SK10622001A3 - Použitie antagonistu integrínu ako liečiva na inhibíciu rastu mozgových tumorov - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Predkladaná prihláška vynálezu si nárokuje prioritu z US patentovej prihlášky č. 60/118 126 podanej 1. februára 1995, ktorá je tu obsiahnutá formou referencie.

Tento vynález s týka hlavne problematiky inhibície rastu tumorov, hlavne inhibície rastu mozgových tumorov.

Doterajší stav techniky

Táto prihláška obsahuje rôzne referencie zahrnuté formou odkazov v zátvorkách. Zverejnenie týchto publikácií v ich plnej podobe je zahrnuté formou referencií v tejto prihláške na dokonalejší opisu odbornej oblasti, do ktorej tento vynález spadá. Plné bibliografické citácie týchto referencii sa nachádzajú na konci tejto prihlášky, pred časťou Patentové nároky.

Mozgové tumory, podobne ako iné pevné tumory, vyžadujú neustále sa zvyšujúci prísun krvi, aby bol zabezpečený ich kontinuálny rast cez 1-2 mm^J (1, 2) . Dosahuje sa to pomocou angiogenézy, procesu ktorý je indukovaný endotelovými rastovými faktormi uvoľnenými tumorovými bunkami. Angiogenéza zahŕňa indukciu proliferácie endotelových buniek z pokojnej mikrovaskulatúry, migrácie neoendotelu smerom k tumorovému lôžku a nakoniec maturácie na novú sieť kapilár (3) . Mozgové tumory sú spomedzi všetkých ľudských neoplázií najviac angiogenetické. Základným angicgenetickým faktorom, demonštrovaným buď in situ hybridizáciou alebo špecifickými protilátkami v úsekoch tkaniva pacientov s glioblastómom a medulobiastómom, najbežnejším malígnym mozgovým tumorom, sú vaskulárny endotelový rastový faktor (VEGF) a základný fibroblastový rastový faktor (bFGF) (4-7) . Expresia VEGF a denzita mikrotepničiek v gliových tumoroch v podstate priamo korešponduje so stupňom malignych vlastností a celkovým priebehom (8-9).

Posledné zistenia predpokladajú, že angiogenéza je regulovaná aktiváciou integrínov endotelových buniek, rodinou transmembránových receptorov, ktoré riadia adhéziu bunky na proteíny extracelulárneho matrixu (ECM) väzbou na aminokyselinovú sekvenciu Arg-Gly-Asp (RGD) (10). Ako odpoveď na bEGF a VEGF, podporujú endotelové bunky expresiu integrínov α_νβ3 a α_νβ5 (11-13). Zistilo sa, že glioblastómy a ich asociovaný vaskulárny endotel exprimuje integríny α_νββ a α_νβδ (14-15). Integrínom sprostredkovaná adhézia vedie k propagácii intracelulárnych signálov, ktoré podporujú prežitie bunky, proliferáciu, motilitu a rozrastanie kapilár (16, 17) . Neschopnosť týchto integrínov viazať sa na ligand vedie k apoptóze endotelových buniek (18, 19) . Matrixový glykoproteín vitronectin slúži ako ligand pre α_νβ3 a α_νβκ a je produkovaný na vedúcej invazívnej strane malígneho gliómu (15, '20). Všetky tieto zistenia naznačujú, že komplexná parakrinálna interakcia medzi tumorovými bunkami, mozgovým ECM a integrínom endotelových buniek spolu vedie ku kontinuálnej angiogenéze a rastu malignych mozgových tumorov.

Štúdie využívajúce anti-o^3 protilátky, LM-609 alebo RGD cyklické peptidové antagoništy α_νβ3 a α_νβδ, ktoré zabraňujú interakcii integrínu a ECM, vykázali antiangiogenetickú odpoveď v kuracej chorioalantoickej membráne (CAM) a v modeli myšacej chiméry (21-23). Ďalšie látky ktoré sa zúčastňujú alternatívnych miest angiogenetickej dráhy, ako protilátky k VEGF alebo jeho tyrozínkinázovému receptoru miestu, boli na inhibíciu angiogenézy tiež efektívne (24, 25).

Predchádzajúce štúdie ukázali, že väzba tumorov prsníka, melanómov a HT29-D4 koloniálnych adenokarcinómových buniek na vitronectin je závislá na α_νβ3 a α_νβ₅ (51-53). Vitronectin, produkovaný tumorom a endotelovými bunkami, je rozpoznávaný α_νβ₃ a α_νβ₅ a je ECM proteínom nachádzajúcim sa s v miestach invázie tumoru a neovaskularizácie (54—55). Okrem toho, že vitronectin podporuje prežitie endotelových buniek prostredníctvom ligácie a_v, a tým angiogenézy, expresia vitronectinu môže ďalej zlepšiť adhéziu tumorov a endotelových buniek, ktoré exprimujú integríny α_νβ₃ a α_νβ₅, a tým podporiť ich inváziu. V jednej štúdii sa použil SCID myšací/ľudský chimérický model rakoviny prsníka, pričom invázia tumoru bola po podaní protilátky anti-a^₃ LM-609 podstatne redukovaná, čo naznačuje priamy účinok na biológiu buniek tumoru prostredníctvom blokády α_νβ₃ (56).

Vďaka svojej vysoko invazívnej povahe a stupňu angiogenézy, poskytujú bunkové tumory výborný model pre ďalšie štúdium úlohy integrínov v progrese tumorov. Niekolko štúdií ukázalo, že hustota mikrotepien korešponduje s celkovým efektom a stupňom malignity v astrocytostómach (57-59). Inhibítory angiogenézy, ako TNP-470, trombospondín-1 a trombocytový faktor 4, spôsobili po ich aplikovaní do experimentálnych mozgových tumorov inhibíciu rastu tumoru (60-62). Doteraz však nebol preverený účinok antagonizmu integrínu na inváziu a angiogenézu mozgových tumorov.

Podstata vynálezu

Predložený vynález je založený na prekvapujúcom zistení, že skúmaný antagonizmus integrínov, hlavne α_νβ₃ a α_νβ5, môže podstatne inhibovať tumorogenézu mozgu in vivo. Je založený aj na zistení, že mikrookolie mozgového tumoru je kritické pre jeho správanie a pri určovaní jeho odpovedí na takéto biologicky riadené terapie. Vynález je ďalej založený na zistení, že antagonisty integrínu môžu mať antitumorogénny efekt, nezávisle od antiantiogenézy, ktorá môže synergický spolupracovať pri spomalení rastu tumoru. Predmetom predloženého vynálezu je napríklad zistenie, že antagonizmus integrínu môže indukovať priamu smrť buniek mozgového tumoru.

Jeden aspekt predloženého vynálezu preto predstavuje spôsob inhibície rastu tumoru v mozgu hostitela. Spôsob pozostáva z podávania terapeuticky účinného množstva antagonistu integrínu hostiteľovi, ktorý takúto inhibíciu potrebuje.

V tomto uskutočnení predloženého vynálezu môže byť integrín α_νβ₃ alebo a_vps. Antagonista môže byť polypeptidový antagonista a_v, protilátka proti α_νβ₃, protilátka proti α_νβ5 alebo kombinácia protilátok proti α_νβ₃ a α_νβ₃.

Iný aspekt predloženého vynálezu poskytuje metódu inhibície angiogenézy v tkanive tumoru lokalizovaného v mozgu hostitela. Spôsob pozostáva z podávania kompozície pozostávajúcej z antagonistu integrínu a_v v množstve inhibujúcom angiogenézu.

V tomto uskutočnení predloženého vynálezu je integrínom α_νβ₃ alebo α_νβδ. Antagonistom je polypeptidový antagonista a_v, protilátka proti α_νβ₃, protilátka proti α_νβδ alebo kombinácia protilátok proti α_νβ₃ a α_νβ₅.

Ďalší aspekt predloženého vynálezu poskytuje spôsob inhibície ECM závislej adhézie buniek mozgového tumoru rastúceho v mozgu hostitela. Spôsob pozostáva z podávania terapeuticky účinného množstva antagonistu integrínu a_v, t. j. integrínu α_νβ₃ a α_νβ5· V tomto uskutočnení predloženého vynálezu je antagonistom polypeptidový antagonista a_y alebo kombinácia protilátok proti α_νβ₃ a α_νβ₅.

Ďalší aspekt predloženého vynálezu poskytuje spôsob inhibície na vitronectine závislej migrácie v raste buniek mozgového tumoru v mozgu hostitela. Spôsob pozostáva z podávania terapeuticky účinného množstva antagonistu proti a_v.

V tomto uskutočnení predloženého vynálezu je antagonistom polypeptidový antagonista a_v alebo protilátka proti α_νβ₃.

Ďalší aspekt predloženého vynálezu poskytuje spôsob indukcie apoptózy tumorových buniek rastúcich v mozgu hostiteľa. Spôsob pozostáva z podávania terapeuticky účinného množstva antagonistu integrínu.

V tomto uskutočnení predloženého vynálezu môže byť integrínom α_νβ₃ alebo ^-βϊ. Antagonistom môže byť polypeptidový antagonista a_v.

Spôsoby predloženého vynálezu sú veľmi vhodné pri liečbe tumorov in vivo. Predložený vynález poskytuje nový terapeutický prístup v liečbe mozgových tumorov.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Spomínané ako aj iné detaily tohto vynálezu a spôsoby ich dosiahnutia budú viac zrejmé a lepšie pochopené preštudovaním nasledujúceho opisu spolu s priloženými výkresmi. Tieto obrázky znázorňujú iba typické uskutočnenie vynálezu, a preto neobmedzujú jeho rozsah. Slúžia na priblíženie špecificity a detailov, pričom:

Obrázok la a lb zobrazujú inhibíciu angiogenézy (a) a rastu tumoru na CAM (b) a_v-anagonistom.

Obrázok 2 zobrazuje velkosť tumoru (A) a prežívanie myší (B) po intracerebrálnej injekcii DAOY a U87MG buniek.

Obrázky 3a a 3b zobrazujú histopatológiu ortotopicky injikovaných buniek mozgového tumoru DAOY (a) a U87MG (b) denne ošetrovaných inaktívnym (A) alebo aktívnym peptidom (B-D). Pri kontrolných zvieratách (A) možno pozorovať velké intracerebrálne tumory (vyznačené šípkami), kým pri zvieratách liečených a_vantagonistom (C a D) sú viditelné iba mikroskopické reziduálne tumory (označené šípkami).

Obrázok 4 zobrazuje prežívanie myší po ortotopickej implantácii mozgového tumoru, pričom bol podaný aktívny alebo neaktívny peptid.

Obrázok 5 zobrazuje a_v-antagonistu na ortotopicky (mozog) a heterotopicky (podkožie) implantovaných DAOY bunkách.

Obrázky 6a-6d zobrazujú profil integrínu (a) a účinok a_vantagonistu na jeho adhéziu, migráciu na virronecrin (c) a prežívanie buniek na vitronectin (d) pre bunky mozgového nádoru a mozgových endotelových buniek.

Obrázok 7 zobrazuje efekt cyklického pentapeptidu na adhéziu tumorovej bunky na ECM proteín.

Obrázok 8 zobrazuje efekt inhibície adhézie, ktorá spôsobuje smrť buniek (apoptózu) v bunkách mozgového tumoru ako aj v bunkách mozgových kapilár. Tento efekt je obmedzený iba na ECM vitronectin a tenascin.

Obrázok 9 zobrazuje imunohistochémiu mozgových tumorov U87 xenotransplantovaných do predného mozgu holých myší a ošetrených aktívnym (anti-a_v) alebo kontrolným peptidom.

Detailný opis vynálezu

Jeden aspekt predloženého vynálezu poskytuje spôsob inhibície rastu nádorov v mozgu hostitela pozostávajúci z podávania terapeuticky účinného množstva antagonistu integrínu hostiteľovi, ktorý vyžaduje takúto inhibíciu.

Spôsob podľa predloženého vynálezu sa môže použiť na liečbu tumorov, ktoré rastú v mozgu, pokým rast tumoru v mozgu vyžaduje interakciu integrínu s ligandom. Medzi takéto tumory patria, avšak ich výpočet nie je limitovaný len na ne, glioblastóm, meduloblastóm (astrocytóm, ďalšie primitívne neuroektodermy a rakoviny gliómu mozgového kmeňa). Pre potreby predloženého vynálezu je rast tumoru lokalizovaný prednostne intracerebrálne v mozgu hostitela. Hostiteľom môže byť cicavec, vrátane, avšak nie iba, potkana a človeka. Rast tumoru je inhibovaný, ak je rast liečbou oslabený.

Pre potreby predloženého vynálezu je integrín ľubovoľný člen špecifickej rodiny homológov heterodimérnych transmembránových receptorov. Receptory riadia adhéziu buniek väzbou aminokyselinovej sekvencie Arg-Gly-Asp (RGD). Receptory môžu byť vystavené na tumorových ako aj na normálnych bunkách. Charakteristika integrínov je v odbore dobre známa a charakterizovaná a detailne opísaná v citovaných dokumentoch (1, 2), ktorých relevantný obsah je tu zahrnutý formou referencie. Medzi integríny patria, avšak ich výpočet nie je limitovaný len na a_v rodinu ako α_νβ₂, α_νβδ , α_νβι, α_νβ₆, <*νβδ a podobné.

Antagonistom integrínu je molekula, ktorá blokuje alebo inhibuje fyziologickú alebo farmakologickú aktivitu integrínu inhibíciou väzbovej aktivity integrínu, receptora na jeho ligand, rôzne matrixové proteíny zahŕňajúce, ale ich výpočet nie je limitovaný na vitronectin, tenascin, fibronectin a kolagén I. V tomto uskutočnení predloženého vynálezu môže byť antagonistom integrínu antagonista integrínu α_νβ3 alebo integrín α_νβ5· Výhodne, antagonista integrínu môže byť buď monoklonálna protilátka, fragment monoklonálnej protilátky alebo peptid.

Antagonistom α_νβ3 môže byť napríklad lubovolný faktor, ktorý inhibuje väzbu α_νβ3 na niektorý z jeho viacnásobných ligandov, konkrétne vitronectin alebo tenascin. Príklady antagonistov α_νβ3 sú opísané v PCT publikáciách WO 96/37492 a WO 97/45137, ktorých relevantný obsah je tu zahrnutý formou referencie.

Podobne, antagonistom α_νβ₅ môže byť ľubovoľný faktor, ktorý inhibuje väzbu α_νβ₅ na jeho ligand, konkrétne vitronectin. Príklady antagonistov α.,-β₅ sú opísané v PCT publikácii WO 97/06791, ktorej relevantný obsah je tu zahrnutý formou referencie.

V jednom uskutočnení predloženého vynálezu je antagonistom polypeptidový antagonista α_ν, konkrétne polypeptidový antagonista α_νβ₃ a α_νβ5. Výhodne tento polypeptid obsahuje aminokyselinovú sekvenciu Arg-Gly-Asp (RGD). V tomto uskutočnení je polyoeptidovým antagonistom RGD cyklický pentapeptidový antagonista a_v.

V súlade s iným uskutočnením predloženého vynálezu môže byť antagonistom monoklonálna protilátka, imunošpecifická pre α_νβ₃ a α_νβ5· Alternatívne môže byť kombináciou protilátok proti α_νβ₃ a α,,βδ. V tomto uskutočnení má monoklonálna protilátka imunošpecifická pre α_νβ₃ imunoreakciu charakteristickú pre monoklonálnu protilátku označenú LM-609. V inom uskutočnení predloženého vynálezu má monoklonálna protilátka imunošpecifická pre α_νβ5 imunoreakciu charakteristickú pre monoklonálnu protilátku označenú P1-F6. Protilátky LM-609 a P1-F6 sú v priemysle dobre známe a komerčne dostupné prostredníctvom Chemicon, Temecula, California.

Na účely predloženého vynálezu môžu byť antagonisty použité samostatne alebo vo vzájomnej kombinácii v spôsobe podľa predloženého vynálezu na inhibíciu rastu tumoru v mozgu.

Terapeuticky účinným množstvom sa myslí množstvo antagonistu postačujúce na merateľnú inhibíciu rastu tumoru v mozgu liečeného hostiteľa. Inhibícia rastu tumoru môže byť stanovená mikroskopickým meraním po farbení, ako je tu opísané MRI skenovaním myšacieho mozgu alebo inkorporáciou 3H-tymidínu. Tieto metódy sú odborníkmi v odbore dobre známe.

Pokiaľ môže antagonista integrínu prevziať podobu peptidu obsahujúceho RGD, anti-a^₃ monoklonálnej protilátky alebo jej fragmentu, anti-a^s monoklonálnej protilátky alebo jej fragmentu alebo kombinácie monoklonálnych protilátok α_νβ₃ a α_νβδ, je nutné si uvedomiť, že účinnosť, a preto aj výraz terapeuticky účinné množstvo môže varírovať. Ako je však ukázané v metóde predloženej procedúry, odborník v odbore môže jednoducho odhadnúť účinnosť kandidáta antagonistu podľa tohto vynálezu.

Účinnosť antagonistu sa môže merať niekoľkými spôsobmi, výpočet ktorých však nie je limitovaný na inhibíciu angiogenézy v CAM teste, v in vivo teste mozgového tumoru a meranie inhibície väzby prirodzených ligandov na integríny, ako α_νβ₃ alebo α_νβ5, všetky tu opísané alebo podobné testy.

Rozsah dávkovania pri podávaní antagonistu závisí na podobe antagonistu a 'na jeho účinnosti vzhľadom na konkrétny integrín. Odborník v odbore môže nájsť vhodné dávkovanie konkrétneho antagonistu z údajov predloženého vynálezu, bez potreby experimentovania. Dávkovanie musí byť dostatočné na vytvorenie požadovaného efektu, ktorým sa inhibuje rast tumoru v mozgu. Dávkovanie nesmie byť tak veľké, aby spôsobovalo vedlajšie efekty, ako napríklad edém mozgu alebo rapídne uvolňovanie cytokínov z mozgových tumorov, čo indukuje kachexiu, keď je antagonista integrínu podía predloženého vynálezu podávaný vo forme polypeptidu. Dávkovanie na kilogram telesnej hmotnosti môže varírovať od 1 do 20 mg, v jednej alebo viacerých dávkach denne, jeden alebo niekolko dní alebo stále. Ak je antagonista integrínu podľa predloženého vynálezu podávaný vo forme monoklonálnej protilátky, dávkovanie môže varírovať od 1 do 20 mg/kg, v jednej dávke podávanej raz až dvakrát týždenne v presne neurčenom čase.

Polypeptid alebo monoklonálna protilátka podľa predloženého vynálezu môže byť podávaná parenterálnou injekciou alebo postupnou infúziou. Aj keď je liečené tkanivo najčastejšie ošetrené intraperitoneálnym alebo subkutánnym (protilátka) podávaním, môžu byť antagonisty podía predloženého vynálezu podávané intraokulárne, intravenózne, intramuskulárne, intrakavitárne, transdermálne a môžu byť dodané peristaltickým spôsobom.

Kompozície sú podávané spôsobom kompatibilným s opisom dávkovania v terapeuticky účinnom množstve. Množstvo a časy podávania závisia na liečenom subjekte, na kapacite systému subjektu využiť aktívnu látku a na požadovanom stupni terapeutického efektu. Presné množstvá potrebnej aktívnej látky závisia na posúdení ošetrujúceho lekára a sú špecifické pre každého pacienta. Avšak vhodné rozsahy dávkovania pre systémové aplikácie sú tu obsiahnuté a závisia na postupe dávkovania. Vhodné režimy podávania sú takisto variabilné, ale sú určené prvým podaním, po ktorom nasledujú opakované dávky v jedno alebo viac hodinových intervaloch ďalších injekcií alebo iných podaní.

V súlade s jedným uskutočnením predloženého vynálezu, poskytuje predložený vynález aj farmaceutickú kompozíciu vhodnú na uskutočňovanie tu opísanej terapeutickej metódy. Kompozícia obsahuje antagonistu podľa predloženého vynálezu v kombinácii s farmaceutický akceptovateľným nosičom. Používané pojmy farmaceutický akceptovateľný, fyziologicky tolerovaný a ich gramatické varianty označujúce kompozície, nosiče, rozpúšťadlá a činidlá, sú použiteľné zameniteľné a označujú materiály, ktoré je možné podať cicavcovi bez toho, aby spôsobil nežiaduci fyziologický efekt.

Prípravky na parentálne podávanie peptidu alebo protilátky podľa predloženého vynálezu zahŕňajú sterilné vodné alebo nevodné roztoky, suspenzie a emulzie. Medzi nevodné rozpúšťadlá patria propylénglykol, polyetylénglykol, rastlinné oleje ako olivový olej a injikovatelné organické estery ako etyloleát. Vodné nosiče zahŕňajú vodu, alkoholovovodné roztoky, emulzie alebo suspenzie, vrátane soľných a pufrovacích roztokov. Parentálne vehikulá zahŕňajú roztok chloridu sodného, Ringerovu dextrózu, dextrózu a chlorid sodný, laktátovaný Ringer alebo fixované oleje. Intravenózne vehikulá zahŕňajú tekuté alebo nutričné doplňovacie látky, elektrolytové doplňovacie látky (založené napr. na Ringerovej dextróze) a podobne. Môžu byť obsiahnuté aj konzervačné látky a iné prísady ako napríklad antimikrobiálne látky, antioxidanty, chelatačné látky, inertné plyny a podobne.

Ďalší aspekt predloženého vynálezu poskytuje spôsob inhibície angiogenézy v tumorovom tkanive lokalizovanom v mozgu hostiteľa. Spôsob pozostáva z podávania kompozície obsahujúcej antagonistu integrínu v množstve inhibujúcom angiogenézu.

Ako je diskutované v časti týkajúcej sa stavu techniky, angiogenéza predstavuje tvorbu neovaskulárnej siete z predchádzajúcich hostiteľských ciev a je potrebná pre rast tumoru nad 1-2 mm³. Pre potreby predloženého vynálezu je angiogenéza inhibovaná ak je zlepšená angiogenéza a symptómy spôsobené angiogenézou.

V jednom uskutočnení predloženého vynálezu je tumorové tkanivo lokalizované intracerebrálne v mozgu hostiteľa. Hostiteľom môže byť ľubovoľný cicavec. Príkladmi hostiteľov sú, avšak ich výpočet nie je limitovaný na myš, potkan a človek.

Rozsah dávkovania podávania antagonistu závisí na podobe antagonistu a na jeho účinnosti na konkrétny integrín. Odborník v odbore môže určiť potrebné dávkovanie konkrétneho antagonistu z údajov podľa predloženého vynálezu, bez potreby experimentovania. Dávkovanie musí byť dostatočné na vytvorenie požadovaného efektu, ktorým sa zlepšuje angiogenéza a príznaky choroby spôsobené angiogenézou. Dávkovanie nesmie byť tak veľké, aby spôsobovalo vedľajšie efekty, ako napríklad edém mozgu spôsobený rapídnou lýzou tumoru spojenou s uvoľňovaním cytokínov alebo hemorágie.

V jednom uskutočnení predloženého vynálezu môže byť antagonistom integrínu antagonista integrínu α_νβ3 alebo integrínu α_νβ₅. Výhodným antagonistom integrínu môže byť buď monoklonálna protilátka alebo peptid. V jednom uskutočnení predloženého vynálezu je antagonistom polypeptidový antagonista a_v, menovite polypeptidový antagonista α_νβ3 a α_νβ5. Polypeptid výhodne obsahuje aminokyselinovú sekvenciu Arg-Gly-Asp (RGD). V jednom uskutočnení

9 je polypeptidovým antagonistom RGD cyklický pentapeptidový antagonista a_v.

V súlade s iným uskutočnením predloženého vynálezu môže byť antagonistom protilátka proti α_νβ₃,β prípadne kombinácia protilátok proti α_νβ₃ a α_νβδ·

Terapeuticky účinným množstvom je množstvo antagonistu postačujúce na dosiahnutie meratelnej inhibície angiogenézy v liečenom tkanive, t. j. množstvo inhibujúce angiogenézu. Ako je tu opísané, inhibícia angiogenézy môže byť meraná in situ imunohistochémiou alebo inými metódami známymi v odbore.

V súlade s uskutočnením predloženého vynálezu poskytuje predložený vynález farmaceutickú kompozíciu vhodnú na uskutočňovanie tu opísaných terapeutických metód. Kompozícia obsahuje antagonistu predloženého vynálezu v kombinácii s farmaceutický akceptovateľným nosičom.

Ďalší aspekt predloženého vynálezu poskytuje spôsob inhibície ECM závislej bunkovej adhézie v bunkách mozgového tumoru rastúcich v mozgu hostiteľa, pozostávajúci z podávania terapeuticky účinného množstva antagonistu integrínov α_νβ3 a α_νβδ.

Na účely predloženého vynálezu, ECM závislá bunková adhézia zahŕňa ľubovoľnú bunkovú adhéziu závislú na ECM a sprostredkovanú a_v integrínmi. Medzi príklady takejto adhézie patrí, avšak ich výpočet nie je limitovaný na vitronectin závislú bunková adhéziu a tenascin závislú bunkovú adhéziu. Zistením predloženého vynálezu je, že ľudské mozgové tumory môžu produkovať vitronectin a tenascin, a tieto ECM hrajú dôležitú úlohu v bunkovej adhézii a migrácii tumoru, integráciou s integrínmi. Pre potreby predloženého vynálezu je inhibícia dosiahnutá, ak je. redukovaná bunková adhézia tumoru a ECM.

Používaný pojem terapeuticky účinné množstvo označuje množstvo antagonistu postačujúce na redukciu bunkovej adhézie tumoru sprostredkovanej ECM. Bunková adhézia sa môže merať tu opísanými spôsobmi ako aj spôsobmi bežne známymi v odbore.

V súlade s jedným uskutočnením predloženého vynálezu môže byť antagonistom polypeptidový antagonista a_v alebo kombinácia protilátok proti α_νβ₃ alebo α_νβδ. Antagonistom môže byť napríklad RGD cyklický polypeptidový antagonista a_v alebo kombinácia protilátok označených LM-609 a P1-F6.

Ďalší aspekt predloženého vynálezu poskytuje spôsob inhibície vitronectin závislej bunkovej migrácie buniek mozgového tumoru rastúcich v mozgu hostiteľa, pozostávajúci z podávania terapeuticky účinného množstva antagonistu α_νβ₃.

Na účely predloženého vynálezu je inhibícia dosiahnutá, ak je redukovaná bunková migrácia.

Použitý pojem terapeuticky účinné množstvo označuje množstvo antagonistu postačujúce na redukciu bunkovej migrácie tumoru sprostredkovanej vitronectinom. Bunková migrácia môže byť meraná tu opísanými spôsobmi ako aj spôsobmi všeobecne známymi v odbore.

V súlade s jedným uskutočnením predloženého vynálezu môže byť antagonistom polypeptidový antagonista a_v alebo mcnoklonálna protilátka imunoreaktívna proti α_νβ₃. Antagonistom môže byť napríklad RGD cyklický pentapeptidový antagonista a„ alebo monoklonálna protilátka označená LM-609.

Predložený vynález tiež poskytuje spôsob indukcie apoptózy tumorových buniek rastúcich v mozgu hostiteľa. Spôsob pozostáva z podávania terapeuticky účinného množstva antagonistu integrínu.

Na účely predloženého vynálezu je apoptóza tumorových buniek indukovaná, ak je po podaní antagonistu v mozgu pozorované zvýšené množstvo apoptózy tumorových buniek. Terapeuticky účinné množstvo je množstvo antagonistu postačujúce na merateľnú apoptózu tumorových buniek v mozgu liečeného hostiteľa. Apoptóza tumorových buniek môže byť meraná tu opísanými spôsobmi alebo spôsobmi všeobecne známymi v odbore.

V súlade s jedným uskutočnení predloženého vynálezu môže byť integrínom α_ν, α_νβ₃ alebo α_νβ₅. Antagonistom môže byť polypeptidový antagonista a_v.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Materiál a metódy

Materiál: aktívny cyklický RGD pentapeptid EMD 121974, cyklo(Arg-Gly-Aps-D-Phe-[N-Me]-Val) a inaktívny kontrolný peptid cRAD (EMD 135981) poskytol A. Jonczyk, Ph.D., Merck KgaA, Darmstadt, Nemecko. Monoklonálne protilátky LM609 a P1F6 už boli opísané (13). Línie mozgových tumorových buniek DAOY a U87MG sa zakúpili od ATCC, Rockville, MD, USA. Primárne kultúry ľudských mozgových kapilárnych endotelových buniek poskytol M. Stins, Ph.D., Childrens Hospital, Los Angeles, USA (49) . Ľudský vitronectin bol zakúpený od Promega, Mediscn, WI, USA.

FACS analýza: Použil sa FACScan cytometer (Becton-Dickinson, San Jose). Použité podmienky už boli opísané (43) . Primárnymi protilátkami boli LM-609 a P1-F6 pri 1:100, sekundárnymi FITC značený kozí antimyšací IgG pri 1:250. Determinácia apoptózy bola robená podľa výrobného manuálu (Clontech, Palo Alto, CA, USA, Apo Alert Annexin V-FITC Apoptosis kit).

Adhézia: Podmienky testu boli rovnaké ako už bolo skôr opísané (15) . Skúmavky s netkanivovou kultúrou sa inkubovali cez noc pri 4 °C s vitronectincm (1-10 pg/ml PBS), premyli a blokovali 30 minút teplom denaturovaným 1 % BSA v PBS a premyli PBS. Kontrolné a testované bunky, vopred inkubované pri 37 °C s testovacou látkou (20 pg/ml) v adhéznom pufri 30 minút, boli prenesené do skúmaviek (5 x 10⁴ buniek/skúmavku) a inkubované 1 hodinu pri 37 °C. Po jemnom premytí skúmaviek adhéznym pufrom boli adherované bunky fixované a farbené kryštálovou violeťou, farbička bola rozpustená v metanole a stanovilo sa OD pri 600° A.

Migrácia: Transwellové polykarbonátové filtre (velkosť pórov 8 pm) sa inkubovali 30 minút pri 37 °C s vitronectinom v PBS (1 pg/ml na vrchnej strane a 10 pg na spodnej strane), blokované 30 minút s 1 % teplom denaturovaným BSA a premyté PBS. Testované bunky (5 x 10⁵/jamku) sa pridali do adhézneho pufra obsahujúceho testovanú látku (20 pg/ml) a inkubovali 4 hodiny pri 37 °C so spodnou komorou obsahujúcou adhézny pufor. Bunky v horne] komore boli odstránené vatovou tyčinkou a bunky na spodnej časti boli fixované a farbené kryštálovou violeťou. Nakoniec bol odpočítaný počet migrovaných buniek.

Apoptóza: Adhézne podmienky boli rovnaké ako v predchádzajúcom, ale 12 doštičiek s jamkami pokrytých vitronectinom a 5 x 10⁵ buniek/jamku sa nanieslo v adhéznom pufri. Po 30 minútovej inkubácii pri 37 °C bol adhézny pufor nahradený pufrom obsahujúcim 20 pg/ml aktívneho cRGD alebo inaktívneho cRAD peptidu a inkubované ďalšie 4 hodiny. Prichytené bunky boli ošetrené trypsínom a kombinované s bunkami uvoľnenými do supernatantu a následne vyšetrené na prítomnosť apoptických buniek použitím Apo Alert Annein V-FITC apopoptosis kit (Clontech) .

CAM test: Dodávateľ vajec a ich príprava už boli opísané (23). Tumorové bunky sa naniesli v 50 pl PBS pri 4 x 10⁶ buniek/vajce pre DAOY a 3,5 x 10⁶ buniek/vajce pre U87MG. Bunky rástli na tumory 7 dní, ktoré sa potom odobrali za sterilných podmienok, upravili na podobnú veľkosť a znovu naniesli na CAM 10 dní starých embryí. Nasledujúci deň bol do CAM cievy injikovaný aktívny lebo inaktívny peptid (10C pg/vajce). Tumory boli fotografované in situ po 7 dňoch rastu, potom odobraté, zvážené a fixované v 4 % pufrovanom formalíne a zaliate do parafínu. Po sériovom narezaní boli rezy * Γ Γ r r » r í· · farbené hematoxilínom a eozínom.

Model mozgového tumoru: Detaily tohto modelu už boli opísané (31). Tumorové bunky (10⁶/10 μΐ PBS) boli injikované intracerebrálne v spomínaných koordinátach. ľntraperitoneálna liečba aktívnym cRGD alebo inaktívnym cRAD peptidom (100 pg/50 μΐ/myš) bola uskutočnená 3. deň po implantácii pre (J87MG bunky a 10. deň pre DAOY bunky a opakovaná denne do objavenia sa štádia kachexie a/alebo umierania. Zvieratá boli potom usmrtené CO₂ anestéziou, mozog bol odstránený a jeho časť zmrazená v tekutom dusíku alebo fixovaná pufrovaným formalínom, zaliata do parafínu a jednotlivé rezy farbené hematoxylín-eozínom.

Subkutánny rast tumoru: Na subkutánny rast tumoru boli bunky (10⁶/myš) injikované subkutánne pod pravé rameno okamžite po intracerebrálnej injekcii.

Testy na zvieratách: Testy na zvieratách sa robili podlá pokynov NIH a schválili lokálnou komisiou pre starostlivosť o zvieratá.

Experimenty

Angionegéza na CAM

Na stanovenie účinku antagonizmu a„ na angiogenézu asociovanú s mozgovým tumorom boli ludské mozgové tumorové bunky DAOY a U87MG narastené na kuracej chorioalantoidných membránach (CAM). Nádory a nechali rásť 7 dní, potom sa odobrali a reimplantovali na čerstvé CAM. 24 hodín po prenose sa do CAM ciev injikovalo 100 pg aktívneho cRGD peptidu alebo kontrolného peptidu (cRAD). Tumory rástli ďalších 6 dní, potom sa zvážili a analyzovali na vaskularizáciu. Pri stereomikroskopickom vyšetrení vykazovali tumory s kontrolným peptidom rozsiahlu angiogenézu, kým tumory ošetrené antagonistom a_v vykázali supresiu angiogenézy (obr. la). a_v-antagonista tiež inhiboval rast tumoru. Na rozdiel od kontrolných tumorov, ktorých hmotnosť sa zvýšila o 80 %, hmotnosť tumorov ošetrených a_vantagonistom klesla o 30 % (obr. lb). Tieto dáta naznačujú, že inhibícia rastu tumoru a_v antagonizmom je následkom disruptovanej, na tumor viazanej, angiogenézy.

Obr. la a lb znázorňujú inhibíciu angiogenézy (a) a rastu tumoru na CAM (b) a_v-antagonistom. Mozgové tumory narastené na CAM boli odobrané, narezané na rovnaké kusy a uložené na čerstvé CAM desaťdňových kuracích vajec. Nasledujúci deň bolo do kuracích ciev injikovaný 100 pg aktívneho a_v-inhibítora alebo kontrolného peptidu a kultivácia pokračovala ďalších 6 dní. Vajcia s kontrolným peptidom vykázali signifikantnú angiogenézu (a) (DAOY=A a U87MG=C), kým pri vajciach s aktívnym peptidom bola pozorovaná signifikantná supresia neovaskularizácie (DAOY=B a (J87MG=D) . Tumory uložené na CAM boli zvážené na začiatku a na konci experimentu (b) . Hmotnosť tumorov ošetrených kontrolným peptidom sa zvýšila o 80 % pri obidvoch typoch tumorov (vľavo, n=8), kým po ošetrení aktívnym peptidom sa ich hmotnosť znížila o asi 30 % (vpravo, n=8).

Ortotopický model tumoru

Na vytvorenie systému, ktorý by rekapituloval prostredie mozgu, boli do pravého frontálneho kortexu nu/nu myší stereotakticky injikované DAOY a U87MG bunky (10⁶ buniek/myš). Táto metóda poskytuje vysoko reprodukovateľný model tumorogenézy ľudského mozgového tumoru a umožňuje merať rast tumoru a prežívanie myši v čase pred iniciovaním a_v-antagonizmu (obr. 2a a 2b) . Obr. 2 znázorňuje veľkosť tumoru (A) a prežívanie myší (B) po intracerebrálnej injekcii buniek DAOY a U87MG. Bunky U87MG vykazujú rapídny rast a dosahujú plató približne 6 mm za 6 týždňov, kým bunky DAOY rastú pomalšie a dosahujú priemer 5,5 mm za 9 týždňov (A). Všetky zvieratá umierajú v 9. týždni (B). V každom prípade je η = 5 alebo 6.

V záujme testovania efektu cRGD peptidu týmto modelom, boli tumory pred denným i.p. podávaním a_v-antagonistu (100 pg/myš) narastené 7 dní (DAOY) alebo 3 dni (U87MG) alebo ich kontrola ďalšie 3 týždne. V čase usmrtenia (4 týždne celkového rastu tumoru) mali kontrolné myši výrazne viditeľný mozgový tumor s priemerom 3 mm (DAOY) a 5,5 mm (U87MG) . Ošetrené myši nemali buď žiadny tumor alebo iba ustupujúce reziduálne tumorové bunky nachádzajúce sa v mikroskopických chumáčoch pozdĺž ventrikulárneho a durálneho povrchu (obr. 3a a 3b) . Obr. 3a a 3b znázorňujú histopatológiu ortotopicky injikovaných buniek mozgového tumoru DAOY (a) a U87MG (b), denne ošetrovaných inaktívnym (A) alebo aktívnym peptidom (BD). U kontrolných zvierat možno vidieť veľké intracerebrálne tumory (šípky A), kým u zvierat ošetrených a_v-antagonistom nie sú detegované buď žiadne tumory alebo iba reziduálne tumory (šípky C a D) .

Ošetrené myši si zároveň udržali svoju telesnú hmotnosť 21 g, avšak DAOY a (J87MG kontrolné myši vážili 16, prípadne 15 g, čo predstavuje úbytok telesnej hmotnosti o 5 až 6 g (pozri tabuľku 1). Priemerný čas prejavu neurologických symptómov pri kontrolnej skupine bol 2,5 týždňa pre (J87MG a 4,5 týždňa pre DAOY myši, kým kontrolné zvieratá nikdy nevykazovali žiadne neurologické symptómy.

Tabula 1

bunková línia	veľkosť tumoru (mm)	hmotnosť myši (g)
mozog	podkožie
DAOY
kontrolný peptid	3,0 ± 0,71	18 ± 1,41	16 ± 1,3
aktívny peptid	NM	17 ± 0,84	21 ± 0,89
U87MG
kontrolný peptid	5,5 ± 0,55	20 ± 1,0	15 ± 0,45
aktívny peptid	NM	19 ± 0,77	20 ± 0,71

NM = nemerateľné

Na prežitie boli testované ďalšie zvieratá. Prežitie bolo stanovené ako čas, v ktorom bolo nutné zvieratá usmrtiť z dôvodu predsmrtného stavu. Všetky kontrolné zvieratá boli usmrtené pred 6. týždňom rastu tumoru a väčšina (> 50 %) z oboch kontrolných skupín bola usmrtená v 3-4 týždni (obr. 4) . Obr. 4 znázorňuje prežitie myší po crtotopickej implantácii mozgového tumoru a podaní buď aktívneho alebo inaktívneho peptidu. I.p. liečba (100 pg/myš/deň) bola iniciovaná na 3. deň pre U87MG a na 7. deň pre DAOY bunky. Hodnota n pre DAOY a U87MG kontrolu je po 16 myší, 32 myší pre ošetrenie DAOY a 24 pre ošetrenie U87MG. Obr. 4 znázorňuje, že žiadne z ošetrených zvierat nevyžadovalo usmrtenie a súčasne myši ošetrené DAOY prežili 24 týždňov a U87MG myši 15 týždňov po injekcii tumorových buniek. U žiadneho z ošetrených zvierat sa nevyvinuli neurologické príznaky a všetky rástli normálne ďalej.

Heterotopický model tumoru

Na určenie vplyvu mikroprostredia na rast tumoru ovplyvneného a_v-antagonizmom sa pred iniciačným ošetrením aktívnym a kontrolným peptidom (100 pg/myš denne i.p.), v 3. (U87MG) a 7. (DAOY) deň po injekcii tumorových buniek, subkutánne injikovali tie isté tumorové bunky (10⁶ buniek/holá myš). Za týchto podmienok sa nevyskytla žiadna inhibícia rastu tumorov aktívnym peptidom a po 6 týždňoch boli tumory z ošetrenej a neošetrenej skupiny rovnaké na makroskopickej ako i na mikroskopickej úrovni, pričom v oboch prípadoch bola pozorovaná rozsiahla angiogenéza (nezverejnené dáta) . To naznačuje, že prirodzené vlastnosti testovaných buniek mozgového tumoru nie sú postačujúce na to, aby boli citlivé na aktivitu cRGD peptidového antagonistu, ale vyžadujú mikroprostredie špecifické pre mozog.

Na ďalšie objasnenie tohto zistenia sa simultánne injikovali DAOY a U87MG bunky (intrakraniálne a subkutánne), pred prvým ošetrením peptidom opísaným pri ortotopickom modeli. Obr. č. 5 znázorňuje účinok a_v-antagonistu na ortotopicky (mozog) a heterotopicky (podkožie) implantované DAOY bunky. Tumorové bunky (10^δ) boli injikované do mozgu a do podkožia a ošetrené inaktívnym (a) alebo aktívnym (b) peptidom, počínajúc 7. dňom. Fotografie boli urobené v 4. týždni. Zvieratá, ktoré dostali inaktívny (a) alebo aktívny (b) peptid vykázali podobnú veľkosť subkutánnych tumorov (A) a vaskularizácie (B). Pri obidvoch podmienkach prerástli subkutánne tumory do susednej svalovej vrstvy (šípky C) . LJ kontrolných zvierat sa vyvinuli velké mozgové tumory (šípky), na rozdiel od myší s aktívnym peptidom, u ktorých sa nepozorovalo mikroskopické reziduálne ochorenie (D) . Obr. 5 preto znázorňuje, že subkutánne tumory v kontrolnej a ošetrenej skupine narástli do priemernej veľkosti 18 mm³, s príznakmi rozsiahlej vaskularizácie (obr. 5) . Pri kontrolných myšiach sa tiež vyvinuli veľké mozgové tumory s podobnou veľkosťou ako pri ortotopickom modeli tumoru, ako aj klinické dôkazy neurologického zhoršenia (tabuľka 1). Na rozdiel od toho prežívali myši s prijatým aktívnym peptidom bez neurologických symptómov a nekropsia ukázala neprítomnosť intracerebrálnych tumorov alebo iba reziduálne mikroskopické zhluky tumorových buniek (obr. 5) . Táto skupina však vykazovala progresívny rast subkutánnych tumorov, čo viedlo k nevyhnutnosti ich usmrtenia po 10 týždňoch. To potvrdilo, že intracerebrálne rastúce tumory sú citlivé na ošetrenie cyklickým RGD peptidom, kým tie isté tumory rastúce subkutánne nie sú.

Expresia integrínu

Vitronectin je matrixový protein, ktorý môže ovplyvniť rôzne biologické odpovede pozorované v mozgu a subkutánnych častiach. Je hojný v extraneurálnych miestach, ale normálne je produkovaný gliovým a neuronálnym tkanivom (15, 20). Malígne gliómové bunky však syntetizujú vitronectin, ktorý môže byť zároveň kritický pre ich prichytenie a rozšírenie (15). Vitronectin môže alternatívne sprostredkovať adhéziu endotelových buniek a ich migráciu k tumorovému lôžku a tým zvýrazniť angiogenézu. Keďže väzba buniek na vitronectin je sprostredkovaná integrínmi α_νβ₃ a α_νβδ, uskutočnili sa FACS analýzy s cielom určiť, či ľudský DAOY meduloblastóm, U87MG glioblastóm a primárne kultúry ľudských mozgových endotelových buniek (HBEC9) exprimujú integríny α_νβ₃ alebo α_νβζ (obr. 6a).

Obrázky 6a-6d znázorňujú profil integrínu (a), efekt a_vantagonistu na adhéziu (b), migráciu (c) a prežívanie buniek na vitronectin (d) , pre mozgový tumor a mozgové kapilárne endotelové bunky. DAOY aj U87MG tumorové bunky a mozgové kapilárne bunky exprimujú integríny α_νβ₃ a α_νβδ (a) . Adhézia na vitronectin bola signifikantne inhibovaná aktívnym peptidom, ako aj kombináciou protilátok proti α_νβ₃ a α_νβ5, kým samotný kontrolný peptid ani samotné špecifické anti-a^₃ alebo anti-a^₅ protilátky nemali signifikantný účinok. Migrácia buniek na vitronectinovom gradiente bola zastavená α_νβ3 protilátkami a a_v-antagonistom, kontrolný peptid ani protilátky α_νβ₅ nemali inhibičný účinok. Prežívanie buniek bolo testované 1 hodinovým naviazaním buniek na vitronectin, po čom nasledovala ich 4 hodinová expozícia na kontrolný peptid alebo a_vantagonistu (20 pg/ml) (d). Prichytené a voľné bunky boli skombinované a vyšetrené pomocou FACS na apoptózu použitím FITC značeného antianexínu V a propídium jodidu. Kým pri kultúrach vystavených kontrolnému peptidu (d, vlavo) bola pozorovaná iba nízka apoptóza, mozgové kapilárne endotelové bunky a DAOY bunky vykázali signifikantný počet apoptotických buniek (d, vpravo).

Obr. 6a-6d znázorňujú, že U87MG bunky exprimujú vysokú hladinu α_νβ3 vzhladom na DAOY bunky, avšak DAOY bunky exprimujú väčšie množstvo α_νβ5· HBEC bunky kultivované na médiu obsahujúcom VEGF exprimujú vysoké množstvo α_νβ=, kým 50 % buniek exprimuje integrín α_νβ3 v krátkodobých kultúrach. Po 2 dňoch rastu boli kultúry testované aj FACS analýzou na platniach potiahnutých vitronectinom. Expresia α_νβ₃ a α_νβ5 sa pri týchto podmienkach nezmenila (nezverejnené dáta).

Adhézia vitronectinu

Na určenie, či α_νβ3 a α_νβ5 regulujú adhéziu DAOY, U87MG a HBEC na vitronectin, boli bunky nanesené do skúmaviek potiahnutých vitronectinom a ponechané naadherovať sa v prítomnosti alebo neprítomnosti buď blokujúcich protilátok na α_νβ3 (LM-609) a α_νβ5 (P1-F6) alebo cRGD peptidu. P1-F6 inhibujú prichytenie DAOY buniek minimálne, kým LM-609 nemajú žiaden účinok na prichytenie buniek. Signifikantné inhibícia adhézie všetkých buniek bola pozorovaná inkubovaním P1-F6 spoločne alebo cRGD samostatne (Obr. 6b) . Tieto dáta naznačujú, že blokovanie niektorým z integrínov samostatne nie je postačujúce, ale že na signifikantné rozrušenie vitronectin závislej adhézie je potrebná dvojitá blokáda α_νβ₃ a α_νβ5, čo bolo demonštrované testovanými bunkami.

Migrácia vitronectinu

Aby sa zistilo, či α_νβ₃ a α_νβδ upravujú migráciu na vitronectin, nezávislú od adhézie, testovali sa tie isté bunky na vitronectinom potiahnutej membráne v Boydenových komôrkach v prítomnosti blokujúcich protilátok alebo cRGD. P1-F6 neovplyvnili migráciu, avšak LM-609 a cRGD signifikantne ihibovali migráciu všetkých troch typov buniek (obr. 6c). Keďže v neprítomnosti P1-F6 bol LM-609 neschopný blokujúcej adhézie, musí byť tento antimigračný efekt sprostredkovaný inou dráhou, nezávislou od síl zodpovedných za adhéziu. LM-609 navyše blokoval migráciu rovnako dobre ako cRGD, čo naznačuje, že bunková signalizácia (celí signaling) sprostredkovaná α_νβ₃ je kritickým komponentom pri determinácii migrácie testovaných buniek mozgovému tumoru a mozgových endotelových buniek.

Apoptóza

Vysoko kvalitné astrocystómy produkujú vitronectin na vedúcom invazívnom okraji, čo napovedá, že tento proteín hrá významnú úlohu pri prichytávaní buniek mozgového tumoru, ich migrácii a prípadne pri prežívaní buniek (15). V predchádzajúcich štúdiách sa ukázalo, že predinkubácia mozgového tumoru alebo kapilárnych buniek s cRGD peptidom alebo kombináciou protilátok anti-a^₃ a anti-a^₅, zabraňuje adhézii buniek na vitronectin. Podobnou inhibíciou na integríne závislého prichytenia na matrixové proteíny bola demonštrovaná apoptóza endotelových a melanómových buniek (26-28). Bolo preto zaujímavé určiť, či a_v-antagonista môže indukovať apoptózu týchto buniek po ich odpojení od vitronectinu. DAOY bunky a primárne HBEC sa vysiali v adhéznom pufri do jamôk pokrytých vitronectinom (1 pg/ml) a ponechali prichytiť sa 30 minút pri 37 °C. Pufor bol potom nahradený pufrom obsahujúcim peptid cRGD alebo cRAD (kontrola) (20 pg/ml) a kultivácia pokračovala ďalšie 4 hodiny. Prichytené bunky boli po ošetrení trypsínom zmiešané s voľnými bunkami a pomocou FACS bol určený počet apoptických buniek, pričom sa použil antianexin V-FITC protilátka a propídium jodid (Clontech Apo alert Annexin V-FITC kit na detekciu apoptózy). Bunky vystavené pôsobeniu kontrolného peptidu cRAD vykázali iba malú apoptózu, kým bunky ošetrené DAOY a HBEC cRGD vykázali signifikantnú apoptózu (obr. 6d) . Tieto dáta naznačujú, že cRGD peptid nielenže uvoľňuje tieto bunky od vitronectinu, ale aj indukuje následnú apoptózu.

Účinok pentapeptidu na adhéziu buniek mozgového tumoru na rôzne ECM substráty

Obr. 7 znázorňuje efekt cyklického pentapeptidu na adhéziu tumorových buniek na ECM proteíny. Netkanivové kultivačné misky boli inkubované 1 hodinu pri 37 °C s vitronectinom, tenascinom, fibronectinom alebo kolagénom I (10 pg/ml) a potom premyté PBS. Po premytí bolo 5 x 10⁵ buniek/jamku nanesených a inkubovaných 16 hodín pri 37 ’C. Kultúry boli následne premyté a resuspendované v adhéznom pufri obsahujúcom 20 pg/ml pentapeptidu alebo kontrolného peptidu a inkubácia pokračovala ďalších 2-24 hodín. Kultúry boli potom dvakrát premyté adhéznym pufrom, farbené kryštálovou violeťou, po čom bolo určené OD 600. Čím je viac adherentných buniek, tým vyššia je hodnota OD. Dáta predstavujú adherentné bunky po 8 hodinovej inkubácii. LJ87 = glioblastóm a DAOY = meduloblastóm.

Ako ilustruje obr. 7, tumorové bunky sa oddelili od vitronectinu a tenascinu, ktorých adherencia je sprostredkovaná a_v-integrínmi, avšak nie od kolagénu a fibronectinu, ktoré interagujú s nie a_v integrínmi. Podobné výsledky boli dosiahnuté pri mozgových kapilárnych bunkách (nezverejnené dáta).

Účinok oddelenia buniek na prežívanie buniek

Obr. 8 znázorňuje apoptózu buniek mozgového tumoru a kapilárnych buniek narastených na ECM a vystavených pentapeptidu. Testovacie podmienky boli ako na obr. 7 s tým, že oddelené bunky a adherované bunky sa zmiešali po ošetrení trypsínom. Bunky sa potom premyli, suspendovali v 50 μΐ PBS a centrifugovali na krycích sklíčkach (cytopsin) . Po fixácii 4 % parafo,rmaldehydom boli bunky farbené na apoptózu pomocou Boehringer Apoptosis Kit. Výsledky sú prezentované v percentuálnom zastúpení apoptických buniek vzhľadom na celkový počet buniek. Experiment sa uskutočnil po 24 hodinovej inkubácii s peptidmi.

Účinok oddelenia buniek na prežívanie buniek je znázornený na obr. 8. Ako je tu uvedené, bunky vystavené aktívnemu peptidu počas 24 hodín a narastené na vitronectine a tenascine vykázali zvýšené množstvo mŕtvych buniek v porovnaní s kontrolnými bunkami. Na rozdiel od toho, pentapeptid neovplyvnil prežívanie buniek rastúcich na kolagéne I alebo fibronectine. Znížené prežívanie buniek bolo pozorované pri tumorových ako aj kapilárnych mozgových bunkách. Podobné výsledky sa dosiahli, keď boli bunky farbené na skoré príznaky bunkovej smrti, exprimované na bunkovom povrchu (Annexin-V, nezverejnené dáta). Pentapeptid teda indukuje oddelenie buniek a smrť buniek mozgového tumoru a buniek mozgových kapilár adherovaných na vitronectin a tenascin.

Produkcia ECM proteínov v ľudskom mozgovom tumore

Ako už bolo uvedené, mozgové tumory produkujú vitronectin a tenascin u ľudí a predpokladá sa, že tieto substráty zlepšujú prežitie tumorových buniek a zvyšujú ich inváziu. V našom modeli mozgového tumoru sa testovala produkcia týchto proteínov.

Obr. 9 znázorňuje imunohistochémiu mozgových tumorov U87 xenotransplantovaných do predného mozgu holých myší a ošetrených aktívnym (anti-a_v) alebo kontrolným peptidom. Myšiam boli injikované tumorové bunky (10⁶ buniek/myš) a na 7. deň po injekcii sa začalo ošetrovanie aktívnym alebo inaktívnym peptidom (100 pg/ myš/deň). Tumory boli po dvojtýždňovom ošetrovaní odstránené, fixované v pufrovanom formalíne, zaliate do parafínu a narezané na 5 pm rezy. Tieto rezy boli vyšetrené na CD31 expresiu (marker pre kapilárne bunky) pomocou monoklonálnej potkanej protimyšacej protilátky (Pharmingen), monoklonálnej protiľudskej vitronectinovej protilátky (Sigma), myšacej protiľudskej tenascinovej protilátky (Neo-Marker) a Boehringer Apoptosis Kit na testovanie mŕtvych buniek. CD 31 = kapilárny marker, VN = vitronectin, TN = tenascin a APO = apoptóza.

Ako ukazuje obr. 9, mozgový tumor naozaj produkuje vitronectin a tenascin, a ich pôvod z tumorových buniek sa dokázal použitím protilátok špecifických pre ľudské proteíny. Podávanie aktívneho pentapeptidu nemalo žiadny vplyv na syntézu týchto proteínov. Navyše sa demonštrovalo, že mozgové tumorové bunky produkujú tieto proteiny v tkanivových kultúrach (nezverejnené dáta). Uvedený myšací model teda napodobňuje stav ľudských mozgových tumorov.

Antiangiogenetický účinok pentapeptidu je znázornený na vrchnej časti obr. 9, kde sa zafarbil tkanivový rez na špecifický marker pre kapilárne bunky konkrétne CD 31. Kým tumory ošetrené kontrolným peptidom mali viacnásobné cievy, ktoré boli na tento marker pozitívne zafarbené, v tumoroch ošetrených aktívnym pentapeptidom boli iba málo takýchto ciev (p < 0,005), čo naznačuje supresiu rastu kapilár. Spodná časť obr. 9 znázorňuje farbenie na apoptické (mŕtve) bunky. Metóda je podobná metóde opísanej na obr.

r e

8. Tumory ošetrené aktívnym pentapeptidom obsahovali signifikantné viac mŕtvych buniek ako tumory ošetrené kontrolným peptidom (p < 0,002). Snímky sú urobené z glioblastómu U87, avšak podobné výsledky boli dosiahnuté aj s meduloblastómu DAOY (nezverejnené dáta).

Vzťah medzi bunkovou smrťou a apopťózou tumorovej bunky.

Na demonštrovanie, že táto zvýšená smrť buniek je spôsobená priamo apoptózou tumorových buniek a nie ako následok potlačenia rastu kapilár, implantovali sa do myšacích buniek mozgového melanómu, ktoré buď exprimovali (M21 L a_v poz.) alebo neexprimovali

I (M21L a_v neg.) a_v-integríny. Ak myši transplantovné s a_v pozitívnymi bunkami a ošetrené aktívnym pentapeptidom prežívajú dlhšie ako myši ošetrené kontrolným peptidom, zodpovednou musí byť priama apoptóza tumorovej bunky.

Tabuľka 2 znázorňuje prežívanie myší s α_νβ₃ negatívnymi alebo pozitívnymi tumormi ošetrenými RGDfV. Tumorové bunky (10⁶) boli injikované do predného mozgu 6 týždňovej holej myši a na 3. deň sa začali ošetrovať aktívnym kontrolným peptidom (100 pg/myš/deň). Myši boli usmrtené, keď sa stali kachektickými a prítomnosť tumoru sa overila autopsiou.

Tabulka 2

bunková línia	Prežívanie (dni)
RGDfV (aktívny)	RADfV (kontrola)
M21Lav neg.	15,7 ± 3,8	15,3 ± 3,3
M21Lav poz.	36,5 ± 2,9	17,3 ± 1,9

Ako znázorňuje tabuľka 2, myši transplantované a_v-negatívnymi melanómovými bunkami prežili 15 dní, nezávisle na spôsobe ošetrenia. Na rozdiel od toho sa však dĺžka života myší s a_v-pozitívnymi tumormi zvýšila po ošetrení aktívnym pentapeptidom na 36 dní, v porovnaní so 17 dňami po ošetrení kontrolným peptidom. To naznačuje, že priama apoptóza tumorovej bunky musí byť zodpovedná za smrť tumorovej bunky.

Záverom možno konštatovať, že spomínané dáta podporujú hypotézu, že cyklický pentapeptid indukuje priamu smrť tumorovej bunky.

Diskusia

Mozgové tumory sú vysoko angiogenetické a sú závislé na neovaskularizácii, ktorá podporuje ich rast. Antiangiogenéza je teda potencionálne dôležitá terapeutická stratégia zameraná proti týmto malignitám. Integríny α.,β₃ a α_νβ5 sú potencionálne antiangiogenetické ciele, pretože ich espresia na endoteli je aktívna počas angiogenézy (12, 13). Ich úloha v procese neovaskularizácie bola potvrdená predchádzajúcimi štúdiami ktoré ukázali, že indukcia angiogenézy bFCG a TNT-α v CAM môže byť narušená prítomnosťou a^-blokujúcej protilátky LM-609 alebo RGD cyklickým peptidovýrn antagonistom α_νβ₃ alebo α_νβ₅ (21, 23) . V obidvoch prípadoch sa predpokladá, že antiangiogenetický účinok je dosiahnutý indukciou apoptózy endotelových buniek ako výsledku prevencie esenciálnych väzbových interakcií a_v-matrixových proteínov (28-30). V tejto štúdii sa použil podobný špecifický RGD cyklický peptidového antagonistu α_νβ₃ alebo α_νβ5 (EMD 121974) a demonštrovala sa jeho schopnosť inhibovať CAM angiogenézu indukovanú dvoma bunkovými líniami ľudského mozgového tumoru, DAOY a U87MG. Ošetrenie cRGD nielenže potlačilo CAM angiogenézu, ale následne viedlo k nekróze a involúcii tumoru.

Na objasnenie či môžu byť podobné odozvy dosiahnuté pri modeli ktorý sumarizuje mikroprostredie mozgu, boli bunky mozgového tumoru stereotaktne injikované do predného mozgu holých myší. Na štúdie sa vybrali bunky U87MG gliómu a DAOY meduloblastómu, kvôli ich výhodnej odpovede na peptid v CAM teste a kvôli ich rozsiahlej invazívnosti a angiogenéze, čo bolo v predchádzajúcom demonštrované in vivo (31, 32) . V tomto ortotopickom modeli cRGD, opäť

I I signifikantne inhiboval rast U87MG a DAOY mozgových tumorov. Kontrolné myši podľahli progresii tumoru a boli u nich nájdené vysoko invazívne tumory, v priemere väčšie ako 3 mm³. Myši ošetrené cRGD prežili bez známok morbidity a nemohli byť u nich detegované živé tumory, až na nevýrazné reziduálne bunky pozdĺž miesta implantácie alebo v malých zhlukoch pozdĺž ventrikulárneho a durálneho povrchu. Všetky reziduálne tumorové ložiská v ošetrenej skupine boli menšie ako 1 mm³, a preto si neosvojili angiogenetickú odpoveď hostiteľa. Alternatívne inhibítory angiogenézy, ako trombospondin-1, TNP-470 a trombocytový faktor 4, takisto inhibovali rast experimentálneho mozgového tumoru, hoci väčšina týchto výsledkov bola obmedzená a subkutánne xenoštepy alebo vyžadovali priamy prísun liečiva do tumorového lôžka stereotaktickou injekciou (23, 24). Peptidový antagonista α_νβ₃ v SCID myš/potkan Leydigova bunka subkutánnom modeli tumoru vykázal 80 % inhibíciu rastu tumoru, nasledujúcu po intraperitoneálnom podaní (35) . Rovnako aj angiostatin, antiangiogenetická látka s doposiaľ neobjasneným mechanizmom účinku, demonštroval výraznú inhibíciu rastu intrakraniálnych C6 a 9L potkaních gliómových xenoštepov (36). Na rozdiel od našej štúdie, bolo ošetrenie angiostatinom (1 mg/myš/deň) alebo peptidomimetickým antagonistom (2 mg/myš/deň) iniciované hneď po implantácii tumorových buniek. Naša štúdia ukázala takmer abláciu vytvorených tumorových xenoštepov a ako prvá ukázala inhibíciu rastu intrakraniálnych mozgových tumorov a angiogenézy prostredníctvom antagonizmu integrínu.

Je zaujímavé, že DAOY a U87MG tumory, ktoré rástli pod kožou simultánne, nevykázali v našej štúdii takmer žiadny efekt na ošetrenie cRGD. To zdôrazňuje dôležitosť extracelulárneho prostredia v regulácii hostitel-tumor-bunka integrínových odpovedí. Angiostatin preukázal rovnakú inhibíciu rastu s.c. a i. c. injikovaných buniek mozgového tumoru, čo naznačuje, že táto látka potláča angiogenézu prostredníctvom iného mechanizmu ako RGD peptid (36). Jedným možným vysvetlením rozdielu v cRGD inhibícii rastu je, že endotelové bunky podkožia môžu byť dedične odlišné od buniek CNS mikrovaskulatúry, čo robí angiogenézu menej citlivú na antagonizmus integrínu. Toto je podporené aj nedávnymi zisteniami, že u myší napadnutými a_v sú abnormálnymi iba mozgové a intestinálne kapilárne bunky, kým zvyšok obehového systému je nezmenený (37). Alternatívnym vysvetlením môže byť fakt, že matrixové proteíny, ktoré slúžia ako ligandy pre integríny endotelových buniek, môžu byť prednostne exprimované tumorovými bunkami, v závislosti na ortotropickej alebo heterotropickej lokalizácii. Bolo napríklad ukázané, že ľudské glioblastómové bunky implantované subkutánne neprodukujú vitronectin, avšak ich umiestnenie do mozgového mikroprostredia indukovalo ich expresiu vitronectinového génu (15). Normálne mozgové tkanivo môže podobne ovplyvniť jeho expresiu ECM proteínov ako odpoveď na útočiace gliómové bunky (38). Na rozdiel od extracelulárnych priestorov, vitronectin je v mozgu normálne neprítomný, a teda už malé zmeny v koncentrácii tohto proteínu v rámci CNS môžu výrazne ovplyvniť odpovede buniek. Štúdie naznačujú, že pohyb endotelových buniek je nezávislý na koncentrácii vitronectinu a na vzdialenosti medzi miestami kontaktov bunkamatrix, ktoré sprostredkúvajú rozširovanie buniek (39, 40).

Antitumorogénne účinky peptidov v našej štúdii sú vo všeobecnosti vyššie ako účinky pozorované pri použití iných antiangiogenetických faktorov. Keďže veľa tumorov exprimuje aj integríny α_νβ3 a «νβδ (vrátane U87MG a DAOY), nemusí byť efekt antagonistov integrínu limitovaný na endotel hostitela, hoci dôležitosť špecifických integrínov v tumorových bunkách nie je až taká jasná (41) . Predchádzajúce štúdie ukázali, že prichytenie buniek gliómu, karcinómu prsníka, melanómu a HT29-D4 kolonického adenokarcinómu na vitronectin je závislý na integrínoch a_v (42-45). Vitronectin je produkovaný tumorovými a stromovými bunkami je najviac sa vyskytujúci v miestach invázie tumoru a neovaskularizácie, vrátane malígnych mozgových tumorov (46, 47). Vitronectin, okrem toho že podporuje prežívanie endotelových buniek, môže byť teda kritický pre zlepšenie adhézie a invázie tumorových buniek, exprimujúcich α_νβ₃ alebo α_νβ5· V SCID myš/človek chimérickom modeli rakoviny prsníka bola invázia tumoru výrazne potlačená po podaní anti-a,J3₃ protilátky LM-609, čo predpokladá priamy účinok blokády α_νβ₃ na tumor nezávislý od angiogenézy (48).

Na zodpovedanie tejto otázky bola vyšetrená bunková adhézia a migrácia vitronectinu v prítomnosti a_v-antagonsitu, s použitím DAOY, U87MG a izolovaných primárnych ľudských mozgových endotelových buniek (HBEC) (49). Αηίί-α_νβ₃ protilátka LM/609 inhibovala migráciu U87MG, DAOY a HBEC na vitronectin, a v kombinácii s anti-a_vPs protilátkou P1-F6 inhibovala adhéziu týchto buniek na vitronectin. Samotný cRGD signifikantne inhiboval adhéziu a migráciu na vitronectin u všetkých troch typov buniek. V podobnej štúdii, bola invázia melanómových buniek zvýšená vitronectinom a blokovaná RGD peptidmi (50). A konečne, ošetrenie cRGD viedlo k zvýšenej apoptóze, a to nie len pri HBEC bunkách, ale aj pri DAOY a U87MG tumorových bunkách. Tieto výsledky naznačujú, že cRGD môže okrem svojej antiangiogenetickej funkcii priamo inhibovať inváziu a proliferáciu tumoru.

Naše dáta ďalej demonštrujú, že cyklický pentapeptid môže tiež inhibovať adhéziu buniek mozgového tumoru na rôzne ECM substráty, ako vitronectin alebo tenascin. Účinok takejto inhibície adhézie vedie k bunkovej smrti (apoptóze) buniek mozgového tumoru ako aj mozgových kapilár. Tento účinok sa týka iba ECM vitronectinu a tenascinu. Zároveň sa ukázalo, že zvýšená smrť buniek je spôsobená priamo bunkovou apoptózou, nie ako následok potlačenia rastu kapilár. Inými slovami, novým zistením predloženého vynálezu je, že cyklický pentapeptid indukuje priamu smrť bunky.

Záverom je nutné konštatovať, že táto štúdia poskytuje dôkazy, že sledovaný antagonizmus integrínov, špeciálne α_νβ₃ a α_νβ₅, môže podstatne inhibovať mozgovú tumorogenézu in vivo a môže teda predstavovať dôležitý nový terapeutický prístup k mozgovým tumorom. Naše výsledky tiež naznačujú, že mikroprostredie je kritické pre správanie sa tumoru ako aj na určovanie jeho odpovedí na takéto biologicky riadené terapie. A konečne bolo ukázané, že antagonizmus integrínu môže mať antitumorogénny efekt, nezávislý od angiogenézy, ktorá môže synergicky spolupracovať na spomalení rastu tumoru.

Poslaním uvedeného je ilustrovať, a nie limitovať rozsah vynálezu. Pre odborníkov všeobecne znalých odboru je naozaj jednoduché predpovedať a pripraviť ďalšie uskutočnenia založené na tu uvedených znalostiach, bez potreby velkého experimentovania.

1. Folkman, J., The role of angiogenesis in tumor growth, Sem. Cancer Biol., 3:6571,1992.

2. Plate, K.H., Risau, W., Angiogenesis in malignant gliomas, Glia., 15:339-347,

1995.

3. Folkman, J., Watson, K., Ingber, D., Hanahan, D., Induction of angiogenesis during the transition from hyperplasiato neoplasia, Náture, 339:58-61, 1989.

4. Chán, A.S., Leunng, S. Y., Wong, M.P., Yuen, S.T., Cheung, N., Fan, Y.W., Chung, L J*., Expression of vascuiar endothelial growth factor and its receptore in the anaplastic progression of astrocytoma, oligodendroglioma, and ependymoma, Am. J. Surg. Pathol., 22:816-826,1998.

5. Takano, S., Yoshii, Y., Kondo, S., Suzuki, H., Maruno, T., Shirai, S., Nose, T., Concentration of vascuiar endothelial growth factor in the sérum and tumor tissue ofbrain tumor patients, Cancer Res., 56:2185-2190, 1996.

6. Brem, S., Tsanaclis, A.M., Gately, S., Gross, J.L., Herblin, W.F., Immunolocalization of basic fibroblast growth factor to the microvascuiature of human brain tumore, Cancer, 70:2673-2680, 1992.

7. Li,V.W., Folkerth, R.D., Waianabe, H., Yu, C., Rupnick, M., Bames, P., Scott, R.M., Black, P.M., Sallan, S., Folkman, J., Microvessel count and cerebrospinal fluid basic fibroblast growth factor in children with brain tumore, Lacet, 344:8286,1994.

8. Abuirauf, S.I., Edvardsen, K., Ho K.L., Yang, X. Y., Rock, J.P., Rosenblum,

M.L., Vascuiar endothelial growth factor expression and vascuiar density as prognostic markers of survival in patients with low-grade astrocytoma, J. Neurosurg., 88:513-520, 1998.

9. Leon, S.P., Folkerth, R.D., Black, P.M., Microvessel density is a prognostic indicator for patients with astroglial brain tumors, Cancer, 71:262-312,1996.

10. Hynes, R.O., Integrins: a family of celí surface receptor, Celí, 48:455-459,1987.

11. Rusnati, M., Tanghetti, E., Dell’Era, P., Gualandris, A., Presta, M., Alphavbeta3 integrin mediates the cell-adhesive capacity and biological activity of basic fibroblast growth factor (FGF-2) in cultured endothelial cells, Mol. Biol. Celí, 8:2449-2461, 1997.

12. Vamer, J.A., The role of vascular celí integrins alpha v beta 3 and alpha v beta 5 in angiogennesis, EXS, 79:361-390, 1997.

13. Friedlander, M., Brooks, P.C., Shaffer, R.W., Kincaid, C.M., Vamer, J.A., Cheresh, D. A., Definition of two angiogenic pathways by distinct alphav integrins, Science, 270:1500-1502,1995.

14. Gladson, G.L., Expression of integrin alpha v beta 3 in small blood vessels of glioblastoma tumors, J. Neuropathol. Exp. Neurol., 55:1143-1149,1996.

15. Gladson, C.L., Wilcox, J.N., Sanders, L., Gillespie, G.Y., Cheresh, D.A.,

Cerebral microenvironment influences expression of the vitronectin gene in astrocytic tumors, J. Celí Sci., 108:947-956, 1995.

16. Longhurst, C.M., Jennings, L.K., Integrin-mediated signál transduction, Celí Mol. Life Sci., 54:514-526,1998.

17. Howe, A., Aplin, A.E., Alahari, S.K., Juliano, RJL., Integrin signaling and celí growth control, Curr. Opin. Celí Biol., 10:220-231,1998.

18. Malik, R.K., Regulation of apoptosis by integrin receptors, J. Pediatr. Hematol. Oncol., 19:541-545,1997.

19. Scatena, M., Almeida, M., Chisson, M.L., Fausto, N., Nicosia, R.F., Giachelli,

C.M., NF-kappaB mediates alphavbeta3 integrin-induced endothelial celí survival, J. Celí Biol., 141-1083-1093,1998.

20. Gladson, C.L., Cheresh, D.A., Gliobiasioma expression of vitronectin and the avb3 integrin. Adhesion mechanism for transformed glial cells, J. Clin. Invest., 88:1924-1932, 1991.

21. Brooks, P.C., Clark, R. A., Cheresh, D. A., Requirement of vascuiar integrin alpha v beta 3 for angiogenesis, Science, 264:569-571, 1994.

22. Christofídou-Solomidou, M., Biidges, M., Murphy, G.F., Abelda, S.M.,

DeLisser, HM., Expression and funcuon of endothelial celí av integrin receptore in wound-induced human angiogenesis in human skin/SCID mice chimeras, Am.

J. Pathol., 151:975-983, 1997.

23. Brooks, P.C., Montgomery, A.M., Rosenfeid, M., Reisfeld, R.A., Hu, T., Klier,. G., Cheresh, D.A., Integrin avb3 antagonists promote tumor regression by inducing apoptosis of angiogenic blood vessels, Celí, 79:1157-1164,1994.

24. Molema, G., Griffioen, A.W., Rocking the foundations of solid tumor growth by attacking the tumor’s blood supply, Immunol. Today, 19:392-394,1998.

25. Kim, K.J., Li, B., Winer, J., Aimanini, M., Gillett, N., Phillips, H.S., Feirara, N., Inhibition of vascuiar endothelial growth factor-induced angiogenesis suppresses tumor growth in vivo, Náture, 362-841-844,1993.

26. Re, F., Zanetti, A., Sironi, M., Polentarutti, N., Lanfrancone, L., Dejana, E., Colotta, F., Inhibition of anchorage-dependent celí spreading triggers apoptosis in cuitured human endothelial cells, J. Celí Biol., 127:537-546,1994.

27. Montgomery, A.M., Reisfffeld, R.A., Cheresh, D.A., Integrín avb3 rescues melanoma cells .Írom apoptosis in three-dimensional dennal collagen, Proc. Natl. Acad Sci., 91:8856-8860, 1994.

28. Isik, F.F., Gibran, N.S., Jang, Y., Sandell, L., Schwartz, S.M., Vitronectin decreases microvascular endotheiial celí apoptosis, J. Celí Physiol., 173:149-155,

1998.

29. Germer, M., Kanse, S.M., Kirkegaard, T., Kioler, L., Feldinng-Habennann, B., Goodman, S., Preissner, T., Kinetic analysis of integrín-dependent celí adhesion on vitronectin. The inhibitory potential of plasminogen activator inhibítor-1 and RGD peptides, Eur. J. Biochem., 253:669-674, 1998.

30. Ruoslahti, E., Reed, J.C., Anchorage dependence, integríns, and apoptosis, Celí, 77:477-478, 1994.

31. MacDonald, T. J., Tabrízi, P., Shimada, H., Zlokovic, B. V., Laug, W.E.,

Detection of brain tumor invasion and micrometastasis in vivo by expression of enhanced green fluorescent protein, Neurosurgery, 43:1437-1443,1998.

32. Hsu, S.C., Volpert, O.V., Steck, P.A., Mikkelsen, T., Polverini, P.J., Rao, S., Chou Bouck, N.P., Inhibition of angiogenesis in human glioblastomas by chromosome 10 induction ofthrobospondin-1, Cancer Res., 56:5684-5691, 1996.

33. Taki, T., Ohnishi, T., Arita, N., Hiraga, S., Saitoh, Y., Izumoto, S., Mori, K., Hayakawa, T., Anti-proliferative effects of TNnP-470 on human malignant glioma in vivo: potent inhibition of tumor angiogenesis, J. Neurooncol., 19:251258,1994.

34. Tanaka, T., Manome, Y., Wen, P., Kufe, D.W., Fine, H.A., Viral vector-mediated transduction of a modified plateiet factor 4 cDNA inhibits angiogenesis and tumor growth, Nat. Med., 3:437-442,1997.

35. Carron, C.P., Meyer, D.M., Pegg, JA., Engleman, V.W., Nickols, M.A., Settlel,

S.L., Westlin, W.F., Ruminski, P.G., Nickols, G.A., A peptidomimetic antagonist of the integrin avb3 inhibits Leydig celí tumor growth and the development of hypercalcemia of malignancy, Cancer Res., 58:1930-1935, 1998.

36. Kirsch, M., Strasser, J., Allende, R., Bello, L., Zhang, J., Black, P.M.,

Angiostatin suppresses malignant glioma growth in vivo, Cancer Res., 58:46544659,1998.

37. Bader, B.L., Raybum, H., Crowley, D., Hynes, R.O., Extensive vasculogenesis, angiogenesis, and organogenesis precede lethality in mice lacking all αν integrins, Celí, 95:507-519,1998.

38. Knott, J.C., Mahesparan, R., Garcia-Cabrera, I., Bolge, T.B., Edvardsen, K.,

Ness, G.O., Mark, S., Lund-Johansen, M., Bjerkvig, R., Stimulation of extracellular matríc components in the normál brain by invading glioma cells, Int. J. Cancer, 75:864-872,1998.

39. Seger, D., Gechtman, Z., Shaltiel, S., Phosphoiylation of vitronectin by casein kinase Π. Identification of the sites and their promotion of celí adhesion and spreading, J. Biol. Chem., 273:24805-24813,1998.

40. Woodard, A., Garcia-Cardera, G., Leong, M., Madri, J., Sessa, W., Languino, L., The synergistic activity of alphavb3 integrin and PDGF receptor increases celí migration, J. Celí Sci., 111:469-478,1998.

41. Sanders, R.J., Mainiero, F., Giancotti, F.G., The role of integrins in tumorigenesis and metastasis, Cancer Invest., 16:329-344,1998.

42. Treasurywala, S., Berens, M.E., Migration arrest in glioma cells is dependent on the alpha-v integrin subunit, Glia., 24:236-243,1998.

r r

43. Won, N.C., Mueller, B.M., Barbas, C.F., Ruminski, P., Quaranta, V., Lin, E.C., Smith, J.W.. Alpha-v integrins mediate adhesion and migration of breast carcinoma celí lines, Clin. Exp. Metasiasis, 16:50-61, 1998.

44. Van Leeuwen, R.L., Yoshinaga, I.G., Akasaka, T., Dekker, S.K., Vermeer, B J., Byers, H,R., Attachment, spreadíng and migration of melanoma cells on vitronectin. The role of alpha v beta 3 and alpha v beta 5 integrins, Exp. Dermatol., 5:308-315,1996.

45. Lehmann, M., EI Battari, A., Abadie, B., Martin, J.M., Marvallldi, J., Role of alpha v beta 5 and alpha v beta 6 integrin glycosylation in the adhesion of a colonic adenocarcinoma celí line (HT29-D4), J. Celí Biochem., 61:266-277,

1996.

46. Kost, C., Benner, K., Stockmann, A., Linder, D., Preissner, K.T., Limited plasmin proteolysis of vitronectin. Characterization of the adhesion proteín as morpho-regulatory and angiostatin binding factor, Eur. J. Biochem., 236:682688,1996.

47. Maenpaa, A., Kovanen, P.E., Paetau, A., Jaaskelainen, J., Timonen, T., Lymphocyte adhesion molecule ligands and extracellular matrix proteins in gliomas and nonnal brain: expression of VCAM-1 in gliomas, Acta. Neuropathol., 94:216-225,1997.

48. Brooks, P.C., Stromblad, S., Klemke, R, Visscher, D., Sarkar, F.H., Cheresh,

D A., Anti-integrin alpha v beta 3 blocks human breast cancer growth and angiogenesis in human skin, J. Clin. Irrvest., 96:1815-1822, 1995.

49. Stins, M.F., Gillesl, F., Kim, K.S., Selective expression of adhesion molecules on human brain microvascular endothelial cells, J. Neuroimmunol., 76:81-90, 1997.

50. Bafetti, L.M., Young, T.N., Itoh, Y., Stack, M.S., Intact vitronectin induces matrix metalloproteinase-2 and tissue inhibitor of metalloprotemase-2 expression and enhanced cellular invasion by meianoma cells, J. Biol. Chem., 273:143-149,

1998.

51. Wong, N.C., Mueller, B.M., Barbas, C.F., Ruminski, P., Quaranta, V., Lin, E.C., Smith, J.W., Alphav integrins mediate adhesion and migration of breast carcinoma celí lines, Clin. Exp. Metastasis, 16:50-61,1998.

52. Van Leeuwen, R.L., Yoshinaga, I.G., Akasaka, T., Dekker, S.K., Venneer, B.J., Byers, H.R., Attachment, spreading and migration of meianoma cells on vitronectin. The role of alpha v beta 3 and alpha v beta 5 integrins, Exp. Dermatol., 5:308-315, 1996.

53. Lehmann, M., EI Battari, A., Abadie, B., Martin, J.M., Marvaldi, J., Role of alpha v beta 5 and alpha v beta 6 integrin giycosylation in the adhesion of a colonic adenocarcinoma celí line (HT29-D4), J. Celí Biochem., 61:266-277,1996.

54. Gladson, C.L., Cheresh, D.A., Glioblastoma expression of vitronectin and the integrin, J. Clin. Invest., 88:1924-1932, 1991.

55. Jaskiewicz, K., Chasen, M.R., Robson, S.C., Differential expression of extraceilular matrix proteins and integrins in hepatocellular carcinoma and chronic livezdisease, AnticancerR.es., 13:2229-2237,1993.

56. Brooks, P.C., Stromblad, S., Klemke, R., Visseher, D., Sarkar, F.H., Cheresh,

D.A., Anti-integrin alpha v beta 3 blocks human breast cancer growth and angiogenesis in human skin, J. Clin. Invest., 96:1815-1822,1995.

57. Leon, S.P., Folkerth, R.D., Black, P.M., Microvessel density is a prognostic indicator for patients with astroglial brain tumors, Cancer, 77:362-372,1996.

58. Wesseling, P., Van Der Laak, J.A., Link, M., Teepen, H.L., Ruiter, D.J., Quantitative analysis of microvascular changes in difíuse astrocytic neoplasms with increasing gráde of malignancy, Hum. Pat ho L, 29:352-358,1998.

59. Li, V.W., Folkerth, R.D., Watanabe, H., Yu, C., Rupnick, M., Bames, P., Scott, M., Black, P.M., Sallan, S., Folkman, J., Microvessel count and cerebrospinal fluid basic fíbroblast growth factor in children with brain tumors, Lancet, 344:8286,1994.

60. Taki, T., Ohnishi, T., Arita, N., Hiraga, S., Saitoh, Y., Izumoto, S., Mori, K., Hayakawa, T., Anti-proliferative effects of TNP-470 on human malignant glioma in vivo: potent inhibition of tumor angiogenesis, J. Neurooncol., 19:251-258,

1994.

61. Hsu, S.C., Voipert, O. V., Steck, P.A., Mikkelsen, T., Polverini, P.J., Rao, S., Chou Bouck, N.P., Inhibition of angiogenesis in human glioblastomas by chromosome 10 induction of thrombospondin-1, Cancer Res., 56:5684-5691,

1996.

62. Tanaka, T., Manome, Y., Wen, P., Kufe, D.W., Fine, H.A., Viral vector-mediated transduction of a modified platelet factor 4 CDNA inhibits angiogenesis and tumor growth, Nat. Med., 3:437-442,1997.

Claims (29)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použitie antagonistu integrínu na prípravu liečiva na inhibíciu rastu tumoru v mozgu hostiteľa.
2. 2. Použitie podľa nároku 1, vyznačujúce sa : ý m, že integrínom je α_ν, α_νβ₃ alebo α_νβ5
3. 3. Použitie podľa nároku 1, vyznačujúce sa tým, že antagonista je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z pclypeptidového antagonistu a_v, protilátky proti α_νβ₃, protilátky proti α_νβ₃ a kombinácie protilátok proti α_νβ₃ a α_νβ5·
4. 4. Použitie podľa nároku 3, vyznačujúce sa tým, že antagonistom je polypeptidový antagonista a_v.
5. 5. Použitie podľa nároku 4, vyznačujúce sa tým, že antagonistom <x_v je polypeptid obsahujúci Arg-Gly-Asp (RGD) .
6. 6. Použitie podľa nároku 5, vyznačujúce sa tým, že antagonistom je RGD cyklický polypeptidový antagonista a_v.
7. 7. Použitie podľa nároku 3, vyznačujúce sa tým, že antagonistom je monoklonálna protilátka imunošpecifická pre α_νβ₃
8. 8. Použitie podľa nároku 7, vyznačujúce sa tým, že monoklonálna protilátka má imunoreakčné charakteristiky mcr.okionálne j protilátky označenej LM-609.
9. 9. Použitie podľa nároku 3, vyznačujúce sa tým, že kombinácia protilátok proti α_νβ₃ a α_νβ₅ je kombináciou monoklonálnej protilátky imunošpecifickej na α_νβ₃ a monoklonálnej protilátky imunošpecifickej na α_νβ₅.
10. 10. Použitie podlá nároku 9, vyznačujúce sa tým, že monoklonálna protilátka imunošpecifická na α_νβ₃ má imunoreakčné charakteristiky monoklonálnej protilátky označenej LM-609 a monoklcnálna protilátka imunošpecifická pre α_νβ₅ má imunoreakčné charakteristiky monoklonálnej protilátky označenej P1-F6.
11. 11. Použitie podľa nároku 1, vyznačujúce sa tým, že tumor je lokalizovaný intracerebrálne v mozgu hostiteľa.
12. 12. Použitie podľa nároku 1, vyznačujúce sa tým, že tumor je vybraný zo skupiny obsahujúcej glioblastóm, meduloblastóm, astrocystóm, primitívnu neuroektodermu a gliómovú rakovinu mozgového kmeňa.
13. 13. Použitie podľa náreku 1, vyznačujúce sa tým, že liečivo je vo forme na intraperitoneálne, subkutánne, intravenózne, transdermálne, intrasynoviálne, intramuskulárne alebo orálne podanie.
14. 14. Použitie podľa nároku 1, vyznačujúce sa tým, že antagonista sa používa v spojení s farmaceutickým nosičom.
15. 15. Použitie antagonistu integrínu na prípravu liečiva na inhibíciu angiogenézy v tumerovom tkanive lokalizovanom v mozgu hostiteľa.
16. 16. Použitie podľa nároku 15, vyznačujúce sa tým, že integrínom. je α·.·β₃ alebo α~β;.
17. 17. Použitie podľa nároku 1, vyznačujúce sa tým, že antagonista je vybraný zo skupiny obsahujúcej polypeptidového antagonistu a_v, protilátky proti α_νβ₃, protilátky proti α_νβ₅ a kombinácie protilátok proti α_νβ₃ a α_νβ₅.
18. 18. Použitie antagonistu integrínov α_νβ₃ a α_νβδ na prípravu liečiva na inhibíciu bunkovej adhézie závislej od extracelulárneho matrixu (ECM) v bunkách mozgového tumoru rastúcich v mozgu hostiteľa.

    »
19. 19. Použitie podľa nároku 18, vyznačujúce sa tým, že antagonistom je antagonista a_v alebo kombinácia protilátok proti α_νβ₃ a α_νβ₅.
20. 20. Použitie podľa nároku 19, vyznačujúce sa tým, že antagonistom a_v je polypeptid obsahujúci Arg-Gly-Asp (RGD).
21. 21. Použitie podľa nároku 20, vyznačujúce sa tým, že antagonistom je RGD cyklický pentapeptidový antagonista a_v.
22. 22. Použitie podľa nároku 18, vyznačujúce sa tým, že ECM je vitronectin alebo tenascin.
23. 23. Použitie antagonistu α_νβ₃ na prípravu liečiva na inhibíciu od vitronectinu závislej bunkovej migrácie buniek mozgového tumoru v mozgu hostiteľa.
24. 24. Použitie podľa nároku 20, vyznačujúce sa tým, že antagonistom je antagonista a_v alebo protilátka proti α_νβ₃.
25. 25. Použitie antagonistu inregrínu na prípravu liečiva na indukciu apoptózy tumorových buniek rastúcich v mozgu hostiteľa.
26. 26. Použitie podľa nároku 25, vyznačujúce sa tým, že integrínom je a_v, α_νβ3 alebo α_νβ5·
27. 27. Použitie podlá nároku 25, vyznačujúce že antagonistom je polypeptidový antagonista a_v.
28. 28. Použitie podlá nároku 27, vyznačuj úce že antagonistom a_v je polypeptid obsahujúci Arg-Gly-Asp
29. 29. Použitie podlá nároku 28, vyznačujúce že antagonistom je RGD cyklický pentapeptidový integrínov α_ν, α_νβ3 alebo α_νβ5.