SI9300319A - Molecular dna for the preparation recombinant lipase, stimulated by bile acid salts (bssl) or by lipase carboxyl ester cel) - Google Patents

Description

MOLEKULA DNA ZA PRIDOBIVANJE REKOMBINANTNE LIPAZE STIMULIRANE S SOLMI ŽOLČNIH KISLIN ALI LIPAZE KARBOKSILNEGA ESTRA (BSSL/CEL)

PODROČJE TEHNIKE

Ta izum se nanaša na molekulo DNA, ki vsebuje intronske sekvence in kodira človeški protein, ki ga, odvisno od položaja delovanja, imenujemo lipaza stimulirana s solmi žolčnih kislin (BSSL- Bile Salt Stimulated Lipase) ali lipaza karboksilnega estra (CELCarboxyl Ester Lipase). Molekulo DNA koristno uporabljamo v proizvodnji rekombinantne človeške BSSL/CEL, prednostno s produkcijo v transgenskih ne-človeških sesalcih. Rekombinantno človeško BSSL/CEL lahko uporabljamo kot sestavino umetne hrane za dojenčke, ki jo uporabljamo kot zamenjavo človeškega mleka, ali pa v izdelovanju zdravil proti npr. slabi absorpciji maščob, cistični fibrozi in kroničnemu pankreatitisu.

OZADJE IZUMA

Hidroliza dietetičnih lipidov

Dietetični lipidi so pomemben vir energije. Več kot 95% teh lipidov sestavljajo trigliceridi bogati z energijo. Nekateri od lipidov, na primer določene maščobne kisline in vitamini topni v maščobah, so bistvene dietetične sestavine. Triacilgliceroli, kakor tudi manjše komponente, tj. esterificirani vitamini topni v maščobah in holesterol, ter diacilfosfatidilgliceroli zahtevajo, preden pride do gastro-intestinalne absorpcije, hidrolizo esterskih vezi, da bi tako nastali manj hidrofobni produkti, ki se lahko absorbirajo. Te reakcije katalizira specifična skupina encimov, ki jih imenujemo lipaze.

Smatramo, da so pri odraslem človeku bistvene lipaze: želodčna lipaza, pankreasna lipaza odvisna od kolipaze (hidroliza tri- in diacilglicerolov), fosfolipaza A2 pankreasa (hidroliza diacilfosfatidilglicerolov) in lipaza karboksilnega estra (CEL) (hidroliza holesteril estrov in estrov vitaminov topnih v maščobah). Pri novorojenčkih, ki jih dojijo, ima v hidrolizi večjega števila zgoraj omenjenih lipidov bistveno vlogo lipaza stimulirana s solmi žolčnih kislin (BSSL). Produkti prebave lipidov tvorijo skupaj s solmi žolčne kisline mešane micele, iz katerih se vrši absorpcija.

Lipaza stimulirana s solmi žolčnih kislin

Človeška mlečna žleza sintetizira in z mlekom izloča lipazo, stimulirano s solmi žolčnih kislin (BSSL) (Blaeckberg et al., 1987), ki po specifični aktivaciji s primarnimi solmi žolčnih kislin, prispeva k endogeni sposobnosti dojenega otroka, da v črevu prebavlja maščobe. Ta encim, ki tvori približno 1% celotnih mlečnih proteinov (Blaeckberg & Her nell, 1981), se ne degradira tekom prehoda skozi želodec, v vsebini dvanaestemika je pa s solmi žolčnih kislin zaščiten proti izgubi aktivnosti, ki jo povzročijo proteaze iz pankreasa, take kot tripsin in himotripsin. Izgubi pa aktivnost, ko mleko pasterizirajo, na primer 30 minut segrevajo pri 62,5°C (Bjoerksten et al., 1980).

Modelni eksperimenti in vitro kažejo, da so končni produkti digestije triacilglicerola drugačni v prisotnosti BSSL (Bemabaeck et al., 1990; Hemell & Blaeckberg, 1982). To je lahko koristno za absorpcijo produkta, zahvaljujoč nižji intraluminalni koncentraciji soli žolčnih kislin za časa neonatalne dobe.

Lipaza karboksilnega estra

Zdi se, da je lipaza karboksilnega estra (CEL), ld se nahaja v soku trebušne slinavke človeka (Lombardo et al., 1978) funkcionalno identična, ali vsaj zelo podobna, BSSL (Blaeckberg). Imata tudi skupne epitope, identične N-terminalne aminokislinske sekvence (Aboualdl et al., 1988) in ju inhibirajo inhibitoiji serin esteraz, npr. eserin in diizopropilfluorofosfat. V novejših raziskavah, izvršenih v več laboratorijev, so karakterizirali strukturo cDNA obeh lipaz, kot lipaze iz mleka, tako lipaze iz trebušne slinavke (Baba et al., 1991; Hui et al., 1991; Nilsson et al., 1990; Reue et al, 1991) in zaključek je, da sta encim iz mleka in encim iz pankreasa produkta istega gena (v tej prijavi ga navajamo kot CEL gen, EC 3.1.1.1). Sekvenca cDNA CEL gena in izvedena sekvenca aminokislin sta opisani v WO 91/1823 (Aktiebolaget Astra).

Zato domnevamo, da je CEL identična BSSL, ter polipeptid, ki ga kodira CEL gen, v tem kontekstu imenujemo BSSL/CEL.

Slaba absorpcija lipidov

Običajni vzroki slabe absorpcije lipidov, in zato tudi nepravilne prehrane, so zmanjšani intraluminalni nivoji lipaze odvisne od kolipaze slinavke in/ali soli žolčnih kislin. Tipični primeri takega pomanjkanja lipaze so bolniki, ki imajo cistično fibrozo, pogosto genetsko obolenje, ki pripelje do doživljenskega pomanjkanja pri 80% bolnikov, kakor tudi kroničen pankreatitis, često zaradi kroničnega alkoholizma.

Danes zdravimo bolnike s pomanjkanjem lipaze pankreasa z oralnim dajanjem zelo velikih odmerkov surovega pripravka encimov prašičjega pankreasa. Vendar pa nizek pH, prevladujoč v želodcu, povzroča izgubo aktivnosti pankreasne lipaze odvisne od kolipaze. Ta učinek ne moremo popolnoma prevladati s uporabo velikih odmerkov encima. Zato so za večino bolnikov neustrezne velike uporabljene doze, poleg tega pa so pripravki nečisti

- inneukusni.

Formulirali so določene tablete, ki gredo skozi kisla področja želodca in izpuščajo encime samo v relativno alkalnem okolju jejunuma. Vendar imajo mnogi bolniki, ki bolujejo na pankreatičnih motnjah, nenormalno kisel jejunum in se v tem primeru lahko zgodi, da tab lete ne bodo izpustile encima.

Razen tega, ker pripravki, ki se danes nahajajo na trgu, potekajo iz ne-človeških virov, obstaja nevarnost imunoreakcij, ki lahko na bolnike škodljivo učinkujejo, ali pa pripeljejo do zmanjšanja učinkovitosti terapije. Nadaljna pomanjkljivost sedaj obstoječih pripravkov je, da ni navedena njihova vsebnost drugih lipolitičnih aktivnosti, razen lipaze odvisne od kolipaz. Dejansko vsebujejo zelo nizke nivoje BSSL/CEL aktivnosti. To je lahko eden od razlogov, da mnogi bolniki, ki bolujejo na cistični fibtozi, kljub zdravljenju z dodajanjem pomanjkljivih snovi, trpijo zaradi pomanjkanja vitaminov topnih v maščobah in esencialnih maščobnih kislin.

Zato obstaja velika potreba po produktih z lastnostmi in strukturo izvedeno iz humanih lipaz ter s široko specifičnostjo z ozirom na substrat, ki bi jih lahko oralno dajali bolnikom, ki bolujejo zaradi pomanjkanja enega ali več pankreasnih lipolitičnih encimov. Produkti, ki jih lahko dobimo s uporabo tega izuma, izpolnjujejo to potrebo bodisi sami po sebi, bodisi v kombinaciji s pripravki, ki vsebujejo druge lipaze.

Umetna hrana za dojenčke

Dobro je znano, da se smatra, da je veliko bolje dojenčke hraniti s človečkim mlekom, kot pa s umetno hrano. Ne samo, da človeško mleko omogoča dobro uravnovešeno oskrbo s hranili, temveč ga otrok tudi lahko prebavi. Tako je več biološko aktivnih sestavin, za katere je znano, da imajo v dojenčku fiziološko funkcijo, bodisi sestavni del človeškega mleka, bodisi produkt njegove prebave; to velja tudi za sestavine, ki so vključene v obrambo proti infekciji in sestavine, ki olajšajo vzemanje hranil iz človeškega mleka.

Kljub velikim naporom, ki so jih vložili v pripravo umetne hrane za dojenčke, niso mogli proizvesti formule, ki bi v neki večji meri imela koristne lastnosti človeškega mleka. Tako umetno hrano za dojenčke, ki jo često pripravijo na osnovi kravjega mleka, dojenček običajno nepopolno prebavi, ona sama pa nima snovi, za katere vemo, da učinkujejo na fiziološke funkcije dojenčka. Da bi dobili umetno hrano za dojenčke s hranljivo vrednostjo podobno človeškemu mleku, v formulo vključujejo več dodatkov, vključno dele proteinov, vitamine, minerale itn., ki se normalno tvorijo, ali pa absorbirajo, za časa prebave človeškega mleka v dojenčku; pri tem pa obstaja neprestana nevarnost povečane obremenitve in možne dolgoročne poškodbe pomembnih organov, takih kot jetra in ledvice. Druga slaba stran povezana s uporabo formul, utemeljenih na kravjem mleku, je pri dojenčku povečana nevarnost povzročanja alergij na goveje proteine.

Kot alternativo umetni hrani za dojenčke, utemeljeni na kravjem mleku, uporabljamo človeško mleko, ki ga lahko dobimo iz t.i. bank mleka. Vendar se prehrani novorojenčkov s človeškim mlekom iz bank mleka v zadnjem času v večji meri izogibamo, zaradi strahu pred prisotnostjo povzročiteljev infekcij, takih kot HTV in CMV, v človeškem mleku. Da bi uničili povzročitelje infekcij v človeškem mleku, ga moramo pred uporabo nujno pasterizirati. Toda, s pasterizacijo zmanjšujemo hranljivo vrednost ter biološke učinke sestavin mleka, na primer inaktiviramo BS SL, kot smo zgoraj omenili.

Dodatek lipaz umetni hrani za dojenčke

Funkcije pankreasa in jeter ob rojstvu niso popolnoma razvite, zlasti pri predčasno rojenih novorojenčkih. Slaba absorpcija maščob, iz fizioloških razlogov, je pogosta ugotovitev in misli se, da je nastala zaradi nizke intraluminalne vsebnosti pankreasne lipaze odvisne od kolipaze in soli žolčnih kislin. Toda zaradi BSSL je taka slaba absorpcija mnogo manj pogosta pri dojenih novorojenčkih, kot pri tistih, ki jih hranijo s pasteriziranim človeškim mlekom ali s umetno hrano za dojenčke (Bemabaeck et al., 1990):

Zato je zaželeno, da bi se izognili zgoraj omenjenim pomanjkljivostim, povezanimi s pasteriziranim mlekom in umetno hrano na osnovi kravjega mleka, da pripravimo umetno hrano za dojenčke s sestavo, Id je bližja sestavi človeškega mleka, tj. formulo, ki vsebuje proteine človeškega mleka.

BSSL ima nekaj edinstvenih lastnosti, zaradi katerih je idealno primerna za dopolnilo umetne hrane za dojenčke:

• Narava jo je namenila oralnemu dajanju. Zato je odporna pri prehodu skozi želodec, aktivira pa se v vsebini tankega čreva.

• Njen specifičen mehanizem aktiviranja bi moral preprečiti nevarno lipolizo lipidov hrane ali tkiva za časa uskladiščenja in prehoda do njenega centra delovanja.

• Zaradi njene široke specifičnosti glede na substrat, ima potencial, sama po sebi, da posreduje pri popolnem prebavljanju večine dietetičnih lipidov, vključno vitaminskih estrov, topnih v maščobah.

• BSSL/CEL je lahko pri hidrolizi estetskih vezi, ki vsebujejo polinenasičene maščobne kisline z dolgimi verigami, boljša od pankreatične lipaze odvisne od kolipaze.

• V prisotnosti želodčne lipaze in v njeni odsotnosti, ali pri nizkih novojih lipaze odvisne od kolipaze, lahko BSSL/CEL zagotovi popolno digestijo triacilglicerolov in vitro celo če so nivoji soli žolčnih kislin nizki, tako kot pri novorojenčkih. V prisotnosti BSSL/CEL postanejo končni produkti digestije triacilglicerolov proste maščobne kisline in prosti glicerol, preje kot pa proste maščobne kisline in monoacilglicerol, ki nastane ob delovanju drugih dveh lipaz (Bembaeck et al., 1990). To lahko pomaga pri absorpciji produktov, zlasti kadar so intraluminalni nivoji soli žolčnih kislin nizki.

Vendar pa uporaba BSSL/CEL za dopolnilo umetne hrane za dojenčke zahteva raspolaganje z velikimi količinami produkta. Čeprav proteine človeškega mleka lahko izoliramo neposredno iz človeškega mleka, to ni realističen in zadosti ekonomičen način za pridobivanje velikih količin, potrebnih za industrijsko proizvodnjo; potemtakem moramo razviti druge metode, preden lahko pripravimo umetno hrano za dojenčke, ki vsebuje proteine človeškega mleka. Ta izum omogoča take metode priprave BSSL/CEL v velikih količinah.

Produkcija proteinov v mleku transgenskih živali

Izoliranje genov, ki kodirajo farmakološki aktivne proteine, je omogočilo cenejšo proizvodnjo takih proteinov v heterolognih sistemih. Privlačen sistem ekspresije za proteine mleka je transgenska žival (za pregled videti Hennighausen et al., 1990). Dietetični sestavki, vsebujoči lipazo, ki jo aktivirajo soli žolčnih kislin, izvedeno iz npr. tehnologije transgenskih živali, so opisali v EP 317,355 (Oklahoma Medical Research Foundation).

V transgensko žival lahko vgradimo sekvence, ki kodirajo proteine, kot cDNA ali kot genomske sekvence. Ker so introni lahko nujni za reguliranje genske ekspresije v transgenskih živalih (Brinster et al., 1988; Whitelaw ez al., 1991), je v mnogih primerih bolje uporabiti genomsko obliko, kot pa cDNA obliko strukturnega gena. WO 90/05188 (Pharmaceutical Proteins Limited) opisuje uporabo v transgenskih živalih take DNA, ki kodira proteine in vsebuje najmanj enega, toda ne vse, introne, ki se naravno nahajajo v genu, ki kodira protein.

CILJ IZUMA

Cilj tega izuma je omogočiti način za proizvodnjo rekombinantne človeške BSSL/CEL z visokim dobitkom in z realistično ceno, za uporabo v umetni hrani za dojenčke, z namenom, da bi se izognili pomanjkljivostim vezanim za pasterizirano mleko in formule na osnovi govejih proteinov.

KRATEK OPIS IZUMA

Namen izuma smo dosegli s kloniranjem in sekvenciranjem človeškega CEL gena. Da bi izboljšali dobitek BSSL/CEL, smo za produkcijo človeške BSSL/CEL v transgenskem nečloveškem sesalcu uporabili pridobljeno molekulo DNA, ki je vsebovala intronske sekvence, namesto znanih sekvenc cDNA.

Torej se v enem vidiku ta izum nanaša na molekulo DNA, ki smo jo v seznamu sekvenc prikazali kot SEQ ID NO: 1, ali na analogon omenjene molekule DNA, ki se hibridizira s molekulo DNA, ki smo jo v seznamu sekvenc prikazali kot SEQ ID: NO 1, ali na njen specifičen del, pod strogimi pogoji hibridizacije.

Postopke, ki jih uporabljamo za izoliranje človeške BSSL/CEL molekule DNA, smo opisali v spodaj navedenih primerih.

Stroge pogoje hibridizacije, na katere se zgoraj sklicujemo, je treba razumeti v njihovem običajnem pomenu, tj. da hibridizacijo izvršimo po navadnem laboratorijskem priročniku, takem kot je Sambrook et al. (1989).

V drugem vidiku ta izum omogoča sistem ekspresije pri sesalcu, ki vsebuje sekvenco DNA, kodirajočo človeško BSSL/CEL, vgrajeno v gen, ki kodira protein mleka nečloveškega sesalca. Tako se tvori hibridni gen, ki ga lahko eksprimiramo v mlečni žlezi odrasle samice sesalca, ki je sprejela omenjeni hibridni gen; ko se ta hibridni gen eksprimira, se proizvaja človeška BSSL/CEL.

V še nadaljnem vidiku se ta izum nanaša na metodo produkcije transgenskega nečloveškega sesalca, sposobnega za ekspresijo človeške BSSL/CEL, ki obsega injiciranje sistema ekspresije sesalca, kot smo ga zgoraj definirali, v oplojeno jajce ali celico embrija sesalca, tako da ekspresijski sistem vključimo v spolne celice sesalca, kakor tudi razvoj nastalega injiciranega oplojenega jajca ali embrija v odrasli samici sesalca.

PODROBEN OPIS IZUMA

Molekula DNA, ki smo jo v seznamu sekvenc prikazali kot SEQ ID NO: 1, ki je v celoti dolga 11531 bp, ima naslednje lastnosti:

Lastnost od baze do baze

5’-bočno območje	1	1640
TATA boks (box)	1611	1617
Ekson 1	1641	1727
Začetek translacije	1653	1653
Ekson 2	4071	4221
Ekson 3	4307	4429
Ekson 4	4707	4904
Ekson 5	6193	6323
Ekson 6	6501	6608
Ekson 7	6751	6868
Ekson 8	8335	8521
Ekson 9	8719	8922
Ekson 10	10124	10321
Ekson 11	10650	11490
3’-bočno območje	11491	11531

V tem kontekstu uporabljamo termin gen, da bi naznačili sekvenco DNA, ki je vključena v produkcijo polipeptidne verige in ki vsebuje območja, ki predhodijo in ki sledijo kodirajočemu območju (5’-proti toku ležeče sekvence in 3’-nižje ležeče sekvence 5’-upstream and 3’-downstream sequences), kakor tudi vmesne sekvence, t.i. introne, ki se nahajajo med posameznimi kodirajočimi segmenti (t.i. eksoni), bodisi v 5’-proti toku ležečem, bodisi v 3’-nižje ležečem območju. 5’-proti toku ležeče območje vsebuje regulacijsko sekvenco, ki kontrolira ekspresijo gena, tipično promotor. 3’-nižje ležeče območje vsebuje sekvence, ki so vključene v terminacijo transkripcije gena in, poljubno, sekvence, odgovorne za poliadeniliranje transkripta in 3’ netranslirano območje.

Molekule DNA izuma, ki jih tukaj pojasnujemo, lahko vsebujejo naravne kakor tudi sintetične sekvence DNA; pri tem so naravne sekvence tipično izvedene neposredno iz genomske DNA, normalno sesalskega porekla, npr, take kot jih spodaj opisujemo. Sintetične sekvence lahko pripravimo z običajnimi metodami za pridobivanje molekul DNA s sintezo. Nadalje so lahko sekvence DNA mešanega genomskega in sintetičnega porekla.

V nadaljnem vidiku se ta izum nanaša na vektor za ekspresijo, ki se lahko replicira in ki nosi sekvenco DNA, kodirajočo človeško BSSL/CEL, ter je sposoben posredovati njeno ekspresijo.

V tem kontekstu pomeni ki se lahko replicira to, da je vektor sposoben replikacije v danem tipu celice gostitelja v katero je vstavljen. Neposredno pred človeško BSSL/CEL sekvenco DNA lahko vgradimo sekvenco, ki kodira signalni peptid, in ki zagotavlja izločanje človeške BSSL/CEL, eksprimirane v celicah gostiteljih, v katerih se vektor nahaja. Signalna sekvenca je lahko tista, ki je naravno povezana s človeško BSSL/CEL sekvenco DNA ali pa nekega drugega porekla.

Vektor je lahko katerikoli vektor, ki ga običajno lahko podvržemo postopkom rekombinnantne DNA in bo zato izbira vektoqa velikokrat odvisna od celice gostitelja, v katero ga moramo vstaviti. Tako je vektor lahko neki vektor, ki se samostojno replicira, npr. vektor, ki obstaja kot izvenkromosomska enota, čigar replikacija je neodvisna od replikacije kromosomov; primeri takega vektoija so plazmid, fag, kozmid, mini-kromosom ali virus. Alternativno je vektor lahko take vrste, da se potem ko je bil vpeljan v celico gostitelja, integrira v njen genom in replicira skupaj s kromosomom(i) v katere je integriran. Primeri ustreznih vektorjev so bakterijski vektorji za ekspresijo. Vektor tega izuma lahko nosi katerokoli molekulo DNA izuma, kot smo jih določili zgoraj.

Ta izum se nadalje nanaša na celico, ki je sprejela vektor ekspresije, ki se lahko replicira, kot smo ga definirali zgoraj. Načeloma je ta celica lahko celica katerekoli vrste, npr. prokariontska celica, enoceličen eukariontski organizem ali pa celica izvedena iz mnogoceličnega organizma, npr. sesalca. Celice sesalcev so zlasti primerne za ta namen in o njih nadalje razpravljemo spodaj.

V drugem pomembnem aspektu se izum nanaša na metodo produkcije rekombinantne človeške BSSL/CEL, po kateri smo sekvenco DNA, ki kodira človeško BSSL/CEL, vgradili v vektor, ki je zmožen replikacije v specifični celici gostitelju, nastali rekombinantni vektor vpeljali v celico gostitelja, ki smo jo gojili v ali na ustreznem gojišču za kulturo pod ustreznimi pogoji za ekspresijo človeške BSSL/CEL in pridobili človeško BSSL/CEL.

Gojišče, ki ga uporabljamo za rast celic, je lahko katerikoli običajni medij primeren za ta namen. Ustrezen vektor je lahko katerikoli od vektorjev, ki smo jih zgoraj opisali in primerna celica gostitelj je lahko katerakoli od zgoraj naštetih tipov celic. Metode, ki jih uporabljamo za konstruiranje vektorja in učinkovanje na njegovo vnašanje v celico gostitelja, so lahko katerekoli metode na področju rekombinantne DNA, za katere je znano, da jih uporabljajo v take namene. Rekombinantna človeška BSSL/CEL, ki jo sintetizirajo te celice, se lahko izloči tj. izpusti skozi celično membrano, odvisno od tipa celice in sestave vektorja.

Če se človeška BSSL/CEL proizvaja znotraj celice z rekombinantnim gostiteljem, torej je celica ne izloča, jo lahko pridobimo s standardnimi postopki, ki obsegajo razkroj celice z mehanskimi sredstvi npr. sonikacijo ali homogenizacijo, ali z encimi ali kemičnimi sredstvi, potem jo pa pridobimo v čisti obliki.

Sekvenci DNA, ki kodira človeško BSSL/CEL mora, da bi jo celica izločila, predhoditi ^v sekvenca, ki kodira signalni peptid; prisotnost le-tega zagotavlja izločanje človeške BSSL/CEL iz celic, tako da se najmanj pomemben del eksprimirane človeške BSSL/CEL izloča v medij za kulturo in jo iz njega izoliramo.

Metoda za produkcijo rekombinantne Človeške BSSL/CEL po izumu, ki jo trenutno priporočamo, je uporaba transgenskih ne-človeških sesalcev, sposobnih izločanja človeške BSSL/CEL v njihovo mleko. Prednost uporabe transgenskih ne-človeških sesalcev je v tem, da lahko pridobimo rekombinantno človeško BSSL/CEL z velikimi dobitki ob sprejemljivih stroških in, zlasti kadar je ne-človeški sesalec krava, da se rekombinantna člo10 veška BSSL/CEL proizvaja v mleku, ki je normalna sestavina npr. umetne hrane za dojenčke; tako da ni potrebno obsežno očiščevanje ko nameravamo rekombinantno človeško BSSL/CEL uporabiti kot hranljivo dopolnilo v produktih, ki imajo za osnovo mleko. Še več, produkcija v višjem organizmu, takem kot je ne-človeški sesalec, normalno vodi k pravilnemu predelovanju (processing) proteina sesalca, npr. z ozirom na njegovo posttranslacijsko predelovanje, kot smo razpravljali zgoraj, ter njegovo pravilno zlaganje. Tudi lahko pridobimo velike količine bistveno čiste človeške BSSL/CEL.

Torej se v nadaljnem pomembnem vidiku ta izum nanaša na sistem ekspresije nahajajoč se v sesalcu, ki obsega sekvenco DNA, kodirajočo človeško BSSL/CEL, vgrajeno v gen, ki kodira protein mleka ne-človeškega sesalca, tako da se tvori hibridni gen, ki se lahko eksprimira v mlečni žlezi odrasle samice sesalca, ki je navedeni hibridni gen sprejela.

Sekvenca DNA, ki kodira človeško BSSL/CEL je prednostno sekvenca DNA, ki smo jo prikazali v seznamu sekvenc kot SEQ ID NO: 1, ali genomski gen človeške BSSL/CEL ali njen analogom

Običajno se smatra, da so mlečna žleza, kot tkivo ekspresije, in geni, ki kodirajo proteine mleka, posebno primerni za uporabo v produkciji heterolognih proteinov v transgenskih ne-človeških sesalcih, ker se v mlečni žlezi proteini mleka naravno proizvajajo na visokih nivojih ekspresije. Poleg tega mleko z lahkoto zbiramo in je dostopno v velikih količinah. Povezano s tem je uporaba genov za mlečne proteine v proizvodnji rekombinantne človeške BSSL/CEL nadaljno koristna zato, ker se le-ta proizvaja v pogojih, ki so podobni naravnim pogojem njene produkcije, v smislu regulacije ekspresije in lokacije produkcije (mlečna žleza).

V tem kontekstu izraz hibridni gen označuje sekvenco DNA, ki vsebuje po eni strani sekvenco DNA, kodirajočo človeško BSSL/CEL, kot smo jo določili zgoraj, po drugi strani pa sekvenco DNA gena za mlečni protein, ki je sposobna posredovati ekspresijo produkta hibridnega gena. Gen, ki kodira mlečni protein označuje celotni gen, kakor tudi njegovo podsekvenco, ki je sposobna posredovati in vpeljati ekspresijo hibridnega gena v tkivo, ki nas zanima, tj. mlečno žlezo. Normalno je navedena podsekvenca tista, ki vsebuje najmanj eno ali več promotorsldh območij, startno mesto transkripcije, 3’- in 5’ne-kodirajoča območja in strukturne sekvence. Priporočljivo je, da so sekvence DNA, ki kodirajo človeško BSSL/CEL, bistveno brez prokariontskih sekvenc, takih kot so vektorske sekvence, ki so lahko povezane s sekvenco DNA po npr. njenem kloniranju.

Hibridni gen prednostno tvorimo z vgrajevanjem in vitro sekvence DNA, ki kodira človeško BSSL/CEL, v gen za mlečni protein, s uporabo tehnik znanih v stroki. Alternativno lahko sekvenco DNA, ki kodira človeško BSSL/CEL, vgradimo in vivo s homologno rekombinacijo.

Normalno bo sekvenca DNA, ki kodira človeško BSSL/CEL, najbolje vgrajena v enega od prvih eksonov gena za mlečni protein ali v njegovo aktivno podsekvenco, ki vsebuje prve eksone in, priporočljivo, naj večji del 5’-bočne sekvence, za katero se veijame, da ima regulatomi pomen.

Hibridni gen prednostno vsebuje sekvenco, ki kodira signalni peptid, tako da produktu hibridnega gena omogoča pravilno izločanje v mlečno žlezo. Signalni peptid bo tipično tak, kot ga normalno najdemo v omenjenem genu za mlečni protein, ali pa tak, ki je povezan s sekvenco DNA, ki kodira človeško BSSL/CEL. Vendar so koristne tudi druge signalne sekvence, sposobne posredovanja pri izločanju produkta hibridnega gena v mlečno žlezo. Seveda se morajo različni elementi hibridnega gena združiti na tak način, da omogočijo pravilno ekspresijo in predelavo genskega produkta. Tako mora normalno biti sekvenca DNA, ki kodira izbrani signalni peptid, precizno vezana na N-terminalni del sekvence DNA, ki kodira človeško BSSL/CEL. V hibridnem genu bo sekvenca DNA, ki kodira človeško BSSL/CEL, normalno vsebovala njen stop-kodon, toda ne njenga lastnega položaja informacijske cepitve in položaja poliadeniliranja. Za sekvenco DNA, ki kodira človeško BSSL/CEL, se bodo normalno ohranile sekvence gena mlečnega proteina za predelavo mRNA.

Smatra se, da je več činiteljev odgovornih za dejanski nivo ekspresije posameznega hibridnega gena. Sposobnost promotorja, kakor tudi drugih regulatomih sekvenc, kot smo prej omenili, položaj integracije sistema ekspresije v genom sesalca, položaj integracije sekvence DNA, ki kodira človeško BSSL/CEL, v gen, ki kodira protein mleka, elementi, ki vršijo post-transkripcijsko regulacijo in drugi podobni činitelji imajo lahko vitalni pomen za doseženi nivo ekspresije. Na osnovi poznavanja različnih činiteljev, ki vplivajo na nivo ekspresije hibridnega gena, bo strokovnjak vedel kako naj načrtuje ekspresijski sistem, ki bo koristen za te namene.

Mlečna žleza izloča več različnih mlečnih proteinov. Obstajata dve glavni skupini mlečnih proteinov, namreč kazeini in proteini sirotke. Sestava mleka različnih vrst se kvalitativno, kakor tudi kvantitativno, razlikuje glede na te proteine. Večina ne-človeških sesalcev proizvaja 3 različne tipe kazeina, namreč a-kazein, β-kazein in K-kazein. Najbolj pogosti proteini goveje sirotke so α-laktalbumin in β-laktalbumin. Sestavo mleka različnega porekla nadalje opisujejo Clarck et al. (1987).

Gen za mlečni protein, ki ga bomo uporabili, lahko izhaja iz iste vrste kakor tisti, v katerega bomo vgradili ekspresijski sistem, lahko pa se izvede iz drugih vrst. Povezano s tem so pokazali, da so regulatomi elementi, ki vodijo ekspresijo gena v mlečno žlezo, funkcionalni preko mej med vrstami, kar je lahko posledica možnega skupnega prednika (Hennighausen et al., 1990).

Primere ustreznih genov, ki kodirajo protein mleka, ali njegovih aktivnih podsekvenc, ki jih bomo uporabili v konstruiranju ekspresijskega sistema tega izuma lahko normalno najdemo med proteini sirotke sesalcev različnega porekla npr. gen za kisli protein sirotke (whey acidic protein - WAP), prednost dajemo le-tem iz glodalcev, in gen za β-laktoglobulin, prednostno ovčjega porekla. Poleg tega so lahko za transgensko produkcijo človeške BSSL/CEL primerni tudi kazeinski geni različnega porekla, npr. goveji aSl-kazein in zajčji β-kazein. Gen, ki ga sedaj priporočamo, je WAP gen glodalcev, ker so ugotovili, da je sposoben omogočiti visok nivo ekspresije več tujih človeških proteinov v mleku različnih transgenskih živali (Hennighausen et la., 1990).

Druga sekvenca, ki je prednostno povezana z ekspresijskim sistemom izuma je t.i. sekvenca stabilizacije ekspresije, sposobna posredovanja ekspresije visokega nivoja. Obstajajo močne indikacije, da so take stabilizirajoče sekvence najdene v bližini in pred geni za protein mleka.

Sekvenca DNA, ki kodira človeško BSSL/CEL, ki jo bomo vgradili v ekspresijski sistem izuma, je lahko genomskega ali sintetičnega porekla ali katerakoli njihova kombinacija. Ugotovili so, da nekateri ekspresijski sistemi zahtevajo prisotnost intronov in drugih regulatomih območij, da bi ekspresija bila zadovoljiva (Hennighausen et al., 1990). V nekaterih primerih je lahko koristno v vektorske konstrukcije vgraditi, kot element, ki kodira polipeptid, genomske strukture, bolje kot pa elemente cDNA (Brinster et al., 1988).

Intronske in eksonske strukture lahko povzročijo višje nivoje mRNA na dinamičnem ravnotežju, kot tiste, ki jih dosežemo, kadar uporabimo vektorje zasnovane na cDNA.

V nadaljnem vidiku se ta izum nanaša na hibridni gen, ki vsebuje sekvenco DNA, kodirajočo človeško BSSL/CEL, vgrajeno v gen, ki kodira protein mleka ne-človeškega sesalca;

pri tem sekvenco DNA vgradimo v gen proteina mleka na tak način, da se lahko eksprimira v mlečni žlezi odrasle samice sesalca, v kateri se nahaja hibridni gen. O hibridnem genu in njegovih sestavnih delih smo podrobno razpravljali zgoraj. Hibridni gen predstavlja pomemben intermediat v konstrukciji ekspresijskega sistema izuma, kot smo zgoraj opisali.

V drugem vidiku se ta izum nanaša na celico ne-človeškega sesalca, v katero je vstavljen sistem ekspresije, kot smo definirali zgoraj. Priporočljivo je, da je celica sesalca celica embrija ali pa pro-jedro. Ekspresijski sistem ustrezno vgradimo v celico sesalca s uporabo metode, ki jo opisujemo v sledečem besedilu in specifično ilustriramo v spodnjih primerih.

V nadaljnem pomembnem vidiku se ta izum nanaša na metodo proizvodnje transgenskega ne-človeškega sesalca, sposobnega ekspresije človeške BSSL/CEL, ki obsega injiciranje sistema za ekspresijo po izumu, kot je definirano zgoraj, v oplojeno jajce ali v celico embrija sesalca, tako da ekspresijski sistem vgradimo v spolne celice sesalca, kakor tudi razvoj nastalega injiciranega jajca ali embrija v odrasli samici sesalca.

Vgradnjo ekspresijskega sistema v spolne celice sesalca lahko izvedemo uporabljajoč katerokoli od primernih tehnik, npr. kot je opisano v Manipulating the Mouse Embryo; A Laboratoiy Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986. Na primer, nekaj sto molekul ekspresijskega sistema lahko neposredno injiciramo v oplojeno jajce, npr. v oplojeno enocelično jajce ali njegovo pro-jedro, ali embrij izbranega sesalca in lahko mikroinjicirana jajca naknadno prenesemo v jajcevod lažnonosnih krušnih mater in jim omogočimo, da se razvijejo. Normalno se ne bodo vsa vbrizgana jajca razvila v odrasle samice, ki bodo eksprimirale človeško BSSL/CEL. Približno polovica sesalcev, gledano s statističnega gledišča, bodo samci, s katerimi se pa vendar v naslednjih generacijah lahko razmnožijo samice.

Ko je enkrat integrirana v spolne celice, lahko sekvenca DNA, ki kodira človeško BSSL/CEL, doseže visok nivo ekspresije, tako da proizvaja pravilno predelano in funkcionalno človeško BSSL/CEL v stabilnih pokolenjih omenjenih sesalcev.

Nadalje je zanimiva metoda proizvajanja transgenskega ne-človeškega sesalca, sposobnega ekspresije človeške BSSL/CEL in bistveno nesposobnega ekspresije svoje lastne BSSL/CEL, ki obsega: (a) uničenje sposobnosti sesalca, da eksprimira sesalčevo BSSL/CEL, tako da se v bistvu BSSL/CEL ne eksprimira in vstavitev ekspresijskega sistema po izumu, kot smo zgoraj določili, ali pa sekvence DNA, ki kodira človeško BSSL/CEL, v spolne celice sesalca na tak način, da se človeška BSSL/CEL eksprimira v sesalcu; in/ali (b) zamenjavo sesalčevega BSSL/CEL gena, ali njegovega dela, s sistemom za ekspresijo po izumu, kot smo določili zgoraj ali sekvence DNA, ki kodira človeško BSSL/CEL.

Sposobnost sesalca, da eksprimira BSSL/CEL, običajno uničimo z uvajanjem mutacij v sekvenco DNA, ki je odgovorna za ekspresijo BSSL/CEL. Take mutacije lahko obsegajo mutacije, ki postavljajo sekvenco DNA izven okvirja, ali vgraditev stop-kodona ali delecijo enega, ali več nukleotidov te sekvence DNA.

BSSL/CEL gen sesalca ali njegov del lahko zamenjamo s sistemom za ekspresijo kot smo zgoraj določili ali pa s sekvenco DNA, ki kodira človeško BSSL/CEL, uporabljajoč dobro znane principe homologne rekombinacije.

V nadaljem vidiku se ta izum nanaša na transgenskega ne-človeškega sesalca, ki ga pripravimo s zgoraj opisano metodo.

Čeprav transgenski ne-človeški sesalec izuma v svojem najširšem vidiku ni omejen na katerikoli poseben tip sesalca, bomo le-tega normalno izbrali med skupino, ki se sestoji iz miši, podgan, zajcev, ovc, svinj, koz in goved. Za industrijsko proizvodnjo človeške BSSL/CEL normalno priporočamo večje živali, take kot ovce, koze, svinje in zlasti goveda, zaradi njihove velike produkcije mleka. Vendar pa so lahko zanimive tudi miši, zajci in podgane, zaradi dejstva, da je manipulacija s temi živalmi lažja in zato ker do rezultatov s temi transgensldmih živalmi pridemo hitreje kot npr. pri govedu.

V obsegu tega izuma je tudi potomstvo transgenskega sesalca, kot smo ga zgoraj definirali, sposobno produkcije človeške BSSL/CEL.

V nadaljnem vidiku, ta izum vključuje mleko iz ne-človeškega sesalca, ki vsebuje rekombinantno človeško BSSL/CEL.

V še nadaljnem vidiku se ta izum nanaša na umetno hrano za dojenčke, ki vsebuje rekombinantno človeško BSSL/CEL, zlasti polipeptid izuma, kot smo ga zgoraj definirali. Umetno hrano za dojenčke lahko pripravimo z dodatkom rekombinantne človeške BSSL/CEL ali polipeptida, v očiščeni ali delno očiščeni obliki, normalnim sestavinam umetne hrane za dojenčke. Vendar normalno dajemo prednost pripravi umetne hrane za dojenčke pripravimo iz mleka izuma, kot smo ga zgoraj definirali, predvsem kadar je po poreklu goveje. Umetno hrano za dojenčke lahko pripravimo z običajnimi postopki in vse15 buje katerekoli nujne dodatke, take kot minerale, vitamine itn.

PRIMERI

PRIMER 1: ORGANIZACIJA GENOMA, ANALIZA SEKVENCE IN LOKALIZACIJA CEL GENA

Če ne navajamo drugače, smo uporabili standardne tehnike molekularne biologije (Maniatis et al., 1982; Ausubel et al., 1987; Sambrook et al., 1989).

Izoliranje genomskih rekombinantov

Preiskali smo dve različni človeški genomski biblioteki fagov, IDASH (Clonentech laboratories Inc., Palo Alto, Ac, USA) in XEMBL-3 SP6/T7 (Stratagene, La Jolla, Ca, USA), s hibridizacijo s plakiranjem (plaque hybridization), uporabljajoč različne subklonirane restrikcijske fragmente (Nilsson et al., 1990) kot sonde, označene s [α- P ] dCTP s tehniko oligooznačevanja (Feinberg et al., 1983).

Mapiranje (mapping), subkloniranje in sekvenciranje genomskih klonov

Pozitivne klone smo digerirali z različnimi restrikcijskinii encimi, podvrgli eketroforezi na 1% agaroznem gelu in nato prenesli z vakuumom (Pharmacia LKB BTG, Uppsala, Švedska) na najlonsko membrano. Membrano smo hibridizirali z različnimi cDNA sondami. Restrikcijske fragmente, ki so se hibridizirali s sondami, smo izolirali, uporabljajoč metodo izotahoforeze (Ofverstedt et al., 1984). Manjše fragmente, <800 bp, smo neposredno vgradili v M13mpl8, M13mpl9, M13BM20 ali M13BM21 vektorje in jih sekvencirali, uporabljajoč kot bakterijo gostitelja E. coli TG1, medtem ko smo večje fragmente subklonirali v vektorje pTZ18R ali pTZ19R, uporabljajoč kot bakterijo gostitelja E. coli DH5 α in jih nato dalje digerirali. (Tako smo proizvedli plazmide pS309, pS310 in pS451, ki smo jih uporabili v primeru 2.) Nekatere od izoliranih fragmentov smo uporabili tudi kot sonde pri hibridizaciji. Vse nukleotidne sekvence smo določili z metodo dideoksi terminacije (Sanger et al., 1977), uporabljajoč Klenow encim in bodisi M13 univerzalni starter sekvenciranja specifičnih oligonukleotidov. Informacijo o sekvenci smo dobili z avtoradiogramov s uporabo računalniškega programa MS-EdSeq, kot so opisali Sjoeberg et al. (1989). Sekvence smo analizirali s programi, ki smo jih dobili iz UWGCG paketa računalniškega programa (Devereux et al., 1984).

Podaljšanje (ekstenzija) starterja

Izolirali smo celotno RNA iz človeškega pankreasa, mlečne žleze za časa laktacije in maščobnega tkiva, s postopkom z gvanidin izotiocianat-CsCl (Chirgwin et al., 1979). Ekstenzijo starterja smo izvedli po Ausbel et al., 1978, uporabljajoč celotno RNA in protismemi (antisense) 26-memi oligonukleotid (5’-AGGTGAGGCCCAACACAACCAGTTGC-3’, nt položaj 35-58. Hibridizacijo startega z 20 pg celotne RNA smo izvršili v 30 pl 0,9 M NaCL, 0,15 M Hepes pH 7,5 in 0,3 M EDTA pri 30°C, čez noč. Po reakciji podaljšanja z reverzno transkriptazo smo produkte podaljšanja analizirali z elektroforezo skozi 6% denaturirajoči poliakrilamidni gel.

Hibridi somatičnih celic

Za kromosomsko določitev CEL gena smo uporabili DNA iz 16 človeško-glodalskih hibridnih linij somatičnih celic, ki smo jih dobili iz NIGMS Human Genetic Mutant Celi

Repositoty (Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ). Človeško-mišje hibride somatičnih celic GM09925 do GM09940 smo izvedli iz fuzij fibroblastov človeškega moškega fetusa (IMR-91) z mišjo celično linijo B-82, ki je deficientna v timidin kinazi (Taggart et al., 1985; Mohandas et al., 1986), hibride GM10324 in GM02860 s HPRT in

APRT deficientno mišjo celično linijo A9 (Callen et al., 1986), medtem ko je hibrid

GM10611 nastal iz mikrocelične fuzije celične linije človeških limfoblastov GM07890, inficiranih s retrovirusnim vektorjem SP-1, z linijo jajcevoda kitajskega hrčka UV-135 (Warburton et al., 1990). Hibridni GM10095 smo izvedli iz fuzije limfocitov samice s uravnoteženim 46, X, t (X; 9) (ql3; 34) kariotipom, s celično linijo kitajskega hrčka

CHW1102 (Mohandas et al., 1979). Vsebino človeškega kromosoma v hibridnih Unijah, ki smo jo določiU s citogenetsko analizo kakor tudi s Southeren blot analizo ter in situ hibridizacijsko analizo, smo prikazaU v tabeU 1. DNA visokih molekulskih mas, izolirane iz miši, kitajskega hrčka in človeške roditeljske ceUčne linije ter 16 hibridnih cehčnih linij, smo digeriraU z EcoRI, frakcioniraU v 0,8% agaroznem gelu in prenesU na najlonske on filtre. Z oUgooznačevanjem (Feinberg in Vogelstein, 1983) smo pripraviU [a- P ] dCTP-označeno CEL cDNA sondo (cela dolžina cDNA) in jo hibridizirali na filtre. Filtre smo vsakega spraU tekom 60 minut, pri 65°C v 6xSSC/0,5%SDS in v 2xSSC/0,5%SDS.

Polimerazna verižna reakcija

AmpUficiraU smo ekson 10 in ekson 11 celotne genomske DNA, izolirane iz levkocitov, DNA iz hibridov somatičnih cehe in iz nekaterih od pozitivnih genomskih rekombinantov, ter celotne RNA iz človeške mlečne žleze za časa laktacije in človeškega pankreasa. UporabiU smo 2 pg DNA. Uporabljene starterje navajamo v tabeli 2. Izvedli smo trideset ciklov PCR v 100 pl volumnu [10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgC^,

200 μΜ vsakega dNTP, 100 pg/rnl želatine, 100 pmol vsakega starterja, 1.5 U Taq DNA polimeraze (Perkin-Elmer Cetus, Nonvalk, CT, USA) j in pri temperaturi spajanja 55°C za vse pare starteija. Sekvenco RNA smo amplificirali uporabljajoč kombinirani metodologiji komplementarne DNA (cDNA) in PCR. cDNA smo sintetizirali iz 10 pg celotne RNA v 40 pl raztopine, ki je vsebovala 50 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 pg/ml BSA, 1 mM vsakega dNTP, 50 ng oligo (^)^2-18⁵ inhibitolja ribonukleaze in 200 U reverzne transkriptaze (MoMULV), (BRL, Bethesda Research Laboratories, Ν.Υ., USA) tekom 30 min. pri 42°C. cDNA smo oborili in resuspendirali v 25 pl H2O; 2 pl tega smo amplificirali, kot smo opisali zgoraj. Amplificirane fragmente smo analizirali na 2% agaroznem gelu. Neke od fragmentov smo nadalje subklonirali in sekvencirali.

Genska struktura človeškega CEL gena

V vsaki genomski biblioteki smo preiskali 10^ rekombinantov in s preiskavo pridobili več pozitivnih klonov, ki smo jih vse izolirali in mapirali. Dva klona, označena λ BSSL1 in λ BSSL5A, smo nadalje analizirali. Digeriranje z več restrikcijskih encimov in South-L em bloting, ki mu je sledila hibridizacija s cDNA sondami, so indicirali, da klon BSSL5A pokriva cel CEL gen ter, da klon BSSL1 pokriva 5*-polovico in približno 10 kb 5’-bočnega območja (slika 1). Skupaj ta dva klona pokrivata približno 25 kb človeškega genoma.

Po subkloniranju in digeriranju z restrikcijskimi encimi, smo pridobili ustrezne fragmente za digeriranje, ter smo lahko določili celo sekvenco CEL gena, vključno 1640 bp 5’bočnega območja in 41 bp 3’-bočnega območja. Ti podatki so odkrili, da človeški CEL gen (SEQ ID NO: 1) zajema območje, v katerem je 9850 bp in ki vsebuje 11 eksonov med katerimi se nahaja 10 intronov (slika 1). To pomeni, da so eksoni, in zlasti introni, relativno majhni. Dejansko so veličine eksonov 1-10 v območju od 87-204 bp, medtem, ko je ekson 11 dolg 841 bp. Veličina intronov je med 85 in 2343 bp. Kot se lahko opazi v tabeli 3, se vse meje ekson/intron pokoravajo AG/GT pravilu in se dobro skladajo s konsensusno sekvenco, ki so jo sugerirali Mount et al. Ko smo kodirajoči del CEL gena primerjali s cDNA (Nilsson et al., 1990) smo našli samo eno razliko v nukleotidni sekvenci; drugi nt v eksonu 1, C, ki je v cDNA sekvenci T. Ker se ta položaj nahaja 10 nt proti toku od start-kodona za translacijo ATG, ta razlika ne vpliva na sekvenco aminokislin.

Sedem članov Alu skupine repetitivnih DNA elementov je prisotnih v sekvenciranem območju, označenih Alul-Alu7(5’-3’) (slika 1), eden v 5’-bočnem območju in šest drugih znotraj CEL gena.

Položaji začetka (inicialni položaji) transkripcije in 5’-bočno območje

Da bi mapirali položaj(e) začetka transkripcije človeškega CEL gena smo izvršili ekstenzijsko analizo, uporabljajoč celotno RNA iz človeškega pankreasa, mlečne žleze za časa laktacije in maščobnega tkiva. Rezultati so nakazali glavni transkripcijski startni položaj, ki se nahaja 12 bp, ter manj pomemben startni položaj, ki se nahaja 8 baz proti toku od iniciatorja metionina. Inicialna položaja transkripcije sta v pankreasu in mlečni žlezi za časa laktacije ista, medtem ko nismo mogli odkriti nikakršnega signala v maščobnem tkivu (slika 2). Sekvencirano območje vključuje 1640 nt 5’-bočne DNA. Utemeljeno na podobnosti seskvenc TATA-boks-podobnih sekvenc, smo CATAAAT našli 30 nt proti toku od inicialnega položaja transkripcije (slika 4). V tem območju nista bili očitni niti CAAT-boks struktura niti GC boksi.

5’-bočno sekvenco smo preiskali računalniško, v obeh nizih, glede na nuldeotidne sekvence, za katere je znano, da so v drugih genih, specifičnih za mlečno žlezo oziroma pankreas, sekvence, ld vežejo faktoije transkripcije. Našli smo več domnevnih prepoznavnih sekvenc (videti sliko 4).

Kromosomska lokalizacija CEL gena

S CEL cDNA sondo smo v človeški kontrolni DNA odkrili štiri EcoRl fragmente, ki so vsebovali približno 13 kb, 10 kb, 2,2 kb in 2,0 kb, medtem ko smo v mišji in hrčkovi kontrolni DNA našli samo po en fragment, približno 25 kb, oziroma 8,6 kb. Prisotnost sekvenc človeškega CEL gena v hibridnih klonih je v korelaciji samo s prisotnostjo človeškega kromosoma 9 (tabela 1). Samo eden od 16 analiziranih hibridov je bil pozitiven za človeški CEL gen; ta hibrid je vseboval kromosom 9 kot edini človeški kromozom. Nismo našli nikakršnih nesoglasij v zvezi z lokalizacijo na tem koromosomu, medtem ko obstajajo vsaj dve neskladnosti za lokalizacijo na kateremkoli drugem kromosomu (tabela 1). Za nadaljno sublokalizacijo CEL gena smo uporabljali človeško-hrčkov hibrid (GM 10095), ld je obdržal der (9) translokacijski kromosom (9pter—*9q34:Xql3—>Xqter) kot edino človeško DNA. S Southern blot analizo nismo v tem hibridu uspeli odkriti kakršnokoli sekvenco CEL gena, kar kaže na to, da se CEL gen nahaja znotraj 9q34-qter področja.

PRIMER 2 : KONSTRUKCIJA VEKTORJEV ZA EKSPRESIJO

Za konstrukcijo vektoija za ekspresijo, z namenom proizvodnje rekombinantne človeške

CEL v mleku transgenskih živali, smo uporabili naslednjo strategijo (slika 5). ' ^v

Pridobili smo tri pTZ utemeljene plazmide (Pharmacia, Uppsala, Švedska), ki so vsebovali različne dele človeškega CEL gena, pS309, pS310 in pS311, uporabljajoč zgoraj opisane metode. Plazmid pS309 vsebuje Sphl fragment, ki pokriva CEL gen od 5’- netransk' ribiranega območja do dela četrtega introna. Plazmid pS310 vsebuje SacI fragment, ki pokriva sekvenco CEL gena od dela prvega introna do dela šestega introna. Tretji, plazmid pS311, vebuje BaznHl fragment, ki pokriva varianto CEL gena od glavnega dela petega introna in ostalo od intron/ekson strukture. V tem plazmidu je bila mutirana repetitivna sekvenca eksona 11, ki normalno kodira 16 ponovitev, tako da je kodirala skrajšano varianto, ki ima 9 ponovitev.

Drugi plazmid, pS283, ki vsebuje del človeške CEL cDNA vklonirane v plazmid pUC19 na flindlll in SacI položajih, smo uporabili za fuzijo genomskih sekvenc. pS283 smo uporabili tudi za dobijanje primernega položaja za restrikcijski encim, KpriL, ki se nahaja , v 5’-netranslirani vodilni sekvenci (leader sequence) CEL. Plazmid pS283 smo nato digerirali z Ncol in Sad in izolirali fragment dolg približno 2,7 kb. Plazmid pS309 smo digerirali z Ncol in BspEI in izolirali fragment dolg približno 2,3 kb, ki vsebuje 5’-del CEL gena. Plazmid pS310 smo digerirali z KspEI in Sad in izolirali fragment dolg približno 2.7 kb, ki vsebuje del srednjega območja CEL gena. Te tri fragmente smo ligirali in transformirali v primemo E. coli, sev TG2, ter izolirali transformante s selekcijo na ampicilin. Iz večjega števila transformantov smo pripravili in za nadaljne eksperimente uporabili eden plazmid, imenovan pS312, ki je vseboval želeni konstrukt.

Da bi dobili modifikacijo pS311, v kateri smo BamHl položaj, ki se nahaja nižje od stopkodona, pretvorili v Sall položaj, da bi olajšali nadaljne kloniranje, smo uporabili sledečo metodo. pS311 smo linearizirali z delnim digeriranjem z Ba/«HI. Lineariziran fragment smo izolirali in vgradili sintetični DNA linker (povezovalec), ki pretvori BamHl v Sall položaj (5’-GATCGTCGAC-3’), torej uniči BamHl položaj. Ker obstajata dva potencialna položaja za integracijo sintetičnega linkeija, smo nastale plazmide analizirali s cepitvijo z restrikcijskimi encimi. Plazmid, pri katerem je linker vgrajen na želenem položaju navzdol od eksona 11, smo izolirali in ga označili s pS313.

Za pridobitev strukture vektorja za ekspresijo, ki vsebuje CEL genomske sekvence in kodira skrajšano CEL varianto, smo uporabili plazmid pS314, označen da posreduje ekspresijo v mlečni žlezi za časa dobe laktacije, specifično za razvojni stadij in tkivo.

Plazmid pS34 vsebuje fragment genoma iz glodalskega gena za kisli protein sirotke (WAP) (Campbell et al., 1984), kloniran kot Noti fragment. Genomski fragment ima približno 4,5 kb proti toku regulatome sekvence, celotno transkribirano ekson/intron območje in približno 3 kb sekvence, ki se nahaja nižje od zadnjega eksona. Edini Kpnl položaj se nahaja v prvem eksonu, 24 bp proti toku naravnega začetnega kodona translacije WAP. Drugi edini položaj za restrikcijski encim je SaB, ki se nahaja v eksonu 3. V pS314 je ta položaj uničen z digeriranjem, napolnjen s uporabo encima Klenow in religacijo. Namesto tega smo vgradili nov SaB položaj neposredno navzdol od Kpnl položaja v eksonu 1. To smo izvedli z digeriranjem s Kpnl in vstavljanjem spojenih sintetičnih oligomerov SYM 2401 5’-CGTCGACGTAC-3* in SYM 2402 5’-GTCGACGGGTAC-3’ na ta položaj (slika 8). Človeško CEL genomsko sekvenco smo vgradili med ta dva položaja, Kpnl in SaB, sledeč naslednjo strategijo. Prvo, pS314 smo digerirali s Kpnl in SaB in fragment, ki predstavlja razcepljeni plazmid, izolirali z elektroforezo. Drugo, pS312 smo digerirali s Kpnl in BamHI in izolirali fragment dolg približno 4,7 kb, ki predstavlja 5’- del človeškega CEL gena. Tretje, pS313 smo digerirali z BamHI in SaB in izolirali 3’-del človeškega CEL gena. Te tri fragmente smo ligirali, transformirali v primemo bakterijo E. coli in transformante izolirali po ampicilinski selekciji. Iz več tranformantov smo pripravili plazmide in jih pazljivo analizirali z mapiranjem z restrikcijskimi encimi ter sekvenčno analizo. Določili smo plazmid, ki predstavlja želeni vektor za ekspresijo in ga označili s pS317.

Z namenom, da bi konstruirali vektor za ekspresijo genomske CEL, ki kodira celo dolžino CEL, smo pS317 modificirali na sledeči način. Prvo, plazmid pTZ18R (Pharmacia), ki vsebuje 5,2 kb BamHI fragment človeškega CEL gena, ki se rasteza od petega introna do navzdol od enajstega eksona, pS451, smo digerirali s Hindlll in Sacl. To digeriranje je povzročilo nastanek fragmenta dolgega približno 1,7 kb, ki se razteza od Hindlll položaja lociranega v intronu 9, do Sacl položaja, lociranega v eksonu 11. Drugo, plazmid pS313 smo digerirali s Sacl in SaB ter izolirali fragment dolg 71 bp, ki vsebuje 3’-del eksona 11 in nastali položaj Salpl. Tretje, ostalo od sekvenc rekombinantnega WAP/CEL gena in plazmida smo izolirali kot SaB/HindBB fragment približno 20 kb iz pS317. Te tri fragmente smo ligirali in transformirali v bakterije. Iz več transformantov smo pripravili plazmide. Plazmide smo digerirali z različnimi restrikcijskimi encimi in jih podvrgli analizi sekvence. Določili smo plazmid, ki je vseboval želeni rekombinantni gen. Ta končni vektor za ekspresijo smo označili s pS452 (slika 7).

pS452 smo digerirali z Noti. Nato smo z elektroforezo na agarozi izolirali element rekombinantnega vektorja, ki je vseboval sekvenco glodalskega WAP, bočno glede na človeški CEL genomski fragment. Izolirani fragment smo nadalje očistili z elektroelucijo, preden smo ga injicirali v embrij miša.

Rekombinantni WAP/CEL gen za ekspresijo v mlečni žlezi transgenskih živali prikazujemo na sliki 8.

DEPOZITI

Sledeče plazmide smo vložili, skladno z Budimpeštansko pogodbo, pri DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen un Zeilkulturen):

Plazmid	Depozit št.
pS309	DSM 7101
pS310	DSM 7102
pS45l	DSM 7498
pS452	DSM 7499

Datum depozita

12. juni 1992

26. februar 1992

PRIMER 3: IZVAJANJE TRANSGENSKIH ŽIVALI

Iz plazmida pS452, po primeru 2, smo izolirali Noti fragment. Ta fragment DNA je vseboval glodalški promotor WAP, vezan na genomsko sekvenco, ki kodira človeško BSSL/CEL. Izolirani fragment smo injicirali, v koncentraciji 3 ng/ul, v projedro 350 C57Bl/6JxCBA/2J-f2 embrija, dobljenega od miši donoija, pripravljene za superovulacijo s 5 IU gonadotropina seruma nosne kobile. C57Bl/6JxCBA/2J-fj živali smo dobili iz Bomholtgard Breeding and Research Centre Ltd, Ry, Denmark. Potem, ko smo embrije zbrali iz jajcevoda, smo jih ločili od kumulusnih celic z obdelavo s hialuronidazo v gojišču M2 (Hogan et al., 1986). Po spiranju smo embrije prenesli v gojišče Ml6 (Hogan et al., 1986) in jih pustili stati v inkubatorju s 5% CO2 atmosfero. Injiciranje smo izvršili v mikrokapljici M2 pod lahkim parafinskim oljem, uporabljajoč Narishigi hidravlične mikromanipulatoije in Nikonov inverzni mikroskop opremljen z Nomarski optiko. Po injiciranju smo embrije, ki so izgledali zdravi, implantirali v lažnonosne C57Bl/6JxCBA/2J22 f| recipiente, ki smo jim intraperitonealno dali 0,37 ml 2,5% Avertina (raztopina tribromoetanola v amilen hidratu, 1 g/ml, ki se uporablja kot anestetik). Miši, ki so integrirale transgen, smo določili s PCR analizo DNA iz vzorcev biopsije repa, ki smo jih dobili tri tedne po rojstvu živali. Pozitivne rezultate smo potrdili s Southeren blot analizo.

PRIMER 4: EKSPRESIJA BSSL/CEL V TRANSGENSKIH MIŠIH

Transgenske miši smo določili z analizo DNA, ki smo jo pripravili iz vzorcev izrezanih iz repa. Vzorce tkiva smo inkubirali s proteinazo K in ekstrahirali s fenol/kloroformom. Izolirano DNA smo uporabili v polimeraznih verižnih reakcijah s starterji, ki amplificirajo specifične fragmente, če je prisotna heterologna vstavljena DNA, ki predstavlja fragment vektoija za ekspresijo. Živah smo analizirali tudi s eksperimenti hibridizacije DNA, da bi potrdili podatke, pridobljene s PCR; to smo naredili tudi, da bi testirali strukturo integriranih elementov vektoija glede na možne preureditve, ter dobili informacijo o številu kopij integriranih elementov vektoija.

V eni seriji eksperimentov smo analizirali 18 miši s tema dvema metodama, rezultati pa so pokazali, da 1 miš nosi vektorski element heterologne DNA, izveden iz pS452. Rezultati PCR analize in eksperimentov hibridizacije so bili enaki (slika 9).

Miš, za katero smo določili, da nosi vektorski element DNA (začetna žival), smo potem parih in Fl zarod analizirali na transgen z istimi postopki.

Doječim samicam smo intraperitonealno injicirali 2 IU oksitocina in jih 10 minut kasneje intraperitonealno anestezirali z 0,40 ml 2,5% Avertina. Na prsno bradavico smo preko sihkonizirane cevi priključili napravo za zbiranje mleka in mleko zbirali v 1,5 ml Eppendorf epruvete ob blagi masaži mlečne žleze. Količina mleka se je spreminjala, odvisno od dneva laktacije, med 0,1 in 0,5 ml na miš, ter zbiranja.

Analizo prisotnosti rekombinantne človeške BSSL/CEL smo naredili s SDS-PAGE, prenosom na nitrocelulozne membrane in inkubacijo s pohklonskimi protitelesi proizvedenimi proti nativni človeški BSSL/CEL. Dobljeni rezultati so pokazali ekspresijo rekombinantne človeške BSSL/CEL v mleku transgenskih miši. Slika 10 kaže prisotnost rekombinantne človeške BSSL/CEL v mleku transgenskih miši: trak pri približno 116,5.

Razmnožili smo stabilne linije transgenskih Živah.

Na podoben način lahko pridobimo druge transgenske živali, take kot krave ali ovce, spo sobne ekspresije človeške BSSL/CEL.

LITERATURA

Abouakil, N., Rogalska, E., Bonicel, J. & Lombardo, D. (1988): Biochim. Biophys. Acta 961, 299-308.

Ausubel, F.M., Brent, R.E., Moore, D.D., Smiyh, J.A., Seidman, J.G. and Struhl, K.: Current Protocols in Molecular Biology. (Wiley Interscience, New York 1987)

Baba, T., Downs, D., Jackson, K.W., Tang, J. and Wang,

C.S. (1991): Biochemistry 30, 500-510.

Beato, M. (1989): Celi 56, 335-344.

Bernback, S., Blackberg, L. & Hernell, O. (1990): J. Ciin. Invest. 221-226.

Bjorksten,B., Burman, L.G., deChateau, P., Fredrikzon, B., Gothefors, L. & Hernell, O. (1980): Br. Med. J. 201, 267-272.

Blackberg, L., Angquist, K.A, & Hernell, O. (1987): FEBS Lett. 217, 37-41.

Blackberg, L. & Hernell, O. (1981): Eur. J. Biochem 116, 221-225.

Blackberg, L. Lombardo, D., Hernell, O., Guy, O. & Olivecrona, T. (1981): FEBS Lett. 136, 284-288.

Boulet, A.M., Erwin, C.R. and Rutter, W.J. (1986): Proč. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 3599-3603.

Brinster, R.L., Allen, J.M., Behringer, R.R., Gelinas, R.E. & Palmiter, R.D. (1988): Proč. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 836-840.

Callen, D.F. (1986): Ann. Genet. 29, 235-239.

Campbell, S.M., Rosen, J.M., Hennighausen, L.G., Strech-Jurk, U. and Sippel, A.E. (1984): Nucleic Acid Res. 12, 8685-8697.

Chirgwin, J.M., Przybyla, A.E., MacDonald, R.J. and Rutter, W.J. (1979): Biochemistry 18, 5294-5299.

Clark, A.J., Simons, P., Wilmut, I. and Lahte, R. (1987): TIBTECH 5, 20-24.

Devereux, J., Haeberli, P. and Smithies. (1984):

Nucleic Acids Res. 12, 387-395.

Feinberg, A. and Vogelstein, B. (1983): Anal. Biochem. 132, 6-13.

Hennighausen, L., Ruiz, L. & Wall, R. (1990): Current Opinion in Biotechnology 1, 74-78.

Hernell, O. & Blackberg, L. (1982): Pediatr. Res. 16, 882-885.

Hogan, B., Constantini, F. and Lacy, E. (1986): Manipulating the mouse embryo. A Laboratory Manual.

Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Hui, D. and Kissel, J.A. (1990): Febs Lett. 276, 131134.

Lombardo, D., Guy, O. & Figarella, C. (1978): Biochim. Biophys. Acta 527, 142-149.

Maniatis, T., Fritsch, E.F. & Sambrook, J.: Molecular Cloning. A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor, NY, 1982)

Mohandas, T., Sparkes, R.S., Sparkes, M.C., Shulkin, J.D., Toomey, K.E. and Funderburk, S.J. (1979): Am. J. Hum. Genet. 31, 586-600.

Mohandas, T., Heinzmann, C., Sparkes, R.S. Wasmuth, J., Edwards, P. and Lusis, A.J. (1986): Somatic Celi. Mol. Genet. 12, 89-94.

Mount, S.M. (1982): Nucleic Acids Res. 10, 459-472.

Nilsson, J., Blackberg, L., Carlsson, P., Enerback, S., Hernell, O. and Bjursell, G. (1990): Eur. J. Biochem. 192, 543-550.

Qasba, M., and Safaya, S.K. (1984): Nature 308, 377380.

Reue, K., Zambaux, J., Wong, H., Lee, G., Leete, T.H., Ronk, M., Shively, J.E., Sternby, B., Borgstrčm, B., Ameis, D. and Schotz, M.C. (1991): J. Lipid. Res. 32, 267-276.

Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T.E.: Molecular Cloning. A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor, NY, 1989)

Sanger, F., Nicklen, S. and Coulson, A.R. (1977): Proč Nati. Acad. Sci. U.S.A. 74, 5463-5467.

Sjčberg, S., Carlsson, P., Enerback, S. and Bjursell, G. (1989): Comput. Appl. Biol. Sci. 5,41-46.

Taggart. R.T., Mohandas, T., Shows, T.B. and Bell, G.I (1985): Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 82, 6240-6244.

Warburton, D., Gersen, S., Yu, M.T., Jackson, C., Handelin, B. and Housman, D. (1990): Genomics 6, 358366.

Whitelaw et al. (1991): Transgenic Research 1, 3-13.

Yu-Lee, L., Richter-Mann, L., Couch, C., Stewart, F., Mackinlay, G. and Rosen, J. (1986): Nucleic. Acid. Res 14, 1883-1902.

Ofverstedt, L.G., Hammarstrčm, K., Balgobin, N., Hjerten, S., Petterson, U. and Chattopadhyaya, J. (1984): Biochim. Biophys. Acta 782, 120-126.

<:

Li >_4

J

U

O O o 00 o

CM

CC

CD O CD O CM cm

CM

O O CM MD O O

MD

MD c—

ΓΟΟ oo — co

Γ- —.

c\ o o

O

CM oo

O o uo

-ii rr o

ml xii

X •a

3>

I υ

<3 χ

i <D

S i—1 >o o

s a

D

W

J ω

u §

<

H

O

CC

O >00 ω

>

O

J

Ό co

U

1-H

J

M

U ω

H

O

H co

Q

O

MD

VC

CM

OO

MD vc

CC

CM

S o

co

O

S g

M

o

o

o

CM OO

CM 08

rr 08

08 oo

08

O

o

MD Γ—

©

©

o

©

©

-li

rr 00

08 oo

ec

CM CM

O

CM ec

cr

08

rr CM

o

O oo

©

o

o

©

o

MD rr

Γ- ΟΟ

CM

O

CM

o 00

o

-

rT rT

o

rr

o

©

o

©

o

m(£

Ό 08

rr r—

O

oo Γ—

O

O Γ-

o 00

08 vc

O

X X

o

©

©

o

©

©

ooli

O

©

OO

—«

MD

MD

MD

ΟΟ

o

rr

o

X

CM

©

©

©

_

ml x

08

oo

08

00

08

oo

08

o

CA

08

•—

o

—*l ~·

rf

o

O

O

o

o

o

O

o

o

o

o

©

oo 08

o

o

CMli

00 (>

o 08

CM

CM

o

CM 08

08 00

o

CM

o X

rr

n) X

©

o

©

o

-ii

MD 00

08 r—

08 vc

CM OO

o

00 r—

CM

CM r—

oo 00

© m

o oo

©

©

o

©

©

©|X

MD

O vc

O CM rr cm rr oo

CM

MD O CM vc r— cm 00 CM

O O O

CM CM rr CZ mi ©IX

rr

O

rr rr

X

oo CM

CD

Γ- Γ-

©

Tt m

o

MD rr

©

©

© ·

' ©

©

xi i

o

CM 00

O

O

CM

MD

Ο

00

X

rr

o

©

o

©

©

©

CMli

o

O

o

©

O

CD

O

o

©

CD

o

©

o

©

CA X

X Tt σ'

o|i

oo r—

rr r—

08

Tf

o oo

rr vc

00

©

O

O r—

rr

CM X

o

O

o

©

©ii

CM 00

08 r—

CM

X cm

o

CM 08

rr

©

© c-

rr vc

MD OO

Tt 00

©

©

O

©

oMi

O \O

rr 08

rr rr

©

MD rr

MD C-

08 r—

CM

X Tt

CM MD

00 00

©

©

©

©

©

©jX

MD Γ—

O

CD

'cm

MD 00

rf vc

rr oo

OC cm

O

CD

O MD

©

©

©

o

©

-ii

rr r—

r- r-

08 VC

Tt

oo MD

MD

o

©

00

oo rr

00 00

©

©

©

©

©

-ii

O

vc c-

MD

m X

O

rt oo

o

CM «n

©

rr vc

CM

X Tt

©

©

©

©

ooli

rr CM

rr 00

O

Tt m

o

O

o vc

©

o

O

O

©

©

©

©

©

m|i

rt Γ—

08 mD

CD

o

o

O vc

O

©

o

O

o

©

©

o

o

©

ΤΤΙ2Ξ

<

<

vc

c*

08

©

CM

rT

rr

vc

MD

r^·

oo

o

rr

r*-

in

CM

CM

CM

m

ΓΤ

rT

rr

rr

m

rr

rr

rr

CM

80

—«

CA

08

08

08

CA

08

08

08

08

08

08

08

08

rr

vc

80

©

08

<08

08

CA

08

08

08

08

08

o

08

08

o

O

O

O

O

O

O

©

O

O

o

O

O

O

O

o·

1—1

»X

1-

s

S

Σ

s

s

s

s

s

s

Σ

s

s

s

s

s

s

o

o

O

O

o

CJ

CJ

□

CJ

CJ

CJ

CJ

C)

CJ

CJ

CJ

U) g

υ

-§ o

^lNa splošno mora biti človeški kromosom prisoten v več kot 20 do 22% celic, ki jih določimo s Southeren blot analizo ’ Vsebuje 9pter->q34 in Xql3->qter te x

α §

υ >

u

Cu

co	CN	cn	in	cn	CM
o	<0	m	m	o
in	<0	CM	o	t—f	Γ
co I	CO 1	l> 1	cn 1	cn I	CTi 1
1 (N	1 vo	1 o	{ vo	1 cn	1 CM
CT\		CM	(—1	co	CM
	vo	CM	o	o
00	co	r-	ΟΊ	cn	CTi

Λ ¢)

I =

Cl

ELA 2 a

o

ΖΣ?

i

4A §

H co

Ό ‘€ υ

S oo

		m 1 O	m 1 CD	m 1 U CD	n t CJ F
m	m	CD	Eh	<	F
1	1	Eh	Eh	CJ	U
O	CD	U	CD	CD	CD
U	U	U	u	tf	tf
CJ	tf	Eh	tf	CJ	CD
CJ	U	u	U	CD	F
tf	U	u	CJ	CD	CJ
F	tf	F	CJ	CD	F
O	O	o	CD	F	tf
U	u	O	CJ	tf	CJ
O	o	Eh	F	CD	CD
u	o	O	CD	tf	CD
tf	tf	Eh	<	tf	tf
F	E-·	tf	CD	CD	U
O	O	O	U	tf	CD
u	tf	U	U	tf	F
tf	U	U	CD	U	U
u	U	tf	tf	CJ	tf
tf J	Eh J	CD J	CJ 1	tf |	CD |
m	in	tn	in	in	in

• ·	·.	·«	• ·	• ·	··
r-t	CM	tj»	in	LD	Γ-
04	0u	04	04	Λ	04

& -5 tS3 'Za amplifikacijo eksona 10 iz cDNA

X) cn

T

S

D >

a i

$ o

c3

O «

Λ s

¢5 a

w *

cn

S

K o

o «j 'S¹ co ’O ir. S §

Ό

m	in	r-	co		CN	10		r—i	CO
rf	co	r-	co	t>	rf	10	ch	o	CN
m		CN	CN	i—1	1-1	rf	rd	CN	m
CN			rd			i—1		r*4

hd

M

H >

υ	o	υ	Ε-	U	ο	ο	υ	υ	u
u	Ε-	υ		υ		Ε-		υ	u
o	υ	υ	Ε-	Ε-	u		Ο	u	υ
u	υ	υ	υ	υ	Ε-	U	Ο	Ε-	u
u	υ	υ		Ε-	υ	U		υ
o	4	Ε-		υ	ο	υ	ο		ο
o	υ	υ	Ε-	υ	ο	u	ο	ο	ο
E	ο	Ε-	Ο	υ	Ε-
υ					Ο
cn	σ>	D)	Οι	σι	σ>	σ>	σι	σι	σι
Itf	(0	β	ιβ	«S	-β	nj	-0	ια
o	υ	υ	ϋ	4J	υ	0	υ	υ	ο
Dl	σι	-Μ	ϋ	σι	υ	U	υ	υ	σι
u	4J	0	υ	υ	υ	υ	υ	JJ	4J
JJ	υ	-U	□	υ	υ	Ιί	σ	ϋ	υ
u	υ	(β	ϋ	u	u	0	υ	ο	4J

ω oo

J

W

U

C8

C «J £

J 'f ω

υ	(Π	υ	σι	4-1	0)	u	4-1	υ	0
υ	υ	υ	4-1	σι	4->	υ	4-1	U	ti
-U	υ	U	υ	0)	u	4-1	ti	4-1	υ
U	σι	U	0	a	4-1	υ	Ol	0	4-1
4-1	4J	υ	u	4->	4J	4J	4-1	4-1	u
0)	υ	4-1	σι	u	01	u	4-1	u	4-1
4-1	υ	υ	Ρ	4-1	Di	Dl	υ	4J	4J
σι	4J	σι	u	-D	4->	Oi	ti	01	υ
ti	ti	υ	Ρ	Dl	□	4-1	υ	Dl	ti
σι	σι	σι	σι	U	ti	Di	Dl	0>	Oi
ti	m	4-1	ο	4-1	«J	ti	ti	ti	ti
ti	σι	υ	σι	υ	ti	Dl	ti	Oi	ti
4J	4-1	4J	4-1	4-1	4-1	4-1	4-1	4J	4J
σι	σι	σι	σι	Dl	Ol	Dl	D)	Dl	Oi
ο				O	o
				C			<		0
	ο	ο	Ο	U		E-	U		U
ο	d	3		P	rf	O	C3	U	c
U			u	F-	|CT	<	U	U	u
U	υ	υ	U	U	«i	u	<c	O
U	η	ο	0	E·	u	o	u	E-	<·
υ	Ρ		Ε-	U	u	E-	E-	3	jrf
ο	Ε-		U	E-	o	U	O
ιη	Ο	rd	ιο	rf	Ό	σ\	m	co	IO
ΓΝ	ιη	rf	Ό	rf	o	m		IO	ID	rf
		--,				--		—		CN
ιη	ιη	10	ΓΝ	io	CN	rd	rf	CN	00	in
ΓΝ		t—1	00	CN	Ό	O	Ό	m	cn	rf
		rd	rd	CN	CN	n	m	rf	rf	C*·
t—1	ιό	ΙΟ	Γ*	Γ0	r-	m	CN	in	m	Ch
	ΓΝ		rd	00	CN	Ό	O	ID	m	Ch
			t—l	t—l	CN	CN	m	m	rf	rf
	τ—1	ΓΟ	co	rd	CO	CO	r-	rf	00	t—1
C0	ιη	ΓΝ	cn	m	O	r-i	00	o	σι	rf
	t—l	rd	t—I	t—1	i—l	t—l	rd	CN	t—l	00
	t—l	σ\	rf	m	00	ω	rd	CN	t—l	O
00	00	00	Ό	00	IO	ΓΝ	00	00	00	in
	ιη		CN	io	Ch	CN	co	CN	io	co
	ΓΝ	ΓΝ	m	rf	rf	in	10	Γ'	co	Ch
rd	rd	C	E-	m	rd	r-i	in	Ch	rf	o
	ΓΟ	10	Ό	in	Ό	t—l	<h		CO	rd
	rf	ΙΟ	O	in	CO	t—l	10	O	rf	O
	OJ	ΓΝ	n	rf	<f	in	10		00	Ch
rd	ΓΝ	Γ0	rf	in	IO	r-	00	σι	O	rd

Položaj nukleotidov je podan kot število baz od starta prvega eksona.

Za primeqavo položaja nukleotida s SEQ ID NO: 1 je potrebno številki v stolpiču dodati 1640 baz.

<0

OPIS SLIK

SHka 1

Položaj CEL gena. Prikazujemo lokalizacijo in karto (map) dveh klonov, ki se delno prekrivata, IBS SLI in IBSSL5A, dobljeno z restrikcijskimi encimi. Pod tem prikazujemo ekson/intronsko organizacijo in mesto uporabljenega restrikcijskega enzima. Eksone smo predstavili s hišicami, ki smo jih oštevilčili 1-11. Asp=Av//700, B=Ba/«HI, E=EcoRI, S=SacI, Sa=Sa/I, Sp=Sp/tI, in X=XZwI. S zadebelenimi strelicami prikazujemo položaj in orientacijo repetitivnih elementov Alu. a-h predstavljajo različne podklonirane fragmente.

Slika 2

Analiza RNA iz človeške mlečne žleze tekom laktacije, pankreasa in maščobnega tkiva, z ekstenzijo starteqa (primer-a). Za start reverzne transkripcije RNA smo uporabili na koncu radioaktivno označen 26-memi oligonukleotid, ki je komplementaren nt položajem 33 do 58 CEL gena. Trak A je marker molekulske veličine (zanka sekvenciranja), trak B pankreasna RNA, trak C RNA maščobnega tkiva in trak D RNA mlečne žleze za časa laktacije.

Slika 3

Aanliza z registriranjem v obliki točk (dotplot analiza) 5’-bočnih območij človeškega in podganjega CEL gena. Homologna območja smo označili A-H in napisali sekvence, ki predstavljajo te dele, zgoraj je človeška in spodaj podganja.

Stika 4

Analiza 5’-bočne sekvence človeškega CEL gena. Domnevne sekvence prepoznanja so bodisi povdarjeno podčrtane, bodisi podčrtano predstavlja komplementarni niz. Masne črke kažejo lege homologij z rCEL (območja A-H). TATA-skupino smo podčrtali s pikami.

Obstajata dve sekvenci, ki obe kažeta 80% podobnost s konsensusnimi sekvenci vezavnega mesta glukokortikoidnega receptoma, GGTACANNNTGTTCT, (Beato, M., 1989), prva na komplementarnem nizu na nt položaju -231 (IA) in druga na nt položaju -811 (IB). Poleg tega se na nt položaju -861 (2) nahaja sekvenca, ki kaže 87% podobnost konsensusni sekvenci vezavnega mesta estrogenskega receptorja, AGGTCANNNTGACCT, (Beato, M., 1989).

Lubon in Henninghausen (1987) sta analizirala promotor in 5’-bočno sekvenco gena kislega proteina sirotke (WAP) in dognala vezavna mesta za jedrne proteine mlečne žleze za časa laktacije. Eno med njimi, 11 bp konservirana sekvenca, AAGAAGGAAGT, je prisotna v več proučevanih genih mlečnih proteinov, npr. v podganjem a-laktalbuminskem genu, (Qasba et al., 1984) in podganjem α -kazeinskem genu (Yu-LEE et al., 1986). V 5’-bočnem območju CEL gena, na komplementarnem nizu na nt položaju -1299 (3) se nahaja sekvenca, ki kaže 82% podobnost tej konservirani sekvenci.

Pri proučevanju regulacije β-kazeinskega gena so v jedrnih ekstraktih iz nosnih ali doječih miši našli tkivno specifičen činitelj mlečne žleze (mammary gland factor - MGF) ter identificirali njegovo prepoznavno sekvenco (ANTTCTTGGNA). V 5’-bočnem območju človeškega CEL gena se nahajata dve sekvenci, ena na komplementarnem nizu na nt položaju -368 (4A) in druga na nt položaju -1095 (4B), obe pa kažeta 82% podobnost s konsensusno sekvenco MGF vezavnega mesta. Poleg teh dveh domnevnih vezavnih mest MGF v 5’-bočnem območju obstaja tudi sekvenca na komplementarnem nizu na nt položaju 275 v inronu I, AGTTCTTGGCA, ki kaže 100% identičnost s konsensusno sekvenco na MGF vezavnem mestu.

Poleg tega obstajajo štiri sekvence, ki vse kažejo 65% podobnost konsensusnim sekvencam specifičnega pospeševalnega elementa iz podganjega pankreasa, CTCACCTGTGCTTTTCCCTG, (Bouler et al., 1986), ena na nt položaju -359 (5A), druga na nt položaju -718 (5B), tretja na nt položaju -1140 (5C) in zadnja na nt položaju -1277 (5D).

Slika 5

Metoda proizvodnje plazmida pS452. Za nadaljne podrobnosti videti primer 2.

Slika 6

Shematska struktura plazmida pS312.

Slika 7

Shematska struktura palzmida pS452.

Slika 8

Fizična karta, ki predstavlja fizično vstavitev človeške BSSL/CEL genomske strukture v prvi ekson WAP gena, kot smo opisali v primeru 2.

SUka 9

A. Shematska predstavitev lokalizacije PCR-starterja, ki smo ga uporabili za identifikacijo transgenskih živali. 5’-starter se nahaja v WAP sekvenci, začevši na položaju -148 bp pred fuzijo med WAP in BSSL/CEL. 3’-starter se nahaja v prvem intronu BSSL/CEL, ki se končuje 398 bp po točki fuzije.

B. Sekvence PCR starteijev, ki smo jih uporabili.

C. Agarozni gel, ki kaže tipično analizo PCR analize potencialnih začetnih živali. M: markeiji molekulskih mas. Trak 1: kontrola PCR-produkta izvedenega iz plazmida pS452. Trakovi 2-13: PCR reakcije izpeljane s pripravki DNA iz potencialnih začetnih živali.

SUka 10

Analiza z imunomadeži (immunoblot analysis) mleka seva miši, ki so transgenske za rekombinantni glodalski WAP/človeški CEL gen pS452. Proteine smo ločili na SDSPAGE, prenesli na Immobilon membrane (Millipore) in vizualizirali s poliklonskimi zajčjimi protitelesi, ki smo jih proizvedli uporabljajoč zelo očiščeno človeško nativno CEL, potem pa svinjski proti-zajčji IgG, označen z alkalno fosfatazo (Dakopatts). Trak 1, markerji niških molekulskih mas, 106, 80, 49.5, 32.5, 27.5, oziroma 18.5 kDA. Trak 2, markeiji visokih molekulskih mas, 205, 116.5, 80, oziroma 49.5 kDA. Trak 3, 25 ng očiščene nerekombinantne CEL iz človeškega mleka. Trak 2, 2 μϊ vzorca mleka iz CEL transgenske miši, razredčen 1:10. Traka 5 in 6, po 2 pl vzorcev mleka dveh različnih neCEL transgenskih miši, razredčenih 1:10, kot kontrolnih vzorcev.

SEZNAM SEKVENC

INFORMACIJE ZA SEQ ID NO: 1:

(i) ZNAČILNOSTI SEKVENCE (A) DOLŽINA: 11531 parov baz (B) TIP: nukleinska kislina (C) ŠTEVILO NIZOV: dvojno (D) TOPOLOGIJA: linearna (ii) VRSTA MOLEKULE: DNA (genomska) (vi) PRVOTNI VIR:

(A) ORGANIZEM: Homo sapiens (F) VRSTA TKIVA: Mlečna žleza (ix) ODLIKE:

(A) IME/KLJUČ: CDS (B) POLOŽAJ: Spajanje (1653..1727, 4071..4221, 4307..4429, 4707

..4904, 6193..6323, 6501..6608, 6751..6868, 8335 ..8521, 8719..8922, 10124..10321, 10650..11394) (ix) ODLIKE:

(A) IME/KLJUČ: mat_peptid (B) POLOŽAJ: spajanje (1722..1727, 4071..4221, 4307..4429, 4707

..4904, 6193 ..6323, 6501..6608, 6751..6868, 8335 -.8521, 8719..8922, 10124..10321, 10650..11391) (D) DRUGE INFORMACIJE: /ECjtevilka = 3.1.1.1 /produkt = Lipaza stimulirana s solmi žolčnih kislin (ix) ODLIKE:

(A) IME/KLJUČ: 5'UTR (B) POLOŽAJ: 1..1640 (ix) ODLIKE:

(A) IME/KLJUČ: TATA_signal (B) POLOŽAJ: 1611..1617 (ix) ODLIKE:

(A) IME/KLJUČ: ekson (B) POLOŽAJ: 1641..1727 (ix) ODLIKE:

(A) IME/KLJUČ: ekson (B) POLOŽAJ: 4071..4221 (ix) ODLIKE:

(A) IME/KLJUČ: ekson (B) POLOŽAJ: 4307..4429 (ix) ODLIKE:

(A) IME/KLJUČ: ekson (B) POLOŽAJ: 4707..4904 (ix) ODLIKE:

(A) IME/KLJUČ: ekson (B) POLOŽAJ: 6193..6323 (ix) ODLIKE:

(A) IME/KLJUČ: ekson (B) POLOŽAJ: 6501..6608 (ix) ODLIKE:

(A) IME/KLJUČ: ekson (B) POLOŽAJ: 6751..6868 (ix) ODLIKE:

(A) IME/KLJUČ: ekson (B) POLOŽAJ: 8335..8521 (ix) ODLIKE:

(A) IME/KLJUČ: ekson (B) POLOŽAJ: 8719..8922 (ix) ODLIKE:

(A) IME/KLJUČ: ekson (B) POLOŽAJ: 10124..10321 (ix) ODLIKE:

(A) IME/KLJUČ: ekson (B) POLOŽAJ: 10650..11490 (ix) ODLIKE:

(A) IME/KLJUČ: 3’UTR (B) POLOŽAJ: 11491..11531 (ix) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 1:

GGATCCCTCG

AGCCTGGGTG

CCGGGTGATA

AACCCAGGAG

ACAGAGACCC

ATGACATGTC

TTCAAGACTG

TGTCTCAAAA

AATGTGGATT

CAGTGAGCTA

AAACAAACAA

CATCAGGTGT

TGATTGTGCC

ACAAAAAACC

TAACAGCTGT

ACTGCACTCT

TCTGTGGACT

ACCCCCTGGT

120

180

GGGGGATGTT	GATAACGGGG	GAGACTGGAG TGGGGCGAGG ACATACGGGA AATCTCTGTA	240
ATCTTCCTCT	AATTTTGCTG	TGAACCTAAA GCTGCTCTAA AAATGTACAT AGATATAAAC	300
TGGGGCCTTC	CTTTCCCTCT	GCCCTGCCCC AGCCCTCCCC CACCTCCTTC CTCTCCCTGC	360
TGCCTCCCCT	CTGCCCTCCC	CTTTCCTCCT TAGCCACTGT AAATGACACT GCAGCAAAGG	420
TCTGAGGCAA	ATGCCTTTGC	CCTGGGGCGC CCCAGCCACC TGCAGGCCCC TTATTTCCTG	480
TGGCCGAGCT	CCTCCTCCCA	CCCTCCAGTC CTTTCCCCAG CCTCCCTCGC CCACTAGGCC	540
TCCTGAATTG	CTGGCACCGG	CTGTGGTCGA CAGACAGAGG GACAGACGTG GCTCTGCAGG	600
TCCACTCGGT	CCCTGGCACC	GGCCGCAGGG GTGGCAGAAC GGGAGTGTGG TTGGTGTGGG	660
AAGCACAGGC	CCCAGTGTCT	CCTGGGGGAC TGTTGGGTGG GAAGGCTCTG GCTGCCCTCA	720
CCCTGTTCCC	ATCACTGCAG	AGGGCTGTGC GGTGGCTGGA GCTGCCACTG AGTGTCTCGG	780
TGAGGGTGAC	CTCACACTGG	CTGAGCTTAA AGGCCCCATC TGAAGACTTT GTTCGTGGTG	840
TTCTTTCACT	TCTCAGAGCC	TTTCCTGGCT CCAGGATTAA TACCTGTTCA CAGAAAATAC	900
GAGTCGCCTC	CTCCTCCACA	ACCTCACACG ACCTTCTCCC TTCCCTCCCG CTGGCCTCTT	960
TCCCTCCCCT	TCTGTCACTC	TGCCTGGGCA TGCCCCAGGG CCTCGGCTGG GCCCTTTGTT	1020
TCCACAGGGA	AACCTACATG	GTTGGGCTAG ATGCCTCCGC ACCCCCCCAC CCACACCCCC	1080
TGAGCCTCTA	GTCCTCCCTC	CCAGGACACA TCAGGCTGGA TGGTGACACT TCCACACCCT	1140
TGAGTGGGAC	TGCCTTGTGC	TGCTCTGGGA TTCGCACCCA GCTTGGACTA CCCGCTCCAC	1200
GGGCCCCAGG	AAAAGCTCGT	ACAGATAAGG TCAGCCACAT GAGTGGAGGG CCTGCAGCAT	1260
GCTGCCCTTT	CTGTCCCAGA	AGTCACGTGC TCGGTCCCCT CTGAAGCCCC TTTGGGGACC	1320
TAGGGGACAA	GCAGGGCATG	GAGACATGGA GACAAAGTAT GCCCTTTTCT CTGACAGTGA	1380
CACCAAGCCC	TGTGAACAAA	CCAGAAGGCA GGGCACTGTG CACCCTGCCC GGCCCCACCA	1440
TCCCCCTTAC	CACCCGCCAC	CTTGCCACCT GCCTCTGCTC CCAGGTAAGT GGTAACCTGC	1500
ACAGGTGCAC	TGTGGGTTTG	GGGAAAACTG GATCTCCCTG CACCTGAGGG GGTAGAGGGG	1560
AGGGAGTGCC	TGAGAGCTCA	TGAACAAGCA TGTGACCTTG GATCCAGCTC CATAAATACC	1620
CGAGGCCCAG	GGGGAGGGCC	ACCCAGAGGC TG ATG CTC ACC ATG GGG CGC CTG Met Leu Thr Met Gly Arg Leu -23 -20	1673
CAA CTG GTT GTG TTG GGC CTC ACC TGC TGC TGG GCA GTG GCG AGT GCC	1721

Gin Leu Val Val Leu Gly Leu Thr Cys Cys Trp Ala Val Ala Ser Ala -15 -10 -5

GCG AAG GTAAGAGCCC AGCAGAGGGG CAGGTCCTGC TGCTCTCTCG CTCAATCAGA 1777

Ala Lys

TCTGGAAACT TCGGGCCAGG CTGAGAAAGA GCCCAGCACA GCCCCGCAGC AGATCCCGGG 1837

CACTCACGCT CATTTCTATG GGGACAGGTG CCAGGTAGAA CACAGGATGC CCAATTCCAT 1897

TTGAATTTCA GATAAACTGC CAAGAACTGC TGTGTAAGTA TGTCCCATGC AATATTTGAA 1957

ACAAATTTCT ATGGGCCGGG CGCAGTGGCT CACACCTGCA ATCCCACCAG TTTGGGAGGC 2017

CGAGGTGGGT	GGATCACTTG	AGGTCAGGAG	TTGGAGACCA	GCCTGGCCAA	CATGGTGAAA	2077
CCCCGTCTCT	ACTAAAAATA	CAAATATTAA	TCGGGCGTGG	TGGTGGGTGC	CTGTAATCCC	2137
AGCTACTCGG	GAGGCTGAGG	CAGGAGAACC	GCTTGAAGCT	GGGAGGTGGA	GATTGCGGTG	2197
AGCTGAGATC	ACGCTACTGC	ACTCCAGCCT	GGGTGACAGG	GCGAGACTCT	GTCTCAAAAA	2257
ATAGAAAAAG	AAAAAAATGA	AACATACTAA	AAAACAATTC	ACTGTTTACC	TGAAATTCAA	2317
ATGTAACTGG	GCCTCTTGAA	TTTACATTTG	CTAATCCTGG	TGATTCCACC	TACCAACCTC	2377
TCTGTTGTTC	CCATTTTACA	GAAGGGGAAA	CGGGCCCAGG	GGCAGGGAGT	GTGGAGAGCA	2437
GGCAGACGGG	TGGAGAGAAG	CAGGCAGGCA	GTTTGCCCAG	CATGGCACAG	CTGCTGCCTC	2497
CTATTCCTGT	GCAGGAAGCT	GAAAGCCGGG	CTACTCCACA	CCCGGGTCCG	GGTCCCTCCA	2557
GAAAGAGAGC	CGGCAGGCAG	GAGCTCTCTC	GAGGCATCCA	TAAATTCTAC	CCTCTCTGCC	2617
TGTGAAGGAG	AAGCCACAGA	AACCCCAAGC	CCCACAGGAA	GCCGGTGTCG	GTGCCCGGCC	2677
CAGTCCCTGC	CCCCAGCAGG	AGTCACACAG	GGGACCCCAG	ATCCCAACCA	CGCTGTTCTG	2737
CTGCCTGCGG	TGTCTCAGGC	CCTGGGGACT	CCTGTCTCCA	CCTCTGCTGC	CTGCTCTCCA	2797
CACTCCCTGG	CCCTGGGACC	GGGAGGTTTG	GGCAGTGGTC	TTGGGCTCCT	GACTCAAAGG	2857
AGAGGTCACC	TTCTTCTTGG	GCGAGCTCTT	CTTGGGGTGC	TGAGAGGCCT	TCGGCAGGTC	2917
ATCACGACCC	CTCCCCATTT	CCCCACCCTG	AGGCCCTCTG	GCCAGTCTCA	ATTGCACAGG	2977
GATCACGCCA	CTGGCACAAG	GAGACACAGA	TGCCTCGCAG	GGGATGCCCA	CGATGCCTGC	3037
ATGTGTTGCT	TCTGGTTCCT	TTCCTCCAGT	TCCAACCGCC	GCACTCTCCC	ACACCAGTGT	3097
GACAGGGGGC	CCATCACCCT	AGACTTCAGA	GGGCTGCTGG	GACCCTGGCT	GGGCCTGGGG	3157
GTGTAGGGCC	ACCCTGCCCT	TCCCCACCTG	GAACCTGGCA	CAGGTGACAG	CCAGCAAGCA	3217
ATGACCTGGT	CCCACCATGC	ACCACGGGAA	GAGGGAGCTG	CTGCCCAAGA	TGGACAGGAG	3277
GTGGCACTGG	GGCAGACAGC	TGCTTCTCAA	CAGGGTGACT	TCAAGCCCAA	AAGCTGCCCA	.3337
GCCTCAGTTC	CGTCAGGGAC	AGAGGGTGGA	TGAGCACCAA	CCTCCAGGCC	CCTCGTGGGG	3397
GTGGACAGCT	TGGTGCACAG	AGGCCATTTT	CATGGCACAG	GGAAGCGTGG	CGGGGGTGGG	3457
AGGTGTGGTC	CCTAGGGGGT	TCTTTACCAG	CAGGGGGCTC	AGGAACTGTG	GGGACTTGGG	3517
CATGGGGCCA	TCGACTTTGT	GCCCAGCCAG	CTAGGCCCTG	TGCAGGGAGA	TGGGAGGAGG	3577
GAAAAGCAGG	CCCCACCCCT	CAGAAAGGAG	GAAGGTTGGT	GTGAAACATC	CCGGGTACAC	3637
TGAGCATTGG	GTACACTCCT	CCCGGGAGCT	GGACAGGCCT	CCCATGTGAT	GGCAAACAGG	3697
CCGACAGGAG	ACACGGCTGT	TGCTCGTCTT	CCACATGGGG	AAACTGAGGA	TCGGAGTCAA	3757
AGCTGGGCGG	CCATAGCCAG	AACCCAAACC	TCCATCCCAC	CTCTTGGCCG	GCTTCCCTAG	3817
TGGGAACACT	GGTTGAACCA	GTTTCCTCTA	AGATTCTGGG	AGCAGGACAC	CCCCAGGGAT	3877
AAGGAGAGGA	ACAGGAATCC	TAAAGCCCTG	AGCATTGCAG	GGCAGGGGGT	GCTGCCTGGG	3937
TCTCCTGTGC	AGAGCTGTCC	TGCTTTGAAG	CTGTCTTTGC	CTCTGGGCAC	GCGGAGTCGG	3997
CTTGCCTTGC	CCCCTCCGGA	TTCAGGCCGA	TGGGGCTTGA	GCCCCCCTGA	CCCTGCCCGT	4057

GTCTCCCTCG CAG CTG GGC GCC GTG TAC ACA GAA GGT GGG TTC GTG GAA 4106

Leu Gly Ala Val Tyr Thr Glu Gly Gly Phe Val Glu

10

GGC GTC AAT AAG AAG CTC GGC CTC CTG GGT GAC TCT GTG GAC ATC TTC 4154

Gly Val Asn Lys Lys Leu Gly Leu Leu Gly Asp Ser Val Asp Ile Phe

20 25 30

AAG GGC ATC CCC TTC GCA GCT CCC ACC AAG GCC CTG GAA AAT CCT CAG 4202

Lys Gly Ile Pro Phe Ala Ala Pro Thr Lys Ala Leu Glu Asn Pro Gin

40 45

CCA CAT CCT GGC TGG CAA G GTGGGAGTGG GTGGTGCCGG ACTGGCCCTG 4251

Pro His Pro Gly Trp Gin

CGGCGGGGCG GGTGAGGGCG GCTGCCTTCC TCATGCCAAC TCCTGCCACC TGCAG GG 4308

Gly

ACC CTG AAG GCC AAG AAC TTC AAG AAG AGA TGC CTG CAG GCC ACC ATC 4356

Thr Leu Lys Ala Lys Asn Phe Lys Lys Arg Cys Leu Gin Ala Thr Ile

60 65

ACC CAG GAC AGC ACC TAC GGG GAT GAA GAC TGC CTG TAC CTC AAC ATT 4404

Thr Gin Asp Ser Thr Tyr Gly Asp Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn Ile

75 80 85

TGG GTG CCC CAG GGC AGG AAG CAA G GTCTGCCTCC CCTCTACTCC 4449

Trp Val Pro Gin Gly Arg Lys Gin

CCAAGGGACC CTCCCATGCA GCCACTGCCC CGGGTCTACT CCTGGCTTGA GTCTGGGGGC 4509

TGCAAAGCTG AACTTCCATG AAATCCCACA GAGGCGGGGA GGGGAGCGCC CACTGCCGTT 4569

GCCCAGCCTG GGGCAGGGCA GCGCCTTGGA GCACCTCCCT GTCTTGGCCC CAGGCACCTG 4629

CTGCACAGGG ACAGGGGACC GGCTGGAGAC AGGGCCAGGC GGGGCGTCTG GGGTCACCAG 4689

CCGCTCCCCC ATCTCAG TC TCC CGG GAC CTG CCC GTT ATG ATC TGG ATC 4738

Val Ser Arg Asp Leu Pro Val Met Ile Trp Ile

100

TAT GGA GGC GCC TTC CTC ATG GGG TCC GGC CAT GGG GCC AAC TTC CTC 4786

Tyr Gly Gly Ala Phe Leu Met Gly Ser Gly His Gly Ala Asn Phe Leu

105 110 115 120

AAC AAC TAC CTG TAT GAC GGC GAG GAG ATC GCC ACA CGC GGA AAC GTC 4834

Asn Asn Tyr Leu Tyr Asp Gly Glu Glu Ile Ala Thr Arg Gly Asn Val

125 130 135

ATC GTG GTC ACC TTC AAC TAC CGT GTC GGC CCC CTT GGG TTC CTC AGC 4882

Ile Val Val Thr Phe Asn Tyr Arg Val Gly Pro Leu Gly Phe Leu Ser

140 145 150

ACT GGG GAC GCC AAT CTG CCA G GTGCGTGGGT GCCTTCGGCC CTGAGGTGGG 4934

Thr Gly Asp Ala Asn Leu Pro

155

GCGACCAGCA TGCTGAGCCC AGCAGGGAGA TTTTCCTCAG CACCCCTCAC CCCAAACAAC 4994

CAGTGGCGGT TCACAGAAAG ACCCGGAAGC TGGAGTAGAA TCATGAGATG CAGGAGGCCC 5054

TTGGTAGCTG TAGTAAAATA AAAGATGCTG CAGAGGCCGG GAGAGATGGC TCACGCCTGT 5114

AATCCCAGCA CTTTAGGAGG CCCACACAGG TGGGTCACTT GAGCGCAGAA GTTCAAGACC 5174

AGCCTGAAAA	TCACTGGGAG	ACCCCCATCT	CTACACAAAA	ATTAAAAATT	AGCTGGGGAC	5234
TGGGCGCGGC	GGCTCACCTC	TGTAATCCCA	GCACGTTGGG	AGCCCAAGGT	GGGTAGATCA	5294
CCTGAGGTCA	GGAGTTTGAG	ACCAGCCTGA	CTAAAATGGA	GAAACCTCTT	CTCTACTAAA	5354
AATACAAAAT	TAGCCAGGCG	TGGTGGCGCT	TGCCTGTAAT	CCCAGCTACT	CGGGAGGCTG	5414
AGGCAGGAGA	ATCGCTTGAA	CTCAGGAGGC	GGAGGTTGCG	GTGAGCCGAG	ATCATGCCAC	5474
TGCACTCCAG	CCTGGAGAAC	AAGAGTAAAA	CTCTGTCTCA	AAAAAAAAAA	AAAAAAAAAA	5534
ATAGCCAGGC	GTGGTATCTC	ATGCCTCTGT	CCTCAGCTAC	CTGGGAGGCA	GAGGTGGAAG	5594
GATCGCTTGA	GCCCAGGGGT	TCAAAGCTGC	AGTGAGCCGT	GGTCGTGCCA	CTGCACTCCA	5654
GCCTGGGCGA	CAGAGTGAGG	CCCCATCTCA	AAAATAAGAG	GCTGTGGGAC	AGACAGACAG	5714
GCAGACAGGC	TGAGGCTCAG	AGAGAAACCA	GGAGAGCAGA	GCTGAGTGAG	AGACAGAGAA	5774
CAATACCTTG	AGGCAGAGAC	AGCTGTGGAC	ACAGAAGTGG	CAGGACACAG	ACAGGAGGGA	5834
CTGGGGCAGG	GGCAGGAGAG	GTGCATGGGC	CTGACCATCC	TGCCCCCGAC	AAACACCACC	5894
CCCTCCAGCA	CCACACCAAC	CCAACCTCCT	GGGGACCCAC	CCCATACAGC	ACCGCACCCG	5954
ACTCAGCCTC	CTGGGACCCA	CCCACTCCAG	CAACCAACGT	GACCTAGTCT	CCTGGGACCC	6014
ACCCCCTCCA	GCACCCTACC	CGACCCAGCT	TCTTAGGGAC	CCACCATTTG	CCAACTGGGC	6074
TCTGCCATGG	CCCCAACTCT	GTTGAGGGCA	TTTCCACCCC	ACCTATGCTG	ATCTCCCCTC	6134
CTGGAGGCCA	GGCCTGGGCC	ACTGGTCTCT	AGCACCCCCT	CCCCTGCCCT	GCCCCCAG GT	619

Gly

160

AAC TAT GGC CTT CGG GAT CAG CAC ATG GCC ATT GCT TGG GTG AAG AGG 6242

Asn Tyr Gly Leu Arg Asp Gin His Met Ala Ile Ala Trp Val Lys Arg

165 170 175

AAT ATC GCG GCC TTC GGG GGG GAC CCC AAC AAC ATC ACG CTC TTC GGG 6290

Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asp Pro Asn Asn Ile Thr Leu Phe Gly

180 185 190

GAG TCT GCT GGA GGT GCC AGC GTC TCT CTG CAG GTCTCGGGAT CCCTGTGGGG 6343

Glu Ser Ala Gly Gly Ala Ser Val Ser Leu Gin

195 200

AGGGCCTGCC CCACAGGTTG AGAGGAAGCT CAAACGGGAA GGGGAGGGTG GGAGGAGGAG 6403

CGTGGAGCTG GGGCTGTGGT GCTGGGGTGT CCTTGTCCCA GCGTGGGGTG GGCAGAGTGG 6463

GGAGCGGCCT TGGTGACGGG ATTTCTGGGT CCCGTAG ACC CTC TCC CCC TAC AAC 6518

Thr Leu Ser Pro Tyr Asn

205

AAG GGC

CTC Leu

ATC CGG

CGA GCC ATC

AGC Ser

CAG AGC GGC

GTG Val

GCC Ala

CTG Leu

AGT Ser 225

6566

Lys 210

Gly

Ile

Arg

Arg Ala 215

Ile

Gin

Ser 220

Gly

CCC

TGG

GTC

ATC

CAG

AAA

AAC

CCA

CTC

TTC

TGG

GCC

AAA

AAG

6608

Pro

Trp

Val

Ile

Gin

Lys

Asn

Pro

Leu

Phe

Trp

Ala

Lys

Lys

230

235

GTAAACGGAG GAGGGCAGGG CTGGGCGGGG TGGGGGCTGT CCACATTTCC GTTCTTTATC 6668

CTGGACCCCA TCCTTGCCTT CAAATGGTTC TGAGCCCTGA GCTCCGGCCT CACCTACCTG 6728

CTGGCCTTGG TTCTGCCCCC AG GTG GCT GAG AAG GTG GGT TGC CCT GTG GGT 6780

Val Ala Glu Lys Val Gly Cys Pro Val Gly

		240		245
GAT GCC GCC Asp Ala Ala 250	: AGG ATG GCC CAG TGT CTG AAG GTT . Arg Met Ala Gin Cys Leu Lys Val 255 260	ACT GAT CCC Thr Asp Pre	: CGA GCC i Arg Ala 265	6828
CTG ACG CTG Leu Thr Leu	i GCC TAT AAG GTG CCG CTG GCA GGC i Ala Tyr Lys Val Pro Leu Ala Gly 270 275	CTG GAG T Leu Glu	GTGAGTAGCT	6878
GCTCGGGTTG	GCCCATGGGG	TCTCGAGGTG	GGGGTTGAGG	GGGGTACTGC	CAGGGAGTAC	6938
TCCGGAGGAG	AGAGGAAGGT	GCCAGAGCTG	CGGTCTTGTC	CTGTCACCAA	CTAGCTGGTG	6998
TCTCCCCTCG	AAGGCCCCAG	CTGTAAGGGA	GAGGGGGTGC	CGTTTCTTCT	TTTTTTTTGA	7058
GATGGAGTCT	CACTGTTGCC	CAGGCTGGAG	TGCAGTGTCA	CGATCTCAGC	TCACTGCAAC	7118
CTCCACCTCC	TGGGTTCAAG	TGATTCTCTG	ACTCAACCTC	CCATGTAGCT	GGGACTACAG	7178
GCACATGCCA	CCATGCCCAG	ATAATTTTTC	TGTGTGTTTA	GTAGGGATGG	AGTTTCATCG	7238
TGTTAGCTAG	GATGATCTCG	GTCTTGGGAC	CTCATGATCT	GCCCACCTCG	GCCTCCCAAA	7298
GTGCTGGAAT	TACAGGCGTG	AGCCACTGTG	CCCGGCCCCT	TCTTTATTCT	TATCTCCCAT	7358
GAGTTACAGA	CTCCCCTTTG	AGAAGCTGAT	GAACATTTGG	GGCCCCCTCC	CCCACCTCAT	7418
GCATTCATAT	GCAGTCATTT	GCATATAATT	TTAGGGAGAC	TCATAGACCT	CAGACCAAGA	7478
GCCTTTGTGC	TAGATGACCG	TTCATTCATT	CGTTCATTCA	TTCAGCAAAC	ATTTACTGAA	7538
CCGTAGCACT	GGGGCCCAGC	CTCCAGCTCC	ACTATTCTGT	ACCCCGGGAA	GGCCTGGGGA	7598
CCCATTCCAC	AAACACCTCT	GCATGTCAGC	CTTACCAGCT	TGCTACGCTA	AGGCTGTCCC	7658
TCACTCATTC	TTCTATGGCA	ACATGCCATG	AAGCCAAGTC	ATCTGCACGT	TTACCTGACA	7718
TGAGCTCAAC	TGCACGGGCT	GGACAAGCCC	AAACAAAGCA	ACCCCCACGG	CCCCGCTAGA	7778
AGCAAAACCT	GCTGTGCTGG	GCCCAGTGAC	AGCCAGGCCC	CGCCTGCCTC	AGCAGCCACT	7838
GGGTCCTCTA	GGGGCCCGTC	CAGGGGTCTG	GAGTACAATG	CAGACCTCCC	ACCATTTTTG	7898
GCTGATGGAC	TGGAACCCAG	CCCTGAGAGA	GGGAGCTCCT	TCTCCATCAG	TTCCCTCAGT	7958
GGCTTCTAAG	TTTCCTCCTT	CCTGCTTCAG	GCCCAGCAAA	GAGAGAGAGG	AGAGGGAGGG	8018
GCTGCCGCTG	AAGAGGACAG	ATCTGGCCCT	AGACAGTGAC	TCTCAGCCTG	GGGACGTGTG	8078
GCAGGGCCTG	GAGACATCTG	TGATTGTCAC	AGCTGGGGAG	GGGGTGCTCC	TGGCACCTCG	8138
TGGGTCGAGG	CCGGGGATGC	TCTAAACATC	CTACAGGGCA	CAGGATGCCC	CTGATGGTGC	8198
AGAATCAACC	CTGCCCCAAG	TGTCCATAGA	TCAGAGAAGG	GAGGACATAG	CCAATTCCAG	8258
CCCTGAGAGG	CAAGGGGCGG	CTCAGGGGAA	ACTGGGAGGT	ACAAGAACCT	GCTAACCTGC	8318

TGGCTCTCCC ACCCAG AC CCC ATG CTG CAC TAT GTG GGC TTC GTC CCT 8366

Tyr Pro Met Leu His Tyr Val Gly Phe Val Pro

280 285

GTC ATT GAT GGA GAC TTC ATC CCC GCT GAC CCG ATC AAC CTG TAC GCC

Val Ile Asp Gly Asp Phe Ile Pro Ala Asp Pro Ile Asn Leu Tyr Ala

290 295 300 305

8414

AAC GCC GCC GAC ATC GAC TAT ATA GCA GGC ACC AAC AAC ATG GAC GGC 8462

Asn Ala Ala Asp Ile Asp Tyr Ile Ala Gly Thr Asn Asn Met Asp Gly

310 315 320

CAC ATC TTC GCC AGC ATC GAC ATG CCT GCC ATC AAC AAG GGC AAC AAG 8510

His Ile Phe Ala Ser Ile Asp Met Pro Ala Ile Asn Lys Gly Asn Lys

325 330 335

AAA GTC ACG GA GTAAGCAGGG GGCACAGGAC TCAGGGGCGA CCCGTGCGGG 8561

Lys Val Thr Glu

340

AGGGCCGCCG GGAAAGCACT GGCGAGGGGG CCAGCCTGGA GGAGGAAGGC ATTGAGTGGA 8621

GGACTGGGAG TGAGGAAGTT AGCACCGGTC GGGGTGAGTA TGCACACACC TTCCTGTTGG 8681

CACAGGCTGA GTGTCAGTGC CTACTTGATT CCCCCAG G GAG GAC TTC TAC AAG 8734

Glu Asp Phe Tyr Lys

345

CTG GTC AGT GAG TTC ACA ATC ACC AAG GGG CTC AGA GGC GCC AAG ACG 8782

Leu Val Ser Glu Phe Thr Ile Thr Lys Gly Leu Arg Gly Ala Lys Thr

350 355 360

ACC TTT GAT GTC TAC ACC GAG TCC TGG GCC CAG GAC CCA TCC CAG GAG 8830

Thr Phe Asp Val Tyr Thr Glu Ser Trp Ala Gin Asp Pro Ser Gin Glu

365 370 375

AAT AAG AAG AAG ACT GTG GTG GAC TTT GAG ACC GAT GTC CTC TTC CTG 8878

Asn Lys Lys Lys Thr Val Val Asp Phe Glu Thr Asp Val Leu Phe Leu

380 385 390

GTG CCC ACC GAG ATT GCC CTA GCC CAG CAC AGA GCC AAT GCC AA 8922

Val Pro Thr Glu Ile Ala Leu Ala Gin His Arg Ala Asn Ala Lys 395 400 405

GTGAGGATCT GGGCAGCGGG TGGCTCCTGG GGGCCTTCCT GGGGTGCTGC ACCTTCCAGC 8982

CGAGGCCTCG CTGTGGGTGG CTCTCAGGTG TCTGGGTTGT CTGGGAAAGT GGTGCTTGAG 9042

TCCCCACCTG TGCCTGCCTG ATCCACTTTG CTGAGGCCTG GCAAGACTTG AGGGCCTCTT 9102

TTTACCTCCC AGCCTACAGG GCTTTACAAA CCCTATGATC CTCTGCCCTG CTCAGCCCTG 9162

CACCCCATGG TCCTTCCCAC TGGAGAGTTC TTGAGCTACC TTCCATCCCC CATGCTGTGT 9222

GCACTGAGAG AACACTGGAC AATAGTTTCT ATCCACTGAC TCTTATGGGC CTCAACTTTG 9282

CCCATAATTT CAGCCCACCA CCACATTAAA AATCTTCATG TAATAATAGC CAATTATAAT 9342

AAAAAATAAG GCCAGACACA GTAGCTCATG CCTGTAATCC CAGCACATTG GGAGGTCAAG 9402

GTGGGAGGAT CACTTGAGGT CAGGAGTCTG AGACTAGTCT GGCCAACATG GCAAAACCCC 9462

ATCTCTACTA AAAATACAAA AATTATCCAG GCATGGTGGT GCATGCCTAT AATCCTAGCT 9522

ACTCAGGAGG CTGAGGTAGC AGAATTGATT GACCCAGGGA GGTGGAGGTT GCAGTGAGCC 9582

GAGATTACGC CACTGCACTC CAGCAGGGGC AACAGAGTGA GACTGTGTCT CGAATAAATA 9642

AGTAAATAAA TAATAAAAAT AAAAAATAAG TTAGGAATAC GAAAAAGATA GGAAGATAAA 9702

AGTATACCTA GAAGTCTAGG ATGAAAGCTT TGCAGCAACT AAGCAGTACA TTTAGCTGTG 9762

AGCCTCCTTT CAGTCAAGGC AAAAAGGGAA ACAGTTGAGG GCCTATACCT TGTCCAATCT 9822

AATTGAAGAA TGCACATTCA CTTGGAGAGC AAAATATTTC TTGATACTGA ATTCTAGAAG 9882

GAAGGTGCCT CACAATGTTT TGTGGAGGTG AAGTATAAAT TCAGCTGAAA TTGTGGAACC 9942

CATGAATCCA TGAATTTGGT TCTCAGCTTT CCCTTCCCTG GGTGTAAGAA GCCCCATCTC 10002

TTCATGTGAA TTCCCCAGAC ACTTCCCTGC CCACTGCCCG GGACCTCCCT CCAAGTCCGG 10062

TCTCTGGGCT GATCGGTCCC CAGTGAGCAC CCTGCCTACT TGGGTGGTCT CTCCCCTCCA 10122

G G AGT GCC AAG ACC TAC GCC TAC CTG TTT TCC CAT CCC TCT CGG ATG 10169

Ser Ala Lys Thr Tyr Ala Tyr Leu Phe Ser His Pro Ser Arg Met

410 415 420

CCC GTC TAC CCC AAA TGG GTG GGG GCC GAC CAT GCA GAT GAC ATT CAG 10217

Pro Val Tyr Pro Lys Trp Val Gly Ala Asp His Ala Asp Asp Ile Gin

425 430 435 440

TAC GTT TTC GGG AAG CCC TTC GCC ACC CCC ACG GGC TAC CGG CCC CAA 10265

Tyr Val Phe Gly Lys Pro Phe Ala Thr Pro Thr Gly Tyr Arg Pro Gin

445 450 455

GAC AGG ACA GTC TCT AAG GCC ATG ATC GCC TAC TGG ACC AAC TTT GCC 10313

Asp Arg Thr Val Ser Lys Ala Met Ile Ala Tyr Trp Thr Asn Phe Ala

460 465 470

AAA ACA GG GTAAGACGTG GGTTGAGTGC AGGGCGGAGG GCCACAGCCG 10361

Lys Thr Gly

475

AGAAGGGCCT CCCACCACGA GGCCTTGTTC CCTCATTTGC CAGTGGAGGG ACTTTGGGCA 10421

AGTCACTTAA CCTCCCCCTG CATCGGAATC CATGTGTGTT TGAGGATGAG AGTTACTGGC 10481

AGAGCCCCAA GCCCATGCAC GTGCACAGCC AGTGCCCAGT ATGCAGTGAG GGGCATGGTG 10541

CCCAGGGCCA GCTCAGAGGG CGGGGATGGC TCAGGCGTGC AGGTGGAGAG CAGGGCTTCA 10601

GCCCCCTGGG AGTCCCCAGC CCCTGCACAG CCTCTTCTCA CTCTGCAG G GAC CCC 10656

Asp Pro

AAC ATG GGC GAC TCG GCT GTG CCC ACA CAC TGG GAA CCC TAC ACT ACG 10704

Asn Met Gly Asp Ser Ala Val Pro Thr His Trp Glu Pro Tyr Thr Thr

480 485 490

GAA AAC AGC GGC TAC CTG GAG ATC ACC AAG AAG ATG GGC AGC AGC TCC 10752

Glu Asn Ser Gly Tyr Leu Glu Ile Thr Lys Lys Met Gly Ser Ser Ser

495 500 505

ATG AAG CGG AGC CTG AGA ACC AAC TTC CTG CGC TAC TGG ACC CTC ACC 10800

Met Lys Arg Ser Leu Arg Thr Asn Phe Leu Arg Tyr Trp Thr Leu Thr

510 515 520 525

TAT CTG GCG CTG CCC ACA GTG ACC GAC CAG GAG GCC ACC CCT GTG CCC 10848

Tyr Leu Ala Leu Pro Thr Val Thr Asp Gin Glu Ala Thr Pro Val Pro

530 535 540

CCC ACA GGG GAC TCC GAG GCC ACT CCC GTG CCC CCC ACG GGT GAC TCC 10896

Pro Thr Gly Asp Ser Glu Ala Thr Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser

545 550 555

GAG ACC GCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCC GTG 10944

Glu Thr Ala Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val

560 565 570

CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC 10992

Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp

575 580 585

TCC Ser 590

GGG Gly

GCC Ala

CCC Pro

CCC GTG CCG

CCC ACG GGT

GAC TCC GGG GCC CCC

CCC Pro 605

11040

Pro

Val 595

Pro

Pro

Thr Gly

Asp 600

Ser

Gly

Ala

Pro

GTG

CCG

CCC

ACG

GGT

GAC

TCC

GGG

GCC

CCC

CCC

GTG

CCG

CCC

ACG

GGT

11088

Val

Pro

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Gly

Ala

Pro

Pro

Val

Pro

Pro

Thr

Gly

610

615

620

GAC

TCC

GGG

GCC

CCC

CCC

GTG

CCG

CCC

ACG

GGT

GAC

TCC

GGC

GCC

CCC

11136

Asp

Ser

Gly

Ala

Pro

Pro

Val

Pro

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Gly

Ala

Pro

625

630

635

CCC

GTG

CCG

CCC

ACG

GGT

GAC

GCC

GGG

CCC

CCC

CCC

GTG

CCG

CCC

ACG

11184

Pro

Val

Pro

Pro

Thr

Gly

Asp

Ala

Gly

Pro

Pro

Pro

Val

Pro

Pro

Thr

640

645

650

GGT

GAC

TCC

GGC

GCC

CCC

CCC

GTG

CCG

CCC

ACG

GGT

GAC

TCC

GGG

GCC

11232

Gly

Asp

Ser

Gly

Ala

Pro

Pro

Val

Pro

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Gly

Ala

655

660

665

CCC

CCC

GTG

ACC

CCC

ACG

GGT

GAC

TCC

GAG

ACC

GCC

CCC

GTG

CCG

CCC

11280

Pro

Pro

Val

Thr

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Glu

Thr

Ala

Pro

Val

Pro

Pro

670

675

680

685

ACG

GGT

GAC

TCC

GGG

GCC

CCC

CCT

GTG

CCC

CCC

ACG

GGT

GAC

TCT

GAG

11328

Thr

Gly

Asp

Ser

Gly

Ala

Pro

Pro

Val

Pro

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Glu

690

695

700

GCT

GCC

CCT

GTG

CCC

CCC

ACA

GAT

GAC

TCC

AAG

GAA

GCT

CAG

ATG

CCT

11376

Ala

Ala

Pro

Val

Pro

Pro

Thr

Asp

Asp

Ser

Lys

Glu

Ala

Gin

Met

Pro

705 710 715

GCA GTC ATT AGG TTT TAGCGTCCCA TGAGCCTTGG TATCAAGAGG CCACAAGAGT 11431

Ala Val Ile Arg Phe

720

GGGACCCCAG GGGCTCCCCT CCCATCTTGA GCTCTTCCTG AATAAAGCCT CATACCCCTG 11491

TCGGTGTCTT TCTTTGCTCC CAAGGCTAAG CTGCAGGATC 11531

Claims (33)

1. PATENTNI ZAHTEVKI

   L Molekula DNA, označena s tem, da kodira biološko funkcionalno lipazo stimulirano s solmi žolčnih kislin ali lipazo karboksilnega estra (BSSL/CEL) in vsebuje intronske sekvence.
2. 2. Molekula DNA po zahtevku 1, označena s tem, da je v seznamu sekvenc prikazana v SEQ ID NO: 1.
3. 3. Analogon molekule DNA po zahtevku 2, označen s tem, da vsebuje intronske sekvence in da se hibridizira s sekvenco DNA, prikazano v seznamu sekvenc v SEQ ID NO: 1 ali njenim specifičnim delom pod strogimi pogoji hibridizacije.
4. 4. Vektor za ekspresijo, ki se lahko replicira, označen s tem, da nosi molekulo DNA po kateremkoli od zahtevkov 1-3, ki kodira človeško lipazo stimulirano s solmi žolčnih kislin ali lipazo karboksilnega estra (BSSL/CEL) in da je sposoben posredovati njeno ekspresijo.
5. 5. Vektor po zahtevku 4, označen s tem, da je sposoben kodiranja biološko funkcionalne lipaze stimulirane s solmi žolčnih kislin ali lipaze karboksilnega estra (BSSL/CEL) in da vsebuje regulatome elemente, ki usmerjajo ekspresijo v mlečno žlezo ne-človeškega sesalca.
6. 6. Vektor po zahtevku 4, označen s tem, da je vektor pS452 (DSM

   7499).
7. 7. Celica izvedena iz mnogoceličnega organizma, označena s tem, da vsebuje vektor po kateremkoli od zahtevkov 4-6.
8. 8. Postopek proizvodnje človeške lipaze stimulirane s solmi žolčnih kislin ali lipaze karboksilnega estra (BSSL/CEL), označen s tem, da obsega: (a) vstavljanje molekule DNA, kot je definirana v kateremkoli od zahtevkov 1-3, v vektor, ki je sposoben replikacije v specifični gostiteljski celici; (b) vpeljavo nastalega rekombinantne44 ga vektorja v gostiteljsko celico; (c) gojenje take celice v ali na gojišču kulture, v katerem se eksprimira polipeptid; (d) pridobivanje polipeptida.

   f t/ , /
9. 9. Sistem ekspresije v sesalcu, označen s tem, da vsebuje hibridni gen, kise lahko eksprimira v mlečni žlezi odrasle samice ne-človeškega sesalca, ki je sprejela omenjeni hibridni gen, tako da se, ko se hibridni gen eksprimira, proizvaja človeška lipaza stimulirana s solmi žolčnih kislin aK lipaza karboksilnega estra (BSSL/CEL), omenjeni hibridni gen pa se proizvaja z vpeljavo molekule DNA, po kateremkoli od zahtevkov 1-3, v gen, ki regulira gen za protein mleka ne-človeškega sesalca.
10. 10. Hibridni gen, označen s tem, da je enak tistemu, ki je določen v zahtevku 9.
11. 11 Celica sesalca, označena s tem, da vsebuje sistem ekspresije, kot je določen v zahtevku 9.
12. 12. Celica ne-človeškega sesalca po zahtevku 11, označena s tem, da je celica embrija.
13. 13. Postopek produkcije transgenskega ne-človeškega sesalca, sposobnega ekspresije človeške lipaze stimulirane s solmi žolčnih kislin ali lipaze karboksilnega estra (BSSL/CEL), označen s tem, da obsega: (a) vpeljavo sistema ekspresije, kot je določen v zahtevku 9, v oplojeno jajce ali celico embrija ne-človeškega sesalca, tako da se sistem ekspresije vključi v spolne celice sesalca in (b) razvoj nastalega vpeljanega oplojenega jajca ali embrija v odrasli samici ne-Človeškega sesalca.
14. 14. Postopek produkcije transgenskega ne-človeškega sesalca, sposobnega ekspresije človeške lipaze stimulirane s solmi žolčnih kislin ali lipaze karboksilnega estra (BSSL/CEL) in v bistvu nesposobnega za ekspresijo lipaze stimulirane s solmi žolčnih kislin ali lipaze karboksilnega estra (BSSL/CEL) samega sesalca, označen s tem, da obsega: (a) uničenje sposobnosti sesalca, da eksprimira svojo, sesalčevo lipazo stimulirano s solmi žolčnih kislin ali lipazo karboksilnega estra (BSSL/CEL), tako da se v bistvu sesalčeva lipaza stimulirana s solmi žolčnih kislin ali lipaza karboksilnega estra (BSSL/CEL) ne eksprimira in vstavljanje sistema ekspresije, kot je določen v zahtevku 9, v spolne celice sesalca na tak način, da se človeška lipaza stimulirana s solmi žolčnih kislin ali lipaza karboksilnega estra (BSSL/CEL) eksprimira v sesalcu; in/ali (b) zamenjavo sesalčevega gena lipaze stimulirane s solmi žolčnih kislin ali lipaze karboksil45 nega estra (BSSL/CEL gena) ali njegovega dela s sistemom ekspresije, kot smo ga določili v zahtevku 9.
15. 15. Transgenski ne-človeški sesalec, označen s tem, da v svojem genomu vsebuje molekulo DNA po kateremkoli od zahtevkov 1-3.
16. 16L Transgenski ne-človeški sesalec po zahtevku 15, označen s tem, da se v njemu molekula DNA nahaja v spolnih celicah sesalca.
17. 17. Transgenski ne-človeški sesalec po zahtevku 15 ali 16, označen s tem, da se molekula DNA nahaja v sesalčevem genu za protein mleka.
18. 18. Transgenski ne-človeški sesalec, označen s tem, da se pripravi po postopku iz zahtevka 13 ali 14.
19. 19. Transgenski ne-človeški sesalec po kateremkoli od zahtevkov 15-18, označen s tem, da je izbran izmed skupine, ki se sestoji iz miši, podgan, zajcev, ovc, svinj in goved.
20. 20. Potomstvo transgenskega ne-človeškega sesalca, označeno s tem, da je ta sesalec po kateremkoli od zahtevkov 15-20.
21. 21. Mleko pridobljeno iz transgenskega ne-človeškega sesalca, označeno s tem, da je ta sesalec po kateremkoli od zahtevkov 15-20.
22. 22. Hrana za dojenčke, označena s tem, da vsebuje mleko, kot je določeno v zahtevku 21.
23. 23. Postopek proizvodnje hrane za dojenčke, označen s tem, da se hrana za dojenčke dopolni s polipeptidom, ki ga kodira molekula DNA po kateremkoli od zahtevkov 1-3.
24. 24. Uporaba molekule DNA, po kateremkoli od zahtevkov 1-3, za proizvodnjo človeške lipaze stimulirane s solmi žolčnih kislin ali lipaze karboksilnega estra (BSSL/CEL).
25. 25. Uporaba po zahtevku 24, za proizvodnjo transgenskega ne-človeš46 kega sesalca, ki eksprimira človeško lipazo stimulirano s solmi žolčnih kislin ali lipazo karboksilnega estra (BSSL/CEL).
26. 26. Uporaba po zahtevku 24, za proizvodnjo mleka, ki vse-buje človeško lipazo stimulirano s solmi žolčnih kislin ali lipazo karboksilnega estra (BSSL/CEL), ki izvira iz transgenskega ne-človeškega sesalca.
27. 27. Uporaba po zahtevku 24, za proizvodnjo hrane za dojenčke, vključujočo mleko, ki vsebuje človeško lipazo stimulirano s solmi žolčnih kislin ali lipazo karboksilnega estra (BSSL/CEL), ki izvira iz transgenskega ne-človeškega sesalca.
28. 28. Uporaba molekule DNA, po kateremkoli od zahtevkov 1-3, v izdelavi zdravila za zdravljenje patološkega stanja povezanega z eksokrino pankreasnoinsuficienco.
29. 29. Uporaba po zahtevku 28, za proizvodnjo zdravila za zdravljenje cistične fibroze.
30. 30. Uporaba po zahtevku 28, za proizvodnjo zdravila za zdravljenje kroničnega pankreatitisa.
31. 31. Uporaba po zahtevku 28, za proizvodnjo zdravila za zdravljenje nepravilnosti v absorpciji maščob.
32. 32. Uporaba po zahtevku 28, za proizvodnjo zdravila za zdravljenje nepravilnosti v absorpciji vitaminov topnih v maščobah.
33. 33. Uporaba po zahtevku 28, za proizvodnjo zdravila za zdravljenje nepravilnosti v absorpciji maščob zaradi fizioloških razlogov.