SI9620059A - Virusni vektorji in njihova uporaba za zdravljenje hiperproliferativnih motenj, zlasti restenoze - Google Patents
Virusni vektorji in njihova uporaba za zdravljenje hiperproliferativnih motenj, zlasti restenoze Download PDFInfo
- Publication number
- SI9620059A SI9620059A SI9620059A SI9620059A SI9620059A SI 9620059 A SI9620059 A SI 9620059A SI 9620059 A SI9620059 A SI 9620059A SI 9620059 A SI9620059 A SI 9620059A SI 9620059 A SI9620059 A SI 9620059A
- Authority
- SI
- Slovenia
- Prior art keywords
- adenovirus
- virus
- gax
- gene
- virus according
- Prior art date
Links
- 208000037803 restenosis Diseases 0.000 title claims abstract description 14
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title claims description 12
- 230000003463 hyperproliferative effect Effects 0.000 title claims description 11
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 title description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 56
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 44
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 76
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 claims description 11
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 11
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 claims description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 7
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 7
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 claims description 7
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 6
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 5
- 101100022881 Rattus norvegicus Meox2 gene Proteins 0.000 claims description 5
- 241000282465 Canis Species 0.000 claims description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 4
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 claims description 4
- 230000007170 pathology Effects 0.000 claims description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 claims description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 claims description 2
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 claims 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 10
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 8
- 230000002950 deficient Effects 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 70
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 43
- 101150029117 meox2 gene Proteins 0.000 description 35
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 description 28
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 21
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 19
- 210000004509 vascular smooth muscle cell Anatomy 0.000 description 16
- 210000002464 muscle smooth vascular Anatomy 0.000 description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 13
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 10
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 10
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 9
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 9
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 7
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 7
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 7
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 6
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 6
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 6
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 5
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical class [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 5
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 5
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 4
- 108700005087 Homeobox Genes Proteins 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 238000002399 angioplasty Methods 0.000 description 4
- 210000000709 aorta Anatomy 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 5-bromodeoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 3
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 3
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 3
- 101100348341 Caenorhabditis elegans gas-1 gene Proteins 0.000 description 3
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 3
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 3
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 3
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 210000001715 carotid artery Anatomy 0.000 description 3
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 3
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 108700004026 gag Genes Proteins 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- -1 neurofilaments Proteins 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N BROMODEOXYURIDINE Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 208000034827 Neointima Diseases 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 241000713896 Spleen necrosis virus Species 0.000 description 2
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 229950004398 broxuridine Drugs 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 101150036170 gas-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N pentobarbital Chemical compound CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700004029 pol Genes Proteins 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- 210000004231 tunica media Anatomy 0.000 description 2
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- OVSKIKFHRZPJSS-UHFFFAOYSA-N 2,4-D Chemical compound OC(=O)COC1=CC=C(Cl)C=C1Cl OVSKIKFHRZPJSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HZLHRDBTVSZCBS-UVJJDBRNSA-N 4-[(e)-(4-aminophenyl)-(4-imino-3-methylcyclohexa-2,5-dien-1-ylidene)methyl]-2-methylaniline;hydrochloride Chemical compound Cl.C1=CC(=N)C(C)=C\C1=C(C=1C=C(C)C(N)=CC=1)/C1=CC=C(N)C=C1 HZLHRDBTVSZCBS-UVJJDBRNSA-N 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 101100243024 Arabidopsis thaliana PCO1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001212038 Arcola Species 0.000 description 1
- 208000037260 Atherosclerotic Plaque Diseases 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 101150044789 Cap gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100038909 Caveolin-2 Human genes 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- XULFJDKZVHTRLG-JDVCJPALSA-N DOSPA trifluoroacetate Chemical compound [O-]C(=O)C(F)(F)F.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCOCC(C[N+](C)(C)CCNC(=O)C(CCCNCCCN)NCCCN)OCCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC XULFJDKZVHTRLG-JDVCJPALSA-N 0.000 description 1
- 102100036912 Desmin Human genes 0.000 description 1
- 108010044052 Desmin Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 230000035519 G0 Phase Effects 0.000 description 1
- 230000010190 G1 phase Effects 0.000 description 1
- 102100039289 Glial fibrillary acidic protein Human genes 0.000 description 1
- 101710193519 Glial fibrillary acidic protein Proteins 0.000 description 1
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000740981 Homo sapiens Caveolin-2 Proteins 0.000 description 1
- 241000598171 Human adenovirus sp. Species 0.000 description 1
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102100021244 Integral membrane protein GPR180 Human genes 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 1
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 1
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 241000713862 Moloney murine sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 101100447658 Mus musculus Gas1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-proline Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 1
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N Poloxamer Chemical compound C1CO1.CC1CO1 RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOOHAUXETOMSMM-UHFFFAOYSA-N Propylene oxide Chemical class CC1CO1 GOOHAUXETOMSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001112090 Pseudovirus Species 0.000 description 1
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- XNCUYZKGQOCOQH-YUMQZZPRSA-N Ser-Leu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O XNCUYZKGQOCOQH-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N Sodium Chemical compound [Na] KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- 206010072810 Vascular wall hypertrophy Diseases 0.000 description 1
- 102000013127 Vimentin Human genes 0.000 description 1
- 108010065472 Vimentin Proteins 0.000 description 1
- 238000005299 abrasion Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 1
- 230000004219 arterial function Effects 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 230000003143 atherosclerotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 1
- 238000010293 colony formation assay Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005045 desmin Anatomy 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009144 enzymatic modification Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 1
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 1
- 238000001400 expression cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 101150098622 gag gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 210000005046 glial fibrillary acidic protein Anatomy 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 1
- 108091008039 hormone receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 108010044311 leucyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 230000008747 mitogenic response Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003562 morphometric effect Effects 0.000 description 1
- 238000013425 morphometry Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 210000005044 neurofilament Anatomy 0.000 description 1
- 231100000065 noncytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002020 noncytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000009806 oophorectomy Methods 0.000 description 1
- 230000001151 other effect Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 229960001412 pentobarbital Drugs 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 238000000819 phase cycle Methods 0.000 description 1
- 229920001992 poloxamer 407 Polymers 0.000 description 1
- 229940044476 poloxamer 407 Drugs 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M potassium chloride Inorganic materials [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 230000026447 protein localization Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108090000064 retinoic acid receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000003702 retinoic acid receptors Human genes 0.000 description 1
- 239000007320 rich medium Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000011477 surgical intervention Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 230000009750 upstream signaling Effects 0.000 description 1
- 230000006492 vascular dysfunction Effects 0.000 description 1
- 231100000216 vascular lesion Toxicity 0.000 description 1
- 230000006439 vascular pathology Effects 0.000 description 1
- 210000005048 vimentin Anatomy 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
- C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2799/00—Uses of viruses
- C12N2799/02—Uses of viruses as vector
- C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
- C12N2799/022—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from an adenovirus
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Predloženi izum se nanaša na nepopolne rekombinantne viruse, ki vsebujejo vsaj en inseriran gen, ki kodira celoto ali del proteina GAX ali varianto tega proteina, in na njihovo terapevtsko uporabo, zlasti za zdravljenje post-angioplastične restenoze.ŕ
Description
ČASE WESTERN RESERVE UNIVERSITY
Virusni vektoiji in njihova uporaba za zdravljenje hiperproliferativnih motenj, zlasti restenoze
Predloženi izum se nanaša na nov posebno učinkovit postopek za zdravljenje patologij, ki so povezane s hiperproliferativnimi motnjami, z gensko terapijo. Postopek v smislu izuma zlasti predstavlja specifično blokiranje proliferacije celic vaskularnih gladkih mišic (VSMC) s prenosom gena gax in vivo. Postopek v smislu izuma je prav posebno prikladen za zdravljenje postangioplastične restenoze s prekomerno ekspresijo gena gax v vaskularni steni. V skladu s predloženim izumom se gen gax lahko prenese z virusnimi vektorji. Ti vektorji so prednostno adenovirusni vektorji.
Izolirani so bili različni geni, povezani z ustavitvijo celične delitve. Tako so geni gas (specifični za ustavitev rasti: gas 1-6) in gadd (za ustavitev rasti in inducibilni za poškodbo DNA : gadd34; gadd45 in gaddl53) močno eksprimirani v mirnih celicah, to je tistih, ki so blokirane v fazi GO celičnega ciklusa (Schneider et al., Celi 1988,54; 787-793, Del Sal et al., Celi 1992, 12: 3514-3521; Cowled et al., Exp.Cell.Res. 1994, 211 : 197-202; Brancolini in Schneider, J.Cell.Biol. 1994; 124 : 743-756; Zhan et al., Mol.Cell.Biol. 1993, 13 : 4242-4250; Jackman et al., Cancer Res. 54 : 5656-5662, 1994). V skladu s temi ugotovitvami glede ekspresije gena, mikroinjiciranje proteina gas-1 blokira sintezo DNA (Del Sal et al., Celi, 1992, 70 : 595-607). Obratno dodatek rastnih faktorjev, kot so PDGF (rastni faktorji, ki izhajajo iz trombocitov), ali fetalnega telečjega seruma zmanjša ekspresijo teh genov v modelih in vitro (Coccia et al. Mol.Cell.Biol. 1992, 12 : 3514-3521). Ta specifičnost ekspresije v zvezi s stanjem celične proliferacije tudi navaja k temu, da ima svojega dvojnika in vivo. Tako je gen gas-1 močno eksprimiran v podganjem uterusu po ovariektomiji (Ferrero in Cairo, Cell.Biol.Int. 1993, 17, 857-862). V enakem živalskem modelu je posledica zdravljenja z estrogeni celična proliferacija, ki se izraža v uterusu z zvečanjem ekspresije proto-onkogena c-myc in z zmanjšanjem ekspresije gena gas-1. Podobno je v hepatičnem modelu proliferacije/regeneracije ekspresija gena gas-6 močno zmanjšana 4 ure po parcialni heptatektomiji, tj. v obdobju tranzicije GO v Gl; ta ekspresija se vrne na normalno verjetno potem, ko je injicirana delitev hepatocitov (Ferrero et al., Cell.Biol.Int 1994,158:263-269).
Prijavitelj se je zanimal za nov gen, tj. gax (homeoboks, specifičen za ustavitev rasti) in s predloženo prijavo prikazuje, da ima ta gen lastnosti, ki so posebno prednostne za uporabo v genski terapiji hiperproliferativnih motenj, posebno restenoze. Gen gax je bil na začetku identificiran v knjižnici cDNA, pripravljeni iz podganje aorte. Kodira protein s 303 amino kislinami. Njegova sekvenca je bila označena in njegova cDNA klonirana (Gorski et al., Mol.Cell.Biol. 1993, 6, 3722-3733). Gen gax ima določene lastnosti, ki so podobne tistim od genov gas in gadd, ker kaže, da tudi on regulira tranzicijo G0/G1 v celičnem ciklusu. Na enak način se nivoji gax mRNA znižajo v podganjih VSMC za faktor 10 po dveh urah izpostavitve PDGF (Gorski et al., Mol.Cell.biol. 1993, 6, 3722-3733). Ekspresija gena gax je zato zatrta med mitogenskim odzivom VSMC.
Ena prednost postopka v smislu izuma je načeloma specifičnost ekspresije gena gax. Tako je v odrasli podgani gen gax pretežno eksprimiran v kardiovaskularnem (aorta in srce) sistemu. Po drugi strani manjka Northern blotting, da bi prikazali prisotnost gax MRNA v jetrih, možganih, želodcu ali skeletnih mišicah. Post-angioplastična restenoza je lokalizirana hiperproliferativna motnja, ki se razvije po nekirurški intervenciji v regiji aterosklerotičnega plaka. Tako je posledica zdravljenja aterosklerotične lezije z angioplastijo zelo pogosto (do 50% primerov v določenih študijah) restenoza po mehanični poškodbi arterijske stene. Ključni dogodek tega mehanizma je proliferacija in migracija celic vaskularnih gladkih mišic (VSMC) tunike medije proti tuniki intimi, posebno zaradi odsotnosti zaščite in/ali povratne zveze, izvedene z endotelijskimi celicami tunike intime. Sposobnost selektivne ekspresije antiproliferativnega gena v smislu izuma v celicah VSMC pomeni zares bistveno prednost.
Druga prednost postopka v smislu izuma je v tem, da gen gax spada v družino homeotičnih genov. Ti geni kodirajo transkripcijske faktorje, ki vsebujejo konsenzne sekvence (ali homeodomene), ki spoznajo specifične regije DNA (ali homeobokse) (pregled : Gehring et al. Celi, 78 : 211-223, 1994). Homeodomena podganjega proteina gax je vsebovana med amino kislinami 185 in 245. Zanimivo je, da so homeotični geni, ki so bili identificirani do sedaj, vključeni v kontrolo celične diferenciacije/rasti med embriogenezo, tako pa se okrepi terapevtska zmožnost postopka v smislu izuma (pregled : Lawrence and Morata Celi 78 : 181-189,1994; Krumlauf, Celi 78:191-201,1994).
Predloženi izum se tako na začetku nanaša na nepopolni rekombinantni virus, ki vsebuje vsaj en inseriran gen, ki kodira celoten protein GAX ali del le-tega ali varianto tega proteina. Predloženi izum se prav tako nanaša na uporabo takega virusa za zdravljenje hiperproliferativnih bolezni.
V virusih v smislu izuma je inserirani gen lahko fragment komplementarne DNA (cDNA) ali genomske DNA (gDNA) ali hibridni konstrukt, ki je sestavljen npr. iz cDNA, v katero je inseriran eden ali več intronov. Gen je prav tako lahko sestavljen iz sintetičnih ali semisintetičnih sekvenc. Kot je označeno zgoraj, je gen lahko tisti, ki kodira celoten protein GAX ali del le-tega ali je varianta tega proteina. V predloženem izumu izraz varianta pomeni katerikoli mutant, fragment ali peptid, ki ima vsaj eno biološko lastnost GAX-a, kot tudi katerikoli homolog GAX-a, ki ga dobimo iz druge vrste. Te fragmente in variante lahko dobimo s katerokoli tehniko, znano strokovnjaku, posebno z genetskimi in/ali kemijskimi in/ali encimskimi modifikacijami ali s hibridizacijo ali z ekspresijskim kloniranjem, ki omogoča variantam, da jih izberemo v skladu z njihovo biološko aktivnostjo. Genetske modifikacije vključujejo supresije, delecije, mutacije itd.
V smislu izuma je inserirani gen prednostno tisti, ki kodira celoten podganji protein gax ali del le-tega ali je od njegovega humanega homologa. Bolj prednostno je cDNA ali gDNA.
Na splošno inserirani gen vključuje tudi sekvence, ki omogočajo, da se le-ta eksprimira v inficirani celici. Te sekvence so lahko tiste, ki so naravno odgovorne za ekspresijo navedenega gena, če so te sekvence sposobne delovanja v inficirani celici. Sekvence so prav tako lahko tudi tiste iz različnih izvorov (odgovorne za ekspresijo različnih proteinov ali celo sintetičnih proteinov). Posebno so lahko sekvence evkariotskih ali virusnih genov ali izvedene sekvence, ki stimulirajo ali zatirajo transkripcijo gena na specifičen ali nespecifičen način in na inducibilen ali neinducibilen način. Lahko so npr. promotorske sekvence, ki so izvedene iz genoma celice, za katero je želeno, da jo inficirajo, ali iz genoma virusa, posebno promotorji adenovirusnih genov E1A in MLP, CMV ali LTR-RSV promotorji itd. Evkariotski promotorji, ki jih prav tako lahko navedemo, so ubikvitarni promotorji (HPRT, vimentin, aktin, tubulin itd.), intermediatni filamentni promotorji (dezmin, nevrofilamenti, keratin, GFAP, itd.), terapevtski genski promotorji (tip MDR, CFTR, faktor VIII, itd.), tkivno specifični promotorji (promotor aktin v celicah gladkih mišic), promotogi, ki so prednostno aktivirani v deljivih celicah, ali drugi promotorji, ki se odzivajo stimulusu (stereoidni hormonski receptor, receptor retinojska kislina itd.). Poleg tega te ekspresijske sekvence lahko modificiramo z dodajanjem aktivacijskih sekvenc, regulatornih sekvenc itd. Kadar pa inserirani gen ne vključuje nobene ekspresijske sekvence, ga lahko inseriramo v genom nepopolnega virusa navzdol od take sekvence.
Poleg tega inserirani gen na splošno vključuje navzgor od kodirne sekvence signalno sekvenco, ki usmerja sintetizirani polipeptid v sekretorne poti ciljne celice. Čeprav je signalna sekvenca lahko signalna sekvenca naravnega GAX-a, pa je prav tako lahko katerakoli druga funkcionalna signalna sekvenca (npr. tista od gena za timidin kinazo) ali umetna signalna sekvenca.
Virusi v smislu predloženega izuma so nepopolni, tj. niso sposobni, da se avtonomno replicirajo v ciljni celici. Na splošno genomom nepopolnih virusov, ki se uporabljajo v obsegu predloženega izuma, tako manjkajo vsaj sekvence, ki so potrebne za replikacijo navedenega virusa v inficirani celici. Te regije so lahko bodisi eliminirane (v celoti ali del), narejene nefunkcionalne ali so substituirane z drugimi sekvencami, zlasti z inseriranim genom. Prednostno nepopolni virus ohrani sekvence svojega genoma, ki so potrebne za enkapsidacijo virusnih delcev.
Virus v smislu izuma lahko izvedemo iz adenovirusa, adeno-povezanega! virusa (AAV) ali retrovirusa. V skladu s prednostno izvedbo je virus adenovirus.
Obstajajo različni sero tipi adenovirusa, katerih struktura in lastnosti se nekako razlikujejo. Od teh sero tipov je v obsegu predloženega izuma prednostno, da uporabimo tip 2 ali tip 5 humanega adenovirusa (Ad 2 ali Ad 5) ali adenoviruse živalskega izvora (prijava WO94/26914). Adenovirusi živalskega izvora, ki jih lahko uporabimo v obsegu predloženega izuma in ki jih lahko navedemo, so adenovirusi pasjega, govejega, murinega (primer: Mavi, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovčjega, prašičjega, ptičjega ali opičjega (primer : SAV) izvora. Prednostno je adenovirus živalskega izvora pasji, bolj prednostno CAV2 (Manhattan ali A26/61 sev (ATCC VR-800)). Prednostno uporabimo v obsegu predloženega izuma adenoviruse humanega ali pasjega izvora ali mešane.
Prednostno nepopolni adenovirusi v smislu izuma obsegajo ITR, enkapsidacijsko sekvenco in ustrezno nukleinsko kislino. Še bolj prednostno je v genomu adenovirusov v smislu izuma vsaj regija El nefunkcionalna. Virusni gen, ki ga preučujemo, lahko naredimo nefunkcionalen s katerokoli znano tehniko, posebno s popolno odstranitvijo, substitucijo, delno delecijo ali adicijo ene ali več baz na gen(e), ki ga (jih) preučujemo. Take modifikacije lahko dosežemo in vitro (na izolirani DNA) ali in situ, npr. z uporabo tehnik genetske manipulacije ali z obdelovanjem z mutagenimi sredstvi. Tudi druge regije lahko modificiramo s posebno regijo E3 (WO95/02697), regijo E2 (WO94/28938), regijo E4 (WO94/28152, WO94/12649 in WO95/02697) in regijo E5 (WO95/02697). V skladu s prednostno izvedbo vsebuje adenovirus v smislu izuma delecijo v regijah El in E4. V skladu z drugo prednostno izvedbo vsebuje delecijo v regiji El, v katero sta inserirani regija E4 in sekvenca, ki kodira gax (prim. FR94 13355). V virusih v smislu izuma se delecija v regiji El prednostno razširja od nukleotidov 455 do 3329 v sekvenci adenovirusa Ad5.
Nepopolne rekombinantne adenoviruse v smislu izuma lahko pripravimo s katerokoli znano tehniko (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). Posebno jih lahko pripravimo s homologno rekombinacijo med adenovirusom in plazmidom, ki nosi med drugim ustrezno sekvenco DNA. Homologno rekombinacijo povzročimo po kotransfekciji navedenega adenovirusa in plazmida v ustrezno celično linijo. Celična linija, ki jo uporabimo, naj bi bila prednostno (i) transformabilna z navedenimi elementi in (ii) naj bi vsebovala sekvence, ki so sposobne, da komplementirajo del genoma nepopolnega adenovirusa, prednostno v integrirani obliki, zato da se izognemo tveganju rekombinacije. Primeri celičnih linij, ki jih lahko omenimo, so humana embrionalna ledvična celična linija 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59), ki vsebuje zlasti, integriran v svoj genom, levji del genoma adenovirusa Ad5 (12%), ali celične linije, ki so sposobne komplementiranja funkcij El in E4, kot je opisano zlasti v prijavah št. WO 94/26914 in WO 95/02697.
Nato adenoviruse, ki so se pomnožili, rekuperiramo in očistimo s standardnimi tehnikami molekularne biologije, kot je ponazorjeno v primerih.
Adeno-povezani virusi (AAV) so DNA-virusi z relativno zmanjšano velikostjo, ki se integrirajo na stabilen in položajno specifičen način v genom celic, ki jih inficirajo.
Sposobni so, da inficirajo širok spekter celic, ne da bi inducirali druge učinke na celično rast, morfologijo ali diferenciacijo. Poleg tega ne kažejo, da bi bili vključeni v humane patologije. Genom AAV je bil kloniran, sekvenciran in označen. Obsega približno 4700 baz in vsebuje invertirano terminalno ponovljivo (ITR) regijo približno 145 baz na vsakem koncu, kije namenjena kot izvor replikacije za virus. Ostanek genoma je razdeljen v dve bistveni regiji, ki nosita enkapsidacijske funkcije: levi del genoma, ki vsebuje gen rep, vključen v virusno replikacijo in ekspresijo virusnih genov, in desni del genoma, ki vsebuje gen cap, ki kodira kapsidne proteine virusa.
Uporaba vektorjev, izvedenih iz AAV, za transferiranje genov in vitro ter in vivo je opisana v literaturi (posebno v: WO 91/18088, WO 93/09239; US 4,797,368, US 5,139,941, EP 488 528). Te prijave opisujejo različne konstrukte, izvedene iz AAV, v katerih so deletirani geni rep in/ali cap in so nadomeščeni z ustreznimi geni, in uporabo teh konstruktov za transferiranje navedenega ustreznega gena in vitro (v kultivirane celice) ali in vivo (direktno v organizem). Nepopolne rekombinantne AAV v smislu izuma lahko pripravimo s kotransfekcijo plazmida, ki vsebuje ustrezno sekvenco nukleinske kisline, ki ima bočno dve AAV-invertirani terminalni ponovljivi (ITR) regiji in plazmid, ki nosi enkapsidacijske gene AAV (geni rep in cap), v celično linijo, ki je inficirana s humanim pomočniškim virusom (npr. adenovirus). Rekombinante AAV, ki jih proizvedemo, nato očistimo s standardnimi tehnikami. Predloženi izum se nanaša tudi na rekombinantni virus, izveden iz AAV, katerega genom obsega sekvenco, ki kodira GAX, ki ima bočno AAV ITR. Izum se prav tako nanaša na plazmid, ki obsega sekvenco, ki kodira GAX, ki ima bočno dva ITR iz AAV. Tak plazmid lahko uporabimo, kot je, za transferiranje sekvence GAX s plazmidom, kjer je primerno, kije vgrajen v liposomski vektor (pseudovirus).
Konstrukcija rekombinantnih retrovirusnih vektorjev je na široko opisana v literaturi: posebno v EP 453242, EP178220, Bernstein et al. Genet. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689, itd. Posebno so retrovirusi integrirni virusi, ki inficirajo deljive celice. Retrovirusni genom večinoma obsega dva LTR, enkapsidacijsko sekvenco in tri kodirne regije (gag, pol in env). V rekombinantnih vektorjih, izvedenih iz retrovirusa, so na splošno geni gag, pol in env deletirani v celoti ali delno in nadomeščeni s sekvencami ustreznih heterolognih nukleinskih kislin. Te vektorje lahko konstruiramo iz različnih tipov retrovirusa, kot zlasti MoMuLV (virus murine Moloney levkemije, tudi označen MoMLV), MSV (virus murinega Moloney sarkoma), HaSV (virus Harvey sarkoma), SNV (virus vranične nekroze), RSV (virus Rous sarkoma) ali drugačen Friendov virus.
Na splošno, zato da konstruiramo rekombinantne retroviruse, ki vsebujejo sekvenco, ki kodira GAX v skladu s predloženim izumom, konstruiramo plazmid, ki vsebuje zlasti LTR, enkapsidacijsko sekvenco in navedeno kodirno sekvenco, in ga nato uporabimo za transfekcijo tako imenovane enkapsidacijske celične linije, pri čemer je celična linija sposobna, da dovede v trans retrovirusne funkcije, ki manjkajo v plazmidu. Na splošno so enkapsidacijske celične linije tiste, ki so sposobne, da eksprimirajo gene gag, pol in env. Take enkapsidacijske celične linije so opisane v stanju tehnike, zlasti celična linija PA317 (US 4, 861,719), celična linija PsiCRIP W090/02806) in celična linija GP+envAm-12 (W089/07150). Poleg tega rekombinantni retrovirusi lahko vsebujejo modifikacije znotraj LTR za supresijo transkripcijske aktivnosti kot tudi ekstenzivne enkapsidacijske sekvence, ki vključujejo del gena gag (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639). Rekombinantne retroviruse, kijih proizvedemo, nato očistimo s standardnimi tehnikami.
Posebno prednostno je, da uporabimo nepopolni rekombinantni adenovirus za zdravljenje restenoze.
Na ta način imajo adenovirusi veliko zmogljivost za inficiranje proliferacijskih vaskularnih gladkih mišic. To dopušča, da je potrebno uporabiti relativno majhne količine aktivne sestavine (rekombinantni adenovirus), poleg tega pa je posledica tudi učinkovito in zelo hitro delovanje na mestih, ki jih je potrebno obdelati. Adenovirusi v smislu izuma so tudi sposobni ekspresije uvedenega gena gax na visokih nivojih, pri čemer jim dajo zelo učinkovito terapevtsko delovanje. Nadalje adenovirusi v smislu izuma zaradi svoje episomalne narave delujejo le omejen čas v proliferativnih celicah in imajo zato prehodni učinek, ki je odlično usklajen z želenim terapevtskim učinkom.
Predloženi izum se tudi nanaša na farmacevtski sestavek, ki obsega enega ali več nepopolnih rekombinantnih virusov, kot so prej opisani. Take sestavke lahko formuliramo glede na način dajanja, ki je lahko: lokalno, oralno, parenteralno, intranazalno, intravensko, intramuskularno, subkutano, intraokularno itd.
Prednostno sestavek v smislu izuma obsega polnila, ki so farmacevtsko sprejemljiva za injekcijsko formulacijo, posebno za injekcijo v vaskularno steno. Ta polnila so lahko zlasti sterilne izotonične fiziološke raztopine soli (mononatrijev ali dinatrijev fosfat, natrijev, kalijev, kalcijev ali magnezijev klorid itd., ali zmesi takih soli), ali suhi, zlasti liofilizirani sestavki, kijih lahko z dodatkom sterilizirane vode ali fiziološke raztopine soli konstituiramo v injekcijske raztopine. Polnilo je prav tako lahko hidrogel, ki ga pripravimo iz kakega biokompatibilnega ali necitotoksičnega (homo ali hetero) polimera. Taki polimeri so opisani npr. v prijavi WO 93/08845. Nekateri od njih, kot zlasti tisti, kijih dobimo iz etilenskih in/ali propilenskih oksidov, so tržno dosegljivi.
Nepopolne rekombinantne adenoviruse v smislu izuma lahko damo pri njihovi uporabi za zdravljenje bolezni, ki so povezane s hiperproliferativnimi motnjami, na različne načine, posebno z injekcijo. Prednostno damo adenoviruse v smislu izuma za zdravljenje restenoze direktno v steno krvne žile z angioplastičnim balonom, ki je prevlečen s hidrofilnim filmom (npr. hidrogel), ki je nasičen z adenovirusi, ali z nekim drugim katetrom, ki vsebuje infuzijsko komoro za adenovirusno raztopino, ki jo lahko nato apliciramo natančno na mesto, ki ga je potrebno obdelati, in pustimo, da se adenovirusi sprostijo lokalno in učinkovito na nivoju celic, ki jih je potrebno obdelati. Tak postopek dajanja prednostno omogoči, da inficiramo visok odstotek (nad 9,6%) celic tunike medie, ki sestavlja prednosten cilj za zdravljenje restenoze, medtem ko standardni postopki za dajanje (intravenozna injekcija) ne omogočajo, da bi se te celice inficirale do neke zelo značilne stopnje.
Postopek obdelave v smislu izuma je prednostno sestavljen iz vnašanja sestavka, ki obsega hidrogel, nasičen z rekombinantnimi adenovirusi na mesto, ki gaje potrebno obdelati. Hidrogel lahko nanesemo direktno na površino tkiva, ki ga je potrebno obdelati, npr. med kirurško intervencijo. Prednostno hidrogel vnesemo na mesto, ki ga je potrebno obdelati, s katetrom, npr. z balonskim katetrom, posebno v času angioplastije. Na posebno prednosten način vnesemo nasičen hidrogel na mesto, ki ga je potrebno obdelati, z balonskim katetrom.
Doze virusa, ki jih uporabimo za injekcijo, lahko prilagodimo glede na različne parametre, zlasti v skladu z načinom dajanja, ki ga uporabimo, in želenim trajanjem obdelovanja. Na splošno rekombinantne viruse v smislu izuma formuliramo in damo v obliki doz med 104 in 1014 pfu/ml. V primeru AAV in adenovirusov lahko uporabimo tudi doze od 106 do IO10 pfu/ml. Izraz pfu (enota, ki tvori plak) ustreza infektivni moči suspenzije virionov in je določen z inficiranjem ustrezne celične kulture in merjenjem števila plakov inficiranih celic, navadno po 48 urah. Tehnike za ugotavljanje titra pfu virusne raztopine so dobro dokumentirane v literaturi.
Predloženi izum daje na razpolago nov in zelo učinkovit način za zdravljenje ali preprečevanje bolezni, povezanih s hiperproliferativnimi motnjami, kot je npr. restenoza.
Nadalje lahko to zdravljenje uporabimo enako dobro pri ljudeh kot tudi pri živalih, kot so ovce, govedo, domače živali (psi, mačke, itd.), konji, ribe itd.
Predloženi izum je bolj popolno opisan z naslednjimi primeri, ki so namenjeni za njegovo ponazoritev, ne pa omejevanje.
Legenda slik:
Slika 1: Prikaz plazmida pCOl
Slika 2: Prikaz plazmida pXL-CMV-GaxHA
Slika 3: Nuklearna lokacija proteina GAX-HA v VSMC, transfektiranih s pXLCMV-GaxHA
Slika 3A: VSMC, transfektirane z vektorjem pCGN (v odsotnosti inserta GAX)
Slika 3B: VSMC, transfektirane z vektorjem pXL-CMV-GaxHA
Slika 4: Nuklearna lokacija proteina GAX-HA v VSMC, obdelanih z Ad-CMV-Gax
Slika 5: Učinek Ad-CMV-GAX na proliferacijo VSMC (t=24 ur)
VSMC preštejemo 24 ur po tem, ko jih obdelamo z Ad-CMV-Gax (1000 pfu/celico) ali s kontrolnim adenovirusom (Ad-RSV-jSGal, 1000 pfu/celico). Rast celic je blokirana (0,5% FCS) ali stimulirana (FCS 20%).
Slika 6: Učinek Ad-CMV-GAX na proliferacijo VSMC (t=48 ur)
VSMC preštejemo 48 ur po tem, ko jih obdelamo z Ad-CMV-Gax (1000 pfu/celico) ali s kontrolnim adenovirusom (Ad-RSV-jSGal, 1000 pfu/celico). Rast celic je blokirana (0,5% FCS) ali stimulirana (FCS 20%).
Slika 7: Učinek Ad-CMV-Gax na viabilnosti VSMC, ki so inkubirane v prisotnosti fetalnega telečjega seruma (FCS 20%)
- eksperimentalni pogoji, prim. slika 6
Slika 7A: Celice, ki niso obdelane z adenovirusom
Slika 7B: Celice, ki so obdelane z Ad-RSV-/3Gal
Slika 7C: Celice, ki so obdelane z Ad-CMV-Gax
Slika 8: Učinki Ad-CMV-Gax in Ad-RSV-jSGal na podganje karotidne arterije po poškodbi z balonskim katetrom
Slika 8A: Meritev intimalne specifične površine
Slika 8B: Meritev razmerja intima proti media
Slika 8C: Meritev luminalne zožitve
Slika 9: Prečni prerez arterijskih kontrolnih in obdelanih žil
Slika 9A: Kontrolne žile, obdelane z Ad-RSV-jSGal
Slika 9B: Žile, obdelane z Ad-CMV-Gax
Splošne tehnike molekularne biologije
Standardni postopki, ki se uporabljajo v molekularni biologiji, kot so preparativne ekstrakcije plazmidne DNA, centrifugiranje plazmidne DNA v gradientu cezijevega klorida, elektroforeza na agaroznih ali akrilamidnih gelih, čiščenje fragmentov DNA z elektroeluiranejm, ekstrakcijo proteinov s fenolom ali s fenolom/kloroformom, obarjanje DNA v mediju fiziološke raztopine z uporabo etanola ali izopropanola, transformacija v Eschericia coli itd., so dobro znani strokovnjakom in obsežno opisani v literaturi [Maniatis T. et al., Molecular Cloning, A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Ν.Υ., 1982; Ausubel F.M. et al. (izd.), Current protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1987].
Plazmide tipov pBR322 in pUC in fage vrste M13 dobimo na tržišču (Bethesda Research Laboratories).
Za ligacije lahko fragmente DNA ločimo v skladu z njihovo velikostjo z elektroforezo na agaroznih ali akrilamidnih gelih, ekstrahiramo s fenolom ali z zmesjo fenola/kloroforma, oborimo z etanolom in nato inkubiramo v prisotnosti T4 DNAligaze (Biolabs) v skladu s predpisi dobavitelja.
5’ štrleče konce lahko zapolnimo z uporabo Klenovvega fragmenta E. Coli DNApolimeraze I (Biolabs) v skladu s predpisi dobavitelja. 3’ štrleče konce uničimo v prisotnosti T4 DNA-polimeraze (Biolabs), ki jo uporabimo v skladu s predpisi izdelovalca. 5’ štrleče konce uničimo s previdno obdelavo z nukleazo Sl.
Položajno usmerjeno mutagenezo in vitro z uporabo sintetičnih oligodeoksinukπ leotidov lahko izvedemo v skladu s postopkom, ki so ga razvili Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764] z uporabo kompleta, ki ga prodaja Amersham.
Encimsko pomnoževanje fragmentov DNA s tehniko, imenovano PCR [verižna reakcija, katalizirana s polimerazo, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1350-1354; Mullis K.B. in Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350], lahko povzročimo z uporabo toplotnega ciklizatorja DNA (Perkin Elmer Cetus) v skladu s predpisi izdelovalca.
Nukleotidne sekvence lahko določimo s postopkom, ki so ga razvili Sanger et al. [proč. Natl. Acad. Sci. USA, 74, (1977) 5463-5467] z uporabo kompleta, ki ga prodaja Amersham.
Primer 1: Konstrukcija vektorja pXL-CMV-GaxHA, ki nosi gen, ki kodira podganji protein gax ob kontroli promotorja CMV
Ta primer opisuje konstrukcijo vektorja, ki vsebuje cDNA, ki kodira protein gax (vrsta : podgana) in adenovirusne sekvence, ki omogočajo rekombinacijo. Epitop hemaglutinina virusa influence (epitop HA1), ki obsega 18 amino kislin dodamo N-terminalnemu koncu proteina gax (Field et al., Mol.Cell.Biol. 8 : 2159-2165,1988). Dodajanje epitopa na ta način omogoča ekspresijo gax, ki jo nadzorujemo zlasti z imunofluorescenčnimi tehnikami z uporabo protiteles, ki so usmerjena proti epitopu HA1. Poleg svoje občutljivosti ta postopek istočasno omogoča tudi eliminacijo tako in vitro kot tudi in vivo šumov ozadja, ki ustrezajo ekspresiji endogenih proteinov gax.
1.1. Konstrukcija plazmida pCOl
A - Konstrukcija plazmida pCE
Fragment EcoRl/XbaI, ki ustreza levemu koncu genoma adenovirusa Ad5, najprej kloniramo med položaja EcoR in Xba vektorja pIC19H. Tako proizvedemo plazmid pCA. Plazmid pCA nato prerežemo s HinfI in njegove 5’ štrleče konce zapolnimo s Klenowim fragmentom E.coli DNA-polimeraze I; to nato prerežemo z EcoRI. Fragment plazmida pCA, ki ga tako proizvedemo in ki vsebuje levi konec genoma adenovirusa Ad5, nato kloniramo med položaja EcoRI in Smal vektorja pIC20H (Marsh et al., Gene 32 (1984) 481). Tako proizvedemo plazmid pCB. Plazmid pCB nato prerežemo z EcoRI in njegove 5’ štrleče konce zapolnimo s Klenovvim fragmen12 tom E.coli DNA-polimeraze I; to nato prerežemo z BamHI. Fragment plazmida pCB, ki ga tako proizvedemo in ki vsebuje levi konec genoma adenovirusa Ad5, nato kloniramo med položaja Nrul in Bglll vektorja pIC20H. Tako proizvedemo plazmid pCE, katerega prednostna lastnost je, da ima prvih 382 baznih parov adenovirusa Ad5, temu pa sledi mnogoterno klonimo mesto.
B - Konstrukcija plazmida pCD’
Fragmenta Sau3A (3346)/SstI (3645) in Sstl (3645)/NarI (5519) iz genoma adenovirusa Ad5 najprej ligiramo skupaj in kloniramo med položaja Clal in BamHI vektoija pIC20H, pri čemer proizvedemo plazmid pPY53. Fragment Sall/Taql plazmida pPy53 (pripravljen iz dam-ozadja), ki vsebuje del genoma adenovirusa Ad5 med položajema Sau3A (3346) in Taql (5207), nato kloniramo med položaja Šali in Clal vektorja pIC20H, pri čemer proizvedemo plazmid pCA. Fragment Taql (5207)/NarI (5519) genoma adenovirusa Ad5, pripravljen iz dam-ozadja in fragment Sall-Taql iz plazmida pCA’ nato ligiramo skupaj in kloniramo med položaja Šali in Narl vektorja pIC20H. Tako proizvedemo plazmid pCC’. Fragment Narl (5519)/NruI (6316) genoma adenovirusa Ad5, pripravljen iz dam-ozadja, in fragment Sall/Narl plazmida pCC’ nato ligiramo skupaj in kloniramo med položaja Šali in Nrul vektorja pIC20R. Tako proizvedemo plazmid pCD’.
C - Konstrukcija plazmida pCOl
Z delno digestijo plazmida pCD’ s Hhol in nato popolno digestijo le-tega z Šali proizvedemo restrikcijski fragment, ki vsebuje sekvenco adenovirusa Ad5 od položaja Sau3A (3446) do Nrul (6316). Ta fragment kloniramo v položaj Šali plazmida pCE. Tako proizvedemo plazmid pCOl (sl. 1), ki vsebuje levi del adenovirusa Ad5 do položaja HinfI (382), mnogoterni klonirni položaj in fragment Sau3A (3446)/NruI (6316) adenovirusa Ad5.
1.2. Konstrukcija vektorja pXL-CMV-GaxHA (prim. sl. 2)
Gax cDNA kloniramo med položaja Xbal in BamHI vektorja pCGN (Tanaka in Herr, Celi 60 : 375-386, 1990). Nastali vektor pGCN-Gax vsebuje zgodnjo promotorsko in spodbujevalno sekvenco citomegalo virusa (CMV) (-522, +72; Boshart et al, Celi, 41: 521-530,1985), vodilno sekvenco timidin kinaze virusa herpes simpleks, ki vključuje iniciacijski kodon AUG kot tudi prve tri amino kisline (+55, +104; Rusconi in Yamamoto, EMBO J., 6 : 1309-1315, 1987), sekvenco, ki kodira epitop HA1 [YPYDVPDYASLGGP (SEQ ID št. 1)], podganjo gax cDNA in končno poliadenilacijsko sekvenco kunčjega gena β-globina (Pabo et al, Celi, 35 : 445-453,1983).
Vektor pCGN-Gax nato prerežemo z Xmnl in Sfil in vnesemo nastali fragment, ki vsebuje promotor, cDNA in poliadenilacijsko sekvenco, potem ko ga najprej obdelamo s Klenowim fragmentom, v položaj EcoRV dvojnega (shuttle) vektorja pCOl, ki vsebuje adenovirusne sekvence, potrebne za rekombinacijo. Plazmid, ki ga dobimo, označimo pXL-CMV-GaxHA (prim. sl. 2).
Primer 2: Prikaz proliferacijsko inhibirnih lastnosti plazmida pXL-CMV-gax-HA
Ta primer opisuje operativne postopke, ki jih lahko uporabimo, da istočasno prikažemo in vitro kvaliteto homologne rekombinacije vektorjev (prim. Primer 1) tako glede ekspresije (detekcija proteina gax in epitopa HA) kot tudi glede aktivnosti (učinek na celično proliferacijo).
Celice vaskularnih gladkih mišic (VSMC) kultiviramo z encimsko digestijo kunčje aorte NZW, pri čemer uporabimo prilagojen postopek od Chamley et al. (Celi Tissue Res. 177 : 503-522, 1977). Na kratko, potem ko kunčjo aorto odstranimo, jo inkubiramo pri 37°C 45 minut v prisotnosti kolagenaze (kolagenaza II, Cooper Biomedical). Drugo digestijo izvedemo v približno 2 urah v prisotnosti kolagenaze in elastaze (Biosys), pri čemer nastane celična suspenzija. Celice vzdržujemo v prisotnosti 20% fetalnega telečjega seruma in jih uporabimo za vse preskuse (prim. spodaj) pred desetim prehodom. V vseh teh poskusih celice gladkih mišic označimo z imunooznačevanjem s protitelesi aktina anti-aSM (F-3777, sigma).
Zato da potrdimo kvaliteto ekspresijskih vektorjev (prim. Primer 1), nadzorujemo prisotnost in lokacijo proteina gax z imunofluorescenco za vsak konstrukt. Da to naredimo, transfektiramo celice gladkih mišic ali celice 3T3 s plazmidi pXL-CMVGaxHA in pCGNgax v prisotnosti zmesi DOSPA/DOPE (Lipofectamine, Gibco BRL). Celice inkubiramo v prisotnosti kompleksa DNA/liposom v mediju kulture, ki ne vsebuje fetalnega telečjega seruma, 4 do 8 ur (optimalno trajanje : 8 ur za SMC). Po 24 urnem inkubiranju v prisotnosti fetalnega telečjega seruma celice kultiviramo na mikroskopski plošči (Titertek) glede na imunofluorescenco nadaljnjih 24 ur. Celice nato fiksiramo v prisotnosti 4% paraformaldehida in nato permeabiliziramo z dodajanjem 0,1% tritona. Po nasičenju celic v prisotnosti albumina govejega seruma (BSA, Sigma) zaporedoma dodamo protitelo anti-HA (12CA5, Boehringer Mannheim) in nato protitelo konjugiramo s fluoresceinom.
Iz imunofluorescenčnih poskusov, izvedenih simultano na celicah NIH3T3 in primarni kulturi kunčjih VSMC, je razvidno, da tako plazmid pCGNgax in dvojni plazmid pXL-CMV-GaxHA resnično kodirata protein, ki je lociran v nukleusu (prim. sl. 3A : kontrolni plazmid; 3B : plazmid pXL-CMV-GaxHA). Nadalje,lahko prikažemo po ekstrakciji nuklearnih proteinov iz celic, transfektiranih s pXL-CMVGaxHA z Western blotting-om, protein, ki ga detektiramo s protitelesi, usmerjenimi proti epitopu HA.
Nato ugotovimo učinek zgornjih vektorjev na celično proliferacijo. Da to lahko naredimo, uporabimo indirektni postopek, ki temelji na merjenju tvorbe kolonije. Na kratko, uporabimo mišje embrionalne celice NIH3T3, da izvedemo preskuse tvorbe kolonije z uporabo prilagojenega postopka od Schweighofferja et al. (Mol.Cell.Biol. 1993,13 : 39-43). Na kratko, celice kotransfektiramo s plazmidom, ki nosi gen za odpornost proti neomicinu in s prebitkom ustreznega vektorja (pCGNgax ali pXLCMV-GaxHA). Po obdobju selekcije v G418 kolonije obarvamo z raztopino karbol fuksina (Diagnostica, Merck) in preštejemo. Iz rezultatov reprezentativnega poskusa, ki so navedeni v tabeli 1, je razviden padec števila kolonij v primeru celic, transfektiranih s pCGNgax.
TABELA 1
Pogoji transfekcije celic 3T3
Število kolonij po selekciji v G 418 pCGN (5 jLtg) + pSV2neo 183 ±28 (’) (lMg)(§) pCGNgax (5 /ig) + pS V2neo 93 ± 11 (iMg) (§ kontrolni vektor pCGN: odsotnost inserta gax) Op<o,oi
Primer 3 : Konstrukcija rekombinantnega adenovirusa Ad-CMVgax
Vektor pXL-CMV-GaxHA, pripravljen v primeru 1, nato lineariziramo in kotransfektiramo za rekombinacijo z nepopolnim adenovirusnim vektorjem v pomočniške celice (celična linija 293), ki dovede v trans funkcije, kodirane z regijami adenovirusa El (ElAinElB).
Adenovirus Ad-CMVgax dobimo s homologno rekombinacijo in vivo med adenovirusom Ad.RSVjSgal (Stratford Perricaudet et al., J. Ciin. Invest 90 (1992) 626) in vektorjem pXL-CMV-GaxHA v skladu z naslednjim predpisom: vektor pXLCMV-GaxHA, lineariziran z encimom HmnI in adenovirus Ad.RSV/3gal, lineariziran s Clal, kotransfektiramo v celično linijo 293 v prisotnosti kalcijevega fosfata, zato da omogočimo homologno rekombinacijo. Rekombinantne adenoviruse, ki jih tako proizvedemo, selekcioniramo s čiščenjem plakov. Po izolaciji rekombinantni adenovirus pomnožimo v celični liniji 293, pri čemer dobimo supernatant kulture, ki vsebuje neočiščen rekombinantni nepopolni adenovirus s titrom približno IO10 pfu/ml.
Virusne delce očistimo s centrifugiranjem v gradientu cezijevega klorida v skladu z znanimi tehnikami, posebno od Grahama et al., Virology 52 (1973) 456). Adenovirus Ad-CMVgax shranimo pri -80°C v 20% glicerolu.
Primer 4: Prikaz proliferacijsko inhibirnih lastnosti adenovirusa Ad.CMVgax
Ta primer opisuje eksperimentalne postopke, ki jih lahko uporabimo, da istočasno prikažemo kvaliteto rekombinantnega adenovirusa tako kot produkcijo proteina gax in kot biološko aktivnost (učinek na celično proliferacijo).
VSMC kunčje aorte inkubiramo v prisotnosti adenovirusa Ad.CMVgaxHA in kontrolnega adenovirusa (Ad-RSVj8Gal : rekombinantni adenovirus, ki eksprimira β-galaktozidazo ob kontroli promotorja RSV), razredčenih v mediju kulture (DMEM, 0,5% FCS). Po približno 1 uri pri 37°C v vlažni atmosferi medij, ki vsebuje adenovirusno raztopino, odsesamo stran in nadomestimo z medijem kulture (DMEM, 0,5% FCS) za obdobje 18 do 24 ur. Nato dodamo medij, bogat s FCS (končna koncentracija FCS : 20%), zato da stimuliramo celično proliferacijo, in celice preštejemo 24 ur in 48 ur kasneje.
Poleg tega 24 ur po dodatku adenovirusne raztopine nadzorujemo ekspresijo proteina gax z VSMC s tehnikami, opisanimi v primeru 2, z nuklearnim označevanjem z imunofluorescenco (lokalizacija proteina) pa tudi z Western blotting-om. Protein, proizveden z rekombinantnim adenovirusom, učinkovito detektiramo s protitelesi, ki spoznajo epitop HA in imajo enako elektroforetsko mobilnost kot protein gax, ki ga detektiramo v nukleusih. VSMC, ki jih transfektiramo s pCGNgax ali pXL-CMV-GaxHA. Slika 4 ponazorjuje lokacijo proteina Gax v VSMC, inkubiranih v prisotnosti Ad-CMVgaxHa.
Iz rezultatov reprezentativnega eksperimenta, ki so prikazani na sl. 4, je razviden očiten padec števila celic po dodatku virusa Ad.CMVgaxHA. Po drugi strani pa tega zmanjšanja števila celic ne opazimo po obdelavi s kontrolnim adenovirusom, uporabljenim v enaki koncentraciji (M.O.L 1000). Paralelno smo potrdili z imunofluorescenco, da to visoko multipliciteto infekcije omogoča bodisi markerski gen /3-gal (uporaba protitelesa anti- E.Coli. /3-gal, Monosan) ali protein gax (uporaba protitelesa anti-HA, prim. Primer 2), ki mora biti eksprimiran v več od 90% populacije kunčjih VSMC.
Dodatek virusa Ad-RSV-/3gal je povezan s šibkim citostatičnim učinkom (-13%) po kultiviranju 24 ur v prisotnosti fetalnega telečjega seruma (20%). Pri enakih eksperimentalnih pogojih vodi obdelava z Ad-CMVgaxHA do 57% znižanja števila celic (prim. sl. 5). Biološka učinkovitost virusa Ad-CMVgaxHa je zelo očitno poudarjena po 48 urah kultiviranja in je lahko celo povezana s smrtjo celic (prim.: sl. 6 in 7).
Torej je blokiranje proliferacije, ki je povzročena z Ad-CMVgaxHA, povezano z izrazitim znižanjem števila celic, ki ga lahko detektiramo po kultiviranju 24 ur (prim sl. 5). Zanimivo je, da opazimo ta učinek Ad-CMVgaxHA v celicah, ki so stimulirane z visoko koncentracijo FCS (20%), ne pa v tistih, ki so osiromašene s FCS (0,5%) (prim. sl. 6). Ta primer tako prikazuje, da lahko rekombinantni adenovirus, ki kodira protein gax, učinkovito blokira celično delitev, ne da bi imel kakršenkoli znaten učinek na viabilnost celic, ki so blokirane v fazi GO svojega cikla.
Učinek adenovirusa Ad-CMVgaxHA na viabilnost VSMC v kulturi je prav tako prikazan na sl. 7.
Inhibitorne lastnosti Ad-CMVgaxHA na sintezo DNA potrdimo s poskusi vgradnje bromodeoksiuridina (BrdU). Na kratko, 24 ur po dodatku adenovirusa VSMC in17 kubiramo v prisotnosti FCS (10 do 20%) in BrdU (10 μΜ), ki ga vgradimo namesto timina v celice v fazi sinteze DNA in ga lahko detektiramo s specifičnimi protitelesi. Vgradnjo BrdU kvantitativno določimo s pretočno citometrijo.
Isto metodologijo za pretočno citometrijo lahko uporabimo za vizualiziranje napredka, povzročenega s kunčjimi VSMC, obdelanimi z Ad-CMVgaxHA v njihovem celičnem ciklusu. Obdelava z Ad-CMVgaxHA je združena z blokiranjem celičnega cikla v fazi G0/G1.
Primer 5 : Inhibicija intimalne hiperplazije z uporabo adenovirusa-gax in vivo
Ta primer prikazuje učinkovitost rekombinantnih adenovirusov v modelu vaskularne patologije.
V modelu arterijske lezije so uporabljeni ostanki po abraziji podganje karotide (Clows et al., Lab Inverst 49 (1983) 327-333). V tem modelu VSMC dediferencirajo, proliferirajo in migrirajo, da se tvori neointima, ki lahko delno zapre arterijo po dveh tednih po poškodbi.
Podgane Sprague-Dawley anesteziramo z intraperitonealno injekcijo pentobarbitala (45 mg/kg). Po eksterni karotidni arteriotomiji podganje karotidne arterije ogulimo z balonskim katetrom in izpostavimo lxl09 pfu Ad-CMVgaxHa ali Ad-RSV/3-Gal. Adenovirus uporabimo v raztopini, ki vsebuje 15% poloksamera 407, ki omogoča prenos gena adenovirusa. Po inkubaciji 20 minut raztopino virusa umaknemo in ligature odstranimo, da se obnovi cirkulacija. Podgane usmrtimo dva tedna kasneje in izvedemo kvantitativne morfometrične analize na prečnih prerezih obdelanih žil. Rezultati so prikazani na sl. 8 in 9.
Iz dobljenih rezultatov je razvidno, da ima vseh devet karotidnih arterij, transfektiranih z Ad-RSV/J-Gal, močno proliferacijo VSMC in razvito znatno neointimalno odebelitev. Površina neointime je 0,186 +/- 0,02 mm2 (SEM) s področjem 0,10 do 0,28. Luminalna razširitev je ustrezno zožena s 40 +/- 4% (območje 21 do 63), sl. 8C. Razmerje intima:media je 1,51 +/- 0,1 (območje 0,87 do 2,17). Ti rezultati so podobni tistim, ki smo jih dobili predhodno za kontrolne žile, obdelane s fiziološko raztopino soli. Nasprotno pa obdelava z Ad-CMVgaxHA izrazito zmanjša patološki odziv na poškodbo z balonom. Za žile, obdelane z Ad-CMVgaxHA, je povprečna površina neointimalnih lezij 0,076 +/- 0,02 mm2 (območje 0 do 0,19), luminalna zožitev pa je zmanjšana na 17,5 +/- 5%. Statistična analiza potrjuje, da obdelava z Ad-CMVgaxHA znatno inhibira razvoj intimalne odebelitve glede na Ad-RSVj3Gal-kontrole. Specifično, obdelava z Ad-CMVgaxHA zmanjša razmerje intimamedia za 69%, intimalno površino za 59% in luminalno zožitev za 56% (sl. 8A in 8B). Izreden učinek na intimalno hiperplazijo nadalje poudarjajo rezultati, ki jih dobimo s prečnimi preprezi kontrolnih (sl. 9A) ali obdelanih (sl. 9B) živali.
Ta primer prikazuje zelo učinkovito aktivnost zaustavitve rasti in vivo konstrukta Ad-CMVgaxHA. Ta aktivnost je zelo specifična in jo ne opazimo pri kontrolnih živalih. Predloženi rezultati jasno prikazujejo terapevtsko aktivnost Ad-CMVgaxHA na vaskularno morfologijo in posebno na hiperplazijo, ki je povezana s postangioplastično restenozo. Uporaba virusa, kot je adenovirus, za prenos gena gax in vivo je posebno učinkovita. Ta postopek je nadalje prednosten, ker temelji na načinu nadomestitve gena. Ta postopek je edinstven v tem, ker združuje tako učinkovitost dajanja in terapevtski gen, ki prikazuje dve terapevtski lastnosti: zaustavitev rasti in konstitutivno ekspresijo v vaskularnem sistemu. Prenos gena Gax v skladu s predloženim izumom inducira specifično regresijo hiperproliferativne motnje v žilah in tako normalizira arterijske funkcije. Lokalni prenos gena Gax v smislu izuma je prav tako posebno prednosten v tem, da ne interferira z reendotelizacijskim postopkom po leziji arterij. Nadalje pa poleg direktnega vpliva na celično proliferacijo in vaskularno morfologijo prenos gena gax v smislu predloženega izuma lahko izraža ugoden indirekten učinek na sintezo ekstracelične matrice in na remodeliranje. Iz teh rezultatov je jasno razvidno, da je prenos gena Gax v smislu izuma močan nov način za zdravljenje vaskularnih lezij po angioplastiji.
Za
ČASE WESTERN RESERVE UNIVERSITY:
PATENTNA PISARNA, d.o.o.
LJUBLJANA,
Lista sekvenc (1) Splošne informacije:
(i) Prijavitelj:
Ime: ČASE WESTERN RESERVE UNIVERSITY
Ulica:
Mesto: Cleveland, Ohio
Država: ZDA
Poštna št.: 44106 (i) Prijavitelj:
Ime: BRANELLEC, Didier
Ulica: 1, Rue Saint-Benoit
Mesto: 94210 La Varenne-Saint Hilaire
Država: Francija
Poštna št.:
(i) Prijavitelj:
Ime: WALSH, Kenneth
Ulica: 207 Judy Farm Road
Mesto: Carlisle, Massachusetts
Država: ZDA
Poštna št.: 01741 (i) Prijavitelj:
Ime: ISNER, Jeffr ey M.
Ulica: 34Brenton Road
Mesto: Weston, Massachusetts
Država: ZDA
Poštna št.: 02193 (ii) Naziv izuma: Virusni vektorji in njihova uporaba za zdravljenje hiperproliferativnih motenj, zlasti restenoze (iii) Število sekvenc: 1 (iv) Naslov za dopisovanje:
(A) Naslov: Rhone-Poulenc Rorer Inc.
(B) Ulica: 500 Arcola Rd. 3C43 (C) Mesto: Collegeville, PA (D) Država: ZDA (E) Poštna št.:19426 (v) Računalniško berljiva oblika:
(A) Tip medija: Gibki disk (B) Računalnik: IBM PC-kompatibilen (C) Operacijski sistem: PC-DOS/MS-DOS (D) Programska oprema: Patentln Release št. 1.0, verzija št. 1.30 (vi) Podatki za sedanjo prijavo:
(A) Številka prijave: PCT (B) Datum vložitve:
(C) Klasifikacija:
(vii) Podatki za prioritetno prijavo:
(A) Številka prijave: FR 95-04234 (B) Datum vložitve: 31-Mar-1995 (viii) Informacije o zastopniku/agentu:
(A) Ime: Savitzky, Martin F.
(B) Registracijska št.: 29,699 (C) Referenčna/seznamska št.: ST95022-US (ix) Telekomunikacijske informacije:
(A) Telefon: (610) 454-3816 (B) Telefaks: (610) 454-3808 (2) Informacije za sekvenco ident. št. 1:
(i) Značilnosti sekvence:
(A) Dolžina:
(B) Tip:
(C) Verižnost:
(D) Topologija:
(ii) Tip molekule:
(v) Tip fragmenta:
(xi) Opis sekvence: sekvenca ident. št. 1:
amino kislin amino kislina linearna peptid interni
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Gly Gly Pro
Cu:
d.o.o. >GVA 14
Za
ČASE WESTERN RESERVE UNIVERSITY:
; tv:
LJUB··
Claims (19)
- PATENTNI ZAHTEVKI1. Nepopolni rekombinantni virus, označen s tem, da vsebuje vsaj en inseriran gen, ki kodira celoten protein GAX ali del le-tega ali varianto tega proteina.
- 2. Virus po zahtevku 1, označen s tem, da nima regij svojega genoma, ki so potrebne za njegovo replikacijo v inficirani celici.
- 3. Virus po zahtevku 1 ali 2, označen s tem, da je adenovirus, prednostno tipa Ad 5 ali Ad 2.
- 4. Virus po zahtevku 1 ali 2, označen s tem, da je adenovirus živalskega, prednostno pasjega izvora.
- 5. Virus po enem od zahtevkov 1 ali 2, označen s tem, da inserirani gen kodira celoto ali del podganjega proteina GAX ali varianto tega proteina.
- 6. Virus po zahtevku 5, označen s tem, da inserirani gen kodira podganji protein GAX ali njegov humani homolog.
- 7. Virus po enem od zahtevkov 1 ali 2, označen s tem, daje inserirani gen cDNA.
- 8. Virus po enem od zahtevkov 1 ali 2, označen s tem, daje inserirani gen gDNA.
- 9. Virus po enem od zahtevkov 1 ali 2, označen s tem, da inserirani gen vključuje sekvence, ki omogočajo, da se eksprimira v inficirani celici.
- 10. Virus po enem od zahtevkov 1 ali 2, označen s tem, da inserirani gen vključuje signalno sekvenco, ki usmerja sintetizirani polipeptid v sekretorne poti ciljne celice.
- 11. Adenovirus po zahtevku 3, označen s tem, da vsebuje delecijo celotne ali dela regije El.
- 12. Adenovirus po zahtevku 11, označen s tem, da dodatno vsebuje delecijo celotne ali dela regije E4.
- 13. Virus po zahtevku 1 ali 2, označen s tem, daje adeno-povezan virus (AAV).
- 14. Virus po zahtevku 1 ali 2, označen s tem, da je retrovirus.
- 15. Uporaba virusa po zahtevkih 1 ali 2 za pripravo farmacevtskega sestavka, ki je namenjen za zdravljenje ali preprečevanje patologij, ki so povezane s hiperproliferativnimi motnjami.
- 16. Uporaba po zahtevku 15 za pripravo farmacevtskega sestavka, ki je namenjen za zdravljenje restenoze.
- 17. Farmacevtski sestavek, ki obsega enega ali več nepopolnih virusov po enem od zahtevkov 1 ali 2.
- 18. Farmacevtski sestavek po zahtevku 17, označen s tem, da je v injekcijski obliki in obsega od 104 do 1014 pfu adenovirusa/ml.
- 19. Farmacevtski sestavek po zahtevku 18, označen s tem, da obsega rekombinantni adenovirus, ki je nasičen v hidrogelu.26089-x-97-mn Za
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9504234A FR2732357B1 (fr) | 1995-03-31 | 1995-03-31 | Vecteurs viraux et utilisation pour le traitement des desordres hyperproliferatifs, notamment de la restenose |
| PCT/US1996/004493 WO1996030385A1 (en) | 1995-03-31 | 1996-03-28 | Viral vectors and their use for treating hyperproliferative disorders, in particular restenosis |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SI9620059A true SI9620059A (sl) | 1998-06-30 |
Family
ID=9477928
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SI9620059A SI9620059A (sl) | 1995-03-31 | 1996-03-28 | Virusni vektorji in njihova uporaba za zdravljenje hiperproliferativnih motenj, zlasti restenoze |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5851521A (sl) |
| EP (1) | EP0817791A4 (sl) |
| JP (1) | JPH11503314A (sl) |
| KR (1) | KR19980703454A (sl) |
| CN (1) | CN1190402A (sl) |
| AP (1) | AP1011A (sl) |
| AU (1) | AU701345B2 (sl) |
| BR (1) | BR9608449A (sl) |
| CA (1) | CA2216878A1 (sl) |
| CZ (1) | CZ308897A3 (sl) |
| FR (1) | FR2732357B1 (sl) |
| HU (1) | HUP9801767A3 (sl) |
| OA (1) | OA10516A (sl) |
| SI (1) | SI9620059A (sl) |
| SK (1) | SK132797A3 (sl) |
| WO (1) | WO1996030385A1 (sl) |
Families Citing this family (54)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5856121A (en) * | 1994-02-24 | 1999-01-05 | Case Western Reserve University | Growth arrest homebox gene |
| US7727761B2 (en) | 1995-08-01 | 2010-06-01 | Vegenics Limited | Vascular endothelial growth factor C (VEGF-C) protein and gene, mutants thereof, and uses thereof |
| FR2740344B1 (fr) * | 1995-10-31 | 1997-11-21 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Application de la proteine gax au traitement de cancers |
| FR2754822B1 (fr) * | 1996-10-18 | 1998-11-27 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Polypeptides comprenant des domaines de la proteine gax, impliques dans la repression de transcription et/ou interagissant avec d'autres proteines, acides nucleiques correspondants et leurs utilisations |
| US6335010B1 (en) * | 1996-11-08 | 2002-01-01 | University Of California At San Diego | Gene therapy in coronary angioplasty and bypass |
| WO2000041732A1 (en) | 1999-01-19 | 2000-07-20 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Hydrogel compositions for controlled delivery of virus vectors and methods of use thereof |
| CA2396628A1 (en) * | 2000-01-25 | 2001-08-02 | Edwards Lifesciences Corporation | Delivery systems for treatment of restenosis and anastomotic intimal hyperplasia |
| US6965010B2 (en) * | 2000-02-25 | 2005-11-15 | Licentia, Ltd. | Materials and methods involving hybrid vascular endothelial growth factor DNAs and proteins |
| US20030100889A1 (en) * | 2001-07-05 | 2003-05-29 | Nicolas Duverger | Method of administration of a gene of interest to a vascular tissue |
| US20030180936A1 (en) * | 2002-03-15 | 2003-09-25 | Memarzadeh Bahram Eric | Method for the purification, production and formulation of oncolytic adenoviruses |
| US20080215137A1 (en) * | 2003-04-30 | 2008-09-04 | Boston Scientific Scimed, Inc. | Therapeutic driving layer for a medical device |
| US20040220656A1 (en) * | 2003-04-30 | 2004-11-04 | Epstein Samuel J. | Coated medical devices and methods of making the same |
| JP2007505603A (ja) * | 2003-09-12 | 2007-03-15 | ヴァーテックス ファーマシューティカルズ、 インコーポレイテッド | プロテアーゼ活性および肝障害のための動物モデル |
| ATE507240T1 (de) | 2004-03-05 | 2011-05-15 | Vegenics Pty Ltd | Materialien und verfahren für wachstumsfaktorbindende konstrukte |
| US7319015B2 (en) * | 2004-03-16 | 2008-01-15 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods and compositions for using alveolar macrophage phospholipase A2 |
| US7582442B2 (en) * | 2004-03-16 | 2009-09-01 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods and compositions for using aleveolar macrophage phospholipase A2 |
| GB0416487D0 (en) | 2004-07-23 | 2004-08-25 | Isis Innovation | Modified virus |
| US20090233986A1 (en) * | 2004-07-27 | 2009-09-17 | Mount Sinai School Of Medicine | Methods and compositions for using sax2 |
| FI20050753L (fi) | 2004-09-03 | 2006-03-04 | Licentia Oy | Uudet peptidit |
| US7531523B2 (en) * | 2005-02-17 | 2009-05-12 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Sodium channel protein type III alpha-subunit splice variant |
| KR100747646B1 (ko) | 2005-02-25 | 2007-08-08 | 연세대학교 산학협력단 | 데코린 유전자를 포함하는 유전자 전달 시스템 및 이를 포함하는 약제학적 항종양 조성물 |
| ATE502956T1 (de) | 2005-08-15 | 2011-04-15 | Vegenics Pty Ltd | Modifizierte vegf und pdgf mit verbesserten angiogenen eigenschaften |
| US20080200408A1 (en) * | 2005-09-30 | 2008-08-21 | Mccormack Kenneth | Deletion mutants of tetrodotoxin-resistant sodium channel alpha subunit |
| US7972813B2 (en) * | 2005-09-30 | 2011-07-05 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Tetrodotoxin-resistant sodium channel alpha subunit |
| DK1969003T3 (da) | 2005-12-14 | 2010-12-13 | Hermo Pharma Ltd | Anvendelser af et neurotrofisk faktor-protein |
| US20090214496A1 (en) * | 2006-01-30 | 2009-08-27 | Licentia Ltd. | Bmx/etk tyrosine kinase gene therapy materials and methods |
| EP2548578B1 (en) | 2006-05-17 | 2014-08-20 | The Ludwig Institute for Cancer Research | Targeting VEGF-B regulation of fatty acid transporters to modulate human diseases |
| FI20070808A0 (fi) | 2007-10-25 | 2007-10-25 | Mart Saarma | GDNF:n silmukointivariantit ja niiden käytöt |
| WO2009088256A2 (ko) | 2008-01-09 | 2009-07-16 | Konkuk University Industrial Cooperation Corp | 배큘로바이러스-기반 백신 |
| US20090196854A1 (en) * | 2008-02-04 | 2009-08-06 | Kytos Biosystems S.A. | Methods and compositions for use of crl 5803 cells for expression of biotherapeutics and encapsulated cell-based delivery |
| FI20080326A0 (fi) | 2008-04-30 | 2008-04-30 | Licentia Oy | Neurotroofinen tekijä MANF ja sen käytöt |
| JP2011526916A (ja) | 2008-06-30 | 2011-10-20 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン | 全身性紅斑性狼瘡を同定および処置するための診断標的および治療標的としてのリソソームホスホリパーゼａ２（ｌｐｌａ２）活性 |
| KR101230913B1 (ko) | 2009-11-06 | 2013-02-07 | 중앙대학교 산학협력단 | 나노입자-기반된 유전자 운반체 |
| KR101232123B1 (ko) | 2010-10-08 | 2013-02-12 | 연세대학교 산학협력단 | 재조합된 유전자발현 조절서열을 가지는 종양 특이적 발현이 개선된 유전자 전달체 |
| AU2012255143A1 (en) | 2011-05-19 | 2014-02-20 | The Regents Of The University Of Michigan | Integrin alpha-2 binding agents and use thereof to inhibit cancer cell proliferation |
| US9404090B2 (en) | 2011-11-24 | 2016-08-02 | Viromed Co., Ltd. | Adenovirus producing novel cell line and the use thereof |
| DK2785683T3 (da) | 2011-11-30 | 2020-04-14 | Ludwig Inst For Cancer Res Ltd | Inkt-cellemodulatorer og fremgangsmåder til anvendelse heraf |
| GB201120860D0 (en) | 2011-12-05 | 2012-01-18 | Cambridge Entpr Ltd | Cancer immunotherapy |
| WO2013184209A1 (en) | 2012-06-04 | 2013-12-12 | Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. | Mif for use in methods of treating subjects with a neurodegenerative disorder |
| ES2878650T3 (es) | 2012-09-06 | 2021-11-19 | Univ Chicago | Polinucleótidos antisentido para inducir la omisión de exón y procedimientos de tratamiento de distrofias |
| KR101429696B1 (ko) | 2012-11-21 | 2014-08-13 | 국립암센터 | 안전성 및 항암활성이 증가된 재조합 아데노바이러스 및 이의 용도 |
| SI2956476T1 (sl) | 2013-02-18 | 2020-03-31 | Vegenics Pty Limited | Molekule za vezavo na ligande in uporabe le-teh |
| WO2014191630A2 (en) | 2013-05-28 | 2014-12-04 | Helsingin Yliopisto | Non-human animal model encoding a non-functional manf gene |
| LT3283500T (lt) | 2015-04-08 | 2020-12-10 | The University Of Chicago | Kompozicijos ir būdai, skirti 2c tipo dubens-žasto raumenų distrofijos korekcijai, panaudojant egzono peršokimą |
| KR102106619B1 (ko) | 2015-10-12 | 2020-05-06 | 진메디신 주식회사 | 유전자 전달 및 유전자 치료를 위한 아데노바이러스 복합체 |
| EA201990718A1 (ru) | 2016-09-20 | 2019-10-31 | Векторы аденовируса собачьих | |
| HUE072083T2 (hu) | 2016-09-20 | 2025-10-28 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Új promóterek |
| MY199743A (en) | 2016-09-20 | 2023-11-21 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Ehv insertion site orf70 |
| TW201823465A (zh) | 2016-09-20 | 2018-07-01 | 德商百靈佳殷格翰維美迪加股份有限公司 | 新穎豬流感疫苗 |
| EP3725875A4 (en) | 2017-12-13 | 2021-10-06 | Genemedicine Co., Ltd. | RECOMBINANT ADENOVIRUS AND STEM CELLS INCLUDING THEM |
| CN112351996A (zh) | 2018-06-11 | 2021-02-09 | 佛罗里达大学研究基金会股份有限公司 | 用于治疗应激相关病症和癌症的材料和方法 |
| WO2024228167A1 (en) | 2023-05-03 | 2024-11-07 | Iox Therapeutics Inc. | Inkt cell modulator liposomal compositions and methods of use |
| WO2025113643A1 (en) | 2023-12-01 | 2025-06-05 | Gilead Sciences Inc. | Anti-fap-light fusion protein and use thereof |
| WO2025259871A1 (en) | 2024-06-14 | 2025-12-18 | Gilead Sciences, Inc. | Anti-ccr8 antibodies and uses thereof |
Family Cites Families (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8424757D0 (en) * | 1984-10-01 | 1984-11-07 | Pasteur Institut | Retroviral vector |
| FR2573436B1 (fr) * | 1984-11-20 | 1989-02-17 | Pasteur Institut | Adn recombinant comportant une sequence nucleotidique codant pour un polypeptide determine sous le controle d'un promoteur d'adenovirus, vecteurs contenant cet adn recombinant, cellules eucaryotes transformees par cet adn recombinant, produits d'excretion de ces cellules transformees et leurs applications, notamment a la constitution de vaccins |
| US4797368A (en) * | 1985-03-15 | 1989-01-10 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector |
| US5139941A (en) * | 1985-10-31 | 1992-08-18 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | AAV transduction vectors |
| US4861719A (en) * | 1986-04-25 | 1989-08-29 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | DNA constructs for retrovirus packaging cell lines |
| JP3082204B2 (ja) * | 1988-09-01 | 2000-08-28 | ホワイトヘッド・インスティチュート・フォー・バイオメディカル・リサーチ | 両栄養性および環境栄養性宿主域を持つ組換え体レトロウイルス |
| US5585362A (en) * | 1989-08-22 | 1996-12-17 | The Regents Of The University Of Michigan | Adenovirus vectors for gene therapy |
| CA2039921A1 (en) * | 1990-04-16 | 1991-10-17 | Xandra O. Breakefield | Transfer and expression of gene sequences into central nervous system cells using herpes simplex virus mutants with deletions in genes for viral replication |
| WO1991018088A1 (en) * | 1990-05-23 | 1991-11-28 | The United States Of America, Represented By The Secretary, United States Department Of Commerce | Adeno-associated virus (aav)-based eucaryotic vectors |
| US5173414A (en) * | 1990-10-30 | 1992-12-22 | Applied Immune Sciences, Inc. | Production of recombinant adeno-associated virus vectors |
| US5252479A (en) * | 1991-11-08 | 1993-10-12 | Research Corporation Technologies, Inc. | Safe vector for gene therapy |
| CA2149771A1 (en) * | 1992-11-18 | 1994-05-26 | Jeffrey M. Leiden | Adenovirus-mediated gene transfer to cardiac and vascular smooth muscle |
| EP1024198A3 (en) * | 1992-12-03 | 2002-05-29 | Genzyme Corporation | Pseudo-adenoviral vectors for the gene therapy of haemophiliae |
| FR2705361B1 (fr) * | 1993-05-18 | 1995-08-04 | Centre Nat Rech Scient | Vecteurs viraux et utilisation en thérapie génique. |
| FR2705686B1 (fr) * | 1993-05-28 | 1995-08-18 | Transgene Sa | Nouveaux adénovirus défectifs et lignées de complémentation correspondantes. |
| KR100356615B1 (ko) * | 1993-07-13 | 2003-04-03 | 아방티 파르마 소시에테 아노님 | 결함아데노바이러스벡터및유전자치료에서그의사용 |
| US5856121A (en) * | 1994-02-24 | 1999-01-05 | Case Western Reserve University | Growth arrest homebox gene |
-
1995
- 1995-03-31 FR FR9504234A patent/FR2732357B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-03-28 CZ CZ973088A patent/CZ308897A3/cs unknown
- 1996-03-28 AP APAP/P/1997/001117A patent/AP1011A/en active
- 1996-03-28 AU AU55315/96A patent/AU701345B2/en not_active Ceased
- 1996-03-28 WO PCT/US1996/004493 patent/WO1996030385A1/en not_active Ceased
- 1996-03-28 EP EP96912530A patent/EP0817791A4/en not_active Withdrawn
- 1996-03-28 BR BR9608449-9A patent/BR9608449A/pt not_active Application Discontinuation
- 1996-03-28 HU HU9801767A patent/HUP9801767A3/hu unknown
- 1996-03-28 KR KR1019970706858A patent/KR19980703454A/ko not_active Ceased
- 1996-03-28 SK SK1327-97A patent/SK132797A3/sk unknown
- 1996-03-28 CN CN96193929A patent/CN1190402A/zh active Pending
- 1996-03-28 SI SI9620059A patent/SI9620059A/sl not_active IP Right Cessation
- 1996-03-28 JP JP8529747A patent/JPH11503314A/ja not_active Ceased
- 1996-03-28 CA CA002216878A patent/CA2216878A1/en not_active Abandoned
- 1996-09-30 US US08/723,726 patent/US5851521A/en not_active Ceased
-
1997
- 1997-09-29 OA OA70089A patent/OA10516A/en unknown
-
2000
- 2000-12-21 US US09/740,876 patent/USRE37933E1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0817791A4 (en) | 1998-07-15 |
| AP1011A (en) | 2001-09-22 |
| CZ308897A3 (cs) | 1998-03-18 |
| FR2732357A1 (fr) | 1996-10-04 |
| HUP9801767A3 (en) | 1999-04-28 |
| AP9701117A0 (en) | 1996-03-28 |
| AU701345B2 (en) | 1999-01-28 |
| FR2732357B1 (fr) | 1997-04-30 |
| KR19980703454A (ko) | 1998-11-05 |
| MX9707549A (es) | 1998-07-31 |
| AU5531596A (en) | 1996-10-16 |
| USRE37933E1 (en) | 2002-12-10 |
| JPH11503314A (ja) | 1999-03-26 |
| HUP9801767A2 (hu) | 1998-10-28 |
| EP0817791A1 (en) | 1998-01-14 |
| OA10516A (en) | 2002-04-22 |
| BR9608449A (pt) | 1999-11-30 |
| SK132797A3 (en) | 1998-07-08 |
| WO1996030385A1 (en) | 1996-10-03 |
| CA2216878A1 (en) | 1996-10-03 |
| US5851521A (en) | 1998-12-22 |
| CN1190402A (zh) | 1998-08-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SI9620059A (sl) | Virusni vektorji in njihova uporaba za zdravljenje hiperproliferativnih motenj, zlasti restenoze | |
| PT1792997E (pt) | Adn triplex lentiviral, vetores e células recombiantes contendo adn triplex lentiviral | |
| PL186151B1 (pl) | Zrekombinowane adenowirusy, kompozycje zawierające zrekombinowane adenowirusy, komórka gospodarza zainfekowana zrekombinowanym adenowirusem oraz sposób otrzymywania biologicznie aktywnego białka p53 typu dzikiego | |
| JP2001510028A (ja) | ｐ２７およびその融合物で血管増殖性疾患を処置する方法 | |
| CN100357433C (zh) | 可用于基因治疗和治疗性筛选的eNOS突变 | |
| JP2005504010A (ja) | 成長ホルモンおよびｆｏｘｍ１ｂを用いた肝臓疾患および肝臓損傷の処置方法 | |
| EP1115877B1 (en) | Polynucleotide constructs and uses thereof | |
| EP1307582B1 (en) | Nucleic acid constructs, vascular cells transformed therewith, pharmaceutical compositions and methods utilizing same for inducing angiogenesis | |
| KR19990067174A (ko) | 암 치료를 위한 지에이엑스 단백질의 용도 | |
| JPH11506325A (ja) | Δｐ６２、その変異体、核酸配列及びこれらの使用 | |
| MXPA97007549A (en) | Viral vectors and their use to treat disordershiperproliferativos, in particular resteno | |
| KR100720201B1 (ko) | 트랜스진의 신경-특이성 발현을 위한 음성 조절요소의 용도 | |
| SK51199A3 (en) | Polypeptides comprising gax protein domains, involved in repressing transcription and/or interacting with other proteins, corresponding nucleic acids and their use | |
| KR20010092800A (ko) | 펩타이드 | |
| US7541343B2 (en) | Inhibiting cellular proliferation by expressing yin yang-1 | |
| AU2002308413B2 (en) | Yin yang 1 | |
| US6982148B2 (en) | Progressive elevated gene-3 (PEG-3) induces aggressive cancer phenotype and regulates angiogenesis | |
| JPH10500859A (ja) | 組換えウイルス、製造方法および遺伝子治療での使用 | |
| HK1018066A (en) | Viral vectors and their use for treating hyperproliferative disorders, in particular restenosis | |
| AU2002308413A1 (en) | Yin yang 1 | |
| ZA200101494B (en) | Polynucleotide contructs and uses therof. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF | Valid on the event date | ||
| KO00 | Lapse of patent |
Effective date: 20061218 |