SK12362000A3 - Prostriedky na báze proteínov matrice na hojenie rán - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Predkladaný vynález sa týka použitia matrice zubnej skloviny, derivátov matrice zubnej skloviny a/alebo proteínov matrice zubnej skloviny ako terapeutických alebo profylaktických činidiel. Substancie sú aktívne ako činidlá zlepšujúce hojenie rán, ako antibakteriálne a/alebo protizápalové činidlá.

Doterajší stav techniky

Proteíny matrice zubnej skloviny sú dobre známe ako prekurzory zubnej skloviny. V patentovej literatúre bolo opísané, že proteíny zubnej skloviny a deriváty matrice zubnej skloviny indukujú tvorbu tvrdých tkanív (tzn. tvorbu zubnej skloviny,

U.S. patent č. 4672032 (Slavkin)) alebo väzbu tvrdých tkanív (EP-B-0337967 a EP-B-0263086). Predchádzajúce výskumy v tomto odbore boli teda zamerané iba na regeneráciu tvrdých tkanív, zatial čo predkladaný vynález sa týka ďalších výhodných účinkov na hojenie rán v mäkkých tkanivách a antibakteriálnych a protizápalových účinkov týchto substancií, ktoré sú neočakávaným objavom.

Podstata vynálezu

Predkladaný vynález je založený na objave, že matrice zubnej skloviny, deriváty matrice zubnej skloviny a/alebo proteíny matrice zubnej skloviny (ďalej je tu pre matricu zubnej skloviny, deriváty matrice zubnej skloviny a proteíny zubnej skloviny používaný výraz aktívne substancie zubnej skloviny) sú výhodné činidlá na zosilnenie alebo zlepšenie hojenia rán v mäkkých tkanivách (tzn. nemineralizovaných tkanivách), ako sú napríklad tkanivá obsahujúce kolagén alebo epitel, vrátane kože a slizníc, svalov, krvných a lymfatických ciev, nervového tkaniva, žliaz, šliach, oka a chrupiek. Ak je tu uvedené v časti príkladov, sú matrice zubnej skloviny, deriváty matrice zubnej skloviny a/alebo proteíny matrice zubnej skloviny osobitne účinné v hojení alebo profylaxii rán v mäkkých tkanivách.

V súlade s tým sa vynález týka použitia prípravku aktívnej substancie zubnej skloviny na prípravu farmaceutických alebo kozmetických prostriedkov pre: (i) hojenie rán; (ii) zlepšenie hojenia rán; a/alebo (iii) regeneráciu a/alebo reparáciu mäkkých tkanív.

V inom aspekte sa vynález týka spôsobu zlepšenia hojenia rán alebo na podporenie regenerácie a/alebo reparácie mäkkých tkanív, kde uvedený spôsob obsahuje podanie terapeuticky alebo profylaktický účinného množstva aktívnej substancie zubnej skloviny jedincovi, ktorý potrebuje takú liečbu.

Ďalej bolo zistené, že matrice zubnej skloviny, deriváty matrice zubnej skloviny a proteíny matrice zubnej skloviny majú antibakteriálne a/alebo protizápalové vlastnosti, ktoré môžu byt využité na liečbu ochorení ako mäkkých, tak tvrdých (tzn. mineralizovaných) tkanív.

V inom aspekte sa vynález týka použitia prípravkov aktívnej substancie zubnej skloviny na prípravu farmaceutického prostriedku na prevenciu a/alebo liečbu infekčných alebo zápalových stavov.

Hojenie rán

Rany a/alebo vredy sa zvyčajne nachádzajú na koži alebo na povrchu slizníc alebo vznikajú v dôsledku Infarktu orgánu (ischémie). Rana môže byt dôsledkom defektu v mäkkých tkanivách alebo lézie alebo základného ochorenia. Regenerácia experimentálne vyvolaných defektov periodontu bola vynálezcami opísaná skôr a nespadá do rozsahu predkladaného vynálezu. Termín koža, ako je tu použitý, označuje vonkajší povrch tela živočícha vrátane človeka a zahŕňa intaktnú alebo takmer intaktnú kožu, takisto ako poranenú kožu. Termín sliznica označuje nepoškodenú alebo poškodenú sliznicu živočícha, ako napríklad človeka, a zahŕňa ústnu, bukálnu, ušnú, nosnú, plúcnu, očnú, gastrointestinálnu, vaginálnu alebo rektálnu sliznicu.

Termín rana, ako je tu použitý, označuje poranenia s narušením normálnej integrity tkanivových štruktúr. Termín tiež zahŕňa termíny lézie, nekrózy a vredy. Termín vred je označenie pre takmer akúkoívek léziu na koži alebo na sliznici a označuje lokálny defekt alebo exkaváciu na povrchu orgánu alebo tkaniva, ktorý vzniká odlučovaním nekrotického tkaniva. Lézia je všeobecne akýkolvek tkanivový defekt. Nekróza označuje tkanivo odumreté v dôsledku infekcie, poranenia, zápalu alebo Infarktu.

Termín rana, ako je tu použitý, označuje akúkoívek ranu (klasifikácia rán je uvedená dľalej) v akomkolvek štádiu hojenia, vrátane stavu pred zahájením hojenia alebo aj stavu pred vznikom špecifickej rany, ako je napríklad chirurgická incisia (profylaktická terapia).

Príkladmi rán, ktoré môžu byť preventívne a/alebo terapeuticky liečené spôsobom podlá predkladaného vynálezu, sú napríklad aseptické rany, zmliaždené rany, rezné rany, tržné rany, nepenetrujúce rany (tzn. rany, pri ktorých nie je porušená koža, ale je poranenie hlbšie uložených štruktúr), otvorené rany, penetrujúce rany, perforujúce rany, bodné rany, septické rany, podkožné rany atd. Príkladmi vredov sú preleženiny, herpetická gingivostomatitída, defekty vzniknuté pôsobením chrómu, omrzliny, otlaky a podobne. Príkladmi vredov sú ďalej napríklad peptické vredy, dvanástnikové vredy, žalúdočné vredy, vredy spojené s dnou, diabetické vredy, ischemické vredy, vredy z hypostázy, holeňové vredy (venózne vredy), sublinguálne vredy, podsliznicové vredy, symptomatické vredy, trofické vredy, tropické vredy, vredy pri pohlavných chorobách, napríklad pri kvapavke (vrátane uretritídy, endocervitídy a proctitídy). Medzi stavy súvisiace s ranami alebo vredmi, ktoré môžu byť úspešne liečené spôsobom podľa predkladaného vynálezu, patria popáleniny, antrax, tetanus, plynatá gangréna, spála, erysipel, sycosis barbae, foliculitis, impetigo contagiosa alebo impetigo bullosa apod. Často sa použitie termínov rana a vred a prekrýva a ďalej sú tieto termíny často používané náhodne. Ako bolo uvedené hore, v predkladanom vynáleze zahŕňa termín rana termíny vred, lézie a infarkt a tieto termíny sú používané zameniteľné, pokiaľ to nie je výslovne uvedené inak.

Medzi rany, ktoré môžu byť liečené spôsobom podľa predkladaného vynálezu, patria tiež (i) všeobecné rany, ako sú chirurgické, traumatické, infekčné, ischemické, termálne, chemické a bulózne rany; (ii) rany špecifické pre orálnu dutinu, ako sú napríklad rany po extrakcii zubu, rany v endodonte, najmä rany súvisiace s liečbou cýst a abscesov, vredov a lézií bakteriálneho, vírusového alebo autoimunitného pôvodu, mechanické, chemické, termálne, infekčné a lichenoidné rany; konkrétnymi príkladmi sú herpetické vredy, stomatitis apthosa, akútna nekrotižujúca ulceratívna gingivitída a syndróm pálenia v ústach; a (iii) rany na koži, ako sú napríklad nádory, popáleniny (napríklad chemické, termálne), lézie (bakteriálne, vírusové, autoimunitné), pohryznutia a chirurgické incisie. Iným spôsobom delenia rán je delenie na (I) rany s malou stratou tkaniva, ako sú rany spôsobené chirurgickou incisiou, drobnou abráziou alebo menším pohryznutím; a (ii) rany s významnou stratou tkaniva. Do druhej skupiny patria ischemické vredy, otlaky, fistuly, lacerácie, ťažšie pohryznutia, popáleniny a rany po odberoch orgánových štepov (v mäkkých a tvrdých tkanivách) a infarkty.

Vplyv aktívnej substancie zubnej skloviny na hojenie rán je významný pre rany prítomné v dutine ústnej. Také rany vznikajú v dôsledku poranenia alebo traumy pri chirurgických zákrokoch v dutine ústnej, vrátane operácií periodontu, extrakcií zubov, endodontickej liečbe, vkladaní zubných implantátov, aplikácie a používaní zubných protéz a podobne. V časti príkladov je demonštrovaný priaznivý efekt aktívnej substancie zubnej skloviny na hojenie takých rán. Ďalej bol pozorovaný vplyv na hojenie mäkkých tkanív.

V dutine ústnej je hojenie rán typu aft, tráum alebo herpetických defektov tiež zlepšené po aplikácii aktívnej substancie zubnej skloviny. Traumatické defekty a herpetické defekty môžu byť samozrejme lokalizované aj inde na tele.

V inom aspekte vynálezu je defekt, ktorý je liečený a/alebo ktorému má byt zabránené, vybraný zo skupiny skladajúcej sa z aseptických rán, infarktov, zmliaždených rán, rezných rán, tržných rán, nepenetrujúcich rán, otvorených rán, penetrujúcich rán, perforujúcich rán, bodných rán, septických rán a podkožných rán.

Ďalšie rany, ktoré sú významné v súvislosti s predkladaným vynálezom, sú rany typu ischemických vredov, otlaky, fistuly, ťažšie pohryznutie, popáleniny a rany vznikajúce po odberu orgánov.

Ischemické vredy a otlaky sa zvyčajne hoja velmi pomaly a najmä v takých prípadoch má zlepšenie a zrýchlenie hojenia značný význam pre pacienta. Ďalej, náklady na liečbu takých pacientov s takými defektmi sú značne znížené, pokial je hojenie zlepšené a prebieha rýchlejšie.

Rany po odbere tkaniva sú rany súvisiace s odstránením tvrdého tkaniva z jedného miesta tela a prenesením tohto tkaniva na iné miesto tela, ako je to napríklad pri transplantáciách. Rany vznikajúce pri takých operáciách sú veľmi bolestivé a zlepšenie hojenia má preto značný význam.

Termín koža je použitý vo veľmi všeobecnom význame a zahŕňa epidermis a - v prípadoch, ked’ je povrch kože viac alebo menej poškodený - tiež dermis. Okrem stratum corneum sa vonkajšia (epitelová) vrstva kože označuje epidermis a hlbšie spojivové tkanivo kože sa označuje dermis.

Pretože je koža časťou tela najviacej vystavenou vonkajším vplyvom, je často miestom rôznych poranení, ako sú napríklad ruptúry, rezné rany, oderky, popáleniny a omrzliny alebo defekty vznikajúce v dôsledku rôznych ochorení. Ďalej, pri nehodách je často poranená veľká časť kože. Avšak, pretože je koža významnou bariérou a má významné fyziologické funkcie, je integrita kože významná pre dobrý stav jedinca a akékoľvek porušenie alebo ruptúra kože predstavuje ohrozenie, ktoré musí telo reparovať na zachovanie existencie.

Okrem kože môžu byť tiež poranené všetky druhy tkanív (tzn. mäkkých a tvrdých tkanív). Poranenia mäkkých tkanív vrátane sliznicových membrán a/alebo kože sú osobitne významné v súvislosti s predkladaným vynálezom.

Hojenie defektov na koži alebo na slizniciach prebieha v mnohých štádiách, ktoré vedú k reparácii alebo regenerácii kože alebo sliznice. V posledných rokoch boli regenerácie a reparácie stanovené ako dva typy hojenia, ktoré môžu prebehnúť. Regenerácia môže byť definovaná ako biologický proces, pri ktorom je celkom obnovená architektúra a funkcie strateného tkaniva. Reparácia je biologický proces, pri ktorom je

Ί kontinuita poraneného tkaniva obnovená novým tkanivom, ktoré nereplikuje štruktúru a funkciu strateného tkaniva.

Väčšina tkanív sa hojí reparáciou, čo znamená, že vytvorené nové tkanivo je štrukturálne a chemicky odlišné od pôvodného tkaniva (jazvové tkanivo. V časnom štádiu reparácie tkaniva je jedným z procesov, ktoré sú takmer vždy prítomné, tvorba prechodného spojivového tkaniva v oblasti zranenia. Tento proces začína tvorbou novej extracelulárnej kolagénovej matrice fibroblastmi. Táto nová extracelulárna kolagénová matrica je potom nosičom pre spojivové tkanivo pri konečnom procese hojenia. Konečným zhojením je, vo väčšine tkanív, tvorba jazvy obsahujúcej spojivové tkanivo. V tkanivách s regeneratívnymi vlastnosťami, ako je napríklad koža a kosť, obsahuje konečné hojenie regeneráciu pôvodného tkaniva. Toto regenerované tkanivo má často určité charakteristiky jazvy, ako je napríklad zosilnenie zhojenej zlomeniny kosti.

Za normálnych okolností má organizmus mechanizmy na hojenie poranenej kože alebo sliznice vedúce k obnoveniu integrity sliznicovej alebo kožnej bariéry. Reparácia aj malých poranení môže trvať hodiny a dni až týždne. Avšak, pri ulceráciách môže byť hojenie veimi pomalé a defekt môže pretrvávať dlhodobo, tzn. mesiace a roky.

Štádiá hojenia rán sú zvyčajne zápal (normálne 1-3 dni), migrácia (normálne 1-6 dní), proliferácia (normálne 3-24 dní) a maturácia (normálne 1-12 mesiacov). Hojenie je komplexný a dobre koordinovaný proces, ktorý zahŕňa migráciu, proliferáciu a diferenciáciu rôznych typov buniek, rovnako ako syntézu zložiek matrice. Hojenie môže byť rozdelené do troch fáz:

(i) Hemostáza a zápal

Ako náhle sa trombocyty dostanú mimo cirkuláciu a do kontaktu s trombínom a kolagénom, tak sa aktivujú a začnú agregovat. Trombocyty teda iniciujú reparačný proces agregáciou a tvorbou prechodnej zrazeniny zaisťujúcou hemostázu a brániacu invázii baktérií. Aktivované trombocyty aktivujú koagulačnú kaskádu a uvoľňujú rastové faktory ako je doštičkový rastový faktor (PDGF) a epidermálne rastové faktory (EGF) a transformujúce rastové faktory (TGF).

Prvými bunkami migrujúcimi do miesta poranenia sú neutrofily, po ktorých nasledujú monocyty, ktoré sú aktivované makrofágy.

Hlavnou úlohou neutrofilov sa zdá byt obrana proti baktériám alebo vyčistenie rany od kontaminujúcich baktérií a zlepšenie hojenia odstraňovaním odumretých buniek a doštičiek. Migrácia neutrofilov ustáva počas prvých 48 hodín za podmienky, že v rane už nie je žiadna bakteriálna kontaminácia. Nadbytok neutrofilov je fagocytovaný tkanivovými makrofágmi vzniknutými z cirkulujúcej zásoby krvných monocytov. Makrofágy sa považujú za zásadné pre účinné hojenie v tom, že sú tiež zodpovedné za fagocytózu patogénnych organizmov a za odstraňovanie bunkovej drviny. Ďalej, makrofágy uvoľňujú veľa faktorov, ktoré sa účastnia ďalšieho procesu hojenia. Makrofágy priťahujú fibroblasty, ktoré začínajú produkovať kolagén.

(ii) Tvorba granulačného tkaniva a reepitelizácia

Počas 48 hodín po poranení začínajú fibroblasty proliferovať a migrovať do oblasti poranenia zo spojivového tkaniva na okrajoch rany. Fibroblasty produkujú kolagén a glykozaminoglykány a ďalej znižujú tlak kyslíka v rane, čím stimulujú proliferáciu buniek endotelu. Endotelové bunky spôsobujú vznik novej kapilárnej siete.

Kolagenázy a aktivátory plazminogénu sú secernované z keratinocytov. Pokial nie je rana narušená a tkanivo je dobre zásobené kyslíkom a živinami, tak migrujú keratinocyty do rany. Predpokladá sa, že keratinocyty migrujú iba nad živé tkanivo a do oblasti pod odumreté tkanivo a pod krustu na rane.

Plocha rany je ďalej zmenšená kontrakciou.

(iii) Remodelovanie kože

Ihneď po dokončení reepitelizácie začína remodelovanie tkaniva. Táto fáza, ktorá trvá niekolko rokov, obnovuje pevnosť poraneného tkaniva.

Všetky hore uvedené procesy hojenia trvajú značný čas. Rýchlosť hojenia je ovplyvnená prítomnosťou infekcie, celkovým zdravotným stavom jedinca, prítomnosťou cudzích telies apod. Niektoré patologické stavy ako je infekcia, macerácia, dehydratácia, špatný celkový zdravotný stav a malnutricia môžu viest k vzniku chronických vredov, ako sú napríklad ischemické vredy.

Kým neprebehne aspoň povrchové zhojenie, pretrváva stále riziko novej infekcie. Preto platí, že čím rýchlejšie je hojenie, tým skôr je toto riziko odstránené.

Preto má značný význam akýkoívek postup, ktorý ovplyvní rýchlosť hojenia rany alebo zlepšenie hojenia rany.

Ďalej, pretože takmer všetky reparačné procesy obsahujú časnú tvorbu spojivového tkaniva, zlepší stimulácia tejto tvorby a následných procesov hojenie tkaniva.

Termín klinické zhojenie, ako je tu použitý, označuje stav, keď nie je vizuálne patrné žiadne narušenie tkaniva a sú prítomné iba mierne známky zápalu, ako je zarudnutie a mierny opuch tkaniva. Ďalej, v pokojnom stave alebo uvolnenom stave nie je prítomná bolesť.

Ako bolo uvedené hore, vynález sa týka použitia matrice zubnej skloviny, derivátov matrice zubnej skloviny a/alebo proteínov zubnej skloviny ako činidiel podporujúcich hojenie rán, tzn. činidiel, ktoré zrýchlujú, stimulujú alebo podporujú hojenie kožných alebo sliznicových rán. Významné je tiež použitie týchto substancií ako činidiel podporujúcich regeneráciu tkaniva a/alebo reparáciu tkaniva. Okrem toho, z dôvodov ovplyvnenia hojenia rany majú matrice zubnej skloviny, deriváty matrice zubnej skloviny a/alebo proteíny zubnej skloviny tiež vplyv na bolesť.

Tradične boli pri starostlivosti o poranenie používané suché obväzy .alebo vysychajúce obväzy. Tieto boli postupne nahradzované nepriedušnými obväzmi udržujúcimi vlhké prostredie. Na úspešnú reparáciu alebo nahradenie poraneného tkaniva musia byť vyvážené procesy hojenia rany, fibrózy a mikrobiálnej invázie. Vela prostriedkov určených na prevenciu infekcie ohrozuje hojenie poranení. Dlhodobé hojenie alebo zápal môžu viesť k vzniku fibrózy. Okrem toho, ako bolo uvedené skôr, sú rastové faktory, ako je epidermálny rastový faktor (EGF), transformujúci rastový faktor-α (TGF-a), doštičkový rastový faktor (PGDF), fibroblastové rastové faktory (FGF) vrátane acidického fibroblastového rastového fakotru (α-FGF) a bázického fibroblastového rastového faktoru (β-FGF), transfor11 mujúci rastový faktor-β (TGF-β), a inzulínu-podobné rastové faktory (IGF-1 a IGF-2), molekulami sprostredkujúcimi proces hojenia a sú často uvádzané ako činidlá vyvolávajúce hojenie rán; avšak, môžu tiež spôsobovať vznik fibrózy, ktorá môže narušiť úspešné hojenie. Aj napriek tomu, že zrýchlení hojenia znižuje riziko infekcie a následný zápal, ktorý môže viesť k tvorbe jazvy, mali terapeutické pokusy o zrýchlenie normálneho hojenia rán relatívne malý úspech. Toto je spôsobené patrne tým, že reparačných procesov sa účastní vela faktorov, ako boli uvedené hore.

Predkladátelia vynálezu pozorovali, že v rôznych bunkových kultúrach fibroblastov (embryonálnych, kožných, z periodontálnych ligamentov, rybích alebo vtáčích) je produkované v kultivačnom médie dvakrát tolko ΤΘΕβΙ pri simulácii EMDOGAINOM^r v porovnaní s nestimulovanými kultúrami, pri testovaní pomocou, napríklad ELISA (pozri príklad 1). Zvýšenie je patrné po 24 hodinách kultivácie, ale najvýraznejšie je po niekolkých dňoch (deň 2 a 3). Po druhom dni je tiež zvýšená proliferácia buniek v bunkových kultúrach stimulovaných EMDOGAINOM^R. Podobné, ale menej výrazné zvýšenie produkcie τσΡβΙ je pozorované pri ludských epitelových bunkách. Pretože sa predpokladá centrálny význam ΤβΡβΙ v epitelizácii povrchu rany, podporujú tieto pozorovania koncept predkladaného vynálezu.

V dutine ústnej je použitie obväzových prostriedkov bežné. Také obväzové prostriedky sú zvyčajne bežných typov, napríklad Surgipads na zastavenie krvácania a Coe-Pack periodontálne obväzy (Coe Laboratories, GC Group, USA) na otvorené rany. Gáza navlhčená antibiotickým roztokom je vkladaná do dutiny po extrakcii zubu a musí byt odstránená po niekolkých dňoch, ked je zahájené hojenie. Vyplachovanie antiseptikami ako je chlórhexidín je pravidelne používané po chirurgických zákrokoch v dutine ústnej. Niekedy sú tiež predpisované celkové alebo lokálne antibiotiká.

Pri liečbe rán musí byt brané v úvahu preventívne opatrenia, ako je zachovanie sterility, predchádzanie kontaminácii, správna aplikácia obväzov/bandáží apod., ktoré zvyčajne vyžadujú, aby bola liečba vykonávaná školenými sestrami. Preto je hojenie rán zvyčajne veľmi nákladné, pokiaľ má byt činidlo podporujúce hojenie aplikované niekoľkokrát za deň. Žiadúcu redukciu nákladov na hojenie rany je preto možné dosiahnuť vtedy, ked je znížená frekvencia aplikácií alebo vtedy, ked je proces hojenia zlepšený tak, že je znížený čas nutný na hojenie rany.

Predkladatelia vynálezu teraz zistili, že matrica zubnej skloviny, deriváty matrice zubnej skloviny a/alebo proteíny zubnej skloviny majú vlastnosti podporujúce hojenie rán. Ďalej existujú dôkazy, že aplikácia matrice zubnej skloviny, derivátov matrice zubnej skloviny a/alebo proteínov zubnej skloviny vedie k zlepšenému hojeniu rán. Konkrétne, vynálezcovia pozorovali, že po aplikácii proteínov matrice zubnej skloviny a/alebo derivátov matrice zubnej skloviny je zápalové štádium skrátené a typické príznaky ako je teplejší povrch, zarudnutie, opuch a bolesť sú menej vyznačené, a nové tkanivo je tvorené rýchlejšie. Pozorovaný čas hojenia rán (napríklad po chirurgickom zákroku) je významne skrátený v porovnaní s chirurgickým zákrokom bez použitia matrice zubnej skloviny, derivátov matrice zubnej skloviny a/alebo proteínov matrice zubnej skloviny.

Terapeutická a/alebo profylaktická aktivita matrice zubnej skloviny, derivátov matrice zubnej skloviny a/alebo proteínov matrice zubnej skloviny môže byť samozrejme dokázaná v in vivo testoch na pokusných zvieratách alebo na ľudoch (pozri časť príkladov uskutočnenia vynálezu). Avšak, dôkazy účinnosti a/alebo aktivity matrice zubnej skloviny, derivátov matrice zubnej skloviny a/alebo proteínov matrice zubnej sklo13 viny môžu byť získané vykonaním relatívne jednoduchých testov in vitro, napríklad testovaním na bunkových kultúrach.

Ďalej existuje niekolko parametrov, ktoré môžu byť použité na hodnotenie efektu na hojenie rán. Medzi tieto parametry patrí:

- počítačová planimetria (hodnotenie rýchlosti hojenia otvorenej rany);

- laserové dopplerové zobrazenie (hodnotenie perfúzy rany);

- tenziometria (hodnotenie pevnosti rany);

- histopatológia/cytológia (mikroskopické hodnotenie tkanív a kvapalín z rany);

- biochemické vyšetrenia (HPLC/RIA) (hodnotenie rôznych liekov a biochemických zložiek v hojacom sa tkanive);

- elektrodiagnostika (hodnotenie vzťahov medzi hojením rany a inerváciou);

- scintigrafia (rádionuklidové zobrazenie tkanív v rane).

Pri hojení rán/vredov má značný význam odstraňovanie tkanivivej drviny a čistenie rany. Predpokladá sa, že čistenie rany a/alebo odstraňovanie tkanivovej drviny z rán/vredov sú nutnými podmienkami pre proces hojenia a ďalej, že pokial sú aplikované činidlá podporujúce hojenie, tak musia byt aplikované na čerstvé a vitálne tkanivo a nie na odumreté tkanivo alebo na kontaminované tkanivo. Odstraňovanie nekrotického tkaniva môže byt vykonané aspoň štyrmi rôznymi spôsobmi: (i) odstraňovaním nekrotického tkaniva ostrým nástrojom; (ii) mechanickým odstraňovaním; (iii) enzymatickým odstraňovaním; a (iv) autolytickým odstraňovaním odumretého tkaniva.

Preto sa predkladaný vynález týka tiež použitia spôsobu odstraňovania nekrotického tkaniva v kombinácii s použitím matrice zubnej skloviny, derivátov matrice zubnej skloviny a/alebo proteinov matrice zubnej skloviny na hojenie alebo prevenciu rán. Taká kombinovaná terapia obsahuje nasledujúce dva kroky: (i) spôsob odstránenia nekrotického tkaniva; (ii) aplikáciu matrice zubnej skloviny, derivátu matrice zubnej skloviny a/alebo proteínov matrice zubnej skloviny; a tieto dva kroky môžu byť vykonávané tolkokrát, koľkokrát je to potrebné a v akomkoľvek poradí.

Ako náhle je nekrotické tkanivo odstránené z rany, môžu byť matrice zubnej skloviny, deriváty matrice zubnej skloviny a/alebo proteiny matrice zubnej skloviny aplikované buď priamo na alebo do rany, alebo môžu byť aplikované vo forme akéhokoľvek vhodného farmaceutického prostriedku, ako je napríklad suchý alebo vlhký obväz, do ktorého boli zapracované matrice zubnej skloviny, deriváty matrice zubnej skloviny a/alebo proteiny matrice zubnej skloviny. Matrice zubnej skloviny, deriváty matrice zubnej skloviny a/alebo proteiny matrice zubnej skloviny môžu byt samozrejme aplikované pri čistení rany.

Ako bude uvedené ďalej, matrice zubnej skloviny, deriváty matrice zubnej skloviny a/alebo proteiny matrice zubnej skloviny môžu byt použité samotné alebo môžu byť použité vo vhodnom prípravku alebo vo farmaceutickom prostriedku.

Zníženie.rizika infekcie

V ďalšom aspekte predkladaného vynálezu sú matrice zubnej skloviny, deriváty matrice zubnej skloviny a/alebo proteiny matrice zubnej skloviny použité ako terapeutické alebo profylaktické činidlá majúce antimikrobiálny efekt. Matrice zubnej skloviny, deriváty matrice zubnej skloviny a/alebo proteiny matrice zubnej skloviny vykazujú účinok znižujúci riziko infekcie.

V týchto súvislostiach označuje termín zníženie rizika infekcie liečebný alebo preventívny účinok matrice zubnej skloviny, derivátov matrice zubnej skloviny a/alebo proteínov matrice zubnej skloviny na infekciu tkaniva u jedinca vtedy, kedf je jedinec alebo tkanivo liečené matricou zubnej skloviny, derivátmi matrice zubnej skloviny a/alebo proteínmi matrice zubnej skloviny.

Termín infekcia označuje inváziu a množenie mikroorganizmov v telesných tkanivách alebo akumuláciu mikroorganizmov v tkanivách, ktoré môžu byť klinicky neznatelné alebo ktoré môže viesť k lokálnemu poškodeniu buniek v dôsledku kompetitívneho metabolizmu, pôsobeniu enzýmov, toxínov, intracelulárnej replikácie alebo reakcie antigén-protilátka.

V predkladanom vynáleze môže byť infekcia, ktorá je liečená alebo ktorej má byt zabránené, spôsobená mikroorganizmami. Medzi mikroorganizmy významné v súvislosti s predkladaným vynálezom patria baktérie, vírusy, kvasinky, plesne, protozoá a prvoky.

V tejto súvislosti znamená výraz antibakteriálny účinok to, že rast baktérií je potlačený alebo to, že baktérie sú deštruované. Termín nie je obmedzený na určité baktérie, ale týka sa baktérií všeobecne. Avšak, vynález je zameraný,.na: (i) patogénne baktérie, ktoré vyvolávajú ochorenie u cicavcov vrátane ludí; a/alebo (ii) na baktérie, ktoré sú normálne prítomné v tele cicavcov a ktoré môžu spôsobiť ochorenie za určitých podmienok.

V súlade s tým sa predkladaný vynález týka použitia aktívnej substancie zubnej skloviny na prevenciu alebo liečbu bakteriálnej infekcie na povrchu tela ako je napríklad koža, sliznica alebo povrch nechtu alebo zubu.

Všeobecný a konkrétny opis bakteriálnych infekcií, ktoré môžu byt liečené

Matrica zubnej skloviny, deriváty matrice zubnej skloviny a/alebo proteíny matrice zubnej skloviny môžu byt použité na liečbu infekcií spôsobených baktériami súčasne s alebo bez antimikrobiálnych činidiel. Medzi Gram-negatívne baktérie, ktoré môžu byt liečené aktívnou substanciou zubnej skloviny, patria koky, ako je Neisseriae (napríklad N. meningitis, N. gonorrhoeae) a Acinetobacter, alebo tyčinky, ako sú Bacteroides (napríklad B. fragilis), Bordetella (napríklad B.pertussis), Brucela (napríklad B. melitentis, B.abortus Bang, B.suis), Campylobacter (napríklad C.jejuni, C. coli, C. fetus), Citrobacter, Enterobacter, Escherichia (napríklad E. coli), Haemophilus (napríklad H. influenzae, H.parainfluenzae), Klebsiella (napríklad K.pneumoniae), Leginella (napríklad L.pneumophila), Pasteurella (P. yersinia, P. multocida), Proteus (napríklad P. mirabilis, P.vulgaris), Pseudomonas (napríklad P. aeruginosa, P.mallei, P. pseudomallei), Salmonella (napríklad S. enteritidis, S.infantis, S.dublin, S.typhi, S.paratyphi, S.schottmulleri, S.cholerasuis, S. typhimurium alebo akákoľvek z 2500 ďalších sérotypov), Serratia (napríklad S. marcences, S. liquifaciens), Shigella (napríklad S.sonnei, S.flexneri, S.dysenteriae, S.boydii), Vibrio (napríklad V. cholerae, V.el tor) a Yersinia (napríklad Y. enterocolitica, Y.pseudotuberculosis, Y.pestis). Medzi Gram-pozitívne baktérie, ktoré môžu byt liečené aktívnou substanciou zubnej skloviny, patria koky, ako je Streptococcus (napríklad S.pneumoniae, S. viridans, S.faecalis, S.pyogenes), Staphylococcus (napríkad S. aureus, S.epidermidis, S. saprophyticus, S.albus) a tyčinky, ako sú Actinomyces (napríklad A. israelli), Bacillus (napríklad B. cereus,

B. subtilis, B. anthracis), Clostridium (napríklad C.botulinum,

C. tetani, C.perfringens, C.difficile), Corynebacterium (napríklad C. diphtheriae), Listeria a Providencia. Medzi ďalšie baktérie spôsobujúce infekcie patrí Propionobactéri um acne a Pityosporon ovale.

Matrice zubnej skloviny, deriváty matrice zubnej skloviny a/alebo proteíny matrice zubnej skloviny môžu byt použité na liečbu infekcií spôsobených spirochétami, ako je napríklad Borrelia, Leptospira, Treponema alebo Pseudomonas.

Antimikrobiálne činidlo, ktoré môže byt použité kombinácii s matricou zubnej skloviny, derivátmi matrice zubnej skloviny a/alebo proteínmi matrice zubnej skloviny, môže byt také antimikrobiálne činidlo, ktoré pôsobí inhibíciu syntézy bunkovej steny, ako sú β-laktámové antibiotiká a vankomycín, výhodne penicilíny, ako je amdinocilín, ampicilín, amoxicilín, azlocilín, bacampicilín, benzatin-penicilín G, carbencilín, cloxacilín, cyclacilín, dicloxacilín, meticilín, mezlocilín, nafcilín, oxacilín, penicilín G, penicilín V, piperacilín a ticarcilín; cefalosporíny, ako sú cefalosporíny prvej generácie, kam patrí cefadroxil, cefazolin, cefalexin, cefalotin, cefapirin a cefradin; druhej generácie, kam patrí cefaclor, cefamandol, cefonicid, ceforanidin, cefoxitin a cefuroxim; alebo cefalosporíny tretej generácie, ako je cefoperazon, cefotaxim, cefotetan, ceftazidim, ceftizoxim, ceftriaxn a moxalaktam; karbapenemy ako je imipenem; alebo monobaktamy ako je aztreonam.

Ďalej môžu byt použité antimikrobiálne činidlá, ktorých mechanizmus účinku spočíva v inhibícii syntézy proteínov, ako je napríklad chloramfenikol; tetracyklíny, ako je napríklad demeclocyklín, doxycyklín, metacyklín, minocyklín a oxytetracyklín; aminoglykozidy, ako je napríklad amikacín, gentamicín, kanamycín, neomycín, netilmicín, paromomycín, spektinomycín, streptomycín a tobramycín; polymyxíny ako je kolistín, kolistimatát a polymyxín B, a erytromycíny a linkomycíny? a ďalej antimikrobiálne činidlá inhibujúce syntézu nukleových kyselín, ako sú sulfónamidy, napríklad sulfacytín, sulfadiazín, sulfizoxazol, sulfametoxazol, sulfametzol a sulfapyridín; trimetoprim, chinolóny, novobiocín, pyrimetamin a rifampin.

V špecifickom rozpracovaní vynálezu je infekcia prítomná v dutine ústnej a môže ísť o bakteriálnu infekciu.

Medzi príklady baktérií v dutine ústnej, ktoré majú byť zničené, patria napríklad:

- baktérie spôsobujúce zubný kaz, napríklad Streptococcus mutans, Lactobacillus spp.;

- baktérie spôsobujúce ochorenie periodontu, ako je napríklad Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Peptostreptococcus micros, Campylobacter (Fusobacteria, Staphylococci), B.forsythus;

- baktérie spôsobujúce alveolitídu, ako je napríklad Staphylococcus, Actinomyces a Bacillus',

- baktérie spôsobujúce periapikálne lézie, ako sú napríklad spirochéty a všetky baktérie uvedené hore.

Protizápalové účinky

Predkladaný vynález sa tiež týka použitia matrice zubnej skloviny, derivátov matrice zubnej skloviny a/alebo proteínov matrice zubnej skloviny ako terapeutických alebo profylaktických činidiel majúcich protizápalové účinky.

Rôzne lieky sa používajú na potlačovanie zápalov, vrátane adrenokortikosteroidov, velkej skupiny činidiel označovanej ako nesteroidné protizápalové lieky alebo NSAID, a liekov typu imunosupresívnych činidiel. Adrenokortikosteroidy, najmä glukokortikoidy, majú výrazné protizápalové účinky pri použití vo farmakologických dávkach. Špecificky inhibujú časnú vaskulárnu fázu zápalového procesu tým, že znižujú cievnu permeabilitu a tak znižujú migráciu granulocytov. Glukokortikoidy tiež interferujú s neskorými zápalovými a reparatívnymi procesmi tým, že inhibujú proliferáciu mezenchymálnych buniek a produkciu extracelulárnych makromolekúl, vrátane proteoglykánov a kolagénu. V pokusoch bolo preukázané, že glukokortikoidy inhibujú, napríklad funkcie makrofágov, produkciu protilátok, bunkovú imunitu a snáď uvoľňovanie lyzosomálnych enzýmov.

Závažnosť tkanivového poškodenia môže závisieť od reakcie antigén/protilátka v organizmu, rovnako ako od stupňa zadržovania zápalových produktov v mieste poranenia. Lokálna akumulácia mediátorov zápalu akceleruje tento proces. Vo väčšine prípadov je tento dej pomalý, s imunoinfiltráciou tkaniva a tvorbou granulačného tkaniva, ktoré obsahuje zápalové bunky.

Termín protizápalový účinok, ako je tu použitý, označuje pôsobenie proti zápalu alebo potlačovanie zápalu.

Všeobecný a podrobný opis typov zápalových stavov, ktoré môžu byt liečené

Zápalový stav, ktorý môže byt liečený spôsobom podľa predkladaného vynálezu, môže byt akýkoľvek zápalový stav v akejkoľvek časti tela alebo akýkoľvek zápalový stav v mäkkých alebo tvrdých tkanivách. V jednom uskutočnení predkladaného vynálezu je zápalový stav prítomný v dutine ústnej. Príkladmi ochorenia v dutine ústnej sú alveolitída, cheilitída, kostová nekróza (posttraumatická), fraktúry.

V inom uskutočnení predkladaného vynálezu je zápal prítomný v mieste odberu kosťového štepu. V treťom uskutočnení predkladaného vynálezu je zápal prítomný v mieste klbnej dutiny. Príkladmi takých zápalových stavov sú reumatoidná artritída a príbuzné ochorenia.

Antibakteriálna verzus protizápalová aktivita

Oproti mnohým v súčasnosti používaným antibiotikám nenarušujú proteíny matrice zubnej skloviny hojenie rany a rýchlejšie hojenie rany neumožňuje vývoj chronických alebo dlhodobých zápalových procesov. Ďalej, reorganizácia správnych tkanív, ako je opísaná po aplikácii derivátov matrice zubnej skloviny na periodontálne defekty, je zreteľne zlepšená pri rýchlom hojení rany bez prítomnosti baktérií alebo zápalových reakcií.

Aplikácia matrice zubnej skloviny, derivátov matrice zubnej skloviny a/alebo proteínov matrice zubnej skloviny vedie k rýchlejšiemu hojeniu rán po chirurgických incisiách, pravdepodobne v dôsledku vytvorenia povrchu, ktorý pri kontakte s baktériami inhibuje ich rast, ale ktorý súčasne zosilňuje migráciu fibroblastov a syntézu kolagénu. Kedf je zápalová fáza skrátená, tak sú typické príznaky ako je zahriatie oblasti, zarudnutie, opuch a bolesť menej výrazné.

Matrica zubnej skloviny, deriváty matrice zubnej skloviny a proteíny matrice zubnej skloviny

Matrica zubnej skloviny je prekurzor zubnej skloviny a môže byť získaná z akéhokoľvek relevantného prírodného zdroja, tzn. od cicavcov, pri ktorých prebieha vývoj zubov. Vhodným zdrojom sú vyvíjajúce sa zuby od jatočných zvierat, ako sú teľatá, prasiatka alebo jahňatá. Iným zdrojom je napríklad rybacia koža.

Matrica zubnej skloviny môže byť pripravená z vyvíjajúcich sa zubov spôsobom opísaným skôr (EP-B-0337967 a EP-B0263086). Matrica zubnej skloviny je zoškrabaná a sú pripravené deriváty matrice zubnej skloviny, napríklad pomocou extrakcie s vodným roztokom ako tlmivým roztokom, riedenou ky21 selinou alebo zásadou alebo zmesou vody/rozpúšťadla, po ktorej nasleduje rozdelenie podľa veľkosti, odsolenie alebo iný stupeň prečistenia a voliteľne lyofilizácie. Enzýmy môžu byt inaktivované tepelným spracovaním alebo rozpúšťadlami a v tomto prípade môžu byt deriváty skladované v kvapaline bez lyofilizácie.

V predkladanom vynáleze sú deriváty matrice zubnej skloviny také deriváty matrice zubnej skloviny, ktoré obsahujú jeden alebo viac proteínov matrice zubnej skloviny alebo časti takých proteínov, ktoré sú produkované za prirodzených podmienok alternatívnym zostrihom a alebo spracovaním, alebo enzymatickým alebo chemickým štiepením prirodzených proteínov, alebo syntézou polypeptidov in vitro alebo in vivo (rekombinantnými DNA metódami alebo kultiváciou diploidných buniek). Medzi deriváty matrice zubnej skloviny patria tiež polypeptidy alebo proteíny odvodené z matrice zubnej skloviny. Polypeptidy alebo proteíny môžu byť naviazané na vhodný biologicky degradovateľný nosič, ako sú polyaminokyseliny alebo polysacharidy alebo ich kombinácie. Ďalej termín deriváty matrice zubnej skloviny tiež zahŕňa syntetické analogické zlúčeniny.

Proteíny sú biologické makromolekuly tvorené aminokyselinovými.zvyškami viazanými navzájom peptidovými väzbami. Proteíny, ako lineárne polyméry aminokyselín, sú tiež označované ako polypeptidy. Typicky majú proteíny približne 50-800 aminokyselinových zvyškov a preto majú molekulovú hmotnosť v rozmedzí od približne 6000 do približne niekoľkých stoviek tisícov daltonov alebo viacej. Malé proteíny sa označujú ako peptidy alebo oligopeptidy.

Proteíny zubnej skloviny sú proteíny, ktoré sú prítomné v matrici zubnej skloviny, tzn. v prekurzore zubnej skloviny (Ten Čate: Oral Histology, 1994, Robinson: Eur. J. Oral Science, Jan. 1998, 106 Suppl. 1: 282-91), alebo proteíny, ktoré môžu byt získané štiepením takých proteínov. Obyčajne majú také proteíny molekulovú hmotnosť nižšiu ako 120000 daltonov a patria medzi nich amelogeniny, non-amelogeniny, non-amelogeniny bohaté na prolín, ameliny (ameloblastin, sheatlin) a tufteliny.

Príklady proteínov na použitie v predkladanom vynáleze zahŕňajú amelogeniny, non-amelogeniny bohaté na prolín, tuftelin, trsové proteíny, sérové proteíny, proteíny prítomné v slinách, amelin, ameloblastin, sheatlin a ich deriváty a zmesi. Prípravok obsahujúci aktívnu substanciu zubnej skloviny podlá predkladaného vynálezu môže obsahovať aspoň dve z hore uvedených proteínových substancií. Komerčný výrobok obsahujúci amelogeniny a pravdepodobne iné proteíny matrice zubnej skloviny je predávaný pod názvom EMDOGAIN^R (Biora AB).

Všeobecne, hlavnými proteínmi matrice zubnej skloviny sú amelogeniny. Tieto proteíny tvoria približne 90% hmotn./ hmotn. proteínov matrice. Zostávajúcich 10% hmotn./hmotn. tvoria non-amelogeniny bohaté na prolín, tuftelin, trsové proteíny, sérové proteíny a aspoň jeden proteín prítomný v slinách; avšak môžu byť prítomné tiež iné proteíny, ako je napríklad amelin (ameloblastin, sheatlin), ktoré boli identifikované v matrici zubnej skloviny. Rôzne proteíny môžu byt ďalej syntetizované a/alebo spracované v niekolkých rôznych velkostiach (tzn. s rôznymi molekulovými hmotnosťami). Tak bolo zistené, že prevládajúce proteíny matrice zubnej skloviny, amelogeniny, môžu existovať v niekolkých rôznych velkostiach, ktoré dohromady tvoria supramolekulové agregáty. Sú to značne hydrofóbne substancie, ktoré za fyziologických podmienok tvoria agregáty. Môžu byť nosičmi pre iné proteíny alebo peptidy.

Iné proteínové substancie sú tiež považované za vhodné na použitie podlá predkladaného vynálezu. Príkladmi takých pro23 teínov sú proteíny bohaté na prolin a polyprolín. Inými príkladmi substancií vhodných na použitie podlá predkladaného vynálezu sú agregáty takých proteínov, deriváty matrice zubnej skloviny a/alebo proteíny matrice zubnej skloviny, rovnako ako metabolity matrice zubnej skloviny, derivátov matrice zubnej skloviny a proteínov matrice zubnej skloviny. Metabolity môžu byť proteíny alebo krátke peptidy akejkolvek velkosti.

Ako bolo uvedené hore, proteíny, polypeptidy alebo peptidy na použitie podlá predkladaného vynálezu majú zvyčajne molekulovú hmotnosť najčastejšie približne do 120 kDa, napríklad 100 kDa, 90 kDa, 80 kDa, 70 kDa alebo 60 kDa, ako je stanovené SDS-PAGE elektroforézou.

Proteíny na použitie podlá predkladaného vynálezu sú zvyčajne pripravené vo forme prostriedku, v ktorom je obsah proteínov aktívnej substancie zubnej skloviny v rozmedzí od približne 0,05% hmotn./hmotn. do 100% hmotn./hmotn., napríklad približne 5-99% hmotn./hmotn., približne 15-90% hmotn./hmotn., približne 20-90% hmotn./hmotn., približne 30-90% hmotn./hmotn., približne 40-85% hmotn./hmotn., približne 50-80% hmotn./hmotn., približne 60-70% hmotn./hmotn., približne 70-90% hmotn./hmotn. alebo približne 80-90% hmotn./hmotn..

Prípravky aktívnej substancie zubnej skloviny na použitie podlá predkladaného vynálezu môžu takisto obsahovať zmes aktívnych substancií zubnej skloviny rôznych molekulových hmotností.

Proteíny matrice zubnej skloviny môžu byť delené na časť s vysokou molekulovou hmotnosťou a na časť s nízkou molekulovou hmotnosťou a bolo zistené, že význam pre liečbu periodontálnych defektov (tzn. periodontálnych rán) má dobre definovaná frakcia proteínov matrice zubnej skloviny. Táto frakcia obsahuje proteíny extrahovatelné kyselinou octovou, ktoré sú súhrnne označované ako amelogeniny a ktoré tvoria čast matrice zubnej skloviny s nízkou molekulovou hmotnosťou (pozri EP-B0337967 a EP-B-0263086).

Ako bolo uvedené hore, čast matrice zubnej skloviny s nízkou molekulovou hmotnosťou má výhodnú aktivitu pre indukciu väzby medzi tvrdým tkanivom v periodontáIných defektoch.

V predkladanom vynáleze nie sú však aktívne proteíny obmedzené na časť matrice zubnej skloviny s nízkou molekulovou hmotnosťou. Medzi výhodné proteíny podlá predkladaného vynálezu patria proteíny ako je amelogenin, amelin, tuftelin apod., s molekulovou hmotnosťou (ako je meraná in vitro SDS-PAGE) nižšia ako približne 60000 daltonov, ale proteíny s molekulovou hmotnosťou vyššou ako 60000 daltonov majú tiež slubne vlastnosti ako činidlá na hojenie rán, ako antibakteriálne činidlá a ako protizápalové činidlá.

V súlade s tým sa predpokladá, že aktívna substancia zubnej skloviny na použitie v predkladanom vynáleze má molekulovú hmotnosť do približne 40000, napríklad medzi 5000 a 25000.

Do rozsahu predkladaného vynálezu spadajú tiež peptidy opísané y WO 97/02730, tzn. peptidy, ktoré obsahujú aspoň jeden element sekvencie vybraný zo skupiny skladajúcej sa z tetrapeptidov DGEA (Asp-Gly-Glu-Ala), VTKG (Val-Thr-Lys-Gly), EKGE (Glu-Lys-Gly-Glu) a DKGE (Asp-Lys-Gly-Glu) a ktoré dalej obsahujú aminokyselinovú sekvenciu, v ktorej je 20 susediacich aminokyselín identických aspoň z 80% so sekvenciou aminokyselín rovnakej dĺžky vybranej zo skupiny skladajúcej sa z aminokyselinovej sekvencie uvedenej v SEQ ID NO: la sekvencie obsahujúcej aminokyseliny 1 až 103 SEQ ID NO: 1 a aminokyseliny 6 až 324 SEQ ID NO: 2.

Termín identita sekvencia označuje identitu sekvencie aminokyseliny v tom, že aminokyseliny majú v peptide rovnakú identitu a pozíciu. Medzera je považovaná za neidentické miesto pre jednu alebo viac aminokyselín.

Také peptidy môžu obsahovať od 3 do 300 aminokyselín, napríklad aspoň 20 aminokyselín, aspoň 30 aminokyselín, aspoň 60 aminokyselín, aspoň 90 aminokyselín, aspoň 120 aminokyselín, aspoň 150 aminokyselín alebo aspoň 200 aminokyselín.

Spôsob izolácie proteínov matrice zubnej skloviny obsahuje extrakciu proteínov a odstránenie vápnikových a fosfátových iónov zo solubilizovaného hydroxyapatitu pri použití vhodnej metódy, ako je napríklad gélová filtrácia, dialýza alebo ultrafiltrácia (pozri napríklad Janson, J-C. and Rydén,

L. ((ed.), Protein Purification, VCH Publishers 1989, a Harris, ELV and Angal, S. Protein Purification Methods - A practical approach, IRL Press, Oxford 1990).

Typický lyofilizovaný proteínový prostriedok obsahuje hlavne alebo výlučne až 70-90% amelanogeninov s molekulovou hmotnosťou (MW) medzi 40000 a 5000 daltony a 10-30% prostriedku tvoria menšie peptidy, soli a reziduálna voda. Hlavné proteínové prúžky majú 20 kDa, 12-14 kDa a približne 5 kDa.

Pomocou separovania proteínov, napríklad zrážaním, iónomeničovou chromatografiou, preparatívnou elektroforézou, gólovou vylučovacou chromatografiou, chromatografiou s reverznou fázou alebo afinitnou chromatografiou, môžu byť prečistené amelogeniny s rôznou molekulovou hmotnosťou.

Môžu byť pripravené rôzne kombinácie amelogeninov rôznych molekulových hmotností, od prevahy 20 kDa zlúčenín na agregovanie amelogeninov s rôznymi molekulovými hmotnosťami od 40 do 5 kDa, do prevahy 5 kDa zlúčenín. Iné proteíny matrice zubnej skloviny, ako je amelin, tuftelin alebo proteolytické enzýmy normálne prítomné v matrici zubnej skloviny, môžu byť pridané do prostriedku a môžu byt nesené amelogeninovými agregátmi.

Alternatívne môžu byt deriváty alebo proteíny matrice zubnej skloviny získané synteticky, pri použití dobre v odbore známych techník, alebo pri použití kultivovaných buniek alebo baktérií modifikovaných technikami rekombinantnej DNA (pozri napríklad Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

Fyzikálne-chemické vlastnosti matrice zubnej skloviny, derivátov matrice zubnej skloviny a proteínov matrice zubnej skloviny

Všeobecne sú matrice zubnej skloviny, deriváty matrice zubnej skloviny a proteíny matrice zubnej skloviny hydrofóbne substancie, tzn. sú špatné rozpustné vo vode, osobitne pri vyšších teplotách. Všeobecne sú tieto proteíny rozpustné pri nefyziologických hodnotách pH a pri nízkych teplotách, napríklad 4-20*C, zatiaľ čo pri telesnej teplote (35-37^eC) a neutrálnom pH agregujú a zrážajú sa.

Matrice zubnej skloviny, deriváty matrice zubnej skloviny a proteíny matrice zubnej skloviny pre použitie podľa predkladaného vynálezu tiež zahŕňajú aktívnu substanciu zubnej skloviny, kde aspoň časť aktívnej substancie zubnej skloviny je vo forme agregátov, alebo po aplikácii in vivo vytvára agregáty. Veľkosť častíc v agregátoch je od približne 20 nm do približne 1 μιη.

Predpokladá sa, že rozpustnosť matrice zubnej skloviny, derivátov matrice zubnej skloviny a proteínov matrice zubnej skloviny má význam pre profylaktickú a terapeutickú aktivitu substancií. Keď je prostriedok obsahujúci matricu zubnej sklo27 viny, deriváty matrice zubnej skloviny a/alebo proteíny matrice zubnej skloviny (ktoré sú spoločne označované ako aktívne substancie zubnej skloviny) podaný napríklad luďom, tak sa proteínové substancie vyzrážajú pôsobením fyziologického pH. Tak sa v mieste aplikácie vytvorí vrstva matrice zubnej skloviny, derivátov matrice zubnej skloviny a/alebo proteínov matrice zubnej skloviny a táto vrstva (ktorá môže byť tiež molekulárnou vrstvou v tých prípadoch, keď sa vytvoria agregáty) sa obťažne odplavuje za fyziologických podmienok. Ďalej, z dôvodu bioadheživných vlastností substancie (pozri ďalej) sa vyzrážaná vrstva pevne naviaže na tkanivo tiež v mieste hranice medzi vyzrážanou vrstvou a tkanivom. Proteínová vrstva tak pokryje tkanivo, na ktoré bola aplikovaná matrica zubnej skloviny, deriváty matrice zubnej skloviny a/alebo proteíny matrice zubnej skloviny a aktívne substancie zubnej skloviny tak zostávajú v mieste aplikácie po dlhý čas, to znamená, že nie je nutné opakovanie aplikácie aktívnej substancie zubnej skloviny v krátkych intervaloch. Ďalej, vrstva vytvorená in situ sa prakticky vyrovná nepriedušnému obväzu, to znamená, že chráni tkanivo pred pôsobením okolitých vplyvov.

V prípade poraneného tkaniva, infikované tkanivá alebo zápalové tkanivá chráni taká vrstva tkaniva pred ďalšou kontamináciou mikroorganizmami prítomnými v okolí. Ďalej, proteínová vrstva môže vykazovať svoj účinok priamym kontaktom s tkanivom alebo s mikroorganizmami prítomnými v tkanive alebo na tkanive.

Na umožnenie vzniku proteínovej vrstvy v mieste aplikácie môže byť výhodné použitie vhodných tlmiacich substancií vo farmaceutických alebo kozmetických prostriedkoch obsahujúcich matricu zubnej skloviny, deriváty matrice zubnej skloviny a/alebo proteíny matrice zubnej skloviny; také tlmiace substancie môžu brániť rozpúšťaniu aktívnej substancie zubnej skloviny v mieste aplikácie.

Bolo tiež zistené, že matrice zubnej skloviny, deriváty matrice zubnej skloviny a proteíny matrice zubnej skloviny majú bioadhezívne vlastnosti, tzn. že majú schopnosť adherovať na koži alebo na povrchy slizníc. Tieto vlastnosti sú významné pri terapeutickej a/alebo profylaktickej liečbe z nasledujúcich dôvodov:

- profylaktické a/alebo terapeutické substancie môžu byt udržované v mieste aplikácie dlhší čas, to znamená, že (i) môže byť znížená frekvencia aplikácií; (ii) je možné dosiahnuť kontrolované uvoľňovanie aktívnej substancie; a/ alebo (iii) zlepšuje sa lokálna liečba v mieste aplikácie;

- substancie môžu byť samotné použiteľné ako nosiče pre iné profylaktický alebo terapeuticky aktívne substancie, pretože nosič obsahujúci matrice zubnej skloviny, deriváty matrice zubnej skloviny a/alebo proteíny matrice zubnej skloviny môže byť pripravený ako bioadhezívny nosič (tzn. nový bioadhezívny systém na podanie liečiv založený na bioadheživných vlastnostiach matrice zubnej skloviny, derivátov matrice zubnej skloviny a/alebo proteínov matrice zubnej skloviny.

Teória mechanizmu účinku

Matrica zubnej skloviny je príkladom extracelulárnej proteínovej ..matrice, ktorá adheruje na minerálne povrchy, rovnako ako na proteínové povrchy. Pri fyziologickom pH a teplote tvoria proteíny nerozpustné supra-molekulárne agregáty (Fincham et al., J. Struct. Biol., 1994, March-April, 112(2): 103-9 a J.Struct. Biol. 1995, July-August, 115(1):50-9), ktoré sú postupne degradované proteolytickými enzýmami (čo prebieha ako in vivo, tak in vitro, pokiaľ neboli proteázy inaktivované).

Nedávne pozorovania týkajúce sa toho, že matrica zubnej skloviny je tvorená a prechodne prítomná počas tvorby koreňov a koreňového cementu môžu vysvetliť to, ako môže aplikácia matrice zubnej skloviny, derivátov matrice zubnej skloviny a/alebo proteínov matrice zubnej skloviny podporovať regeneráciu periodontálneho tkaniva. Avšak zistenie, ktoré je základom predkladaného vynálezu, že matrice zubnej skloviny, deriváty matrice zubnej skloviny a/alebo proteiny matrice zubnej skloviny majú tiež pozitívny efekt na hojenie defektov mäkkých tkanív, ako sú rany, je velmi prekvapivé. To rovnaké platí pre pozorovanie antiinfekčného a protizápalového účinku.

Pri mnohých druhoch sú zisťované zvyšky matrice zubnej skloviny v novo minerálizovaných korunkách zubov pri ich prerezávaní do dutiny ústnej. Je možné predpokladať, že nový zub je velmi citlivý na bakteriálnu infekciu bežnými baktériami v dutine ústnej a že preto musí mať počas tejto iniciálnej fázy prirodzenú ochranu.

Aplikácia nerozpustnej matrice zubnej skloviny, derivátov matrice zubnej skloviny a/alebo proteínov matrice zubnej skloviny s vhodnými antibakteriálnymi a/alebo protizápalovými vlast nosťami na povrch rán zlepší a zrýchli hojenie.

Ako bude uvedené v príkladoch, matrice zubnej skloviny, deriváty matrice zubnej skloviny a/alebo proteiny matrice zubnej skloviny alebo proteínové agregáty inhibujú bakteriálny rast kontaktnou inhibíciou, zatial čo bunky vystavené pôsobeniu týchto substancií reagujú na matricu zubnej skloviny ako na normálne prostredie, ktoré potlačuje zápalové reakcie.

Podlá predkladaného vynálezu môžu byť matrice zubnej skloviny, deriváty matrice zubnej skloviny a/alebo proteiny matrice zubnej skloviny použité na kuratívne účely, rovnako ako na preventívne účely. Ďalej, matrice zubnej skloviny, deriváty matrice zubnej skloviny a/alebo proteiny matrice zubnej skloviny môžu byt použité spolu s inými aktívnymi činidlami, ako sú napríklad antibakteriálne, protizápalové, antivírusové, antimykotické činidlá, alebo môžu byť použité spolu s rasto30 vými faktormi, ako je napríklad TGF, PDGF, IGF, FGF, keratinocytový rastový faktor alebo ich peptidové analógy (predpokladá sa, že EGF podporuje hojenie zvýšením migrácie a delenia epitelových buniek; okrem toho zvyšuje EGF počet fibroblastov v rane, čo vedie k vyššej produkcii kolagénu). Enzýmy, hlavne proteázy - buď prirodzene prítomné v matrici zubnej skloviny alebo jej prípravku alebo pridané - môžu byt tiež použité v kombinácii s matricou zubnej skloviny, derivátmi matrice zubnej skloviny a/alebo proteínmi matrice zubnej skloviny.

Aktívna substancia zubnej skloviny je zvyčajne pripravená ako farmaceutický alebo kozmetický prostriedok. Taký prostriedok sa môže skladať z proteínového prípravku alebo môže ďalej obsahovať farmaceutický alebo kozmeticky prijateíné prísady. Osobitne výhodnými prísadami pre použitie vo farmaceutických alebo kozmetických prípravkoch sú propylénglykolalginát alebo kyselina hyalurónová alebo ich deriváty.

Farmaceutické a/alebo kozmetické prostriedky

V nasledujúcom texte sú opísané príklady vhodných prostriedkov obsahujúcich aktívnu substanciu zubnej skloviny. V závislosti od použitia aktívnej substancie zubnej skloviny môže byť prostriedok farmaceutický alebo kozmetický prostriedok. Termín farmaceutický prostriedok v ďalšom opise zahŕňa kozmetické prostriedky, rovnako ako prostriedky spadajúce do takzvanej šedej zóny medzi farmaceutickými prostriedkami a kozmetickými prostriedkami.

Na podanie jedincom (zvieratám alebo luďom) sú matrice zubnej skloviny, deriváty matrice zubnej skloviny a/alebo proteíny matrice zubnej skloviny (tiež označované súhrnne ako aktívne substancie zubnej skloviny) a/alebo ich prípravky výhodne pripravené ako farmaceutické prostriedky obsahujúce aktívnu substanciu zubnej skloviny a volitelne jednu alebo viac farmaceutický prijateľných prísad.

Prostriedky môžu byť vo forme pevných, polopevných alebo kvapalných prostriedkov, ako sú napríklad:

- bioabsorbovatelné náplasti, drenáže, obväzy, hydrogélové obväzy, hydrokoloidné obväzy, filmy, peny, poťahy, bandáže, prostriedky na podanie liečiv, implantáty;

- prášky, granuly, granuláty, kapsuly, agarózové alebo chitosánové korálky, tablety, pilulky, mikrokapsuly, mikrosféry, nanočastice;

- spreje, aerosóly, inhalačné prostriedky;

- gély, hydrogély, pasty, masti, krémy, mydlá, čapíky, vaginálne prostriedky, zubné pasty;

- roztoky, disperzie, suspenzie, emulzie, zmesi, pleťové vody, ústne vody, šampóny, nálevy;

- kity obsahujúce napríklad dva samostatné zásobníky, kde prvý zásobník obsahuje aktívnu substanciu zubnej skloviny, volitelne v zmesi s iným aktívnym liekom a/alebo farmaceutický prijatelnými prísadami a druhý zásobník obsahuje vhodné médium určené na pridanie do prvého zásobníku pred použitím za zisku prostriedku určeného na okamžité použitie;

- iné vhodné formy, ako sú implantáty alebo poťahy implantátov alebo formy vhodné na použitie pri implantáciách alebo transplantáciách.

V predkladanom vynáleze sú najdôležitejšie prostriedky pre aplikáciu na kožu alebo na sliznicu. Prostriedok obsahujúci aktívnu substanciu zubnej skloviny môže byť podaný akýmkoľvek vhodným spôsobom, napríklad lokálne (dermálne), bukálne, orálne, nazálne, intraaurikulárne, rektálne alebo vaginálne, alebo môže byt podaný do telnej dutiny, ako je napríklad koreň zubu alebo koreňový kanálik zubu. Ďalej môže byť prostriedok pripravený na použitie pri chirurgických výkonoch, napríklad pri incisiách, ked uľahčí hojenie vnútorných rán a poranených mäkkých tkanív.

Ako bolo uvedené hore, prostriedky obsahujúce aktívnu substanciu zubnej skloviny môžu byt vhodné na použitie počas chirurgických výkonoch, napríklad na lokálnu aplikáciu (napríklad do dutiny ústnej, vo forme gélov, filmov alebo suchých peliet, alebo môžu byt použité vo forme roztokov na preplachovanie alebo môžu byt pripravené ako pasty alebo krémy na aplikáciu na tkanivá alebo povrchy, kde bránia bakteriálnej infekcii. Pre operačné výkony alebo implantácie v oblasti koreňového kanálku zubu môže byt na uzatvorenie dutiny použitá pasta.

Prostriedky môžu byt pripravené bežnými farmaceutickými technikami, pozri napríklad Remington's Pharmaceutical Sciences a Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, Swarbrick, J. and J.C.Boylan, Marcel Dekker, Inc., New York, 1988.

Ako bolo uvedené hore, prostriedky obsahujúce aktívnu substanciu zubnej skloviny sú určené na aplikáciu na kožu alebo na sliznicu. Ďalšie aplikácie sú takisto možné, napríklad aplikácie na umelý chrup, protézy, implantáty a aplikácie do teľných dutín, ako je dutina ústna, nosná a poševná. Sliznicou je výhodne sliznica dutiny ústnej, nosnej, sliznica tvári, ucha, rekta a vagíny. Ďalej môžu byt prostriedky aplikované priamo na rany alebo na poranenia mäkkých tkanív.

Ďalšou významnou aplikáciou je aplikácia v dentálnych/ odontologických oblastiach. Príkladom je aplikácia do periodontálnych (dentálnych) chobotov, na ďasná alebo na poranenia ďasien alebo na iné rany v dutine ústnej, alebo pri chirurgických výkonoch v dutine ústnej.

Ďalej sa predpokladá, že vdľaky antibakteriálnym vlastnostiam aktívnej substancie zubnej skloviny môže byť výhodná jej aplikácia na zuby alebo na zubné korene na prevenciu kazu a/alebo povlaku. Toto použitie podporuje zistenie (Weinmann,

J.P. et al., Hereditary disturbences of enamel formation and calcificatlon, J. Amer. Dent. Ass. 32: 397-418, 1945; Sundell,

S. Hereditary amelogenesis imperfecta. An epidemiológie, genetic and clinical study in Swedish child population, Swed. Dent. J. Suppl. 1986, 31: 1-38), že nedokonale vyvinuté zuby (amelogenesis imperfecta), ktoré v dôsledku toho obsahujú značné množstvo amelogeninov, sú značne rezistentné voči zubnému kazu.

Farmaceutické prostriedky obsahujúce aktívnu substanciu zubnej skloviny slúžia ako systém na podanie liečiv. Termín systém na podanie liečiv, ako je tu použitý, označuje farmaceutický prostriedok alebo dávkovú formu, ktorý po podaní uvoľňuje aktívne substancie do tela človeka alebo zvieraťa. Termín systém na podanie liečiv preto zahŕňa jednoduché farmaceutické prostriedky, ako sú napríklad krémy, masti, kvapalné prostriedky, prášky, tablety apod., rovnako ako zložitejšie prostriedky, ako sú spreje, náplasti, obväzy, bandáže a iné prostriedky.

Okrem aktívnej substancie zubnej skloviny môže farmaceutický prostriedok podľa predkladaného vynálezu obsahovať farmaceutický alebo kozmeticky prijatelné prísady.

Farmaceutický alebo kozmeticky prijatelná prísada je substancia, ktorá je v podstate neškodná pre jedinca, ktorému je prostriedok podaný. Také prísady zvyčajne spĺňajú požiadavky dané národnými zdravotníckymi úradmi. Oficiálne liekopisy, ako je napríklad Britlsh Pharmacopoeia, United States of America Pharmacopoeia a The Éuropean Pharmacopoeia, uvádzajú štandardy pre farmaceutický prijatelné prísady.

To, aká farmaceutický prijateíná prísada je vhodná na použitie vo farmaceutickom prostriedku, všeobecne závisí od vybranej dávkovej formy pre použitie na určitý typ rán. Ďalej sú uvedené príklady vhodných farmaceutický prijatelných prísad pre rôzne prostriedky podlá predkladaného vynálezu.

Ďalej je uvedený prehlad farmaceutických prostriedkov podlá predkladaného vynálezu. Prehlad je založený na spôsobe podania prostriedku. Avšak je potrebné si uvedomiť, že pokial môže byť farmaceutický prijateíná prísada použitá v rôznych dávkových formách alebo prostriedkoch, tak nie je použitie farmaceutický prijatelnej prísady obmedzené na určitú dávkovú formu alebo na určitú funkciu prísady.

Volba farmaceutický prijatelnej prísady v prostriedkoch podlá predkladaného vynálezu a jej optimálna koncentrácia nemôže byt zvyčajne stanovená vopred a musí byt určená podlá experimentálneho testovania konečného prostriedku. Avšak odborníci v odbore sa môžu orientovať napríklad podlá Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.vydanie, Mack Publishing Company, Easton, 1990.

Prostriedky na lokálne podanie

Pre aplikáciu na kožu alebo na sliznicu môžu obsahovať prostriedky podlá predkladaného vynálezu bežné netoxické farmaceutický prijatelné nosiče a prísady, vrátane mikrosfér a lipozómov.

Prostriedky podlá predkladaného vynálezu zahŕňajú všetky typy pevných, polopevných a kvapalných prostriedkov. Osobitne významnými prostriedkami sú napríklad pasty, masti, hydrofilné masti, krémy, gély, hydrogély, roztoky, emulzie, suspenzie, pleťové vody, masti, šampóny, želé, mydlá, tyčinky, spreje, prášky, filmy, peny, tampóny, tampóny (napríklad kolagénové tampóny), obväzy (napríklad absorpčné obväzy), drenáže, bandáže, náplasti a systémy pre transdermálne podanie.

Farmaceutický prijatelnými prísadami môžu byt rozpúšťadlá, tlmiace činidlá, konzervačné činidlá, zvlhčovacie činidlá, chelatačné činidlá, antioxidačné činidlá, stabilizačné činidlá, emulgačné činidlá, suspendačné činidlá, gélotvorné činidlá, masťové základy, činidlá zosilňujúce prienik do tkanív, parfumovacie činidlá a činidlá chrániace pokožku.

Príkladmi rozpúšťadiel sú napríklad voda, alkoholy, rastlinné alebo rybie oleje (napríklad jedlé oleje ako je mandlový olej, ricínový olej, kakaové maslo, kokosový olej, kukuričný olej, bavlníkový olej, lanový olej, olivový olej, palmový olej, podzemnicový olej, makový olej, repkový olej, sezamový olej, sójový olej, slnečnicový olej, čajovníkový olej), anorganické oleje, mastné oleje, kvapalný parafín, polyetylénglykoly, glycerol, kvapalné polyalkylsiloxány a ich zmesi.

Príkladmi tlmiacich činidiel sú kyselina citrónová, kyselina octová, kyselina vínna, kyselina mliečna, kyselina hydrogénfosforečná, dietylamín apod.

Príkladmi konzervačných činidiel pre použitie v prostriedkoch sú parabény, ako je metyl-, etyl-, propyl-p-hydroxybenzoát, butylparabén, izobutylparabén, izopropylparabén, sorbát draselný, kyselina sorbová, kyselina benzoová, metylbenzoát, fenoxyetanol, bronopol, bronidox, MDM hydantoin, jodopropynylbutylkarbamát, EDTA, benzalkóniumchlorid a benzylalkohol, alebo zmesi konzervačných činidiel.

Príkladmi zvlhčovacích činidiel sú glycerín, propylénglykol, sorbitol, kyselina mliečna, močovina a ich zmesi.

Príkladmi chelatačných činidiel sú sodná sol EDTA a kyselina citrónová.

Príkladmi antioxidačných činidiel sú butylovaný hydroxyanizol (BHA), kyselina askorbová a jej deriváty, tokoferol a jeho deriváty, cysteín a ich zmesi.

Príkladmi emulgačných činidiel sú prirodzené živice, napríklad arabská guma alebo tragant; prirodzené fosfatidy, napríklad sójový lecitín; deriváty sorbitánmonooleátu; lanolín; alkoholy z dreva; sorbitánové estery; monoglyceridy; mastné alkoholy; estery mastných kyselín (napríklad triglyceridy mastných kyselín); a ich zmesi.

Príkladmi suspendačných činidiel sú napríklad celulózy a deriváty celulózy ako je napríklad karboxymetylcelulóza, hydroxyetylcelulóza, hydroxypropylcelulóza, hydroxypropylmetylcelulóza, karagén, arabská guma, tragant, a ich zmesi.

Príkladmi gélových základov, činidiel zvyšujúcich viskozitu alebo zložiek vychytávajúcich exsudát z rany sú: kvapalný parafín, polyetylén, mastné oleje, koloidný oxid kremičitý alebo hliník, zinkové mydlá, glycerol, propylénglykol, tragant, karboxyvinylpolyméry, silikáty horečnato-hlinité, Carbopol¹*, hydrofilné polyméry ako je napríklad škrob alebo deriváty celulózy, napríklad karboxymetylcelulóza, hydroxyetylcelulóza a iné deriváty celulózy, hydrokoloidy napúčajúce vo vode, karagény, hyaluronáty (napríklad hyaluronátový gél volitelne obsahujúci chlorid sodný) a algináty vrátane propylénglykol alginátu.

Príkladmi masťových základov sú včelí vosk, parafín, cetanol, cetylpalmitát, rastlinné oleje, sorbitánové estery mastných kyselín (Span), polyetylénglykoly a produkty kondenzácie medzi sorbitánovými estermi mastných kyselín a ety37 lénoxidom, ako je napríklad polyoxyetylénsorbitán-monooleát (Tween).

Príkladmi hydrofóbnych alebo vo vode emulzifikujúcich mastových základov sú parafíny, rastlinné oleje, živočíšne tuky, vosky, lanolín a kvapalné polyalkylsiloxány.

Príkladmi hydrofilných mastových báz sú pevné makrogoly (polyetylénglykoly).

Príkladmi mastových báz sú trietanolamínové mydlá, sulfátované mastné alkoholy a polysorbáty.

Príkladmi práškových zložiek sú: alginát, laktóza, prášok, ktorý tvorí gél po aplikácii na ranu (absorbuje kvapalinu/exsudát z rany). Prášok určený na aplikáciu na rozsiahle otvorené rany musí byť sterilný a prítomné častice musia byt mikronizované.

Príkladmi ďalších zložiek sú polyméry, ako je karmelóza, karmelóza sodná, hydroxypropylmetylcelulóza, hydroxyetylcelulóza, hydroxypropylcelulóza, pektín, xantánová živica, chlebovníková živica, arabská guma, želatína, karbomér, emulzifikátory. ako je vitamín E, glycerylstearáty, cetanylglukozid, kolagén, karagén, hyaluronáty a algináty a kitosány.

Obväzy a/alebo bandáže sú tiež významným systémom pre podanie aktívnej substancie zubnej skloviny. Pokiaľ sú obväzy použité ako dávkové formy, tak môže byt aktívna substancia zubnej skloviny zmiešaná s inými materiálmi/zlôžkami pred alebo počas výroby obväzu, alebo môže byť aktívna substancia zubnej skloviny dajakým spôsobom nanesená na obväz, napríklad ponorením obväzu do roztoku alebo disperzie aktívnej substancie zubnej skloviny alebo nastriekaním roztoku aktívnej substancie zubnej skloviny na obväz. Alternatívne môže byť aktívna substancia zubnej skloviny aplikovaná na obväz vo forme prášku. Obväzy môžu byt absorpčné obväzy na aplikáciu na exudujúcíe rany. Obväzy môžu byt takisto vo forme hydrogélových obväzov (napríklad vo forme zositených polymérov, ako je Intrasite^R, ktorý obsahuje karboxymetylcelulózu, propylénglykol alebo polysacharid, disacharid a proteiny) alebo vo forme okluzívneho obväzu, ako sú napríklad alginátové, chitosánové, hydrofilné polyuretánové filmy, kolagénové obväzy, prášky, peny, porózne obväzy, peny (napríklad polyuretánové alebo silikónové), hydrokoloidné obväzy (napríklad karboxymetylcelulózové, CMC), obväzy na báze kolagénu alebo kyseliny hyalurónovej, alebo ich kombinácie.

Alginátové, chitosánové a hydrokoloidné obväzy absorbujú po umiestnení na ranu exsudát. Pri tejto absorpcii vytvárajú vodný gél na povrchu rany a predpokladá sa, že tento gél je výhodný pre hojenie rany, pretože udržuje vlhké prostredie v oblasti rany.

Tiež sa predpokladá, že aktívna substancia zubnej skloviny môže byt obsiahnutá v prostriedku adherujúcom k tkanivu, ktorý ďalej obsahuje napríklad fibrinogén a voliteíne faktor XIII alebo iný plazmatický koagulačný faktor na zabránenie krvácaniu. Tkanivový adhezívny prostriedok môže byt pripravený buď ako vopred pripravená zmes aktívnej substancie zubnej skloviny, fibrinogénu a voliteíne faktoru XIII, a trombín je pridaný k tejto zmesi bezprostredne pred aplikáciou tohto prostriedku na ranu. Alternatívne môže byt vopred pripravená zmes aktívnej substancie zubnej skloviny, fibrinogénu a voliteíne faktoru XIII aplikovaná na ranu pred aplikáciou trombínu. In situ mení trombín fibrinogén na fibrín, čo napodobuje prirodzený proces koagulácie, ktorý prebieha pri hojení rany. Prítomnosť aktívnej substancie zubnej skloviny v tkanivovom adhezívnom prostriedku môže urýchliť hojenie rany, ako bolo opísané hore. Komerčný výrobok vhodný na obsiahnutie aktívnej substancie zubnej skloviny je Tisseel^R, dvojzložkový fibrínový tesniaci materiál vyrábaný Immuno, AG, Viedeň, Rakúsko.

V zubnej paste alebo v ústnej vode alebo v inom prostriedku na aplikáciu na chrup alebo na korene zubov môže byt aktívna substancia zubnej skloviny prítomná buď v rozpustenom stave vo vehikulu s mierne kyslým pH, alebo vo forme disperzie vo vehikule s neutrálnym pH. Predpokladá sa, že použitie aktívnej substancie zubnej skloviny môže vytvoriť ochrannú vrstvu na povrchu zubu, čo bráni väzbe baktérií spôsobujúcich zubný kaz (pozri príklad 4). V takých prostriedkoch starostlivosti o chrup môže byt aktívna substancia zubnej skloviny prítomná spolu s jednou alebo viacerými zlúčeninami, ktoré majú preventívny účinok na zubný kaz, zvyčajne s fluórom alebo iný stopovým prvkom ako je vanád alebo molybdén. Pri neutrálnom pH sa predpokladá väzba stopového prvku (napríklad iónová väzba) na aktívnu substanciu zubnej skloviny, z ktorej je tento prvok majúci účinnosť proti zubnému kazu uvoľňovaný pri rozpustení aktívnej substancie zubnej skloviny pri pH približne

5,5 alebo nižšom, ktoré je spôsobené napríklad produkciou kyselín baktériami spôsobujúcimi zubný kaz.

Prostriedky na lokálne podanie uvedené hore sú najvhodnejšie na aplikáciu priamo na ranu a sú takisto vhodné na aplikáciu alebo zavedenie do rôznych teľných otvorov, napríklad do uretry, rekta, pošvy, ucha, nosu alebo úst. Prostriedok môže byt aplikovaný priamo na liečenú oblasť, napríklad na sliznicu, alebo môže byť aplikovaný akýmkoľvek vhodným spôsobom podania.

Pre lokálne podanie sú významné tie prostriedky, ktoré majú tixotropné vlastnosti, tzn. ich viskozita je ovplyvnená napríklad pretrepaním alebo premiesením tak, že v čase podania môže byt viskozita znížená a po aplikácii sa viskozita zvyšuje, takže prostriedok zostáva v mieste aplikácie.

Prostriedky na orálne použitie alebo na aplikáciu na sliznicu alebo na kožu

Prostriedky podlá predkladaného vynálezu môžu byt pripravené takisto vo forme suspenzií, emulzií alebo disperzií. Také prostriedky obsahujú aktívnu substanciu zubnej skloviny v zmesi s disperzným alebo namáčivým činidlom, suspendačným činidlom a/alebo s jedným alebo viacerými konzervačnými činidlami a inými farmaceutický prijatelnými prísadami. Také prostriedky môžu byt vhodné na dopravenie aktívnej substancie zubnej skloviny na napríklad intaktnú alebo poranenú sliznicu, ako je orálna, bukálna, nazálna, rektálna alebo vaginálna sliznica, alebo na dodanie aktívnej substancie na intaktnú alebo poranenú kožu alebo na rany.

Vhodnými disperznými alebo namáčivými činidlami sú napríklad prirodzené fosfatidy, ako je lecitín alebo sójový lecitín; produkty kondenzácie medzi etylénoxidom a napríklad mastnými kyselinami, alifatické alkoholy s dlhým retazcom, alebo čiastočné estery mastných kyselín a anhydrid hexitolu, ako je napríklad polyoxyetylénstearát, polyoxyetylénsorbitolmonooleát, polyoxyetylénsorbitánmonooleát apod.

Vhodnými suspendačnými činidlami sú napríklad, prirodzené živice, ako je napríklad arabská guma, xantánová živica, tragant; celulózy, ako je napríklad karboxymetylcelulóza sodná, mikrokryštalická celulóza (napríklad Avicel^R RC 591, metylcelulóza); algináty a chitosány, ako je napríklad alginát sodný apod.

Príklady konzervačných činidiel vhodných na použitie v prostriedkoch podlá predkladaného vynálezu sú rovnaké, ako boli konzervačné činidlá uvedené hore.

Prostriedky na použitie podľa predkladaného vynálezu môžu byt takisto podané orálne. Orálne prostriedky môžu byt vo forme časticových prostriedkov alebo vo forme pevných, polopevných alebo kvapalných dávkových foriem.

Medzi prostriedky na orálne podanie patria napríklad prášky, granuly, granuláty, parfumový prášok, tablety, kapsuly, šumivé tablety, žuvacie prostriedky, medicínske oblátky, tablety s okamžitým uvoľňovaním a tablety s modifikovaným uvoľňovaním, rovnako ako kvapalné alebo tekuté prostriedky ako sú roztoky, suspenzie, emulzie, disperzie a zmesi. Ďalej môžu byt prostriedky vo forme práškov, dispergovateľných práškov alebo granúl vhodných na prípravu vodnej suspenzie po pridaní kvapalného média, ako je napríklad vodné médium.

Pevné dávkové formy na orálne (alebo na lokálne) použitie podľa predkladaného vynálezu zvyčajne obsahujú aktívnu substanciu zubnej skloviny a akékoľvek ďalšie aktívne substancie, volitelne v zmesi s jednou alebo viacerými farmaceutický prijatelnými prísadami. Týmito prísadami môžu byt napríklad:

- inertné riedidlá alebo plnivá, ako je sacharóza, sorbitol, cukor, manitol, mikrokryštalická celulóza, škroby vrátane zemiakového škrobu, uhličitan vápenatý, chlorid sodný, laktóza, fosforečnan vápenatý, síran vápenatý alebo fosforečnan sodný;

- činidlá uľahčujúce granulovanie a činidlá podporujúce rozpadavost, ako sú napríklad deriváty celulózy, vrátane mikrokryštalickej celulózy, škroby, vrátane zemiakového škrobu, kroskarmelóza sodná, algináty alebo kyselina algínová a chitosány;

- spojivá, ako je napríklad sacharóza, glukóza, sorbitol, arabská guma, kyselina algínová, alginat sodný, želatína, škrob, vopred želatinizovaný škrob, mikrokryštalická celulózasilikát horečnato-hlinitý, karboxymetylcelulóza sodná, metylcelulóza, hydroxypropylmetylcelulóza, etylcelulóza, polyvinylpyrolidón, polyvinylacetát alebo polyetylénglykol; a chitosány;

- klzné činidlá, ako sú klzné činidlá a antiadhezívne činidlá, napríklad stearan horečnatý, stearan zinočnatý, kyselina stearová, kremičitany, hydrogenované rastlinné oleje alebo talk.

Ďalšími farmaceutický prijatelnými prísadami môžu byť farbivá, chuťová prísady, zmäkčovacie činidlá, zvlhčovacie činidlá, tlmiace činidlá apod.

V prípadoch, že je farmaceutický prostriedok vo forme pevnej dávkovej formy v jednotkových dávkach (napríklad tabletách alebo kapsulách), tak môže byt jednotková dávka opatrená poťahom, ako sú napríklad opísané ďalej.

V prípade, že je prostriedok vo forme tablety, kapsuly alebo prostriedku tvoreného viacerými jednotkami, tak môžu byt prostriedok alebo jednotlivé jednotky alebo tablety alebo kapsuly obsahujúce jednotlivé jednotky potiahnuté napríklad cukrovým povlakom, filmom (napríklad na báze hydroxypropylmetylcelulózy, metylcelulózy, metylhydroxyetylcelulózy, hydroxypropylcelulózy, karboxymetylcelulózy, akrylátových kopolymérov (Eudragit), polyetylénglykolov a/alebo polyvinylpyrolidónu) alebo enterálnym poťahom (napríklad na báze kopolymérov kyseliny metakrylovej (Eudragit), celulózaacetátftalátu, hydroxypropylmetylcelulóza-acetátsukcinátu, polyvinylacetátftalátu, šelaku a/alebo etylcelulózy). Ďalej môžu byť použité materiály predlžujúce uvolňovanie, ako je napríklad glycerylmonostearát alebo glyceryldistearát.

Rektálne a/alebo vaginálne prostriedky

Na aplikáciu na rektálnu alebo vaginálnu sliznicu patria medzi vhodné prostriedky podlá predkladaného vynálezu čapíky (typu emulzia alebo suspenzia), nálevy a rektálne želatínové kapsuly (roztoky alebo suspenzie). Vhodnými farmaceutický prijateľnými čapíkovými bázami sú kakaové maslo, esterifikované mastné kyseliny, glycerínovaná želatína a rôzne bázy rozpustné alebo dispergovatelné vo vode, ako sú polyetylénglykoly a polyoxyetylén-sorbitánové estery mastných kyselín. Môžu byť použité rôzne pomocné činidlá, ako sú napríklad činidlá zvyšujúce vstrebávanie alebo surfaktanty.

Nazálne prostriedky

Na aplikáciu na nosnú sliznicu (rovnako ako na sliznicu dutiny ústnej) sú vhodnými prostriedkami podlá predkladaného vynálezu spreje a aerosóly na inhaláciu. V typickom nazálnom prostriedku je aktívna substancia zubnej skloviny prítomná vo forme častíc volitelne dispergovaných vo vhodnom vehikule. Farmaceutický prijateíné vehikulá a prísady a volitelne dalšie farmaceutický prijateíné materiály, ako sú riedidlá, činidlá zvyšujúce absorpciu, chuťové prísady, konzervačné činidlá apod., sú vybrané podlá bežných pravidiel prípravy farmaceutických prostriedkov.

Dávkovanie matrice zubnej skloviny, derivátov matrice zubnej skloviny a proteínov matrice zubnej skloviny

Vo farmaceutických prostriedkoch podlá predkladaného vynálezu na aplikáciu na kožu alebo na sliznicu je aktívna substancia zubnej skloviny zvyčajne prítomná v koncentrácii v rozmedzí od približne 0,01% do približne 99,9% hmotn./hmotn. Množstvo aplikovaného prostriedku zodpovedá množstvu celkového proteínu na cm² poranenie/koža/tkanivo, ktoré je v rozmedzí od približne 0,01 mg/cm² do približne 20 mg/cm², napríklad od približne 0,1 mg/cm² do približne 15 mg/cm².

Množstvo aplikovaného prostriedku závisí od koncentrácie aktívnej substancie zubnej skloviny v prostriedku a od rýchlosti uvolňovania aktívnej substancie zubnej skloviny z prostriedku, ale zvyčajne je v rozmedzí približne 15-20 mg/cm².

V prípadoch, ked je aktívna substancia zubnej skloviny podaná vo forme, kvapalného prostriedku, je koncentrácia aktívnej substancie zubnej skloviny v prostriedku v rozmedzí od približne 0,1 do približne 50 mg/ml. V niektorých prípadoch sú žiadúce vyššie koncentrácie a môžu byť získané koncentrácie až 100 mg/ml.

Pri aplikácii prostriedku do dutiny ústnej sú použitelné nasledujúce dávky:

Experimentálne defekty (u opíc) v dutine ústnej majú velkosť zvyčajne približne 4 x 2 x 5-6 mm, čo vyžaduje aplikáciu 50 μΐ alebo približne 0,025 až 0,15 mg celkového proteínu/mm² alebo približne 2,5-15 mg/cm². Obyčajne sa aplikuje do 0,5, napríklad 0,4, 0,3, 0,2 alebo 0,1 ml prostriedku majúceho koncentráciu približne 1-40 mg/ml, napríklad 5-30 mg/ml.

Defekty v dutine ústnej u ludí spôsobené ochorením periodontu majú zvyčajne velkosť 5-10 x 2-4 x 5-10 mm, čo zodpovedá približne 200 μΐ a zvyčajne je na jeden zub aplikované približne 0,5-1 ml, napríklad 0,2-0,3 ml, prostriedku majúceho koncentráciu približne 1-40 mg celkového proteínu/ml, napríklad 5-30 mg/ml. 0,2-0,3 mg/ml zodpovedá približne 6 mg proteínu na 25-100 mm² alebo približne 0,1 mg/mm², pokial sa výpočet vykonáva iba pre povrch koreňa. Zvyčajne sa aplikuje väčší objem, aby sa dosiahlo pokrytie všetkých povrchov. I aplikácia vo viacerých vrstvách vyžaduje len malú frakciu hore uvedených množstiev.

Zvyčajne sa do defektu v extrakčnej dutine (otvore po extrakcii zubu) aplikuje približne 0,1-0,5 ml, napríklad približne 0,15-0,3 ml alebo približne 0,25-0,35 ml prostriedku obsahujúceho aktívnu substanciu zubnej skloviny. Koncentrácia aktívnej substancie zubnej skloviny v prostriedku je zvyčajne 1-40 mg celkového proteínu/ml, ako napríklad 5-30 mg/ml. Ked sa 0,3-0,4 ml takého prostriedku aplikuje pri extrakcii zubu múdrosti, tak tento objem zodpovedá približne 0,1 mg/cm² (dutina sa berie ako valec s priemerom 5 mm a hĺbkou 20 mm).

Koncentrácia aktívnej substancie zubnej skloviny vo farmaceutickom prostriedku závisí od typu substancie zubnej skloviny, jej účinnosti, závažnosti liečeného ochorenia a od veku a celkového stavu pacienta. Spôsoby na stanovenie vhodných kon centrácií aktívnej substancie zubnej skloviny vo farmaceutických prostriedkoch sú v odbore dobre známe a môžu byt vykonané podía pravidiel Guidelines for dood clinical practice (GCP) alebo Investigational New Drug Exemption (IND), ako sú opísané napríklad v International Standard ISO/DIS 14155 Clinical Investigation of Medical Devices, 1994, a v ICH (International Comittee for Harmonisation): harmonised tripartite guideline for good clinical practice, Brookwood Medical Publicatitons, Ltd., Surrey, UK, 1996. Odborník v odbore bude schopný pri použití spôsobov opísaných v štandardných učebniciach, návodoch a pravidlách opísaných hore, a všeobecných znalostí odboru, vyberať presné dávkovanie pre akúkoľvek aktívnu substanciu zubnej skloviny a/alebo vybrané dalšie substancie a dávkové formy, pri realizácii iba bežných pokusných postupov.

V ďalších aspektoch sa predkladaný vynález týka spôsobov (i) prevencie a/alebo liečby rán; (ii) zníženia infekcií;

a (iii) prevencie a/alebo liečby zápalov, kde uvedený spôsob obsahuje podanie účinného množstva aktívnej substancie zubnej skloviny takému cicavcovi.

Je potrebné si uvedomiť, že podrobnosti týkajúce sa použitia aktívnej substancie zubnej skloviny na prevenciu a/alebo terapiu rán sú rovnaké alebo analogické ako podrobnosti týkajúce sa iných aspektov použitia (antibakteriálneho a protizápalového použitia), čo znamená, že opis týkajúci sa aktívnej substancie zubnej skloviny, prípravkov obsahujúcich aktívnu substanciu zubnej skloviny, farmaceutických prostriedkov obsahujúcich aktívnu substanciu zubnej skloviny, prípravy (i) aktívnej substancie zubnej skloviny, (ii) prípravkov obsahujúcich aktívnu substanciu zubnej skloviny a (iii) farmaceutických prostriedkov obsahujúcich aktívnu substanciu zubnej skloviny, rovnako ako ich zlepšených vlastností a použitia, je možné aplikovať na všetky aspekty predkladaného vynálezu.

Opis obrázkov na pripojených výkresoch

Obr. 1 jg graf ukazujúci syntézu DNA v íudských PLD bunkách stimulovaných EMD alebo nestimulovaných EMD;

Obr. 2 je graf ukazujúci produkciu TGF-βΙ v íudských PLD bunkách stimulovaných EMD alebo nestimulovaných EMD;

Obr. 3 je schematické znázornenie prietokovej komôrky a počítačového systému, ktoré boli použité v prietokových pokusoch opísaných v príkladoch 3 a 4;

Obr. 4, 5 a 6 sú grafy ukazujúce výsledky troch samostatných pokusov ukazujúcich väzbu Actinomyces viscosus na sklenené

- 47 platne spracované EMD a kyselinou octovou, v príslušnom poradí;

Obr. 7, 8 a 9 sú grafy ukazujúce výsledky troch samostatných pokusov ukazujúcich väzbu Streptococcus mutans na sklenené platne spracované EMD a kyselinou octovou, v príslušnom poradí;

Obr. 10A je rôntgenová snímka ukazujúca pooperačný defekt po odstránení zubu múdrosti; a

Obr. 10B je rôntgenová snímka ukazujúca regeneráciu periodontálneho ligamentu po liečbe EMD, ako je opísaná v príklade 12.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Materiály a metódy

Derivát matrice zubnej skloviny, EMDOGAIN^R, od BIORA AB, S-205, Malmô, Švédsko, obsahuje 30 mg lyofilizovaného proteínu matrice zubnej skloviny (skratka EMD) a 1 ml roztoku ako nosiča (propylénglykol-alginát), ktoré sú zmiešané pred aplikáciou, pokial nie sú proteín a nosič testované samostatne. Hmotnostný pomer medzi hlavnými proteínovými pikmi v 20, 14 a 5 kDa je 85:5:10, v príslušnom poradí. Tepelne spracovaný EMD je EMD, ktorý bol zahrievaný počas 3 hodín pri približne 80°C na inaktiváciu zvyškových proteáz.

Amelogenínový proteín (20 kDa) a amelogeninový peptid bohatý na tyrozín (TRAP) (5 kDa) boli izolované z EMD pri použití HPLC gélovej vylučovacej chromatografie (TSK G-2000 SW uvedená do rovnováhy pri použití 30% acetonitrilu v 0,9% NaCl) a boli prečistené pomocou chromatografie s reverznou fázou (Pro-RPC, HR 5/10, Pharmacia Upjohn, Švédsko), pri po48 užití gradientu acetonitrilu. Separované proteíny/peptidy boli potom pridávané v rôznych množstvách do roztoku nosiča (EMDOGAIN^R), pokial neboli testované samostatne.

Kyselina hyalurónová bola HMT-0028 (MW 990000) od Seikagaku Corporation, Tokyo, Japonsko.

Baktérie a kvasinky boli všetky primárne izolované od pacientov a boli klasifikované podlá metabolických a antigénnych vlastností pri použití štandardných postupov. Druhy použitých baktérií a kvasiniek sú uvedené v tabuíke uvedenej ďalej.

Sérový albumín (hovädzí) a kolagén 1 typu (hovädzí) boli obidva získané od Sigma, S.Louis, USA.

Agarové platne boli všetky Brain Hart Infusion agar od Difco doplnený ludskými erytrocytmi (100 ml/liter agaru).

Príklad 1: Proliferácia buniek a produkcia TGF-βΙ v PDL bunkách ošetrených EMDOGAINOM^R

Rezervný roztok EMD bol pripravený rozpustením skúmavky (obsahujúcej 30 mg EMD) v 3 ml 0,1% Hac sterilizovanej filtráciou. 60 μΐ EMD rezervného roztoku bolo pridaných k 6000 μΐ Dulbeccovho modifikovaného Eaglovho média obsahujúceho 10% fetálne telacie sérum a 1% roztoku penicilínu-streptomycínu.

300 μg zmesi bolo pridaných do každej jamky 96-jamkových mikrotitračných platní (NUNC A/S, Dánsko, katal. č. 167008).

1000 buniek z ľudského periodontáIného ligamentu (PDL) (získaných zo zdravého ľudského periodontálneho tkaniva od jedincov po extrakcii premolárov z ortodontických dôvodov a kultivovaných spôsobom opísaným v Somerman et al., J. Dental Res. 67: 66-70, 1988), sa pridalo do každej jamky a vykonala sa inkubácia pri 37’C, 5% CO₂ počas 5 dní.

PDL bunky použité ako kontroly boli kultivované v Dulbeccovom modifikovanom Eaglovom médie spôsobom opísaným hore, ale za neprítomnosti EMD.

Po inkubácii boli bunky testované imunotestom na proliferáciu buniek, ktorý merí inkorporáciu 5-bróm-2'-deoxyuridínu (Brdu), podľa návodu výrobca (Boehringer Mannheim, katal. č. 1647 229) V tomto teste je Brdu inkorporovaný miesto tymidínu do DNA rastúcich buniek. Inkorporácia Brdu je detekovaná ELISA testom a množstvo BrdU merané v teste ukazuje na rýchlost syntézy DNA a tým na rýchlost proliferácie PDL buniek.

Výsledky uvedené na obr. 1 ukazujú, že PDL bunky kultivované v prítomnosti EMD majú významne vyššiu rýchlost proliferácie ako PDL bunky kultivované v neprítomnosti EMD.

100 μΐ bunkového supernatantu z mikrotitračnej platne bolo pridaných k 20 μΐ IN HCl a bola vykonaná 10-minútová inkubácia pri teplote okolia. Inkubačná zmes bola neutralizovaná 20 μΐ IN NaOH/0,5 M HEPES. 100 μΐ tejto zmesi bolo pridaných k 400 μΐ riediaceho tlmivého roztoku. 200 μΐ tohto roztoku bolo analyzovaných ELISA pri použití Quantikines™ kitu (katalógové č. DB100) od R D Systems, UK, podľa návodu výrobca.

Výsledky sú uvedené na obr. 2 a ukazujú výrazné zvýšenie produkcie TGF-βΙ v PDL bunkách inkubovaných s EMD v porovnaní s PDL bunkami neinkubovanými s EMD.

Príklad 2: Testovanie rastu mikroorganizmov v prítomnosti derivátov matrice zubnej skloviny a proteínov matrice zubnej skloviny

Cielom tohto príkladu je preukázanie inhibičných účinkov derivátov matrice zubnej skloviny a proteínov matrice zubnej skloviny na rast mikróbov in vitro.

Proteíny použité v tomto príklade boli rozpustené vo fosfátom tlmenom salinickom roztoku (PBS) s pH upraveným na 5,5 pomocou kyseliny octovej. Použité baktérie boli suspendované v PBS, pH 6,8, v konečnej koncentrácii majúcej ODg₀₀ = 0,4.

μΐ EMDOGAINU^r (30 mg EMD v 1 ml PGA) a 50 μΐ EMD, tepelne spracovaného EMD, EMD frakciou A, B, C a H (všetky obsahujúce 10 mg proteínu na ml PBS tlmivého roztoku) bolo nanesených na agarovú platňu a nechalo sa uschnúť na vrchu platne (priemer 9 cm, štandardný agar na stanovenie rezistencie s pridanými činidlami podlá potrieb jednotlivých baktérií). Potom bola pridaná homogénna suspenzia baktérií (1 ml, OD₂₈₀ = 0,5) rozotrením suspenzie na hornej ploche agarových platní a platne boli inkubované pri 35’C počas 3 dní (aeróbne kultúry) alebo 14 dní (anaeróbne kultúry) v atmosfére obohatenej C0₂ alebo za aeróbnych podmienok, podlá požiadaviek jednotlivých mikroorganizmov. Všetky kultúry boli kontrolované denne. Kolagén typu 1 a sérový albumín (obidva hovädzieho pôvodu) boli testované za rovnakých podmienok ako kontroly. Neriedený propylénglykolalginát (PGA-EMD nosič), PBS tlmivý roztok a kyselina hyalurónová (HA - alternatívny nosič pre EMD) boli aplikované ako negatívne kontroly.

Výsledky sú uvedené v tabulke 1. Iba deriváty matrice zubnej skloviny alebo proteíny alebo deriváty matrice zubnej skloviny inhibovali rast niektorých mikroorganizmov. Neboli prítomné žiadne známky difúznych zón okolo proteínu, čo ukazuje na to, že aplikované EMD proteíny agregovali na povrchu agaru a že bol inhibovaný rast len tých mikroorganizmov, ktoré boli v priamom kontakte s proteínmi. Ked boli odobrané vzorky zo zón inhibície a tieto vzorky boli kultivované v kvapalnom inédie (LB médium s doplnkovými zložkami), tak boli získané monokultúry pôvodných mikroorganizmov, čo ukazuje, že aktívne proteíny nie sú baktericidné. Všetky kontroly boli v teste negatívne, čo ukazuje na to, že žiadny nešpecifický mechanizmus neovplyvnil výsledky.

Tabuľka 1: Rast (+/-) na hornej ploche testovanej substancie

EMD frakcia A: hlavne amelogenin s približne 26-20 kDa; EMD frakcia B: proteíny s približne 17-13 kDa;

EMD frakcia C; peptidy s približne 10-5 kDa;

EMD frakcia H: všetky proteíny v EMD s vyššou molekulovou hmotnosťou ako 27 kDa;

+ - normálny rast mikroorganizmov;

- úplná inhibícia rastu mikroorganizmov;

+/- - určitá inhibícia rastu v porovnaní s negatívnymi kontrolami.

Všetky výsledky uvedené v tabuľke boli zaznamenané druhý deň (pre aeróbne kultúry) alebo po piatich dňoch (pre anaeróbne kultúry) inkubácie.

Tieto výsledky ukazujú, že EMD obsahuje proteíny alebo peptidy, ktoré môžu po agregácii na povrchu inhibovať rast niektorých gram-negatívnych tyčiniek a niektorých gram-pozitívnych kokov. Vzhľadom na základné charakteristiky EMD proteínov (ref. jpc) a preto, že účinok nie je mikrobicídny, je možným vysvetlením pozorovaného účinku to, že proteínové agregáty vytvárajú nerozpustnú bariéru, ktorá separuje mikroorganizmy od rastových substrátov.

Príklad 3: Vplyv EMD na rýchlosť väzby Actinomyces viscosus in vitro

Úvod

Bol testovaný vplyv EMD na počiatočnú väzbu Actinomyces viscosus, orálneho organizmu, ktorý sa hojne vyskytuje v zubnom povlaku, ale ktorý nie je uvádzaný do súvislostí so závažnou periodontitídou. Hoci tento organizmus môže tvoriť agregáty s Porphyromonas gingivalis a tak môže ovplyvňovať kolonizáciu povrchu koreňov potenciálnymi periodontálnymi patogénmi, sú Actinomyces spp. nachádzané v relatívne hojnom počte v zdravých subgingiválnych lokalitách (tieto zistenia zodpovedajú zistením uvedeným v Liljemark et al., Microb. Immunol. 8: 1993, str 5-15, ktorí zistili, že po liečbe periodontu sa počty Actinomyces spp. značne zvýšili). Haffajee et al., J. Clin. Periodont. 24, 1997,, str. 767-776, zistili z počtu mikroorganizmov v subgingiválnych povlakoch, že pri jedincoch s dobrou odpoveďou na počiatočnú periodontálnu liečbu boli relatívne hojne prítomné A. viscosus a T. denticola.

Materiály

Actinomyces viscosus bol získaný od Dr. A.J. van Winkelhoff (Dept. of Oral Microbiology, ACTA). EMDOGAIN^R bol získaný od BIORA (Malmô, Švédsko). RBS detergenčné činidlo bolo získané od Fluka (Fluka Chemie AG, Buchs, Švajčiarsko).

Kultivácia a odber baktérií

A. viscosus bol naočkovaný z platní s krvným agarom do vsádzkovej kultúry v Schadlerovom kvapalnom médie a bola vykonaná kultivácia počas 24 hodín pri 37’C. Táto kultúra bola použitá na naočkovanie druhej kultúry v Schadlerovom bujóne, v ktorom sa bola kultivácia realizovala počas 16 hodín. Bunky boli získané centrifugovaním (5 min. pri 6500 x g) a boli premyté dvakrát destilovanou vodou. Potom boli mikroorganizmy spracované sonikáciou počas 20 sekúnd pri 30 W (Vibra Celí model 375, Sonics and Materials Inc., Danbury, CT, USA) na rozrušenie bakteriálnych reťazcov a agregátov. Sonikácia bola prerušovaná za ochladzovania kúpelom ladu a vodou. Bunky boli počítané pri použití Burker-Turkerovho počítača buniek. Nakoniec bol A. viscosus suspendovaný v adhéznom tlmivom roztoku (2 mM fosforečnan draselný, 50 mM chlorid draselný a 1 mM chlorid vápenatý, pH 6,8).

Potiahnutie sklenených platní

Sklenené platne boli dôkladne očistené sonikáciou v 5%

RBS detergenčnom činidle, boli dôkladne vymyté vodou, boli prepláchnuté metanolom a nakoniec boli prepláchnuté destilovanou vodou. Týmto postupom sa získal vodný kontaktný uhol nula stupňov. EMD bol rozpustený v 0,01 M kyseline octovej v koncentrácii 7,5 mg/ml. Sklenené platne boli rozdelené na dve poloviny pomocou teflónovej značky (DÁKO A/S, Glostrup,

Dánsko). Kyselina octová (0,01 M) bola aplikovaná na jednu stranu a 250 EMD na druhú stranu. Sklenené platne boli sušené vzduchom v komôrke počas 4-6 hodín.

Prietokový pokus

Prietoková komôrka a počítačový systém použité v tomto pokuse sú schematicky znázornené na obr. 3. Pred každým pokusom boli všetky trubice a prietoková komôrka naplnené adhéznym tlmivým roztokom tak, aby systém neobsahoval žiadne vzduchové bubliny. Potiahnuté sklenené platne tvorili dno prietokovej komôrky. Prietok bol nastavený na 2,5 ml/min (čo je porovnatelné s rýchlosťou toku slín u človeka). Bakteriálna suspenzia sa nechala cirkulovať systémom približne 3-4 hodín a bol stanovený počet baktérií adherujúcich k substrátu. Boli uskutočnené tri nezávislé pokusy. Všetky pokusy boli vykonané s 3xl0⁸ bunkami na 250 ml adhézneho tlmivého roztoku. Počas pokusu boli každých 10-15 minút zhotovené snímky v 6 vopred vybraných miestach platne potiahnutej EMD a kontrolou. Výška kanálu paralelnej prietokovej komôrky bola 0,6 mm.

Analýza údajov

Po spočítaní adherujúcich baktérií vo všetkých snímkoch boli údaje transformované na baktérie na štvorcový centimeter. Pre každý pokus bol konečný počet mikroorganizmov na cm² použitý pre štatistickú analýzu (Študent t-test pre párové merania pri použití n ako počtu pokusov).

Výsledky

Pokus 1 (obr. 4) ukázal postupné zvyšovanie počtu naviazaných mikroorganizmov, najmä počas prvých 150 minút prietoku. Po tomto čase dosiahol počet mikroorganizmov naviazaných na EMD plató 2,0 x 10⁶ baktérií na cm², čo je približne 4-krát viac, ako na časti sklenenej platne spracovanej kyselinou octovou.

Tiež v pokuse 2 (obr. 5) stimuloval EMD výrazne väzbu A.viscosus na substrát. Avšak, na počiatku pokusu bol tento efekt menej výrazný. Pravdepodobne to bolo spôsobené nižšou hustotou mikroorganizmov v prietokovom systému. Počas 90 minút sa počet baktérií naviazaných na EMD postupne zvyšoval vzhľadom na kontrolu a po 3 hodinách dosiahol maximum 1,4 x 10⁶ na cm², čo je 3-násobné zvýšenie.

Tretí pokus (obr. 6) ukázal stimuláciu adherencie A. viscosus na EMD poťah už po 5 minútach toku. EMD indukoval rýchle zvýšenie počtu naviazaných mikroorganizmov počas prvých 45 minútach. Potom pokračovala adherencia mikroorganizmov progresívne. Väzba na stranu spracovanú kyselinou octovou mala podobný charakter, s menším počtom adherujúcich mikroorganizmov. Po 200 minútach bola väzba na EMD poťah dvakrát vyšší ako na povrch spracovaný kyselinou octovou.

V 3 pokusoch dohromady bol rozdiel štatisticky významný (p < 0,05).

Z výsledkov sa zdá, že EMD, použitý ako poťah na sklenenom povrchu, má významný stimulačný efekt in vitro pre väzbu A.viscosus. Hoci dosiaľ nie je jasné, ktoré mechanizmy sú zodpovedné za túto vyššiu iniciálnu väzbu, predpokladá sa, že organizmy interagujú s prolínovými zvyškami, ktoré sú hojne prítomné v amelogeninovej zložke komerčne dostupnej proteínovej zmesi. Bakteriálna adhézia je často určovaná špecifickými interakciami proteín-peptid a lektín-uhľovodan. Je známe, že A.viscosus sa môže pomocou svojich fimbrií 1. typu viazať na proteíny bohaté na prolín, ako sú slinné proteíny bohaté na prolín (PRP) a kolagén I. a III. typu.

Špecifické interakcie medzi EMD a niektorými mikroorganizmami môžu mat významné následky pre zloženie biologického potahu v dutine ústnej, pretože môžu menit ekológiu povlakov. Keď môže prebehnút ekologický posun v prospech organizmov, ktoré nie sú asociované s ochorením periodontu, tak môže EMD zlepšit ochorenie periodontu iba týmto mechanizmom. Ten je samozrejme odlišný od iných výhodných účinkov EMD.

Príklad 4: Vplyv EMD na rýchlost naviazania Streptococcus mutans in vitro

Úvod

Existuje veľa dôkazov pre kauzálnu úlohu organizmov v povlakoch pre patogenézu ochorenia dutiny ústnej, ako je periodontitída a zubný kaz. Súčasný model tvorby supragingiválneho povlaku predpokladá, že Streptococcus spp. sú prevládajúce organizmy kolonizujúce povrch zubu. Tak sa povlaky vyvíjajú v dôsledku rastu baktérií a ďalšej kolonizácie inými druhmi baktérií. Táto kolonizácia môže prebiehat väzbou baktéria-baktéria, alebo môže byt umožnená molekulami slín. Rast povlaku je tiež podporený produkciou extracelulárnych makromolekúl. S. mutans sa teraz považuje za jeden z najdôležitejších kmeňov v biologickom potahu, pretože je asociovaný so zubným kazom. Hoci bolo preukázané, že niekoľko gram-pozitívnych baktérií (tzn. S.mutans) spôsobujú stratu alveolárnej kosti pri gnotobiotických zvieratách, nie sú tieto mikroorganizmy pravdepodobne hlavnou príčinou vzniku periodontálnych chobotov. Avšak, potenciálne patogénne mikroorganizmy musia byt schopné ako prekonaní obranných mechanizmov hostiteľa a imunitných mechanizmov, tak zahájenia deštrukcie tkaniva hostiteľa.

Materiály

Strepotcoccus mutans NS bol získaný od Dr. H. van der Mei (Matéria Technica, University of Groningen). Emdogain bol získaný od BIORA (Malmô, Švédsko). RBS detergenčné činidlo bolo získané od Fluka (Fluka Chemie AG, Buchs, Švajčiarsko).

Kultivácia a odber baktérií

S.mutans bol naočkovaný z platní s krvným agarom do vsádzkovej kultúry v Todd Hewittovom bujóne a bola vykonaná kultivácia počas 24 hodín pri 37’C. Táto kultúra bola použitá na naočkovanie druhej kultúry v Todd Hewittovom bujóne, v ktorom bola kultivácia realizovaná počas 16 hodín. Bunky boli získané centrifugovaním (5 min. pri 6500 x g) a boli premyté dvakrát destilovanou vodou. Potom boli mikroorganizmy spracované sonikáciou počas 20 sekúnd pri 30 W (Vibra Celí model 375, Sonics and Materials Inc., Danbury, CT, USA) na rozrušenie bakteriálnych reťazcov a agregátov. Sonikácia bola prerušovaná za ochladzovania kúpeía íadom a vodou. Bunky boli rátané pri použití Burker-Turkerovho počítača buniek. Nakoniec bol S. mutans suspendovaný v adhezívnom tlmivom roztoku (2 mM fosforečnan draselný, 50 mM chlorid draselný a 1 mM chlorid vápenatý , pH 6,8).

Potiahnutie sklenených platní

Sklenené platne boli dôkladne očistené sonikáciou v 5%

RBS detergenčnom činidle, boli dôkladne vymyté vodou, boli prepláchnuté metanolom a nakoniec boli prepláchnuté destilovanou vodou. Týmto postupom sa získal vodný kontaktný uhol nula stupňov. EMD bol rozpustený v 0,01 M kyseline octovej v koncentrácii 7,5 mg/ml. Sklenené platne boli rozdelené na dve poloviny pomocou teflónovej značky (DÁKO A/S, Glostrup, Dánsko). Kyselina octová (0,01 M) bola aplikovaná na jednu stranu a 250 μ9 EMD na druhú stranu. Sklenené platne boli sušené vzduchom v komôrke počas 4-6 hodín.

Prietokový pokus

Prietoková komôrka a počítačový systém použité v tomto pokuse sú schematicky znázornené na obr. 3. Pred každým pokusom boli všetky trubice a prietoková komôrka naplnené adhéznym tlmivým roztokom tak, aby systém neobsahoval žiadne vzduchové bubliny. Potiahnuté sklenené platne tvorili dno prietokovej komôrky. Prietok bol nastavený na 2,5 ml/min (čo je porovnatelné s rýchlosťou toku slín u človeka). Bakteriálna suspenzia sa nechala cirkulovať systémom približne 3-4 hodín a bol stanovený počet baktérií adherujúcich k substrátu. Boli uskutočnené tri nezávislé pokusy. Všetky pokusy boli vykonané s 3xl0⁸ bunkami na 250 ml adhézneho tlmivého roztoku. Počas pokusu boli každých 10-15 minút zhotovené snímky v 6 vopred vybraných miestach platne potiahnutej EMD a kontrolou. Výška kanálu paralelnej prietokovej komôrky bola 0,6 mm.

Analýza údajov

Po spočítaní adherujúcich baktérií vo všetkých snímkoch boli údaje transformované na baktérie na štvorcový centimeter. Pre každý pokus bol konečný počet mikroorganizmov na cm² použitý pre štatistickú analýzu (Študent t-test pre párové merania pri použití n ako počtu pokusov).

Výsledky

V každom z troch pokusov vykazoval EDM inhibičný účinok na rýchlosť väzby S.mutans (obr. 7, 8, 9; p < 0,05). Inhibícia mala hodnotu približne 40-70% v porovnaní s kontrolami spracovanými kyselinou octovou.

V prvom pokuse (obr. 7) bola preukázaná inhibícia počtu S.mutans naviazaných na sklenený povrch potiahnutý EMD už po 10 minútach toku. Po 3 hodinách bola väzba inhibovaná na asi 60% v porovnaní s kontrolou.

V druhom pokuse (obr. 8) začal EMP inhibovať väzbu S. mutans po 1,5 hodine toku. Počet S.mutans adherujúcich na EMD dosiahol plató 0,5 miliónu na cm² približne po 40 minútach toku. Po 3,5 hodinách boli počty na úrovni 25% v porovnaní s kontrolou.

V treťom pokuse (obr. 9) bola preukázaná inhibícia väzby S.mutans EMD už od zahájení toku. Rovnako ako v príklade 1 dosiahla inhibícia 60% kontrolných hodnôt po 3 hodinách toku.

Tento pokus preukázal, že EMD má významný inhibičný účinok na adherenciu S.mutans na sklenené povrchy. Možným vysvetlením tejto inhibície môže byť prítomnosť hydrofóbnych zlúčenín v zmesi EMD. Jedným z proteínov hojne prítomných v zmesi je amelogenin; proteín, ktorý obsahuje okrem kyslej hydrofilnej C-koncovej sekvencie tiež hydrofóbne jadro obsahujúce 100-300 zvyškov bohatých na prolin, leucín, metionín a glutamín. Saito et al., Árch. Oral Biol. 42, 1997, str. 539-545, zistili,,že adherencia rôznych kmeňov S.mutans na imobilizované hydrofóbne proteíny (OAIS) bola inhibovaná. Autori pripisujú tento účinok negatívnemu náboju na povrchu mikroorganizmu (ako je to v prípade S.mutans). Iné charakteristiky povrchu môžu takisto ovplyvňovať adherenciu na substrát. S.mutans obsahuje povrchový antigén I/II, ktorý má N-koncovú časť bohatú na alanín a obsahuje tandémové repetitívne sekvencie. Predpokladá sa, že tento región má štruktúru α-skrutkovice, ktorá nadobúda konformáciu závitu a ktorá môže zodpovedať za hydrofóbny charakter bunkového povrchu spojený s expresiou antigénu I/II.

Príklad 5: Vplyv EMD na rast niektorých periopatogénov

Prevotella intermedia a Porphyromonas gingivalis boli vopred kultivované počas 10-16 hodín pri 37’C v tioglykolátovom médie doplnenom 0,5 mg/l vitamínu K a 5 mg/l hemínu v aeróbnej atmosfére vytváranej GasPakPlus zariadením vo vhodných nádobách. Ako náhle dosiahli kultúry OD₆₀₀ » 0,1-0,2, čo zodpovedá hustote buniek 10⁶-10⁷ cfu (jednotiek vytvárajúcich kolónie) na ml, boli odobrané 100 μΐ alikvoty a baktérie boli vyzrážané odstredením. Baktérie boli resuspendované v 100 μΐ čerstvo pripravenej zmesi ľudského séra a sterilného salinického roztoku a suspenzie obsahujúce 10⁵-10⁶ buniek boli prenesené do sterilných 1,5 ml Eppendorf skúmaviek a boli zmiešané s (i) 100 μΐ prípravku EMD (3 mg EMD v 0,1 PGA), (ii)

100 μΐ PGA nosiča alebo (iii) 100 μΐ zmesi séra/NaCl ako kontroly rastu. 10 μΐ alikvoty na testovanie rastu boli odoberané po 0, 3, 6 a 24 hodinách. Alikvoty boli sériovo riedené v sterilnom 0,9% roztoku NaCl a 10 μΐ jednotlivých riedení bolo naočkovaných na Schaedlerov agar. Kultivačné podmienky boli rovnaké ako pre predbežnú kultiváciu. Agarové platne boli inkubované počas 3-4 dní a potom boli vyrátané cfu a bunkové hustoty (cfu/ml). Všetky pokusy boli opakované 6 raz.

Výsledky (uvedené ako percentá cfu/ml vzhľadom ku koncentrácii v čase 0)

1) Kontrolné kultúry v rôznych časoch h 6 h 24 h

P. intermedia P. gingivalis

100

100

160

100

125

150

2) Kultúry v prítomnosti	PGA nosiča v rôznych časoch
	0	3 h	6 h	24 h
P. intermedia	100	140	25	10
P. gingivalis	100	75	50	5
3) Kultúry v	prítomnosti	EMD v rôznych časoch
	0	3 h	6 h	24 h
P. intermedia	100	40	0	0
P. gingivalis	100	30	0	0

Kultúry boli výrazne inhibované prítomnosťou EMD v porovnaní s kontrolami so samotným nosičom alebo bez pridania EMD.

Príklad 6: Testovanie vplyvu EMDOGAINU^R na zlepšené hojenia rany v mäkkých tkanivách po chirurgickom zákroku na periodonte

Cieľom tohto príkladu je ukázať vplyv derivátov matrice zubnej skloviny a/alebo proteínov matrice zubnej skloviny na zlepšené hojenie rany v mäkkých tkanivách po chirurgickom zákroku na periodonte.

Pokusné defekty v marginálnom periodonte viac ako 50 zubov opíc druhu makak boli vytvorené odstránením zubného cementu, periodontálnej membrány a marginálnej alveolárnej kosti na cerviko-apikálnu vzdialenosť približne 5 mm pomocou zubného vrtáku. Do týchto pokusných defektov potom nebolo aplikované bučí nič, alebo bola vykonaná aplikácia derivátu matrice zubnej skloviny (získaného z EMDOGAINU^R bud vo forme nerekonštituovaného lyofilizovaného prášku, alebo vo forme rekonštituovaného prostriedku). Koncentrácia proteínu v rekonštituovanom prostriedku bola približne 5-30 mg/ml a aplikovaný objem bol od približne 0,1 do približne 0,2 ml na defekt.

Hojenie rany bolo hodnotené vizuálne počas nasledujúcich 8 týždňov. V defektoch, do ktorých bol aplikovaný EMDOGAIN^r, bolo pozorované dobré hojenie (bez zarudnutia alebo opuchu) a zanedbateľná tvorba povlaku po 2 týždňoch, ked boli odstránené stehy, dobré hojenie a malá gingivitída po 5 týždňoch a zhojenie bez komplikácií po 8 týždňoch, ked bol pokus ukončený. Naopak, v kontrolných defektoch bol po 2 týždňoch pozorovaný zápal s retrakciou a hojná tvorba povlaku, a po 5 a 8 týždňoch bola pozorovaná závažná retrakcia a gingivitída.

Príklad 7: Testovanie vplyvu derivátov matrice zubnej skloviny a proteínov matrice zubnej skloviny na hojenie rany po chirurgickom zákroku na periodonte

Cieľom tohto príkladu je ukázať vplyv derivátov matrice zubnej skloviny a proteínov matrice zubnej skloviny na zlepšené hojenie rany u pacientov po chirurgickom zákroku na periodonte .

Päťdesiat päť (55) pacientov vyžadujúcich chirurgický zákrok na periodonte bolo rozdelených do dvoch skupín, kde pri jednej skupine bol vykonaný bežný chirurgický výkon s modifikovanou Widmanovou flap technikou (20 pacientov) a pri druhej skupine bola vykonaná rovnaká operácia s aplikáciou EMDOGAINU^r (35 pacientov) (použitá koncentrácia bola 30 mg proteínu na ml a bolo aplikovaných približne 0,3 ml na zub. Žiadnemu z pacientov neboli v čase zákroku podané antibiotiká, ale všetci boli inštruovaní k dennému používaniu aseptických (chlórhexidínových) roztokov na vyplachovanie úst.

Aktívne dotazovanie pacientov bolo uskutočnené v čase odstraňovania stehov (1-3 týždne po chirurgickom zákroku). Zatial čo 3 (15%) kontrolní pacienti udávali komplikácie vyžadujúce antibiotickú liečbu, iba 1 (3%) pacient ošetrený EMDOGAINOM^R vyžadoval takú terapiu.

Príklad 8: Testovanie vplyvu derivátov matrice zubnej skloviny a proteínov matrice zubnej skloviny na hojenie rany po extrakcii zubu

Cielom tohto príkladu je ukázať vplyv derivátov matrice zubnej skloviny a proteínov matrice zubnej skloviny na hojenie rany po extrakcii 3. moláru.

Pacientom vo veku 30 rokov alebo viac so symetricky zarazenými alebo čiastočne zarazenými tretími molármi vyžadujúcimi odstránenie bola vykonaná extrakcia tretej stoličky klasickou metódou obsahujúcou vytvorenie vertikálneho vrecka na vykonanie nutnej osteotómie a rezu. Zatial čo druhá stolička bola extrahovaná a dutina bola vyplnená EMD0GAIN0M^R pred urobením stehov. Všetkým pacientom boli podané antibiotiká (3 g amoxicilínu alebo 1 g erytromycínu) 1-2 hodiny pred chirurgickým výkonom a po výkonu im bol podaný Ibuprofen (600 mg x 3). Boli inštruovaní k vyplachovaniu chlórhexidínom (0-1%, 10 ml x 2) počas 4 týždňov.

Stehy boli odstránené po 2 týždňoch. Hojenie miest s aplikáciou EMDOGAINU^R a kontrolných miest bolo hodnotené ako pacientom, tak dentistom. V jednom centre boli pri 9 pacientoch vykonané kontralaterálne extrakcie s/bez aplikácie EMDOGAINU^r. Pri jednom pacientovi bola pozorovaná mierna iritácia od stehov na obidvoch stranách, zatial čo iný pacient mal výz64 namné bolesti len na kontrolnej strane, ale nie na strane ošetrenej EMDOGAINOM^R. V druhom centre udávali 3 pacienti z 6 bolesti iba na kontrolnej strane. V treťom centre bola pri jednom pacientovi diagnostikovaná závažná komplikácia, alveolitída, ktorá prebiehala na kontrolnej strane. Strana ošetrená EMDOGAINOM^R sa zhojila bez problémov. Iný pacient mal miernu iritáciu od stehov na obidvoch stranách, ale iba na kontrolnej strane bol zápal a bolesť, ktoré vyžadovali opakované výplachy salinickým roztokom a užívanie analgetík.

Tieto klinické výsledky ukazujú, že aplikácia EMDOOGAINU^R do dutiny po extrakcii zubu múdrosti môže zlepšiť hojenie a znížiť inak častý bolestivý opuch.

Príklad 9: Testovanie vplyvu derivátov matrice zubnej skloviny a proteínov matrice zubnej skloviny na hojenie alveolitis sicca

Cielom tohto príkladu je ukázať vplyv derivátov matrice zubnej skloviny a proteínov matrice zubnej skloviny na hojenie alveolitis sicca (suchej dutiny).

Po odstránení 35 radix relicta mal pacient mužského pohlavia.vo veku 70 rokov významnú bolesť a opuch súvisiaci s extrakčnou dutinou. Po vyšetrení jeho dentistom bolo jasné, že sa u nej vyvinula alveolitis sicca, pri ktorej sa počiatočné koagulum rozpadá a kostová stena dutiny nekrotizuje. Prilahlá kosť a mäkké tkanivá boli zápalovo zmenené.

Pacient mal anamnézu srdcového zlyhania a bol liečený antikoagulačným liekom Marevanom. V dôsledku tohto ochorenia mal zníženú cirkuláciu periférnej krvi. Tiež fajčil pravidelne niekoíko cigariet denne.

Alveolitída bola liečená tradičným spôsobom spočívajúcim v odstránení nekrotickej kosti a indukcii nového krvácania. Ďalej bolo mobilizované ďasno a dutina bola uzatvorená stehom. Pacient bol potom liečený penicilínom (apocilín 660 mg, 2 tablety ráno a večer počas 7 dní) na liečbu infekcie a takisto si vyplachoval ústa dvakrát denne roztokom chlórhexidínu. Po piatich dňoch, po ukončení podávania antibiotík, sa pacient dostavil na zubársku kliniku s trvajúcou výraznou bolesťou.

Bola vykonaná vizuálna prehliadka operovanej oblasti a palpácia a vyšetrenie sondou a bolo preukázané, že alveolitída pretrváva a že je prítomná nekrotická kosť. Rôntgenové vyšetrenie ukázalo deštrukciu a nekrózu kosti pod apikálnou oblasťou alveolu. Operovaná oblasť bola opäť vyčistená a vzniknutý defekt v kosti bol vyplnený EMDOGAINOM^R (30 mg/ml, maximálne 0,5 ml) a bola uskutočnená nová sutúra ďasna na uzavrenie alveolu. Nebola zahájená žiadne ďalšia liečba, ale pacient pokračoval vo vyplachovaní roztokom chlórhexidínu. 0 dva dni neskoršie udával pacient vymiznutie bolestí a opuchu. Klinické vyšetrenie a odstránenie stehov jeden týždeň po liečbe EMDOGAINOM^R ukázalo dobré hojenie bez prítomnosti nekrotické tkaniva alebo zápalu a intaktné ďasno bez zarudnutia alebo opuchu prekrývajúcej ranu. Pri sondovaní a palpácii nebolo krvácanie ani bolesť. Nebol prítomný zápach z úst ani exsudát. Pacient neopisoval žiadnu bolesť alebo iné príznaky.

Príklad 10: Testovanie profylaktického vplyvu derivátov matrice zubnej skloviny a proteínov matrice zubnej skloviny na alveolltis sicca

Cielom tohto príkladu je ukázať profylaktický vplyv derivátov matrice zubnej skloviny a proteínov matrice zubnej skloviny na alveolitis sicca.

82-ročná pacientka ženského pohlavia mala longitudinálnu fraktúru koreňu zubu 44. Tento zub bol nosným zubom v mostíku v rozsahu zubov 35 až 46 a bol endodonticky liečený pred niekoľkými rokmi. Klinicky bolo ďasno obklopujúce zub zápalovo zmenené a bola prítomná gingiválna kapsa v rozsahu celého apexu pri zube na linguálnej strane. Rôntgenový snímok ukázal lokálnu periodontitídu zubu 44.

Pacientka mala dobrú orálnu hygienu, ale mala ochorenie srdca liečené Marevanom (antikoagulačným činidlom) a krvácanie z ďasna bolo ľahko provokované sondovaním. Pred 6 mesiacmi bol pacientke chirurgicky odstránený zub 35 z dôvodov závažnej periodontitídy. Po tejto operácii mala dlhodobo alveolitis sicca. Velmi sa obávala toho, aby odstránenie zubu 44 nespôsobilo rovnaké postchirurgické komplikácie. Bola informovaná, že kombinácia jej vysokého veku, liečby Marevanom a infikovaného koreňa a gingiválneho vrecka výrazne zvyšuje riziko pooperačných komplikácií ako je alveolitída, ale že nie je iná alternatíva ako chirurgické odstránenie koreňových fragmentov.

Pacientka súhlasila s odstránením zubu 44 a s pokusnou profylaktickou liečbou EMDOGAINOM^R na prevenciu vzniku alveolitis sicca. Pacientke bola pod anestézou vykonaná incisia a odstránenie bukálnej kosti za účelom odstránenia koreňového fragmentu bez straty mostíka. Po odstránení bol prázdny alveolus mechanicky vyčistený a vyplnený EMDOGAINOM^R (30 mg/ml, max. aplikácia 0,5 ml) a lalok bol reponovaný s jedným stehom. Rovnaký deň večer pacientka udávala (telefonicky) dlhodobé krvácanie z operovanej oblasti (liečba Marevanom nebola ukončená pred operáciou), ale nie iné príznaky. Pri odstránení stehu päť dní po výkonu bola operačná rana v mäkkých tkanivách celkovo zhojená. Pacientka neudávala žiadne príznaky ako bolesť alebo opuch po chirurgickom výkonu a bola celkom velmi spokojená s liečbou.

- 67 Príklad 11: Testovanie vplyvu derivátov matrice zubnej skloviny a proteínov matrice zubnej skloviny na hojenie post traumatických komplikácií

Cieľom tohto príkladu je ukázať vplyv derivátov matrice zubnej skloviny a proteínov matrice zubnej skloviny na hojenie post-traumatických komplikácií u pacienta.

Po nehode mal pacient postihnutý horný predný zub, ktorý bol ligovaný na pohotovostnej klinike. Dentista zistil, že zuby 11 a 21 sú avitálne a zuby 12 a 22 majú mezio-incizálne fraktúry triedy I alebo II. Marginálne ďasno bola významne zápalovo zmenené a špatné priliehalo k povrchu zubov. Pacient udával bolesti a znecitlivenie, opuch a divnú chuť a zápach. Boli prítomné tiež príznaky poranenia periodontálneho ligamenta v apikálnych regiónoch zubov 11 a 21. Obidva centrálne rezáky boli vyčistené a korene boli vyplnené čerstve namiešaným Ca(OH)₂·

Po 4 týždňoch bolo hojenie stále neuspokojivé. Stav prešiel do chronického zápalu a zuby boli považované za stratené. Štandardnou terapiou tohto stavu by bola extrakcia všetkých štyroch rezákov a ich náhrada mostíkom alebo implantátom.

Avšak pacient odmietol túto liečbu a ako posledný pokus o záchranu zubov bol vykonaný prenos gingiválneho laloku na všetkých štyroch postihnutých zuboch (11, 12, 21, 22). Boli použité dve ampuly EMDOGAINU^R (60 mg v 3 ml). Maximálne 0,2 ml EMDOGAINU^R (30 mg/ml) na zub bolo aplikovaných injekčnou striekačkou pred tým, ako boli laloky zošité 7 stehmi. 4 stehy boli odstránené 5 dní po výkonu. Potom došlo k výraznému zlepšeniu subjektívnych aj klinických príznakov. Pacient už neudával bolesti a nebol prítomný zápach alebo pachuť z postihnutej oblasti. Po 2 týždňoch boli odstránené zostávajúce stehy. Ďasno nevykazovalo žiadne známky zápalu a pacient nemal obťaže. Ďasno bolo zdravé a bez príznakov zápalu; pevne priliehalo k zubu a/alebo alveolárnej kosti, malo ružovú farbu (nebolo zarudnuté, ako je to pri zápalu) a malo normálnu (nie opuchnutú) intradentálnu papilu. Ďalej, značné zlepšení bolo pozorované v podobe obnovenia periodontálneho ligamentu v postihnutej časti zubu a ukladánie novej alveolárnej kosti bolo vizualizované rôntgenovým vyšetrením.

Príklad 12: Hojení traumatických rán na susedných zuboch a nervoch

Kasuistika

Pacientka ženského pohlavia vo veku 39 let mala závažnú pericoronitídu vôkol íavého dolného zubu múdrosti. Na verejnej zubnej klinike bol zub čiastočne odstránený pri ponechaní apikálnej poloviny zubu v čelisti po iatrogénnej fraktúre koreňu. Deň po chirurgickom odstránení koreňového fragmentu bola pacientka s bolesťami konzultovaná so špecialistom na orálnu chirurgiu.

Dva dni po výkonu bola pacientka u svojho dentistu na kontrole. Mala opuch na lavej strane a mala pretrvávajúcu a kompletnú blokádu lavého mandibulárneho nervu. Klinické a rôntgenové vyšetrenie ukázalo, že počas chirurgického výkonu bola pri vŕtaní vážne poškodená kosť čelisti, apikálna tretina distálneho koreňa zubu 37 a kanál mandibulárneho nervu (pozri rôntgenovú snímku, obr. 1A). Pri sondovaní bola hĺbka distálneho vrecka na zubu 37 25 mm od vrcholu korunky zubu, čo bola hĺbka zadného vrcholu distálneho koreňa.

V snahe o indukciu hojenia kosti a nervu a regeneráciu strateného periodontálneho ligamentu na zubu 37 bola operačná rana otvorená a starostlivo vyčistená. Po vypláchnutí obnaženej kosti salinickým roztokom bol povrch distálneho koreňa 37 a mandibulárneho nervu pokrytý EMDOGAINOM^R (30 mg/ml, apliko69 vané v nadbytku; približne 1 ml) a rana bola uzatvorená tromi stehmi. Pacientka bola poučená, aby si vyplachovala ústa chlórhexidínovým roztokom (Cordosyl^R) dvakrát denne počas ďalších piatich dní a bola jej naordinovaná päťdenná profylaktická liečba penicilínom (Ampicilín 660 mg x 4).

Po desiatich dňoch prišla pacientka na kontrolu a na odstránenie stehov. V tomto čase opuch zmizol a hojenie mäkkých tkanív bolo veľmi dobré. Napriek tomu kompletná anestéza mandibulárneho nervu pretrvávala a pacientka bola informovaná, že prognóza pri natrhnutom nerve je prinajlepšom neistá. V tento čas bolo z dôvodov anestézy nemožné zistiť vitalitu zubu 37. Zvyčajne vedie také poranenie koreňu zubu k nekróze drene a k ankylóze zubu. Na prevenciu týchto komplikácií je indikovaná endodontická liečba. Avšak na zistenie toho, či môže pokusná terapia navodiť hojenie periodontálneho ligamentu, pacientka súhlasila s tým, že zub zostane dajaký čas bez ošetrenia. Pacientka bola zvaná na kontroly raz za mesiac.

O dva mesiace neskoršie udávala pacientka lokálnu hyperestézu v ľavej polovine dolného rtu, čo je príznakom hojenia nervu. Mäkké tkanivá v oblasti 37-38 boli dokonale zhojené bez jazvy. Rôntgenová snímka ukázala tvorbu novej kosti v extrakčnom alveole. Zub 37 a okolité tkanivá boli stále necitlivé.

Štyri mesiace po liečbe anestéza odznela a zub 37 bol pri testovaní vitálny, ale hypersenzitívny, ako na teplotu, tak pri elektrickom teste. Rôntgenová snímka ukázala, že kosťová výplň extrakčného alveolu bola významná a boli prítomné známky periodontálne j regenerácie na distálnom koreni zubu 37.

Päť mesiacov po zahájení liečby EMDIGAINOM^R bola vitalita zubu 37 normálna. V tomto čase bola na rôntgenovej snímke patrná úplná regenerácia funkčného periodontálneho ligamentu (obr. 1B) a novo vytvorená alveolárna kosť normálneho vzhladu vyplnila kostové defekty a extrakčný alveolus. Neboli prítomné známky ankylózy.

Hĺbky vrecka distálne na zubu 37 bola pri sondovaní teraz iba 10 mm, čo je približne 1 mm pod cementoenamelovým spojením. Po tejto kontrole bola pacientka prepustená zo sledovaní ako celkom zhojená a bola odoslaná na pravidelné 1-ročné kontroly.

Komentár

Kompletné a rýchle hojenie traumatických rán na susedných zuboch a nervoch po chirurgickom odstránení zubu múdrosti je vzácne. Obvyklé komplikácie, ako bola hore opísaná komplikácia, zvyčajne končia kompletným odstránením poraneného zubu, alebo minimálne endodontickým odstránením zubnej drene a vyplnením koreňových kanálkov kosťou s ankylózou. Ruptúra nervu sa zvyčajne hojí 8-12 mesiacov, pokial vôbec, a niektoré oblasti s parestéziami pretrvávajú niekolko rokov. Rýchlosť a dobrá kvalita hore opísaného hojenia sú velmi neobvyklé a mali by byt považované za známku prínosu EMDOGAINU^R pre hojenie rán.

Rôntgenoyé vyšetrenia:

A: Pacient dva dni po odstránení zubu 38. Je prítomný velký defekt distálne na zubu 37 a postihnutie mandibulárneho kanálu. Tiež alveolárna kosť disto-bukálne na zubu 37 bola odstránená počas chirurgického zákroku.

B: Pacient päť mesiacov po chirurgickom zákroku. Sú prítomné známky kompletného funkčného periodontálneho ligamentu (lamina dura) v defekte na distálnej časti koreňa zubu 37. Nie sú príznaky ankylózy. Sú zretelné hranice mandibulárneho kanálu a extrakčný alveolus je celkom vyplnený kosťou. Tiež sú prítomné známky tvorby novej disto-bukálnej alveolárnej kosti okolo zubu 37.

Príklad 13: Testovanie vplyvu derivátov matrice zubnej skloviny a proteínov matrice zubnej skloviny na hojenie ulcus cruris (venózneho vredu)

Pacient 1

Pacientom bol muž narodený v roku 1926 a mal anamnézu opakovaných trombóz s posttrombotickým syndrómom a recidivujúcimi holeňovými vredmi. Bol liečený systémovo antikoagulačnými kumarínovými derivátmi a vredy boli liečené lokálne pri použití prípravku Crupodex (monomér dextránu) BIOGAL a 3% roztoku kyseliny borítej.

V čase zahájenia terapie prípravkom EMDOGAIN^R mal oválny holeňový vred velkosti 5 x 4 cm a hĺbky 0,5 mm, ktorý bol v štádiu granulácie s veími špatnou epitelizáciou.

Defekt bol dezinfikovaný 3% H₂O₂ a 500 μΐ prípravku EMDOGAIN^R bolo aplikováných po kvapkách a tieto kvapky boli rovnomerne rozotrené sterilnou tyčinkou. EMDOGAIN^R bol ponechaný počas 10 minút, na vzduchu a potom bola rana zakrytá Inadine (Johnson and Johnson Rayon) obväzom impregnovaným 10% jódpovidónovou mastou.

Po 5 dňoch prebehla epitelizácia proximálnej časti vredu a vred sa zmenšil na 1,8 x 2,2 cm a neboli známky vedľajších reakcií (zápalu). Nebol aplikovaný žiadny EMDOGAIN^R. Po 12 dňoch prebehla dfalšia epitelizácia v proximálnej časti a nová epitelizácia v laterálnej časti v oblasti približne 2 x 2 cm. Takmer polovina vredu bola zhojená. Bolo aplikových 400 μΐ prípravku EMDOGAIN^R.

Po 19 dňoch prebehla ďalšia epitelizácia v proximálnej a laterálnej časti vredu, ale nie v distálnej časti, kde bol vred dosť hlboký (približne 1 mm). Viac ako polovina vredu bola zhojená. Bolo aplikovaných 300 μΐ prípravku EMD0GAIN^R. Od zahájenia liečby prípravkom EMDOGAIN^R pacient neudával žiadnu bolesť vo vrede, na rozdiel od stavu pred liečbou. EMDOGAIN^r bol potom aplikovaný raz týždne do dňa 40 (v dávke 200 μΐ) a vred bol považovaný za úplne zhojený po 47 dňoch.

Pacient 2

Pacientkou bola žena narodená v roku 1949 a mala varixy, chronickú žilnú insuficienciu a recidivujúce holeňové vredy. Mala polyvalentnú alergiu na farmaceutické činidlá (lieky), rovnako ako varikózny ekzém. Bola v predchádzajúcom čase liečená lokálne Otosporínovými kvapkami (polymyxín B sulfát + neomycín sulfát + hydrokortizón) a hydrokortizonovými obväzmi.

V čase zahájenia liečby prípravkom EMDOGAIN^R mala holeňový vred s velkosťou 1 cm v priemere a hĺbkou 2 mm. Bolo aplikovaných 300 μΐ prípravku EMDOGAIN^R.

Po 5 dňoch bola patrná epitelizácia 2 mm okolo defektu (po obvode) a neboli známky vedlajších reakcií (zápalu). Nebol aplikovaný prípravok EMD0GAIN^R. Po 12 dňoch sa velkosť defektu zmenšila na priemer 2 mm a bolo aplikovaných 100 μΐ prípravku EMDOGAIN^R.

Po 19 dňoch mal vred stále ešte priemer 2 mm, ale jeho spodina granulovala a vred už nebol tak hlboký (približne 0,2 mm). Bylo aplikovaných 100 μΐ prípravku EMD0GAIN^R.

Rovnaká pacientka mala iný vred na druhej nohe, ktorý mal velkosť približne 0,3 x 1 cm. Bolo aplikovaných 200 μΐ prípravku EMDOGAIN^R.

Po 7 dňoch bola prítomná nová epitelizácia, na spodine bolo granulačné tkanivo a veľkosť sa zmenšila na približne 0,2 x 0,5 cm.

Potom bolo na každý vred aplikovaných 100 μΐ prípravku EMD0GAIN^R raz týždne do dňa 40 a vredy boli považované za úplne zhojené po 47 dňoch. Neboli pozorované žiadne alergické reakcie na EMD0GAIN^R.

Na rovnakej nohe vznikol nový vred majúci veľkosť približne 0,5 x 0,3 cm a na tento vred bolo aplikovaných 100 μΐ prípravku EMDOGAIN^R.

Pacient 3

Pacientkou bola žena narodená v roku 1929 a mala hlbokú žilnú trombózu po erysipelu a v čase zahájenia terapie prípravkom EMDOGAIN^r mala veľmi rozsiahly holeňový vred s veľkosťou približne 15 x 19 cm v štádiu progresie, kde tento vred bol po rôznej liečbe považovaný za takmer beznádejný. 700 μΐ prípravku EMD0GAIN^R bolo aplikovaných na plochu približne 3 cm od horného okraja.

Po 7 dňoch nebola prítomná žiadna epitelizácia, ale liečená plocha bola transparentnejšia (lepšie štruktúrovaná) s malými rozptýlenými oblasťami granulácie a v tejto oblasti nebola bolesť ani známky progresie. Na rovnakú oblasť bolo aplikovaných 700 μΐ prípravku EMD0GAIN^R.

Po 4 týždňoch sa u pacientky rozvinula infekcia, pravdepodobne spôsobená Pseudomonas, v distálnej časti vredu neliečenej prípravkom EMDOGAIN^R. Bolo aplikovaných 700 μΐ prípravku EMDOGAIN^R. Infekcia vymizla po 7 dňoch.

- 74 Pacient 4

Pacientkou bola žena narodená v roku 1947 a mala varixy so superficiálnou tromboflebitídou po erysipelu a v čase zahájenia terapie prípravkom EMDOGAIN^R mala holeňový vred s velkosťou približne 2 x 0,8 cm s čistou, ale negranulujúcou spodinou. Bolo aplikovaných 300 μΐ prípravku EMDOGAIN^R.

Po 7 dňoch sa velkosť vredu zmenšila na približne 0,7 x 0,3 cm a po obvode bola prítomná epitelizácia a na spodine granulácia. Bolo aplikovaných 200 μΐ prípravku EMDOGAIN^R a potom bolo počas 5 týždňov aplikovaných 100 μΐ prípravku EMDOGAIN^r za týždeň. Vred bol považovaný za úplne zhojený po piatich týždňoch.

Príklad 14: EMDOGAIN^r ako doplnok pri nechirurgickej periodontálnej liečbe v mieste povrchu lalokov

Cielom výskumu bolo zhodnotenie toho, či môže aplikácia prípravku EMDOGAIN^r zlepšiť výsledky hojenia po nechirurgickej periodontálnej liečbe. Špecifickým cielom tejto štúdie bolo hodnotenie účinku v mieste povrchu lalokov.

Návrh štúdie

Štúdia bola vykonaná ako intra-individuálne longitudinálne testovanie s trvaním 6 mesiacov. Štúdia bola dvojito zaslepená, rozštiepená, placebom kontrolovaná a randomizovaná.

Jedincovia pacientov liečených na Clinic of Periodontics, Depart ment of Periodontology, Gôteborg University, pre stredne pokročilú chorobu periodontu.

- 75 Zaraďovacie kritériá aspoň 3 miesta povrchu laloku v každom z 2 kontralaterálnych kvadrantov s hĺbkou vrecka pri sondovaní 5 mm a s aspoň jedným párom miest s hĺbkou pri sondovaní 6 mm;

vybraný zub musí mať vitálnu dreň, ako je stanovené termálnou alebo elektrickou stimuláciou, alebo - pokiaí bol liečený koreňový kanálok - musí byť asymptomatický a bez technických obťaží.

Liečba

Pri vstupnom vyšetrení boli všetci pacienti zoznámení so stavom a boli nim podané informácie o správnych meraniach supragingiválneho povlaku. Bolo vykonané hodnotenie rozsahu a polohy koreňa.

Potom, čo prestalo krvácanie z vreciek, bol do vreciek aplikovaný na 2 minúty 24% EDTA gél (získaný od Biora AB, Švédsko). Potom boli vrecká opatrne vypláchnuté salinickým roztokom a potom bola aplikovaná buď testovaná (EMDOGAIN^R), alebo kontrolná substancia (PGA gél).

Hodnotenie

Základné vyšetrenie, vyšetrenie v 1-, 2-, 3-, 8-a 24mesiaci obsahovalo nasledujúce zložky:

1. stav orálnej hygieny - prítomnosť/neprítomnosť povlakov

2. stav ďasien - (Gingival Index; Loe 1967)

3. sondovanie hĺbky vrecka

4. sondovanie adherencie

5. krvácanie pri sondovaní - prítomnosť/neprítomnosť (15 sekúnd)

6. hypersenzitivita zubu - po vzduchovom stimule (áno/nie)

- 76 7. stupeň diskomfortu - zaznamenávaný 1-, 2-a 3-týždne po vyšetrení pri použití 10 cm « vizuálnej analógovej stupnice (VAS).

Povlaky; priemer (sd)

	kontrola	emdogainr
Vstupné vyšetrenie	0,10 (0,30)	0,19 (0,40)
1 týždeň	0,08 (0,27)	0,05 (0,22)
2 týždne	0,05 (0,22)	0,02 (0,15)
3 týždne	0,05 (0,22)	0,10 (0,30)
6 týždňov	0,14 (0,35)	0,19 (0,40)
26 týždňov	0,12 (0,33)	0,07 (0,34)

Gingiválny index; priemer (sd)

i-	kontrola	EMDOGAINR
Vstupné vyšetrenie	1,40 (0,50)	1,40 (0,50)
1 týždeň	1,00 (0,32)	0,87 (0,52)
2 týždne	0,83 (0,44)	0,74 (0,45)
3 týždne	0,69 (0,60)	0,60 (0,50)
6 týždňov	0,67 (0,53)	0,64 (0,58)
26 týždňov	0,62 (0,54)	0,62 (0,49)

ΊΊ

Krvácanie pri sondovaní; %

	kontrola	emdogainr
Vstupné vyšetrenie	100	100
1 týždeň	67	44
2 týždne	43	33
3 týždne	29	26
6 týždňov	33	31
26 týždňov	19	24

Subjektívne hodnotenie pacienta; VAS skóre
Týždeň 1
	kontrola	emdogainr
VAS skóre
0-20	8%	0%
21-40	15%	8%
41-60	31%	30%
61-80	8%	0%
81-100	38%	62%

Týždeň 3

	kontrola	EMDOGAINR
VAS skóre
0-20	14%	7%
21-40	0%	7%
41-60	3%	0%
61-80	21%	22%
81-100	57%	64%

Záver

Pacienti mali menej pooperačných problémov, menšie krvácanie a lepší gingiválny index. Tieto výsledky podporujú pria znivý efekt EMDOGAINU^R na hojenie rán.

Príklad 15: Pilotná štúdia hojenia rán na ošípaných

Úvod

Predmet štúdie

Predmetom štúdie je hodnotenie hojenia rezných rán u ošípaných a hodnotenie vplyvu EMD na tieto rany.

Dôvody pre volbu zvieracieho druhu

Ošípané sú vybrané ako testovací model preto, že bolo overené, že tento druh je dobrým modelom na hodnotenie hojenia rán u človeka.

Materiály a metódy

Zvieratá

Pokus bol vykonaný na 4 samiciach SPF ošípaných (krížencov Danish country, Yorkshire a Duroc). V čase zahájenia aklimatizačného obdobia meli zvieratá telesnú hmotnosť približne 35 kg.

Zvieratá sa nechali aklimatizovať počas 1 týždňa, počas ktorého boli zvieratá sledované na vylúčenie zvierat v špatnom zdravotnom stave. Všetky pozorovania boli zaznamenávané.

Chov

Štúdia bola uskutočnená v zvieracom boxe opatrenom filtráciou vzduchu pri teplote 21’C ± 3’C, relatívnej vlhkosti 55% ± 15% a výmene vzduchu 10-krát za hodinu. Box bol osvetlovaný v cykle 12 hodín svetla a 12 hodín šera. Svetlo bolo od 06 do 18 h.

Zvieratá boli v boxoch umiestnené samostatne.

Podstielka

Ako podstielka boli použité piliny LIGNOCEL H 3/4 od Hahn and Co., D-24796, Bredenbek-Kronsburg. Bola vykonaná pravidelná analýza na možné kontaminujúce zložky.

Potrava

Bola podávaná komerčne dostupná potrava pre ošípaných Altromin 9033 od Chr. Petersen A/S, DK-4100 Ringsted (približne 800 g dvakrát denne). Pravidelne bola vykonávaná analýza hlavných nutričných zložiek a možných kontaminujúcich zložiek.

Pitie

Dvakrát denne bola zvieratám podávaná pitná voda. Bola vykonaná pravidelná analýza na možné kontaminujúce zložky.

Poranenia

Poranenia boli vytvorené v deň 1. Zvieratá boli uvedené do anestézy prípravkami Stresnil^R Vet. Janssen, Belgia (40 mg azaperonu/ml, 1 ml/kg) a Atropinom DAK Dánsko (1 mg atropínu/ ml, 0,5 ml/10 kg), ktoré boli podané ako jedna intramuskulárna injekcia, po ktorej nasledovala i.v. injekcia prípravku Hypnodil^R Janssen, Belgia (50 mg metomidátu/ml, približne 2 ml).

V dorzolaterálnej oblasti na jednej strane boli zvieratá vyholené, omyté mydlom a vodou, dezinfikované 70% etanolom, ktorý bol opláchnutý sterilným salinickým roztokom, a nakoniec boli osušené sterilnou gázou.

poranení (25 x 25 x 0,4 mm) bolo urobených na pripravených plochách, 4 na každej strane chrbta, pri použití ACCUDermatom (GA 630, Aesculap^R). Rany boli očíslované 1 (najviac kraniálna) až 4 (najviac kaudálna) na ľavej strane chrbta a 5 (najviac kraniálna) až 8 (najviac kaudálna) na pravej strane chrbta.

Zrazená krv bola odstránená sterilnou gázou.

Bezprostredne pred chirurgickým zákrokom, približne 8 hodín po zákroku a kedykoľvek to bolo nutné bola zvieratám podaná intramuskulárna injekcia prípravku Anorfin^R, A/S GEA, Dánsko (0,3 mg buprenorfinu/ml, 0,04 ml/kg).

Dávkovanie

Poranenia boli liečené nasledovne:

	Zviera č.
1	2
Lokalizácia	naľavo	napravo	naľavo	napravo
Kraniálne	A			B
	B	A
		B	A
Kaudálne			B	A

	Zviera č.
3	4
Lokalizácia	naľavo	napravo	naľavo	napravo
Kraniálne	A			B
	B	A
		B	A
Kaudálne			B	A

A = kontrola B = EMD

Približne 15 minút pred podaním bol EMD prostriedok pripravený podľa návodu výrobca. EMD prostriedok bol použitý počas 2 hodín po príprave. Na poranenia liečené spôsobom B bol EMD aplikovaný vo forme tenkej vrstvy na povrch poranenia. Jedna ampula EMD bola použitá na 4 rany.

Obväzy

Rany boli obviazané pri použití Tegaderm^R. Obväzy boli prekryté gázovou bandážou fixovanou prípravkom Fixomul^R. Obväzy, gáza a Fixomul^R boli fixované prubánovým obväzom, Bend-a-rete^R (Tesval, Itália). Obväzy boli kontrolované denne.

Obväzy boli menené v deň 2 (všetky zvieratá) a 3 (zvieratá č. 3 a 4).

Pred každou výmenou obväzu boli zvieratá uvedené do anestézy intramuskulárnou injekciou do krku (1,0 ml/10 kg telesnej hmotnosti) zmesi Zoletil 50^RVet., Virbac, Francia (125 mg tiletamínu a 125 mg zolazepámu v 5 ml rozpúšťadla, ml) Rompun^RVet., Bayer, Nemecko (20 mg xylazínu/ml, 6,5 ml) a Methadonu^RDAK, Nycomed DAK, Dánsko (10 mg metadónu/ml,

2,5 ml).

Kontrola rán

Každá rana bola skontrolovaná a fotografovaná v deň 2 (všetky zvieratá), 3 (všetky zvieratá) a 4 (zvieratá č. 3 a 4). Bol hodnotený stupeň exsudácie a zápalu. Zistenie novotvorenéej epidermis bolo opísané podrobne.

Klinické príznaky

Všetky viditelné známky ochorenia a akékolvek zmeny správania boli zaznamenávané denne. Akákolvek odchýlka od normálu bola opísaná s ohladom na čas vzniku, trvania a intenzitu.

Telesná hmotnosť

Zvieratá boli zvážené pri dodaní, v deň vytvorenia poranenia a pri ukončení testu.

Konečné vyšetrenie

V deň 3 (približne 56 hodín po poranení) boli zvieratá

č. 1 a 2 usmrtené incisiou v oblasti véna a artéria subclavia, ktorá bola vykonaná po omráčení pištoľou.

V deň 4 (približne 72 hodín po poranení) boli zvieratá

č. 3 a 4 usmrtené incisiou v oblasti véna a artéria subclavia, ktorá bola vykonaná po omráčení pištoľou.

Odber tkanivových vzoriek

Každá rana bola vyrezaná ako blok separovaný od kostrového svalu. Pokiaľ bola prítomná akákoľvek adherencia na prítomný kostrový sval, tak bola čast svalu obsiahnutá v materiáli na fixáciu. Každý blok bol fixovaný vo fosfátom tlmenom neutrálnom 4% formaldehyde.

Histologické vzorky

Po fixácii boli 4 reprezentatívne vzorky z všetkých rán ponorené do parafínu, narezané na nominálnu hrúbku 5 μπι a farbené hematoxylínom a eozínom. Po farbení boli rezy prezreté v svetelnom mikroskope pri použití mriežky. To umožnilo meranie celkovej dĺžky rany a dĺžky epitelizovaného povrchu. Tento pomer bol vyjadrený ako percento rany pokrytej epitelom na sklíčko. Boli určené priemerné hodnoty pre každú ranu a potom boli vyrátané priemery pre skupinu.

Štatistická analýza

Údaje boli spracované na dosiahnutie priemerných hodnôt pre skupinu a štandardných odchýlok. Tiež boli identifikované hodnoty ležiace pomimo rozsah. Potom bola každá premenná testovaná na homogenitu variancie pri použití Barlettovho testu. Pokial bola varianca homogénna, tak bola pre premennú vykonaná analýza variancie. Pokial boli detekované štatisticky významné odlišnosti, tak mohli byť možné rozdiely medzi skupinami testované Dunnettovým testom. Pokial bola variancia heterogénna, tak bola každá premenná testovaná Shapiro-Wilkovou metódou.

V prípade normálnej distribúcie mohli byť možné rozdiely medzi skupinami identifikované Student-t testom. Inak boli rozdiely medzi skupinami hodnotené Kruskal-Wallisovým testom. Pokial boli detekované akékolvek štatisticky významné rozdiely medzi skupinami, tak bola následná identifikácia skupín vykonaná pri použití Wilcoxon Rank-Surn testu.

Štatistická analýza bola vykonaná pri použití SAS^R procedúr (verzia 6.12) opísaných v SAS/STAT^R User's Guide, verzia 6, 4. vydanie, zväzok 1+2, 1989, SAS Inštitúte Inc., Čary, North Carolina 27513, USA.

Zoznam sekvencii <110> Biora AB <120> Prostriedky na báze proteínov matrice na hojenie rán <130> 20542PC1 <160> 2 <170> FastSEQ pre Windows Verzia 3.0 <210> 1 <211> 407 <212> PRT <213> neznámy

Met Ser Ala 1	Ser Lys 5	íle Pro	Leu Phe Lys Met Lys 10	Gly	Leu Leu Leu A 5
Phe Leu Ser	Leu Val 20	Lys Met	Ser Leu Ala Val Pro 25	Ala	Phe Pro Gin 30
.Arg Pro Gly 35	Gly Gin	Gly Met	Ala Pro Pro Gly Met 40	Ala 45	Ser Leu Ser
Leu Glu Thr 50	Met Arg	Gin Leu 55	Gly Ser Leu Gin Gly 60	Leu	Asn Ala Leu
Ser Gin Tyr 65	Ser Arg	Leu Gly 70	Phe Gly Lys Ala Leu 75	Asn	Ser Leu Trp 80
Leu His Gly	Leu Leu 85	Pro Pro	His Asn Ser Phe Pro 90	Trp	íle Gly Pro 95
Arg Glu His	Glu Thr 100	Gin Gin	Pro Ser Leu Gin Pro 105	His	Gin Pro Gly 110
Leu Lys Pro 115	Phe Leu	Gin Pro	Thr Ala Ala Thr Gly 120	Val 125	Gin Val Thr
Pro Gin Lys 130	Pro Gly	Pro His 135	Pro Pro Met His Pro 140	Gly	Gin Leu Pro
Leu Gin Glu 145	Gly Glu	Leu íle 150	Ala Pro Asp Glu Pro 155	Gin	Val Ala Pro 160
Ser Glu Asn	Pro Pro 165	Thr Pro	Glu Val Pro íle Met 170	Asp	Phe Gly Asp 175
Pro Gin Phe	Pro Thr 180	Val Phe	Gin íle Ala His Ser 185	Leu	Ser Arg Gly 190
Pro Met Ala 195	His Asn	Lys Val	Pro Thr Phe Tyr Pro 200	Gly 205	Met Phe Tyr
Met Ser Tyr 210	Gly Ala	Asn Gin 215	Leu Asn Ala Pro Gly 220	Arg	íle Gly Phe
Met Ser Ser 225	Glu Glu	Met Pro 230	Gly Glu Arg Gly Ser 235	Pro	Met Gly Tyr 240
Gly Thr Leu	Phe Pro 245	Gly Tyr	Gly Gly Phe Arg Gin 250	Thr	Leu Arg Gly 255
Leu Asn Gin	Asn Ser 260	Pro Lys	Gly Gly Asp Phe Thr 265	Val	Glu Val Asp 270
Ser Pro Val 275	Ser Val	Thr Lys	Gly Pro Glu Lys Gly 280	Glu 285	Gly Pro Glu
Gly Ser Pro 290	Leu Gin	Glu Pro 295	Ser Pro Asp Lys Gly 300	Glu	Asn Pro Ala
Leu Leu Ser 305	Gin íle	Ala Pro 310	Gly Ala His Ala Gly 315,	Leu	Leu Ala Phe 320
Pro Asn Asp	His íle	Pro Asn	Met Ala Arg Gly Pro	Ala	Gly Gin Arg

330 ³²⁵ n·. Kla Ala ASP pro Leu íle Thr Pro ^Glu

Leu Leu Gly Val Thr Pro Ala Ala Ala A P 350 ³⁴? v Glu Thr Tyr Gly Ala Asp Val Thr Thr Pro Leu

Leu Ala Glu Val Tyr Glu Thr Tyr y _{365 G}ly Asp Gly C- Ala Thr Met As_P íle Thr Met Ser Pro Asp Thr _CX„ n°o PXO Heh M. W -X «. OXn VaX «· 385 m Trp Arg Phe GXn GXu Pro <210> 2 <211> 324 <212> PRT <213> neznámy

Met

Lys

Pro

Asn

Ser

Met

Glu

Asn

Ser

Leu

Pro

Val

His

Pro

Pro

Pro

1

5

10

15

Leu

Pro

Ser

Gin

Pro

Ser

Leu

Gin

Pro

His

Gin

Pro

Gly

Leu; 30 r

Lys

Pro

20

25

Phe

Leu

Gin

Pro

Thr

Ala

Ala

Thr

Gly

Val

Gin

Val

Thr

Pro

Gin

Lys

35

40

45

Pro

Gly

Pro

His

Pro

Pro

Met

His

Pro

Gly

Gin

Leu

Pro

Leu

Gin

Glu

50

55

60

Gly

Glu

Leu

íle

Ala

Pro

Asp

Glu

Pro

Gin

Val

Ala

Pro

Ser

Glu

Asn

65

70

75

80

Pro

Pro

Thr

Pro

Glu

Val

Pro

íle

Met

Asp

Phe

Gly

Asp

Pro

Gin

Phe

85

90

95

Pro

Thr

Val

Phe

Gin

íle

Ala

His

Ser

Leu

Ser

Arg

Gly

Pro

Met

Ala

100

105

110

His

Asn

Lys

Val

Pro

Thr

Phe

Tyr

Pro

Gly

Met

Phe

Tyr

Met

Ser

Tyr

115

120

125

Gly

Ala

Asn

Gin

Leu

Asn

Ala

Pro

Gly Arg

íle

Gly

Phe

Met

Ser

Ser

130

135

140

Glu

Glu

Met

Pro

Gly

Glu

Arg

Gly

Ser

Pro

Met

Gly

Tyr

Gly

Thr

Leu

145

150

155

160

Phe

Pro

Gly

Tyr

Gly Gly

Phe

Arg

Gin

Thr

Leu

Arg

Gly

Leu

Asn

Gin

165

170

175

Asn

Ser

Pro

Lys

Gly Gly Asp

Phe

Thr

Val

Glu

Val

Asp

Ser

Pro

Val

180

185

190

Ser

Val

Thr

Lys

Gly

Pro

Glu

Lys

Gly.

Glu

Gly

Pro

Glu

Gly

Ser

Pro

195

200

205

Leu

Gin

Glu

Pro

Ser

Pro

Asp

Lys

Gly

Glu

Asn

Pro

Ala

Leu

Leu

Ser

•

210

215

220

Gin

íle

Ala

Pro

Gly

Ala

His

Ala

Gly

Leu

Leu

Ala

Phe

Pro

Asn

Asp

225

230

235

240

His

íle

Pro

Asn

Met

Ala

Arg

Gly

Pro

Ala

Gly

Gin

Arg

Leu

Leu

Gly

245

250

255

Val

Thr

Pro

Ala

Ala

Ala

Asp

Pro

Leu

íle

Thr

Pro

Glu

Leu

Ala

Glu

260

265

270

Val Tyr Glu

Thr Tyr Gly

Ala

Asp 280

Val Thr Thr

Pro Leu 285

Gly

Asp Gly

275

Glu

Ala

Thr

Met

Asp

Íle

Thr

Met

Ser

Pro

Asp

Thr

Gin

Gin

Pro

Pro

290

295

300

Met

Pro

Gly

Asn

Lys

Val

His

Gin

Pro

Gin

Val

His

Asn

Ala

Trp

Arg

305

310

315

320

Phe

Gin

Glu

Pro

Claims (34)

1. Použitie prípravku aktívnej substancie zubnej skloviny na prípravu farmaceutického alebo kozmetického prostriedku na hojenie rán na koži alebo na sliznici.

2. Použitie prípravku aktívnej substancie zubnej skloviny na prípravu farmaceutického alebo kozmetického prostriedku na zlepšenie hojenia rán na koži alebo na sliznici.

3. Použitie prípravku aktívnej substancie zubnej skloviny na prípravu farmaceutického alebo kozmetického prostriedku na regeneráciu alebo reparáciu kože alebo sliznice.

4. Použitie podľa akéhokoľvek z nárokov 1-3, v ktorom je rana prítomná na sliznici v dutine ústnej.

5. Použitie podľa akéhokoľvek z nárokov 1-3, v ktorom je rana poranenia alebo traumy spojené s orálnym chirurgickým výkonom vrátane periodontálnej chirurgie, extrakcie zubu, endodontickej terapie, vkladania zubných implantátov, aplikácie a používania zubných protéz.

6. Použitie podľa akéhokoľvek z nárokov 1-3, v ktorom je rana vybraná zo skupiny zahŕňajúcej aseptické rany, zmliaždené rany, rezné rany, tržné rany, nepenetrujúce rany, otvorené rany, penetrujúce rany, perforujúce rany, bodné rany, septické rany, infarkty a podkožné rany.

7. Použitie podľa akéhokoľvek z nárokov 1-3, v ktorom je rana vybraná zo skupiny zahŕňajúcej ischemické vredy, preleženiny, fistuly, täžšie pohryznutia, popáleniny a defekty po odberu orgánu.

8. Použitie podlá akéhokoľvek z nárokov 1-4, v ktorom je rana vybraná zo skupiny zahŕňajúcej aftózne rany, traumatické rany a rany asociované s herpes.

9. Použitie prípravku aktívnej substancie zubnej skloviny na prípravu farmaceutického prostriedku na prevenciu a/alebo liečbu infekcie.

10. Použitie podlá nároku 9, kde infekcia je spôsobená mikroorgan i zrnom.

11. Použitie podlá nároku 9 alebo 10 na prevenciu alebo liečbu rastu baktérií na sliznicovom povrchu.

12. Použitie podlá nároku 9 alebo 10 na prevenciu alebo liečbu rastu baktérií na nechtu alebo na povrchu zubu.

13. Použitie podlá nároku 9 alebo 10, kde infekcia je prítomná v dutine ústnej.

14. Použitie podlá nároku 13 na profylaxiu a/alebo liečbu bakteriálnej infekcie v dutine ústnej.

15. Použitie podlá akéhokoľvek z nárokov 9-14, v ktorom je infekcia spôsobená baktériou spôsobujúcou zubný kaz, ako je napríklad Streptococcus mutans; baktériou spôsobujúcou ochorenie periodontu, ako je napríklad Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Peptostreptococcus micros, Campylobacter Fusobacterie, Staphylococci), B. forsythus: baktériou spôsobujúcou alveolitídu, ako je napríklad Staphylococcus, Actinomyces a Bacillus: a baktériou spôsobujúcou periapikálne lézie, ako sú napríklad Spirochetes.

16. Použitie podľa akéhokoľvek z nárokov 9-11, kde baktéria je prítomná na koži.

17. Použitie prípravku aktívnej substancie zubnej skloviny na prípravu farmaceutického prostriedku na prevenciu a/alebo liečbu zápalu kože alebo sliznice.

18. Použitie podľa nároku 17, v ktorom je zápal prítomný v dutine ústnej.

19. Použitie podľa nároku 17, v ktorom je zápal prítomný v mieste odberu kosťového štepu.

20. Použitie podľa akéhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, v ktorom je aktívnou substanciou zubnej skloviny matrica zubnej skloviny, deriváty matrice zubnej skloviny a/alebo proteíny matrice zubnej skloviny.

21. Použitie podľa akéhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, v ktorom je aktívna substancia zubnej skloviny vybraná zo skupiny skladajúcej sa z enamelinov, amelogeninov, non-amelogeninov, non-amelogeninov bohatých na prolín, amelinov (ameloblastinu, sheatlinu), tuftelinov a ich derivátov a zmesí.

22. Použitie podľa akéhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, v ktorom má aktívna substancia zubnej skloviny molekulovú hmotnosť najviacej 120 kDa, napríklad najviacej 100 kDa, 90 kDa, 80 kDa, 70 kDa alebo 60 kDa, ako je určené SDS PAGE elektroforézou.

23. Použitie podľa akéhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, v ktorom obsahuje prípravok aktívnej substancie zubnej skloviny zmes aktívnych substancií zubnej skloviny s rôznymi molekulovými hmotnosťami.

24. Použitie podľa akéhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, v ktorom obsahuje prípravok aktívnej substancie zubnej skloviny aspoň dve substancie vybrané zo skupiny zahŕňajúcej amelogeniny, non-amelogeniny bohaté na prolín, tuftelin, trsové proteíny, sérové proteíny, slinové proteíny, amelin, ameloblastin, sheatlin a ich deriváty.

25. Použitie podľa akéhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, v ktorom má aktívna substancia zubnej skloviny molekulovú hmotnosť najviacej 40000.

26. Použitie podľa akéhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, v ktorom má aktívna substancia zubnej skloviny molekulovú hmotnosť v rozmedzí od približne 5000 do približne 25000.

27. Použitie podľa akéhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, v ktorom má hlavná časť aktívnej substancie zubnej skloviny molekulovú hmotnosť približne 20 kDa.

28. Použitie podľa akéhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, v ktorom je aspoň časť aktívnej substancie zubnej skloviny vo forme agregátov alebo môže po aplikácii tvoriť agregáty.

29. Použitie podľa nároku 26, v ktorom majú agregáty veľkosť častíc od približne 20 nm do približne l gm.

30. Použitie podľa akéhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, v ktorom je obsah proteínu v prípravku aktívnej substancie zubnej skloviny v rozmedzí od približne 0,05% hmotn./hmotn.

do 100% hmotn./hmotn., napríklad od približne 5-99% hmotn./ hmotn.; približne od 10-95% hmotn./hmotn.; približne od 15-90% hmotn./hmotn.; približne od 20-90% hmotn./hmotn.; približne od 30-90% hmotn./hmotn.; približne od 40-85% hmotn./hmotn.; približne od 50-80% hmotn./hmotn.; pri92 blížne od 60-70% hmotn./hmotn.; približne od 70-90% hmotn./ hmotn.; alebo približne od 80-90% hmotn./hmotn.

31. Použitie podlá akéhokolvek z predchádzajúcich nárokov, v ktorom farmaceutický prostriedok ďalej obsahuje farmaceutický prijatelnú prísadu.

32. Použitie podlá nároku 31, v ktorom je farmaceutický prijatelnou prísadou propylénglykolalginát.

33. Použitie podlá nároku 31, v ktorom je farmaceutický prijatelnou prísadou kyselina hyalurónová alebo jej sol alebo derivát.

34. Použitie podlá akéhokolvek z nárokov 1-33, v ktorom je p

na hojenie rán na koži alebo na slizniciach použitý EMDOGAIN alebo akýkolvek proteín alebo peptid obsiahnutý v tomto prípravku .