SK137299A3 - Expression of fungicide-binding polypeptides in plants for producing fungicide tolerance - Google Patents
Expression of fungicide-binding polypeptides in plants for producing fungicide tolerance Download PDFInfo
- Publication number
- SK137299A3 SK137299A3 SK1372-99A SK137299A SK137299A3 SK 137299 A3 SK137299 A3 SK 137299A3 SK 137299 A SK137299 A SK 137299A SK 137299 A3 SK137299 A3 SK 137299A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- bas
- plant
- gene
- tolyloxy
- scfv
- Prior art date
Links
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 76
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 68
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims description 60
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims description 59
- 230000027455 binding Effects 0.000 title claims description 56
- 239000000417 fungicide Substances 0.000 title description 64
- 230000000855 fungicidal effect Effects 0.000 title description 51
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 146
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 83
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 34
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 28
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 claims description 27
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 claims description 27
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 27
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 24
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 23
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 23
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 23
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 23
- -1 o-tolyloxy Chemical group 0.000 claims description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 18
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 17
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 16
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 13
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 claims description 12
- 238000010586 diagram Methods 0.000 claims description 10
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims description 10
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 8
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 8
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 7
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 claims description 6
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 claims description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 claims description 5
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 5
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 claims description 4
- 244000038559 crop plants Species 0.000 claims description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 claims description 4
- 238000002823 phage display Methods 0.000 claims description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 2
- 230000003032 phytopathogenic effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 claims description 2
- HVHVOXOBZKQWGG-UHFFFAOYSA-N CON=CC1=CC=CC=C1C(C(=O)OC)OC1=CC=CC=C1C Chemical compound CON=CC1=CC=CC=C1C(C(=O)OC)OC1=CC=CC=C1C HVHVOXOBZKQWGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims 3
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 claims 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 claims 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 claims 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 claims 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 claims 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 27
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 20
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 17
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 15
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 15
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 14
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 13
- 230000000885 phytotoxic effect Effects 0.000 description 13
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 12
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 12
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 9
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 9
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 8
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 7
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 7
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 7
- JLIDBLDQVAYHNE-YKALOCIXSA-N (+)-Abscisic acid Chemical compound OC(=O)/C=C(/C)\C=C\[C@@]1(O)C(C)=CC(=O)CC1(C)C JLIDBLDQVAYHNE-YKALOCIXSA-N 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 6
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 240000007049 Juglans regia Species 0.000 description 5
- 235000009496 Juglans regia Nutrition 0.000 description 5
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 5
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 5
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N Acetamide Chemical compound CC(N)=O DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101000972350 Bombyx mori Lebocin-4 Proteins 0.000 description 4
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 3
- AZZMGZXNTDTSME-JUZDKLSSSA-M cefotaxime sodium Chemical compound [Na+].N([C@@H]1C(N2C(=C(COC(C)=O)CS[C@@H]21)C([O-])=O)=O)C(=O)\C(=N/OC)C1=CSC(N)=N1 AZZMGZXNTDTSME-JUZDKLSSSA-M 0.000 description 3
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- FCRACOPGPMPSHN-UHFFFAOYSA-N desoxyabscisic acid Natural products OC(=O)C=C(C)C=CC1C(C)=CC(=O)CC1(C)C FCRACOPGPMPSHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 235000020234 walnut Nutrition 0.000 description 3
- QMNUDYFKZYBWQX-UHFFFAOYSA-N 1H-quinazolin-4-one Chemical compound C1=CC=C2C(=O)N=CNC2=C1 QMNUDYFKZYBWQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 235000006667 Aleurites moluccana Nutrition 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 description 2
- 241000167854 Bourreria succulenta Species 0.000 description 2
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 description 2
- 235000009025 Carya illinoensis Nutrition 0.000 description 2
- 244000068645 Carya illinoensis Species 0.000 description 2
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 2
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 2
- 244000299507 Gossypium hirsutum Species 0.000 description 2
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 2
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 description 2
- 101150000102 LEB4 gene Proteins 0.000 description 2
- 240000008415 Lactuca sativa Species 0.000 description 2
- 235000003228 Lactuca sativa Nutrition 0.000 description 2
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 2
- 235000011430 Malus pumila Nutrition 0.000 description 2
- 244000070406 Malus silvestris Species 0.000 description 2
- 235000015103 Malus silvestris Nutrition 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N N-benzyladenine Chemical compound N=1C=NC=2NC=NC=2C=1NCC1=CC=CC=C1 NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 244000088401 Pyrus pyrifolia Species 0.000 description 2
- 235000011400 Pyrus pyrifolia Nutrition 0.000 description 2
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 description 2
- 102000014701 Transketolase Human genes 0.000 description 2
- 108010043652 Transketolase Proteins 0.000 description 2
- 241000219793 Trifolium Species 0.000 description 2
- 240000006677 Vicia faba Species 0.000 description 2
- 235000010749 Vicia faba Nutrition 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 241000219095 Vitis Species 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 235000019693 cherries Nutrition 0.000 description 2
- 125000000068 chlorophenyl group Chemical group 0.000 description 2
- 229940088530 claforan Drugs 0.000 description 2
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- JHIVVAPYMSGYDF-UHFFFAOYSA-N cyclohexanone Chemical compound O=C1CCCCC1 JHIVVAPYMSGYDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 2
- 238000011066 ex-situ storage Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 2
- 239000006870 ms-medium Substances 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 125000003854 p-chlorophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(*)=C([H])C([H])=C1Cl 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 231100000208 phytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 239000003375 plant hormone Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 210000003660 reticulum Anatomy 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000010153 self-pollination Effects 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 2
- HNVIQLPOGUDBSU-OLQVQODUSA-N (2s,6r)-2,6-dimethylmorpholine Chemical compound C[C@H]1CNC[C@@H](C)O1 HNVIQLPOGUDBSU-OLQVQODUSA-N 0.000 description 1
- TUBQDCKAWGHZPF-UHFFFAOYSA-N 1,3-benzothiazol-2-ylsulfanylmethyl thiocyanate Chemical compound C1=CC=C2SC(SCSC#N)=NC2=C1 TUBQDCKAWGHZPF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WURBVZBTWMNKQT-UHFFFAOYSA-N 1-(4-chlorophenoxy)-3,3-dimethyl-1-(1,2,4-triazol-1-yl)butan-2-one Chemical compound C1=NC=NN1C(C(=O)C(C)(C)C)OC1=CC=C(Cl)C=C1 WURBVZBTWMNKQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PXMNMQRDXWABCY-UHFFFAOYSA-N 1-(4-chlorophenyl)-4,4-dimethyl-3-(1H-1,2,4-triazol-1-ylmethyl)pentan-3-ol Chemical compound C1=NC=NN1CC(O)(C(C)(C)C)CCC1=CC=C(Cl)C=C1 PXMNMQRDXWABCY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WKBPZYKAUNRMKP-UHFFFAOYSA-N 1-[2-(2,4-dichlorophenyl)pentyl]1,2,4-triazole Chemical compound C=1C=C(Cl)C=C(Cl)C=1C(CCC)CN1C=NC=N1 WKBPZYKAUNRMKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DPGXTUOZQHBZRC-UHFFFAOYSA-N 1-[2-[2-(2,4-dichlorophenyl)-4-ethyl-1,3-dioxolan-2-yl]ethyl]-1,2,4-triazole Chemical compound O1C(CC)COC1(C=1C(=CC(Cl)=CC=1)Cl)CCN1N=CN=C1 DPGXTUOZQHBZRC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBGKAFRWBNEYTR-UHFFFAOYSA-N 1-[2-[2-(2,4-dichlorophenyl)-4-propyl-1,3-dioxolan-2-yl]ethyl]-1,2,4-triazole Chemical compound O1C(CCC)COC1(C=1C(=CC(Cl)=CC=1)Cl)CCN1N=CN=C1 FBGKAFRWBNEYTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MGNFYQILYYYUBS-UHFFFAOYSA-N 1-[3-(4-tert-butylphenyl)-2-methylpropyl]piperidine Chemical compound C=1C=C(C(C)(C)C)C=CC=1CC(C)CN1CCCCC1 MGNFYQILYYYUBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MNJNIEKPRUQZFY-UHFFFAOYSA-N 1-[[2-[1-chloro-4-(4-chlorophenoxy)cyclohexa-2,4-dien-1-yl]-4-methyl-1,3-dioxolan-2-yl]methyl]-1,2,4-triazole Chemical compound O1C(C)COC1(C1(Cl)C=CC(OC=2C=CC(Cl)=CC=2)=CC1)CN1N=CN=C1 MNJNIEKPRUQZFY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YIKWKLYQRFRGPM-UHFFFAOYSA-N 1-dodecylguanidine acetate Chemical compound CC(O)=O.CCCCCCCCCCCCN=C(N)N YIKWKLYQRFRGPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 1-naphthaleneacetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CC=CC2=C1 PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZMYFCFLJBGAQRS-UHFFFAOYSA-N 1-{[3-(2-chlorophenyl)-2-(4-fluorophenyl)oxiran-2-yl]methyl}-1H-1,2,4-triazole Chemical compound C1=CC(F)=CC=C1C1(CN2N=CN=C2)C(C=2C(=CC=CC=2)Cl)O1 ZMYFCFLJBGAQRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PCYWMDGJYQAMCR-UHFFFAOYSA-N 1h-pyrrole-3-carbonitrile Chemical compound N#CC=1C=CNC=1 PCYWMDGJYQAMCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004201 2,4-dichlorophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(*)=C(Cl)C([H])=C1Cl 0.000 description 1
- XEPBBUCQCXXTGR-UHFFFAOYSA-N 2,5-dimethyl-n-phenylfuran-3-carboxamide Chemical compound O1C(C)=CC(C(=O)NC=2C=CC=CC=2)=C1C XEPBBUCQCXXTGR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YTOPFCCWCSOHFV-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethyl-4-tridecylmorpholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCN1CC(C)OC(C)C1 YTOPFCCWCSOHFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UFNOUKDBUJZYDE-UHFFFAOYSA-N 2-(4-chlorophenyl)-3-cyclopropyl-1-(1H-1,2,4-triazol-1-yl)butan-2-ol Chemical compound C1=NC=NN1CC(O)(C=1C=CC(Cl)=CC=1)C(C)C1CC1 UFNOUKDBUJZYDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-[hydroxy(methyl)phosphoryl]butanoic acid Chemical compound CP(O)(=O)CCC(N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IRTLROCMFSDSNF-UHFFFAOYSA-N 2-phenyl-1h-pyrrole Chemical class C1=CNC(C=2C=CC=CC=2)=C1 IRTLROCMFSDSNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZRDUSMYWDRPZRM-UHFFFAOYSA-N 2-sec-butyl-4,6-dinitrophenyl 3-methylbut-2-enoate Chemical compound CCC(C)C1=CC([N+]([O-])=O)=CC([N+]([O-])=O)=C1OC(=O)C=C(C)C ZRDUSMYWDRPZRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710099475 3'-phosphoadenosine 5'-phosphate phosphatase Proteins 0.000 description 1
- MUVPTYCYFMJMFU-UHFFFAOYSA-N 3-(1h-imidazol-2-yl)-1-propyl-1-[2-(2,4,6-trichlorophenoxy)ethyl]urea Chemical compound N=1C=CNC=1NC(=O)N(CCC)CCOC1=C(Cl)C=C(Cl)C=C1Cl MUVPTYCYFMJMFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KTCKIOYQNQQFLX-UHFFFAOYSA-N 3-chloro-1-[3-chloro-2,6-dinitro-4-(trifluoromethyl)phenyl]-5-(trifluoromethyl)-2h-pyridin-2-amine Chemical compound C1=C(C(F)(F)F)C=C(Cl)C(N)N1C1=C([N+]([O-])=O)C=C(C(F)(F)F)C(Cl)=C1[N+]([O-])=O KTCKIOYQNQQFLX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OOTHTARUZHONSW-UHFFFAOYSA-N 4-[(2-chlorophenyl)hydrazinylidene]-3-methyl-1,2-oxazol-5-one Chemical compound CC1=NOC(=O)C1=NNC1=CC=CC=C1Cl OOTHTARUZHONSW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JGSMMBCVBWNILQ-UHFFFAOYSA-N 5-ethoxy-3-(trichloromethyl)-2h-thiadiazole Chemical compound CCOC1=CN(C(Cl)(Cl)Cl)NS1 JGSMMBCVBWNILQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005725 8-Hydroxyquinoline Substances 0.000 description 1
- 241001605719 Appias drusilla Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- KHBQMWCZKVMBLN-UHFFFAOYSA-N Benzenesulfonamide Chemical compound NS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 KHBQMWCZKVMBLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014698 Brassica juncea var multisecta Nutrition 0.000 description 1
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 1
- 240000000385 Brassica napus var. napus Species 0.000 description 1
- 235000006618 Brassica rapa subsp oleifera Nutrition 0.000 description 1
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 1
- WGEPWLDJPGTBSB-UHFFFAOYSA-N CN(C)P(=O)C1=NC(=NN1)C1=CC=CC=C1 Chemical compound CN(C)P(=O)C1=NC(=NN1)C1=CC=CC=C1 WGEPWLDJPGTBSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- REEFSLKDEDEWAO-UHFFFAOYSA-N Chloraniformethan Chemical compound ClC1=CC=C(NC(NC=O)C(Cl)(Cl)Cl)C=C1Cl REEFSLKDEDEWAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JTSDRYQMCVFPSS-UHFFFAOYSA-N ClC1=C(C=CC=C1)C(CC=1C=NC=NC1)(O)C1=CC=C(C=C1)Cl Chemical compound ClC1=C(C=CC=C1)C(CC=1C=NC=NC1)(O)C1=CC=C(C=C1)Cl JTSDRYQMCVFPSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 108010066133 D-octopine dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- HDWLUGYOLUHEMN-UHFFFAOYSA-N Dinobuton Chemical compound CCC(C)C1=CC([N+]([O-])=O)=CC([N+]([O-])=O)=C1OC(=O)OC(C)C HDWLUGYOLUHEMN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- 108010074122 Ferredoxins Proteins 0.000 description 1
- 101710196411 Fructose-1,6-bisphosphatase Proteins 0.000 description 1
- 101710186733 Fructose-1,6-bisphosphatase, chloroplastic Proteins 0.000 description 1
- 101710109119 Fructose-1,6-bisphosphatase, cytosolic Proteins 0.000 description 1
- 101710198902 Fructose-1,6-bisphosphate aldolase/phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 101000609762 Gallus gallus Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000005561 Glufosinate Substances 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DYMNZCGFRHLNMT-UHFFFAOYSA-N Glyodin Chemical compound CC(O)=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC1=NCCN1 DYMNZCGFRHLNMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- QJPWUUJVYOJNMH-VKHMYHEASA-N L-homoserine lactone Chemical compound N[C@H]1CCOC1=O QJPWUUJVYOJNMH-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000004431 Linum usitatissimum Nutrition 0.000 description 1
- 240000006240 Linum usitatissimum Species 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- MZNCVTCEYXDDIS-UHFFFAOYSA-N Mebenil Chemical compound CC1=CC=CC=C1C(=O)NC1=CC=CC=C1 MZNCVTCEYXDDIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- VJAWBEFMCIINFU-UHFFFAOYSA-N Nitrothal-isopropyl Chemical compound CC(C)OC(=O)C1=CC(C(=O)OC(C)C)=CC([N+]([O-])=O)=C1 VJAWBEFMCIINFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- CBENFWSGALASAD-UHFFFAOYSA-N Ozone Chemical compound [O-][O+]=O CBENFWSGALASAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150101414 PRP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000237988 Patellidae Species 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 1
- YPCALTGLHFLNGA-UHFFFAOYSA-N Pyracarbolid Chemical compound C1CCOC(C)=C1C(=O)NC1=CC=CC=C1 YPCALTGLHFLNGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 101100368710 Rattus norvegicus Tacstd2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100342406 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) PRS1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229930182692 Strobilurin Natural products 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DHKHKXVYLBGOIT-UHFFFAOYSA-N acetaldehyde Diethyl Acetal Natural products CCOC(C)OCC DHKHKXVYLBGOIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940121373 acetyl-coa carboxylase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- IMHBYKMAHXWHRP-UHFFFAOYSA-N anilazine Chemical compound ClC1=CC=CC=C1NC1=NC(Cl)=NC(Cl)=N1 IMHBYKMAHXWHRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000008059 anilinopyrimidines Chemical class 0.000 description 1
- 235000021120 animal protein Nutrition 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- IWLXWEWGQZEKGZ-UHFFFAOYSA-N azane;zinc Chemical compound N.[Zn] IWLXWEWGQZEKGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003851 azoles Chemical class 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- LJOZMWRYMKECFF-UHFFFAOYSA-N benodanil Chemical compound IC1=CC=CC=C1C(=O)NC1=CC=CC=C1 LJOZMWRYMKECFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RIOXQFHNBCKOKP-UHFFFAOYSA-N benomyl Chemical compound C1=CC=C2N(C(=O)NCCCC)C(NC(=O)OC)=NC2=C1 RIOXQFHNBCKOKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PINYKEPRXJGGMY-UHFFFAOYSA-N bis(2-chlorophenyl)-pyridin-3-ylmethanol Chemical compound ClC1=C(C=CC=C1)C(O)(C=1C=NC=CC1)C1=C(C=CC=C1)Cl PINYKEPRXJGGMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- KVNRLNFWIYMESJ-UHFFFAOYSA-N butyronitrile Chemical compound CCCC#N KVNRLNFWIYMESJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- CSNJTIWCTNEOSW-UHFFFAOYSA-N carbamothioylsulfanyl carbamodithioate Chemical compound NC(=S)SSC(N)=S CSNJTIWCTNEOSW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TWFZGCMQGLPBSX-UHFFFAOYSA-N carbendazim Chemical compound C1=CC=C2NC(NC(=O)OC)=NC2=C1 TWFZGCMQGLPBSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 229960002727 cefotaxime sodium Drugs 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000000306 component Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 150000001879 copper Chemical class 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009402 cross-breeding Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- HAORKNGNJCEJBX-UHFFFAOYSA-N cyprodinil Chemical compound N=1C(C)=CC(C2CC2)=NC=1NC1=CC=CC=C1 HAORKNGNJCEJBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- CJHXCRMKMMBYJQ-UHFFFAOYSA-N dimethirimol Chemical compound CCCCC1=C(C)NC(N(C)C)=NC1=O CJHXCRMKMMBYJQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QNBTYORWCCMPQP-UHFFFAOYSA-N dimethomorph Chemical compound C1=C(OC)C(OC)=CC=C1C(C=1C=CC(Cl)=CC=1)=CC(=O)N1CCOCC1 QNBTYORWCCMPQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012990 dithiocarbamate Substances 0.000 description 1
- 150000004659 dithiocarbamates Chemical class 0.000 description 1
- QNDQILQPPKQROV-UHFFFAOYSA-N dizinc Chemical compound [Zn]=[Zn] QNDQILQPPKQROV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JMXKCYUTURMERF-UHFFFAOYSA-N dodemorph Chemical compound C1C(C)OC(C)CN1C1CCCCCCCCCCC1 JMXKCYUTURMERF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000006260 ethylaminocarbonyl group Chemical group [H]N(C(*)=O)C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- JFSPBVWPKOEZCB-UHFFFAOYSA-N fenfuram Chemical compound O1C=CC(C(=O)NC=2C=CC=CC=2)=C1C JFSPBVWPKOEZCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHDGWKAJBYRJJL-UHFFFAOYSA-K ferbam Chemical compound [Fe+3].CN(C)C([S-])=S.CN(C)C([S-])=S.CN(C)C([S-])=S WHDGWKAJBYRJJL-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- FQKUGOMFVDPBIZ-UHFFFAOYSA-N flusilazole Chemical compound C=1C=C(F)C=CC=1[Si](C=1C=CC(F)=CC=1)(C)CN1C=NC=N1 FQKUGOMFVDPBIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- UYJUZNLFJAWNEZ-UHFFFAOYSA-N fuberidazole Chemical compound C1=COC(C=2NC3=CC=CC=C3N=2)=C1 UYJUZNLFJAWNEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- CKAPSXZOOQJIBF-UHFFFAOYSA-N hexachlorobenzene Chemical compound ClC1=C(Cl)C(Cl)=C(Cl)C(Cl)=C1Cl CKAPSXZOOQJIBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QNVRIHYSUZMSGM-UHFFFAOYSA-N hexan-2-ol Chemical compound CCCCC(C)O QNVRIHYSUZMSGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AILKHAQXUAOOFU-UHFFFAOYSA-N hexanenitrile Chemical compound CCCCCC#N AILKHAQXUAOOFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Substances C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001841 imino group Chemical group [H]N=* 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- ONUFESLQCSAYKA-UHFFFAOYSA-N iprodione Chemical compound O=C1N(C(=O)NC(C)C)CC(=O)N1C1=CC(Cl)=CC(Cl)=C1 ONUFESLQCSAYKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- DWKPPFQULDPWHX-VKHMYHEASA-N l-alanyl ester Chemical compound COC(=O)[C@H](C)N DWKPPFQULDPWHX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 235000005772 leucine Nutrition 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 1
- YKSNLCVSTHTHJA-UHFFFAOYSA-L maneb Chemical compound [Mn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S YKSNLCVSTHTHJA-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);methyl n-[[2-(methoxycarbonylcarbamothioylamino)phenyl]carbamothioyl]carbamate;n-[2-(sulfidocarbothioylamino)ethyl]carbamodithioate Chemical compound [Mn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.COC(=O)NC(=S)NC1=CC=CC=C1NC(=S)NC(=O)OC WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- CIFWZNRJIBNXRE-UHFFFAOYSA-N mepanipyrim Chemical compound CC#CC1=CC(C)=NC(NC=2C=CC=CC=2)=N1 CIFWZNRJIBNXRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- ZWJNEYVWPYIKMB-UHFFFAOYSA-N methfuroxam Chemical compound CC1=C(C)OC(C)=C1C(=O)NC1=CC=CC=C1 ZWJNEYVWPYIKMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CIEXPHRYOLIQQD-UHFFFAOYSA-N methyl N-(2,6-dimethylphenyl)-N-2-furoylalaninate Chemical compound CC=1C=CC=C(C)C=1N(C(C)C(=O)OC)C(=O)C1=CC=CO1 CIEXPHRYOLIQQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 1
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 1
- AXJDDGOHBYMCAJ-UHFFFAOYSA-N n-(3,4-dimethoxyphenyl)benzamide Chemical compound C1=C(OC)C(OC)=CC=C1NC(=O)C1=CC=CC=C1 AXJDDGOHBYMCAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OYRIKLVYHTWHCZ-UHFFFAOYSA-N n-cyclohexyl-2,5-dimethylfuran-3-carboxamide Chemical compound O1C(C)=CC(C(=O)NC2CCCCC2)=C1C OYRIKLVYHTWHCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002828 nitro derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000014571 nuts Nutrition 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- AMEKQAFGQBKLKX-UHFFFAOYSA-N oxycarboxin Chemical compound O=S1(=O)CCOC(C)=C1C(=O)NC1=CC=CC=C1 AMEKQAFGQBKLKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003540 oxyquinoline Drugs 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003800 pharynx Anatomy 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 230000029553 photosynthesis Effects 0.000 description 1
- 238000010672 photosynthesis Methods 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 239000004069 plant analysis Substances 0.000 description 1
- 238000003976 plant breeding Methods 0.000 description 1
- 230000008654 plant damage Effects 0.000 description 1
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 1
- 235000021118 plant-derived protein Nutrition 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- ZLIBICFPKPWGIZ-UHFFFAOYSA-N pyrimethanil Chemical compound CC1=CC(C)=NC(NC=2C=CC=CC=2)=N1 ZLIBICFPKPWGIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MCJGNVYPOGVAJF-UHFFFAOYSA-N quinolin-8-ol Chemical compound C1=CN=C2C(O)=CC=CC2=C1 MCJGNVYPOGVAJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 239000012713 reactive precursor Substances 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000033764 rhythmic process Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000008117 seed development Effects 0.000 description 1
- 230000007226 seed germination Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- QYOJSKGCWNAKGW-HCWXCVPCSA-N shikimate-3-phosphate Chemical compound O[C@H]1CC(C(O)=O)=C[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H]1O QYOJSKGCWNAKGW-HCWXCVPCSA-N 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- PUYXTUJWRLOUCW-UHFFFAOYSA-N spiroxamine Chemical compound O1C(CN(CC)CCC)COC11CCC(C(C)(C)C)CC1 PUYXTUJWRLOUCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 230000004960 subcellular localization Effects 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 125000003718 tetrahydrofuranyl group Chemical group 0.000 description 1
- WJCNZQLZVWNLKY-UHFFFAOYSA-N thiabendazole Chemical compound S1C=NC(C=2NC3=CC=CC=C3N=2)=C1 WJCNZQLZVWNLKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YFNCATAIYKQPOO-UHFFFAOYSA-N thiophanate Chemical compound CCOC(=O)NC(=S)NC1=CC=CC=C1NC(=S)NC(=O)OCC YFNCATAIYKQPOO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QGHREAKMXXNCOA-UHFFFAOYSA-N thiophanate-methyl Chemical compound COC(=O)NC(=S)NC1=CC=CC=C1NC(=S)NC(=O)OC QGHREAKMXXNCOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KUAZQDVKQLNFPE-UHFFFAOYSA-N thiram Chemical class CN(C)C(=S)SSC(=S)N(C)C KUAZQDVKQLNFPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012090 tissue culture technique Methods 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- BAZVSMNPJJMILC-UHFFFAOYSA-N triadimenol Chemical compound C1=NC=NN1C(C(O)C(C)(C)C)OC1=CC=C(Cl)C=C1 BAZVSMNPJJMILC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ABDKAPXRBAPSQN-UHFFFAOYSA-N veratrole Chemical compound COC1=CC=CC=C1OC ABDKAPXRBAPSQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- AMHNZOICSMBGDH-UHFFFAOYSA-L zineb Chemical compound [Zn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S AMHNZOICSMBGDH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- DUBNHZYBDBBJHD-UHFFFAOYSA-L ziram Chemical compound [Zn+2].CN(C)C([S-])=S.CN(C)C([S-])=S DUBNHZYBDBBJHD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8209—Selection, visualisation of transformants, reporter constructs, e.g. antibiotic resistance markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
- C12N15/8258—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon for the production of oral vaccines (antigens) or immunoglobulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Expresia polypeptidov viažucich fungicídy v rastlinách s cieľom dosiahnuť toleranciu voči fungicídom
Oblasť techniky
Predložený vynález sa týka postupu na produkciu rastlín tolerantných voči fungicídom expresiou exogénneho polypeptidu viažuceho fungicíd v rastlinách alebo rastlinných orgánoch. Vynález sa ďalej týka použitia príslušných nukleových kyselín, ktoré kódujú polypeptid, protilátku alebo časti protilátky s vlastnosťami viazania fungicídu v transgénnych rastlinách a samotnej takto transformovanej rastliny.
Doterajší stav techniky
Je známe, že metódy genetického inžinierstva umožňujú špecifický transfer cudzích génov do genómu rastliny. Tento proces sa nazýva transformácia a výsledné rastliny transgénne rastliny. Transgénne rastliny sa dnes používajú v rôznych oblastiach biotechnológie. Príkladmi sú rastliny odolné voči hmyzu (Vaek a kol. Plánt Celí 5 (1987), 159-169), rastliny odolné voči vírusom (Powell a kol. Science 232 (1986), 738-743) a rastliny odolné voči ozónu (Van Camp a kol. BioTech. 12 (1994), 165-168). Príkladmi zlepšených kvalitatívnych charakteristík dosiahnutých genetickým inžinierstvom sú: zlepšená trvanlivosť ovocia (Oeller a kol. Science 254 (1991), 437-439), zvýšená produkcia škrobu v zemiakových hľuzách (Stark a kol. Science 242 (1992), 419), zmeny v zložení škrobu (Visser a kol. Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 289-296) a lipidov (Voelker a kol. Science 257 (1992), 72-74) a produkcia cudzích polymérov (Poirer a kol. Science 256 (1992), 520-523).
Dôležitým cieľom práce uskutočňovanej v oblasti rastlinnej molekulovej genetiky je generovanie tolerancie voči herbicídom. Tolerancia voči herbicídom je charakterizovaná zlepšenou kompatibilitou (čo sa týka typu alebo úrovne) rastliny alebo rastlinných orgánov s aplikovaným herbicídom. Toto možno dosiahnuť rôznymi spôsobmi. Známymi metódami je využitie metabolického génu, napríklad patového génu, v spojení s glufosinátovou rezistenciou (WO 8705629) alebo cieľového enzýmu, ktorý je rezistentný voči herbicídu, ako napríklad v prípade enolpyruvyl šikimát-3-fosfát syntézy (WO 9204449), ktorá je rezistentná voči glyfosátu, a použitie herbicídu v bunkovej a pletivovej kultúre na výber tolerantných rastlinných buniek a výsledných rezistentných rastlín, ako je opísané v prípade inhibítorov acetyl-CoA-karboxylázy (US 5162602, US 5290696).
Protilátky sú proteíny, zložky imunitného systému. Spoločnou vlastnosťou všetkých protilátok je ich priestorová guľová štruktúra, konštrukcia ľahkého a ťažkého reťazca a ich základná schopnosť viazať molekuly alebo časti molekulovej štruktúry s vysokou špecifickosťou (Alberts a kol., in: Molekularbiologie derZelle [molekulárna biológia bunky], 2. vydanie 1990, VCH Verlag, ISBN 3-52727983-0, 1198-1237). Na základe týchto vlastností sa protilátky používajú na niekoľko účelov. Použitie možno rozdeliť na použitie protilátok v zvieracích a ľudských organizmoch, v ktorých sa produkujú, teda takzvané in situ aplikácie, a ex situ aplikácie, t.j. využitie protilátok po ich izolácii z produkujúcich buniek alebo organizmov (Whitelam und Cockburn, TIPS zv. 1, 8 (1996), 268-272).
Použitie somatických hybridných bunkových línií (hybridómov) ako zdroja protilátok proti veľmi špecifickými antigénom je založené na práci Kôhlera a Milsteina (Náture 256 (1975) 495-97). Tento postup umožňuje produkciu takzvaných monoklonálnych protilátok, ktoré majú jednotnú štruktúru a ktoré sa vyrábajú pomocou fúzie buniek. Slezinové bunky imunizovanej myši sa fúzujú s myelómovými bunkami myši. Takto sa získajú hybridómové bunky, ktoré sa rozmnožujú bez obmedzenia. Bunky súčasne vylučujú špecifické protilátky proti antigénu, ktorým bola myš imunizovaná. Slezinové bunky poskytujú schopnosť produkcie protilátky, zatiaľ čo myelómové bunky prispievajú schopnosťou neobmedzeného rastu a sústavného vylučovania protilátok. Keďže každá hybridómová bunka, súc klonom, je odvodená z jedinej B bunky, všetky vyprodukované molekuly protilátky majú rovnakú štruktúru vrátane miesta viazania antigénu. Táto metóda výrazne podporila použitie protilátok, pretože protilátky, ktoré majú jedinú a známu špecifickosť a homogénnu štruktúru, sú teraz dostupné v neobmedzených množstvách. Monoklonálne protilátky majú rozsiahle použitie v imunodiagnostike a ako terapeutiká.
V nedávnych rokoch sa získala takzvaná metóda bakteriofágového displeja na produkciu protilátok a tá sa vyhýba imunitnému systému a rôznym imunizáciám u zvieraťa. Afinita a špecifickosť protilátky sa dajú merať in vitro (Winter a kol., Ann. Rev. Immunol. 12 (1994), 433-455; Hoogenboom TIBTech zv. 15 (1997), 62 -70). Génové segmenty, ktoré obsahujú sekvenciu, ktorá kóduje variabilnú oblasť protilátok, t.j. miesto viazania antigénu, sa fúzujú s génmi pre obalový proteín bakteriofágu. Potom sa fágmi, ktoré obsahujú také fúzne gény, infikujú baktérie. Získané fágové častice sú teraz vybavené obalmi obsahujúcimi fúzny proteín podobný protilátke, pričom doména viazania protilátky smeruje von. Takú fágovú displejovú knižnicu možno teraz použiť na izoláciu fágu, ktorý obsahuje požadovaný fragment protilátky a ktorý sa viaže špecificky na istý antigén. Každý fág izolovaný takýmto spôsobom produkuje monoklonálny polypeptid viažuci antigén, ktorý zodpovedá monoklonálnej protilátke. Gény pre miesto viazania antigénu, ktoré sú jedinečné pre každý fág, možno izolovať z fágovej DNA a použiť na skonštruovanie kompletných protilátkových génov.
V oblasti ochrany plodín sa protilátky používali najmä ako analytické nástroje ex situ na kvalitatívnu a kvantitatívnu detekciu antigénov. Toto zahŕňa detekciu rastlinných zložiek, herbicídov alebo fungicídov v pitnej vode (Sharp a kol. (1991) ACS Symp Ser., 446 (Pestic. Residues Food Saf.) 87-95), vo vzorkách pôdy (WO 9423018) alebo v rastlinách alebo rastlinných orgánoch, a použitie protilátok ako pomocných látok na čistenie viazaných molekúl.
Produkciu imunoglobulínov v rastlinách prvýkrát opísal Hiatt a kol., Náture, 342 (1989), 76 - 78. Spektrum obsahuje jednoreťazcové protilátky až po multimérne sekrečné protilátky (J. Ma a Mich Hein, 1996, Annuals New York Academy of Sciences, 72 - 81).
Novšie pokusy využívajú protilátky in situ na obranu rastlín proti patogénom, najmä proti vírusovým chorobám, expresiou špecifických protilátok alebo ich častí v rastlinných bunkách, ktoré sú namierené proti proteínom vírusového obalu (Tavladoraki a kol., Náture 366 (1993), 469-472; Voss a kol., Mol. Breeding 1 (1995), 39-50).
Analogický prístup bol použitý aj na ochranu rastlín proti napadnutiu hlístami (Rosso a kol., Biochem Biophys Res Com, 220 (1996) 255-263). Existujú príklady aplikácie vo farmakológii, kde sa in situ expresia protilátok v rastlinách používa na orálnu imunizáciu (Ma a kol., Science 268 (1995), 716-719; Mason a Arntzen, Tibtech zv. 13 (1996), 388-392). Telu sa poskytujú protilátky vytvorené rastlinou a pochádzajúce z rastlín alebo rastlinných orgánov, ktoré sú vhodné na konzumáciu, cez ústnu dutinu, hrdlo alebo tráviaci trakt, ktoré protilátky spôsobujú účinnú imunitnú ochranu. Navyše sa už v rastlinách exprimovala jednoreťazcová protilátka proti nízkomolekulovému rastlinnému hormónu kyseline abscisovej a pozorovala znížená dostupnosť rastlinných hormónov v dôsledku viazania kyseliny abscisovej v rastline (Artsaenko a kol., The Plánt Journal (1995) 8 (5) 745-750).
Chemická kontrola húb u agronomický významných plodín vyžaduje použitie vysoko selektívnych fungicídov bez fytotoxických účinkov. Fytotoxický účinok fungicídov môže byť založený napríklad na inhibícií rastu rastliny, zníženej fotosyntéze a v dôsledku toho zníženej úrode. V niektorých prípadoch je však ťažké vyvinúť dostatočne selektívne fungicídy, ktoré možno použiť u všetkých dôležitých veľkoplošných plodín rastlín a ktoré nespôsobujú poškodenie rastliny, ktorá poskytuje úrodu akejkoľvek plodiny. Zavedenie hospodárskych rastlín rezistentných alebo tolerantných voči fungicídom môže prispieť k vyriešeniu tohto problému a môže otvoriť nové využitie fungicídov pri plodinách, kde doposiaľ ošetrenie nebolo možné, alebo bolo možné ale iba pri prijateľných stratách úrody.
Vývoj hospodárskych rastlín odolných voči fungicídom pletivovou kultúrou alebo semenovou mutagenézou a prírodnou selekciou je obmedzený. Na druhej strane fytotoxický účinok musí byť zistiteľný už na úrovni pletivovej kultúry a na druhej strane iba tie rastliny možno manipulovať technikami tkanivových kultúr, kde možno celé rastliny úspešne regenerovať z bunkových kultúr. Navyše po mutagenéze a selekcii môžu hospodárske rastliny vykazovať nežiaduce charakteristiky, ktoré treba znova odstraňovať v niektorých prípadoch opakovaným spätným krížením. Zavedenie rezistencie uskutočňovaním kríženia by bolo tiež obmedzené na rastliny toho istého druhu.
Z vyššie uvedených dôvodov je prístup genetického inžinierstva izolovaním génu kódujúceho rezistenciu a jeho transferom do hospodárskych rastlín cieleným spôsobom lepší ako tradičná metóda šľachtenia rastlín.
V súčasnosti vývoj hospodárskych rastlín tolerantných voči herbicídom alebo odolných voči herbicídom metódami molekulovej biológie vyžaduje poznanie mechanizmu pôsobenia herbicídu v rastline a toho, že možno nájsť gény poskytujúce odolnosť voči herbicídu. Veľký počet herbicídov, ktoré sa v súčasnosti využívajú komerčne, pôsobí blokovaním kroku biosyntézy enzýmu esenciálnej aminokyseliny, lipidu alebo pigmentu. Toleranciu voči herbicídom možno generovať zmenou génov týchto enzýmov takým spôsobom, že herbicíd sa už nebude môcť viazať, a zavedením týchto zmenených génov do hospodárskych rastlín. Alternatívnym spôsobom je nájdenie analogických enzýmov v prírode, napríklad v mikroorganizmoch, ktoré vykazujú prirodzenú odolnosť voči danému herbicídu. Tento gén zabezpečujúci odolnosť sa z takého mikroorganizmu izoluje, preklonuje na vhodné vektory a potom po úspešnej transformácii sa exprimuje v hospodárskych rastlinách citlivých na herbicíd (WO 96/38567).
Podstata vynálezu
Cieľom predloženého vynálezu bolo vyvinúť novú, všeobecne použiteľnú metódu genetického inžinierstva na výrobu transgénnych rastlín tolerantných voči fungicídom.
Zistili sme, že tento cieľ možno prekvapujúco dosiahnuť postupom expresie exogénneho polypeptidu, protilátky alebo častí protilátky s vlastnosťami viazania fungicídu v rastlinách.
Predložený vynález sa týka predovšetkým produkcie protilátky viažucej fungicíd a klonovania príslušného génu alebo génového fragmentu.
Prvým krokom je produkcia vhodnej protilátky, ktorá viaže fungicíd. Toto možno medzi iným dosiahnuť imunizáciou stavovcov, vo väčšine prípadov myši, potkana, psa, koňa, osla alebo kozy antigénom. Antigénom v tomto prípade je fungicídne aktívna zlúčenina, ktorá je asociovaná alebo spojená s nosičom vyššej molekulovej hmotnosti, napríklad hovädzí sérový albumín (BSA - bovine sérum albumín), kurací ovalbumín, KLH (keyhole limpet hemocyanine) alebo iné nosiče prostredníctvom funkčnej skupiny. Po opakovanej aplikácii antigénu sa zvyčajnými metódami monitoruje imunitná odpoveď a takto sa izoluje vhodné antisérum. Týmto postupom sa najprv získa polyklonálne sérum, ktoré obsahuje protilátky s rozličnými špecifickosťami. Na cielené použitie in situ je potrebné izolovať génovú sekvenciu, ktorá kóduje jedinú špecifickú monoklonálnu protilátku. Na tento účel je k dispozícii viacero rôznych prístupov. Prvý prístup využíva fúziu buniek produkujúcich protilátku a rakovinových buniek, čím sa získa hybridómová bunková kultúra, ktorá sústavne produkuje protilátky a ktorá nakoniec jednotením získaných klonov vedie k homogénnej bunkovej línii, ktorá produkuje definovanú monoklonálnu protilátku.
cDNA pre protilátku alebo časti protilátky, teda takzvaná jednoreťazcová protilátka (scFv), sa izoluje z takej monoklonálnej bunkovej línie. Tieto sekvencie cDNA možno potom klonovať do expresných kaziet a použiť na funkčnú expresiu v prokaryotických a eukaryotických organizmoch vrátane rastlín.
Alternatívne je možné vyselektovať protilátky prostredníctvom fágových displejových knižníc a tieto protilátky viažu molekuly fungicídu a konvertujú ich katalytický na produkt, ktorý nemá fungicídne vlastnosti. Metódy na získavanie katalytických protilátok sú opísané v Janda a kol., Science 275 (1997) 945-948, Chemical selection for catalysis in combinatorial Antibody libraries; Catalytic Antibodies, 1991, Ciba Foundation Symposium 159, Wiley - Interscience Publication. Klonovanie génu tejto katalytickej protilátky a jeho expresia v rastline môže v zásade tiež viesť k rastline odolnej voči fungicídom.
Vynález sa osobitne týka expresných kaziet, ktorých kódovacia sekvencia kóduje polypeptid viažuci fungicíd alebo jeho funkčný ekvivalent, a použitia týchto expresných kaziet na získanie rastliny tolerantnej voči fungicídom. Sekvencia nukleovej kyseliny môže byť napríklad sekvencia DNA alebo sekvencia cDNA. Kódovacie sekvencie, ktoré sú vhodné na zasunutie do expresnej kazety podľa vynálezu, sú napríklad tie, ktoré obsahujú sekvenciu DNA z hybridómovej bunky, ktorá kóduje polypeptid s vlastnosťami viazania fungicídu, a takto poskytujú hostiteľovi rezistenciu voči špecifickým fungicídom.
Okrem toho expresné kazety podľa vynálezu obsahujú sekvencie regulačných nukleových kyselín, ktoré riadia expresiu kódovacej sekvencie v hostiteľskej bunke. Vo výhodnom uskutočnení expresná kazeta podľa vynálezu obsahuje na konci 5’ kódovacej sekvencie promótor a na konci 3’ polyadenylačný signál a ak sa hodí, iné regulačné prvky, ktoré sú spojené operatívne s medziľahlou kódovacou sekvenciou pre polypeptid s vlastnosťami viazania fungicídu a/alebo tranzitného peptidu. Operatívne prepojenie sa má chápať vo význame sekvenčného usporiadania promótora, kódovacej sekvencie, terminátora a ak sa hodí aj iných regulačných prvkov takým spôsobom, že každý z regulačných prvkov môže pri exprimovaní kódovacej sekvencie fungovať tak, ako sa plánovalo. Sekvencie výhodné okrem iného na operatívne prepojenie sú cieľové sekvencie na zaručenie subcelulárnej lokalizácie v apoplastoch, v plazmovej membráne, vo vakuole, v plastidoch, do mitochondrií, v endoplazmatickom retikulu (ER), v jadre, v lipozómoch alebo v iných častiach a urýchľovačoch translácie, ako je napríklad vedúca sekvencia konca 5’ z vírusu tabakovej mozaiky (Gallie a kol., Nucl. Acids Res. 15(1987) 8693-8711).
Vhodnými promótormi expresnej kazety podľa vynálezu sú v zásade akékoľvek promótory schopné riadiť expresiu cudzích génov. Výhodné promótory sú najmä rastlinné promótory alebo promótory pochádzajúce z rastlinných vírusov. Osobitne výhodný je promótor CaMV 35S z vírusu karfiolovej mozaiky (Franck a kol., Celí 21(1980) 285-294). Tento promótor obsahuje rôzne rozpoznávacie sekvencie pre transkripčné efektory, ktoré spolu vedú k permanentnej a konštitučnej expresii zavedeného génu (Benfey a kol., EMBO J. 8 (1989) 21952202).
Expresná kazeta podľa vynálezu môže obsahovať aj chemicky indukovateľný promótor, pomocou ktorého možno kontrolovať expresiu exogénneho polypeptidu v rastline v určitom čase. Medzi inými možno použiť promótory opísané v literatúre, napríklad promótor PRP1 (Ward a kol., Plánt. Mol. Biol. 22 (1993), 361-366), promótor, ktorý je indukovateľný kyselinou salicylovou (WO 95/1919443), promótor, ktorý je indukovateľný benzénsulfónamidom (EP 388186), promótor, ktorý je indukovateľný kyselinou abscisovou (EP335528), alebo promótor, ktorý je indukovateľný etanolom alebo cyklohexanónom (WO9321334).
Ďalšími promótormi, ktoré sú osobitne výhodné, sú tie, ktoré zaručujú expresiu v pletivách alebo rastlinných orgánoch, v ktorých prebieha fýtotoxická fungicídna aktivita. Promótory, ktoré zaručujú expresiu špecifickú pre listy, si zaslúžia osobitnú zmienku. Treba spomenúť zemiakový cytosolický FBPase promótor alebo zemiakový ST-LSI promótor (Stockhaus a kol., EMBO J. 8 (1989) 2445-245).
Stabilná expresia jednoreťazcových protilátok, ktorá predstavovala až 0,67 % celkového rozpustného semenového proteínu v semenách transgénnych tabakových rastlín, sa umožnila pomocou promótora špecifického pre semená (Fiedler a Conrad, Bio/Technology 10(1995), 1090-1094). Keďže expresia môže byť možná aj v semenách, ktoré boli vysiate, alebo ktoré práve klíčia, a môže byť žiaduca na účely predloženého vynálezu, také promótory špecifické pre klíčenie a pre semená sú tiež regulačné prvky, ktoré sú podľa vynálezu výhodné. Expresná kazeta podľa vynálezu môže preto obsahovať napríklad promótor špecifický pre semená (s výhodou USP alebo LEB4 promótor), LEB4 signálový peptid, gén, ktorý sa má exprimovať, a ER retenčný signál. Konštrukcia kazety je priblížená na príklade vo forme diagramu na obrázku 1 týkajúcom sa jednoreťazcovej protilátky (scFv gén).
Expresná kazeta podľa vynálezu je vyrobená fúzovaním .vhodného promótora s vhodnou polypeptidovou DNA a s výhodou DNA, ktorá kóduje tranzitný peptid špecifický pre chlóroplast a ktorá je zasunutá medzi promótor a poíypeptidovú DNA, a polyadenylačného signálu pomocou zvyčajných techník rekombinácie a klonovania, ktoré sú opísané napríklad v T. Maniatis, E. F. Fritsch a J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) a tiež v T. J. Silhavy, M. L. Berman a L. W. Enquist, Experimente with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) a v Ausubel, F. M. a kol., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-lnterscience (1987).
Osobitne výhodné sú sekvencie, ktoré umožňujú zacielenie do apoplastu, plastidu, vakuoly, plazmatickej membrány, mitochondrie, endoplazmatického retikula (ER) alebo pri neprítomnosti vhodných operačných sekvencií rezidenciu v priestore vzniku, konkrétne cytosolu (Kermode, Crit. Rev. Plánt Sci. 15, 4 (1996),
K
285-423). Lokalizácia v ER a bunkovej stene sa ukázala ako osobitne prínosná pre kvantitatívnu akumuláciu proteínu v transgénnych rastlinách (Schouten a kol. , Plánt Mol. Biol. 30 (1996), 781-792; Artsaenko a kol., Plánt J. 8 (1995) 745-750).
Vynález sa týka aj expresných kaziet, ktorých kódovacia sekvencia kóduje fúzny proteín viažuci fungicíd, pričom časť fúzneho proteínu je tranzitný proteín, ktorý riadi translokáciu polypeptidu. Osobitne výhodné sú tranzitné peptidy špecifické pre chloroplast, ktoré sa štiepia enzymaticky z polypeptidového zoskupenia viažuceho fungicíd po translokácii polypeptidu viažuceho fungicíd do chloroplastov rastliny. Osobitne výhodný je tranzitný peptid odvodený ód plastidovej transketolázy (TK) alebo funkčný ekvivalent tohto tranzitného peptidu (napríklad tranzitný peptid malej podjednotky Rubiscovej alebo ferredoxínovej NADP oxidoreduktázy).
Polypeptidová DNA alebo polypeptidová cDNA potrebná na produkciu expresných kaziet podľa vynálezu sa s výhodou amplifikuje pomocou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR). Metódy amplifikácie DNA pomocou PCR sú známe napríklad z Innis a kol., PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990). DNA fragmenty vyprodukované pomocou PCR možno vhodne skontrolovať sekvenčnou analýzou, aby sa zabránilo polymerázovým chybám v konštruktoch, ktoré sa majú exprimovať.
Vložená nukleotidová sekvencia, ktorá kóduje polypeptid viažuci fungicíd, sa dá pripraviť synteticky alebo získať prirodzene, alebo môže obsahovať zmes komponentov syntetickej a prírodnej DNA. Vo všeobecnosti sa pripravujú syntetické nukleotidové sekvencie s kodónmi, ktoré sú výhodné pre rastliny. Tieto kodóny, ktoré sú výhodné pre rastliny, možno určiť z kodónov, ktorých proteíny sú najfrekventovanejšie, a ktoré sa exprimujú vo väčšine zaujímavých rastlinných druhov. Pri príprave expresnej kazety možno manipulovať rôznymi fragmentmi DNA, aby sa získala nukleotidová sekvencia, ktorá sa vhodne číta v správnom zmysle, a ktorá je vybavená správnym čítacím rámcom. Na vzájomné spojenie fragmentov DNA možno k fragmentom pridať adaptéry alebo linkery.
Oblasti promótora a terminátora podľa vynálezu by mali byť s výhodou vybavené v zmysle transkripcie linkerom alebo polylinkerom obsahujúcim jedno alebo viacero reštrikčných miest na zasunutie tejto sekvencie. Linker má spravidla 1 až 10, obyčajne 1 až 8, s výhodou 2 až 6 reštrikčných miest. V regulačných oblastiach má linker vo všeobecnosti veľkosť do 100 bp, často menej ako 60 bp, ale najmenej 5 bp. Promótor podľa vynálezu môže byť buď natívny alebo homologický alebo aj cudzí alebo heterologický voči hostiteľskej rastline. Expresná kazeta podľa vynálezu obsahuje - v zmysle transkripcie z konca 5’ po koniec 3’ promótor podľa vynálezu, akúkoľvek požadovanú sekvenciu a oblasť na transkripčnú termináciu. Rôzne terminačné oblasti sú vzájomne zameniteľné podľa potreby.
Navyše možno použiť manipulácie, ktoré poskytujú vhodné reštrikčné miesta, alebo ktoré odstraňujú nadbytočnú DNA alebo reštrikčné miesta. Tam, kde sú možné vloženia, delécie alebo substitúcie, napríklad tranzície alebo transverzie, možno použiť in vitro mutagenézu, “primérovú opravu, reštrikciu alebo ligáciu. V prípade vhodných manipulácií, ako je napríklad reštrikcia, “chewing-back” alebo vypĺňanie projekcií pre “tupé konce, možno zabezpečiť komplementárne konce fragmentov na účely ligácie.
Osobitne dôležité pre úspech podľa vynálezu je pripojenie špecifického ER retenčného signálu SEKDEL (Schuoten, A. a kol. Plánt Mol. Biol. 30 (1996), 781 792), ktorým sa priemerná hladina expresie strojnásobí až zoštvornásobí. Ďalšie retenčné signály, ktoré sa vyskytujú prirodzene v rastlinných a zvieracích proteínoch, ktoré sa nachádzajú v ER, možno tiež použiť na konštrukciu kazety.
Výhodnými polyadenylačnými signálmi sú rastlinné polyadenylačné signály, s výhodou tie, ktoré v zásade zodpovedajú polyadenylačným signálom T-DNA z Agrobacterium tumefaciens, najmä gén 3 z T-DNA (oktopín syntáza) z Ti plazmidu pTiACH5 (Gielen a kol., EMBO J. 3 (1984) 835 et seq.) alebo funkčné ekvivalenty.
Expresná kazeta podľa vynálezu môže obsahovať napríklad konštitučný promótor (s výhodou CaMV 35 S promótor), signálový peptid LeB4, gén, ktorý sa má exprimovať a ER retenčný signál. Konštrukcia kazety je zobrazená ako diagram na obrázku 2 týkajúcom sa jednoreťazcovej protilátky (scFv gén). Ako ER retenčný signál sa s výhodou používa aminokyselinová sekvencia KDEL (lyzín, kyselina asparágová, kyselina glutámová, leucín).
Fúzovaná expresná kazeta, ktorá kóduje polypeptid s vlastnosťami viazania fungicídu, sa s výhodou klonuje do vektora, napríklad pBin19, ktorý je vhodný na transformovanie Agrobacterium tumefaciens. Agrobaktérie, ktoré sú transformované takým vektorom, možno potom použiť známym spôsobom na transformovanie rastlín, najmä hospodárskych rastlín, napr. tabakových rastlín, napríklad ponáraním poranených listov alebo častí listov v roztoku Agrobacteria a potom ich kultiváciou vo vhodnom médiu. Transformácia rastlín pomocou Agrobacteria je známa medzi inými z F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, zv. 1, Engineering and Utilization, redigovali S. D. Kung a R. Wu, Academic Press, 1993, s. 15-38, a z S. B. Gelvin, Molecular Genetics of T-DNA Transfer from Agrobacterium to Plants, tiež v Transgenic Plants, s. 49-78. Transgénne rastliny možno regenerovať z transformovaných buniek poranených listov alebo častí listov známym spôsobom a tieto transgénne rastliny obsahujú gén na expresiu polypeptidu s vlastnosťami viazania fungicídu integrovaný do expresnej kazety podľa vynálezu.
Aby sa transformovala hostiteľská rastlina s DNA kódujúcou polypeptid viažuci fungicíd, expresná kazeta podľa vynálezu sa zapojí ako vložka do rekombinantného vektora, ktorého vektorová DNA obsahuje dodatočné funkčné regulačné signály, napríklad sekvencie na replikáciu alebo integráciu. Vhodné vektory sú opísané medzi iným v “Methods in Plánt Molecular Biology and Biotechnology” (CRC Press), kapitola 6/7, s. 71-119 (1993).
Pomocou vyššie uvedených rekombinačných a klonovacích techník možno klonovať expresné kazety podľa vynálezu do vhodných vektorov, ktoré im umožnia multiplikáciu, napríklad v E. coli. Vhodnými klonovacími vektormi sú medzi inými pBR332, séria pUC, séria M13mp a pACYC184. Osobitne vhodné sú binárne vektory, ktoré sa môžu replikovať v E. coli aj v agrobaktériách, napríklad pBin19 (Bevan a kol. (1980) Nucl. Acids Res. 12, 8711).
Vynález sa ďalej týka použitia expresnej kazety podľa vynálezu na transformáciu rastlín, rastlinných buniek, rastlinných pletív alebo rastlinných orgánov. Výhodným cieľom pri použití je sprostredkovanie rezistencie voči fytotoxicky aktívnym fungicídom.
V závislosti od výberu promótora môže expresia prebehnúť špecificky v listoch, v semenách alebo v iných rastlinných orgánoch. Také transgénne rastliny, ich propagačný materiál a ich rastlinné bunky, rastlinné pletivá alebo rastlinné orgány sú ďalším predmetom predloženého vynálezu.
Transfer cudzích génov do genómu rastliny sa nazýva transformácia. V tomto procese sa používajú vyššie opísané metódy transformácie a regenerácie rastlín z rastlinných pletív alebo rastlinných buniek na prechodnú alebo stabilnú transformáciu. Vhodnými metódami sú protoplastová transformácia poyletyléngylokolom indukovanou absorpciou DNA, biolistický prístup pomocou génovej pušky, elektroporácia, inkubácia suchých embryí v roztoku obsahujúcom DNA, mikroinjekcia a agrobaktériou sprostredkovaný génový transfer. Spomenuté metódy sú opísané napríklad v B. Jenes a kol., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, zv. 1, Engineering and Utilization, redaktori: S. D. Kung a R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 a v Potrykus, Annu. Rev. Plánt Physiol. Plánt Molec. Biol. 42 (1991) 205-225). Konštrukt, ktorý sa má exprimovať, sa s výhodou klonuje do vektora, ktorý je vhodný na transformáciu Agrobacterium tumefaciens, napríklad pBin19 (Bevan a kol., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711).
Agrobaktérie, ktoré boli transformované expresnou kazetou podľa vynálezu, možno potom použiť známym spôsobom na transformovanie rastlín, najmä hospodárskych rastlín ako sú obilniny, kukurica, sója, ryža, bavlna, cukrová repa, repka, slnečnica, lán, zemiak, tabak, rajčina, repka olejná, ďatelina, šalát a rôzne stromové, orechové a druhy Vitís, napríklad káva, ovocné stromy ako jablone, hrušky alebo čerešne, orechové stromy ako vlašský orech alebo pekan a najmä vinič, napríklad ponáraním poranených listov alebo častí listov do agrobakteriálneho roztoku a potom ich kultiváciou vo vhodnom médiu.
Funkčne ekvivalentné sekvencie, ktoré kódujú polypeptid viažuci fungicíd, sú podľa vynálezu tie sekvencie, ktoré ešte majú požadované funkcie napriek rozdielnej nukleotidovej sekvencii. Funkčné ekvivalenty teda zahŕňajú prirodzene sa vyskytujúce varianty tu opísaných sekvencii a tiež umelé nukleotidové sekvencie, napríklad umelé nukleotidové sekvencie, ktoré sa získali chemickou syntézou a sú prispôsobené kodónovému použitiu rastliny.
Funkčný ekvivalent sa má chápať najmä ako prírodná alebo umelá mutácia pôvodne izolovanej sekvencie, ktorá kóduje polypeptid viažuci fungicíd, ktorá mutácia naďalej vykazuje požadovanú funkciu. Mutácie zahŕňajú substitúcie, adície, delécie, výmeny alebo vloženia jedného alebo viacerých nukleotidových zvyškov. Predložený vynález teda zahŕňa aj tie nukleotidové sekvencie, ktoré sa získajú modifikáciou tejto nukleotidovej sekvencie. Účelom takej modifikácie môže byť napríklad ďalšie obmedzenie tam obsiahnutej kódujúcej sekvencie, alebo napríklad vloženie ďalších miest štiepenia pre reštrikčné enzýmy.
Ďalšími funkčnými ekvivalentmi sú tie varianty, ktorých funkcia je menej alebo viac výrazná v porovnaní s východiskovým génom alebo génovým fragmentom.
Umelé sekvencie DNA sú navyše vhodné, pokiaľ sprostredkujú žiadanú toleranciu voči fungicídom s cieľom zabránenia fýtotoxickým účinkom na hospodárske rastliny, ako je opísané vyššie. Také umelé sekvencie DNA možno identifikovať napríklad spätnou transláciou proteínov, ktoré majú aktivitu viazania fungicídu a ktoré boli skonštruované pomocou molekulového modelovania alebo in vitro výberom. Osobitne vhodné sú kódovacie sekvencie DNA, ktoré sa získali spätnou transláciou polypeptidovej sekvencie v súlade s využitím kodónu, ktorý je špecifický pre hostiteľskú rastlinu. Špecifické využitie kodónu môže ľahko určiť odborník s poznatkami z metód rastlinnej genetiky pomocou vyhodnocovania počítačom iných, známych génov rastliny, ktorá sa má transformovať.
Ďalšie vhodné ekvivalentné sekvencie nukleovej kyseliny podľa vynálezu, ktoré treba spomenúť, sú sekvencie, ktoré kódujú fúzne proteíny, kde časť fúzneho proteínu je polypeptid viažuci fungicíd nie rastlinného pôvodu alebo jeho funkčne ekvivalentná časť. Napríklad druhá časť fúzneho proteínu môže byť ďalší polypeptid s enzýmovou aktivitou, alebo antigénna polypeptidová sekvencia, pomocou ktorej je možná detekcia expresie scFvs (napríklad myc-prívesok alebo his-prívesok). S výhodou je však polypeptid s vlastnosťami viazania fungicídu na požadované miesto pôsobenia smerovaný regulačnou proteínovou sekvenciou, napríklad signálnym alebo tranzitným peptidom.
Vynález sa však týka aj produktov expresie získaných podľa vynálezu a fýznych proteínov tranzitného peptidu a polypeptidu s vlastnosťami viazania fungicídu.
Rezistencia alebo tolerancia pre účely predloženého vynálezu znamená umelo získanú schopnosť rastlín odolávať pôsobeniu fungicídov s fytotoxickou aktivitou. Zahŕňa čiastočnú a najmä úplnú necitlivosť voči týmto inhibítorom v priebehu aspoň jednej generácie rastliny.
Fytotoxickým miestom pôsobenia fungicídov je vo všeobecnosti pletivo listov, takže listovo špecifická expresia exogénneho polypeptidu viažuceho fungicíd dokáže poskytnúť dostatočnú ochranu. Je však pochopiteľné, že fytotoxické pôsobenie fungicídu nemusí byť obmedzené na pletivo listu, ale môže sa uskutočňovať vo všetkých ostatných orgánoch rastliny pletivovo špecifickým spôsobom.
Okrem toho je výhodná konštitučná expresia exogénneho polypeptidu viažuceho fungicíd. Na druhej strane môže byť žiaduca aj indukovateľná expresia.
Účinnosť trasgénne exprimovaného polypeptidu s vlastnosťami viazania fungicídu možno určiť napríklad in vitro propagáciou výhonkového meristému v médiu obsahujúcom fungicíd v sériách so striedavými koncentráciami alebo pomocou testov klíčenia semien. Okrem toho fungicídovú toleranciu skúšobnej rastliny, ktorá bola zmenená vzhľadom na typ a úroveň, možno testovať v skleníkových experimentoch.
Vynález sa ďalej týka transgénnych rastlín transformovaných expresnou kazetou podľa vynálezu a transgénnych buniek, pletív, orgánov a propagačného materiálu takých rastlín. Osobitne výhodné sú transgénne hospodárske rastliny, napríklad obilniny, kukurinca, sója, ryža, bavlna, cukrová repa, kanola, slnečnica, ľan, zemiak, tabak, rajčiak, repka olejná, ďatelina, šalát a rôzne krovinové, stromové, orechové a Vitis druhy, napríklad káva, ovocné stromy ako jablone, hrušky alebo čerešne, orechové stromy ako vlašský orech alebo pekan, a najmä vinič.
Transgénne rastliny, rastlinné bunky, rastlinné pletivá alebo rastlinné orgány možno ošetriť fungicídom s fytotoxickým pôsobením, ktorý inhibuje rastlinné enzýmy, pričom rastliny, rastlinné bunky, rastlinné pletivá alebo rastlinné orgány, ktoré neboli transformované, úspešne odumrú alebo sa poškodia. Príkladmi vhodných účinných látok sú strobiluríny, konkrétne metyl metoxyimino-a-(o15 tolyloxy)-o-tolylacetát (BAS 490F) a metabolity a funkčné deriváty týchto zlúčenín. DNA, ktorá kóduje polypeptid s vlastnosťami viazania fungicídu a ktorá bola vložená do expresných kaziet podľa vynálezu, sa takto dá použiť ako selekčný marker.
Predložený vynález má výhodu, najmä v prípade hospodárskych rastlín, že po indukovaní vybranej rezistencie hospodárskej rastliny voči fungicídom s fytotoxickou aktivitou možno také fungicídy použiť pri týchto plodinách na kontrolu škodlivých húb, dokonca aj pri vyššej miere aplikácie, ktorá by inak viedla k poškodeniu rastlín. Ako príklady takých fungicídov s fytotoxickou aktivitou možno bez obmedzenia rozsahu vynálezu uviesť herbicídne zlúčeniny z nasledujúcich skupín:
• síra, ditiokarbamáty a ich deriváty, napríklad dimetylditiokarbamát železitý, dimetylditiokarbamát zinočnatý, etylénbisditiokarbamát zinočnatý, etylénbisitiokarbamát mangánatý, etyléndiamínbisditiokarbamát horečnato zinočnatý, tetrametyltiuram disulfidy, ammónny komplex (Ν,Ν-etylénbisditiokarbamátu) zinočnatého, amónny komplex (Ν,Ν’-propylénbisditiokarbamátu) zinočnatého, (Ν,Ν’-propylénbisditiokarbamát) zinočnatý, N,N’-polypropylénbis(tiokarbamoyljdisulfid;
• nitroderiváty, napríklad dinitro(1-metylheptyl)fenyl krotonát, 2-sec-butyl-4,6dinitrofenyl 3,3-dimetylakrylát, 2-sec-butyl-4,6-dinitrofenyl izopropyl karbonát, diizopropyl 5-nitroizoftalát;
• heterocyklické látky, napríklad 2-heptadecyl-2-imidazolín acetát, 2,4-dichlór-6(o-chlóranilino)-s-triazín, Ο,Ο-dietyl ftalimidofosfonotioát, 5-amino-1-[bis(dimetylamino)fosfinyl]-3-fenyl-1,2,4-triazol, 2,3-dikyano-1,4-ditioantrachinón, 2-tio-1,3-ditiolo[4,5-b]chinoxalín, metyl 1-(butylkarbamoyl)-2-benzimidazolkarbamát, 2-metoxykarbonylaminobenzimidazol, 2-(2-furyl)benzimidazol, 2-(4tiazolyl)benzimidazol, N-(1,1 ^^-tetrachlóretyltiojtetrahydroftalimid, N-trichlórmetyltiotetrahydroftalimid, N-trichlórmetyltioftalimid, • N-dichlórfluórmetyltio-N’.N'-dimetyl-N-fenylsulfodiamid, 5-etoxy-3-trichlórmetyl-1,2,3-tiadiazol, 2-tiokyanatometyltiobenzotiazol, 1,4-dichlór-2,516 dimetoxybenzén, 4-(2-chlórfenylhydrazono)-3-metyl-5-izoxazolón, pyridín-2tio-1-oxid, 8-hydroxychinolín alebo jeho soľ s meďou, 2,3-dihydro-5karboxanilido-6-metyl-1,4-oxatiín, 2,3-dihydro-5-karboxanilido-6-metyl-1,4oxatiín 4,4-dioxid, 2-metyl-5,6-dihydro-4H-pyrán-3-karboxanilid, 2-metylfuran3-karboxanilid, 2,5-dimetylfurán-3-karboxanilid, 2,4,5-trimetylfurán-3karboxanilid, N-cyklohexyl-2,5-dimetylfurán-3-karboxamid, N-cyklohexyl-Nmetoxy-2,5-dimetylfurán-3-karboxamid, 2-metylbenzanilid, 2-jódbenzanilid, Nformyl-N-morfolín-2,2,2-trichlóretyl acetál, piperazín-1,4-diylbis-1-(2,2,2trichlóretyl)formamid, 1-(3,4-dichlóranilino)-1-formylamino-2,2,2-trichlóretán;
• amíny, napríklad 2,6-dimetyl-N-tridecylmorfolín alebo jeho soli, 2,6-dimetyl-Ncyklododecylmorfolín alebo jeho soli, N-[3-(p-tercbutylfenyl)-2-metylpropyl]cis-2,6-dimetylmorfolíne, N-[3-(p-tercbutylfenyl)-2-metylpropyl]piperidín, (8(1,1 -dimetyletyl)-N-etyl-N-propyl-1,4-dioxaspiro[4.5]dekán-2-metánamín, • azoly, napríklad 1-[2-(2,4-dichlórfenyl)-4-etyl-1,3-dioxolan-2-yletyl]-1H-1,2,4triazol, 1 -[2-(2,4-dichlórfenyl)-4-n-propyl-1,3-dioxolan-2-yletyl]-1 H-1,2,4-triazol, N-(n-propyl)-N-(2,4,6-trichlórfenoxyetyl)-N’-imidazolylmočovina, 1-(4-chlórfenoxy)-3,3-dimetyl-1-(1 H-1,2,4-triazol-1-yl)-2-butanón, 1-(4-chlórfenoxy)-3,3dimetyl-1-(1 H-1,2,4-triazol-1-yl)-2-butanol, (2RS,3RS)-1-[3-(2-chlórfenyl)-2-(4fIuórfenyl)-oxiran-2-ylmetyl]-1 H-1,2,4-triazol, 1-[2-(2,4-dichlórfenyl)-pentyl]-1 H1.2.4- triazol, 2,4’-difluór-a-(1 H-1,2,4-triazolyI-1 -metyl)benzhydryl alkohol, 1 ((bis(4-fluórfenyl)metylsilyl)metyl)-1 H-1,2,4-triazol, 1 -[2RS,4RS;2RS,4SR)-4bróm-2-(2,4-dichlórfenyl)tetrahydrofuryl]-1 H-1,2,4-triazol, 2-(4-chlórfenyl)-3cyklopropyl-1-(1 H-1,2,4-triazol-1-yl)-butan-2-ol, (+)-4-chlór-4-[4-metyl-2-(1 H1.2.4- triazol-1-ylmetyl)-1,3-dioxolan-2-yl]fenyl 4-chlórfenyl éter, (E)-(R,S)-1(2,4-dichlórfenyl)-4,4-dimetyl-2-(1 H-1,2,4-triazol-1 -yl)pent-1 -en-3-ol, 4-(4ch,órfenyl)-2-fenyl-2-(1 H-1,2,4,-triazolylmetyl)butyronitril, 3-(2,4-dichlórfenyl)6-fIuór-2-(1 H-1,2,4-triazol-1-yl)chinazolin-4(3H)-ón, (R,S)-2-(2,4-dichlórfenyl)1-H-1,2,4-triazol-1-yl)hexan-2-ol, (1RS,5RS;1RS,5SR)-5-(4-chlórbenzyl)-2,2dimetyl-1-(1 H-1,2,4-triazol-1-ylmetyl)cyklopentanol, (R,S)-1-(4-chlórfenyl)-4,4dimetyl-3-(1 H-1,2,4-triazol-1 -ylmetyl)pentan-3-ol, (+)-2-(2,4-d ich lórfeny l)-3(1 H-1,2,4-triazolyl)propyl 1,1,2,2-tetrafluóretyl éter, (E)-1-[1-[4-chlór-2trifluórmetyl)fenyl]imino)-2-propoxyetyl]-1 H-imidazol, 2-(4-chlórfeny 1)-2-( 1 H17
1,2,4-triazol-1 -ylmetyl)hexano-nitril, a-(2-chlórfenyl)-a-(4-chlórfenyl)-5pyrimidinemetanol, 5-butyl-2-dimetylamino-4-hydroxy-6- metylpyrimidín, bis(pchlórfenyl)-3-pyridínmetanol, 1,2-bis(3-etoxykarbonyl-2-tioureido)benzén, 1,2bis(3-metoxykarbonyl-2-tioureido)benzén, • strobiluríny, napríklad metyl E-metoxyimino-[a-(o-tolyloxy)-o-tolyl]acetát, metyl E-2-{2-[6-(2-kyanofenoxy)pyrimidín-4-yloxy]fenyl}-3-metoxyakrylát, metyl-Emetoxyimino-[a-(2-fenoxyfenyl)]acetamid, metyl E-metoxyimino-[a-(2,5-dimetylfenoxy)-o-toly Ijacetamid, • anilinopyrimidíny, napríklad N-(4,6-dimetylpyrimidin-2-yl)anilín, N-[4-metyl-6(1-propinyl)pyrimidín-2-yl]anilín, N-[4-metyl-6-cyklopropylpyrimidin-2-yl]anilín, • fenylpyroly, napríklad 4-(2,2-difluór-1,3-benzodioxol-4-yl)pyrol-3-karbonitril, • cinamamidy, napríklad 3-(4-chlórfenyl)-3-(3,4-dimetoxyfenyl)akryloylmorfolín, • a rad fungicídov, napríklad dodecylguanidín acetát, 3-(3-(3,5-dimetyl-2oxycyklohexyl)-2-hydroxyetyl]glutárimid, Ν-metyl-, N-etyl-(4-trifluórmetyl, -2(3’,4’-dimetoxyfenyl]benzamid, hexachlórbenzén, metyl N-(2,6-dimetylfenyl)-N(2-furoyl)-DL-alaninát, DL-N-(2,6-dimetylfenyl)-N-(2'-metoxyacetyl)alanín metyl ester, N-(216-dimetylfenyl)-N-chlóracetyl-D,L-2-aminobutyrolaktón1 metylester DL-N-(2,6-dimetylfenyl)-N-(fenylacetyl)alanínuI 5-metyl-5-vinyl-3(3,5-dichlórfenyl)-2,4-dioxo-1,3-oxazolidín, 3-[3,5-dichlórfenyl(-5-metyl-5metoxymety[]-1,3-oxazolidín-2,4-dión, 3-(3,5-dichlórfenyl)-1-izopropylkarbamoylhydantoín, N-(3,5-dichlórfenyl)-1,2-dimetylcyklopropán-1,2dikarboximid, 2-kyano-[N-(etylaminokarbonyl)-2-metoximino]acetamid, N-(3chlór-2,6-dinitro-4-trifluórmetylfenyl)-5-trifluórmetyl-3-chlór-2-aminopyridín.
Funkčne ekvivalentné deriváty týchto fungicídov majú porovnateľné spektrum účinnosti proti fýtopatogénnym hubám ako látky, ktoré boli spomenuté špecificky, v spojení s menej, rovnako alebo viac výraznou fytotoxickou aktivitou.
Vynález je ďalej ilustrovaný na nasledujúcich príkladoch, ale nie je na ne obmedzený:
Všeobecné metódy klonovania
Klonovacie kroky uskutočnené v rámci rozsahu predloženého vynálezu, napríklad reštrikčné štiepenia, elektroforéza agarózového gélu, purifikácia fragmentov DNA, transfer nukleových kyselín do nitrocelulózových a nylonových membrán, prepojenie DNA fragmentov, transformácia buniek E. coli, kultivácia baktérií, multiplikácia fágov a sekvenčná analýza rekombinantnej DNA, sa uskutočnili podľa Sambrook a kol. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN 0-87969-309-6).
Bakteriálne kmene použité ďalej (E. coli, XL-I Blue) sa získali od Stratagene. Agrobakteriálny kmeň použitý na transformáciu rastlín (Agrobacterium tumefaciens, C58C1 s plazmidom pGV2260 alebo pGV3850kan) bol opísaný v Deblaere a kol. (Nucl. Acids Res. 13 (1985) 4777). Alternatívne možno použiť agrobakteriálny kmeň LBA4404 (Clontech) alebo aj iné vhodné kmene. Na účely klonovania sa použili vektory pUC19 (Yanish-Perron, Gene 33(1985), 103-119) pBluescript SK(Stratagene), pGEM-T (Promega), pZerO (Invitrogen), pBin19 (Bevan a kol., Nucl. Acids Res. 12(1984) 8711-8720) a pBinAR (Hófgen a Willmitzer, Plánt Science 66 (1990) 221-230).
Sekvenčná analýza rekombinantnej DNA
Molekuly rekombinantnej DNA boli sekvenované pomocou laserového fluorescenčného prístroja na sekvenovanie DNA od Pharmacia, pomocou Sangerovej metódy (Sanger a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74(1977), 54635467).
Generovanie rastlinných expresných kaziet
Promótor 35S CaMV bol zasunutý do plazmidu pBin19 (Bevan a kol., Nucl. Acids Res. 12, 8711 (1984)) vo forme fragmentu EcoRI-Kpnl (zodpovedajúceho nukleotidom 6909-7437 karfiolového mozaikového vírusu (Franck a kol. Celí 21 (1980) 285). Polyadenylačný signál génu 3 T-DNA z Ti plazmidu pTiACH5 (Gielen a kol., EMBO J. 3 (1984) 835), nukleotidy 11749-11939, bol izolovaný vo forme fragmentu Pvull-Hindlll a po pridaní Sphl linkerov klonovaný do miesta štiepenia
Pvuil medzi miestom štiepenia Sphl-Hindill vektora. Takto sa získal plazmid pBinAR (Hôfgen a Willmitzer, Plánt Science 66 (1990) 221-230).
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obr. 1 znázorňuje diagram kazety pre semenovo špecifickú expresiu génu scFV
Obr. 2 znázorňuje diagram kazety na expresiu génu scFv v listoch transgénnych rastlín tabaku.
Obr. 3 znázorňuje diagram konštrukcie génu scFv-antiBAS 490F (V - variabilný región, L - linker).
Obr. 4 znázorňuje funkčnú charakterizáciu scFv-antiBAS 490F v priamej ELISA.
Obr. 5 znázorňuje diagram kazety pre semenovo špecifickú expresiu génu scFvantiBas 490F.
Obr. 6 znázorňuje detekciu existujúcej aktivity viazania antigénu v protilátkovom fragmente scFv-anti-BAS 490F v listoch po vysušení alebo lyofilizácii pomocou analýz ELISA.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Keďže fungicídy nie sú imunogénne, musia sa spojiť s nosným materiálom, napríklad KLH. Ak molekula obsahuje reaktívnu skupinu, spojenie možno uskutočniť priamo; ak nie, funkčná skupina sa zavedie, keď sa fungicíd syntetizuje, alebo sa počas syntézy vyberie reaktívny prekurzor, aby sa tieto molekuly pripojili na nosnú molekulu v jednom reakčnom kroku. Príklady spájacích reakcií možno nájsť v Miroslavic Ferencik in “Handbook of Immunochemistry”, 1993, Chapman & Halí, v kapitole Antigens, strany 20 - 49.
Opakovaná injekcia tejto modifikovanej molekuly nosiča (antigén) sa používa na imunizáciu napríklad myší Balb/c. Keď je pomocou ELISA (enzymelinked immunosorbent assay) zistiteľný dostatočný počet protilátok s viazaním na antigén, získajú sa slezinové bunky týchto zvierat a fúzujú sa s myelómovými bunkami, aby sa kultivovali hybridy. Okrem toho sa v ELISA použije “fungicídom modifikovaný BSA”, aby sa rozlíšila imunitná odpoveď namierená proti hapténu z odpovede KLH.
Monoklonálne protilátky sa pripravujú metódami podobnými známym metódam, opísaným napríklad v “Practical Immunology”, Leslie Hudson a Frank Hay, Blackwell Scientific Publications, 1989 alebo v “Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, James Goding, 1983, Academic Press, Inc., alebo v “A practical guide to monoclonal antibodies”, J. Liddell a A. Cryer,1991, John Wiley & Sons; alebo Achim Moller a Franz Emling “Monoklonale Antikôrper gegen TNF und deren Verwendung” [monoklonálne protilátky proti TNF a ich použitie]. Európska patentová špecifikácia EP-A260610.
Príklad 2
Východiskovým bodom skúmania bola monoklonálna protilátka, ktorá špecificky rozoznáva fungicíd BAS 490F a ktorá má okrem toho vysokú afinitu viazania. Vybraná hybridómová bunková línia je charakterizovaná tým, že vylučované monoklonálne protilátky, ktoré sú namierené proti fungicídnemu antigénu BAS 490F, majú vysokú afinitu a sú k dispozícii špecifické sekvencie imunoglobulínov (Berek, C. a kol., Náture 316, (1985) 412-418). Táto monoklonálna protilátka proti BAS 490F bola východiskovým bodom konštrukcie jednoreťazcového protilátkového fragmentu (scFv-antiBAS 490F).
Najprv bola mRNA izolovaná z hybridómových buniek a transkribovaná do cDNA. Táto cDNA pôsobila ako šablóna pre amplifikáciu variabilných imunoglobulínových génov VH a VK so špecifickými primérmi VH1 BACK a VH FOR-2 pre ťažký reťazec a VK2 BACK a MJK5 FON X pre ľahký reťazec (Clackson a kol., Náture 352, (1991) 624-628). Izolované variabilné imunoglobulíny boli východiskovým bodom konštrukcie jednoreťazcového protilátkového fragmentu (scFv-antiBAS 490F). V nasledujúcej fúznej PCR sa tri komponenty VH, VK a linkerový fragment skombinovali v reakcii PCR a scFv-antiBAS 490F sa amplifikoval (obr. 3).
Funkčná charakterizácia (aktivita viazania antigénu) skonštruovaného génu scFv-antiBAS 490F sa uskutočnila po expresii v bakteriálnom systéme. S týmto cieľom sa syntetizoval scFv-antiBAS 490F v E. coli ako rozpustný protilátkový fragment pomocou metódy Hoogenboom, H. R. a kol., Nucleic Acids Research 19 (1991), 4133-4137. Aktivita a špecifickosť skonštruovaného protilátkového fragmentu sa skontrolovali analýzou ELISA (obr. 4).
Aby sa umožnila semenovo špecifická expresia protilátkového fragmentu v tabaku, gén scFv-antiBAS 490F sa klonoval nadol od promótora LeB4. Promótor LeB4, ktorý bol izolovaný z Vicia faba, vykazuje prísne semenovo špecifickú expresiu rôznych cudzích génov v tabaku (Bäumlein, H. a kol., Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 121-128). Transport polypeptidu scFv-antiBAS 490F do endopiazmatického retikula mal za následok stabilnú akumuláciu veľkých množstiev protilátkového fragmentu. S týmto cieľom sa gén scFv-antiBAS 490F fúzoval so signálnou peptidovou sekvenciou, ktorá zaručuje vstup do endopiazmatického retikula, a s ER retenčným signálom SEKDEL, ktorý zaručuje, že polypeptid ostane v ER (Wandelt a kol., 1992) (obr. 5).
Skonštruovaná expresná kazeta bola klonovaná do binárneho vektora pGSGLUC 1 (Saito a kol., 1990) a transferovaná do kmeňa Agrobacterium EHA 101 elektroporáciou. Na následnú transformáciu Nicotiana tabacum sa použili rekombinantné agrobakteriálne klony. Na jeden konštrukt bolo regenerovaných /ΟΙ 40 tabakových rastlín. Semená v rôznych vývojových štádiách boli pozbierané z regenerovaných transgénnych rastlín tabaku po samoopelení. Rozpustné proteíny boli získané z týchto semien vo vodnom tlmivom systéme po extrakcii. Analýza transgénnych rastlín demonštruje, že fúzia génu scFv-antiBAS 490F do DNA sekvencie ER retenčného signálu SEKDEL umožnila získanie maximálnej akumulácie 1,9 % proteínu scFv-antiBAS 490F v zrelých semenách.
Konštruovaný gén scFv-antiBAS 490F mal veľkosť približne 735 bp. Variabilné domény boli navzájom fúzované v sekvencii VH-L-VL.
Špecifická selektivita bola určená v extraktoch zrelých tabakových semien pomocou priamej ELISA. Získané hodnoty jasne demonštrujú, že proteínové extrakty obsahujú funkčne aktívne fragmenty protilátok.
Príklad 3
Semenovo špecifická expresia a koncentrácia jednoreťazcových fragmentov protilátok v endoplazmatickom retikulu buniek transgénnych tabakových semien pod kontrolou USP promótora.
Východiskovým bodom skúmania bol jednoreťazcový protilátkový fragment proti fungicídu BAS 490F (scFv-antiBAS 490F). Funkčná charakterizácia (aktivita viazania antigénu) skonštruovaného génu scFv-antiBAS 490F sa uskutočnila po expresii v bakteriálnom systéme a po expressii v tabakových listoch. Aktivita a špecifickosť skonštruovaného protilátkového fragmentu sa skontrolovala pomocou ELISA analýzy.
Aby sa umožnila semenovo špecifická expresia protilátkového fragmentu v tabaku, gén scFv-antiBAS 490F sa klonoval nadol od promótora USP. Promótor USP, ktorý bol izolovaný z Vicia faba, vykazuje prísne semenovo špecifickú expresiu rôznych cudzích génov v tabaku (Fiedler, H. a kol., Plánt Mol. Biol. 22 (1993), 669-679). Transport polypeptidu scFv-antiBAS 490F do endoplazmatického retikula mal za následok stabilnú akumuláciu veľkých množstiev protilátkového fragmentu. S týmto cieľom sa gén scFv-antiBAS 490F fúzoval so signálnou peptidovou sekvenciou, ktorá zaručuje vstup do endoplazmatického retikula, a s ER retenčným signálom SEKDEL, ktorý zaručuje, že polypeptid ostane v ER (Wandelt a kol., 1992) (obr. 1).
Skonštruovaná expresná kazeta bola klonovaná do binárneho vektora pGSGLUC 1 (Saito a kol., 1990) a transferovaná do kmeňa Agrobacterium EHA 101 elektroporáciou. Na následnú transformáciu Nicotiana tabacum sa použili rekombinantné agrobakteriálne klony. Semená v rôznych vývojových štádiách boli pozbierané z regenerovaných transgénnych rastlín tabaku po samoopelení. Rozpustné proteíny boli získané z týchto semien vo vodnom tlmivom systéme po extrakcii. Analýza transgénnych rastlín demonštruje, že fúzia génu scFv-antiBAS 490F do DNA sekvencie ER retenčného signálu SEKDEL pod kontrolou promótora USP spôsobila syntézu jednoreťazcových protilátkových fragmentov s afinitou viazania pre BAS 490F už v desiaty deň vývoja semien.
Príklad 4
Aby sa dosiahla expresia protilátkového fragmentu v celej rastline, najmä v listoch, gén scFv-antiBAS 490F bol klonovaný nadol od promótora CaMV 35 S. Tento silný konštitučný promótor sprostredkuje expresiu cudzích génov v prakticky všetkých rastlinných pletivách (Benfey a Chua, Science 250 (1990), 956 - 966). Transport proteínu scFv-antiBAS 490F do endoplazmatického retikula umožnil stabilnú akumuláciu veľkých množstiev protilátkového fragmentu v listovom materiáli. Najprv sa gén scFv-antiBAS 490F fúzoval so signálnou peptidovou sekvenciou, ktorá zabezpečuje vstup do endoplazmatického retikula, a s ER retenčným signálom KDEL, ktorý zaručuje, že produkt ostane v ER (Wandelt a kol., Plánt J. 2(1992), 181 - 192). Skonštruovaná expresná kazeta sa klonovala do binárneho vektora pGSGLUC 1 (Saito a kol., Plánt Celí Rep. 8 (1990), 718 - 721) a transferovala sa do kmeňa Agrobacterium EHA 101 elektroporáciou. Na následnú transformáciu Nicotiana tabacum sa použili rekombinantné agrobakteriálne klony. Regenerovalo sa približne 100 rastlín tabaku. Z regenerovaných transgénnych rastlín tabaku sa zozbieral listový materiál v rôznych vývojových štádiách. Rozpustné proteíny boli získané z tohto listového materiálu vo vodnom tlmivom systéme po extrakcii. Následné analýzy (western blot analýzy a ELISA) demonštrovali, že v listoch sa získala maximálna akumulácia viac ako 2 % biologicky aktívneho polypeptidu scFv-antiBAS 490F viažuceho antigén. Tieto vysoké hodnoty expresie sa určili v plne narastených zelených listoch, ale proti,átkový fragment bol zistený aj v starnúcom listovom materiáli.
Príklad 5
PCR amplifikácia fragmentu cDNA kódujúceho jednoreťazcovú protilátku proti BAS 490F pomocou syntetických oligonukleotidov.
PCR amplifikácia jednoreťazcovej protilátkovej cDNA sa uskutočnila v DNA termálnom cyklovači Perkin Elmer. Reakčné zmesi obsahovali 8 ng/μΙ jednovláknovej šablónovej cDNA, 0,5 μΜ relevantných oligonukleotidov, 200 μΜ nukleotidov (Pharmacia), 50 mM KCI, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3 pri 25 °C, 1,5 mM MgCI2) a 0,02 U/μΙ Taq polymerázy (Perkin Elmer). Podmienky amplifikácie boli nasledovné:
Teplota žíhania: 45 °C
Denaturačná teplota: 94 °C,
Elongačná teplota: 72 °C,
Počet cyklov: 40
Výsledkom je fragment približne 735 bázových párov, ktorý bol ligovaný do vektora pBluescript. Ligačná zmes sa použila na transformáciu E. coli XL-I Blue a plazmid sa amplifikoval. V súvislosti s použitím a optimalizáciou polymerázovej reťazovej reakcie pozrite: Innis et al., 1990, PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press.
Príklad 6
Produkcia transgénnych rastlín tabaku, ktoré exprimujú cDNA kódujúcu jednoreťazcovú protilátku s vlastnosťami viazania fungicídu.
Plazmid pGSGLUC 1 sa transformoval do Agrobacterium tumefaciens C58G1:pGV2260. Na transformovanie rastlín tabaku (Nicotiana tabacum cv. Samsun NN) sa použilo zriedenie 1 : 50 kultivácie zo dňa na deň pozitívne transformovanej agrobakteriálnej kolónie v médiu Murashige-Skoog (Physiol. Plánt. 15 (1962) 473 et seq.) obsahujúcom 2% sacharózy (2MS médium). V Petriho miske sa inkubovali listové disky sterilných rastlín (každý približne 1 cm2) počas 5 10 minút pri agrobakteriálnom zriedení 1 : 50. Potom nasledovala dvojdňová inkubácia v tme pri 25 °C na médiu 2MS obsahujúcom 0,8 % Bacto-Agaru. Kultivácia pokračovala po 2 dňoch pri 16 hodinách svetla a 8 hodinách tmy a pokračovala v týždennom rytme na MS médiu obsahujúcom 500 mg/l Claforanu (cefotaxim-nátrium), 50 mg/l kanamycínu, 1 mg/l benzylaminopurínu (BAP), 0,2 mg/l kyseliny naftyloctovej a 1,6 g/l glukózy. Rastúce výhonky sa preniesli do MS média obsahujúceho 2 % sacharózy, 250 mg/l Claforanu a 0,8 % Bacto-Agaru.
Príklad 7
Stabilná akumulácia jednoreťazcového protilátkového fragmentu proti fungicídu BAS 490F v endoplazmatickom retikulu.
Východiskovým bodom skúmania bol jednoreťazcový protilátkový fragment proti fungicídu BAS 490F (scFv-antiBAS 490F), ktorý sa exprimuje v rastlinách tabaku. Množstvo a aktivita syntetizovaného polypeptidu scFv-antiBAS 490F sa určili pomocou Western blot analýz a ELISA.
Aby sa umožnila expresia génu scFv-antiBAS 490F v endoplazmatickom retikulu, cudzí gén sa exprimoval pod kontrolou promótora CaMV 53S ako translačná fúzia so signálovým peptidom LeB4 (N-koniec) a ER retenčným signálom KDEL (C-koniec). Transport polypeptidu scFv-antiBAS 490F do endoplazmatického retikula umožnil stabilnú akumuláciu veľkých množstiev aktívneho protilátkového fragmentu. Po zozbieraní listového materiálu sa rezy zmrazili pri -20 °C (1), lyofilizovali (2) alebo vysušili pri teplote miestnosti (3). Rozpustné proteíny sa získali z listového materiálu extrakciou vo vodnom tlmivom roztoku a polypeptid scFv-antiBAS 490F sa vyčistil afinitnou chromatografiou. Na určenie aktivity protilátkového fragmentu sa použili rovnaké množstvá vyčisteného polypeptidu scFv-antiBAS 490F (zmrazeného, lyofilizovaného a vysušeného) (obr. 6). Obr. 6A zobrazuje aktivitu viazania antigénu pre polypeptid scFv-antiBAS 490F purifikovaný z čerstvých (1), lyofilizovaných (2) a vysušených listov (3). Na obr. 6B sa príslušné množstvá proteínu scFv-antiBAS 490F (približne 100 ng), ktoré sa použili na analýzy ELISA, určili pomocou analýz Western blot. Veľkosti štandardov molekulovej hmotnosti proteínu sú uvedené vľavo. Zistili sa približne identické aktivity viazania antigénu.
Príklad 8
Aby sa demonštrovala tolerancia voči fungicídom pre transgénne rastliny tabaku, ktoré produkujú polypeptid s vlastnosťami viazania fungicídu, tieto tabakové rastliny sa ošetrili rôznymi množstvami BAS 490F. Vo všetkých prípadoch bolo možné v skleníku preukázať, že rastliny exprimujúce gén scFv-antiBAS 490F vykazovali vyššiu toleranciu voči fungicídu BAS 490F a menej výrazné fytotoxické účinky v porovnaní s kontrolou.
Claims (20)
1. Postup na prípravu rastlín tolerantných voči metyl metoxyimino-a-(o-tolyloxy)o-tolylacetátu (BAS 490F), vyznačujúci sa tým, že pozostáva z expresie exogénneho polypeptid u viažuceho metyl metoxyimino-a-(o-tolyloxy)-otolylacetát (BAS 490F) v rastline.
2. Postup podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že exogénnym polypeptidom viažucim metyl metoxyimino-a-(o-tolyloxy)-o-tolylacetát (BAS 490F) je fragment jednoreťazcovej protilátky.
3. Postup podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že exogénnym polypeptidom viažucim metyl metoxyimino-a-(o-tolyloxy)-o-tolylacetát (BAS 490F) je úplná protilátka alebo fragment z nej odvodený.
4. Expresná kazeta pre rastliny, vyznačujúca sa tým, že pozostáva z promótora, signálneho peptidu, génu kódujúceho expresiu exogénneho polypeptidu viažuceho metyl metoxyimino-a-(o-tolyloxy)-o-tolylacetát (BAS 490F), ER retenčného signálu a terminátora.
5. Expresná kazeta podľa nároku 4, vyznačujúca sa tým, že použitým konštitučným promótorom je promótor CaMV 35S.
6. Expresná kazeta podľa nároku 4, vyznačujúca sa tým, že gén, ktorý sa má exprimovať, je gén fragmentu jednoreťazcovej protilátky.
7. Expresná kazeta podľa nároku 4, vyznačujúca sa tým, že ako gén, ktorý sa má exprimovať, sa používa gén alebo génový fragment polypeptidu viažuceho metyl metoxyimino-a-(o-tolyloxy)-o-tolylacetát (BAS 490F) vo forme translačnej fúzie s inými funkčnými proteínmi, napríklad enzýmami, toxínmi, chromoformi a viažucimi proteínmi.
8. Expresná kazeta podľa nároku 4, vyznačujúca sa tým, že gén, ktorý sa má exprimovať, sa získa z hybridómovej bunky alebo pomocou iných rekombinantných metód, napríklad metódou protilátkového fágového displeja.
9. Použitie expresnej kazety podľa nároku 4 na transformáciu dvojklíčnych alebo jednoklíčnych rastlín, ktoré konštitučné exprimujú exogénny polypeptid viažuci metyl metoxyimino-a-(o-tolyloxy)-o-tolylacetát (BAS 490F) semenovo alebo listovo špecificky.
10. Použitie podľa nároku 9, kde expresná kazeta je transferovaná do bakteriálneho kmeňa a získané rekombinantné klony sa používajú na transformáciu dvojklíčnych alebo jednoklíčnych rastlín, ktoré konštitučné exprimujú exogénny polypeptid viažuci metyl metoxyimino-a-(o-tolyloxy)-otolylacetát (BAS 490F) semenovo alebo listovo špecificky.
11. Použitie expresnej kazety podľa nároku 4 vo funkcii selekčného markera.
12. Použitie transformovanej rastliny získanej v súlade s nárokom 10 na prípravu polypeptidu viažuceho metyl metoxyimino-a-(o-tolyloxy)-o-tolylacetát (BAS 490F).
13. Postup transformácie rastliny zavedením génovej sekvencie, vyznačujúci sa tým, že sa kóduje polypeptid viažuci metyl metoxyimino-a-(o-tolyloxy)-otolylacetát (BAS 490F) do rastlinnej bunky, do kalusového pletiva, celej rastliny a protoplastov rastlinných buniek.
14. Postup podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým, že transformácia sa uskutočňuje pomocou agrobaktérie, najmä druhu Agrobacterium tumefaciens.
15. Postup podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým, že transformácia sa uskutočňuje pomocou elektroporácie.
16. Postup podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým, že transformácia sa uskutočňuje pomocou metódy bombardovania časticami.
17. Príprava polypeptidu viažuceho metyl metoxyimino-a-(o-tolyloxy)-o-tolylacetát (BAS 490F), vyznačujúca sa tým, že pozostáva z expresie génu, ktorý kóduje tento polypeptid v rastline alebo bunkách rastliny a potom izoláciou tohto polypeptidu.
18. Rastlina obsahujúca expresnú kazetu podľa nároku 4, vyznačujúca sa tým, že expresná kazeta poskytuje toleranciu voči metyl metoxyimino-a-(o-tolyloxy)-otolylacetátu (BAS 490F).
19. Spôsob kontroly fýtopatogénnych húb u hospodárskych transgénnych rastlín tolerantných voči metyl metoxyimino-a-(o-tolyloxy)-o-tolylacetátu (BAS 490F), vyznačujúci sa tým, že obsahuje použitie metyl metoxyimino-a-(o-tolyloxy)-otolylacetátu (BAS 490F), proti ktorému táto hospodárska rastlina vytvára polypeptidy alebo protilátky viažuce metyl metoxyimino-a-(o-tolyloxy)-otolylacetát (BAS 490F).
20. Polypeptid alebo protilátka viažuca metyl metoxyimino-a-(o-tolyloxy)-otolylacetát (BAS 490F) alebo protilátka s vysokou afinitou viazania voči metyl metoxyimino-a-(o-tolyloxy)-o-tolylacetátu (BAS 490F), ktorá je vyrobená podľa nároku 17.
1/6
Obr. 1 Diagram kazety pre semenovo špecifickú expresiu génu scFV
0U3P prarótar temdnator CäW 35
O signál. p^tid LS4é£3 jstaetäaocvý Fv E3 c-nyc-Täg
2/6
Obr. 2 Diagram kazety na expresiu génu scFv v listoch transgénnych rastlín tabaku.
Dpcarótcr CäW 35S {$3 téminátoŕ CäM/ 35 ^signál, pqptid Jj=B4 jeäxostäaaaý IV
3/6
Obr. 3
Diagram konštrukcie génu scFv-antiBAS 490F (V - variabilný región, L - linker)
4/6
Obr. 4
Funkčná charakterizácia scFv-antiBAS 490F v priamej ELISA
5/6
PV fWl-W
Obr. 5 Diagram kazety pre semenovo špecifickú expresiu génu scFv-anti-BAS 490F
□pranótnrLä34 00 tamiratcr C&M7 35 jedtaetezraýBV
E3 onyo-Täg
6/6
PV «Η-Ή
Obr. 6 Detekcia existujúcej aktivity viazania antigénu . v protilátkovom fragmente scFv-anti-BAS 490F v listoch po vysušení alebo lyofilizácii pomocou analýz ELISA.
Obr. 6A ukazuje aktivitu viazania antigénu pre polypeptid scFv-anti-BAS 490F z čerstvých (1), lyofilizovaných (2) a vysušených (3) listov.
Obr. 6B ukazuje príslušné množstvá proteínu scFv-anti-BAS 490F (približne 100 ng), použité na analýzy ELISA, určené pomocou analýz Western blot. Veľkosti štandardov molekulovej hmotnosti proteínu sú uvedené vľavo.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19718251A DE19718251A1 (de) | 1997-04-30 | 1997-04-30 | Expression von Fungizid-bindenden Polypeptiden in Pflanzen zur Erzeugung von Fungizidtoleranz |
| PCT/EP1998/002242 WO1998049329A1 (de) | 1997-04-30 | 1998-04-16 | Expression von fungizid-bindenden polypeptiden in pflanzen zur erzeugung von fungizidtoleranz |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK137299A3 true SK137299A3 (en) | 2000-05-16 |
Family
ID=7828212
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK1372-99A SK137299A3 (en) | 1997-04-30 | 1998-04-16 | Expression of fungicide-binding polypeptides in plants for producing fungicide tolerance |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0979295A1 (sk) |
| JP (1) | JP2001523101A (sk) |
| KR (1) | KR20010020387A (sk) |
| CN (1) | CN1254381A (sk) |
| AR (1) | AR015626A1 (sk) |
| AU (1) | AU737242B2 (sk) |
| BG (1) | BG103840A (sk) |
| BR (1) | BR9808698A (sk) |
| CA (1) | CA2288432A1 (sk) |
| DE (1) | DE19718251A1 (sk) |
| EA (1) | EA199900889A1 (sk) |
| GE (1) | GEP20032959B (sk) |
| HU (1) | HUP0003594A3 (sk) |
| ID (1) | ID22915A (sk) |
| IL (1) | IL132252A0 (sk) |
| NO (1) | NO995291L (sk) |
| NZ (1) | NZ500181A (sk) |
| PL (1) | PL336661A1 (sk) |
| SK (1) | SK137299A3 (sk) |
| TR (1) | TR199902681T2 (sk) |
| WO (1) | WO1998049329A1 (sk) |
| ZA (1) | ZA983594B (sk) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10033750A1 (de) * | 2000-07-12 | 2002-01-31 | Mpb Cologne Gmbh Molecular Pla | Pathogenresistenz in Organismen |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IT1248361B (it) * | 1991-06-28 | 1995-01-05 | Enea | Vettori plasmidici per l'espressione di geni in piante |
| IL109159A (en) * | 1993-03-29 | 2003-11-23 | Isk Biotech Corp | Immunoassays for tetrachloroiso-phthalonitrile and its metabolites and antibodies for use therein |
-
1997
- 1997-04-30 DE DE19718251A patent/DE19718251A1/de not_active Withdrawn
-
1998
- 1998-04-16 GE GEAP19985103A patent/GEP20032959B/en unknown
- 1998-04-16 AU AU73356/98A patent/AU737242B2/en not_active Ceased
- 1998-04-16 CN CN98804679A patent/CN1254381A/zh active Pending
- 1998-04-16 BR BR9808698-7A patent/BR9808698A/pt not_active IP Right Cessation
- 1998-04-16 PL PL98336661A patent/PL336661A1/xx unknown
- 1998-04-16 EP EP98920534A patent/EP0979295A1/de not_active Withdrawn
- 1998-04-16 CA CA002288432A patent/CA2288432A1/en not_active Abandoned
- 1998-04-16 EA EA199900889A patent/EA199900889A1/ru unknown
- 1998-04-16 JP JP54654298A patent/JP2001523101A/ja active Pending
- 1998-04-16 IL IL13225298A patent/IL132252A0/xx unknown
- 1998-04-16 NZ NZ500181A patent/NZ500181A/en unknown
- 1998-04-16 KR KR1019997010009A patent/KR20010020387A/ko not_active Ceased
- 1998-04-16 SK SK1372-99A patent/SK137299A3/sk unknown
- 1998-04-16 TR TR1999/02681T patent/TR199902681T2/xx unknown
- 1998-04-16 ID IDW991291A patent/ID22915A/id unknown
- 1998-04-16 HU HU0003594A patent/HUP0003594A3/hu unknown
- 1998-04-16 WO PCT/EP1998/002242 patent/WO1998049329A1/de not_active Ceased
- 1998-04-29 ZA ZA9803594A patent/ZA983594B/xx unknown
- 1998-04-30 AR ARP980102047A patent/AR015626A1/es not_active Application Discontinuation
-
1999
- 1999-10-28 BG BG103840A patent/BG103840A/bg unknown
- 1999-10-29 NO NO995291A patent/NO995291L/no not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1254381A (zh) | 2000-05-24 |
| ID22915A (id) | 1999-12-16 |
| EP0979295A1 (de) | 2000-02-16 |
| HUP0003594A2 (hu) | 2001-02-28 |
| NO995291D0 (no) | 1999-10-29 |
| HUP0003594A3 (en) | 2002-10-28 |
| NO995291L (no) | 1999-12-20 |
| NZ500181A (en) | 2001-02-23 |
| JP2001523101A (ja) | 2001-11-20 |
| DE19718251A1 (de) | 1998-11-05 |
| EA199900889A1 (ru) | 2001-04-23 |
| GEP20032959B (en) | 2003-04-25 |
| TR199902681T2 (xx) | 2000-07-21 |
| WO1998049329A1 (de) | 1998-11-05 |
| PL336661A1 (en) | 2000-07-03 |
| AR015626A1 (es) | 2001-05-16 |
| BR9808698A (pt) | 2000-07-11 |
| AU7335698A (en) | 1998-11-24 |
| KR20010020387A (ko) | 2001-03-15 |
| AU737242B2 (en) | 2001-08-16 |
| CA2288432A1 (en) | 1998-11-05 |
| BG103840A (bg) | 2000-07-31 |
| ZA983594B (en) | 1999-10-29 |
| IL132252A0 (en) | 2001-03-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6506278B2 (ja) | マイクロペプチド及び遺伝子発現をモジュレートするためのその使用 | |
| CZ143589A3 (cs) | Způsob výroby v podstatě čisté chemicky regulovatelné DNA | |
| ES2365602T3 (es) | Proteínas oligoméricas tipo chaperona, estables a desnaturalizantes y/o resistentes a proteasa, polinucleótidos que codifican las mismas y sus usos. | |
| JP2002508665A (ja) | 受容体キナーゼＢｉｎ１ | |
| Saalbach et al. | High-level expression of a single-chain Fv fragment (scFv) antibody in transgenic pea seeds | |
| JP2002532114A (ja) | トランスジェニック植物およびその作出法 | |
| JP7010819B2 (ja) | 除草剤耐性を有する形質転換植物 | |
| Farran et al. | High‐density seedling expression system for the production of bioactive human cardiotrophin‐1, a potential therapeutic cytokine, in transgenic tobacco chloroplasts | |
| WO2014036806A1 (zh) | 一种具有草甘膦耐性的基因及其应用 | |
| CN111518186A (zh) | 植物抗盐蛋白MsVNI1及编码基因和应用 | |
| JPH11507232A (ja) | 機能的ヒト２−５ａ系を同時発現するトランスジェニック植物 | |
| US7951992B2 (en) | Metal resistant plants, and methods of manufacture thereof | |
| SK137299A3 (en) | Expression of fungicide-binding polypeptides in plants for producing fungicide tolerance | |
| JP2003230379A (ja) | ｄｓＲＮＡ−結合タンパク質を発現するトランスジェニック植物および動物宿主におけるウイルスおよびウイロイドに対する抵抗性 | |
| AU2021479356B2 (en) | Mutated hydroxyphenylpyruvate dioxygenase polypeptide, and coding gene and use thereof | |
| CZ382199A3 (cs) | Produkce rostlin tolerantních k fungicidům expresí polypeptidů vázajících fungicidy v rostlině | |
| SK126499A3 (en) | Expression of herbicide-binding polypeptides in plants to produce herbicide tolerance | |
| WO2006057306A1 (ja) | ストレス耐性及び／又は生産性を改良したイネ科植物、及びその作出方法 | |
| CN110396125B (zh) | 拟南芥转录因子基因pif3在植物抗虫胁迫中的应用 | |
| MXPA01009823A (es) | Vectores virales de insectos y usos de los mismos. | |
| ES2265671T3 (es) | Produccion de proteinas en plantas de alfalfa transgenicas. | |
| CN111944830B (zh) | 一种抗除草剂基因及其构建的载体、表达的多肽和基因的应用 | |
| US20030014774A1 (en) | Transgenic rice plant and its family with environmental stress resistant by proline accumulation of high level and its production | |
| CN1317054A (zh) | 组成型抗病性基因(cdr1)及其使用方法 | |
| US20150353951A1 (en) | Synthetic glyphosate-resistant gene and use thereof |