SK10932000A3 - Mrazuvzdorný proteín, sekvencia nukleovej kyseliny kódujúca mrazuvzdorný proteín a potravinový výrobok s jeho obsahom - Google Patents

Description

Mrazuvzdorný proteín, sekvencia nukleovej kyseliny kódujúca mrazuvzdorný proteín a potravinový výrobok s jeho obsahom

Oblasť techniky

Vynález sa týka mrazuvzdorných proteínov (AFPs) a mrazeného potravinového výrobku obsahujúceho AFPs.

Doterajší stav techniky

Mrazuvzdorné proteíny (AFPs) boli navrhnuté za účelom zlepšenia mrazuvzdorných vlastností potravín.

Pre potreby vynálezu je termín AFP v doterajšej technike dobre známy, ide najmä o tie proteíny, ktoré vykazujú inhibičnú aktivitu proti rastu kryštálov ľadu. Ako príklad pozri US 5,118,792.

WO 90/13571 opisuje mrazuvzdorné kryštály vyrábané chemicky alebo rekombinantnými DNA metódami. AFPs môžu byť vhodne použité v potravinových výrobkoch.

WO 92/22581 opisuje AFPs z rastlín, ktoré možno použiť na kontrolu tvaru ľadových kryštálov v zmrzline. Tento dokument tiež opisuje spôsob extrahovania polypeptidových zlúčenín z mimobunkového priestoru rastlín infiltrovaním extrakčného média do listov bez porušenia rastlín.

WO 94/03617 opisuje výrobu AFPs z kvasníc a ich možné použitie v zmrzlinách. WO 96/11586 opisuje AFPs z rýb produkované mikróbami.

Viaceré literárne zdroje uvádzajú izoláciu a/alebo použitie rastlinných proteínov na kryoochranu. Kryoochranné proteíny majú funkciu v ochrane rastlinných membrán proti poškodeniu mrazom. Tieto proteíny však nemajú rekryštalizačné vlastnosti a preto nespadajú pod termín AFPs.

Hincha v časopise Journal of Plánt Physiology, 1992, 140, 236-240 opisuje izoláciu kryoochranných proteínov z kapusty. Volger v Biochimica et Biophysica Acta, 412 (1975), 335-803 opisuje izoláciu kryoochranných listových proteínov zo

-2špenátu. Boothe v Plánt Physiol (1995), 108: 759-803 opisuje izoláciu proteinov z Brassica napus. Opäť sa však tieto ptoreíny považujú skôr za kryoochranné proteíny ako AFPs. Neven v Plánt Molecular Biology 21: 291-305, 1993 opisuje DNA charakteristiku kryoochranného proteinu zo špenátu. Salzman v Abstracts a Reviews z 18. výročného stretnutia ASEVA/ýchodnej sekcie v Am. &j. Enol. Vitie., Zv. 44, č. 4, 1993 opisuje prítomnosť varuodolných polypeptidov v púčikoch Vitis. Hoci proteíny sú analogické s mrazuvzdornými proteínami rýb, sú to kryoochranné proteíny, a nie AFPs. Lin v Biochemical and Biophysical Research Communication, Zv. 183, č. 3, 1992, str. 1103-1108 a v Lin, Plánt Physiology (1992) 99, 519-525 opisuje 15 kDa kryoochranný proteín z Arabidopsis Hakaira. Houde v Plánt Journal (1995) 8 (4), 583-593 uvádza kryoochranné proteíny z pšenice.

Avšak použitie AFPs sa doteraz neuplatnilo pre komerčne dostupné potravinové výrobky. Jednou z príčin sú vysoké náklady a komplikovaný spôsob získavania AFPs. Ďalšou príčinou je, že AFPs, ktoré boli doteraz navrhované na použitie v potravinových výrobkoch nemôžu byť začlenené do štandardnej zmesi výrobku, pretože majú tendenciu byť nestabilné počas spracovávania, najmä počas pasterizácie. Túto destabilizáciu podľa všetkého spôsobuje denaturácia AFPs, čo je známy efekt bežne pozorovaný u peptidov a proteinov.

V našej predbežne nepublikovanej patentovej prihláške WO 98/4148 bolo opísané, že z prírodných zdrojov, ako napríklad lišajníkov, môžu byť izolované veľmi dobré AFPs.

Teraz sa stanovila čiastková sekvenciu aminokyselín veľmi aktívnej AFP z lišajníka.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je mrazuvzdorný proteín, ktorý môže byť odvodený od lišajníka, pričom jeho zdanlivá molekulová hmotnosť je od 20 do 28 kDa a jeho aminokyselinová sekvencia na N-konci má aspoň 80 % prekrytie s nasledovnou sekvenciou A-P-A-W-M-D-A-E-S-F-G-A-l-A-H-G-G-L a modifikované verzie a izoformy tohto proteinu.

-3Vo výhodnom uskutočnení vynález poskytuje mrazuvzdorný proteín, ktorý možno odvodiť z lišajníka, pričom tento proteín má zdanlivú molekulovú hmotnosť približne 24 kDa a poradie aminokyselín od N-konca je: A-P-A-W-M-D-A-E-S-F-GA-l-A-H-G-G-L.

Do rozsahu vynálezu sú zahrnuté aj proteiny so sekvenciou veľmi podobnou vyššie uvedenej sekvencii. Pre potreby vynálezu sú do jeho rozsahu zahrnuté všetky RI aktívne proteiny s poradím aminokyselín, ktoré sa najmenej z 80 % prekrýva s vyššie uvedenou sekvenciou. Výhodnejšie je prekrytie najmenej 90 %, najvýhodnejšie viac než 95 %, napríklad tie aminokyselinové sekvencie, ktoré sa buď nelíšia vôbec alebo sa líšia len jednou alebo dvomi aminokyselinami od vyššie uvedenej sekvencie.

Pre účely vynálezu stupeň prekrytia dvoch (čiastkových) aminokyselinových sekvencii môže byť vypočítaný nasledovne:

(a) dve aminokyselinové sekvencie sa vyrovnajú a spočíta sa počet identických aminokyselín, ktoré sú identické a vyskytujú sa v rovnakom poradí (X) (b) každá zmena, delécia alebo adícia aminokyseliny sa ráta ako jeden bod a spočíta sa celkový počet zmien, delécií a adícií (Y) (c) stupeň prekrytia sa vypočíta podľa vzorca X*100 %/ (X+Y).

Napríklad dve (čiastkové) aminokyselinové sekvencie z N-konca: A-P-A-V-V-M-G-D-A-E-S-F-G-A-l-A-H-G-G-L sa môžu spojiť s kontrolnou sekvenciou:

A-P-A-V-V-M-G-D-A-E-S-F-G-A-l-A-H-G-G-L

A-P-A-W -M- D-A-E-S-F-G-A-l-A-H-G-G-L

Celkový počet identických aminokyselín v rovnakom poradí je 17. Počet zmien je 1 (W zmenené na V na štvrtom mieste); počet adícií je 2 (V na piatom mieste, G na siedmom mieste); nie sú tam žiadne delécie. Celkový počet zmien, adícií a delécií je teda 3. Stupeň prekrytia vychádza 17*100 %/ (17+3) = 85 %

Takže proteín s (čiastkovou) sekvenciou aminokyselín z N-konca: A-P-A-V-V-M-G-D-A-E-S-F-G-A-l-A-H-G-G-L môže byť zahrnutý do rozsahu vynálezu.

-4Do rozsahu preloženého vynálezu spadajú aj modifikované verzie vyššie uvedených proteínov, kde tieto modifikácie materiálne neovplyvňujú vlastnosti inhibície rekryštaliácie ľadu, ako ich glykozylované verzie.

Pre účely vynálezu pojem 24 kDa molekulová hmotnosť znamená akúkoľvek molekulovú hmotnosť od 20 do 28 kDa pri meraní na SDS-PAGE s použitím štandardných referenčných značkovačov, pričom výhodná molekulová hmotnosť je od 22 do 26 kDa.

Výhodné AFP podľa predloženého vynálezu môžu byť odvodené od lišajníka, najmä od druhu Umbilicaria antarctica.

Do rozsahu predloženého vynálezu môžu byť tiež zahrnuté mrazuvzdorné proteíny, ktoré hoci sú pôvodne odvodené od lišajníka, vyrábajú sa inými spôsobmi, napríklad genetickými modifikačnými technikami, kde napríklad mikroorganizmy alebo rastliny sa geneticky modifikujú tak, aby produkovali vyššie uvedené proteíny. Tieto proteíny tiež spadajú pod pojem môžu byť odvodené od lišajníkov

Do rozsahu predloženého vynálezu tiež spadajú sekvencie nukleových kyselín, ktoré môžu kódovať vyššie opísané AFP.

Vektory obsahujúce sekvencie nukleových kyselín schopné kódovať AFP vynálezu taktiež môžu byť zahrnuté do rozsahu vynálezu.

Z uvedeného vyplýva, že je tiež možné geneticky modifikovať iné prírodné zdroje tak, aby produkovali výhodné AFP ako bolo uvedené vyššie.

Prihlasovatelia tiež zistili, že AFP s vyššie uvedenou sekvenciou zlepšili vlastnosti inhibície rekryštalizácie ľadu. Vhodný test na stanovenie vlastností inhibície rekryštalizácie ľadu je opísaný v príkladoch a zahrňuje rýchle zmrazenie na najmenej -40 °C, napríklad -80 °C a následné uskladnenie na jednu hodinu pri -6 °C. Výhodne AFP podľa predloženého vynálezu poskytujú veľkosť kryštálov následne po teste inhibície rekryštalizácie ľadu, ako bude uvedené v príkladoch, do 15 μίτι, výhodne od 5 do 15 μητ

AFP podľa vynálezu môžu byť výhodne použité v potravinárskych výrobkoch, ktoré sú zmrazené alebo sú určené na zmrazenie. Veľmi výhodné je najmä použitie AFP vo výrobkoch, ktoré sú pred zmrazením zahriate napríklad pasterizáciou alebo sterilizáciou. Veľmi výhodné je tiež použitie v mrazených cukrovinkách.

-5Príkladmi takýchto mrazených výrobkov sú: zmesi mrazených cukroviniek, napríklad zmesi zmrzlín alebo zmesi vodových zmrzlín, ktoré sú pred zmrazením pasterizované. Takéto zmesi sa obyčajne skladujú pri teplote miestnosti. Vhodnými formami výrobku sú napríklad prášková zmes zabalená napríklad vo vrecku alebo vo vrecúškach. Táto zmes môže byť základom mrazeného výrobku, napríklad po pridaní vody, prípadne iných prísad a voliteľne aj po prevzdušnení.

Ďalším príkladom vhodnej zmesi by mohla byť tekutá zmes (voliteľne aj prevzdušnená), ktorá po pridaní ďalších komponentov a voliteľne aj po ďalšom prevzdušnení môže byť zmrazená.

Jasnou výhodou vyššie uvedených zmesí je, že prítomnosť AFP ako prísady umožňuje zmrazenie zmesi v stave kľudu, napríklad v mrazničke doma alebo v obchode bez tvorby neprijateľných ľadových kryštálov a teda so štruktúrou odlišnou od výrobkov, ktoré sa bežne pripravujú mrazením v stave kľudu.

Tieto zmesi sa veľmi vhodne môžu zabaliť do uzavretých obalov (napríklad kartónov, vreciek, krabie, plastických obalov, atd.). Vo všeobecnosti má jeden obal hmotnosť od 10 do 1000 g. Pre viacpočetné obaly je vhodná hmotnosť do 500 kg. Všeobecne hmotnosť obalu je od 10 g do 5000 g.

Ako bolo uvedené vyššie, výhodnými výrobkami, kde možno použiť AFP sú mrazené cukrárske výrobky, ako napríklad zmrzlina alebo vodová zmrzlina. Podiel AFP je výhodne od 0,00001 do 0,5 % hmotn. konečného výrobku. Ak sa používajú suché zmesi alebo koncentráty, koncentrácia môže byť vyššia, aby sa zaistil podiel AFP v konečnom mrazenom výrobku v rámci uvedených hraníc.

Pre účely vynálezu pod pojmom mrazený cukrársky výrobok sa rozumejú mliečne mrazené cukrovinky, napríklad smotanová zmrzlina, mrazený jogurt, šerbet, sorbet, ľadové mlieko a mrazený vaječný krém, ovocné zmrzliny, zmrzliny s mramorovou štruktúrou a mrazené ovocné pyré. Pre niektoré aplikácie je použitie vo fermentovaných potravinárskych výrobkoch menej výhodné.

Výhodne podiel tuhých častí v mrazených cukrovinkách (napríklad cukru, tuku, príchutí, atď.) je väčší ako 4 % hmotn., napríklad väčší ako 30 % hmotn., výhodne od 40 do 70 % hmotn.

-6Mrazený cukrársky výrobok podľa vynálezu môže byť vyrobený akýmkoľvek spôsobom vhodným na výrobu mrazených cukroviniek. Najvýhodnejšie je však zmiešať všetky prísady zmesi pred pasterizáciou a pred začatím zmrazovania.

Zmrazovanie môže výhodne zahrňovať krok vytvrdzovania, napríklad do teploty

-34,4 °C (- 30 °F) alebo nižšej.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Vlastnosti inhibície rekryštalizácie ľadu AFP môžu byť stanovené nasledovne:

Vzorka výrobku obsahujúceho AFP bola upravená tak, že podiel sacharózy dosahoval 30 % hmotn. (ak počiatočný podiel sacharózy bol vyšší, znížil sa riedením, ak bol nižší, pridala sa sacharóza do 30 % hmotn.).

Kvapka vzorky s objemom 3 μΙ sa kvapla na podložné sklíčko, ktoré sa potom prikrylo krycím sklíčkom s priemerom 16 mm a zaťažilo hmotnosťou 200 g, aby sa zabezpečila jednotná hrúbka. Okraje sklíčka sa utesnili priesvitným lakom na nechty.

Sklíčko sa potom umiestnilo na stolček Linkham THM 600 mikroskopu s riadenou teplotou. Stolček sa rýchlo ochladil na -40 °C (50 °C za minútu), pričom sa vytvorilo veľké množstvo malých kryštálov. Teplota stolčeka sa potom rýchlo zvýšila na -6 °C (50 °C za minútu) a udržiavala sa na tejto teplote.

Ľadová fáza sa pozorovala pri -6 °C s použitím Aristloplanovho mikroskopu. Za účelom zlepšenia kontrastu ľadových kryštálov sa použilo polarizované svetlo v kombinácii s lambda platňou. Stav ľadovej fázy (veľkosť ľadových kryštálov) sa zaznamenával fotomikrografiou pri T=0 a T=1 hodinu. Veľkosť ľadových kryštálov (dĺžka) sa určovala obkreslením obvodu kryštálov. Maximálna dĺžka každého jednotlivého kryštálu ľadu z dávky zmrzliny bola vložená do tabuľkového procesora, kde sa analyzovali údaje za účelom zistenia priemernej a štandardnej odchýlky.

-7Ďalší spôsob na testovanie vlastností na inhibíciu rekryštalizácie ľadu je nasledovný:

Mrazuvzdorná aktivita sa merala použitím modifikovaného roztláčacieho testu (splat assay) (Knoght a kol., 1988). Kvapka s 2,5 μΙ sledovaného roztoku v 30% hmotn. sacharóze sa preniesla na čisté, vhodne označené sklíčko s priemerom 16 mm, na ňu sa položilo ďalšie sklíčko a obe sklíčka sa potom stlačili medzi palcom a ukazovákom. Stlačené sklíčka sa ponorili do hexánového kúpeľa s teplotou -80 °C v nádobe so suchým ľadom. Keď sa pripravili všetky stlačené sklíčka, preniesli sa z -80 °C hexánového kúpeľa do pozorovacej komory s obsahom hexánu pri -6 °C s použitím pinzety predchladenej v suchom ľade. Po prenose do -6 °C bolo vidno, že sa stlačené sklíčka zmenili z priehľadných na nepriehľadné. Zmeny boli zaznamenávané videokamerou a prenesené do obrazového analýzového systému (LUCIA, Nikon) s použitím objektívu s 20násobným zväčšením. Vzhľad každej roztlačenej vzorky bol zaznamenávaný v čase = 0 a potom po 30 až 60 minútach. Porovnávala sa veľkosť ľadových kryštálov v oboch vzorkách. Ak veľkosť po 30 až 60 minútach je podobná alebo len o málo väčšia (napríklad o viac než 20 %, výhodnejšie o menej než 10 %, najvýhodnejšie menej než 5 %) v porovnaní s veľkosťou pri t = 0, je to prejav dobrých vlastností inhibície rekryštalizácie ľadových kryštálov.

Vo všeobecnosti tieto testy sa môžu aplikovať na akýkoľvek vhodný výrobok obsahujúci AFP a vodu. Všeobecne úroveň AFP v takomto testovanom výrobku nie je veľmi rozhodujúca a môže sa pohybovať napríklad od 0,0001 do 0,5 % hmotn., výhodne od 0,0005 do 0,1 % hmotn., najvýhodnejšie od 0,001 do 0,05 % hmotn., napríklad 0,01 % hmotn.

Pre tento test možno použiť akýkoľvek vhodný výrobok s obsahom AFP a vody. Avšak všeobecne nie je potrebné získať AFP v čistej forme. Pre praktické aplikácie by normálne stačilo pripraviť tekutý extrakt alebo šťavu prírodného materiálu a potom možno tento extrakt alebo šťavu testovať.

-8Príklad 2

9,5 g Umbilicaria antarctica nazbieraného počas jari 1996 z Antarktídy a uskladneného pri -20 °C bolo homogenizovaných v tekutom dusíku v trecej miske a rozomletých na jemný prášok. Tento prášok sa premiestnil do novej trecej misky udržiavanej pri izbovej teplote. Po pridaní 10 ml 0,2M TrisHCI obsahujúceho 10 mmol/l EDTA bol prášok ďalej rozomieraný a homogenizovaná hmota sa prefiltrovala cez dve vrstvy mušelínu. Zachytený materiál sa znovu dal do trecej misky, pridalo sa k nemu ďalších 10 ml tlmivého roztoku ďalej sa rozomieľal. Tento materiál bol prefiltrovaný vyššie uvedeným spôsobom a filtrát zmiešaný s filtrátom z prvého homogenizačného kroku. Filtrát sa potom centrifugoval pri 30 000 g po dobu 15 minút a kal bol zozbieraný a zmrazený v alikvotných dávkach.

0,15 g NH₄SO₄ bolo rozpustených v 1 ml kalu a roztok bol inkubovaný po dobu 30 minút pri 4 °C. Po centrifugácii pri 30 000 g po dobu 10 minút sa 0,3 g NH₄SO₄ rozpustilo v kale získanom z tohto kroku a roztok sa inkuboval pri 4 °C po dobu 30 minút. Roztok sa centrifugoval pri 30 000 g po dobu 10 minút a kal sa vyhodil. Pelety sa znovu suspendovali v 0,2 ml vody a sériových zriedeniach tohto roztoku a pôvodného extraktu pripraveného v 30 % hmotn. sacharózy vo vode na semikvantitatívnu analýzu stlačenej vzorky. Aktivita stlačenej vzorky by mohla byť sledovaná (pomocou vyššie uvedenej metódy) v pôvodnom extrakte do viac než 200-násobného zriedenia a v opätovne suspendovaných peletách do 800-násobného zriedenia, čo naznačuje, že viac než polovica celkovej aktivity stlačenej vzorky prítomnej v pôvodnom extrakte sa zozbierala v NH₄SO₄ peletách.

200 mikrolitrov 0,1 M TrisHCI s pH 7,5 sa pridalo do resuspendovaných peliet a roztok sa koncentroval v 10 kDa microcone (Amicon) na 150 mikrolitrov. 100 mikrolitrov tohto roztoku sa nanieslo na stĺpec Q-Sepharose, ktorý bol vopred ekvilibrovaný v 50 mM TrisHCI s pH 7,5 použitím chromatografického systému SMART (Pharmacia) pri prietokovej rýchlosti 100 mikrolitrov za minútu pričom sa odoberali 100 mikrolitrové frakcie. Ďalších 800 mikrolitrov v 50 mM TrisHCI s pH 7,5 s 0 až 0,5M NaCl gradientom sa nanieslo na stĺpec cez 1,5 ml a eluát sa monitoroval pri 280 nm. Po 50-násobnom zriedení v 30 % hmotn. sacharóze sa

-9frakcie testovali na aktivitu roztlačenej vzorky ako v Príklade 1. Zistilo sa, že aktivita koreluje s vrcholom OD 280, ktorý eluoval pri približne 0,1 M NaCI, ktorý bol prevažne zozbieraný vo frakcii 14.

mikrolitrová frakcia 14 sa aplikovala na gélový permeačný stĺpec Superdex 75, ktorý bol vopred ekvilibrovaný v 50 mM TrisHCI s pH 7,5 pri prietokovej rýchlosti 40 mikrolitrov na minútu použitím chromatografického systému SMART (Pharmacia). Eluát sa monitoroval pri OD 280 a OD 215 a do 0,6 ml od nanesenia vzorky sa zozbierali 80 mikrolitrové frakcie, v rozmedzí 1,1 ml až 1,6 ml sa zozbierali 50 mikrolitrové frakcie a v rozmedzí 1,6 ml až 3 ml sa zozbierali 100 mikrolitrové frakcie. 1 mikroliter z každej frakcie sa zriedil 25-násobne v 30 % hmotn. sacharóze a testoval na aktivitu roztačenej vzorky. Zistilo sa, že aktivita koreluje s vrcholom OD280 a OD215, ktorý eluoval so zadržaním 1,2 ml vo frakciách 9 a 10. Stĺpec Superdexu sa kalibroval stanovením zadržaného objemu (Ve) štandardných proteínov markérov molekulovej hmotnosti (Sigma) a objemu pórov (Vo) stanoveného ako 0,91 ml nanesením modrého dextránu. Zostavila sa štandardná krivka Iog10 Mr proti Ve/Vo a stanovila sa zdanlivá molekulová hmotnosť OD 280 vrchol korelujúca s aktivitou roztlačenej vzorky lišajníkov ako 30 kDa.

mikrolitrov z frakcií 9 a 10 eluovaných zo Superdex stĺpca sa zmiešalo a koncentrovalo na 10 mikrolitrov v 10 kDa microcne (Amicon) a 3,5 mikrolitra 4x SDS-PAGE vzorkového tlmivého roztoku sa pridalo do 10 mikrolitrových frakcií 9 a 10 eluovaných zo Superdex stĺpca a do frakcií 12 až 16 eluovaných zo stĺpca QSepharose. Po následnom zahrievaní na 95 °C po dobu 5 minút a centrifugácii pri 10 000 g po dobu 3 minút sa 10 mikrolitrov každej vzorky umiestnilo do jamiek do 4% zloženého gélu a polypeptidy sa oddeľovali elektroforézou cez 12% 0,75 mm hrubý SDS-PAGE mini-gel (Biorad). Po elektroforéze sa gél farbil a fixoval v Coomassie Brilliant Blue a odfarbil v zmesi metanoľkyselina octová:voda v pomere (1:4:5) hmotn. Takto sa stanovil polypeptid so zdanlivou Mr 24 kDa v koncentrovaných zmiešaných frakciách 9 a 10 eluovaných zo Superdex stĺpca. Keď sa gél zafarbil striebrom použitím Biorad striebornej farbiacej sady podľa inštrukcii

-10výrobcu, stanovil sa polypeptid s rovnakou zdanlivou Mr vo frakcii 14 eluovanej z QSepharose stĺpca a vo frakciách 9 a 10 eluovaných zo Superdex stĺpca.

Po purifikácii ďalšieho proteínu s použitím v zásade rovnakého postupu ako bol opísaný vyššie sa získala nasledovná sekvencia aminokyselín z N-konca z 24 kDa polypeptidu: A-P-A-V-V-M-G-D-A-E-S-F-G-A-l-A-H-G-G-L

Príklad 3

Neupravený filtrát z lišajníka podľa Príkladu 2 sa vyzrážal síranom amónnym a resuspendoval v 0,2 M TrisHCI s pH 7,5 ako bolo opísané vyššie a potom sa zriedil 1/10 v jednom z nasledujúcich tlmivých roztokov: 0,2M citran sodný s pH 3,0, 0,2M octan sodný s pH 4,0, 0,2M piperazín s pH 5,0, 0,2M bisTris s pH 6,0, 0,2M trietanolamín s pH 7,0, 0,2M Tris s pH 8,0, 0,2M CHES s pH 9,0, 0,2M CAPS s pH 10,0. Tieto vzorky sa potom sériovo riedili 1/2 v príslušnom tlmivom roztoku a roztoky sa miešali v pomere 1:1 so 60% sacharózou pred analýzou roztlačenej vzorky podľa druhého testu, ako bolo opísané v Príklade 1. Medzi pH 10 a pH 6,0 bolo možné jasne zistiť inhibičnú aktivitu až do zriedenia 1/320. Medzi pH 3,0 až 5,0 bolo možné aktivitu jasne zistiť do zriedenia 1/80, čo naznačuje, že hoci proteín si zachováva istú aktivitu pri nízkom pH, jeho aktivita je redukovaná faktorom 4 pri pH 5 alebo nižšom.

Príklad 4

Proteín z vyčisteného mrazuvzdorného lišajníka podľa Príkladu 2 sa oddelil 2 dimenzionálnymi elektroforézami. Gél s obsahom 9,2M močoviny, 4% akrylamidu (2,66 ml 30% akrylamidu 0,8% bisakrylamidu), 2% deionizovaného Triton X 100, 1% 4 až 7 Biolyt amfolytu (Biorad), 1% 3,5 až 10 Biolyt amfolytu (Biorad), 0,1% TEMED, 0,01% persíranu amónneho sa polymerizoval v malých sklených skúmavkách (Biorad). Skúmavky sa opláchli destilovanou vodou a ponorili do minigélového systému umožňujúceho prispôsobiť sa im, pričom horná komora bola naplnená 20mM NaOH a dolná komora bola naplnená 10mM H₃PO₄. Vyčistená

-11 vzorka lišajníka sa zmiešala v pomere 1:1 s prvou dimenziou vzorkového tlmivého roztoku (9,2M močovina, 2,0% Triton X-100, 5% beta-merkaptoetanol, 1% 4 až 7 Biolyt amfolytu, 0,25% 3 až 10 Biolyt amfolytu) a zahriala na 37 °C pred aplikáciou do jedného zo skúmavkových gélov. Na druhú tyčinku sa aplikovali 2 dimenzionálne markérové proteíny (Biorad) a na tretiu tyč sa aplikovala zmes 2 dimenzionálnych markérových proteinov a vzorka lišajníka. Po elektroforéze pri 500 V po dobu 10 minút a 750 V po dobu 4 hodín sa tyčinky vytiahli zo skúmaviek a umiestnili na 3 oddelené 1 mm hrubé 12% SDS-PAGE mini-gély (Biorad) a naniesol sa do nich SDS-PAGE vzorkový tlmivý roztok. Po elektroforéze sa gély zafarbili striebrom použitím Biorad sady podľa inštrukcií výrobcu. Oddelením sa zistili 3 miesta na géli vo vzorke s lišajníkom so zdanlivou Mr približne 24 kDa a PI nižším než 4,5.

dimenzionálne zaostrenie vyčisteného mrazuvzdorného proteinu z lišajníka s použitím plátku gélu pozostávajúceho z rovnakých komponentov ako v prvom dimenzionálnom géli v 2 dimenzionálnej separácii okrem toho, že sa použili Biolyt 3 až 5 amfolyty namiesto Biolyt 4 až 7 amfolyty, odhalilo pás s izoelektrickým bodom nižším než 3,6 po zafarbení striebrom.

Claims (9)

1. PATE NTOVÉ NÁROKY

   1. Mrazuvzdorný protein, ktorý môže byť odvodený od lišajníka, ktorého zdanlivá molekulová hmotnosť je od 20 do 28 kDa a jeho aminokyselinová sekvencia na N-konci má aspoň 80 % prekrytie s nasledovnou sekvenciou: A-P-A-W-M-D-A-E-S-F-G-A-l-A-H-G-G-L a modifikované verzie a izoformy tohto proteínu.
2. 2. Mrazuvzdorný protein podľa nároku 1, ktorého aminokyselinová sekvencia na N-konci je nasledovná:

   A-P-A-V-V-M-G-D-A-E-S-F-G-A-l-A-H-G-G-L a modifikované verzie a izoformy tohto proteínu.
3. 3. Mrazuvzdorný protein podľa nároku 1 alebo 2, ktorý má molekulovú hmotnosťou od 22 do 26 kDa.
4. 4. Mrazuvzdorný protein podľa nároku 1 alebo 2, ktorý má aspoň 90% prekrytie s čiastkovými sekvenciami z nároku 1 alebo 2.
5. 5. Mrazuvzdorný protein podľa nároku 1 alebo 2, ktorý má 100% prekrytie s čiastkovými sekvenciami z nároku 1 alebo 2.
6. 6. Mrazuvzdorný protein podľa nároku 1, kde jeho modifikácia zahrnuje glykozyláciu.
7. 7. Sekvencia nukleovej kyseliny, ktorá kóduje mrazuvzdorný protein podľa jedného alebo viacerých z predchádzajúcich nárokov.
8. 8. Potravinový výrobok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje mrazuvzdorný protein podľa nároku 1 alebo 2.
9. 9. Potravinový výrobok podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým, že je to mrazený cukrársky výrobok.