SI9300068A - Novel fungicidal strains and use thereof in antibiotic production - Google Patents

Description

Novi glivični soji in njihova uporaba pri proizvodnji antibiotikov

Predloženi izum se nanaša na nove, genetsko konstruirane glivične soje in na njihovo uporabo pri pripravi antibiotikov. Natančneje se nanaša na nove, genetsko konstruirane soje Aspergillus in na njihovo uporabo pri pripravi droge lovastatina in njegovih analogov.

Lovastatin je kemično 1,2,3,7,8,8a-heksahidro-3,7-dimetil-8-[2-(tetrahidro-4-hidroksi-6-okso-2H-piran-2-il)-etil]-l-naftalenil ester[lS-[la(R-), 3a,7/3,8/3 (2S*,4S’), 8a/3]]-2-metilbutanojske kisline in ima kemično formulo

Koristen je kot antihiperholesterolemik, ki je močan inhibitor HMG-CoA reduktaze, encima, ki kontrolira hitrost pri biosintezi holesterola. Je glivični metabolit, proizveden s fermentacijskimi postopki ob uporabi izbranih glivičnih sojev.

Antibiotiki, kot lovastatin, so metaboliti, ki za svojo sintezo zahtevajo serije različnih encimov. Da bi omogočili njihovo proizvodnjo z molekulskim kloniranjem mikroorganizmov, ki proizvajajo antibiotike, je potrebna izolacija, analiza in morda modifikacija ustreznih genov za več encimov. S poskusi za izoliranje takih genov iz takih glivičnih vrst so doslej dobili klone, ki so nosili bodisi posamezne gene serije, ali le nepopolne genske serije - glej Malpartida and Hopwood, Molecular Cloning of the Whole Biosynthetic Pathway of a Streptomyces Antibiotic and its Expression in a Heterologous Host, Nature (1984), 309 str. 462-464.

V CA-PS 1,129,794 (Endo) je opisana priprava lovastatina s fermentacijo ob uporabi soja glivične vrste Monascus ruber.

V CA-PS 1,161,380 (Monaghan et al.) je opisana priprava lovastatina s fermentacijo ob uporabi sojev glivične vrste Aspergillus terreus.

Pri obeh teh znanih postopkih proizvedejo lovastatin skupaj z drugimi, zelo podobnimi kemičnimi spojinami v bistvenih količinah, od katerih ga je treba ločiti. Pri proizvodnji ob uporabi Monascus ruber se pojavi lovastatin skupaj z monakolinom J. Pri njegovi pripravi ob uporabi Aspergillus terreus se pojavi skupaj z dihidrolovastatinom in s hidroksi kislino. Medtem ko lahko hidroksi kislino zlahka laktonizirajo v lovastatin, je treba dihidrolovastatin od njega ločiti.

Predmet predloženega izuma je, da zagotovimo nove, genetsko konstruirane mutantne glivične soje, ki so sposobni uporabe pri fermentacijskih postopkih za pripravo lovastatina.

Nadaljnji predmet izuma je, da zagotovimo nove postopke za pripravo lovastatina s fermentacijo ob uporabi takih sojev.

Po enem vidiku predloženega izuma gre za nove mutantne glivične soje ustreznih vrst rodu Aspergillus, ki so sposobni, da eksprimirajo in izločajo lovastatin. Ti soji vsebujejo gene encimske serije, ki proizvaja lovastatin, v funkcionirnem odnosu, izvedene iz DNA sojev Aspergillus terreus, ki proizvajajo lovastatin. Proizvedemo jih s postopkom protoplastne transformacije DNA iz soja Aspergillus terreus, ki proizvaja lovastatin in ki tudi vsebuje primeren selektabilen marker, z drugo vrsto Aspergillus, ki ne proizvaja lovastatina, izbrano izmed A oryzae, A fumigatus, A niger, A nidulans in A flavus, selekcijo tako nastalih transformantov na osnovi selektabilnega markeija, identifikacijo in izolacijo transformantov, ki proizvajajo lovastatin, in njihovim subkloniranjem.

V skladu z drugim vidikom izuma gre za postopek za pripravo lovastatina, ki obsega fermentiranje hranilnega medija s transformantom mikroorganizmom Aspergillus, ki vsebuje gene, izvedene iz Aspergillus terreus, in kodira za serijo encimov, ki proizvajajo lovastatin, in rekuperiranje tako nastalega lovastatina.

S postopkom v smislu predloženega izuma proizvedemo lovastatin z znatno manjšimi količinami nečistot dihidrolovastatina in derivatov hidroksi kisline v primerjavi s postopki, kjer uporabljajo Aspergillus terreus.

Pri postopku za pripravo transformantov v smislu predloženega izuma lahko uporabimo standardne tehnike priprave protoplastov iz izbranega soja Aspergillus, ki ne proizvaja lovastatina, in standardne tehnike ekstrahiranja DNA iz soja Aspergillus terreus, ki proizvaja lovastatin. Te tehnike so dobro znane strokovnjakom in tukaj ni potrebna podrobna diskusija. Podobno so tehnike in postopki protoplastne transformacije, ki se tukaj uporabljajo, znani in standardni.

Prednostna izbira soja Aspergillus, ki ne proizvaja lovastatina, je soj Aspergillus oryzae, vendar to ni kritično za uspeh pri izvajanju izuma. Lahko uporabimo druge vrste Aspergillus, namreč A niger, A nidulans, A fumigatus in A flavus. A oryzae izberemo kot prednostno vrsto zaradi njegove inertnosti, zaradi katere se da z njim zlahka in varno rokovati v laboratorijskih fermentacijah in fermentacijah v velikem merilu.

Za selekcijo mikroorganizmov transformantov iz netransformantov po protoplastnem transformacijskem postopku mora DNA iz A terreus vsebovati selektabilen marker. Obstaja široka izbira selektabilnih markerjev, ki so dostopni izkušenemu delavcu in selektabilni zanj, natančna izbira pa ni kritična za uspeh pri izvajanju izuma. Lahko uporabimo markeije antibiotske rezistence, kot ampicillinske rezistence, rifampicinske rezistence, streptomicinske rezistence itd., in dobljeno zmes transformantov in netransformantov lahko gojimo v mediju, ki vsebuje ustrezen antibiotik, tako da bodo le transformanti, ki vsebujejo selektabilen marker, preživeli za izoliranje.

Posebno prednosten kot selektabilen marker je zaradi prikladnosti cikloheksimidna rezistenca. Cikloheksimid je inhibitor proteinske sinteze, tako da prisotnost cikloheksimidno rezistentnega soja ali transformanta v brozgi kulture zlahka ugotovimo.

Po selekciji transformantov na osnovi selektabilnega markeija le-te skriniramo glede na tiste, ki bodo eksprimirali in izločali lovastatin. Le relativno majhno število vseh proizvedenih transformantov pri protoplastnem transformacijskem postopku ima to sposobnost. Prepoznamo jih z ločenim gojenjem v standardni brozgi kulture in analizo dobljenega medija, npr. s HPLC, glede na prisotnost lovastatina. Tiste, ki so pri testiranju pozitivni glede na prisotnost lovastatina, subkultiviramo in gojimo, da dobimo kolonije novih transformantnih glivičnih mikroorganizmov rodu Aspergillus, ki proizvajajo lovastatin, in prednostno vrste Aspergillus oryzae.

Izum je nadalje ilustrativno opisan v naslednjih eksperimentalnih poročilih.

V priloženih risbah je sl. 1 grafična predstavitev HPLC analize surovih glivičnih ekstraktov, proizvedenih po spodaj opisanih poskusih primera 1;

sl. 2^XH-NMR spekter lovastatinske spojine, dobljene in očiščene iz hibridnega soja; sl. 3 je masni spekter iste spojine;

sl. 4 je prikaz morfoloških karakteristik novega transformanta AoAt/NBJ-V.

PRIMERI

MATERIALI IN METODE

GLIVIČNA KULTURA - glivične izolate Aspregillus terreus in A. oryzae, uporabljene pri predloženi študiji, izoliramo iz vzorcev prsti za orhideje, zbranih pri Agriculture Canada, Research Station, Beaverlodge, Alberta, Kanada.

SELEKCIJA CIKLOHEKSIMIDNO REZISTENTNIH MUTANTOV

Po gojenju obeh izolatov Aspergillus na Czapekovih dox medijih, ki vsebujejo cikloheksimid (konc. 0,l-5mM), 6 dni pri 28 ± 2°C, spore (10⁸) vsakega izolata A. terreus in A. oryzae porazdelimo na 10 mM cikloheksimidno Czapekovo dox brozgo (50 ml) in inkubiramo 30 minut, centrifugiramo pri 10000 g 10 minut in nato ponovno suspendiramo v sterilni destilirani vodi. Trikrat jih izperemo ob mešanju in ponovno sedimentiramo s centrifugiranjem. Spore nato suspendiramo v sterilni 1 % (v/v) raztopini Tritona Χ-100 in njihova števila določimo v alikvotu na hemocitometru. Primemo razredčenje porazdelimo na 10 mM cikloheksimidni selekcijski medij in rezistentne mutante izoliramo po inkubaciji 10 dni pri 28 ± 2 °C. Izolate preiščemo glede na proizvodnjo lovastatina. Za nadaljnjo transformacijsko študijo izberemo cikloheksimidno rezistenten izolat A. terreus, ki proizvaja lovastatin.

PRIPRAVA PROTOPLASTOV IN DNA

Aspergillus oryzae in cikloheksimidno rezistenten izolat A. terreus (tukaj označen JAG-4703), ki proizvaja lovastatin, gojimo ločeno v 50 ml Czapekove dox brozge. Kulture inkubiramo 58 ur pri 28 ± 2 °C na rotacijskem stresalniku (New Brunswick Scientific Inc.) pri 200 obratih na minuto, nato poberemo in izperemo s sterilno destilirano vodo s ponovljenim centrifugiranjem.

Protoplaste iz kultur obeh vrst dobimo ob uporabi Novozyma 234 (Novo-Nordisk, Novo Alle, DK 2880, Bagsvaerd, Danska), da odstranimo celične stene med prebavo 10 do 12 ur, na splošno po metodi, opisani v Dickinson & Isenberg, J. Gen. Microbiol. 128, str. 651-654 (1982). Alikvoti protoplastov iz vsake vrste regenerirajo viabilne spore z enojno celično steno pri 28 °C po 24 urah v regenerimem mediju (R), ki vsebuje 0,1 g agarja (Difco), 5g sorboze in 0,35 g EDTA v 50 ml destilirane vode. Pri vzklitju razvijejo te spore vse karakteristike kulture svojih staršev.

Celotno DNA izoliramo iz protoplastov Aspergillus terreus po postopku, opisanem v Schlief & Wensink, Practical Methods in Molecular Biology, 33, 21-29 (1981). Protoplaste suspendiramo v raztopini, ki vsebuje 10 mg/ml SDS, 0,1 M NaCl in 0,1 M tris-HCl, pH 9,0. Dodamo enak volumen fenola, nasičenega s tris-HCl pufrom. Zmes centrifugiramo 10 min. pri 12000 g v cevki centrifuge Eppendorf (Brinkmann Instruments, Canada Ltd., Rexdale, Ontario). Gornjo fazo, ki vsebuje DNA, odstranimo, pomešamo s 95 %-nim etanolom, skladiščimo 60 min. pri -20 °C, nato centrifugiramo kot prej 10 minut. Pelet ponovno suspendiramo v pufru, pH 7,0, in inkubiramo z RNazo (Sigma, St. Louis, MO, ZDA), obdelamo s fenolom in DNA oborimo iz vodnega sloja. Izolirano DNA čistimo s adsorpcijo in izpiranjem na DEAE-celulozi (DE-52, Whatman), predhodno namočeni v 10 mM tris-HCl pufru, pH 7,5, in 0,3 M NaCl, ki je v Pasteuijevi pipeti. DNA eluiramo z 10 mM tris-HCl pufrom, pH 7,5, ki vsebuje 1,5 M NaCl. To raztopino razredčimo na 0,2 M NaCl in DNA oborimo z dvema volumnoma etanola. Čistoto DNA določimo iz 200 do 320 nm spektrov z določitvijo razmeija absorbance Α^θ/Α^. V transformacijah uporabimo le DNA z razmerji med 1,50 in 2,00. Šest vzorcev, vsak 0,1 mg izolirane DNA, inkubiramo v regenerimem mediju, da zagotovimo odsotnost viabilnih protoplastov, in nihče od njih ne razvije kolonije.

INKUBACIJA PROTOPLASTOV - DNA

Približno 5,2 χ 10⁴ protoplastov A oryzae, določeno s hemocitometerskimi štetji, inkubiramo z 10-100 ng A terreus DNA v 5 ml regenerimega medija, s sestavo, kot je opisano zgoraj, in regeneriramo, kot je opisano zgoraj. Za študijo možnih kemičnih efektov DNA na ekspresijo lovastatina inkubiramo 10-100 μξ DNA telečjega timusa (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO., ZDA), DNA (Bethesda Research Laboratories, Gaitherberg, MD, ZDA) in homologne A. oryzae DNA s podobnimi deleži protoplastov A. oryzae. Kadar je v inkubacijah vključena DNA, je protoplastna regeneracija zmanjšana na manj kot 10 % in s primerjalnimi števili tako obdelanih protoplastov (10⁵) nismo mogli doseči cikloheksimidne rezistence.

PROIZVODNJA LOVASTATINA IN TEST

Suspenzijo spor, razvitih iz protoplastov A oryzae, inkubiranih z A terreus DNA, inokuliramo, 1 ml na petrijevko, na Czapekov dox agami medij, ki vsebuje 10 mM cikloheksimida. Po inkubaciji 48 ur pri 28 ± 2 °C kulture dosežejo premer 6-8 mm. Vsaka se razvije ločeno iz posamične spore ob teh pogojih. Tiste, ki zrastejo na cikloheksimidnem mediju, vsako inokuliramo ločeno na brozgo Czapekovih dox medijev (50 ml v 500 ml erlenmajerici) in inkubiramo na rotacijskem stresalniku (200 obratov/min) pri 28 ± 2 °C 12 ur. Vsak rastni medij smo preiskali glede na proizvodnjo lovastatina po postopku, kije spodaj opisan, in s HPLC analizo.

EKSTRAKCIJA

Fermentirano brozgo (50 ml) nakisamo na pH 4,0 s 17 N HCl in nato frakcioniramo proti etilacetatu (100 ml, 3x). Združene etilacetatne frakcije posušimo v vakuumu pri z' °C, ostanek zberemo v acetonitrilu (5ml) in nato podvržemo HPLC analizi.

HPLC ANALIZA

HPLC opremo (Beckman Model 420) smo nabavili pri Beckman Instruments, Toronto, Kanada, in obstaja iz Altex črpalke (model 110 A) in injekcijskega ventila. LC-UV detektor nastavimo na 237 nm. Uporabimo hipersil C-18 ODS kremenično kolono (25 x 0,46 cm premera) in topilni sistem acetonitrila in vode (55:45, v/v) pri pretočnem razmerju 1,0 ml/min. Proizvedeni lovastatin primerjamo in kvantificiramo iz skonstruirane standardne lovastatinske krivulje.

PRIMER 1 - REZULTATI

Devetinsedemdeset cikloheksimidno rezistentnih izolatov, vključno 4 izolate, ki proizvajajo lovastatin, dobimo iz 5,2 χ 10⁵ A. oryzae protoplastov, inkubiranih z DNA iz cikloheksimidno rezistentnega mutanta A. terreus, ki proizvaja lovastatin. Transformacijske poskuse izvedemo 6-krat.

Rezultati so podani v naslednji tabeli 1.

TABELA 1 Cikloheksimidno rezistentni in lovastatin eksprimirajoči protoplasti Aspergillus oryzae, inkubirani z DNA iz cikloheksimidno razistentnega mutanta Aspergillus terreus, ki proizvaja lovastatin

>
o 4-·	o
rt	)θβ*
o N	'rt1	c • rX +-»
o		rt
»«H	o	*-»
'g	t-i CL	rt >
+-> KZ)	3	o

O CA CA O O

O in O m o

O VA CA r-l <u u

od tl <υ c

<u υ

U mo o (N o m va mo r- t— mo o

t43

Ή

Λ υ

c υ

tsO (U •s o ? a &

(Λ VI o K a « o o > 4-1 4-1 o o o u l-ι U

KZ) CL CL g

vi rt

K

O

4->

O t-i

CL

ΧΛ

VI

CL

Vi

O

*&		b	b	·&
i-H	r“<	r—l	r-l	rH
X	X	X	X	X
rH	r-H
’Φ		cn	ca	t—5

		&		KI o
	r-H	r-l	rH	rH
X	X	X	X	X
	CA	CA	O	MO
S	vi	tri		CA

Ι.όχΙΟ⁵ 1.1 χΙΟ⁵ :S

Ena od transformiranih kultur AO-II je obdržala svoje originalne transformirane karakteristike 6 mesecev. Sl. 1 prikazuje HPLC analizo ekstraktov, dobljenih iz recipientskih in donorskih kultur A. oryzae, in tistih, obdelanih z A. terreus DNA. Proizvodnja lovastatina s transformiranimi izolati je prikazana spodaj v tabeli 2.

TABELA 2 Proizvodnja lovastatina s transformiranimi izolati

Aspergillus oryzae v Czapekovi dox brozgi (pH 6,8)

Izolat št.	dobitek lovastatina (mg/1)
AO-I	15.36 ± 1.78
AO-II	26.89 ± 3.76
AO-III	13.46 ± 4.56
AO-IV	9.67 ± 0.75

Izolat št. AO-I subkultiviramo 5-krat, da dobimo transformant AoAt - NBJ/5, kije bil deponiran 25. feb. 1992 kot viabilna permanentna kultura pri American Type Culture Collection pod referenčno številko ATCC 74135.

Lovastatin proizvedemo skupaj z njegovim analogom hidroksi kisline, ki se ga da zlahka pretvoriti v lovastatin npr. z refluktiranjem v toluenu, da izvedemo laktonizacijo in pri tem povečamo dobitek lovastatina. V teh poskusih nismo izvedli laktonizacije.

Lovastatina, ki ga je proizvedla starševska kultura A. terreus v Czapekovi dox brozgi, je bilo 166,72 ± 5.92 mg/1 in starševski A. oryzae ni proizvajal lovastatina.

Sl. 2 priloženih risb je ^-NMR spekter lovastatinske spojine, očiščene s HPLC od hibridnega soja. S primerjavo z znanim, standardnim spektrom lovastatina ta spekter potrjuje identiteto produkta.

Sl. 3 priloženih risb je masni spekter istega produkta in kaže, da smo lovastatin dobili s čistoto 99 %.

Koncentracije DNA, ki so v območju od 5-20 ng/ml medija, niso vplivale niti na regeneracijsko kapaciteto protoplastov A. oryzae niti na rekuperiranje cikloheksimidno rezistentnih in lovastatin proizvajajočih izolatov iz inkubacij z A. terreus DNA. Podatki kažejo, da te koncentracije niso bile omejevalni faktor pri proizvodnji lovastatina. Podobno DNA iz telečjega timusa, DNA in homologna A. oryzae DNA pri koncentracijah od 5 ng do 5 /tg na ml medija niso vplivale na regeneracijo protoplastov A. oryzae v primerjavi z neobdelanimi kontrolami. Vendar je DNA pri 10 oz. 100 /tg na ml medija zmanjšala regeneracijo na največ 26 % oz. 1 %. Te DNA obdelave niso sprožile lovastatinske ekspresije.

Regenerimi medij je dal števila protoplastov, primerljiva s tistimi, ki so jih dosegli Acha et al. J. Gen. Microbiol., 45, 515-523 (1966) ob uporabi bolj kompleksnega mineralnega medija. Konidiji in sveže vzkliti konidiji so proizvedli boljše dobitke viabilnih protoplastov in DNA kot miceliji. V tem sistemu nismo opazili tvorbe celičnih agregatov med protoplastno regeneracijo, kot je opisano v Acha et al. (1966). Očiten transfer faktorjev, odgovornih za ekspresijo cikloheksimidne rezistence in lovastatinsko ekspresijo iz A. terreus v A. oryzae, nakazuje interspecies DNA transformacijo. So-transformacija cikloheksimidne rezistence in lovastatinske proizvodnje je bila nepričakovano zadovoljiva in sugerira fizikalno bližino in možno kopičenje genov, vpletenih v ekspresijo teh karakteristik.

Morfologija novega transformanta AoAt-NBJ/5 je prikazana na sl. 4 in jo lahko okarakteriziramo, kot sledi:

MORFOLOGIJA AoAt-NBJ/5

Glave konidijev kolonske, svetlo rjave. Konidiofori gladki, brezbarvni. Vezikli polkrogelni, pokriti do ene polovice ali dveh tretjin s fialidami, razporejenimi v dveh slojih. Konidiji kroglasti ali elipsoidni, pri čemer gladke kolonije na Czapekovem agaiju rastejo zelo hitro, bodisi kosmate ali žametaste cimetasto ijave zaradi proizvodnje konidijev. Oranžni eksudat, sprememba rumena v qavo.

Ti poskusi kažejo, da lahko načelno genetsko določene lastnosti proizvodnje antibiotikov ene glivične vrste eksprimiramo v drugi.

PRIMER 2 - POSTOPEK PRIPRAVE

Glivična kultura: za proizvodnjo lovastatina uporabimo transformirano kulturo Aspergillus oryzae (ATCC št. 74135) AoAt/NBJ-V.

FERMENTACIJA

Priprava inokuluma: glivično kulturo (liofilizirana fiola) prenesemo aseptično na poševni krompirjev dekstrozni agar in pustimo rasti 4 do 5 dni pri 25 °C. Pri koncu inkubacije pripravimo suspenzijo konidijev z dodatkom 10 ml raztopine tritona x-100 (0.01 %), močno mešamo in prenesemo suspenzijo konidijev na sterilen riž (50 g), ki ga vsebuje erlenmajerica (kapaciteta 250 ml). Bučo dopolnimo s še 10 ml sterilne vode, močno mešamo in inkubiramo 5 do 7 dni pri 28 °C. Na koncu inkubacijskega časa dodamo sterilno vodo (50 ml).

Suspenzija konidijev prehaja skozi sterilno muslinsko tkanino in filtrat, ki vsebuje 1 x 10⁸ konidijev/ml) prenesemo na inokulacijski fermentor (kapaciteta 50 1) s 30 1 inokulacijskih medijev. Sestava uporabljenih inokulacijskih medijev je, kot sledi:

D-glukoza 20 g/l sladni ekstrakt 20 g/l neo-pepton 3g/l vodovodna voda 11 pH 6,8 (naravnan z 10 %-nim NaOH).

Medije steriliziramo 30 minut pri 121 °C (1,05 barov). Inokulum pustimo rasti 17 do 20 ur pri 28 °C (hitrost prezračevanja 0,3-0,5 vvm) z 80-100 % raztopljenega kisika (200 obratov/min).

PROIZVODNJA LOVASTATINA

Inokulum (30 1) prenesemo na proizvodno fermentorsko posodo (delovni volumen 10001), ki vsebuje proizvodne medije. Sestava proizvodnih medijev je, kot sledi:

Laktoza ardamin pH g/l 10 g/l

sojin protein	2 g/1
KC1	2 g/1
KHgPO,	0.8 g/1
MnSO^HgO	0.03 g/1
betain	0.6 g/1
p r2000	2 ml
vodovodna voda	11

ρΗ 6,8 (pred sterilizacijo, naravnan s 10 % NaOH/H₂SO₄, sterilizacija pri 121 °C 1 uro pri 1,05 do 1,41 barih.

Po inokulaciji kulturo pustimo rasti 7 do 8 dni pri 28 °C s kontrolo pH pri 6,0 do 6,2 (z 10 %-no HgSOJ.

Hitrost prezračevanja vzdržujemo med 0,7 in 1,0 vvm (% raztopljenega kisika 80 do 100 %).

2. STOPNJA PROIZVODNJE dni staro fermentirano brozgo (501) prenesemo aseptično v inokulacijski fermentor (delovni volumen 2000 1), ki vsebuje 1500 1 inokulacijskih medijev (sestava podana zgoraj). Inokulum pustimo rasti 24 ur pri 28 °C (200 obratov/min), razt. kisik 80 do 100 %). Brozgo (2001) prenesemo aseptično v proizvodni fermentor (kapaciteta 30 000 1 z delovnim volumnom 20 000 1), ki vsebuje 18 000 1 proizvodnih medijev. Kulturo pustimo rasti še 7 do 9 dni pri 28 °C s kontrolo pH pri 6,0 do 6,2. Po 60 urah fermentacije pH ne kontroliramo. Fermentirano brozgo dopolnjujemo s hranilnimi mediji (hitrost 101/h) 5 dni. Sestava hranilnih medijev je, kot sledi:

D-glukoza 285.7 g/1 ardamin ph 71.4 g/1 sojin protein 14.3 g/1 vodovodna voda 11 ph 6,8 (pred sterilizacijo) - sterilizirano 30 do 45 minut pri 121 °C. Pri koncu fermentacije brozgo nakisamo na pH 4,0 z 10N HCl in centrifugiramo. Glivično pogačo sušimo pri 55 °C in podvržemo ekstrakciji.

EKSTRAKCIJA IN ČIŠČENJE

Posušeno glivično pogačo (20 kg) homogeniziramo s hladnim etilace tatom (10 do 15 min) in homogeniziran material refluktiramo 4 do 6 ur pri 80 do 85 °C, pustimo ohladiti in filtriramo. Filtrat posušimo v vakuumu do črnega katranastega materiala (2,5 kg do 3 kg). Črn katranast material pomešamo s silikagelom (2,5 kg) in CH₂C1₂ (5 1). ClfC^ uparimo v vakuumu in s silicijevim dioksidom pomešan surov katranast material zlijemo na silikagelno stekleno kolono (dolžina 100 cm x premer 22,5 cm) razvito z EtOAc:heksanom (1:2 v.v). Zberemo vzorce (2000 ml, 12x). Po 24 urah eluirno topilno zmes spremenimo v EtOAc:Heksan (1:1, v/v) in pustimo teči še 24 ur. Vzorce, ki vsebujejo produkt, zberemo, posušimo (280 g) in kristaliziramo z metanolom.

KRISTALIZACIJA

Rumen posušen produkt (280 g) raztopimo v 2,81 metanola in vremo 40 do 60 minut pri 60 do 65 °C. Vročo metanolno zmes filtriramo in filtrat inkubiramo 4 do 6 ur pri 4 °C. Bele kristalne igle odločimo od matične lužnice in splaknemo s hladnim metanolom. Kristale posušimo v vakuumu, stehtamo (190 g) in držimo v eksikatorju pri4°C.

Posledica postopka v smislu predloženega izuma so lahko dobitki lovastatina, ki so dovolj visoki, da povzročijo porušitev celičnih sten novih transformantov Aspergillus oryzae, tako da na ta način lahko izločimo stopnjo liziranja celic pred rekuperiranjem lovastatina. To bistveno poenostavi navzdolni rekuperacijski in čistilni postopek. Kot je opisano zgoraj, lahko lovastatin v smislu predloženega izuma rekuperiramo s postopkom solventne ekstrakcije, ne da bi bilo potrebno tvoriti njegove estre, soli itd. med potekom rekuperiranja. Solventna ekstrakcija je mnogo enostavnejši in bolj gospodaren postopek za rekuperiranje in čiščenje kot kromatografija.

Med tem ko smo izum opisali podrobno glede na specifične poskuse, se razume, da nanje ni omejen. Njegov obseg je definiran v priloženih zahtevkih.

Za

NOVOPHARM LIMITED:

LJUBLJANA /

PATENTNA PISARNA

Claims (13)

1. Postopek za pripravo lovastatina, označen s tem, da obsega fermentiranje hranilnega medija s transformiranim glivičnim mikroorganizmom soja Aspergillus, izbranega iz skupine vrst A. oryzae, A. niger, A. nidulans, A. fumigatus in A. flavus, ta soj pa je nesposoben eksprimirati lovastatin, vendar smo ga transformirali, da vsebuje tujo DNA, ki kodira za serijo encimov, sposobnih sintetiziranja lovastatina, in selektabilen marker, in rekuperiranje lovastatina iz hranilnega medija.

2. Postopek po zahtevku 1, označen s tem, da transformirani mikroorganizem vsebuje tujo DNA, izvedeno iz vrste Aspergillus terreus, ki proizvaja lovastatin.

3. Postopek po zahtevku 2, označen s tem, daje soj Aspergillus soj vrste A. oryzae.

4. Postopek po kateremkoli od prejšnjih zahtevkov, označen s tem, da tuja DNA, uvedena v transformant, vsebuje cikloheksimidno rezistenčne gene kot selektabilen marker.

5. Postopek po kateremkoli od prejšnjih zahtevkov, označen s tem, da je transformant AoAt-NBJ/5, kot je tukaj opisan in definiran.

6. Postopek po kateremkoli od prejšnjih zahtevkov, označen s tem, da vključuje dodatno stopnjo laktonizacije analoga hidroksi kisline, nastalega v fermentacijskem postopku, v lovastatin.

7. Postopek po kateremkoli od prejšnjih zahtevkov, označen s tem, da izvedemo rekuperacijo lovastatina s solventno ekstrakcijo.

8. Novi glivični transformanti serije encimov, ki so sposobni sintetizirati lovastatin, označeni s tem, da so ti transformanti soji vrste Aspergillus, izbrani izmed A. oryzae, A. niger, A. nidulans, A. fumigatus in A. flavus, ki je naravno nesposobna eksprimirati lovastatin, vendar vsebuje gene, ki vsebujejo tujo DNA, ki kodirajo za serijo encimov, sposobnih sintetiziranja lovastatina.

9. Glivični transformanti po zahtevku 9, označeni s tem, da vrsto Aspergillus iz15 beremo iz skupine, ki obstoji iz A. oryzae, A. niger, A. nidulans in A. fumigalis.

10. Glivični transformanti po zahtevku 10 označeni s tem, da je vrsta Aspergillus A. oryzae.

11. Glivični transformanti po zahtevku 11, označeni s tem, da tujo DNA izvedemo iz lovastatin eksprimirajočega soja vrste Aspergillus terreus.

12. Glivični transformanti po zahtevku 12, označeni s tem, da obsegajo produkt protoplastne transformacije celotne DNA iz soja A. terreus v soj A. oryzae.

13. Glivični transformanti AoAt-NBJ/5, kot so tukaj opisani in definirani.

Za

NOVOPHARM LIMITED:

PATENTNA PISARNA

LJUBLJANA e

POVZETEK

Novi glivični soji in njihova uporaba pri proizvodnji antibiotikov

Lovastatin proizvedemo s postopkom fermentacije ob uporabi glivičnega transformanta, proizvedenega z uvedbo DNA lovastatin eksprimirajočega soja Aspergillus terreus v soj Aspergillus, ki ne eksprimira lovastatina, kot soj Aspergillus oryzae.

A_A> — 1 I I 0 4 β 12 FIG. 1A ΑΛ—*—-— --- i i 1

O k 8 12

FIG· IB

0 1 1 4 8 FIG. 1C 1 12 .A _A λ_Α—, S_ 0 4 8 FIG. 1D » 12

A; ekstrakt iz A. oryzae (starševski)

B; ekstrakt iz A. terreus (starševski)

C; standardni lovastatin

D; ekstrakt iz transformiranega A. oryzae

PATENTNA PISARNA

Ljub

PATENTNA PISARNA

LJUBLJANA/ co cn

CM t>.

m mο

Μ· rsi