 2 hodiny pri teplote miestnosti. Potom sa doštičky trikrát opláchli v PBS + 0,05% Tween 20 a do každej jamky sa pridalo 100 μΐ kozej anti-Iudskej kappa protilátky (Sigma A7164) značenej HRPO v roztoku 1% BSA v PBS-Tween a doštičky sa inkubovali pri teplote miestnosti na hojdacej plošine minimálne 1 hodinu. Doštičky sa opláchli rovnako ako predtým a potom ešte raz s PBS. Na detekciu väzby sa do každej jamky pridalo 100 μΐ vyvíjačieho roztoku (1 tableta fosfát-citrátového pufru Sigma P4922 rozpustená v 100 ml H₂O s prídavkom jednej 30 mg tablety dihydrochloridu o-fenylen-diamínu Sigma P8412) a doštičky sa inkubovali 15 minút. Reakcia sa zastavila pridaním 75 μΐ 2M H₂SO₄a potom sa merala absorbancia pri 490 nm.

V teste ELISA s anti-Iudskou Fd protilátkou sa každá jamka 96 jamkovej doštičky potiahla s 1,2 μg ovčej anti-ludskej Fd protilátky (väzbové miesto PC075) v 50mM karbonát/bikarbonátovom obalovacom pufri pH 9,6 (pufrové tablety Sigma C3041) a inkubovali sa pri 4 °C cez noc. Doštičky sa potom opláchli trikrát v PBS + 0,05% Tween 20 a potom sa blokovali so 150 μΐ 1% BSA v PBS + 0,05% Tween 20 v každej jamke 1 hodinu pri 20 ’C. Potom sa doštičky opláchli rovnako ako predtým a do každej jamky sa pridalo 100 μΐ testovaného roztoku a doštičky sa inkubovali 2 hodiny pri teplote miestnosti. Potom sa doštičky opäť trikrát opláchli v PBS + 0,05% Tween 20 a do každej jamky sa pridalo 100 μΐ kozej anti-ludskej kappa protilátky (Sigma A7164) značenej s HRPO v roztoku 1% BSA v PBS-Tween a doštičky sa inkubovali pri teplote miestnosti na hojdacej plošine minimálne 1 hodinu. Doštičky sa opláchli ako predtým a potom ešte raz s PBS. Na detekciu väzby sa pridal vyvíjači roztok a postupovalo sa rovnako ako je opísané v predchádzajúcom texte pre CEA test.

Vybrali sa klony s najlepšou hladinou expresie CEA na ďalší rast v 24-jamkových doštičkách a znovu sa testovali. Vybral sa najlepší kloň podľa kritérií týchto testov a namnožil sa v 1 litrovej produkčnej kultúre, ktorá sa pripravila riedením 1:10 konfluentnej kultúry (t.j. 100 ml do 900 ml čerstvého kultivačného média) a pestovaná ďalších 14 dní. Fragment F(ab')₂ludskej protilátky sa potom purifikoval zo supernatantu tejto kultúry postupom opísaným v príklade 102.

Príklady 12 až 38

Ďalšie kombinácie variantov génov variabilných úsekov humanizovaného ťažkého a lahkého reťazca: Konštrukcia variantov variabilného úseku 806.077 humanizovaného ťažkého a lahkého reťazca

Gény počiatočného variabilného humanizovaného 806.077 úseku sa využili tiež na následnú prípravu ďalších génových konštrukcií, ktoré obsahovali ďalšie rezíduá kostry myšacej protilátky. Modifikácia génových sekvencii sa uskutočnila (vo väčšine prípadov) kazetovou mutagenézou. Táto technika spočívala v tom, že časť pôvodného génu sa odstránila pomocou vhodných jedinečných reštrikčných enzýmov z pôvodného úplného plazmidového vektora a nahradila sa kazetou dvojvláknovej DNA (obsahujúcou dva komplementárne oligonukleotidy navzájom hybridizované do fragmentu DNA s vhodnými kohéznymi koncami) metódou priamej ligácie do pripraveného plazmidu, čím sa rekonštituoval gén, ale teraz obsahujúci požadované zmeny v DNA. Ďalšia kombinácia mutácií, či už ťažkého alebo ľahkého reťazca sa môže vytvoriť jednoduchou výmenou fragmentov DNA medzi vhodnými variantmi s využitím dostupných jedinečných miest pre reštrikčné enzýmy.

Okrem pôvodnej sekvencie HuVKl (sekvencia SEQ ID NO: 4 9 a NO: 50) sa vytvorili ďalšie varianty humanizovaného variabilného úseku ľahkého reťazca, ktoré sa nazvali HuVK2, HuVK3 a HuVK4. Variabilný úsek ľahkého reťazca variantu HuVK2 je modifikácia pôvodnej kódujúcej sekvencie HuVKl, ktorá spôsobuje aminokyselinovú zámenu M4L (podľa Kabátovej nomenklatúry) v dôsledku kazetovej mutagenézy génu (sekvencia SEQ ID NO: 49). Plazmid pNG3-Vkss-806-077HuVKl-HuCK-Neo (obsahujúci úplný humanizovaný lahký reťazec, sekvencie SEQ ID NO: 49 a NO: 50) štiepil s reštrikčnými enzýmami Sací a Nhel. Štiepený plazmid sa rozdelil elektroforézou v 2% agarózovom géli a vyštiepený fragment sa oddelil do zvyšku vektora. DNA vektora sa vyrezala z gélu a izolovala a uložila na -20 °C. Navrhli sa a syntetizovali dva oligonukleotidy (obsahujúce požadovanú zmenu) (sekvencie SEQ Dl NO: 58 A NO: 59). Tieto oligonukleotidy sa hybridizovali tak, že sa pridalo 200 pmol každého oligonukleotidu do celkového objemu 30 μΐ H₂O, zmes sa zahriala na 95 °C a nechala sa pomaly chladnúť na 30 ’C. 100 pmol výsledného spojeného produktu sa priamo ligovalo do dopredu pripraveného vektora. Táto kazetová výmena DNA umožnila vytvorenie požadovanej DNA a proteínovej sekvencie HuVK2 (sekvencie SEQ ID NO: 60 a NO: 61) umiestnené už v expresnom vektore pNG3-Vkss-806.077HuVK2-HuCK-Neo.

Podobne sa vytvoril variant HuVK3 so zmenami aminokyselín D1Q, Q3V a M4L (nomenklatúra podía Kabata) s použitím syntetických oligonukleotidov (sekvencie SEQ ID NO: 62 a NO:

63), ktoré umožnili vytvorenie požadovanej DNA a proteínovej sekvencie HuVK3 (sekvencie SEQ ID NO: 64 a NO: 65) umiestnené už v expresnom vektore pNG3-Vkss-806.077HuVK3-HuCK-Neo.

Variant variabilného úseku ľahkého reťazca HuVK4 sa vytvoril iným spôsobom, pretože neboli k dispozícii vhodné jedinečné reštrikčné miesta v blízkosti mutovaného miesta. Variant HuVK4 s aminokyselinovou zámenou L47W sa vytvoril s PCR mutagenézou. Vektor pNG3-Vkss-806.077HuVKl-HuCK-Neo sa použil ako templát v dvoch PCR reakciách (94 °C, 90 s, 55 °C, 60 s, 72 °C, 120 s, 15 cyklov, pufre a ostatné podmienky boli zhodné s predchádzajúcim opisom). V reakcii A sa použili syntetické oligonukleotidové primery so sekvenciami SEQ ID NO: 66 a NO: 67 a v reakcii B sa použili syntetické oligonukleotidové primery so sekvenciami SEQ ID NO: 68 a NO: 69. Výsledkom, týchto dvoch PCR reakcií (A a B) boli fragmenty s dĺžkou 535 bp a 205 bp. Reakčné produkty sa rozdelili elektroforézou v 2% agarózovom géli a separovali sa od znečisťujúcich produktov. Pásy s očakávanou dĺžkou sa vyrezali z gélu a izolovali. Pripravili sa zmesi rôznych množstiev produktov A a B a uskutočnila sa PCR reakcia so syntetickými oligonukleotidmi so sekvenciami SEQ ID NO: 66 a NO: 68. Výsledný produkt (asi 700 bp) sa naštiepil s reštrikčnými enzýmami SacII a Xhol a štiepny produkt sa separoval elektroforézou v 2% agarózovom géli. Pás s očakávanou veľkosťou 310 bp sa vyrezal z gélu a izoloval. Fragment sa potom ligoval do vektora pNG3-Vkss-806-077HuVKl-HuCK-Neo (ktorý sa predtým štiepil s reštrikčnými enzýmami SacII/Xhol a izoloval) a tým sa vytvorila požadovaná DNA a proteínová sekvencia HuVK4 (sekvencie SEQ ID NO: 70 a NO: 71) v expresnom vektore pNG3Vkss-806.0 7 7HuVK4-HuCK-Neo.

Okrem pôvodnej sekvencie HuVHl (sekvencia SEQ ID NO: 54 a NO: 55) sa vytvorilo 6 ďalších variantov humanizovaného variabilného úseku ťažkého reťazca, ktoré sa nazvali HuVH2 a HUVH7. Variabilný úsek ťažkého reťazca variantu HuVH2 bol modifikáciou pôvodnej kódujúcej sekvencie HuVHl, ktorá viedla k aminokyselinovéj zámene G49A (podľa Kabátovej nomenklatúry) v dôsledku kazetovej mutagenézy génu (sekvencia SEQ ID NO: 54) . Plazmid pNG4-VHss-806.077HuVHl-HuIGG2CHľ (obsahujúci úplný humanizovaný ťažký Fd reťazec IgG2, sekvencia SEQ ID NO: 56 a NO: 57) sa štiepil s reštrikčnými enzýmami Stul a Nôti.

Naštiepený plazmid sa rozdelil elektroforézou v 2% agarózovom géli a vyštiepený fragment sa oddelil od zvyšku vektora. DNA vektora sa vyrezala z gélu, izolovala a uchovala pri -20 °C. Dva oligonukleotidy sa navrhli a syntetizovali (sekvencie SEQ ID NO: 72 a NO: 73) , hybridizovali a produkt sa priamo ligoval do dopredu pripraveného vektora. Táto kazetová výmena umožnila vytvorenie požadovanej DNA a proteínovej sekvencie HuVH2 (sekvencie SEQ ID NO: 74 a NO: 75) umiestnené už v expresnom vektore pHG4-VHss-806.077HuVH2-HuigG2CHľ.

Podobne sa vytvoril variant HuVH3 so zmenami aminokyselín T73S a F78A (nomenklatúra podľa Kabata) s použitím syntetických oligonukleotidov (sekvencie SEQ ID NO: 76 a NO: 77), avšak v tomto prípade sa vektor pNG4-VHss-806.077HuVHl-HuIgG2CHľ štiepil s reštrikčnými enzýmami Nôti a SacII. Syntetická DNA kazeta sa priamo ligovala do dopredu pripraveného vektora, čo viedlo k vytvoreniu požadovanej DNA a proteínovej sekvencie HuVH3 (sekvencie SEQ ID NO: 78 a NO: 79) v expresnom vektore PNG4-VHss-806.077HuVH3-HuľgG2CHľ .

HuVH4 s aminokyselinovými zámenami G49A, T37S a F78A (nomenklatúra podľa Kabata) kombinujú varianty HuVH2 (sekvencie SEQ ID NO: 74 a NO: 75) a HuVH3 (sekvencie SEQ; ID NO: 78 a NO: 79). Tento variant sa získal naštiepením vektora pNG4-VHss806.077HuVH3-HuIgG2CHľ reštrikčnými enzýmami Nôti a Nheľ a izolovaním fragmentu s veľkosťou asi 200 bp v 2% agarózovom géli. Fragment sa izoloval a potom ligoval do vektora pNG4-VHss806.077HuVH2-HuľgG2CHl' (ktorý sa predtým naštiepil reštrikčnými enzýmami Nôti a NheI a vektorový fragment sa izoloval). Výsledné klony obsahovali požadovanú DNA a proteínovú sekvenciu HuVH4 (sekvencie SEQ ID NO: 80 a NO: 81) v expresnom vektore pNG4~ VHss-806.077HuVH4-HuIgG2CHľ .

Variant HuVH5 s aminokyselinovou zámenou V67A (nomenklatúra podľa Kabata) sa pripravil s použitím syntetických oligonukleotidov (sekvencie SEQ ID NO: 82 a NO: 83) . Vektor pNG4-VHss-806.077HuVHl-HuIgG2CHľ sa opäť štiepil s reštrikčnými enzýmami Nôti a SacII. Syntetická DNA kazeta sa ligovala priamo do dopredu pripraveného vektora, čím vznikol expresný vektor pNG4-VHss-806.077HuVH5-HuľgG2CHl' obsahujúci požadovanú DNA a proteínovú sekvenciu HuVH5 (sekvencie ID NO: 84 a NO: 85) .

Variant HuVH6 s aminokyselinovými zámenami V67A, T73S a F78A (nomenklatúra podľa Kabata) sa pripravil s použitím syntetických oligonukleotidov (sekvencie SEQ ID NO: 86 a NO: 87). Na túto mutáciu sa vektor pNG4-VHss-806.077HuVHl-HuIgG2CHľ štiepil s reštrikčnými enzýmami Nôti a SacII. Syntetická DNA kazeta sa ligovala priamo do dopredu pripraveného vektora, čím vznikol expresný vektor pNG4-VHss-806.077HuVH6-HuIgG2CHl’ obsahujúci požadovanú DNA a proteínovú sekvenciu ' HuVH6 (sekvencie SEQ ID NO: 88 a NO: 89).

Variant HuVH7 a aminokyselinovými zámenami G49A, V69A a F78A (nomenklatúra podľa Kabata) kombinuje varianty HuVH2 (sekvencie SEQ ID NO: 74 a NO: 75) a HuVH6 (sekvencie SEQ ID NO: 88 a NO: 89) . Tento variant sa získal štiepením vektora pNG4VHss-806.077HuVH6-HuIgG2CHľ s reštrikčnými enzýmami Nôti a Nheľ a izolovaním reštrikčného fragmentu Notl/NheI s veľkosťou asi 200 bp v 2% agarózovom géli. Fragment sa izoloval a potom sa ligoval do vektora pNG4-VHss-806.077HuVH2-HuIgG2CHľ (ktorý sa predtým štiepil s reštrikčnými enzýmami Nôti a Nheľ a izoloval sa vektorový fragment). Výsledné klony obsahovali požadovanú DNA a proteínovú sekvenciu HuVH7 (sekvencie SEQ ID NO: 90 a NO: 91) v expresnom vektore pNG4-VHss-806.077HuVH7-HuľgG2CHľ .

Kombinácie takýchto variantov génov humanizovaných ťažkých a ľahkých reťazcov sa dosiahlo vystrihnutím expresnej kazety variantu ťažkého reťazca Fd (vrátane promótora a génu vystrihnutého ako BglII/Sall fragment) a klonovaním tohto fragmentu do miest BamHI/SalI vektora nesúceho variant ľahkého reťazca, aby sa vytvorila ko-expresná vektorová konštrukcia. Zoznam možných kombinácií variantov založených na variantoch humanizovaného ťažkého a ľahkého reťazca opísaných v predchádzajúcom texte je uvedený v nasledujúcej tabuľke.

Kombinácie variantov variabilných úsekov humanizovaného ťažkého a ľahkého reťazca

Príklad č.	variabilný úsek ťažkého reťazca	sekven- cia 3EQ ID NO	variabil-_sný úsek ľahkého c reťazca	ekven- cia >EQ ID NO	ko-expresný plazmidový vektor
η η	HuVHi	54 a 55	HuVKl	49 a 50	pNG 306HuVHi/HuVKl/HuIaG2
12	HuVHi	54 a 55	KuVK2	60 a 51	pNG 806HuVKl/HuVK2/HuIgG2
1 *	HuVHi	54 ä 55	HuVK3	64 ä 65	pNG 8 0 6HUVK1/HuVK3/HuIgG2
14	HuVHi	54 a 55 j	HuVK4	70 ä 71	pNG 306HuVHi/KuVK4/HuIgG2
	HuVH2	74 a 75 j	HuVKl j	49 a 50	pNG 306HuVE2/HuVKl/HuIgG2
15	HuVH2	74 a 75	HuVKl	60 3. bi	pNG 806HuVH2/HuVK2/HuIgG2
17	HuVH2	74 a 75	HuVX3	64 a 6 5	pNG 806HuVH2/HuVX3/HúIgG2
13	HuVK2	74 a 75	HuVK4	70 a 71	pNG 806HuVH2/HuVK4/HuIgG2
19	Hu'ZH3	73 a 79	HuVKl	49 a 30	pNG 806HuVH3/HuVKl/HuIgG2
20	HuVK3	78 a 79	HuVK2	60 a 6i	pNG 306HuVH3/HuVK2/HuIgG2
21	HuVH3	73 a 79	HuVKl	64 a 63	pNG 80SHuVH3/HuVK3/HuIgG2
22	HuVH3	78 a 79	HuVK4	70 a 71	pNG 30 6HuVE3/HuVK4/HuIgG2
23	HuVH4	30 a 31	HuVKl	49 a 50	pNG 806HuVH4/HuVKl/HuIgG2
2 4	HuVH4	3 0 ä 31	HuVK2	50 a 51	pNG 306HuVH4/HuVK2/HuIgG2
2 5	HuVH4	80 a 31	HuVX3	54 a 53	pNG 806HuVK4/KuVK3/HuIgG2
26	HuVH4	80 a 81	HuVK4	70 a 71	pNG 3 0 6HUVH4/HuVK4/HuIgG2
27	HuVE5	34 a 35	HuVKl	49 a 50	pNG 306HuVH5/HuVKl/HuIgG2
2 3	HuVHô	S4 a 85	HuVK2	60 a 6i	pNG 306HuVH5/KuVK2/HuIgG2
2 9	HuVE5	34 a 35	HuVK3	64 a 65	pNG 806HuVH5/HuVK3/HuIgC-2
30	EuVH5	84 a 85	HuVK4	70 a 71	pNG 306HuVH5/HuVK4/HuIgG2
3 1	HuVH6	38 a 89	HuVKl	49 a 50	pNG 806HuVH6/HuVKl/HuIgG2
32	HuVK6	83 a 89	HUVK2	50 a 61	pNG 806KuVH6/HuVK2/HuIgG2
33	HuVH6	38 a 39	HuVKl	64 a 65	pNG 806HuVK6/HuVK3/HuIgG2
34	KuVH6	83 a 89	EuVK4	70 a 71	pNG 80SHuVH6/HuVK4/HuIgG2
35	HUVS7	90 a 91	HuVKl	49 a 50	pNG 806HuVK7/HuVKl/HuIgG2
36	HuVH7	90 a 91	HuVK2	60 a 61	pNG 806HuVH7/HuVK2/HuIgG2
37	HuVK7	90 a 91	HuVK3	64 a 65	pNG 806HuVH7/HuVK3/HuIgG2
38	HuVH7	90 a 91	HuVK4	70 a 71	pNG 806HuVH7/HuVK4/HuIgG2

Podobne ako v príklade 11 sa konštrukcia v príklade 14 pripravila tak, že sa skonštruoval ko-expresný plazmid obsahujúci obidva protilátkové gény pre variabilné úseky ťažkého reťazca 806.077HuVHl a lahkého reťazca 806.Q77HuVK4. V tomto prípade sa plazmidový vektor pNG3-Vkss-806.077HuVK4-HuCK-Neo obsahujúci variabilný úsek HuVK4 (sekvencie SEQ ID NO: 70 a NO: 71) humanizovaného lahkého reťazca štiepil s reštrikčnými enzýmami BamHI a Sali, potom sa rozdelil v 1% agarózovom géli a vektorový pás sa vyrezal a purifikoval. Plazmid pNG4-VHss806.077HuVHl-HuIgG2CHľ (obsahujúci variabilný úsek humanizovaného ťažkého reťazca 806.077HuVHl, sekvencie SEQ ID NO: 56 a NO: 57) sa štiepil s reštrikčnými enzýmami BglII a Sali, reakčná zmes sa potom rozdelila elektroforézou’ v 2% agarózovom géli a vyrezal sa a purifikoval pás zodpovedajúci fragmentu. Takto získaný DNA fragment sa potom ligoval do pripraveného vektora pNG3-Vkss-806.077HuVK4-HuCK-Neo, čím sa pripravili klony požadovaného ko-expresného vektora HuVHl/HuVK4.

Rovnako, ako sa opísalo v príklade 11, sa tieto konštrukcie transfekovali do myelómových buniek NSO (ECACC č. 85110503) štandardnými technikami elektroporácie a transfekované bunky sa selektovali na rezistenciu voči antibiotiku G418. Získané klony sa testovali tak na expresiu protilátky v testoch ELISA s antiludskou Fd protilátkou ako aj ELISA na väzbu s CEA. Klony majúce najlepšiu expresiu a najvyššiu úroveň väzby s CEA sa selektovali, namnožili a exprimoval sa produkt. Ľudský protilátkový fragment F(ab')₂ sa purifikoval zo supernatantu kultúry tak, ako je opísané v príklade 102.

Príklady 39 až 47

Expresia humanizovaných fragmentov F(ab')₂ s rôznymi triedami konštantných úsekov ľudského ťažkého reťazca

Môžu sa použiť ďalšie triedy konštrukcií chimérneho ťažkého reťazca Fd. A síce pripravili sa ďalšie varianty vektorov ťažkého reťazca obsahujúci buď HulgGICHľ (sekvencie SEQ ID NO: 20 a NO: 21) alebo HuIgG3CHľ (sekvencie ID NO: 24 a 115), ktorých konštantné úseky sú náhradou za gén HuIgG2CHľ (sekvencie SEQ ID NO: 22 a NO: 23) . Vytvorené vektory sú pNG4VHss-HuIgGlCHľ a pNG4-VHss-HuIgG3CHľ. Požadovaný variabilný úsek ťažkého reťazca protilátky sa môže vystrihnúť z príslušného plazmidu pNG4-VHss-variabilný úsek VH-HuIgGlCHľ štiepením reštrikčnými enzýmami EcoRI a Sací a klonovaním do podobne štiepeného vektora pNG4-VHss-HuIgG2CHľ alebo pNG4-VHssHuIgG3CHľ sa vytvorí úplná sekvencia ťažkého reťazca Fd. Ako sa už opísalo v predchádzajúcom texte, ak sú jednotlivé sekvencie ťažkého a Zahkého reťazca pripravené, expresná kazeta génu ťažkého reťazca Fd obsahujúca promótor a gén sa môže vystrihnúť štiepením s reštrikčnými enzýmami a získaný fragment potom sa potom môže klonovať do vhodných miest vektora s Zahkým reťazcom, aby sa vytvoril konečný ko-expresný vektor. Nasledujúca tabulka uvádza príklady 39 až 47, v ktorých sa kombinovali rôzne variabilné úseky ťažkého a ľahkého reťazca s mnohými rôznymi triedami konštantného úseku ľudského ťažkého reťazca.

V príklade 44 sa vektor pNG4-VHss-HuIgGlCHl' štiepil s reštrikčnými enzýmami EcoRI a Sací a izoloval sa vektorový fragment, ako sa opísalo v predchádzajúcom texte. Variabilný úsek HuVHl ťažkého reťazca protilátky (sekvencia SEQ ID NO: 54 a NO: 55) sa vystrihol z plazmidu pNG4-VHss-806.077HuVHl-IgGlCHľ štiepením s reštrikčnými enzýmami EcoRI a Sací a fragment sa klonoval do podobne štiepeného vektora pNG4-VHss-HuIgG3CHľ, čím vznikla úplná sekvencia humanizovaného ťažkého reťazca Fd reťazca IgG3 (sekvencia SEQ ID NO: 94 a NO: 95) v kompletnom vektore pNG4-VHss-806.077HuVHl-HuIgG3CHľ. Génová expresná kazeta ťažkého reťazca Fd, zahrňujúca promótor a gén, sa vystrihla s reštrikčnými enzýmami a ako BglII/Sall fragment sa klonovala do BamHI/SalI miest vektora lahkého reťazca pNG3-Vkss806.077HuVKl-HuCK-Neo (ktorý obsahuje humanizovaný lahký reťazec HuVKl-HuCK, sekvencie SEQ ID NO: 51 a NO: 52), ktorý sa naštiepil s reštrikčnými enzýmami BamHI a Sali, rozdelil v 1% agarózovom géli a purifikoval ako vektorový pás. Tým sa vytvoril ko-expresný vektor pNG806HuVHl/HuVK3/HuIgGGg3, z ktorého sa môže exprimovať humanizovaný protilátkový fragment 80 6.07 7HuVHl/HuVKl-HuIgG3/Kappa Fd.

	humanizovaný	sekven- i cia	humanizovaný	sekven- cia	ko-expresný plazmidový
č .	ťažký reťazec	SEQ ID' NO:	ľahký reťazec	SEQ ID NO:	vektor
3 S	HuVKl-KuIgC-1	52 a 53	KuVKl-HuCK	51 a 52	cNG 80ôKuVKl/KuVKl/KuľgGl
40	HuVHI-HuľgC-2	S 5 a 5 7	KuVKl-HuCK	51 a 52	pNG 305KuVKi/KuVKl/KuIgG2
£ ¹	HuVKl-HuľgG3	s, 95	HuVKl-HuCK	51 a 52	pNG 30SHuVHl/HuVKl/HuIgG3
1 ”7	HuVKl-KulgGI	92 a 93	HuVK3-HuCK	95 a 97	pNG 306KuVKl/HuVK3/KulgGI
43	HuVHl-HuIgG2	55 a 57	HuVK3-HuCK	96 a 97	pNG 306HuVEl/HuVK3/HuIgG2
Δ Δ	KuVKl-HuľgG3	94 a 95	HuVK3-HuCK	95 a 97	pNC- 806 HuVHl / HuVK3 /HuIgG3
4 5	HuVHl-HulgGI	52 a 93	Hu VK4-HuCK	53 a 95	pNG 805HuVHl/HuVX4/HuIgGl
4 o	HuVHl-HuIgG2	55 a 57	HuVK4-KuCK	93 a 99	pNG 806HuVHl/HuVK4/HuIgG2
47	HuVKl-HuXgG3	94 a 95	HuVK4-HuCK	98 a 99	pNG 806HuVHl/HuVK4/HuIgG3

V príklade 47 sa vektor pNG4-VHss-HuIgG3CHľ štiepil s reštrikčnými enzýmami EcoRI a Sací a izoloval sa vektorový fragment. Variabilný úsek HuVKl ťažkého reťazca protilátky (sekvencie SEQ ID NO: 54 a NO: 55) sa vystrihol z plazmidu pNG4VHss-806.077HuVHl-HuIgG2CHľ štiepením reštrikčnými enzýmami EcoRI a Sací a fragment sa klonoval do podobne naštiepeného vektora pNG4-VHss-HuIgG3CHľ. Tým vznikla úplná sekvencia humanizovaného ťažkého Fd reťazca IgG3 (sekvencie SEQ ID NO: 94 a NO: 95) v kompletnom vektore pNG4-VHss-806.077HUVH169

HuIgG3CHľ . Génová expresná kazeta ťažkého reťazca Fd, zahrňujúca promótor a gén, sa vystrihla s reštrikčnými enzýmami ako BglII/Sall fragment a klonovala sa do BamHI/SalI miest vektora ľahkého reťazca pNG3-Vkss-806.077HuVK4-HuCK-Neo (obsahujúceho humanizovaný ľahký reťazec HuVK4-HuCK, sekvencie SEQ ID NO: 98 a NO: 99), ktorý sa štiepil s reštrikčnými enzýmami BamHI a Sali, rozdelil v 1% agarózovom géli a purifikoval ako vektorový pás. Tým sa vytvorila ko-expresná vektorová konštrukcia pNG 806HuVHl/HuVK4/HuIgG3, z ktorého sa môže exprimovať humanizovaný protilátkový fragment HuVHl/HuVKlHuIgG3/Kappa Fd.

Ďalšie príklady uvedené v tabuľke sa pripravili podobným spôsobom ako opísané príklady 44 a 47. Avšak v prípade konštrukcií obsahujúcich ľudský IgGl, konečný ko-expresná vektorová konštrukcia sa vytvorila klonovaním génovej expresnej kazety ťažkého reťazca Fd (obsahujúci promótor a gén) vystrihnutej ako BglII/BamHI fragment (pretože nie je k dispozícii vnútorné reštrikčné miesto Sali v géne konštantného úseku HuIgGlCHľ a klonovanej do BamHI miesta vhodne pripraveného vektora s ľahkým reťazcom. V tomto prípade sa musela skontrolovať orientácia kazety s ťažkým reťazcom. To sa uskutočnilo štiepením s reštrikčnými enzýmami (napr. enzýmom HindlII) a elektroforetickou analýzou výsledných fragmentov v porovnaní s fragmentmi podobne štiepenej verzie HuIgG2 (pozri príklady 11 až 38. Pokial sa vzorce fragmentov zhodovali pre obidve konštrukcie, je isté, že kazeta ťažkého reťazca sa naklonovala v správnej orientácii.

Rovnako, ako sa opísalo v príklade 11, tieto konštrukcie sa transfekovali do myelómových buniek NSO (ECACC č. 8510503) štandardnými technikami elektroporácie a transfekované bunky sa selektovali na rezistenciu voči antibiotiku G418. Získané klony sa testovali tak na expresiu protilátky v testoch ELISA a antiludskou Fd protilátkou ako aj ELISA na väzbu s CEA, a vybrali sa, namnožili a kultivovali sa na expresiu klony s najlepšou expresiou a väzbovou hladinou s CEA. Podobne ako v predchádzajúcich príkladoch ľudský protilátkový fragment F(ab')₂sa izoloval zo supernatantu príslušnej kultúry ako je opísané v príklade 102.

Príklad 48

Príprava fúzneho proteínu humanizovaný 806.077 F(ab')₂ ^- [A248, G251T,D253]HCPB

Tento príklad opisuje prípravu génu kódujúceho fragment humanizovaného ťažkého reťazca Fd 806.077 spojeného s [A248,G251T,D253JHCPB a ich ko-expresiu s génom kódujúcim prodoménu ľudskej karboxypeptidázy B, čím vzniká proteín F(ab')₂ s molekulou [A248,G251T,D253]HCPB na C-konci každého fragmentu ťažkého reťazca. Konštantný a kĺbový úsek humanizovaného fragmentu ťažkého reťazca Fd sú odvodené z izotypu ľudskej protilátky IgG3. Exprimovaný proteín je tiež nazývaný proteínom protilátka-enzým.

a) Príprava génu kódujúceho fragment humanizovaného ťažkého reťazca Fd 806.077 spojeného s [A248S,G251T,D253K]HCPB a jeho klonovanie do pEE6

Gén kódujúci humanizovaný 806.077 Fd spojený s [A248S,G251T,D253K]HCPB sa vytvoril pomocou PCR z pZENl921 (pozri príklad 2).

Prvá PCR sa pripravila s templátom pZEN1921 (2 ng) a oligonukleotidmi so sekvenciami SEQ ID NO: 100 a NO: 101 (100 pmol každého) v pufri (100 μΐ) obsahujúcom lOmM Tris-HCl, pH 8,3, 50mM KC1, l,5mM MgCl₂, 0,125mM každého z dATP, dCTP, dGTP a dTTP. Reakcia sa inkubovala 5 min. pri 94 °C, potom sa pridala termostabilná DNA polymeráza (2,5 U, 0,5 μΐ) a zmes sa prevrstvila s minerálnym olejom (100 μΐ) a potom, sa reakčná zmes inkubovala 25 cyklov: 94 °C, 1 min, 53 ’C, 1 min, 72 ’C, 2,5 min a nakoniec ešte 10 min pri 72 ’C. Produkt PCR s veľkosťou 536 bp sa izoloval elektroforézou v í% agarózovom géli (Agarose type I, Sigma katalóg, č. A-6013) a potom sa vyrezal pás z gélu a izoloval sa DNA fragment.

Druhá PCR sa pripravila s templátom IgG3-pBSIIKS+ (8,7 ng, pozri odkazy v príklade 4) a oligonukleotidmi so sekvenciami SEQ ID NO: 102 a NO. 103, výsledný fragment s veľkosťou 954 bp sa izoloval rovnako ako je opísané. Produkty z obidvoch PCR (s koncentráciami 0,2, 1,0 alebo 5,0 ng/μΐ) sa zmiešali v pufri pre PCR opísanom vyššie. Zmesi sa inkubovali 5 min pri 94 °C a potom v 10 cykloch 94 ’C, 1 min, 63 °C, 4 min. Pridali sa oligonukleotidy so sekvenciami ID NO: 102 a NO. 103 (100 pmol každý) do PCR pufru (50 μΐ). Po inkubácii 3 min pri 94 °C sa zmes ďalej inkubovala v 25 cykloch 94 °C, 1 min, 53 ’C, 2 min a 72 °C, 2 min a nakoniec ešte 10 min pri 72 °C. Týmto postupom sa báza G v polohe 508 sekvencie SEQ ID NO: 115 nahradila bázou A.

PCR produkt s veľkosťou 1434 bp sa izoloval elektroforézou v 1% agarózovom géli, purifikoval a potom sa štiepil s NheI (20 U) a Xbal (80 U) (New England Biolabs, Inc.) v celkovom objeme 100 μΐ obsahujúcom lOmM Tris-HCl, pH 7,9, 50mM NaCl, lOmM MgCl₂, lmM DTT a BSA (100μg/μl) 4 hodiny pri 37 ’C. Výsledný fragment sa znovu izoloval elektroforézou v 1% agarózovom géli a purifikoval. V podobnej štiepnej reakcii sa štiepil vektor pNG4VHss-806.077HuVHl-HuIgG2CHľ (10 μg, pozri príklad 11) s NheI a Xbal a potom sa pridal teľacia intestinálna alkalická fosfatáza d μΐ, New England Biolabs, Inc. 10 υ/μΐ), aby sa odstránili presahujúce 5' fosfátové skupiny a reakcia sa inkubovala .30 minút pri 37 ’C. Fosfatázová aktivita sa ukončila inkubáciou 10 minút pri 70 ’C. Plazmid štiepený s Nhel-Xbal sa purifikoval z agarózového gélu. PCR produkt z opísanej reakcie (asi 500 ng) sa ligoval do štiepenej plazmidovej DNA (asi 200 ng) v 20 μΐ reakcii obsahujúcej 50mM Tris-HCl, pH 7,8, lOmM MgCl₂, lOmM DTT, lmM ATP, 50 μg/ml BSA a 400 U T4 DNA ligázy (New England Biolabs, Inc.) 4 hodiny pri 25 ’C. 1 μΐ reakčnej zmesi sa potom použil na transformáciu 20 μΐ kompetentných buniek E. coli DH5a. Transformované bunky sa vysiali na L-agar so 100 μg/ml ampicilínu. Potenciálne klony obsahujúce humanizovaný 806.077Fd[A248S,G251T,D253K]HCPB sa identifikovali s PCR.. S každým klonom sa uskutočnila PCR ako je opísané v predchádzajúcom texte s oligonukleotidmi so sekvenciami SEQ ID NO: 104 a NO: 105. Vzorka (10 μΐ) z PCR reakcie sa analyzovala elektroforézou v 1% agarózovom géli. Klony obsahujúce požadovaný gén sa identifikovali podľa prítomnosti produktu s veľkosťou 512 bp. Tieto klony s pásom s veľkosťou 512 bp sa použili na minipreparáciu DNA. Vzorky DNA sa kontrolovali štiepením s HindlII a Xbal, či je prítomný fragment s veľkosťou 3751 bp a 1862 bp. Klony obsahujúce tieto fragmenty po naštiepení DNA s HindlII a Xbal sa použili na izoláciu DNA vo väčšej mierke a sekvencia inzertov sa overila sekvenovaním DNA. Sekvencia očakávaného inzertu je uvedená ako sekvencia SEQ ID NO: 112. Zo všetkých overovaných klonov 2 klony obsahovali očakávanú sekvenciu, ale s mutáciou jedenej bázy. Kloň 54 (nazvaný pMF195) mal bázu T v polohe 605 podľa sekvencie SEQ ID NO: 112 miesto bázy A a kloň 68 (nazvaný pMF198) mal bázu C v polohe 1825 miesto bázy T. Sekvencia uvedená tu ako sekvencia SEQ ID NO: 112 sa pripravila z pMF195 a pMF198 štiepením obidvoch (10 μg každého) s Xmal (10 U) a Xbal (100 U) (New England Biolabs, Inc.) v pufri obsahujúcom 20mM Tris-acetát, pH 7,9, 50mM octan draselný, lOmM octan horečnatý, lmM DTT a BSA (100gg/ml) . Fragment s veľkosťou 215 bp z pMF195 a vektorový fragment z pMF198 (po opracovaní s alkalickou fosfatázou) sa izoloval z 1% agarózového gélu a fragmenty sa ligovali navzájom, ako sa opísalo v predchádzajúcom texte. Ligačná zmes sa potom použila na transformáciu kompetentných DH5a. Transformované bunky sa vysiali na L-agar s ampicilínom a výsledné klony sa testovali štiepením s Xmal a Xbal na prítomnosť fragmentov s veľkosťou 5400 bp a 215 bp. Pozitívne klony sa použili na prípravu plazmidovej DNA vo velkej mierke a sekvencia inzertu sa potvrdila sekvenovaním DNA. Plazmid obsahujúci gén 806.077Fd[A248S, G251T, D253K] HCPB z klonu 102 sa nazval pMF213. Fragment HindlII-Xbal z pMF213 sa klonoval do pEE6 (čo je derivát pEEô.hCMV, pozri Stevens a Cockett, 1989, Nucl. Acid Res. 17, 7110, v ktorom miesto Hindlll upstream od promótora CMV sa zmenilo na miesto BglII) v DH5a (testovaných potom s oligonukleotidmi so sekvenciami SEQ ID NO: 106 a NO: 107 na inzert s veľkosťou 2228 bp), čím vznikol plazmid pMF221.

b) Príprava ko-expresného vektora na expresiu fúzneho proteinu protilátka-enzým

Na prípravu vektora schopného exprimovať fúzny proteín protilátka-enzým v eukaryotickej bunke sa použil systém GSSystem™ (Celltech Biologics, WO 87/04462, WO 89/01036, WO 86/05807, WO 89/10404). Postup vyžadoval klonovanie ľahkého reťazca humanizovanej protilátky do úseku HindlII-Xmal vektora pEE14. Tento vektor je opísaný v Bebbington, METHODS: A Companion to Methods in Enzymology, 1991, 2, 136-145. Na konštrukciu expresného vektora sa plazmidy pEE14 a pNG3-Vkss806.077HuVK4-HuCK-Neo (pozri príklad 14) štiepili s Hindlll a Xmal. Vhodný vektor (z pEE14) a inzert (fragment s veľkosťou 732 bp z pNG3-Vkss-806.077HuVK4-HuCK-Neo) z každého štiepenia sa izolovali z 1% agarózového gélu a navzájom ligovali a potom sa použili na transformáciu DH5a. Transformované bunky sa vysiali na L-agar s ampicilínom (100 μg/ml). Kolónie sa testovali reštrikčnou analýzou izolovanej DNA s enzýmami Hindlll a Xmal na prítomnosť fragmentu s veľkosťou 732 bp. Kolónie obsahujúce reštrikčný fragment s veľkosťou 732 bp sa použili na prípravu plazmidovej DNA vo velkej mierke a sekvencie inzertu sa overili sekvenovaním DNA. Plazmid obsahujúci sekvenciu humanizovaného ľahkého reťazca sekvencie SEQ ID NO: 70 v plazmide pEE114 sa nazval pEE-806.077HuVK4-HuCK.

Na vytvorenie ko-expresného vektora sa vektor pMF221 (10 gg) štiepil s BglII (20 U) a Sali (40 U) v pufri (100 μΐ) obsahujúcom lOmM Tris-HCl, pH 7,9, 150mM NaCl, lOmM MgCl₂, lmM DTT a BSA (100 μg/ml) a fragment s veľkosťou 9,95 kb sa izoloval a ligoval s fragmentom BglII-Sall z pMF221 a potom klonoval do DH5a. Kolónie sa testovali s PCR s dvoma súbormi oligonukleotidových primerov (sekvencie SEQ ID NO: 104 a NO: 105 a sekvencie SEQ DI NO: 108 a NO: 109). Klony poskytujúce produkt PCR s veľkosťou 185 bp a 525 bp sa ďalej charakterizovali sekvenovaním DNA. Kloň so správnou sekvenciou predstavujúci ko-expresný vektor ľahký reťazec/mutantný Fd HPCB v DH5a sa nazval pMF228. Humanizovaná sekvencia Fd-mutantnej HCPB je tu uvedená ako sekvencia SEQ ID NO: 113. Zvyšky 1 až 19 predstavujú signálnu sekvenciu, zvyšky 20 až 242 predstavujú humanizovaný variabilný úsek CH1 z IgG3, zvyšky 243 až 306 sú kĺbová oblasť IgG3 a zvyšky 307 až 613 predstavujú mutovanú sekvenciu HCPB so zmenami v porovnaní s ľudskou sekvenciou HCPB vo zvyškoch v polohách 248, 251 a 253. Zmeny v sekvencií HCPB sú v sekvencií SEQ ID NO: 113 v polohách 554 (Ser), 557 (Thr) a 559 (Lys).

c) Príprava vektora na expresiu pro-domény z proHCPB

Druhý eukaryotický expresný plazmid pEE12 obsahujúci prepro-sekvencie na sekréciu pro-domény s dodatočným leucínovým zvyškom na C-konci (zvaný pro-L) z preproHCPB sa pripravil ako je opísané v odkazoch v príklade 17 v Medzinárodnej patentovej prihláške WO 96/20011. Plazmid pMF161 sa pripravil pomocou PCR z pMF18 ako je opísané pre nemodifikovanú prepro-sekvenciu pomocou oligonukleotidov so sekvenciami SEQ ID NO: 110 a NO: 111. Fragment s veľkosťou 358 bp sa klonoval do pBluescript, čim vznikol pMF141 a potom do pEE12, čím vznikol pMF161. Proteínová sekvencia pro-L je uvedená ako sekvencia SEQ ID NO: 114.

d) Expresia fúzneho proteínu protilátka-enzým v eukaryotických bunkách

Na expresiu v eukaryotických bunkách sa vektory obsahujúce gény schopné exprimovať fúzny proteín protilátka-enzým (pMF228) a sekvencie pro-L (pMFlôl) ko-transfekovali do buniek COS-7. Bunky COS sú bunky bunkovej línie CV-1 obličkových buniek z afrických zelených opíc transformovaných vírusom SV-40 s defektným replikačným počiatkom a využívajú sa na krátkodobú prechodnú expresiu rôznych proteínov, pretože majú schopnosť replikovať kruhové plazmidy obsahujúce replikačný počiatok vírusu SV-40 s vysokým počtom kópií. Existujú dva dostupné klony buniek COS, a to COS-1 a COS-7. Základné metódy transfekcie buniek COS opísal Bebbington v METHODS: A Companion to Methods in Enzymology, 1991, 2, 141. Na expresiu HCPB sa použili plazmidové vektory pMF48 a pMF67 (2 μg z každého) na kotransfekciu buniek COS-7 (2xl0⁵) v 6-jamkovej kultivačnej miske v 2 ml Eaglovho média modifikovaného Dulbeccom (DMEM) s 10% teplom inaktivovaným teľacím fetálnym sérom (FCS) metódou tzv. lipofekcie, t.j. prenosom polynukleotidu sprostredkovaným katiónovým lipidom (Felgner a kol., METHODS: A Companion to Methods in Enzymology, 1993, 5, 67-75). Bunky sa inkubovali 20 hodín pri 37 °C v CO₂ inkubátore . Zmes plazmidovej DNA v médiu bez séra (200 μΐ) sa mierne zmiešala s činidlom LIPOFECTIN™ (12 μΐ) a inkubovala pri teplote miestnosti 15 minút. Bunky sa potom opláchli s médiom bez séra (2 ml) . Médium bez séra (600 μΐ) sa potom pridalo k zmesi DNA/LIPOFECTIN™ a zmesou sa prevrstvili bunky, ktoré sa ďalej inkubovali 6 hodín pri 37 °C v inkubátore s CO₂. Médium obsahujúce DNA sa potom nahradilo normálnym médiom DMEM obsahujúcim 10% FCS a bunky sa ďalších 72 hodín inkubovali rovnako ako predtým. Bunkové supernatanty (nariedené 1:10 s 0,025M Tris-HCl, pH 7,5, 125 μΐ) sa analyzovali na aktivitu proti Hipp-Glu (5h test, v celkovom objeme 250 μΐ) postupom opísaným v príklade 103. Nariedený supernatant spôsobil 18,4% hydrolýzy substrátu Hipp-Glu.

Alternatívne sa môže použiť nemodifikovaná doména (z plazmidu pMF67), opísaná v odkazoch z príkladu 17 Medzinárodnej patentovej prihlášky WO 96/20011) namiesto pro-L expresného plazmidu v opísanom experimente. Expresia proteínov vo veľkej mierke v bunkách COS je opísaná v Ridder a kol., 1995, Gene 166, 273-276 a v Blysey a kol., 1996, Cryotechnology 18, 183-192.

Na stabilnú expresiu v bunkách CHO sa použili postupy, ktoré opísal Bebbington, METHODS: A Companion to Methods in Enzymology, 1991, 2, 136-145 s využitím selekcie s 25μΜ GS a 50μΜ MSX. Prípadne sa môže na transfekciu buniek COS použiť aj lipofekcia, opísaná v predchádzajúcom texte. Bunky sa transfekujú zmesou plazmidov pMF228 a pMF161 alebo pMF228 a pMF67. Supernatanty z prežívajúcich kolónií sú testované CEAELISA (opísanou v príklade 11) a western prenosom (ktorý je opísaný ďalej) na prítomnosť pásu s veľkosťou 170 kDa veľkosti požadovaného fúzneho proteinu

Vhodne nariedené supernatanty sú tiež testované na enzýmovú aktivitu, ako je opísané v príklade 103. Kolónie exprimujúce požadovaný fúzny proteín protilátka-enzým sú potom kultivované v potrebnej mierke (pozri napr. Reff, M.E., 1993, Current Opinion in Biotechnology 4, 573-576 a ďalšie práce v tejto práci citované) a fúzny proteín sa potom purifikuje zo supernatantu bunkovej kultúry jednou alebo niekoľkými metódami opísanými ďalej v príklade 102.

zodpovedaj úceho protilátka-enzým.

d) Analýza western prenosom

Analýza western prenosom sa uskutočnila nasledovným spôsobom. Alikvotné diely (20 μΐ) supernatantu z každej vzorky sa zmiešali s rovnakým objemom vzorkového pufru (62,5mM Tris-HCl, pH 8,1, 1% SDS, 10% sacharóza a 0,05% brómfenolová modrá) buď s reduktantom alebo bez neho. Vzorky sa potom inkubovali 10 minút pri 65 °C pred tým, ako sa rozdelili elektroforézou v 8-18% akrylamidovom gradientovom géli (gélový systém EXCEL™ firmy Pharmacia Biotechnology Products) v zariadení MULTIPHOR™ II (LKB Producer AB) podlá odporučenia výrobcu. Po elektroforéze sa separované proteíny preniesli na membránu (HYBOND™ C-Super, Amersham International) pomocou zariadenia NOVABLOT™ (LKB Producer AB) podlá protokolov poskytnutých výrobcom. Po prenose sa membrána usušila.

Prítomnosť protilátkových fragmentov sa detegovala s použitím anti-Iudskej protilátky kappa (Sigma A7164), konjugát lahkého reťazca peroxidázou) s protilátkových chemiluminiscenčného systému International).

kappa kozej anti-Iudskej protilátky s riedením 1:2500. Prítomnosť ludských sa vizualizovala pomocou (detekčný systém ECL™, Amersham fragmentov

Príklady 49 až 74

Príprava ďalších fúznych proteínov humanizovaný 806.077F(ab')₂ mutovaná HCPB

Tento príklad opisuje prípravu génov kódujúcich humanizovaný Fd fragment z protilátky 806.077 spojený s mutovanou HCPB (D253K alebo G251T,D253K alebo A248S,G251T,D253K) a ich ko-expresiu s génom kódujúcim humanizovaný lahký reťazec z protilátky 806.077 a génom kódujúcim pro-doménu ľudskej karboxypeptidázy B, čím vzniká F(ab')₂ proteín s molekulou mutovanej HPCB na C-konci každého fragmentu ťažkého reťazca. Konštantné a kĺbové úseky humanizovaného ťažkého Fd reťazca sú odvodené z izotypov ludských protilátok IgGl alebo IgG2 alebo IgG3. Exprimované proteíny sú ďalej nazývané fúzne proteíny protilátka - enzým.

Postupy opísané v príklade 48 sa opakujú s príslušnými vhodnými sekvenciami podlá ďalej uvedenej tabuľky. Oligonukleotidy na konštrukciu pomocou PCR a testovanie klonov sa ľahko odvodia z vhodných sekvencií.

Aby sa zmenili sekvencie mutovanej HPCB, templát PCR, a to plazmid pZEN1921 z časti A) príkladu 48, je nahradený plazmidom pZEN1860 pre mutáciu [G251T,D253K]HCPB (pozri príklad 1) alebo pICI1713 pre mutáciu [D253K]HPCB (pozri Medzinárodná patentová prihláška WO 96/20011).

Na zmenu konštantného úseku ťažkého reťazca a kĺbového úseku bol templátom PCR vektor IgG3-pBSIIKS+ z časti a) príkladu 48 nahradený s vektorom pNG4-VHss-HuIgG2CHľ (NCIMB č. 40797).

Kvôli výmene sekvencie humanizovaného ľahkého reťazca protilátky sa vektor pEE14-806.077HuVK4-HuCK z časti b) príkladu 48 nahradil s vektorom pEEl4-806.077HuVKl-HuCK alebo s pEE14806.077HuVK3-HuCK. Vektory pEE14-806-077HuVKl-HuCK a pEE14806.077HuVK3-HuCK sa pripravili rovnako ako je to opísané pre vektor pEE14-806.077HuVK4-HuCK v časti b) príkladu 38, ale s využitím fragmentu HindlII-Xmal s veľkosťou 732 bp z pNG4-VHss806.077HuVKl-Neo, prípadne z pNG4-VHss-806.077HuVK3-Neo (pozri príklady 12-38) namiesto fragmentu HindlII-Xmal z pNG4-VHss806.077HuVK4-Neo.

Varianty fúznych proteínov protilátka-enzým pre každý príklad sú uvedené v nasledovnej tabuľke.

?r.	humanizovaný ťažký reťazec	humanizovaný ľahký reťazec	mutant KPCB
4 9	HuVHl-HuIgC-3	HuVK4-HuCK	[□2 53 K] HCPB
5 C	HuV-' -HuľcG3	HuVK4-HuCK	[C-251T, D253K]HCPB
1 ⁵¹	HuVH1-Hu Ϊ aG3	HuVKl-HuCK	[A248S, C-251T, D253KJHCPB
Ξ 2	HuVHl-HuIgG3	HuVKl-HuCK	[D253K] HCPB
5 2	HuVH'' -HuIcG3	HuVKl-HuCK	[G251T, D253K]HCPB
54	HuVHl-HulcG3	HuVKl-HuCK	[A243S, G251T, D253K] HCPB
5 5	mu v H i - ťu- gC-3	HuVK3-HuCK	[D253K] HCPB
5 o	HuVH-HuIcG3	HuVK3-HuCK	[G251T, D253K]HCPB
5 7	HuVHl-HulgGI	HuVK4-HuCK	[A248S, G251T, D253K]HC?B
53	HuVHl-HulgGI	HuVK4-HuCK	[C2 53K] HCPB
Ξ 9	HuVHl-HulgGI	HuVK4-HuCK	[G251T, D253K]HCPB
o 0	HuVH1-HuI gG 1	HuVKl-HuCK	[A243S, G251T, D253K]HCPB
o 1	HuVH1-HuIaG1	HuVKl-HuCK	[D253K]HC?3
o 2	HuVH1-HuIgG1	HuVKl-HuCK	[G251T, D253K]HCP3
c 3	HuVH1-HuIgG1	HuVKl-HuCK	[A243S, G251T, D253K]HCPB
□ 4	HuVHl-HuIgG1	HuVKl-HuCK	[D2 5 3 K] HCPB
55-	HuV n 2. — πυΣ	HuVKl-HuCK	[G251T, D253K]HCPB
5 6	HuVHl -HuIgC-2	HuVK4-HuCK	[A248S, G251T, D253K]HCPB
6 7	HuVHl-HuIgG2	HuVK4-HuCK	[D253K] HCPB
6 3	HuVH1-HuIgG2	HuVK4-HuCK	[G251T, D253K]HCP3
6 3	HuVHl-HuľgG2	HuVKl-HuCK	[A243S, G251T, D253K]HCPB
70	HuVHl-HuIgG2	HuVKl-HuCK	[D253K] HCPB
71	HuVHl-HuIgG2	HuVKl-HuCK	[G251T, D253K]HCPB
72	HuVHl-HuľgG2	HuVK3-HuCK	[A248S, G251T, D253K]HCPB
73	HuVHl-HuIgG2	HuVK3-HuCK	[D253K] HCPB
74	HuVHl-HuIgG2	HuVK3-HuCK	[G251T, D253K] HCPB

Príklad 75

Príprava fúzneho proteínu [A248S,G251T,D253K]HCPB - humanizovaný 806.077 F(ab')₂

Tento príklad opisuje prípravu génu kódujúceho proenzým [A248S,G251T,D253K]HCPB spojený s humanizovaným (verzia 1 VH z ľudského IgG3) Fd fragmentom ťažkého reťazca protilátky 806.077 a jeho ko-expresiu s génom kódujúcim humanizovaný ľahký reťazec (verzia 4 VK z CK) protilátky 806.077. Tým vzniká proteín F(ab')₂s molekulou pro- [A248S,G251T,D253K]HCPB na každom fragmente ťažkého reťazca. Enzým sa aktivuje enzýmovým odstránením prodomény pomocou trypsínu.

Štandardné postupy molekulovej biológie ako je štiepenie s reštrikčnými enzýmami, ligácia, kinázová reakcia, defosforylačná reakcia, polymerázová reťazová reakcia (PCR), transformácia baktérií, gélová elektroforéza, príprava pufrov, izolácia a purifikácia DNA, sa uskutočňovali postupmi ako ich opisuje Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Second Edition, 1989, prípadne sa postupovalo podlá odporučenia výrobcov špecifických produktov. Enzýmy sa použili vo väčšine prípadov od firmy New England Biolabs, možno však použiť aj produkty iných firiem. Oligonukleotidy sa pripravili na syntetizátore DNA Applied Biosystems 380A z fosfoamiditov (nukleozid-2-kyanoetyl-N,N'-didizopropylfosfoamiditov s bázou chránenou 5'-dimetoxytritylovou skupinou) naviazaných na sklenený porézny nosič v mierke 0,2 μπιοί podľa protokolov dodaných výrobcom Applied Biosystems Inc.

Mutanty HCPB, natívne HCPB a fúzne proteíny s HCPB sa testovali na schopnosť konvertovať hipuryl-L-glutámovú kyselinu alebo hipuryl-L-arginín na kyselinu hippurovú pomocou testu využívajúceho HPLC, ktorý je opísaný v príklade 103 alebo v Medzinárodnej patentovej prihláške WO 96/20011, príklad 20.

Techniky imunotestovania sa uskutočňovali podía metód, ktoré opísal Tijssen, 1985, Practice and Theory of Enzýme Immunoassays, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vo. 15, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, alebo podlá postupov odporučených výrobcom špecifických produktov.

Na vytvorenie plazmidov schopných exprimovať fúzny proteín protilátka-enzým v eukaryotických bunkách sa použil systém GSSystem (Celltech Biologics, podrobne opísaný v Medzinárodných patentových prihláškach WO 86/05807 a WO 89/10404) s dvoma plazmidmi pEE6 (čo je derivát pEE6.hCMV, pozri Stevens a Cockett, 1989, Nucl. Acid Res. 17, 7110, v ktorom miesto HindlII upstream od promótora hCMV sa zmenilo na miesto BglII) a pEE12 (čo je derivát pSV-GS s mnohými odstránenými miestami (Bebbington a kol., 1992, Biotechnology, 10, 169).

a) Klonovanie pre-pro-HCPB do reštrikčného miesta Xmal (poloha 1048 v sekvencií SEQ ID NO: 124)

Dvojvláknová DNA z plazmidu pMF18 (opísaného v Medzinárodnej patentovej prihláške WO 96/20011, referenčný príklad 19) , konštrukcia obsahujúca pre-pro-HCPB klonovaný do vektora pBluescript II KS+ (Stratagene), sa pripravila štandardným postupom (súprava na izoláciu plazmidov Qiagen alebo podobne) a reštrikčné štiepenie sa uskutočnilo velmi starostlivo, aby sa zaistilo úplné štiepenie. Reštrikčný enzým HindlII štiepi plazmid pMF18 práve pred začiatkom pro-sekvencie génu HCPB a enzým Xmal v kodóne pre 240. aminokyselinu (prolín) maturovaného proteínu, a tento fragment od HindlII miesta po Xmal je označovaný ako fragment pre-pro-HCPB. Izoloval sa DNA so správnou dĺžkou, obsahujúcou fragment pre-pro-HCPB (1061 bp).

Dvojvláknová DNA z plazmidového vektora pUC19 (New England Biolabs) sa pripravila, štiepila s reštrikčnými enzýmami HindlII a Xmal a purifikovala (2651 bp) podobným spôsobom ako fragment pre-pro-HCPB. Na klonovanie génového fragmentu HCPB do vektora pUC sa pripravili ligačné zmesi s pomerom 1 mol vektora na 2,5 mol inzertu a s celkovou koncentráciou DNA asi 2,5 ng/μΐ, s T4 DNA ligázou, lmM ATP a enzýmovým pufrom. Po uskutočnení ligačnej reakcie sa zmes DNA použila na transformáciu kmeňa E. coli DH5a. Alikvotné diely buniek sa vysiali na L-agar so živným médiom obsahujúcom 100 μΐ/ml ampicilínu na selekciu plazmidového vektora, a inkubovali sa pri 37 ’C cez noc. Niekolko kolónií sa potom zobralo a použilo na minipreparáciu dvojvláknovej plazmidovej DNA. Tieto vzorky DNA sa analyzovali štiepením s reštrikčnými enzýmami a tak sa identifikovala konštrukcia so správnou konfiguráciou. Tento plazmid obsahuje fragment pre-proHCPB nad Xmal v maturovanom géne a je označený ako pCF003.

b) Klonovanie [A248S,G251T, D253K]HCPB z polohy G241 + linker a 5 aminokyselín z VH

Na oddelenie HCPB od sekvencie Fd sa v priebehu · PCR do sekvencie vložil neutrálny peptidový linker (spojka) obsahujúci (glycín-glycín-glycín-serín)₃. Aby sa vytvorila mutovaná sekvencia [A248S,G251T,D253K]HCPB (ako opísané v referenčnom príklade 2) s pridaným peptidovým linkerom a prvými 5 aminokyselinami humanizovanej 806.077HV, pripravila sa PCR so 100 pmol primerov CME00971 a CME00972 (sekvencie SEQ ID NO: 122 a NO: 123) s približne 5 ng DNA pZENl921, všetkými dNTP s koncentráciou 200μΜ, reakčným pufrom pre Taq polymerázu a 2,5 U Taq polymerázy v celkovom reakčnom objeme 100 μΐ. Zmes sa zahrievala 10 minút pri 94 ’C pred pridaním Taq polymerázy, a potom sa uskutočnilo 30 cyklov PCR - 94 ’C, 1,5 minúty, 55 °C, 2 minúty, 72 ’C, 2 minúty - po ktorých nasledovala 10 minútová inkubácia pri 72 ’C na ukončenie reakcie. Produkt PCR obsahujúci fragment [A248S,G251T,D253K]HCPB (asi 298 bp) sa analyzoval elektroforézou v agarózovom géli na správnu velkosť a zistilo sa, že obsahuje predovšetkým pás so správnou velkosťou. Zvyšok produktu v reakčnej zmesi sa purifikoval od zvyšku reagencií mikrokoncentračnou kolónkou CENTRICON™ 100 (Amicon) a potom sa DNA izolovala precipitáciou a etanolom a octanom sodným, centrifugáciou, vákuovým usušením a resuspendovaním v destilovanej vode. Izolovaná DNA sa naštiepila s reštrikčnými enzýmami Xmal a EcoRI a purifikoval sa pás so správnou veľkosťou (271 bp).

Dvojvláknová DNA plazmidu pCF003 (opísaný vyššie) sa pripravila štandardným spôsobom (plazmidová súprava Qiagen alebo podobná), štiepila sa s enzýmami Xmal a EcoRI purifikoval sa pás so správnou veľkosťou (2696 bp).

Na klonovanie génového fragmentu mutovanej HCPB do vektora sa pripravili ligačné zmesi s pomerom 1 mol vektora (pCF003) na 2,5 mol inzertu (PCR fragment [A248S,G251T,D253K]HCPB) s celkovou koncentráciou DNA asi 2,5 ng/μΐ, s T4 DNA ligázou, lmM ATP a enzýmovým pufrom. Po uskutočnení ligačnej reakcie sa zmes DNA použila na transformáciu kmeňa E. coli DH5a. Alikvotné diely buniek sa vysiali na L-agar so živným médiom obsahujúcim 100 μg/ml ampicilínu na selekciu plazmidového vektora, a inkubovali sa pri 37 °C cez noc. Asi 200 kolónií sa prenieslo odtlačkom na dva sterilné nitrocelulózové filtre (Schleicher a Schuell) na misky s L-agarom a živným médiom so 100 μg/ml ampicilínu na selekciu plazmidového vektora, ktoré sa potom inkubovali cez noc pri 37 ’C. Duplikátna miska sa potom uložila pri 4 ’C a slúžila ako zdroj živých buniek a druhá miska sa opracovala tak, aby sa DNA z jednotlivých kolónií denaturovala a fixovala na filtri. Nitrocelulózový filter sa odstránil z agarovej misky a postupne sa položil na istý čas na navlhčený filtračný papier (Whattman: 1) na 2 minúty na papier nasiaknutý s 10% SDS, 2) 7 minút 0,5M NaOH, 1,5M NaCl, 3) 4 minúty 0,5M NaOH, 1,5M NaCl, 4) 2 minúty 0,5M NaOH, 1,5M NaCl, 5) 2 minúty 0,5M Tris-HCl, pH 7,4, 1,5M NaCl, 6) 2 minúty 2xSSC (štandardný roztok soli a citrátu). Filter sa potom umiestnil na papier Whattman nasiaknutý lOxSSC a denaturovaná DNA sa naviazala na filter ultrafialovým žiarením (Spectrolinker XL-1500 UV Crosslinker). Flitre sa potom usušili pri teplote miestnosti a potom sa prehybridizovali pri 60 ^eC jednu hodinu v roztoku 6xSSC s miernym trepaním (napr. v hybridizačnom inkubátore Techne HB-1D). Prehybridizácia slúži na blokovanie väzbových miest pre DNA na filtroch.

Aby sa určilo, ktoré kolónie obsahujú požadovaný DNA inzert, DNA fixovaná na nitrocelulózový filter sa hybridizovala s rádioaktívne značenou ³²P-DNA sondou pripravenou z purifikovaného PCR fragmentu [A248S,G251T,D253K]HCPB) (ako je uvedené) . Asi 50 ng DNA sa značilo pomocou 50 gCi ³²P-dCTP (>3000 Ci/mmol) a T7 DNA polymerázy v celkovom reakčnom objeme 50 μΐ (súprava T7 Quickprime, Pharmacia), keď reakcia prebiehala 15 minút pri 37 °C. Značená sonda sa zahriala na 2 minúty pri 95 °C aby sa denaturovala dvojvláknová DNA, bezprostredne potom sa pridala k 10 ml 60 ’C roztoku 6xSSC a týmto roztokom sa potom nahradil prehybridizačný roztok na filtroch. Inkubácia za mierneho trepania prebiehala ďalšie 3 hodiny pri 60 ’C. Potom sa hybridizačný roztok zlial a filtre sa premyli dvakrát po 15 minút v roztoku 2xSSC pri 60 °C. Filtre sa potom jemne usušili s filtračným papierom, zabalili sa priľnavej fólie (Saran™ alebo podobnej) a exponovali sa na róntgenový film (napr. X-OMAT-ARS™, Kodak) cez noc pri teplote miestnosti. Po vyvolaní filmu sa kolónie obsahujúce požadovaný inzert identifikovali ako tie, ktoré dávali najsilnejší signál (najtmavšia škvrna) na rôntgenovom filme. V tejto sérii experimentov asi 15% kolónií poskytlo pozitívny signál. Z nich sa 12 vybralo na ďalší skríning. Kolónie sa odobrali z duplikátneho filtra a naniesli sa na L-agarové živné médium so 100 gg/ml ampicilínu a potom sa kultivovali v živnom médiu LB so 100 μg/ml ampicilínu.

Vybrané kolónie sa potom použili na minipreparáciu plazmidovej DNA. Tieto vzorky DNA sa potom analyzovali štiepením s reštrikčnými enzýmami a identifikovali sa konštrukcie so správnou konfiguráciou. Aby sa zaistilo, že sa nevniesli žiadne zmeny v sekvencii DNA počas PCR, vybralo sa niekolko kolónií so správnou reštrikčnou mapou na minipreparáciu DNA štandardný m postupom (plazmidová súprava Qiagen alebo podobná) a inzerty sa sekvenovali pomocou niekoľkých samostatných oligonukleotidových primerov. Konštrukcia so správnou konfiguráciou sa identifikovala a tento plazmid obsahujúci gén pre-pro[A248S,G251T,D253K]HCPB-linker-humanizovaný 806.077VH nad miestom PstI (v 5. Aminokyseline, poloha 1301 v sekvencii SEQ ID NO: 124) sa nazvala pCF004.

c) Klonovanie humanizovaného 806.077Fd

Dvojvláknová DNA plazmidu pNG4-VHss-HuVHl-806.077-IgG3CHľ, konštrukcia obsahujúca humanizovanú verziu 806.077VH1 s ľudskou IgG3CHl a kĺbovým úsekom klonované do vektora pNG4 (pozri príklad 44) sa pripravila štandardným postupom (plazmidová súprava Qiagen alebo podobná) a štiepila sa s enzýmami .PstI a Xmal. Purifikoval sa DNA so správnou veľkosťou (854 bp) obsahujúca humanizovaný Fd 806.077 fragment. Pripravila sa dvojvláknová DNA z plazmidového vektora pUC19 (New England Biolabs), štiepila s reštrikčnými enzýmami PstI a Xmal a purifikovala (2659 bp) podobným spôsobom ako humanizovaný Fd 806.077 fragment.

Kontrolovala sa čistota alikvotov štiepenej a purifikovanej DNA a stanovila sa koncentrácia DNA elektroforézou v agarózovom géli porovnaním so známymi štandardami.

Na základe týchto meraní sa pripravili ligačné zmesi na

klonovanie	génového f	ragmentu	humanizovaného	Fd	806.077	do
vektora pUC	s pomerom	1 mol	vektora na 2,5	mol	inzertu	a s
celkovou koncentráciou	DNA asi	2,5 ng/μΐ s T4	DNA	ligázou,	lmM

ATP a enzýmovým pufrom.

Po uskutočnení ligačnej reakcie sa zmes DNA použila na transformáciu kmeňa E. coli DH5a. Alikvotné diely buniek sa vysiali na L-agar so živným médiom obsahujúcim 100 gg/ml ampicilínu na selekciu plazmidového vektora, a inkubovali sa pri 37 °C cez noc. Niekoľko kolónií sa potom zobralo a použilo n a minipreparáciu dvojvláknovej plazmidovej DNA. Tieto vzorky DNA sa analyzovali štiepením s reštrikčnými enzýmami a tak sa identifikovala konštrukcia so správnou konfiguráciou. Tento plazmid obsahuje humanizovaný 806.077 Fd fragment medzi miestom PstI a miestom Xmal a označil sa pCF005.

d) Klonovanie humanizovaného 806.077Fd do konštrukcie pre-pro [A248S,G251T,D253K]HCPB- linker

Dvoj vláknová DNA plazmidu pCF005 (opísaného v predchádzajúcom texte) sa pripravila štandardným postupom (plazmidová súprava Qiagen alebo podobná) a štiepila sa s enzýmami PstI a EcoRI. DNA so správnou veľkosťou (854 bp) obsahujúca humanizovaný Fd 806.077 fragment (870 bp) sa purifikovala. Dvoj vláknová DNA z plazmidového vektora pCF004 (opísaného v predchádzajúcom texte) sa pripravila, štiepila s reštrikčnými enzýmami PstI a EcoRI a purifikovala sa (3950 bp) podobným spôsobom ako humanizovaný Fd 806.077 fragment.

Pripravili sa ligačné zmesi na klonovanie génového fragmentu humanizovaného Fd 806.077 do vektora pCF0004 s pomerom 1 mol vektora na 2,5 mol inzertu a s celkovou koncentráciou DNA asi 2,5 ng/μΐ, s T4 DNA ligázou, lmM ATP a enzýmovým pufrom.

Po uskutočnení ligačnej reakcie sa zmes DNA použila na transformáciu kmeňa E. coli DH5a. Alikvotné diely buniek sa vysiali na L-agar so živným médiom obsahujúcim 100 μg/ml ampicilínu na selekciu plazmidového vektora, a inkubovali sa pri 37 °c cez noc. Niekoľko kolónií sa potom zobralo a použilo na minipreparáciu dvojvláknovej plazmidovej DNA. Tieto vzorky DNA sa analyzovali štiepením s reštrikčnými enzýmami a tak sa identifikovala konštrukcia so správnou konfiguráciou. Tento plazmid obsahujúci gén pre-pro [A248S,G251T,D253K]HCPB- linkerhumanizovaný 806.077Fd v pUC19 sa označil pCF006.

e) Klonovanie pre-pro[A248S,G251T,D253K]HCPB-linker-(humanizovaný 806.077)Fd do vektora pEE6hCMV

Dvojvláknová DNA plazmidu pCF006 (opísaného v predchádzajúcom texte) sa pripravila štandardným postupom (plazmidová súprava Qiagen alebo podobná) a štiepila sa s enzýmami HindlII a EcoRI. DNA so správnou velkosťou (2185 bp) obsahujúca fúzny proteín sa purifikovala.

Dvojvláknová DNA z plazmidového vektora pEE6 (opísaného v predchádzajúcom texte) sa pripravila, štiepila s reštrikčnými enzýmami HindlII a EcoRI a purifikovala (4775 bp) podobným spôsobom ako fragment fúzneho proteinu. Pripravili sa ligačné zmesi na klonovanie humanizovaného Fd 806.077 fúzneho proteinu do vektora pEE6 s pomerom 1 mol vektora na 2,5 mol inzertu a s celkovou koncentráciou DNA asi 2,5 ng/μΐ, s T4 DNA ligázou, lmM ATP a enzýmovým pufrom. Po uskutočnení ligačnej reakcie sa zmes DNA použila na transformáciu kmeňa E. coli DH5a. Alikvotné diely buniek sa vysiali na L-agar so živným médiom obsahujúcim 100 μg/ml ampicilínu na selekciu plazmidového vektora, a inkubovali sa pri 37 °C cez noc. Niekoľko kolónií sa potom zobralo a použilo na minipreparáciu dvojvláknovéj plazmidovej DNA. Tieto vzorky DNA sa analyzovali štiepením s reštrikčnými enzýmami a tak sa identifikovala konštrukcia so správnou konfiguráciou. Tento plazmid obsahujúci gén pre-pro[A248S,G251T,D253K]HCPBlinker-humanizovaný 806.077Fd v pEE6 sa označil pCF007.

f) Klonovanie humanizovaného lahkého reťazca 806.077 verzia 4 do vektora pEE12

Dvojvláknová DNA plazmidu pNG3-VKss-806.077-HuVK4-HuCK-Neo, konštrukcia obsahujúca humanizovanú verziu 806.077 HuVK4 s ľudským CK klonovaným do vektora pNG3 (pozri príklady 12-38), sa pripravila štandardným postupom (plazmidová súprava Qiagen alebo podobná) a štiepila sa s enzýmami HindlII a EcoRI. DNA so správnou veľkosťou (854 bp) obsahujúca humanizovaný 806.077 ľahký reťazec (2022 bp) sa purifikovala. Dvojvláknová DNA z plazmidového vektora sa pripravila, štiepila s reštrikčnými enzýmami HindlII a EcoRI a purifikovala (7085 bp) podobným spôsobom ako humanizovaný 806.077 ľahký reťazec. Pripravili sa ligačné zmesi pre humanizovaný ľahký reťazec 806.077 do vektora pEE12 a pomerom 1 mol vektora na 2,5 mol inzertu a s celkovou koncentráciou DNA asi 2,5 ng/μΐ, s T4 DNA ligázou, lmM ATP a enzýmovým pufrom. Po uskutočnení ligačnej reakcie sa zmes DNA použila na transformáciu kmeňa E. coli DH5a. Alikvotné diely buniek sa vysiali na L-agar so živným médiom obsahujúcim 100 μg/ml ampicilínu na selekciu plazmidového vektora, a inkubovali sa pri 37 ’C cez noc. Niekoľko kolónií sa potom zobralo a použilo na minipreparáciu dvojvláknovej plazmidovej DNA. Tieto vzorky DNA sa analyzovali štiepením s reštrikčnými enzýmami a tak sa identifikovala konštrukcia so správnou konfiguráciou. Tento plazmid obsahujúci humanizovaný ľahký reťazec 806.077 verzia 4 sa označil pCF008/4.

g) Klonovanie CMVp-pre-pro[A248S,G251T,D253K]HCPB-linker-(humanizovaný 806.077)Fd do pCF088/4

Dvojvláknová DNA plazmidu pCF007 (opísaného v predchádzajúcom texte) sa pripravila štandardným postupom (plazmidová súprava Qiagen alebo podobná) a štiepila s enzýmami BglII a Sali. Reštrikčný enzým BglII štiepi plazmid pCF007 na začiatku vedúcej sekvencie CMV MIE promótora a génu fúzneho proteínu. Reštrikčný enzým Sali štiepi asi 520 bp za stop kodónom maturovaného proteínu. Purifikovala sa DNA so správnou veľkosťou (4844 bp) obsahujúca fúzny protein. Dvojvláknová DNA z plazmidového vektora pCF008/4 sa pripravila, štiepila s reštrikčnými enzýmami BamHI a Sali a purifikovala (7436 bp) s podobným spôsobom ako fúzny protein. Pripravili sa ligačné zmesi na klonovanie fúzneho proteínu [A248S,G251T,D253K]HCPB- linker(humanizovaný 806.077)Fd do vektora pCF008/4 s pomerom 1 mol vektora na 2,5 mol inzertu a s celkovou koncentráciou DNA asi 2,5 ng/μΐ, s T4 DNA ligázou, lmM ATP a enzýmovým pufrom. Po uskutočnení ligačnej reakcie sa zmes DNA použila na transformáciu kmeňa E. coli DH5a. Alikvotné diely buniek sa vysiali na L-agar so živným médiom obsahujúcim 100 úg/ml ampicilínu na selekciu plazmidového vektora, a inkubovali sa pri 37 ’C cez noc. Niekoľko kolónií sa potom zobralo a použilo na minipreparáciu dvoj vláknovej plazmidovej DNA. Tieto vzorky DNA sa analyzovali štiepením s reštrikčnými enzýmami a tak sa identifikovala konštrukcia so správnou konfiguráciou. Tento plazmid obsahujúci gény pre pro[A248S,G251T,D253K]HCPB-linker(humanizované protilátky 806.077) v GS expresnom vektore pEE12 sa nazval pCF009 a jeho plazmidová mapa je uvedená na obr. 2. DNA sekvencie a aminokyselinová sekvencia ľahkého reťazca HuVK4 sú uvedené ako sekvencie SEQ ID NO: 70 a NO: 71. Sekvencia DNA génu pre-pro[A248S,G251T,D253K]HCPB-linker - (humanizované protilátky 806.077) je tu uvedená ako sekvencia SEQ ID NO: 124 a príslušná sekvencia aminokyselín ako SEQ ID NO: 125.

h) Expresia pro[mutant]HCPB-linker-(Fab')₂ (humanizovaný 806.077) v myšacích myelómových bunkách

Nasledujúce metódy sa využili na expresiu všetkých mutantov ([D253K], [G251T,D253K] a [A248S,G251T,D253K]) pro-HCPB fúznych proteínov.

Výhodná myšacia myelómová bunková línia je NS0 (Galfre a Milstein, 1981, Methods in Enzymol. 73, 3-46) a je dostupná z ECACC, PHLS CAMR, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 0JG (ECACC katalóg, č. 85110503) . Tieto bunky sa kultivovali v Eaglovom médiu modifikovanom Dulbeccom (DMEM, Gibco BRL) obsahujúcom 10% teplom inaktivovaného fetálneho teľacieho séra (FSC) .

Na expresiu pro[mutant]HCPB-linker-(Fab')₂ (humanizovaný 806.077) sa použili plazmidy pFC009 (opísaný v predchádzajúcom texte) a pRc/RSV (Invitrogen katalóg. č. V780-20), ktorý obsahuje gén rezistencie voči neomycínu na selekciu stabilných bunkových línií rezistentných voči G418.

Približne 5 μg z každého plazmidu (v rozsahu od 0,5 do 10 μg) sa použilo na transfekciu 8x106 buniek NSO metódou lipofekcie, t. j. prenosom polynukleotidu do eukaryotickej bunky sprostredkovaným katiónovým lipidom (Felgner a kol., METHODS: A Companion to Methods in Enzymology, 1993, 5, 67-75) . Bunky sa zozbierali odstredením, opláchli sa médiom bez séra (30 ml), resuspendovali v 800 μΐ média a udržovali pri 37 °C v nádobe pre tkanivové kultúry pokial sa nepridala DNA. Médium bez séra (450 μΐ) sa jemne premiešalo s činidlom LIPOFECTIN™ (50 μΐ) a inkubovalo sa pri teplote miestnosti 30 až 45 minút. Táto zmes sa pridala k 500 μΐ média obsahujúceho plazmidovú DNA (v objeme menšom ako 100 μΐ) a ponechala sa pri teplote miestnosti 15 minút. Médium bez séra (600 μΐ) sa potom pridalo k zmesi DNA/LIPOFECTIN™ a zmes sa pridala k bunkám, ktoré sa ďalej inkubovali 6 hodín pri 37 °C v inkubátore s CO₂. Médium obsahujúce DNA sa potom nahradilo s normálnym médiom DMEM (8 ml) obsahujúcim 10% FCS a bunky sa inkubovali cez noc. Potom sa médium opäť nahradilo s normálnym DMEM médiom (8 ml) obsahujúcom 10% FCS a bunky sa inkubovali rovnako ako predtým ďalších 24 hodín. Na konci tejto inkubácie sa médium opäť nahradilo s normálnym DMEM médiom obsahujúcim 10% FCS a selekčný G418 (1,5 mg/ml) a bunky sa nariedili (1 k 4 až 1 k 20) (približne 0,6 až l,5xl0⁶ buniek na misku) s rovnakým médiom do jamiek mikrotitračnej doštičky (150 μΐ) na jamku, 2 alebo viac doštičiek na každé riedenie). Mikrotitračné doštičky sa inkubovali aspoň 2 týždne pri 37 °C v inkubátore s C0₂ a pravidelne sa kontrolovali, či tvoria životaschopné klony. Médium z jamiek obsahujúcich jednotlivé životaschopné klony sa odobralo na testovanie a nahradilo sa s čerstvým médiom (obsahujúcim G418). Odoberané médium sa testovalo na väzbu protilátky CEA v ELISA teste (spôsobom, ktorý je opísaný v Medzinárodnej patentovej prihláške č. WO 96/20011, referenčný príklad 5, časť 1, okrem toho, že sekundárna anti-myšacia protilátka sa zamenila za anti-Iudskú (kozí anti-Iudský lahký reťazec kappa konjugovaný s peroxidázou, Sigma 7164) . Vzorky pozitívne v teste CEA ELISA sa tiež testovali na enzýmovú aktivitu [A248S,G251T,D253K]HCPB (ako sa už opísalo v predchádzajúcom texte) po aktivácii (t. j. odstránení pro-domény z fúzneho proteínu) s trypsínom (700 μg/ml v 50mM Tris-HCl a 150mM NaCl pH 7,6 pri 4 °C 1 hodinu, reakcia sa zastavila pridaním päťnásobku inhibítora trypsínu zo sóje) . Identifikovalo sa niekolko klonov, ktoré produkovali médium pozitívne na 806.077 protilátku viažucu CEA a enzýmovú aktivitu [A248S,G251T,D253K]HCPB. Tieto klony sa ďalej testovali analýzou neredukujúcim western prenosom (ako je opísané v Medzinárodnej patentovej prihláške č. WO 96/20011, referenčný príklad 5, okrem toho, že anti-myšacia protilátka sa zamenila za anti-Iudskú (kozí anti-Iudský lahký reťazec kappa konjugovaný s peroxidázou, Sigma A7164) na identifikáciu klonov, ktoré produkujú prednostne fúzny proteín (Fab')₂806.077. Tieto klony sa namnožili, testovali na stabilnú tvorbu fúzneho proteínu v priebehu niekoľkých generácií a najväčší producenti sa potom spojili a uchovali zmrazení v kvapalnom dusíku štandardným spôsobom.

Namnoženie, expresia vysokej úrovne a fermentácie fúznych proteínov v myelómových bunkách NS0 sa uskutočnili podobným spôsobom, ktorý opísali Bebbington a kol., 1992, Bio/Technology, 10, 169-174. Fúzne proteíny sa purifikovali a pro-sekvencia sa odstránila ako je opísané v príklade 102.

Príklady 76 a 101

Klonovanie a expresia ďalších variantov proHCPB-linker(humanizovaný 806.077)Fd + (humanizovaný 806.077)lahký reťazec

Spôsob vytvárania fúznych proteínov s ďalšími mutantmi HCPB bol podobný tomu, ktorý je podrobne opísaný v predchádzajúcom príklade 7, okrem časti b) tohto príkladu, a použili sa mutanty [D253K]HCPB alebo [G251T,D253K]HCPB miesto [A248S,G251T,D253K], a plazmidová DNA použitá v PCR bola z pICI1713 (pozri Medzinárodná patentová prihláška WO 96/20011, príklad 15) alebo pZEN1860 (referenčný príklad 1). Na klonovanie, identifikáciu a potvrdenie sekvencie sa použili výsledné plazmidy obsahujúce pre-pro[D253K]HCPB-linker alebo pre-pro[G251T, D253K]HCPBlinker a humanizovaný gén 806.077 nad miestom PstI (5. aminokyselina) vo vektore pUC19 ako základu, namiesto plazmidu pCF004 v nasledujúcom klonovaní.

Spôsob vytvárania fúznych proteínov s ďalšími doménami CH1 bol podobný tomu, ktorý je podrobne opísaný v predchádzajúcom príklade 7, okrem časti c) tohto príkladu, a použili sa plazmidy obsahujúce buď verziu 1 humanizovaného 806.077VH s ludským IgGl alebo IgG2 CH1 a kĺbovými úsekmi namiesto 806.077-HuVHl-IgG3CHľ (sekvencie SEQ ID NO: 92 a NO: 56) . Po klonovaní, identifikácii a potvrdení sekvencii sa výsledné plazmidy, obsahujúce sekvencie IgGl alebo IgG2 použili namiesto plazmidu pCF005 pre nasledujúce klonovanie.

Spôsob vytvárania fúznych proteínov s ďalšími variantmi humanizovaného lahkého reťazca 806.077 bol podobný tomu, ktorý je podrobne opísaný v predchádzajúcom príklade 7, okrem časti f) tohto príkladu, a použili sa plazmidy obsahujúce buď verziu 1 alebo verziu 3 humanizovaného 806.077Lc namiesto 806.077-HuVK4HuCK (sekvencie SEQ ID NO: 51 a NO: 96). Po klonovaní, identifikácii a potvrdení sekvencii sa výsledné plazmidy obsahujúce alternatívne sekvencie ľahkých reťazcov použili namiesto plazmidu pCF008/4 v nasledujúcom klonovaní. Varianty príbuzných proteinov v každom jednotlivom prípade (príklady 76 až 101) sú uvedené v nasledujúcej tabuľke.

	humanizovaný ťažký reťazec	humanizovaný lahký reťazec	mutant enzýmu KPCB
75	i-.u'/Z-i - ?.uícG3	HuVK4-HuCK	[D253K] HCPB
77	MU Vr. ‘ -mu±cG3	HuVK4-HuCK	[G251T, D253K]HCPB
73	HuVHi-HuIcG3	HuVKl-HuCK	[A248S, G251T, D253K]HCP3
79	r.u VH i - mu _ gG 3	HuVKl-HuCK	[D253K] HCPB
30	Huvm· -r.uicG3	HuVKl-HuCK	[G251T, D253K]HCPB
21	HuVHi -KulgG3	KuVK3-HuCK	[A248S, G251T, D253K]HCPB
32	HuVHl-HuIgG3	HuVK3-HuCK	[D253K] HCPB
33	HuVKl-HuIgG3	HuVK3-HuCK	[G251T, D253K] HCPB
34	HuVHi-HuIgGl	HuVK4-HuCK	[A248S, G251T, D253K]HC?3
35	HuVKl-HuIgGl	HuVK4-HuCK	[D253K]HCPB
3 o	HuVHi-HulcGl	KuVK4-HuCK	[G251T, D253K]HCP3
87	HuVKl-HuIgGl	HuVKl-HuCK	[A243S, G251T, D253K]HC?3
33	HuVHi-HuIcC-l	HuVKl-HuCK	[D253K]HCP3
39	HuVHi-HuIgGl	HuVKl-HuCK	[G251T, D253K]HCPB
90	KuVH1-HuIgGl	HuVK3-HuCK	[A248S, G251T, D253K]HCPB
9i	HuVHi-HuIgGl	HuVK3-HuCK	[D253K]HCPB
92	HuVHi-HuIgGl	HuVK3-HuCK	[G251T, D253K]HCPB
93	HuVKl-HuIgG2	HuVK4-HuCK	[A248S, G251.T, D253K]HCPB
94	HuVHl-HuIgG2	HuVK4-HuCK	[D253K] HCPB

95	HuVHl -HuZcG2	EuVX4-HuČK	ÍG251T, D253K1HCPB
96	HuVHl-HuIcG2	EuVKl-HuCK	[A24SS, G251T, D253K]HCPB
97	HuVHl-HuZgG2	EuVKl-HuCK	[D253K] ECPB
93	r.uVHl-Hu^TcG2	EuVKl-HuCK	[G2S1T, D253K]HCPB
99	HuVHl-HuZcG2	EuVK3-EuCK	[A243S, G251T, D253K]HCP3
100	n u v - j. -n j. cu2	HuVX3-HuCX	[D253K]EC?3
101	HuVH1-Hu ZcG2	HuVX2-HuCX	[G251T, D253X]HCPB

Príklad 102

Purifikáca proteínov obsahujúcich sekvencie protilátky 806.077

Purifikácia rekombinantných F(ab')r proteínov alebo fúznych proteínov protilátka-enzým zo supernatantov myelómových buniek, buniek CHO alebo buniek COS možno dosiahnuť niekoľkými spôsobmi, a to použitými buď jednotlivo alebo spoločne. Purifikácia myšacích 806.077 F(ab'): chimérnych konštrukcií 806.077 F(ab')? a úplne humanizovaných konštrukcií 806.077 F(ab')? sa uskutočnila jednou alebo niekoľkými z nasledovných metód: afinitná chromatografia, aniónová výmenná chromatografia alebo proteín A/proteín G chromatografia. Tieto spôsoby možno tiež použiť na purifikáciu fúznych konštrukcií protilátka 806.077-B7 (pozri príklad 104) .

a) Afinitná chromatografia s antigénom

Karcionoembryonický antigén (CEA) , proti ktorému sa pripravila pôvodná myšacia protilátka 806.077, sa imobilizoval v chromatografickej kolóne (s použitím produktov firmy Pharmacia). výrobcu. Stručne, antigén sa imobilizuje prostredníctvom stabilných esterových väzieb na prostredie s médiom Sepharose™ High Performance, naplneným v kolónach (HiTrap™) a NHSaktivovaných. Naviazanie CEA na aktivovaný matrix sa uskutočnilo podľa štandardných inštrukcií výrobcu.

Príprava lml afinitnej kolóny

Zásobný roztok CEA (8 mg/ml) sa najskôr nariedil väzbovým pufrom (0,2M hydrogenuhličitan sodný, 0,5M chlorid sodný, pH 8,3) na výslednú koncentráciu 0,5 mg/ml. Nová kolóna sa prepláchla so 6 ml vychladenej lmM HCI s prietokom nepresahujúcim 1 ml/min. Bezprostredne potom sa ligand CEA (1 ml s koncentráciou 0,5 mg/ml) injikoval do kolóny. Kolóna sa uzavrela na obidvoch koncoch a ponechala 30 minút pri teplote miestnosti. Prebytočné aktívne skupiny, ktoré naviazali ligand, sa deaktivovali a všetky nešpecifický naviazané ligandy sa odstránili prepláchnutím kolóny trikrát striedavo pufrom s vysokým a nízkym pH. Použité pufre boli 0,5M etanolamín, 0,5M chlorid sodný (pH 8,3) a O,1M octan sodný, 0,5M chlorid' sodný (pH 4,0). Pri každom prepláchnutí matrixu sa použilo 6 ml každého pufru. Nakoniec sa kolóna prepláchla skladovacím pufrom (0,05M Na₂HPO4, 0,01% NaN₃, pH 7,0).

Postup purifikácie

Supernatant z bunkovej kultúry, obsahujúci požadované konštrukcie F(ab')₂ alebo fúzne konštrukcie, t. j. chimérne konštrukcie 806.077 F(ab')₂, humanizované konštrukcie 806.077

F(ab')₂ alebo fúzne proteíny protilátka-enzým, sa nariedil v pomere 1:1 s PBS (pH 7,2) a aplikoval na kolónu s prietokom 1 ml/min. Kolóna sa predtým ekvilibrovala s roztokom PBS (50mM fosforečnan sodný, 150mM chlorid sodný, pH 7,2). Kolóna sa prepláchla desaťnásobkom objemu PBS potom, čo ňou prešiel bunkový supernatant. Naviazané F(ab')₂ sa eluovali 5-násobkom objemu lOOmM citrátu sodného (pH 3,0) a odoberali sa 1 ml frakcie. Eluované F(ab')₂ sa detegovali western analýzou pomocou vhodného konjugátu protilátky a peroxidázy (anti-ludské ľahké reťazce kappa Sigma A7164 v prípade úplne humanizovaných F(ab')₂), ktorá sa vizualizovala peroxidom vodíka a 4-chloro-l96 naftolom. Vhodné frakcie sa spojili a pokiaľ to bolo nutné, zakoncentrovali sa pomocou centrifugácie (Centricon™) .

b) Aniónová výmenná chromatografia

Supernatant z bunkovej kultúry, obsahujúci požadované konštrukcie F(ab')₂z t.j. chimérne konštrukcie 806.077 F(ab')₂, humanizované konštrukcie F(ab')₂ alebo fúzne proteíny protilátkaenzým, sa diafiltroval do 50mM Tris (pomocou premiešavanej kyvety s cut-off membránou s limitom filtrácie molekulovej hmotnosti 10 000) dokial iónová sila roztoku nebola v rovnováhe s ekvilibračným pufrom kolóny. 4 0ml alikvotná časť diafiltrovaného roztoku sa naniesla do vhodnej kolóny (Pharmacia Mono Q™ 10/10HR) s rýchlosťou 2 ml/min. Kolóna sa predtým ekvilibrovala s 50mM Tris-HCl (pH 8,0). Keď supernatant prešiel kolónou, kolóna sa prepláchla opäť ekvilibračným pufrom.

Naviazaný materiál sa potom eluoval 15-násobkom (objemu kolóny) s 0-50% pufru B (50mM Tris, IM chlorid sodný, pH 8,0). Eluované frakcie sa zbierali (4 ml na frakciu) a frakcie obsahujúce F(ab')₂ sa identifikovali western analýzou pomocou vhodného konjugátu protilátky a peroxidázy (anti-ľudské ľahké reťazca kappa Sigma A7164 v prípade úplne humanizovaných F(ab')₂, ktorá sa vizualizovala peroxidom vodíka a 4-chloro-l-naftolom. Vhodné frakcie sa zlúčili a pokiaľ to bolo nutné, zakoncentrovali sa pomocou centrifugácie (Centricon™) .

c) Purifikácia pomocou proteín A/proteín G

Supernatant z bunkovej kultúry obsahujúci požadované konštrukcie F(ab')₂ alebo fúzne konštrukcie (t.j. 806.077 F(ab')₂, chimérne konštrukcie 806.077 IgGl alebo IgG2 alebo IgG3, konštrukcie pro-HCPB-linker-806.077 F(ab')₂, konštrukcie 806.077 F (ab') ₂-HCPB) sa nariedil v pomere 1:1 s PBS a potom sa naniesol na kolónu predtým ekvilibrovanou s PBS (pH 7,2). Kolón sa prepláchla s PBS a naviazané F(ab')₂ alebo fúzne proteíny sa potom eluovali so lOOmM citrátom sodným (pH 3,0) v prípade F(ab')₂ a 50mM glycínom + lOOmM chloridom sodným (pH 10,8) v prípade fúznych proteínov. Eluované frakcie sa spojili a neutralizovali pridaním 125 μΐ 2M Tris na každý 1 ml eluátu. Frakcie obsahujúce F(ab')₂ sa spojili a pokial to bolo nutné, zakoncentrovali sa centrifugáciou.

d) Štiepenie pro-sekvencie

Fúzne proteíny obsahujúce kovalentne spojené pro-sekvencie (t.j. Pro-HCPB-linker-806.077 F(ab')₂) sa inkubovali s trypsínom, aby sa odštiepila pro-sekvencia. Tento postup v miligramovej mierke (vzhľadom na fúzny proteín) sa uskutočnil nasledovne. Trypsín sa zmiešal v pomere 1:1000 (trypsín:fúzny proteín). Zmes sa inkubovala 24 hodín pri teplote miestnosti (približne 22 ’C), kým sa nedokončilo štiepenie. Fúzny proteín sa potom separoval od pro-sekvencie recirkuláciou zmesi podľa jedného z pôvodných postupov pre chromatografickú purifikáciu alebo obohatenie zmesi.

Príklad 103

Test aktivity fúznych proteínov protilátka-enzým obsahujúcich mutovanú ľudskú CPB proti analógom predlieku Hipp-Glu

Supernatanty bunkových kultúr alebo purifikované fúzne proteíny protilátka-enzým obsahujúce mutanty ľudskej CPB ([D253K], [G251T,D253K] alebo [A248S,G251T, D253K], pozri príklady 48 až 101) sa testovali na schopnosť premieňať kyselinu hippuryl-L-glutámovú (Hipp-Glu, pozri Medzinárodná patentová prihláška WO 96/20011, referenčný príklad 9) na kyselinu hippurovú meraním na HPLC.

Reakčná zmes (250 μΐ) obsahovala buď 4 μg purifikovaného fúzneho proteínu alebo supernatantu bunkovej kultúry (buď v pôvodnom stave alebo nariedeného s 0,025M Tris-HCI, pH 7,5, 125 μΐ) a 0,5mM Hipp-Glu v 0, 025M Tris-HCl, pH 7,5. Vzorky sa inkubovali 5 hodín pri 37 ’C. Reakcia sa zastavila pridaním 250 μΐ 30% metanolu, 70% fosfátového pufru (50mM, pH 6,5), 0,2% kyseliny trifluóroctovej a kyselina hippurová, ktorá sa tvorila, sa kvantifikovala pomocou HPLC (Hewlett Packard 1090 Šerieš 11 s diódovým poľom).

Vzorky (50 μΐ) sa injikovali do kolóny (25 cm, HICHROM™ HiRPB) a separovali pomocou pohyblivej fázy z 15% metanolu a 85% fosfátového pufru (50mM, pH 6,5) pri prietoku 1 ml/min. Množstvo vznikajúceho produktu (kyseliny hippurovej) sa stanovilo pomocou kalibračnej krivky pripravenej zo známych množstiev kyseliny hippurovej (Sigma H6375). Výsledky sú vyjadrené ako percentá konverzie substrátu na produkt pri 37 °C v časovom rozsahu od 30 minút do 24 hodín v závislosti na rýchlosti konverzie.

V prípade fúznych proteinov protilátka-enzým s N-koncovou proCPB sa pro-doména najskôr odstránila štiepením s trypsínom (700 μg/ml) v 50mM Tris-HCl, pH 7,6, 150 mM NaCl 1 hodinu pri ’C.

Príklad 104

Príprava fúzneho proteinu ľudská B7.1-humanizovaný 806.077 F(ab')₂ (hB7-806)

Rovnako ako v referenčnom príklade 3 sa fúzny proteín obsahujúci signálnu sekvenciu a extracelulárnu doménu ľudskej B7.1 fúzovanej priamo k 5'-koncu kódujúceho úseku humanizovaného reťazca Fd protilátky 806.077 pripravil pomocou PCR. Vytvoril sa tak fragment HindlII-NheI obsahujúci prirodzenú signálnu sekvenciu a extracelulárnu doménu ľudskej B7.1 fúzovanej priamo k úseku VH humanizovaného ťažkého reťazca protilátky 806.077. Ten sa klonoval do vhodného vektora, napr. pNG4-VHss-HuIgG2CHl' alebo pNG4-VHss-HuIgG3CHľ (pozri príklady 39 až 47) (a nahradil bázy 1 až 423 v sekvencii SEQ ID NO: 18), čím vznikol fúzny gén ľudská B7.1-humanizovaný 806.077Fd. Ko-expresia tohto fúzneho génu s humanizovaným 806.077 L reťazcom (vhodný vektor, obsahujúci verziu VK4 humanizovaného 806.077 ľahkého reťazca, je pCF008/4, pozri príklad 75) sa dosiahla po konštrukcii koexpresného vektora pomocou expresných systémov tu opísaných. Takýto vektor sa potom použije na transfekciu myelómových buniek NSO a kolónie sa selektujú na prítomnosť CEA väzbovej aktivity v supernatante bunkových kultúr. Ďalšie humanizované sekvencie sa už opísali v príkladoch 39 až 47.

Fúzny proteín hB7-806 sa exprimuje vo vhodnej bunkovej línii a purifikuje pomocou kolóny s proteínom A, ako je opísané v referenčnom príklade 102. Je nutné poznamenať, že pre fragmenty humanizovaných protilátok 806.077 a ich fúzne proteíny sú výhodné iné purifikačné metódy ako kolóny a proteínom A. Fúzne proteíny sa môžu testovať tak na väzbu antigénu ako aj receptoru a tiež na ko-stimulačnú aktivitu T-buniek, keď sa naviažu na bunky LS174T, pomocou testu opísaného v referenčnom príklade 3.

Príklad 105

Príprava chimérnych a humanizovaných konjugátov 806.077 F(ab')₂CPG2

Postup opísaný v príklade 5 sa opakoval s tým, že myšací F(ab')₂ sa nahradil jednou z chimérnych verzií opísaných v príklade 8 alebo jednou z humanizovaných verzií opísaných v príkladoch 39 až 47.

Príklad 106

Príprava fúzneho proteinu humanizovaný 806.077 Fab - enzým CPG2

Konštrukcie fúznych proteínov humanizovanej protilátky 806.077 a bakteriálneho enzýmu CPG2 sa pripravili pomocou PCR

100 podobne ako sa skonštruovali HuVK4 v príkladoch 12 až 38, kde sa použili špeciálne navrhnuté primery pre PCR reakcie, aby sa amplifikovali zložky génov protilátky a enzýmu (tak, aby výsledné produkty DN obsahovali presahujúce komplementárne sekvencie), ktoré sa spojili prostredníctvom špeciálnej PCR reakcie typu zostrih/spojenie, a tak sa vytvoril úplný gén fúzneho proteínu protilátka-enzým. Fúzny protein sa teda vytvoril spojením 3'-konca génu humanizovaného ťažkého reťazca 806.077 Fd s 5'-koncom štruktúrneho kódujúceho génu CPG2, čím vznikne gén kódujúci fúzny protein Fab-CPG2. V takejto konštrukcii môže byť zložka humanizovaného ťažkého reťazca 806.077 ukončená za zvyškom K236 v prípade ťažkého reťazca HuVHl-HuIgGl Fd (sekvencia SEQ ID NO: 93) , za zvyškom Val237 v prípade ťažkého reťazca HuVHl-HuIgG2 Fd (sekvencia SEQ' ID NO: 57) alebo za zvyškom reťazca Val237 v prípade HuVHl-HuIgG3 Fd (sekvencia SEQ ID NO: 95) (v každom prípade vrátane akejkolvek sekvencie patriacej ku kĺbovému úseku) a môže sa spojiť s prvým zvyškom CPG2 na C-konci od štiepiaceho miesta signálnej sekvencie (Minton a kol., 1984, Gene 31, 31-38). Avšak preto, aby sa získali optimálne väzbové vlastnosti protilátky a optimálne enzýmové vlastnosti, odporúča sa vložiť ďalšie zvyšky do miesta spojenia medzi dvoma zložkami.

Fúzny gén sa potom klonuje do vhodného vektora, napr. pNG4VHss-HuIgG2CHľ (NCIMB č. 40797), po príslušnom štiepení s reštrikčnými enzýmami a izolácii vektora a fúzneho génu je pripravený fragment DNA, ktorý nahrádza pôvodný gén protilátky génom fúzneho proteínu. Ko-expresia fúzneho génu s humanizovaným lahkým reťazcom 806.077 sa potom dosiahne skonštruovaním koexpresného vektora rovnako ako je to opísané v príklade 11. Koexpresný vektor sa použije na transfekciu myelómových buniek NSO a kolónie sa potom selektujú na svoje CEA a Fd väzbové vlastnosti zo supernatantu bunkových kultúr ako sa opísalo v predchádzajúcom texte. Fúzny protein sa môže purifikovať pomocou

101 kolóny s proteínom-A a štandardnými testami sa dokáže, či má požadované antigénne a enzýmové vlastnosti.

Príklad 107

Ďalšie kombinácie humanizovaných variabilných úsekov ťažkého a lahkého reťazca na podklade sekvencie ľahkého reťazca VK4

Postup opísaný v príkladoch 12 až 38 sa opakoval s tým, že variabilné sekvencie humanizovaného lahkého reťazca VK4 (sekvencia SEQ ID NO: 71) sa nahradila modifikovanou sekvenciou, kde tyrozín (Tyr) v polohe 35 sekvencie SEQ ID NO: 71 sa nahradil s fenylalanínom (Phe).

Príklad 108

Ďalšia kombinácia humanizovaných variabilných úsekov ťažkého a lahkého reťazca na podklade sekvencie lahkého reťazca VK4

Postup opísaný v príkladoch 12 až 38 sa opakoval s tým, že variabilné sekvencie humanizovaného lahkého reťazca VK4 (sekvencia SEQ ID NO: 71) sa nahradila modifikovanou sekvenciou, kde fenylalanín (Phe) v polohe 72 sekvencie SEQ ID NO: 71) sa nahradil s leucínom (Leu).

Príklad 109

Postup opísaný v príkladoch 12 až 38 sa opakoval s tým, že variabilné sekvencie humanizovaného lahkého reťazca VK4 (sekvencia SEQ ID NO: 71) sa nahradila modifikovanou sekvenciou, kde tyrozín (Tyr) v polohe 35 sekvencie SEQ ID NO: 71) sa nahradil s fenylalanínom (Phe) a fenylalanín (Phe) v polohe 72 sekvencie SEQ ID NO: 71 sa nahradil s leucínom (Leu).

102

Príklad. 110

Kombinácia humanizovaných variabilných úsekov ťažkého reťazca a chimérnych sekvencii lahkého reťazca

Postup opísaný v príkladoch 12 až 38 sa opakoval s tým, že variabilné sekvencie humanizovaného lahkého reťazca sa nahradila s chimérnou sekvenciou SEQ ID NO: 17 tu opísanou v príklade 8.

Príklady 111 až 113

Expresia humanizovaných fragmentov F(ab')₂ s modifikovanou variabilnou sekvenciou lahkého reťazca VK4

Postupy opísané v príkladoch 39 až 47 sa opakovali s tým, že variabilná sekvencia opísaná v príklade 107 sa použila na nahradenie humanizovanéj sekvencie lahkého reťazca (sekvencia SEQ ID NO: 99) a že tyrozín (Tyr) v polohe 57 sekvencie SEQ ID NO: 99 sa nahradil s fenylalanínom (Phe).

Príklad 111 kombinuje HuVHl-HuIgGl a modifikovanú sekvenciu SEQ ID NO: 99 opísanú v úvodnom odseku.

Príklad 112 kombinuje HuVHl-HuIgG2 a modifikovanú sekvenciu SEQ ID NO: 99 opísanú v úvodnom odseku.

Príklad 113 kombinuje HuVHl-HuIgG3 a modifikovanú sekvenciu SEQ ID NO: 99 opísanú v úvodnom odseku.

Príklady 114 až 116

Postupy opísané v príkladoch 39 až 47 sa opakovali s tým, že variabilná sekvencia opísaná v príklade 108 sa použila na nahradenie humanizovanej sekvencie lahkého reťazca (sekvencia SEQ ID NO: 99) a že fenylalanín (Phe) v polohe 94 sekvencie SEQ ID NO: 99 sa nahradil s leucínom (Leu).

103

Príklad 114 kombinuje HuVHl-HuIgGl a modifikovanú sekvenciu SEQ ID NO: 99 opísanú v úvodnom odseku.

Príklad 115 kombinuje HuVHl-HuIgG2 a modifikovanú sekvenciu SEQ ID NO: 99 opísanú v úvodnom odseku.

Príklad 116 kombinuje HuVHl-HuIgG3 a modifikovanú sekvenciu SEQ ID NO: 99 opísanú v úvodnom odseku.

Príklady 117 až 119

Expresia humanizovaných fragmentov F(ab')₂ s modifikovanou variabilnou sekvenciou ľahkého reťazca VK4

Postupy opísané v príkladoch 39 až 47 sa opakovali s tým, že variabilná sekvencia opísaná v príklade 109 sa použila na nahradenie humanizovanej sekvencie lahkého reťazca (sekvencia SEQ ID NO: 99) a že tyrozín (Tyr) v polohe 57 sekvencie SEQ ID NO: 99 sa nahradil s fenylalanínom (Phe).

Príklad 117 kombinuje HuVHl-HuIgGl a modifikovanú sekvenciu SEQ ID NO: 99 opísanú v úvodnom odseku.

Príklad 118 kombinuje HuVHl-HuIgG2 a modifikovanú sekvenciu SEQ ID NO: 99 opísanú v úvodnom odseku.

Príklad 119 kombinuje HuVHl-HuIgG3 a modifikovanú sekvenciu SEQ ID NO: 99 opísanú v úvodnom odseku.

Príklady 120 až 122

Expresia humanizovaných fragmentov F(ab')₂ s chimérnou sekvenciou lahkého reťazca

Postupy opísané v príkladoch 39 až 47 sa opakovali s tým, že chimérna sekvencia lahkého reťazca opísaná v príklade 110 nahradila sekvencie humanizovaných ľahkých reťazcov použitých v príkladoch 39 až 47.

Príklad 120 kombinuje HuVHl-HuIgGl a chimérnu sekvenciu lahkého reťazca opísanú v úvodnom odseku.

104

Príklad 121 kombinuje HuVHl-HuIgG2 a chimérnu sekvenciu lahkého reťazca opísanú v úvodnom odseku.

Príklad 122 kombinuje HuVHl-HuIgG3 a chimérnu sekvenciu ľahkého reťazca opísanú v úvodnom odseku.

Príklad 123

Príprava humanizovaného fúzneho proteínu založeného na modifikovanej sekvencii lahkého reťazca VK4

Postupy opísané v príklade 48 sa opakovali, ale s tým, že plazmid pEE14-806-077HuVK4-HuCK sa nahradil s plazmidom obsahujúcim modifikované sekvencie VK4 uvedené v príkladoch 107 a 111 až 113.

Príklad 124

Postupy opísané v príklade 48 sa opakovali, ale s tým, že plazmid pEE14-806-077HuVK4-HuCK sa nahradil s plazmidom obsahujúcim modifikované sekvencie VK4 uvedené v príkladoch 108 a 114 až 116.

Príklad 125

Postupy opísané v príklade 48 sa opakovali, ale s tým, že plazmid pEE14-806-077HuVK4-HuCK sa nahradil s plazmidom obsahujúcim modifikované sekvencie VK4 uvedené v príkladoch 109 a 117 až 119.

105

Príklad 126

Príprava humanizovaného fúzneho proteínu založeného na chimérnej sekvencii ľahkého reťazca VK4

Postupy opísané v príklade 48 sa opakovali, ale s tým, že plazmid pEE14-806-077HuVK4-HuCK sa nahradil s plazmidom obsahujúcim chimérne sekvencie ľahkého reťazca uvedené v príkladoch 110 a 120 až 122.

Príklad 127

Príprava humanizovaného fúzneho proteínu založeného na modifikovanej sekvencii ľahkého reťazca VK4

Postupy opísané v príklade 75 sa opakovali, ale s tým, že plazmid pCF008/4 sa nahradil s plazmidom obsahujúcim modifikované sekvencie VK4 uvedené v príkladoch 107 a 111 až 113.

Príklad 128

Postupy opísané v príklade 75 sa opakovali, ale s tým, že plazmid pCF008/4 sa nahradil s plazmidom obsahujúcim modifikované sekvencie VK4 uvedené v príkladoch 108 a 114 až 116.

Príklad 129

Postupy opísané v príklade 75 sa opakovali, ale s tým, že plazmid pCF008/4 sa nahradil s plazmidom obsahujúcim modifikované sekvencie VK4 uvedené v príkladoch 109 a 117 až

119.

106

Príklad 130

Príprava humanizovaného fúzneho proteinu založeného na modifikovanej sekvencii ľahkého reťazca VK4

Postupy opísané v príklade 75 sa opakovali, ale s tým, že plazmid pCF008/4 sa nahradil s plazmidom obsahujúcim modifikované sekvencie VK4 uvedené v príkladoch 110 a 120 až 122 .

Referenčný príklad 1

Príprava génovej sekvencie [G251,D253K]HCPB

Spôsob klonovania [G251,D253K]HCPB v E. coli bol velmi podobný spôsobu opísanému v Medzinárodnej patentovej prihláške WO 96/20011, príklad 15. Plazmid pICI266 sa použil ak klonovací vektor, ale východiskovým materiálom pre miestne cielenú mutagenézu pomocou PCR bol gén [D253KJHCPB v plazmide pICI1713 (pozri Medzinárodná patentová prihláška WO 96/20011, príklad 15) . Avšak v tomto prípade miestne cielená mutagenéza prostredníctvom PCR amplifikácie génu sa použila na zámenu aminokyselinového kodónu v polohe 251 maturovaného génu, t.j. glycínu na treonín (GGC na ACT), teda mutácia G251T. Počas generovania tejto mutácie vznikol tiež celý rad mutácií v rovnakom mieste tým, že sa použila zmes oligonukleotidov so zámenou kodónu v polohe G251T. Jednotlivé mutované gény sa identifikovali po transformácii a hybridizácii sekvenovaním príslušného mutovaného miesta a potom sa sekvenoval celý gén. V tomto prípade sa však berie do úvahy iba oligonukleotid na vnesenie mutácie G251T. Pripravili sa dve reakcie PCR rovnakým spôsobom ako je opísané v Medzinárodnej patentovej prihláške WO 96/20011, príklad 15. V prvej reakcii sa použili primery CAN00402 (sekvencia SEQ ID NO: 116) a CAN00734 (sekvencia SEQ ID NO: 117) . V druhej reakcii sa použili primery CAN00284

107 (sekvencia SEQ ID NO: 118) a CAN01076 (sekvencia SEQ ID NO: 119). V obidvoch prípadoch východisková DNA bol plazmid PICI1713.

Alikvoty z obidvoch PCR sa analyzovali, či obsahujú DNA so správnou veľkosťou (750 a 250 bp) , zmerala sa koncentrácia elektroforézou na agarózovom géli a zistilo sa, že obsahujú prevažne pásy zodpovedajúce správnej veľkosti. Ďalšia PCR sa pripravila s použitím primárnych produktov z obidvoch PCR s primermi CÄN00402 (sekvencia SEQ ID NO: 116) a CAN00284 (sekvencia SEQ ID NO: 118). Alikvot z PCR sa analyzoval, či obsahuje DNA so správnou veľkosťou (1000 bp), zmerala sa koncentrácia elektroforézou na agarózovom géli a zistilo sa, že obsahuje prevažne pás zodpovedajúci správnej veľkosti. Zvyšok PCR produktu z reakčnej zmesi sa purifikoval, izolovaná DNA sa štiepila s reštrikčnými enzýmami Ncoľ a EcoRl a purifikoval sa pás so správnou veľkosťou (1000 bp) rovnako ako je opísané v Medzinárodnej patentovej prihláške WO 96/20011, príklad 16.

Dvojvláknová DNA plazmidu pICl266 sa štiepila s enzýmami Ncoľ a EcoRl a DNA so správnou veľkosťou (5600 bp) sa purifikovala. Skontrolovala sa čistota alikvotov štiepeného a purifikovaného vektora a inzertu DNA a zmerala sa koncentrácia elektroforézou v agarózovom géli porovnaním so známymi štandardami. Na základe týchto stanovení sa pripravili ligačné zmesi na klonovanie génu HCPB do plazmidu pICI266 podobným spôsobom opísaným v Medzinárodnej patentovej prihláške WO 96/20011, príklad 16.

Po uskutočnení ligačnej reakcie sa zmes DNA použila na transformáciu kmeňa E. coli DH5a, kolónie sa testovali hybridizáciou. Niekoľko kolónií sa zobralo na minipreparáciu DNA a vzorky DNA sa sekvenovali v úseku mutácie vnesenej s PCR, aby sa identifikovali klony s mutáciou G251T postupom opísaným v Medzinárodnej patentovej prihláške WO 96/20011, príklad 16. Na

108 základe výsledkov sekvenovania sa vybral plazmid obsahujúci požadovaný gén [G251T,D253K]HCPB a nazval sa pZEN1860.

Referenčný príklad 2

Príprava génovej sekvencie [A248,G251T,D253K]HCPB

Spôsob klonovania [A248,G251T,D253K]HCPB v E. coli bol velmi podobný spôsobu opísanému v referenčnom príklade 1. Východiskovým materiálom pre miestne cielenú mutagenézu pomocou PCR bol gén [G251T,D253K]HCPB v plazmide pZEN1860 (pozri referenčný príklad 1) . Avšak v tomto prípade miestne cielená mutagenéza prostredníctvom PCR amplifikácie génu sa použila na zámenu aminokyselinového kodónu v polohe 248 maturovaného génu, t.j. alanínu na serín (GCT na TTC), teda mutácia A248S.

Pripravili sa dve reakcie PCR rovnakým spôsobom ako je opísaný v referenčnom príklade 1. V prvej reakcii sa použili priméry CAN00402 (sekvencia SEQ ID NO: 116) a CAN00720 (sekvencia SEQ ID NO: 120). V druhej reakcii sa použili priméry CAN00284 (sekvencia SEQ ID NO: 118) a CAN00726 (sekvencia SEQ ID NO: 121) . V obidvoch prípadoch východisková DNA bol plazmid pZEN1860.

Spôsoby PCR, klonovanie, expresia a identifikácia boli rovnaké ako v referenčnom príklade 1. Na základe výsledkov sekvenovania sa vybral plazmid obsahujúci požadovaný gén [A248, G251T,D253K]HCPB a nazval sa pZEN1921.

Referenčný príklad 3

Príprava a charakterizácia fúzneho proteínu ľudská B7.1-myšacia A5B7 F(ab')₂ (AB7)

Spôsoby prípravy, purifikácie a charakterizácie F(ab')₂rekombinantnej myšacej protilátky A5B7 sa publikovali (pozri Medzinárodná patentová prihláška WO 96/20011, referenčný príklad 5). Izolovala a opísala sa cDNA sekvencie ľudského antigénu B7.1

109 (zvaného tiež CD80) (Freeman, G.J., Journal of Immunology, 1989, 143, 2714-2722). V tomto príklade AB7 znamená fúzny proteín ľudský B7.1 - myšací A5B7 F(ab')₂ a A5B7 znamená anti-CEA protilátku zvanú A5B7.

Pomocou stratégie založenej na PCR sa izolovali prirodzená signálna sekvencia a extracelulárna doména ľudského B7.1 (kódujúca aminokyseliny 1 až 242) z cDNA pripravenej z kultivovaných buniek Raji (ATCC č. CCL 8 6) a priamo fúzovali upstream s 5'-koncom maturovanej kódujúcej sekvencie myšacieho fragmentu Fd A5B7. To zahrňuje izoláciu sekvencie B7.1 pomocou PCR primérov 187/6 a 204/96 (sekvencie SEQ ID NO: 126 a NO: 127) a izoláciu čiastočnej sekvencie A5B7 Fd pomocou primérov 203/96 a 205/96 (sekvencie SEQ ID NO: 128 a NO: 129). Po purifikácii sa PCR produkty zmiešali približne v ekvimolárnych množstvách a fúzovali prostredníctvom PCR s primermi 187/96 205/96. Výsledný PCR produkt sa purifikoval, štiepil s HindlII a BstI (New England Biolabs (UK) Ltd., Wilbury Way, Hitchin, SG4 OTY) a klonoval do úseku HindlII-BstI plazmidu pAFl štandardným postupom, aby vznikol fúzny gén ľudský B7.l-myšacíA5B7 Fd s úplnou dĺžkou. Tento fúzny gén (sekvencie SEQ ID NO: 130 a NO: 131) sa klonoval ako fragment EcoRI-HindlII do systému GSSystem™ expresného vektora pEE6 (Celltech Biologics, Bath Road, Slough, SL1 4EN) podľa protokolov opísaných v Medzinárodnej patentovej prihláške WO 96/20011, referenčný príklad 5, aby sa vytvoril vektor pAB7.1.

Fragment BglII-Sall obsahujúci expresnú kazetu B7.1-A5B7 Fd sa potom klonoval do miest BglII a Sali vektora pAF6 opísaného v predchádzajúcom texte, aby sa vytvoril vektor pAB7.2 schopný ko-expresie fúzneho proteinu a lahkého reťazca A5B7. Vektor pAB7.2 sa potom použil na transformáciu myelómových buniek NS0 a selektovali sa kolónie na základe schopnosti rastu bez prítomnosti glutamínu. Bunkové línie exprimujúce fúzny proteín sa identifikovali stanovením pomocou ELISA testu opísaného v predchádzajúcom texte. Bunková línia exprimujúca

110 fúzny proteín vo vhodnej hladine (1D4) sa selektovala na purifikáciu a charakterizáciu fúzneho proteinu AB7.

Purifikácia a charakterizácia proteinu ΆΒΊ

Secernovaný rekomhinantný materiál B7.1(35-242)-A5B7 F(ab')₂, AB7, sa purifikoval zo supernatantu s použitím agarózového matrixu s proteínom-A ako je napr. Protein-A Sepharose Fast Flow od firmy Pharmacia (Pharmacia Biotech, 23 Grosvenor Rd., St. Albans, Herts, AL1 3AW). Matrix sa prepláchol 2X8 objemami väzbového pufru (3M NaCl, 1,5M Glycín, pH 8,9). Supernatant obsahujúci AB7 sa nariedil 1:1 s väzbovým pufrom. Prepláchnutý matrix sa pridal k nariedenému supernatantu (1 ml usadeného matrixu na 40 ml nariedeného supernatantu) a inkuboval sa pri miernom trepaní 2 hodiny pri 4 °C. Matrix sa potom scentrifugoval a asi 75% supernatantu sa zlialo. Matrix sa potom resuspendoval vo zvyšnom supernatante a výsledná zmes sa naplnila do kolóny. Kolóna sa prepláchla 5 až 6 objemami 150mM NaCl, lOmM NaH₂PC>4, pH 7,4. Pufor sa potom vymenil za lOOmM citrát sodný , pH 2,8 a zbierali sa eluované frakcie. Frakcie sa titrovali na približne pH 7,0 pridaním 2M Tris pufra pH 8,5. Eluované frakcie sa analyzovali s neredukujúcou SDS-PAGE a ako výsledný produkt zostala frakcia s vrcholom AB7.

N-koncové sekvenovanie

Vzorky AB7 sa rozdelili redukujúcou SDS-PAGE elektroforézou a preniesli na PVDF (polyvinylidéndifluorid) membránu (zariadenie, gély, prenosová membrána a postup -- všetko od firmy NOVEX, 4202 Sorrento Valley Blvd., San Diego, CA 92121, USA). Proteínové pásy sa zafarbili s Coomassie modrou a pás s veľkosťou asi 70 kDa (t.j. fúzny proteín B7.1-Fd) sa sekvenoval na N-konci (Applied Biosystems, 494 Proteín Sequencer, Perkin Elmer, ABI Division, Kelvin Close, Birchwood Science Park North, Warington, WA3 7PB) . Získaná sekvencia súhlasila s očakávanou

111 sekvenciou od aminokyseliny 35 v sekvencii SEQ ID NO: 131, ValIle-His-Va, atď.).

Analýza BIAcore

Produkt AB7 sa analyzoval pomocou zariadenia BIAcore pre povrchovú plazmónovú rezonanciu od firmy Biacore (23 Grosvenor Rd., St. Albans, Herts, AL1 3AW) metódou pre BIAcore analýzu prevzatú z publikácie Greene, J.L., Leytze, G.M., Emswiller, J., Peach, R.O., Bajorath, J., Cosand, W. a Linsley, P.S., 1996, J. Biol. Chem. 271, 26762-27771. Vzorky purifikovaného produktu AB7 sa injikovali na povrch CTLA4-Ig naviazaný s amínom a na prázdny kontrolný povrch naviazaný s amínom. Naviazanie AB7 sa dalo zreteľne pozorovať na povrchu s CTLA-Ig v porovnaní s kontrolným povrchom (pozri obr. 3) . Mohla sa tiež ukázať väzba medzi CTLAIg a AB7, keď sa injikoval CTAL-Ig na amínom naviazaný povrch AB7 .

Tieto údaje spoločne s údajmi z anti-CEA ELISA . testov potvrdzujú, že purifikovaný fúzny proteín AB7 má biologické vlastnosti obidvoch spojených častí, menovite väzbové aktivity pre receptor a antigén.

Ko-stimulačná aktivita fúzneho proteínu AB7

Schopnosť fúzneho proteínu AB7 poskytovať ko-stimulačný signál pre T-bunky, ak je naviazaný na tumorové bunky exprimujúce CEA, sa testovala pomocou upraveného ko-stimulačného testu, ktorý publikovali Jenkins a kol., 1991, J. Immunol. 147, 2461. Bunky kolorektálneho nádoru LS174 exprimujúce CEA (fixované s 0,5% paraformaldehydom 5 minút pri teplote miestnosti) sa inkubovali s 10 μg/ml fúzneho proteínu AB7 (2 hodiny rotovania pri 4 °C v médiu RPMI 1640 (Gibco Life Technologies, Paisley, Scotland) obsahujúcom 0,5% ľudské sérum (Sigma AB, Sigma Chemical Co., Dorset, UK). Bunky sa pred

112 použitím dvakrát opláchli a naviazanie fúzneho proteínu sa potvrdilo s použitím konjugátu fluoresceínizotiokyanátu (FITC) s kozím anti-myšacím Ig (Becton-Dickinson UK Ltd, Oxford) v prietokovej cytometrii (Facscan, Becton-Dickinson). Aby bolo možné použiť v teste nepripravené (t.j. bez primeru) ľudské Tbunky, stimul pre receptor T-buniek (TCR) sa poskytol protilátkou proti receptoru T-buniek (protilátka anti-CD3, OKT-3 Orthoclinical Diagnostics, Amersham, UK), ktorou sa predtým obalili jamky v 96-jamkovéj doštičke. OKT-3 sa imobilizovala tak, že sa purifikovaná protilátka inkubovala (2 μg/ml v bikarbonátovom obaľovacom pufri, pH 9,6 (tablety Sigma) cez noc pri 4 ’C v 96-jamkovej mikrotitračnej doštičke s jamkami s rovným dnom (Costar Corporation, Cambridge, MA, USA), ktoré sa potom opláchli trikrát až štyrikrát s PBS. T-bunky purifikované z darcovskej ľudskej krvi (negatívne vyčerpané, t.j. vytlačením všetkých zložiek okrem T-buniek) pomocou magnetických perličiek (Dynabeds, Dynal A. S., Oslo, Norway) sa pridali do jamiek v množstve 2xl0⁵ na jamku v 50 μΐ RPMI 1640 média obsahujúceho 5% ľudské sérum. Bunky LS174T viažuce fúzny proteín sa pridali v množstve 5xl0⁴ na jamku v 50 μΐ RPMI 1640 média obsahujúceho 5% ľudské sérum. Nakoniec sa objem v každej jamke doplnil na 200 μΐ médiom RPMI 1640 obsahujúcim 5% ľudské sérum. Po 48 hodinách sa kultúry označili pulzom 1,25 μθί [³H]tymidínu (Amersham International) a o 16 hodín neskôr sa zozbierali poloautomatickým zberačom buniek (TomTec Harvester, Wallac, UK). Inkorporácia [³H]tymidínu do DNA sa kvantifikovala scintilačným počítačom (Betaplate Scint, Betaplate Counter, Wallac, UK). Typické údaje z ko-stimulačného testu sú uvedené v nasledujúcej tabulke.

113

	aCD3 (2gg/ml) naviazaná na jamky [cpm]
samotné T-bunky	3582
T-bunky + aCD28	28178
T-bunky + LS174T	12303
T-bunky + LS174T + aCD28	25759
T-bunky + LS174T/fúzny proteín	41755

aCD3 = protilátka anti-CD3, aCD28 = protilátka anti-CD28

Nepripravené T-bunky vyžadujú tak signál pre receptor TCR ako aj ko-stimulačný signál. V tomto teste signál pre receptor T-bunky sa poskytol protilátkou aCD3. Pokial je poskytnutá kostimulácia prostredníctvom aCD28 (Becton-Dickinson, 0,6 gg/ml), príjem [³H]tymidínu sa stimuluje viac ak 8x v porovnaní so samotnou aCD3. Prítomnosť nádorových buniek nemá žiadny vplyv na túto stimuláciu. Ak sa ko-stimulačný signál poskytne prostredníctvom fúzneho proteínu AB7 naviazaného na nádorové bunky, je príjem [³H]tymidínu stimulovaný viac ako 3x v porovnaní so samotnými nádorovými bunkami a je viac ako llx vyšší ako sa môže pozorovať pri neprítomnosti ko-stimulácie. Zjavná stimulácia, ktorú poskytli samotné nádorové bunky, sa môže spôsobiť zvyškom pomocných buniek prítomných v purifikovanej populácii T-buniek. Zvýšenie proliferácie T-buniek sa opakovane pozorovalo v jamkách obsahujúcich proteín naviazaný na nádorové bunky v každom z piatich testov, keď sa porovnávali s jamkami obsahujúcimi samotné T-bunky alebo nenaviazané nádorové bunky.

Referenčný príklad 4 Príprava IgG3-pBSIIKS+

114

Tento príklad opisuje prípravu vektora obsahujúceho gén pre konštantný úsek ťažkého reťazca a kĺbový úsek ľudského IgG3.

Gén obsahujúci sekvenciu SEQ ID NO: 115 (tá obsahuje sekvenciu (zvyšky 8 až 508) podobnú sekvencii SEQ ID NO: 25, ale zvyšky 312 a 501 sekvencie SEQ ID NO: 25 sú zmenené na C a G) sa pripravil pomocou PCR spôsobom podobným tomu, ktorý opísali Jayaraman a kol., 1991, Proc. Natl. Acad Sci. USA 88, 4084-4088.

Gén sa pripravil v dvoch častiach známych ako IgG3A a IgG3B. Tie sa oddelene klonovali do miest Sací a Xmal v pBluescript KS+ (Stratagene Cloning System), čím: vznikli vektory IgG3A-pBSIIKS+klonA7 a IgG3B-pBSIIKS+klonB17. IgG3A sa pripravil tak, že sa predĺžil za reštrikčným miestom PmaCI (CACGTG v polohe 334 až 339 v sekvencii SEQ ID NO: 115) . Podobne IgG3B sa pripravil tak, že 5'-koniec sekvencie bol pred reštrikčným miestom PmaCI. Vektorový fragment (2823 bp) z IgG3ApBSIIKS+klonA7 a inzertovaný fragment (666 bp) z IgG3BpBSIIKS+klonB17 sa izolovali elektroforézou v 1% agarózovom géli a purifikovali. Fragmenty sa ligovali a ligačné zmesi sa potom transformovali baktérie E. coli DH5a. Klony obsahujúce požadovaný gén sa identifikovali reštrikčným štiepením izolovanej DNA pomocou Sací a Xmal, ktoré poskytovalo fragment 520 bp. Sekvencia inzertu sa potvrdila sekvenovaním DNA a kloň F3 sa pomenoval IgG3-pBSIIKS+.

115

ZOZNAM SEKVENCIÍ (2) INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 32 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 1:

GGAAGCTTGA AGATGGATAC AGTTGGTGCA GC 32 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 31 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 2:

GGAAGCTTAG ACAGATGGGG GTGTCGTTTT G 31 (2) INFORMÁCIA 0 SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 32 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché

116 (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid

(xi)	OPIS	SEKVENCIE:	SEQ	ID	NO	: 3
Glu	Val Gin	Leu	Gin Gin Ser	Gly	Ala	Glu	Leu	Val	Arg	Ser	Gly Ala
1			5			10					15
Ser	Val Lys	Leu	Ser Cys Thr	Ala	Ser	Gly	Phe	Asn	íle	Lys	Asp Asn
		20			25					30

Tyr Met (2) INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 24 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 4:

GACATTCAGC TGACCCAGTC TCCA (2) INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 24 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina

117 (xi) OPIS SEKVENCIE: SÉQ ID NO: 5:

GACATTGAGC TCACCCAGTC TCCA 24 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 22 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 6:

AGGTSMARCT GCAGSAGTCW GG 22 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 41 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 7:

ACTAGTGGAA TTCAGTGTGA GGTSCATRCTG CAGCARTCWG G 41 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 357 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina

118 (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 8:

GACATTGAGC	TCACCCAGTC	TCCAGCAATC	ATGTCTGCAT	CTCCAGGGGA	GAAGGTCACC	50
ATAACCTGCA	GTGCCAGCTC	AAGTGTAACT	TACATGCACT	GGTTCCAGCA	GAAGCCAGGC	120
ACTTCTCCCA	AACTCTGGAT	TTATAGCACA	TCCAACCTGG	CTTCTGGAGT	CCCTGCTCGC	180
TTCAGTGGCA	GTGGATCTGG	GACCTCTTAC	TCTCTCACAA	TCAGCCGAAT	GGAGGCTGAA	240
GATGCTGCCA	CTTATTACTG	CCAGCAAAGG	AGTACTTACC	CGCTCACGTT	CGGTGCTGGG	300
ACCAAGCTGG	AGCTGAAACG	GGCTGATGCT	GCACCAACTG	TATCCATCTT	CAAGCTT	357

(2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 108 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 9:

Asd íle Glu Leu Thr Gin Ser Pro Ala íle Met Ser Ala Ser Pro Gly

119

Glu Lys Val Thr íle Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Met 20 25 30

His Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp íle Tyr 35 40 45

Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr íle Ser Arg Met Glu Ala Glu

70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser Thr Tyr Pro Leu Thr

90 95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala 100 105 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 360 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 10:

120

GAGGTGCAGC	TGCAGCARTC	WGGGGCAGAG	CTTGTGAGGT	CAGGGGCCTC	AGTCAAGTTG	60
TCCTGCACAG	CTTCTGGCTT	CAACATTAAA	GACAACTATA	TGCACTGGGT	GAAGCAGAGG	120
CCTGAACAGG	GCCTGGAGTG	GATTGCATGG	ATTGATCCTG	AGAATGGTGA	TACTGAATAT	180
GCCCCGAAGT	TCCGGGGCAA	GGCCACTTTG	ACTGCAGACT	CATCCTCCAA	CACAGCCTAC	240
ČTGCACCTCA	GCAGCCTGAC	ATCTGAGGAC	ACTGCCGTCT	ATTACTGTCA	TGTCCTGATC	300
TATGCTGGTT	ATTTGGCTAT	GGACTACTGG	GGTCAAGGAA	CCTCAGTCGC	CGTCTCCTCA	360

(2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DÍŽKA: 120 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 11:

Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Ser Gly Ala

5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn íle Lys Asp Asn

25 30

Tyr Met His Trp Val Lys Gin Arg Pro Glu Gin Gly Leu Glu Trp íle 35 40 45

Ala Trp íle Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe

121

Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Ser Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

70 75 80

Leu His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

90 95

His Val Leu íle Tyr Ala Gly Tyr Leu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Thr Ser Val Ala Val Ser Ser 115 120 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 39 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 12:

AAGCTTTCCC GCGGGGACAT TGAGCTCACC CAGTCTCCA (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 30 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina

122 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 13:

AAGCTTCTCG AGCTTGGTCC CAGCACCGAA (2) INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 36 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 14:

AAGCTTGGAA TTCAGTGTGA GGTGCAGCTG CAGCAG (2) INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 33 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 15:

AAGCTTCGAG CTCACGGCGA CTGAGGTCC TTG (2) INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 705 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina

123 (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 16:

ATGGATTTTC AAGTGCAGAT TTTCAGCTTC CTGCTAATCA GTGCTTCAGT CATAATGTCC 60

CGCGGGGACA TTGAGCTCAC CCAGTCTCCA GCAATCATGT CTGCATCTCC AGGGGAGAAG 120

GTCACCATAA CCTGCAGTGC CAGCTCAAGT GTAACTTACA TGCACTGGTT CCAGCAGAAG 180

CCAGGCACTT CTCCCAAACT CTGGATTTAT AGCACATCCA ACCTGGCTTC TGGAGTCCCT 240

GCTCGCTTCA GTGGCAGTGG ATCTGGGACC TCTTACTCTC TCACAATCAG CCGAATGGAG 300

GCTGAAGATG CTGCCACTTA TTACTGCCAG CAAAGGAGTA CTTACCCGCT CACGTTCGGT 360

GCTGGGACCA AGCTCGAGAT CAAACGGACT GTGGCTGCAC CATCTGTCTT CATCTTCCCG 420

CCATCTGATG AGCAGTTGAA ATCTGGAACT GCCTCTGTTG TGTGCCTGCT GAATAACTTC 480

TATCCCAGAG AGGCCAAAGT ACAGTGGAAG GTGGATAACG CCCTCCAATC GGGTAACTCC 540

CAGGAGAGTG TCACAGAGCA GGACAGCAAG GACAGCACCT ACAGCCTCAG CAGCACCCTG 600

ACGCTGAGCA AAGCAGACTA CGAGAAACAC AAAGTCTACG CCTGCGAAGT CACCCATCAG 660

GGCCTGAGTT CGCCCGTCAC AAAGAGCTTC AACAGGGGAG AGTGT

705

124 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 235 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 17:

Met Asp Phe Gin Val Gin íle Phe Ser Phe Leu Leu íle Ser Ala Ser 15 10 15

Val Íle Met Ser Arg Gly Asp íle Glu Leu Thr Gin Ser Pro Ala íle 20 25 30

Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr íle Thr Cys Ser Ala Ser 35 40 45

Ser Ser Val Thr Tyr Met His Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Thr Ser 50 55 60

Pro Lys Leu Trp íle Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

70 75 80

Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr íle

90 95

Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin G Ír. Arg 100 105 110

Ser Thr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu íle Lys 115 120 125

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe íle Phe Pro Pro Ser Asp Glu 130 135 140

Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

145

150

155

160

125

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin 165 Π0 175

Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 180 185 190

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 195 200 205

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 210 215 220

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230 235 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 18:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 765 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 18:

ATGAAGTTGT	GGCTGAACTG	GATTTTCCTT	GTAACACTTT	TAAATGGAAT	TCAGTGTGAG	60
GTGCAGCTGC	AGCARTCAGG	GGCAGAGCTT	GTGAGGTCAG	GGGCCTCAGT	CAAGTTGTCC	120
TGCACAGCTT	CTGGCTTCAA	CATTAAAGAC	AACTATATGC	ACTGGGTGAA	GCAGAGGCCT	180
GAACAGGGCC	TGGAGTGGAT	TGCATGGATT	GATCCTGAGA	ATGGTGATAC	TGAATATGCC	240
CCGAAGTTCC	GGGGCAAGGC	CACTTTGACT	GCAGACTCAT	CCTCCAACAC	AGCCTACCTG	300

126

CACCTCAGCA GCCTGACATC TGAGGACACT GCCGTCTATT ACTGTCATGT CCTGATCTAT	360
GCTGGTTATT TGGCTATGGA CTACTGGGGT CAAGGAACCT CAGTCGCCGT GAGCTCGGCT	420
AGCACCAAGG GACCATCGGT CTTCCCCCTG GCCCCCTGCT CCAGGAGCAC CTCCGAGAGC	480
ACAGCCGCCC TGGGCTGCCT GGTCAAGGAC TACTTCCCCG AACCGGTGAC GGTGTCGTGG	540
AACTCAGGCG CTCTGACCAG CGGCGTGCAC ACCTTCCCGG CTGTCCTACA GTCCTCAGGA	600
CTCTACTCCC TCAGCAGCGT CGTGACGGTG CCCTCCAGCA ACTTCGGCAC CCAGACCTAC	660
ACCTGCAACG TAGATCACAA GCCCAGCAAC ACCAAGGTGG ACAAGACAGT tgagcgcaaa	720
TGTTGTGTCG AGTGCCCACC GTGCCCGGCG CCACCTGTGG CCGGC	765

(2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 19: (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 255 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna

(ii)	TYP MOLEKULY: proteín
(xi)	OPIS SEKVENCIE: SEQ ID	NO	: 19:
Met	Lys Leu Trp Leu Asn Trp íle Phe	Leu	Val Thr Leu Leu Asn Gly
1	5	10	15

íle Gin Cys Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg 20 25 30

Ser Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn íle 35

127

Lys Asp Asn Tyr Met His Trp Val Lys Gin Arg Pro Glu Gin Gly Leu 50 55 60

Glu Trp Íle Ala Trp íle Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala

70 75 80

Pro Lys Phe Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Ser Ser Ser Asn

90 95

Thr Ala Tyr Leu His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys His Val Leu íle Tyr Ala Gly Tyr Leu Ala Met Asp Tyr 115 120 125

Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Ala Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 130 135 140

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser

145 150 155 160

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

165 170 175

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 180 185 190

Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

195 200 205

Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr Tyr Thr Cys Asn Val 210 215 220

Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys

225 230 235 240

Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly

245

250

255

128 (2)

INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 20:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 121 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 20:

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 15 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 65 70 75 80

Tyr íle Cys Asn Val Asn His Asn Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 HO

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

115

120

129 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 21:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 369 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 21:

GCCTCCACCA AGGGCCCATC GGTCTTCCCC CTGGCACCCT CCTCCAAGAG CACCTCTGGG 60

GGCACAGCGG CCCTGGGCTG CCTGGTCAAG GACTACTTCC CCGAACCGGT GACGGTGTCG 120

TGGAACTCAG GCGCCCTGAC CAGCGGCGTG CACACCTTCC CGGCTGTCCT ACAGTCCTCA 180

GGACTCTACT CCCTCAGCAG CGTGGTGACT GTGCCCTCCA GCAGCTTGGG CACCCAGACC 240

TACATCTGCA ACGTGAATCA CAACCCCAGC AACACCAAGG TCGACAAGAA AGTTGAGCCC 300

AAATCTTGTG ACAAGACGCA CACGTGCCCG CCGTGCCCGG CTCCGGAACT GCTGGGTGGC 360

CCGTAATAG 369 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 22:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 116 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: protein

130

(Xi)

OPIS

SEKVENCIE

C 1 · u·

;eq

ID

NO:

22

•

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

1

5

10

15

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

20

25

30

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

35

40

45

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

50

55

60

Leu

Ser

Val

Thr

Val

Pro

Ser

Asn

Phe

Gly

Thr

Gin

Thr

65

70

75

80

Tyr

Thr

Cys

Asn

Val

Asp

His

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

85

90

95

Thr

Val

Glu

Arg

Lys

cys

Cys

Val

Glu

Cys

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

100

105

110

Pro Val Ala Gly

115 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 23:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 348 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 23:

131

GCTAGCACCA AGGGACCATC GGTCTTCCCC CTGGCCCCCT GCTCCAGGAG CACCTCCGAG 60

AGCACAGCCG CCCTGGGCTG CCTGGTCAAG GACTACTTCC CCGAACCGGT GACGGTGTCG 120

ŤGGAACTCAG GCGCTCTGAC CAGCGGCGTG CACACCTTCC CGGCTGTCCT ACAGTCCTCA 180

GGACTCTACT CCCTCAGCAG CGTCGTGACG GTGCCCTCCA GCAACTTCGG CACCCAGACC 240

TACACCTGCA ACGTAGATCA CAAGCCCAGC AACACCAAGG TGGACAAGAC AGTTGAGCGC 300

AAATGTTGTG TCGAGTGCCC ACCGTGCCCG GCGCCACCTG TGGCCGGC 348 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 24:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 167 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín

(xi)

OP

'IS

SEKVENCIE

• c

!EQ

ID

NO:

24

·'

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

1

5

10

15

Ser

Thr

Ser

Gly

Thr

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

20

25

30

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

35

40

45

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

132

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr

70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

90 95

Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro 100 105 HO

Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg 115 120 125

Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys 130 135 140

Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro 145 150 155 i₆₀

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 165 (2) INFORMÁCIA 0 SEKVENCII SEQ ID NO: 25:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 501 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 25:

133

GCTAGCACCA AGGGCCCATC GGTCTTCCCC CTGGCGCCCT GCTCCAGGAG CACCTCTGGG 60

GGCACAGCGG CCCTGGGCTG CCTGGTCAAG GACTACTTCC CCGAACCGGT GACGGTGTCG 120

TGGAACTCAG GCGCCCTGAC CAGCGGCGTG CACACCTTCC CGGCTGTCCT ACAGTCCTCA 180

GGACTCTACT CCCTCAGCAG CGTGGTGACC GTGCCCTCCA GCAGCTTGGG CACCCAGACC 240

TACACCTGCA ACGTGAATCA CAAGCCCAGC AACACCAAGG TGGACAAGAG AGTGGAGCTG 300

AAAACCCCAC TTGGTGACAC AACTCACACG TGCCCTAGGT GTCCTGAACC TAAATCTTC-? 360

GACACACCTC CCCCGTGCCC ACGGTGCCCA GAGCCCAAAT CTTGCGACAC GCCCCCACCC- 420

TGTCCCAGAT GTCCTGAACC AAAGAGCTGT GACACTCCAC CGCCCTGCCC GAGGTGCCCA 480

GCACCTGAAC TCCTGGGAGG A 501 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 26:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 10 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 26:

Ser Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Met His (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 27:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

134 (A) DĹŽKA: 7 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 27:

Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser

5 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 28 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 28:

Gin Gin Arg Ser Thr Tyr Pro Leu Thr

5 (2) INFORMÁCIA 0 SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 29 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 5 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid

135 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 29:

Asp Asn Tyr Met His

5 (2) INFORMÁCIA 0 SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 30:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid

OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 30:

Phe Asn íle Lys Asp Asn Tyr Met His

5 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 31:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 17 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid

OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 31:

Trp íle Asn Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys

10

Phe Arg Gly

136 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 32:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 11 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 32:

Leu íle Tyr Ala Gly Tyr Leu Ala Met Asp Tyr

10 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 33:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 33:

His Val Leu íle Tyr Ala Gly Tyr Leu Ala Met Asp Tyr

10 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 34:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 60 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna

137 (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (ix) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 34:

TCGAGAGATC TAAGCTTCCG CGGGAATTCC TCGAGGAGCT CCCCGGGGGA

TCCGTCGACT (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 35:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 60 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (ix) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 35:

CTAGAGTCGA CGGATCCCCC GGGGAGCTCC TCGAGGAATT CCCGCGGAAG

CTTAGATCTC (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 36:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 29 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 36:

AAGCTTCCCG GGTATTAAAG CAGAACTTG

138 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 37:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 29 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 37:

ACTAGTGGAT CCCAGACATG ATAAGATAC (2) INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 38:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 39 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 38:

GGTCTATATA AGCAGAGCTG TCTGGCTAAC TAGAGAACC (2) INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 39:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 39 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina

139 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 39:

GGTTCTCTAG TTAGCCAGAC AGCTCTGCTT ATATAGACC (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 40:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 19 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 40:

GGACTTTCCT ACTTGGCAG (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 41:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 41:

GGCAACTAGA AGGCACAGTC (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 42:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 77 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina

140 (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 42:

AGCTTGCCGC CACCATGGAT TTTCAAGTGC AGATTTTCAG CTTCCTGCTA 50

ATCAGTGCTT CAGTCATAAT GTCCCGC 77 (2) INFORMÁCIA 0 SEKVENCII SEQ ID NO: 43:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 71 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 43:

GGGACATTAT GACTGAAGCA CTGATTAGCA GGAAGCTGAA AATCTGCACT 50

TGAAAATCCA TGGTGGCGGC A 71 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 44:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 61 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina

141 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 44:

AGCTTGCCGC CACCATGAAG TTGTGGCTGA ACTGGATTTT CCTTGTAACA 50

CTTTTAAATG 60 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 45:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 61 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 45:

AATTCCATTT AAAAGTGTTA CAAGGAAAAT CCAGTTCAGC CACAACTTCA 50

TGGTGGCGGC A 61 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 46:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 357 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 46:

142

AAGCTTCTCG AGATCAAACG GACTGTGGCT GCACCATCTG TCTTCATCTT CCCGCCATCT 60

GATGAGCAGT TGAAATCTGG	AACTGCCTCT GTTGTGTGCC TGCTGAATAA CTTCTATCCC	120
AGAGAGGCCA AAGTACAGTG	GAAGGTGGAT AACGCCCTCC AATCGGGTAA CTCCCAGGAG	180
AGTGTCACAG AGCAGGACAG	CAAGGACAGC ACCTACAGCC TCAGCAGCAC CCTGACGCTG	240
AGCAAAGCAG ACTACGAGAA	ACACAAAGTC TACGCCTGCG AAGTCACCCA TCAGGGCCTG	300
AGTTCGCCCG TCACAAAGAG	CTTCAACAGG GGAGAGTGTT AATAGCCCGG GACTAGT	357

(2) INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 47:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 381 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 47;

GGAAGCTTGA	GCTCGGCTAG	CACCAAGGGA	CCATCGGTCT	TCCCCCTGGC	CCCCTGCTCC	60
AGGAGCACCT	CCGAGAGCAC	AGCCGCCCTG	GGCTGCCTGG	TCAAGGACTA	CTTCCCCGAA	120
CCGGTGACGG	TGTCGTGGAA	CTCAGGCGCT	CTGACCAGCG	GCGTGCACAC	CTTCCCGGCT	180
GTCCTACAGT	CCTCAGGACT	CTACTCCCTC	AGCAGCGTCG	TGACGGTGCC	CTCCAGCAAC	240
TTCGGCACCC	AGACCTACAC	CTGCAACGTA	GATCACAAGC	CCAGCAACAC	CAAGGTGGAC	300
AAGACAGTTG	AGCGCAAATG	TTGTGTCGAG	TGCCCACCGT	GCCCGGCGCC	ACCTGTGGCC	360

GGCTAATAGC CCGGGACTAG T

381

143 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 48:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 342 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 48:

AAGCTTTCCC GCGGCGACAT CCAGATGACC CAGAGCCCAA GCAGCCTGAG CGCTAGCGTG 60

GGTGACAGAG TGACCATCAC GTGTAGTGCC AGCTCAAGTG TAACTTACAT GCACTGGTAC 120

CAGCAGAAGC CAGGTAAGGC TCCAAAGCTG CTGATCTACA GCACATCCAA CCTGGCTTCT 180

GGTGTGCCAA GCAGATTCTC CGGAAGCGGT AGCGGCACCG ACTACACCTT CACCATCAGC 240

AGCCTCCAGC CAGAGGATAT CGCCACCTAC TACTGCCAGC AGAGGAGTAC TTACCCGCTC 300

ACGTTCGGCC AAGGGACCAA GCTCGAGATC AAACGGACTA GT 342 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 49:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 501 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 49:

144

GACATCCAGA TGACCCAGAG CCCÄAGCAGC CTGAGCGCTA GCGTGGGTGA CAGAGTGACC 60

ATCACGTGTA GTGCCAGCTC AAGTGTAACT TACATGCACT GGTACCAGCA GAAGCCAGGT 120

AAGGCTCCAA AGCTGCTGAT CTACAGCACA TCCAACCTGG CTTCTGGTGT GCCAAGCAGA 180

TTCTCCGGAA GCGGTAGCGG CACCGACTAC ACCTTCACCA TCAGCAGCCT CCAGCCAGAG 240

GATATCGCCA CCTACTACTG CCAGCAGAGG AGTACTTACC CGCTCACGTT CGGCCAAGGG 300

ACCAAGCTCG AGATCAAACG G 321 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 50:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 107 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 50:

Asp íle Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

Asp Arg Val Thr íle Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Met

His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu íle Tyr

Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

145

Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr íle Ser Ser Leu Gin Pro Glu 65 ™ ^{75 80}

Asp íle Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser Thr Tyr Pro Leu Thr 85 90 ⁹⁵

Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu íle Lys Arg 100 105 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 51:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 705 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 51:

ATGGATTTTC AAGTGCAGAT TTTCAGCTTC CTGCTAATCA GTGCTTCAGT CATAATGTCC

CGCGGCGACA TCCAGATGAC CCAGAGCCCA AGCAGCCTGA GCGCTAGCGT GGGTGACAGA

GTGACCATCA CGTGTAGTGC CAGCTCAAGT GTAACTTACA TGCACTGGTA CCAGCAGAAG.

CCAGGTAAGG CTCCAAAGCT GCTGATCTAC AGCACATCCA ACCTGGCTTC TGGTGTGCCA

AGCAGATTCT CCGGAAGCGG TAGCGGCACC GACTACACCT TCACCATCAG CAGCCTCCAG

CCAGAGGATA TCGCCACCTA CTACTGCCAG CAGAGGAGTA CTTACCCGCT CACGTTCGGC

CAAGGGACCA AGCTCGAGAT CÄAACGGACT GTGGCTGCAC CATCTGTCTT CATCTTCCCG

CCATCTGATG AGCAGTTGAA ATCTGGAACT GCCTCTGTTG TGTGCCTGCT GAATAACTTC

120

180

240

300

360

420

480

146

TATCCCAGAG AGGCCAAAGT ACAGTGGAAG GTGGATAACG CCCTCCAATC GGGTAACTCC

CAGGAGAGTG TCACAGAGCA GGACAGCAAG GACAGCACCT ACAGCCTCAG CAGCACCCTG

ACGCTGAGCA AAGCAGACTA CGAGAAACAC AAAGTCTACG CCTGCGAAGT CACCCATCAG

GGCCTGAGTT CGCCCGTCAC AAAGAGCTTC AACAGGGGAG AGTGT

540

600

660

705 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 52: (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

	(A)	DĹŽKA: 235 aminokyselín
	(B)	TYP: aminokyselina
	(C)	TYP VLÁKNA: jednoduché
	(D)	TOPOLÓGIA: lineárna
(ii)	TYP	MOLEKULY: proteín
(xi)	OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:

Met Asp Phe Gin Val Gin íle Phe Ser Phe Leu Leu íle Ser Ala Ser

S 10 15

Val íle Met Ser Arg Gly Asp íle Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser

25 30

Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr íle Thr Cys Ser Ala Ser 35 40 45

Ser Ser Val Thr Tyr Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala 50 55 60

Pro Lys Leu Leu íle Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

70 75 80

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr íle

BS

147

Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp íle Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg 10S no

100

Ser Thr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu íle Lys 115 120 125

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe íle Phe Pro Pro Ser Asp Glu 130 135 140

Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

145 150 155 160

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin

165 170 175

Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 180 185 190

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 195 200 205

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 210 215 220

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 (2) INFORMÁCIA 0 SEKVENCII SEQ ID NO: 53:

(í) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 385 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina

148 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 53:

GAAGCTTGGA ATTCAGTGTG AGGTGCAGCT GCAGCAGAGC GGTCCAGGTC TCGTACGGCC 60

TAGCCAGACC CTGAGCCTCA CGTGCACCGC ATCTGGCTTC AACATTAAGG ACAATTACAT 120

GCACTGGGTG AGACAGCCAC CTGGACGAGG CCTTGAGTGG ATTGGATGGA TTGACCCTGA 180

GAATGGTGAC ACTGAGTACG CACCTAAGTT TCGCGGCCGC GTGACAATGC TGGCAGACAC 240

TAGTAAGAAC CAGTTCAGCC TGAGACTCAG CAGCGTGACA GCCGCCGACA CCGCGGTCTA 300

TTATTGTCAC GTCCTGATAT ACGCCGGGTA TCTGGCAATG GACTACTGGG GCCAAGGGAC 3 60

CCTCGTCACC GTGAGCTCGA CTAGT 385 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 54:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 360 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 54:

GAGGTGCAGC TGCAGCAGAG CGGTCCAGGT CTCGTACGGC CTAGCCAGAC CCTGAGCCTC 60

ACGTGCACCG CATCTGGCTT CAACATTAAG GACAATTACA TGCACTGGGT GAGACAGCCA 120

CCTGGACGAG GCCTTGAGTG GATTGGATGG ATTGACCCTG AGAATGGTGA CACTGAGTAC 180

GCACCTAAGT TTCGCGGCCG CGTGACAATG CTGGCAGACA CTAGTAAGAA CCAGTTCAGC 240

149

CTGAGACTCA GCAGCGTGAC AGCCGCCGAC ACCGCGGTCT ATTATTGTCA CGTCCTGATA

TACGCCGGGT ATCTGGCAAT GGACTACTGG GGCCAAGGGA CCCTCGTCAC CGTGAGCTCG (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 55:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 107 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 55:

Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gin

10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn íle Lys Asp Asn

25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp íle

40 45

Gly Trp íle Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe 50 55 60

Arg Gly Arg Val Thr Met Leu Ala Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser

70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

300

360

150

His Val Leu íle Tyr Ala Gly Tyr Leu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 56:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 765 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 56:

ATGAAGTTGT GGCTGAACTG GATTTTCCTT GTAACACTTT TAAATGGAAT TCAGTGTGAG 60

GTGCAGCTGC AGCAGAGCGG TCCAGGTCTC GTACGGCCTA GCCAGACCCT GAGCCTCACG 120

TGCACCGCAT CTGGCTTCAA CATTAAGGAC AATTACATGC ACTGGGTGAG ACAGCCACCT 180

GGACGAGGCC TTGAGTGGAT TGGATGGATT GACCCTGAGA ATGGTGACAC TGAGTACGCA 240

CCTAAGTTTC GCGGCCGCGT GACAATGCTG GCAGACACTA GTAAGAÁCCA GTTCAGCCTG 300

AGACTCAGCA GCGTGACAGC CGCCGACACC GCGGTCTATT ATTGTCACGT CCTGATATAC 360

GCCGGGTATC TGGCAATGGA CTACTGGGGC CAAGGGACCC TCGTCACCGT GAGCTCGGCT 420

AGCACCAAGG GACCATCGGT CTTCCCCCTG GCCCCCTGCT CCAGGAGCAC CTCCGAGAGC 480

ACAGCCGCCC TGGGCTGCCT GGTCAAGGAC TACTTCCCCG AACCGGTGAC GGTGTCGTGG 540

151

AACTCAGGCG CTCTGACCAG CGGCGTGCAC ACCTTCCCGG CTGTCCTACA GTCCTCAGGA

CTCTACTCCC TCAGCAGCGT CGTGACGGTG CCCTCCAGCA ACTTCGGCAC CCAGACCTAC

ACCTGCAACG TAGATCACAA GCCCAGCAAC ACCAAGGTGG ACAAGACAGT TGAGCGCAAA

TGTTGTGTCG AGTGCCCACC GTGCCCGGCG CCACCTGTGG CCGGC (2) INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 57:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

600

660

720

765 (ii) TYP MOLEKULY: proteín

(xi)	OPIS	SEKVENCIE	: SEQ ID	NO:	57 :
Met	Lys Leu	Trp Leu Asn	Trp íle Phe	Leu	Val Thr Leu Leu Asn Gly
1		5		10	15
íle	Gin Cys	Glu Val Gin	Leu Gin Gin	Ser	Gly Pro Gly Leu Val Arg
		20	25		30
Pro	Ser Gin	Thr Leu Ser	Leu Thr Cys	Thr	Ala Ser Gly Phe Asn íle
	35		40		45
Lys	Asp Asn	Tyr Met His	Trp Val Arg	Gin	Pro Pro Gly Arg Gly Leu
	50		55		60
Glu	Trp íle	Gly Trp íle	Asp Pro Glu	Asn	Gly Asp Thr Glu Tyr Ala
65		70			75 80

152

Pro Lys Phe Arg Gly Arg Val Thr Met Leu Ala Asp Thr Ser Lys Asn 85 90 95

Gin Phe Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val 100 10S 110

Tyr Tyr Cys His Val Leu íle Tyr Ala Gly Tyr Leu Ala Met Asp Tyr 115 120 125

Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 130 135 140

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser

145 ISO 155 160

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

165 170 175

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 180 185 190

Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

195 200 205

Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr Tyr Thr Cys Asn Val 210 215 220

Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys 225 230 235 240

Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly·

245

250

255

153 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 58:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 40 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 58:

GGCGACATCC AGCTGACCCA GAGCCCAAGC AGCCTGAGCG 40 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 59:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 46 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 59:

CTAGCGCTCA GGCTGCTTGG GCTCTGGGTC AGCTGGATGT CGCCGC 46 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 60:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 321 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina

154

OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 60:

GACATCCAGC TGACCCAGAG CCCAAGCAGC CTGAGCGCTA GCGTGGGTGA CAGAGTGACC 60

ATCACGTGTA GTGCCAGCTC AAGTGTAACT TACATGCACT GGTACCAGCA GAAGCCAGGT 120

AAGGCTCCAA AGCTGCTGAT CTACAGCACA TCCAACCTGG CTTCTGGTGT GCCAAGCAGA 180

TTCTCCGGAA GCGGTAGCGG CACCGACTAC ACCTTCACCA TCAGCAGCCT CCAGCCAGAG 240

GATATCGCCA CCTACTACTG CCAGCAGAGG AGTACTTACC CGCTCACGTT CGGCCAAGGG 300

ACCAAGCTCG AGÄTCAAACG G 321 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 61 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 107 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 61:

Asp íle Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

Asp Arg Val Thr íle Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Met

His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu íle Tyr

Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

155

Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr íle Ser Ser Leu Gin Pro Glu ·

70 75 80

Asp íle Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser Thr Tyr Pro Leu Thr

90 95

Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu íle Lys Arg 100 los (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 62:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 40 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 62:

GGCCAGATCG TGCTGACCCA GAGCCCAAGC AGCCTGAGCG (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 63:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 46 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 63:

CTAGCGCTCA GGCTGCTTGG GCTCTGGGTC AGCACGATCT GGCCGC

156 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 64:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 321 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 64:

CAGATCGTGC TGACCCAGAG CCCAAGCAGC CTGAGCGCTA GCGTGGGTGA CAGAGTGACC 60

ATCACGTGTA GTGCCAGCTC AAGTGTAACT TACATGCACT GGTACCAGCA GAAGCCAGGT 120

AAGGCTCCAA AGCTGCTGAT CTACAGCACA TCCAACCTGG CTTCTGGTGT GCCAAGCAGA 180

TTCTCCGGAA GCGGTAGCGG CACCGACTAC ACCTTCACCA TCAGCAGCCT CCAGCCAGAG 240

GATATCGCCA CCTACTACTG- CCAGCAGAGG AGTACTTACC CGCTCACGTT CGGCCAAGGG 300

ACCAAGCTCG AGATCAAACG G 321 (2) INFORMÁCIA 0 SEKVENCII SEQ ID NO: 65:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 107 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 65:

157

Gin íle Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

5 10 15

Asp Arg Val Thr íle Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Mec

25 30

His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu íle Tyr 35 40 45

Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr íle Ser Ser Leu Gin Pro Glu

70 75 BO

Asp íle Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser Thr Tyr Pro Leu Thr

90 95

Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu íle Lys Arg

100 105 (2) INFORMÁCIA 0 SEKVENCII SEQ ID NO: 66:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 22 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 66:

CGTATTAGTC ATCGCTATTA CC

158 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 67:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 39 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 67:

GTTGGATGTG CTGTAGATCC ACAGCTTTGG AGCCTTACC (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 68:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 21 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 68:

TCCGTTTGAT CTCGAGCTTG (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 69:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

159 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ÍD NO: 69:

GGTAAGGCTC CAAAGCTGTG GATCTACAGC ACATCCAAC 39 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 70:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 321 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 70:

GACATCCAGA TGACCCAGAG CCCAAGCAGC CTGAGCGCTA GCGTGGGTGA CAGAGTGACC 60

ATCACGTGTA GTGCCAGCTC AAGTGTAACT TACATGCACT GGTACCAGCA GAAGCCAGGT 120

AAGGCTCCAA AGCTGTGGAT CTACAGCACA TCCAACCTGG CTTCTGGTGT GCCAAGCAGA 180

TTCTCCGGAA GCGGTAGCGG CACCGACTAC ACCTTCACCA TCAGCAGCCT CCAGCCAGAG 240

GATATCGCCA CCTACTACTG CCAGCAGAGG AGTACTTACC CGCTCACGTT CGGCCAAGGG 300

ACCAAGCTCG AGATCAAACG G 321 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 71:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 107 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín

160

:xi)

OP

'IS

SEKVEN

CIE

: S

EQ

ID

NO:

71

•

Asp

íle

Gin

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

1

5

10

15

Asp

Arg

Val

Thr

íle

Thr

Cys

Ser

Ala

Ser

Val

Thr

Tyr

Met

20

25

30

His

Trp

Tyr

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Trp

íle

Tyr

35

40

45

Ser

Thr

Ser

Asn

Leu

Ala

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

SO

55

60

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Tyr

Thr

Phe

Thr

íle

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

65

70

75

80

Asp

íle

Ala

Thr

Tyr

Cys

Gin

Arg

Ser

Thr

Tyr

Pro

Leu

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gin

. Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

íle

Lys

Arg

100

105

(2) INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 72:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 64 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 72:

CCTTGAGTGG ATTGCATGGA TTGACCCTGA GAATGGTGAC ACTGAGTACG 50

CACCTAAGTT TCGC

161 (2) INFORMÁCIA 0 SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 73:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 68 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 73:

GGCCGCGAAA CTTAGGTGCG TACTCAGTGT CACCATTCTC AGGGTCAATC 50

CATGCAATCC ACTCAAGG 68 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 74:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 360 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 74:

GAGGTGCAGC TGCAGCAGAG CGGTCCAGGT CTCGTACGGC CTAGCCAGAC CCTGAGCCTC 60

ACGTGCACCG CATCTGGCTT CAACATTAAG GACAATTACA TGCACTGGGT GAGACAGCGA 120

CCTGGACGAG GCCTTGAGTG GATTGCATGG ATTGACCCTG AGAATGGTGA CACTGAGTAC 180

GCACCTAAGT TTCGCGGCCG CGTGACAATG CTGGCAGACA CTAGTAAGAA CCAGTTCAGC 240

CTGAGACTCA GCAGCGTGAC AGCCGCCGAC ACCGCGGTCT ATTATTGTCA CGTCCTGATA 300

TACGCCGGGT ATCTGGCAAT GGACTACTGG GGCCAAGGGA CCCTCGTCAC CGTGAGCTCG 360

162 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ SEQ IĎ NO: 75:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 107 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 75:

Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gin

5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn íle Lys Asp Asn

25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp íle

40 45

Ala Trp íle Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe 50 55 60

Arg Gly Arg Val Thr Met Leu Ala Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser

70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

His Val Leu íle Tyr Ala Gly Tyr Leu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

120

163 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 76:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 80 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 76:

GGCCGCGTGA CAATGCTGGC AGACTCAAGT AAGAACCAGG CCAGCCTGAG

ACTCAGCAGC GTGACAGCCG CCGACACCGC (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 77:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 74 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 77:

GGTGTCGGCG GCTGTCACGC TGCTGAGTCT CAGGCTGGCC TGGTTCTTAC

TTGAGTCTGC CAGCATTGTG ACGC (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 78:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 360 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché

164 (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 78:

GAGGTGCAGC TGCAGCAGAG CGGTCCAGGT CTCGTACGGC CTAGCCAGAC CCTGAGCCTC 60

ACGTGCACCG CATCTGGCTT CAACATTAAG GACAATTACA TGCACTGGGT GAGACAGCCA 120

CCTGGACGAG GCCTTGAGTG GATTGGATGG ATTGACCCTG AGAATGGTGA CACTGAGTAC 1B0

GGACCTAAGT TTCGCGGCCG CGTGACÄATG CTGGCAGACT CAAGTAAGAA CCAGGCCAGC 240

CTGAGACTCA GCAGCGTGAC AGCCGCCGAC ACCGCGGTCT ATTATTGTCA CGTCCTGATA 300

TACGCCGGGT ATCTGGCAAT GGACTACTGG GGCCAAGGGA CCCTCGTCAC CGTGAGCTCG 360 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 79:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 120 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 79:

Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gin 15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn íle Lys Asp Asn 20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp íle

165

Gly Trp íle Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe 50 55 60

Arg Gly Arg Val Thr Met Leu Ala Asp Ser Ser Lys Asn Gin Ala Ser ^{65 70} 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

90 95

His Val Leu íle Tyr Ala Gly Tyr Leu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 no

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 80:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 360 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 80:

GAGGTGCAGC TGCAGCAGAG CGGTCCAGGT CTCGTACGGC CTAGCCAGAC CCTGAGCCTC

ACGTGCACCG CATCTGGCTT CAACATTAAG GACAATTACA TGCACTGGGT GAGACAGCCA

CCTGGACGAG GCCTTGAGTG GATTGCATGG ÄTTGACCCTG AGAATGGTGA CACTGAGTAC

GCACCTAAGT TTCGCGGCCG CGTGACAATG CTGGCAGACT CAAGTAAGAA CCAGGCCAGC

CTGAGACTCA GCAGCGTGAC AGCCGCCGAC ACCGCGGTCT ATTATTGTCA CGTCCTGATA

TACGCCGGGT ATCTGGCAAT GGACTACTGG GGCCAAGGGA CCCTCGTCAC CGTGAGCTCG

120

180

240

300

360

166 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 81:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 120 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 81:

Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gin 15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn íle Lys Asp Asn

25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp íle 35 40 45

Ala Trp íle Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe

55 60

Arg Gly Arg Val Thr Met Leu Ala Asp Ser Ser Lys Asn Gin Ala Ser

70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

90 95

His Val Leu íle Tyr Ala Gly Tyr Leu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

120

167 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 82:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 80 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 82:

GGCCGCGCCA CAATGCTGGC AGACACTAGT AAGAACCAGT TCAGCCTGAG 50

ACTCAGCAGC GTGACAGCCG CCGACACCGC 80 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 83:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 74 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 83:

GGTGTCGGCG GCTGTCACGC TGCTGAGTCT CAGGCTGAAC TGGTTCTTAC 50

TAGTGTCTGC CAGCATTGTG GCGC 74 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 84:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

168 (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 84:

GAGGTGCAGC TGCAGCAGAG CGGTCCAGGT CTCGTACGGC CTAGCCAGAC CCTGAGCCTC

ACGTGCACCG CATCTGGCTT CAACATTAAG GACAATTACA TGCACTGGGT GAGACAGCCA

CCTGGACGAG GCCTTGAGTG GATTGGATGG ATTGACCCTG AGAATGGTGA CACTGAGTAC

GCACCTAAGT TTCGCGGCCG CGCCACAATG CTGGCAGACA CTAGTAAGAA CCAGTTCAGC

CTGAGACTCA GCAGCGTGAC AGCCGCCGAC ACCGCGGTCT ATTATTGTCA CGTCCTGATA

TACGCCGGGT ATCTGGCAAT GGACTACTGG GGCCAAGGGA CCCTCGTCAC CGTGAGCTCG (2) INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 85:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 120 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna

120

180

240

300

360

(ii)	TYP MOLEKULY:	proteín
(xi)	OPIS SEKVENCIE	: SEQ ID NO: 85:
Glu	Val Gin Leu Gin Gin	Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gin
1	5	10 1S
Thr	Leu Ser Leu Thr Cys	Thr Ala Ser Gly Phe Asn íle Lys Asp Asn
	20	25 30
Tyr	Met His Trp Val Arg	Gin Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp íle
	35	40 45
Gly	Trp íle Asp Pro Glu	Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe

169

Arg Gly Arg Ala Thr Met Leu Ala Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser 65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

His Val Leu íle Tyr Ala Gly Tyr Leu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 86:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 80 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 86:

GGCCGCGCCA CAATGCTGGC AGACTCAAGT AAGAACCAGG AACGCCTGAG 50

ACTCAGCAGC GTGACAGCCG CCGACACCGC 80 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 87:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 74 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna

170 (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 87:

GGTGTCGGCG GCTGTCACGC TGCTGAGTCT TGCTGAGTCT CAGGCTGGCC 50 TGGTTCTTAC CAGCATTGTG GCGC 74 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 88:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 360 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 88:

GAGGTGCAGC TGCAGCAGAG CGGTCCAGGT CTCGTACGGC CTAGCCAGAC CCTGAGCCTC 60

ACGTGCACČG CATCTGGCTT CAACATTAAG GACAATTACA TGCACTGGGT GAGACAGCCA 120

CCTGGACGAG GCCTTGAGTG GATTGGATGG ATTGACCCTG AGAATGGTGA CACTGAGTAC 100

GCACCTAAGT TTCGCGGCCG CGCCACAATG CTGGCAGACT CAAGTAAGAA CCAGGCCAGC 240

CTGAGACTCA GCAGCGTGAC AGCCGCCGAC ACCGCGGTCT ATTATTGTCA CGTCCTGATA 300

TACGCCGGGT ATCTGGCAAT GGACTACTGG GGCCAAGGGA CCCTCGTCAC CGTGAGCTCG 360 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 89:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 120 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina

171 (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 89:

Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gin 15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn íle Lys Asp Asn 20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp íle 35 40 45

Gly Trp íle Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe 50 55 50

Arg Gly Arg Ala Thr Met Leu Ala Asp Ser Ser Lys Asn Gin Ala Ser 65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

His Val Leu íle Tyr Ala Gly Tyr Leu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

120

172 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 90:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 360 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 90:

GAGGTGCAGC	TGCAGCAGAG	CGGTCCAGGT	CTCGTACGGC	CTAGCCAGAC	CCTGAGCCTC	60
ACGTGCACCG	CATCTGGCTT	CAACATTAAG	GACAATTACA	TGCACTGGGT	GAGACAGCCA	120
CCTGGACGAG	GCCTTGAGTG	GATTGCATGG	ATTGACCCTG	AGAATGGTGA	CACTGAGTAC	180
GCACCTAAGT	TTCGCGGCCG	CGCCACAATG	CTGGCAGACT	CAAGTAAGAA	CCAGGCCAGC	240
CTGAGACTCA	GCAGCGTGAC	AGCCGCCGAC	ACCGCGGTCT	ATTATTGTCA	CGTCCTGATA	300
TACGCCGGGT	ATCTGGCAAT	GGACTACTGG	GGCCÄAGGGA	CCCTCGTCAC	CGTGAGCTCG	360

(2) INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 91:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 120 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 91:

173

Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gin 15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn íle Lys Asp Asn 20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp íle 35 40 45

Ala Trp íle Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe 50 55 60

Arg Gly Arg Ala Thr Met Leu Ala Asp Ser Ser Lys Asn Gin Ala Ser

70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

90 95

His Val Leu íle Tyr Ala Gly Tyr Leu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 92: (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 780 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina

174 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 92:

ATGAAGTTGT GGCTGAACTG GATTTTCCTT GTAACACTTT TAAATGGAAT TCAGTGTGAG 60

GTGCAGCTGC AGCAGAGCGG TCCAGGTCTC GTACGGCCTA GCCAGACCCT GAGCCTCACG 120

TGCACCGCAT CTGGCTTCAA CATTAAGGAC AATTACATGC ACTGGGTGAG ACAGCCACCT 180

GGACGAGGCC TTGAGTGGAT TGGATGGATT GACCCTGAGA ATGGTGACAC TGAGTACGCA 240

CCTAAGTTTC GCGGCCGCGT GACAATGCTG GCAGACACTA GTAAGAACCA GTTCAGCCTG 300

AGACTCAGCA GCGTGACAGC CGCCGACACC GCGGTCTATT ATTGTCACGT CCTGATATAC 360

GCCGGGTATC TGGCAATGGA CTACTGGGGC CAAGGGACCC TCGTCACCGT GAGCTCGGCC 420

TCCACCAAGG GCCCATCGGT CTTCCCCCTG GCACCCTCCT CCAAGAGCAC CTCTGGGGGC 480

ACAGCGGCCC TGGGCTGCCT GGTCAAGGAC TACTTCCCCG AACCGGTGAC GGTGTCGTGG S40

AACTCAGGCG CCCTGACCAG CGGCGTGCAC ACCTTCCCGG CTGTCCTACA GTCCTCAGGA 600

CTCTACTCCC TCAGCAGCGT GGTGACTGTG CCCTCCAGCA GCTTGGGCAC CCAGACCTAC 660

ATCTGCAACG TGAATCACAA CCCCAGCAAC ACCAAGGTCG ACAAGAAAGT TGAGCCCAAA 720

TCTTGTGACA AGACGCACAC GTGCCCGCCG TGCCCGGCTC CGGAACTGCT GGGTGGCCCG 780 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 93:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 260 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín

175

Xi)

OP

IS

SEKVEN

CIE

: S

EQ

ID

NO:

93

i

Met

Lys

Leu

Trp

Leu

Asn

Trp

íle

Phe

Leu

Val

Thr Leu

Leu

Asn i

Gly

1

5

10

15

íle

Gin

Cys

Glu

Val

Gin

Leu

Gin

Ser

Gly

Pro Gly

Leu

Val

Arg

20

25

30

Pro

Ser

Gin

Thr

Leu

Ser

Leu

Thr

Cys

Thr

Ala

Ser Gly

Phe

Asn

íle

35

40

45

Lys

Asp

Asn

. Tyr

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Pro

Pro Gly

Arg

[ Gly

Leu

55 60

Glu Trp íle Gly Trp íle Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala

70 75 BO

Pro Lys Phe Arg Gly Arg Val Thr Met Leu Ala Asp Thr Ser Lys Asn.

B5 90 95

Gin Phe Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val 100 10S no

Tyr Tyr Cys His Val Leu íle Tyr Ala Gly Tyr Leu Ala Met Asp Tyr 115 120 125

Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 130 135 140

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

145 150 155 160

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

165 170 175

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 180 185 190

Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

195

200

205

176

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr íle Cys Asn Val 210 215 220

Asn His Asn Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys

225 230 235 240

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

245 250 255

Leu Gly Gly Pro

260

12)

INFORMÁCIA 0 SEKVENCII SEQ ID NO (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

94:

(A) DĹŽKA: 918 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 94:

ATGAAGTTGT GGCTGAACTG GATTTTCCTT GTAACACTTT TAAATGGAAT TCAGTGTGAG

GTGCAGCTGC AGCAGAGCGG TCCAGGTCTC GTACGGCCTA GCCAGACCCT GAGCCTCACG

TGCACCGCAT CTGGCTTCAA CATTAAGGAC AATTACATGC ACTGGGTGAG ACAGCCACCT

GGACGAGGCC TTGAGTGGAT TGGATGGATT GACCCTGAGA ATGGTGACAC TGAGTACGCA

CCTAAGTTTC GCGGCCGCGT GACAATGCTG GCAGACACTA GTAAGAACCA GTTCAGCCTG

AGACTCAGCA GCGTGACAGC CGCCGACACC GCGGTCTATT ATTGTCACGT CCTGATATAC

GCCGGGTATC TGGCAATGGA CTACTGGGGC CAAGGGACCC TCGTCACCGT GAGCTCGGCT

120

180

240

300

360

420

177

AGCACCAAGG GCCCATCGGT CTTCCCCCTG GCGCCCTGCT CCAGGAGCAC CTCTGGGGGC 480

ACAGCGGCCC TGGGCTGCCT GGTCAAGGAC TACTTCCCCG AACCGGTGAC GGTGTCGTGG 540

AACTCAGGCG CCCTGACCAG CGGCGTGCAC ACCTTCCCGG CTGTCCTACA GTCCTCAGGA 600

CTCTACTCCC TCAGCAGCGT GGTGACCGTG CCCTCCAGCA GCTTGGGCAC CCAGACCTAC 660

ACCTGCAACG TGAATCACÄA GCCCAGCAAC ACCAAGGTGG ACAAGAGAGT GGAGCTGAAA 720

ACCCCACTCG GTGACACAAC TCACACGTGC CCTAGGTGTC CTGAACCTAA A.TCTTGTGAC 780

ACACCTCCCC CGTGCCCACG GTGCCCAGAG CCCAAATCTT GCGACACGCC CCCACCGTGT 840

CCCAGATGTC CTGAACCAAA GAGCTGTGAC ACTCCACCGC CCTGCCCGAG GTGCCCAGCA 900

CCTGAACTCC TGGGAGGG 91S (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 95:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 306 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 95:

Met Lys Leu Trp Leu Asn Trp íle Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly íle Gin Cys Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg

Pro Ser Gin Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn íle

178

Lys Asp Asn Tyr Met His Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Arg Gly Leu 50 55 60

Glu Trp íle Gly Trp íle Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala 65 70 75 80

Pro Lys Phe Arg Gly Arg Val Thr Met Leu Ala Asp Thr Ser Lys Asn 85 90 95

Gin Phe- Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val 100 105 HO

Tyr Tyr Cys His Val Leu íle Tyr Ala Gly Tyr Leu Ala Met Asp Tyr 115 120 125

Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 130 135 140

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Gly Gly

145 150 155 160

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

165 170 175

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 180 185 190

Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 195 200 205

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Thr Cys Asn Val 210 215 220

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Leu Lys 225 230 235 240

Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro

245

250

255

179

Lys	Ser Cys	Asp 260	Thr Pro-Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys
265	270
Ser	Cys	Asp	Thr	Pro	Pro Pro	Cys Pro Arg Cys Pro	Glu	1?2TO	Lys Ser
		275				280	285
Cys.	Asp	Thr	Pro	Pro	Pro Cys	Pro Arg Cys Pro Ala	Pro Glu Leu Leu
	290				295	300
Gly	Gly
305
(2) INFORMÁCIA	O SEKVENCII	SEQ ID NO: 96:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 705 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 96:

ATGGATTTTC AAGTGCAGAT TTTCAGCTTC CTGCTAATCA GTGCTTCAGT CATAATGTCC

CGCGGCCAGA TCGTGCTGAC CCAGAGCCCA AGCAGCCTGA GCGCTAGCGT GGGTGACAGA

GTGACCATCA CGTGTAGTGC CAGCTCAAGT GTAACTTACA TGCACTGGTA CCAGCAGAAG

CCAGGTAAGG CTCCAAAGCT GCTGATCTAC AGCACATCCA ACCTGGCTTC TGGTGTGCCA

AGCAGATTCT CCGGAAGCGG TAGCGGCACC GACTACACCT TCACCATCAG CAGCCTCCAG

CCAGAGGATA TCGCCACCTA CTACTGCCAG CAGAGGAGTA CTTACCCGCT CACGTTCGGC

CAAGGGACCA AGCTCGAGAT CAAACGGACT GTGGCTGCAC CATCTGTCTT CATCTTCCCG

120

180

240

300

360

420

180

CCATCTGATG AGCAGTTGAA ATCTGGAACT GCCTCTGTTG TGTGCCTGCT GAATAACTTC 480

TATCCCAGAG AGGCCAAAGT ACAGTGGAAG GTGGATAACG CCCTCCAATC GGGTAACTCC 540

CAGGAGAGTG TCACAGAGCA GGACAGCAAG GACAGCACCT ACAGCCTCAG CAGCACCCTG 600

ACGCTGAGCA AAGCAGACTA CGAGAAACAC AAAGTCTACG CCTGCGAAGT CACCCATCAG 660

GGCCTGAGTT CGCCCGTCAC AAAGAGCTTC AACAGGGGAG AGTGT 705 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 97:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 235 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 97:

Met Asp Phe Gin Val Gin Xle Phe Ser Phe Leu Leu íle Ser Ala Ser

Val íle Met Ser Arg Gly Gin íle Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser

Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr íle Thr Cys Ser Ala Ser

Ser Ser- Val Thr Tyr Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala

181

Pro Lys Leu Leu íle Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

S5 70 75 80

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr íle

90 95

Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp íle Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg

100 105 110

Ser Thr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu íle Lys 115 120 125

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe íle Phe Pro Pro Ser Asp Glu

130 135 140

Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

145 ISO 155 ISO

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin

165 170 175

Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 180 185 190

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 195 200 205

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 210 215 220

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225

230

235

182 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 98:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 705 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 98:

ATGGATTTTC AAGTGCAGAT TTTCAGCTTC CTGCTAATCA GTGCTTCAGT CATAATGTCC

CGCGGCGACA TCCAGATGAC CCAGAGCCCA AGCAGCCTGA GCGCTAGCGT GGGTGACAGA

GTGACCATCA CGTGTAGTGC CAGCTCAAGT GTAACTTACA TGCACTGGTA CCAGCAGAAG

CCAGGTAAGG CTCCAAAGCT GTGGATCTAC AGCACATCCA ACCTGGCTTC TGGTGTGCCA

AGCAGATTCT CCGGAAGCGG TAGCGGCACC GACTACACCT TCACCATCAG CAGCCTCCAG

CCAGAGGATA TCGCCACCTA CTACTGCCAG CAGAGGAGTA CTTACCCGCT CACGTTCGGC

CAAGGGACCA AGCTCGAGAT CAAACGGACT GTGGCTGCAC CATCTGTCTT CATCTTCCCG

CCATCTGATG AGCAGTTGAA ATCTGGAACT GCCTCTGTTG TGTGCCTGCT GAATAACTTC

TATCCCAGAG AGGCCAAAGT ACAGTGGAAG GTGGATAACG CCCTCCAATC GGGTAACTCC

CAGGAGAGTG TCACAGAGCA GGACAGCAAG GACAGCACCT ACAGCCTCAG CAGCACCCTG

ACGCTGAGCA AAGCAGACTA CGAGAAACAC AAAGTCTACG CCTGCGAAGT CACCCATCAG

GGCCTGAGTT CGCCCGTCAC AAAGAGCTTC AACAGGGGAG AGTGT

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

705

183 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 99:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 235 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 99:

Met Asp Phe Gin Val Gin íle Phe Ser Phe Leu Leu íle Ser Ala Ser 15 10 15

Val íle Met Ser Arg Gly Asp íle Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser 20 25 30

Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr íle Thr Cys Ser Ala Ser

40 45

Ser Ser Val Thr Tyr Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala 50 55 60

Pro Lys Leu Trp íle Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 65 70 75 80

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr íle 85 90 95

Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp íle Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg 100 105 110

Ser Thr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu íle Lys

115 120 125

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe íle Phe Pro Pro Ser Asp Glu 130 135 140

Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

145

150

155

160

184

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin 165 170 175

Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser ISO 135 190

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 195 200 205

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 210 215 220

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230. 235 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 100:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 54 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 100:

CCAGCACCT GAACTCCTGG GAGGAGCAAC AGGACACAGT TATGAGAGT

ACAA (2) INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 101:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 50 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina

185 (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 101:

GGGGGTCTAG ATTATTAGTA CAGGTGTTCC AGGACGTAGC TGGCAACATA 50 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 102:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 46 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 102:

GGGGGAGCTC GGCTAGCACC AAGGGCCCAT CGGTCTTCCC CCTGGC 46 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 103:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 55 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 103:

TTGTACTTCT CATAACTGTG TCCTGTTGCT CCTCCAGGA GTTCAGGTGC 50

TGGGC

186 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 104:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 21 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 104:

GCCTGTGCTC AATATTGATG G 21 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 105:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 21 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 105:

GGAGAAAGCC ATATCTGCCT G 21 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 106:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

187 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 106:

TCGCTATTAC CATGGTGATG CGGTTTTGGC (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 107:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 23 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 107:

GGCTGGATTC TCAGTGGCGA CTT (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 108:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 18 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 108:

CACAACAGAG GCAGTTCC (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 109:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina

188 (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 109:

CACCTTCACC ATCAGCAGCC 20 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 110:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 19 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 110:

GGACCTGCTG CAGAGTCTG 19 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 111:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 47 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 111:

GGCTGCAGGA ATTCTTATTA TAGACGAACC CGGCTATCAA ACTGAGC

189 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 112:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 1870 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 112:

AAGCTTGCCG CCACCATGAA GTTGTGGCTG AACTGGATTT TCCTTGTAAC ACTTTTAAAT 60

GGAATTCAGT GTGAGGTGCA GCTGCAGCAG AGCGGTCCAG GTCTCGTACG GCCTAGCCAG 120

ACCCTGAGCC TCACGTGCAC CGCATCTGGC TTCAACATTA AGGACAATTA CATGCACTGG 180

GTGAGACAGC CACCTGGACG AGGCCTTGAG TGGATTGGAT GGATTGACCC TGAGAATGGT 240

GACACTGAGT ACGCACCTAA GTTTCGCGGC CGCGTGACAA TGCTGGCAGA CACTAGTAAG 300

AACCAGTTCA GCCTGAGACT CAGCAGCGTG ACAGCCGCCG ACACCGCGGT CTATTATTGT 360

CACGTCCTGA TATACGCCGG GTATCTGGCA ATGGACTACT GGGGCCÄAGG GACCCTCGTC 420

ACCGTGAGCT CGGCTAGCAC CAAGGGCCCA TCGGTCTTCC CCCTGGCGCC CTGCTCCAGG 480

AGCACCTCTG GGGGCACAGC GGCCCTGGGC TGCCTGGTCA AGGACTACTT CCCCGAACCG 540

GTGACGGTGT CGTGGAACTC AGGCGCCCTG ACCAGCGGCG TGCACACCTT CCCGGCTGTC 600

CTACAGTCCT CAGGACTCTA CTCCCTCAGC AGCGTGGTGA CCGTGCCCTC CAGCAGCTTG 660

GGCACCCAGA CCTACACCTG CAACGTGAAT CACAAGCCCA GCAACACCAA GGTGGACAAG 720

AGAGTGGAGC TGAAAACCCC ACTCGGTGAC ACAACTCACA CGTGCCCTAG GTGTCCTGAA 780

CCTAAATCTT GTGACACACC TCCCCCGTGČ CCACGGTGCC CAGAGCCCAA ATCTTGCGAC 840

190

ACGCCCCCAC CGTGTCCCAG ATGTCCTGAA CCAAAGAGCT GTGACACTCC ACCGCCCTGC 900

CCGAGGTGCC CAGCACCTGA ACTCCTGGGA GGAGCAACAG GACACAGTTA TGAGAAGTAC 960

AACAAGTGGG AAACGATAGA GGCTTGGACT CAACAAGTCG CCACTGAGAA TCCAGCCCTC 1020

ATCTCTCGCA GTGTTATCGG AACCACATTT GAGGGACGCG CTATTTACCT CCTGAAGGTT 10BO

GGCAAAGCTG GACAAAATAA GCCTGCCATT TTCATGGACT GTGGTTTCCA TGCCAGAGAG 1140

TGGATTTCTC CTGCATTCT3 CCAGTGGTTT GTAAGAGAGG CTGTTCGTAC CTATGGACGT 1200

GAGATCCAAG TGACAGAGCT TCTCGACAAG TTAGACTTTT ATGTCCTGCC TGTGCTCAAT 1260

ATTGATGGCT ACATCTACAC CTGGACCAAG AGCCGATTTT GGAGAAAGAC TCGCTCCACC 1320

CATACTGGAT CTAGCTGCAT TGGCACAGAC CCCAACAGAA ATTTTGATGC TGGTTGGTGT 1380

GAAATTGGAG CCTCTCGAAA CCCCTGTGAT GAAACTTACT GTGGACCTGC CGCAGAGTCT 144 0

GAAAAGGAGA CCAAGGCCC7 GGCTGATTTC ATCCGCAACA AACTCTCTTC CATCAAGGCA 1500

TATCTGACAA TCCACTCGTA CTCCCAAATG ATGATCTACC CTTACTCATA TGCTTACAAA 1560

CTCGGTGAGA ACAATGCTC-A GTTGAATGCC CTGGCTAAAG CTACTGTGAA AGAACTTGCC 1620

TCACTGCACG GCACCAAGTA CACATATGGC CCGGGAGCTA CAACAATCTA TCCTTCTGCT 1680

GGGACTTCTA AAGACTGGGC TTATGACCAA GGAATCAGAT ATTCCTTCAC CTTTGAACTT 1740

CGAGATACAG GCAGATATGG CTTTCTCCTT CCAGAATCCC AGATCCGGGC TACCTGCGAG 1800

GAGACCTTCC TGGCAATCAA GTATGTTGCC AGCTACGTCC TGGAACACCT GTACTAATAA 1860

TCTAGAGAGA

1870

191 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 113:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 613 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 113:

Met Lys Leu Trp Leu Asn Trp íle Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly 15 10 15 íle Gin Cys Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg 20 25 30

Pro Ser Gin Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn íle

40 45

Lys Asp Asn Tyr Met His Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Arg Gly Leu

55 60

Glu Trp íle Gly Trp íle Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala

70 75 80

Pro Lys Phe Arg Gly Arg Val Thr Met Leu Ala Asp Thr Ser Lys Asn

90 95

Gin Phe Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val 100 105 110

Tyr Tyr Cys His Val Leu íle Tyr Ala Gly Tyr Leu Ala Met Asp Tyr 11S 120 125

Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

130

135

140

192

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro

145 150

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 165

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala

180

Cys Ser Arg Ser Thr Ser Gly Gly 155 160

Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 170 175

Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

185 190

Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 195 200 205

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Thr Cys Asn Val 210 215 220

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Leu Lys

225 230 235 240

Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro

245 250 255

Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys 260 265 270

Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser

275 280 205

Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 290 295 300

Gly Gly Ala Thr Gly His Ser Tyr Glu Lys Tyr Asn Lys Trp Glu Thr

305 310 315 320 íle Glu Ala Trp Thr Gin Gin Val Ala Thr Glu Asn Pro Ala Leu íle

325 330 335

Ser Arg Ser Val íle Gly Thr Thr Phe Glu Gly Arg Ala íle Tyr Leu

340

345

350

193

Leu Lys Val Gly Lys Ala Gly Gin Asn Lys Pro Ala íle Phe Met Asp 355 360 355

Cys Gly Phe His Ala Arg Glu Trp íle Ser Pro Ala Phe Cys Gin Trp 370 375 3Θ0

Phe Val Arg Glu Ala Val Arg Thr Tyr Gly Arg Glu íle Gin Val Thr

385 390 395 400

Glu Leu Leu Asp Lys Leu Asp Phe Tyr Val Leu Pro Val Leu Asn íle

405 410 415

Asp Gly Tyr íle Tyr Thr Trp Thr Lys Ser Arg Phe Trp Arg Lys Thr

420 425 430

Arg Ser Thr His Thr Gly Ser Ser Cys íle Gly Thr Asp Pro Asn Arg

435 440 445

Asn Phe Asp Ala Gly Trp Cys Glu íle Gly Ala Ser Arg Asn Pro Cys

450 455 460

Asp Glu Thr Tyr Cys Gly Pro Ala Ala Glu Ser Glu Lys Glu Thr Lys

465 470 475 480

Ala Leu Ala Asp Phe íle Arg Asn Lys Leu Ser Ser íle Lys Ala Tyr

485 490 495

Leu Thr íle His Ser Tyr Ser Gin Met Met íle Tyr Pro Tyr Ser Tyr

500

505

510

194

Ala Tyr Lys Leu Gly Glu Asn Asn Ala Glu Leu Asn Ala Leu Ala Lys

515 520 S25

Ala Thr Val Lys Glu Leu Ala Ser Leu His Gly Thr Lys Tyr Thr Tyr

530 535 540

Gly Pro Gly Ala Thr Thr íle Tyr Pro Ser Ala Gly Thr Ser Lys Asp 545 550 555 560

Trp Ala Tyr Asp Gin Gly íle Arg Tyr Ser Phe Thr Phe Glu Leu Arg 565 570 575

Asp Thr Gly Arg Tyr Gly Phe Leu Leu Pro Glu Ser Gin íle Arg Ala 580 585 590

Thr Cys Glu Glu Thr Phe Leu Ala íle Lys Tyr Val Ala Ser Tyr Val 595 600 605

Leu Glu His Leu Tyr 610

195 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 114:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 96 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 114:

His His Gly Gly Glu	His Phe Glu Gly Glu Lys Val Phe Arg Val Asn
1	5	10	15
Val	Glu Asp Glu Asn	His Íle Asn íle íle	Arg Glu Leu Ala Ser Thr
	20	25	30
Thr	Gin íle Asp Phe	Trp Lys Pro Asp Ser	Val Thr Gin íle Lys Pro
	35	40	45
His	Ser Thr Val Asp	Phe Arg Val Lys Ala	Glu Asp Thr Val Thr Val
	50	55	60
Glu	Asn Val Leu Lys	Gin Asn Glu Leu Gin	Tyr Lys Val Leu íle Ser
65		70	75 80

Asn Leu Arg Asn Val Val Glu Ala Gin Phe Asp Ser Arg Val Arg Leu 85 90 95 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 115:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 520 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna

196 (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 115:

GAGCTCGGCT AGCACCAAGG GCCCATCGGT CTTCCCCCTG GCGCCCTGCT CCAGGAGCAC 60

CTCTGGGGGC ACAGCGGCCC TGGGCTGCCT GGTCAAGGAC TACTTCCCCG AACCGGTGAC 120

GGTGTCGTGG AACTCAGGCG CCCTGACCAG CGGCGTGCAC ACCTTCCCGG CTGTCCTACA 180

GTCCTCAGGA CTCTACTCCC TCAGCAGCGT GGTGACCGTG CCCTCCAGCA GCTTGGGCAC 240

CCAGACCTAC ACCTGCAACG TGAATCACAA GCCCAGCAAC ACCAAGGTGG ACAAGAGAGT 300

GGAGCTGAAA ACCCCACTCG GTGACACAAC TCACACGTGC CCTAGGTGTC CTGAACCTAA 360

ATCTTGTGAC ACACCTCCCC CGTGCCCACG GTGCCCAGAG CCCAAATCTT GCGACACGCC 420

CCCACCGTGT CCCAGATGTC CTGAACCAAA GAGCTGTGAC ACTCCACCGC CCTGCCCGAG 480

GTGCCCAGCA CCTGAACTCC TGGGAGGGTA ÄTAGCCCGGG 520 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 116:

(2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 116:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 31 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 116:

GTTATTACTC GCTGCCCAAC CAGCCATGGC G

197 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 117:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 23 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 117:

GCAGCAGGAT AGATTGTTGT AGC 2 3 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 118:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 88 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 118:

CCGGAATTCT TATTAGTTCA GGTCCTCCTC AGAGATCAGC TTCTGCTCCT 50

CGAACTCATG GTGGTGATGG TGGTGGTACA GGTGTTCC 88 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 119:

(i) CHARAKTERI STIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 30 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna

198 (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 119:

CAATCTATCC TGCTGCTGGG ACTTCTAAAG (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 120:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 120:

GATTGTTGTA GCTCCCGGGC (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 121:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 30 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 121:

GGAGCTACAA CAATCTATCC TTCTGCTGGG (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 122:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 22 bázových párov

199 (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 122:

ACGGCACCAA GTACACATAT GG 22 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 123:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 90 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 123:

ACGAGAATTC GACCGCTCTG CTGCAGCTGC ACCTCGGAAC CGCCACCGCT 50

GCCACCGCCA GAACCGCCAC CGTACAGGTG TTCCAGGACG 90 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 124:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 2154 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 124:

200

A7GT7GGCAC 7C77GGT7C7 GGTGACTGTG GCCCTGGCAT CTGCTCATCA TGGTGGTGAG

CACTTTGAAG GCGAGAAGGT GTTCCGTGTT AACGTTGAAG ATGAAAATCA CATTAACATA

ATCCGCGAGT TGGCCAGCAC GACCCAGATT GACTTCTGGA AGCCAGATTC TGTCACACAA

ATCAAACCTC ACAGTACAGT TGACTTCCGT GTTAAAGCAG AAGATACTGT CACTGTGGAG

AATGTTCTAA AGCAGAATGA ACTACAATAC AAGGTACTGA TAAGCAACCT GAGAAATGTG

GTGGAGGCTC AGTTTGATAG CCGGGTTCGT GCAACAGGAC ACAGTTATGA GAAGTACÄAC

AAGTGGGAAA CGATAGAGGC TTGGACTCAA CAAGTCGCCA CTGAGAATCC AGCCCTCATC

TCTCGCAGTG TTATCGGAAC CACATTTGAG GGACGCGCTA TTTACCTCCT GAAGGTTGGC aaagctggac aaaataagcc tgccattttc atggactgtg GTTTCCATGC CAGAGAGTGG

ATTTCTCCTG CATTCTGCCA GTGGTTľGTA AGAGAGGCTG 77CG7ACC7A 7GGACG7GAG

ATCCAAGTGA CAGAGCTTCT CGACAAGTTA GACTTTTATG 7CC7GCC7G7 GCTCAATATT

GÄTGGCTACA TCTACACCTG GACCAAGAGC CGATTTTGGA GAAAGACTCG CTCCACCCAT

ACTGGÄTCTA GCTGCATTGG CACAGACCCC AACAGAAATT TTGATGCTGG 77GG7G7GAA

A77GGAGCC7 CTCGAAACCC C7G7GA7GAA AC77AC7G7G GACCTGCCGC AGAGTCTGAA

AAGGAGACCA AGGCCC7GGC 7GA777CA7C CGCAACAAAC TCTCT7CCAT CAAGGCA7A7

CTGACAA7CC ACTCGTACTC CCAAA7GA7G ATCTACCCTT AC7CA7A7GC 77ACAAAC7C

GG7GAGAACA ATGCTGAGTT GAATGCCCTG GCTAAAGCTA C7G7GAAAGA ACTTGCCTCA

120

ISO

240

300

360

420

480

540 ' 600

660

720

780

840

900

960

1020

201

CTGCACGGCA CCAAGTACAC ATATGGCCCG GGAGCTACAA CAATCTATCC TTCTGCTGGG 1080

ACTTCTAAAG ACTGGGCTTA TGACCAAGGA ATCAGATATT CCTTCACCTT TGAACTTCGA 1140

GATACAGGCA GATATGGCTT TCTCCTTCCA GAATCCCAGA TCCGGGCTAC CTGCGAGGAG 1200

ACCTTCCTGG CAATCAAGTA TGTTGCCAGC TACGTCCTGG AACACCTGTA CGGTGGCGGT 1260

TCTGGCGGTG GCAGCGGTGG CGGTTCCGAG GTGCAGCTGC AGCAGAGCGG TCCAGGTCTC 1320

GTACGGCCTA GCCAGACCCT GAGCCTCACG TGCACCGCAT CTGGCTTCAA CATTAAGGAC 13 30

AATTACATGC ACTGGGTGAG ACAGCCACCT GGACGAGGCC TTGAGTGGAT TGGATGGATT 1440

GACCCTGAGA ATGGTGACAC TGAGTACGCA CCTAAGTTTC GCGGCCGCGT GACAATGCTG 1500

GCAGACACTA GTAAGAACCA GTTCAGCCTG AGACTCAGCA GCGTGACAGC CGCCGACACC 1560

GCGGTCTATT ATTGTCACGT CCTGATATAC GCCGGGTATC TGGCAATGGA CTACTGGGGC 1620

CAAGGGACCC TCGTCACCGT GAGCTCGGCT AGCACCAAGG GCCCATCGGT CTTCCCCCTG 1680

GCGCCCTGCT CCAGGAGCAC CTCTGGGGGC ACAGCGGCCC TGGGCTGCCT GGTCAAGGAC 1740

TACTTCCCCG AACCGGTGAC GGTGTCGTGG AACTCAGGCG CCCTGACCAG CGGCGTGCAC 1800

ACCTTCCCGG CTGTCCTACA GTCCTCAGGA CTCTACTCCC TCAGCAGCGT GGTGACCGTG 1860

CCCTCCAGCA GCTTGGGCAC CCAGACCTAC ACCTGCAACG TGAATCACAA GCCCAGCAAC 1920

ACCAAGGTGG ACAAGAGAGT GGAGCTGAAA ACCCCACTCG GTGACACAAC TCACACGTGC 1980

CCTAGGTGTC CTGAACCTAA ATCTTGTGAC ACACCTCCCC CGTGCCCACG GTGCCCAGAG 2040

CCCAAATCTT GCGACACGCC CCCACCGTGT CCCAGATGTC CTGAACCAÄA GAGCTGTGAC 2100

ACTCCACCGC CCTGCCCGAG GTGCCCAGCA CCTGAACTCC TGGGAGGGTA ATAG

2154

202 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 125:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 716 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 125:

Met Leu Ala Leu Leu Val Leu Val Thr Val Ala Leu Ala Ser Ala His

10 15

His Gly Gly Glu His Phe Glu Gly Glu Lys Val Phe Arg Val Asn Val

25 30

Glu Asp Glu Asn His íle Asn íle íle Arg Glu Leu Ala Ser Thr Thr

40 45

Gin íle Asp Phe Trp Lys Pro Asp Ser Val Thr Gin íle Lys Pro His

55 SO

Ser Thr Val Asp Phe Arg Val Lys Ala Glu Asp Thr Val Thr Val Glu

70 75 80

Asn Val Leu Lys Gin Asn Glu Leu Gin Tyr Lys Val Leu íle Ser Asn 85 90 95

Leu Arg Asn Val Val Glu Ala Gin Phe Asp Ser Arg Val Arg Ala Thr 100 105 110

Gly His Ser Tyr Glu Lys Tyr Asn Lys Trp Glu Thr íle Glu Ala Trp 115 120 125

Thr Gin Gin Val Ala Thr Glu Asn Pro Ala Leu íle Ser Arg Ser Val

130

135

140

203 íle Gly Thr Thr Phe Glu Gly Arg Ala íle Tyr Leu Leu Lys Val Gly 150 155 160

145

Lys Ala Gly Gin Asn Lys Pro Ala íle Phe Met Asp Cys Gly Phe His 16S 170 175

Ala Arg Glu Trp íle Ser Pro Ala Phe Cys Gin Trp Phe Val Arg Glu 180 185 190

Ala Val Arg Thr Tyr Gly Arg Glu íle Gin Val Thr Glu Leu Leu Asp

195 200 205

Lys Leu Asp Phe Tyr Val Leu Pro Val Leu Asn íle Asp Gly Tyr íle 210 215 220

Tyr Thr Trp Thr Lys Ser Arg Phe Trp Arg Lys Thr Arg Ser Thr His

225 230 235 240

Thr Gly Ser Ser Cys íle Gly Thr Asp Pro Asn Arg Asn Phe Asp Ala

245 2S0 255

Gly Trp Cys Glu íle Gly Ala Ser Arg Asn Pro Cys Asp Glu Thr Tyr 260 265 270

Cys Gly Pro Ala Ala Glu Ser Glu Lys Glu Thr Lys Ala Leu Ala Asp 275 280 285

Phe íle Arg Asn Lys Leu Ser Ser íle Lys Ala Tyr Leu Thr íle His 290 295 300

Ser Tyr Ser Gin Met Met íle Tyr Pro Tyr Ser Tyr Ala Tyr Lys Leu

305 310 315 320

Gly Glu Asn Asn Ala Glu Leu Asn Ala Leu Ala Lys Ala Thr Val Lys

325 330 335

Glu Leu Ala Ser Leu His Gly Thr Lys Tyr Thr Tyr Gly Pro Gly Ala

340

345

350

204

Thr Thr íle Tyr Pro Ser Ala Gly . Thr Ser Lys Asp Trp Ala Tyr Asp 3S5 360 365

Gin Gly íle Arg Tyr Ser Phe Thr Phe Glu Leu Arg Asp Thr Gly Arg · 370 375 380

Tyr Gly Phe Leu Leu Pro Glu Ser Gin íle Arg Ala Thr Cys Glu Glu

385 390 395 400

Thr Phe Leu Ala íle Lys Tyr Val Ala Ser Tyr Val Leu Glu His Leu

405 410 415

Tyr Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gin 420 425 430

Leu Gin Gin Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gin Thr Leu Ser 435 440 445

Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn íle Lys Asp Asn Tyr Met His 450 455 460

Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp íle Gly Trp íle

465 470 475 480

Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe Arg Gly Arg

485 490 495

Val Thr Met Leu Ala Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu Arg Leu 500 505 510

Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys His Val Leu 515 520 525 íle Tyr Ala Gly Tyr Leu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu

530

535

540

205

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 545 550 555 550

Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 555 570 575

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 580 5Θ5 590

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser S9S 600 505

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 610 615 620

Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

625 630 635 640

Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr

645 650 655

Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro 660 665 670

Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro

67S 680 685

Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro

690 695 700

Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

705

710

715

206 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 126:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 42 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 126:

TATATAAAGC TTGCCGCCAC CATGGGCCAC ACACGGAGGC AG 42 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 127:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 45 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 127:

ACTCCACCAG CTTCACCTCG TTATCAGGAA AATGCTCTTG CTTGG 45 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 128:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 45 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina

207 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 128:

AGAGCATTTT CCTGATAACG AGGTGAAGCT GGTGGAGTCT GGAGG 45 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 129:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 40 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 129:

CCAGGCATCC CAGGGTCACC ATGGAGTTAG TTTGGGCÄGC 40 (2) INFORMÁCIA 0 SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 130:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 1446 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (ix) ZNAKY:

(A) MENO/OZNAČENIE: CDS (B) POZÍCIA: 16 ... 1435 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 130:

208

AAGCTTGCCG CCACC ATG GGC CAC ACA CGG AGG CAG GGA ACA TCA CCA TCC 51

Met Gly His Thr Arg Arg Gin Gly Thr Ser Pro Ser

1

5

10

AAG

TGT

CCA

TAC

CTC

AAT

TTC

TTT

CAG

CTC

TTG

GTG

CTG

GCT

GGT

CTT

99

Lys

Cys

Pro

Tyr

Leu

Asn

Phe

Gin

Leu

Val

Leu

Ala

Gly

Leu

15

20

25

TCT

CAC

TTC

TGT

TCA

GGT

GTT

ATC

CAC

GTG

ACC

AAG

GAA

GTG

AAA

GAA

147

Ser

His

Phe

Cys

Ser

Gly

Val

íle

His

Val

Thr

Lys

Glu

Val

Lys

Glu

30

35

40

GTG

GCA

ACG

CTG

TCC

TGT

GGT

CAC

AAT

GTT

TCT

GTT

GAA

GAG

CTG

GCA

195

Val

Ala

Thr

Leu

Ser

Cys

Gly

His

Asn

Val

Ser

Val

Glu

Leu

Ala

45

50

55

60

CAA

. ACT

CGC

ATC

TAC

TGG

CAA

. AAG

i GAG

AAG

AAA

. ATG

GTG

CTG

ACT

' ATG

243

Gin Thr Arg íle Tyr Trp Gin Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met

70 75

ATG TCT GGG GAC ATG AAT ATA TGG CCC GAG TAC AAG AAC CGG ACC ATC

291

Met

Ser Gly

Asp Met 80

Asn

íle Trp Pro Glu Tyr 85

Lys

Asn

Arg 90

Thr

íle

TTT

GAT

ATC

ACT

AAT

AAC

CTC

TCC

ATT

GTG

ATC

CTG

GCT

CTG

CGC

CCA

339

Phe

Asp

íle

Thr

Asn

Leu

Ser

íle

Val

íle

Leu

Ala

Leu

Arg

Pro

95

100

105

TCT

GAC

GAG

GGC

ACA

TAC

GAG

TGT

GTT

CTG

AAG

TAT

GAA

AAA

GAC

387

Ser

Asp

Glu

Gly

Thr

Tyr

Glu

Cys

Val

Leu

Lys

Tyr

Glu

Lys

Asp

110 115 120

GCT TTC AAG CGG GAA CAC CTG GCT GAA GTG ACG TTA TCA GTC AAA GCT 435

Ala Phe Lys Arg Glu His Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala

125

130

135

140

209

GAC

TTC

CCT

ACA

CCT

AGT

ATA

TCT

GAC

TTT

GAA

ATT

CCA ACT

TCT

AAT

483

Asp

Phe

Pro

Thr

Pro

Ser

íle

Ser

Asp

Phe

Glu

íle

Pro Thr

Ser

Asn

145

ISO

155

ATT

AGA

AGG

ATA

ATT

TGC

TCA

ACC

TCT

GGA

GGT

TTT

CCA

GAG

CCT

CAC

531

íle

Arg

íle

Iie

Cys

Ser

Thr

Ser

Gly

Phe

Pro

Glu

Pro

His

160

165

170

CTC

TCC

TGG

TTG

GAA

AAT

GGA

GAA

TTA

AAT

GCC

ATC AAC

ACA

Leu

Ser

Trp

Leu

Glu

Asn

Gly

Glu

Leu

Asn

Ala

íle Asn

Thr

175

180

185

GTT

TCC

CAA

GAT

CCT

GAA

ACT

GAG

CTC

TAT

GCT

GTT

AGC AGC

AAA

CTG

Val

Ser

Gin

Asp

Pro

Glu

Thr

Glu

Leu

Tyr

Ala

Val

Ser Ser

Lys

Leu

190

195

200

GAT

TTC

AAT

ATG

ACA

ACC

AAC

CAC

AGC

TTC

ATG

TGT

CTC ATC

AAG

TAT

Asp

Phe

Asn

Met

Thr

Asn

His

Ser

Phe

Met

Cys

Leu íle

Lys

Tyr

205

210

215

220

579

627

675

GGA Gly

CAT TTA AGA GTG AAT

CAG ACC TTC AAC TGG AAT ACA ACC AAG CAA

723

His Leu Arg

Val Asn 225

Gin Thr

Phe

Asn Trp 230

Asn

Thr

Lys Gin 235

GAG

CAT

TTT

CCT

GAT

AAC

GAG

GTG

AAG

CTG

GTG

GAG

TCT

GGA

GGC

771

Glu

His

Phe

Pro

Asp

Asn

Glu

Val

Lys

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly Gly

240

245

250

TTG Leu

GTA CAG CCT Val Gin Pro 255

GGG GGT TCT CTG AGA CTC TCC TGT GCA ACT TCT GGG

819

Gly

Ser

Leu Arg Leu Ser Cys Ala

Thr

Ser Gly

260

265

TTC

ACC

TTC

ACT

GAT

TAC

ATG

AAC

TGG

GTC

CGC

CAG

CCT

CCA

GGA

867

Phe

Thr

Phe

Thr

Asp

Tyr

Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gin

Pro

Gly

270

275

280

AAG

GCA

CTT

GAG

TGG

TTG

GGT

TTT

ATT

GGA

AAC

AAA

GCT

AAT

GGT

TAC

915

210

Lys Ala Leu Glu Trp Leu Gly Phe íle Gly Asn Lys Ala Asn Gly Tyr

285 290 295 300

ACA ACA GAG TAC AGT GCA TCT GTG AAG GGT CGG TTC ACC ATC TCC AGA 963

Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr íle Ser Arg

30S 310 315

GAC AAA TCC CAA AGC ATC CTC TAT CTT CAA ATG AAC ACC CTG AGA GCT 1011

Asp Lys Ser Gin Ser íle Leu Tyr Leu Gin Met Asn Thr Leu Arg Ala

320 325 330

GAG GAC AGT GCC ACT TAT TAC TGT ACA AGA GAT AGG GGG CTA CGG TTC 1059

Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Thr Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe

335 340 345

TAC TTT GAC TAC TGG GGC CAA GGC ACC ACT CTC ACA GTC TCC TCA GCC 1107

Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala

350 355 360

AAA ACG ACA CCC CCA TCT GTC TAT CCA CTG GCC CCT GGA TCT GCT GCC 1155

Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala

365 370 375 380

CAA ACT AAC TCC ATG GTG ACC CTG GGA TGC CTG GTC AAG GGC TAT TTC 1203

Gin Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe

385 390 395

CCT GAG CCA GTG ACA GTG ACC TGG AAC TCT GGA TCT CTG TCC AGC GGT 1251

Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly

400 405 410

GTG CAC ACC TTC CCA GCT GTC CTG CAG TCT GAC CTC TAC ACT CTG AGC 1299

Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser

415 420 425

AGC TCA GTG ACT GTC CCC TCC AGC ACC TGG CCC AGC GAG ACC GTC ACC 1347

Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr

430

435

440

211

TGC Cys 445

AAC Asn

GTT Val

GCC Ala

CAC His

CCG Pro 450

GCC Ala

AGC Ser

ACC Thr

AAG Lys 455

GTG Val

GAC Asp

AAG AAA Lys Lys

ATT íle 460

GTG

ccc

AGG

GAT

TGT

GGT

TGT

AAG

CCT

TGC

ATA

TGT

ACA

T AGTAAGAATT

Val

Pro

Arg

Asp

Cys

Gly

Cys

Lys

Pro

Cys

íle

Cys

Thr

465

470

C

(2) INFORMÁCIA

0

SEKVENCIÍ

SEQ ID NO:

131

95

1445

1446 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 473 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 131:

Met Gly His Thr Arg Arg Gin Gly Thr Ser Pro Ser Lys Cys Pro Tyr 1 5 10 15

Leu Asn Phe Phe Gin Leu Leu Val Leu Ala Gly Leu Ser His Phe Cys 20 25 30

Ser Gly Val íle His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu 35 40 45

Ser Cys Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gin Thr Arg íle 50 55 60

Tyr Trp Gin Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp ao

212

Met Asn íle Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr íle Phe Asp íle Thr 85 90 95

Asn Asn Leu Ser íle Val íle Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly 100 105 110

Thr Tyr Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg 115 120 125

Glu His Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr 130 135 140

Pro Ser

145 íle Ser Asp Phe Glu íle Pro Thr Ser Asn íle Arg Arg íle ISO 155 160 íle Cys Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu 165 170 175

Glu Asn Gly Glu Glu Leu Asn Ala

180 íle Asn Thr

Thr

Val

185

Ser Gin Asp

190

Pro Glu Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met 195 200 205

Thr Thr Asn His Ser Phe Met Cys Leu íle Lys Tyr Gly His Leu Arg 210 215 220

Val Asn Gin Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gin Glu His Phe Pro

225 230 235 240

Asp Asn Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro

24S 250 255

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr

260

265

270

213

Asp Tyr Tyr Met Asn Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly L.ys Ala Leu Glu 275 280 285

Trp Leu Gly Phe íle Gly Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr 290 295 300

Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr íle Ser Arg Asp Lys Ser Gin

305 310 315 320

Ser íle Leu Tyr Leu Gin Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala

325 330 335

Thr Tyr Tyr Cys Thr Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr 340 345 350

Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro

355 360 365

Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gin Thr Asn Ser 370 375 380

Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val

385 390 395 400

Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe

405 410 415

Pro Ala Val Leu Gin Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr 420 425 430

Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala 435 440 445

His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys íle Val Pro Arg Asp 450 455 460

Cys Gly Cys Lys Pro Cys íle Cys Thr

465

470

214

Claims

1. Protilátka anti-CEA (806.077 Ab), ktorá obsahuje úseky určujúce komplementaritu (úseky CDR) obsahujúce nasledujúce sekvencie:

a) ťažký reťazec

CDR1 DNYMH (sekvencie SEQ ID NO: 29)

CDR2 WIDPENGDTE YAPKFRG (sekvencia SEQ ID NO: 31)

CDR3 LIYAGYLAMD Y (sekvencia SEQ ID NO: 32)

b) ľahký reťazec

CDR1 SASSSVTYMH (sekvencia SEQ ID NO: 2 6)

CDR2 STSNLAS (sekvencia SEQ ID NO: 27)

CDR3 QQRSTYPLT (sekvencia SEQ ID NO: 28)

2. Protilátka podía nároku 1, kde úseky CDR 1 a 3 sú definované ako:

CDR1 FNIKDNYMH (sekvencia SEQ ID NO: 30) a

CDR3 HVLIYAGYLA MDY (sekvencia SEQ ID NO: 33)

3. Protilátka podía nároku 1, ktorá obsahuje nasledujúce, voliteľne humanizované štruktúry:

sekvenciu variabilného úseku ťažkého reťazca (sekvencia SEQ ID NO: 11):

EVQLQQSGAE LVRSGASVKL SCTASGFNIK DNYMHWVKQR 4 0 PEQGLEWIAW IDPENGDTEY APKFRGKATL TADSSSNTAY 80 LHLSSLTSED TAVYYCHVLI YAGYLAMDYW GQGTSVAVSS 120

215 a sekvenciu variabilného úseku ľahkého reťazca (sekvencia SEQ ID NO: 9):

4. Humanizovaná protilátka podľa nároku 3, ktorá obsahuje aspoň jednu z nasledujúcich sekvencií:

sekvenciu variabilného úseku ťažkého reťazca, ktorá je VH1 (sekvencia SEQ ID NO: 55) sekvenciu variabilného úseku ľahkého reťazca, ktorá je VK4 (sekvencia SEQ ID NO: 71) konštantný úsek CH1 ťažkého reťazca ľudského IgG3, úsek CL ľudského ľahkého reťazca kappa a kĺbový úsek ľudského IgG3, voliteľne vo forme fragmentu F(ab')₂.

5. Konjugát obsahujúci protilátku podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov 1 až 4 a efektorovú skupinu.

6. Konjugát podľa nároku 5, kde efektorová skupina je vybraná z ktoréhokoľvek z nasledujúcich súborov:

a) enzým vhodný na použitie v systéme ADEPT,

b) CPG2,

c) [G251T,D253K]HCPB,

d) [A248S,G251T,D253K]HCPB,

e) ko-stimulačná molekula

f) extracelulárna doména z B7

216

g) extracelulárna doména z ludskej B7.1 a

h) extracelulárna doména z ludskej B7.2, voliteľne vo forme fúzneho proteinu.

7. Konjugát podlá nároku 6, ktorý je fúzny proteín vybraný z ktoréhokoľvek konjugátu v nasledujúcom súbore (sekvencie sú uvedené v smere od N-konca k C-koncu):

a) humanizovaný 806.077 F(ab')₂ - {[A248S,G251T,D253K]HCPB}₂ obsahujúci:

protilátkový reťazec Fd' ID NO: 55)/konštantný úsek CH1 reťazec Fd' je fúzovaný [A248S,G251T,D253K]HCPB, so štruktúrou VH1 (sekvencia SEQ z IgG3/kíbový úsek z IgG3, pričom svojím C-koncom k N-koncu a lahký reťazec protilátky vzorca VK4 (sekvencia SEQ ID NO: 71)/úsek CL z lahkého reťazca kappa,

b) {[A248S,G251T,D253K]HCPB}₂ - humanizovaný 806.077 F(ab')₂obsahujúci:

[A248S,G251T,D253K]HCPB, pričom HCPB je fúzovaná svojím C-koncom prostredníctvom spojkylinkera (GGGS)₃ k N-koncu protilátkového reťazca Fd' štruktúry VH1 (sekvencia SEQ ID NO: 55)/konštantný úsek CHl z IgG3/kíbový úsek z IgG3, a lahký reťazec protilátky vzorca VK4 (sekvencia SEQ ID NO: 71)/úsek CL z lahkého reťazca kappa, a

c) (ludská B7.1 extracelulárna doména)₂ - humanizovaný 806.077 F(ab')₂ obsahujúci:

ľudskú extracelulárnu doménu B7.1, pričom B7.1 je fúzovaná svojím C-koncom k N-koncu protilátkového reťazca štruktúry VH1 (sekvencia SEQ ID NO: 55)/konštantný úsek CHl z IgG3/kíbový úsek z IgG3,

217 a ľahký reťazec protilátky vzorca VK4 (sekvencia SEQ ID NO: 71)/úsek CL z ľahkého reťazca kappa.

8. Polynukleotidová sekvencia, ktorá je schopná kódovať polypeptid protilátky alebo konjugátu podľcL ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov 1 až 7.

Vektor, ktorý obsahuje polynukleotid podľa nároku 8.

10. Hostiteľská bunka sekvenciou podľa nároku človeka alebo transgénna bunky.

transformovaná polynukleotidovou 8, alebo transgénny živočích okrem rastlina pochádzajúca z hostiteľskej

11. Hybridom 806.077 uložený v ECACC pod č. 96022936.

12. Farmaceutický prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje konjugát podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov v spojení s farmakologicky prijateľným riedidlom alebo nosičom, voliteľne vo forme vhodnej na intravenózne podávanie.

13. Konjugát podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov na použitie ako liek.

14. Spôsob prípravy protilátky alebo konjugátu podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačuj ú c i sa t ý m, že sa

a) hostiteľská bunka, transgénny cicavec okrem človeka alebo transgénna rastlina podľa nároku 10 alebo hybridom podľa nároku

218

11 vystaví takým podmienkam, ktoré vedú k expresii, a voliteľne aj sekrécii protilátky alebo konjugátu, a voliteľne

b) protilátka alebo konjugát sa čiastočne purifikujú.

15. Spôsob liečenia človeka alebo zvieraťa, ktorí takúto liečbu potrebujú, vyznačujúci sa tým, že sa človeku alebo zvieraťu podá farmaceutický účinné množstvo konjugátu podľa ktoréhokolvek z predchádzajúcich nárokov.