SI20053A

SI20053A - Postopek za indukcijo neposredne in vitro organogeneze pri čebuli

Info

Publication number: SI20053A
Application number: SI9800247A
Authority: SI
Inventors: Borut Bohanec; Zlata Luthar
Original assignee: Univerza V Ljubljani
Priority date: 1998-09-24
Filing date: 1998-09-24
Publication date: 2000-04-30
Also published as: WO2000016610A1; AU5768599A

Abstract

Opisan je postopek, ki vodi do nastanka neposredne in vitro organogeneze čebule, začete iz generativnih organov, predvsem cvetov ali ovarijev, brez nastanka kalusa. V procesu regeneracije nastala embriogena tkiva so zelo primerna za nadaljnje postopke neposrednega vnosa genov (genske transformacije), v nadaljnjem razvoju iz organogenih skupkov nastali poganjki pa omogočajo visoko stopnjo klonske razmnožitve (mikropropagacije) začete iz posameznih donorskih rastlin.ŕ

Description

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta

Postopek za indukcijo neposredne in vitro organogeneze pri čebuli

Področje izuma (Field of Invention)

Predmetni izum se nanaša na področje rastlinske biotehnologije, posebej na nov postopek za indukcijo neposredne in vitro organogeneze pri čebuli s specifično uporabo v mikropropagaciji ali genetskih transformacijah čebule.

Čebula (Allium cepa L.) spada med najbolj pomembne zelenjadnice, po obsegu pridelave je v svetovnem merilu na drugem mestu. Pridelovalno območje sega od arktičnih do tropskih predelov. Čebulo se da razmnoževati s semeni, čebulicami ali vegetativno. Načini, ki vključujejo in vitro razmnoževanje, spadajo med sodobnejše postopke vegetativnega razmnoževanja čebule. Pomen vegetativnega razmnoževanja je v hitri razmnožitvi genotipov pomembnih za žlahtnjenje rastlin ter za ohranjanje genetske strukture pomembnejših, tudi moško sterilnih linij. Postopki, ki omogočajo neposredno somatsko in vitro organogenezo, so poleg naštetega posebej pomembni kot pogoj za uspešno genetsko transformacijo čebule.

Stanje tehnike (Prior Art)

Objavljenih je bilo več študij usmerjenih v proučevanje različnih in vitro odzivov pri čebuli, pretežno izzvani po poti aksilamega razraščanja.

Mikropropagacija je pri čebuli težavna, najprej je potrebno izbrati izhodiščno tkivo uporabljeno za vcepek. Del proučevanj je za izsečke uporabljal dele čebule ali čebulic, tudi nastalih in vitro. Najprimernejše tkivo so deli bazalne plošče s skrajšanimi osnovami listov. O tovrstnem pristopu poročajo:

Hussey G (1978) In vitro propagation of the onion Allium cepa by axillary and adventitious shoot proliferation. Sci Hortic 9: 227-236;

Fujieda K, Matsuoka N, Fujita Y (1979) Vegetative multiplication of onion, Allium cepa L., through tissue culture. J Japan Soc Hort Sci 48: 186-194;

Hussey G, Falavigna A (1980) Origin and production of in vitro adventitious shoots in the onion, Allium cepa L. J Exp Bot 31: 1675-1686;

Kahane R, Rancillac M, Teyssendier de la Serve B (1992) Long-term multiplication of onion {Allium cepa L.) by cyclic shoot regeneration in vitro. Plant Celi Tiss Org Cult 28: 281-288.

Drugi del proučevanj je za izsečke uporabljal dele nezrelih socvetij. Matsubara S, Hihara H (1978) Onion bulblet regeneration on receptacles in vivo and in situ. J Japan Soc Hort Sci 46: 479-486, poročata o uporabi baze nezrelega socvetja.

Pike LM, Yoo KS (1990) A tissue culture technique for clonal propagation of onion using immature flower buds. Sci Hortic 45: 31-36 ter Mohamed-Yasseen Y, Splittstoesser WE, Litz RE (1993) In vitro bulb formation and plant recovery from onion inflorescences. HortScience 28: 1052 pa so za izsečke uporabili razrezane dele nezrelih socvetij ali posamične nezrele cvetne brste.

Nastanek kalusnega tkiva je uspel iz številnih tkiv, kot na primer delov čebul, čebulic ali koreninic (Dunstan Dl, Short KC (1978) Shoot production ffom onion callus cultures. Sci Hortic 9: 99-110), delov mlajših listov, nezrelih spolnih embrijev, nezrelih neoplojenih semenskih zasnov, zrelih delov bazalnih plošč (Phillips CG, Luteyn KJ (1983) Effects of picloram and other auxins on onion tissue cultures. J Amer Soc Hort Sci 108: 948-953).

Najbolj pogosto uporabljani rastlinski rastni regulatorji (fitohormoni) za indukcijo poganjkov so bili naftalenocetna kislina (NAA), 6-benzilaminopurin (BAP), medtem ko je bil za indukcijo kalusa pikloram učinkovitejši od NAA ali 2,4-diklorofenoksiocetne kisline (2,4-D).

Značilnost objavljenih protokolov je relativno nizka učinkovitost formiranja poganjkov, iz ene donorske rastline je z njihovo uporabo možno pridobiti relativno majhno število poganjkov. Protokoli osnovani na indukciji poganjkov iz delov čebul ali čebulic so dali do 10 poganjkov na izseček, medtem ko je število možnih izsečkov, pridobljenih iz ene čebule, omejeno (Fujieda et al. 1979). Protokoli osnovani na inokulaciji nezrelih cvetov ali delov nezrelih socvetij so bili različno uspešni. Pike in Yoo (1990) poročata o 10% indukciji cvetov, iz induciranih cvetov pa je nastalo okoli 5 poganjkov. Mohamed-Yassen et al. (1993), ki so inducirali poganjke iz na 4 dele razrezanih nezrelih socvetij so uspeli izzvati do 10.6 poganjkov na izseček, torej 42.4 na socvetje. V nobenem od naštetih del ni opisana neposredna organogeneza poganjkov preko nastanka organogenih skupkov, kar je predmet tega izuma.

In vitro gojene poganjke je možno razmnoževati tudi z in vitro odebelitvijo bazalih delov ter razrezom tako nastalih čebulic (Kahane at al. 1992), vendar je postopek zamuden, za en ciklus razmnožitve potrebujejo 3-4 mesece. Objavljen je bil tudi protokol za nastanek somatske embriogeneze (Phillips and Luteyn 1983). Avtoija sta inducirala nastanek kalusa iz meristemskih vršičkov sejancev, korenin sejancev, zrelih embrijev, nezrelih oplojenih ovul in iz zrelih bazalnih plošč.

Opis izuma z izvedbenimi primeri (Description of Invention with Working Examples)

Iz navedenega pregleda del je razvidno, da do sedaj še ni bila razvita učinkovita metoda za neposredno somatsko regeneracijo, ki bi vodila preko nastanka organogenih skupkov ter kasnejšega razvoja velikega števila poganjkov, in bi temeljila na postopku, ki ne vključuje nastanka kalusa ter je učinkovit pri večini testiranih kultivarjev. Taka metoda je pomembna z dveh vidikov. Prvič, uporaba tovrstne regeneracije je mogoča za in vitro razmnožitev velikega Števila poganjkov nastalih iz ene same izhodiščne rastline. Drugič, nastanek organogenih skupkov preko neposredne somatske organogeneze je en od pogojev za uporabo metod prenosa genov z metodo genetske transformacije, tako osnovane na biolističnem pristopu kot pristopu po poti okužbe z bakterijo Agrobacterium in podobnih metodah.

Sedaj pa smo presenetljivo ugotovili, da so lahko zreli čebulni cvetovi ali ovariji inducirani za nastanek neposredne organogeneze, ki vodi do nastanka kompaktnih organogenih tvorb (organogenih skupkov), iz katerih se lahko kasneje izdolžijo Številni poganjki. Indukcijski postopki in sestavine gojišč so zelo podobni, kot so bili uporabljeni za povsem drug odziv, to je ginogenetsko regeneracijo haploidnih rastlin čebule (Bohanec B, Jakše M, Ihan A, Javornik B (1995) Studies of gynogenesis in onion (Allium cepa L.): induction procedures and genetic analysis of regenerants. Plant Science 104: 215-224; Jakše M, Bohanec B, and Ihan A (1996) Effect of media components on the gynogenic regeneration of onion (Allium cepa L.) cultivars and analysis of regenerants. Plant Celi Rep 15: 934-938). Glavne razlike med protokolom za indukcijo haploidov in tu opisanim postopkom 2 je uporaba BDS gojišča (Dunstan Dl, Short KC (1977) Improved growth of tissue cultures of onion, Allium cepa. Physiol Plant 41: 70-72) namesto B5 (Gamborg OL, Miller RA, Ojima K (1968) Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root celiš. Exp Celi Res 50:151-158) indukcijskega gojišča, povišana vsebnost vitaminov in inozitola, uporaba gellan-guma namesto agarja in krajše indukcijsko tretiranje. Te relativno majhne spremembe povzročijo povsem drugačen odziv istih čebulnih organov ob gojenju in vitro, kakršen še ni bil nikjer opisan.

Predmetni izum je postopek za indukcijo neposredne in vitro organogeneze pri čebuli, ki obsega stopnje:

(i) Inokulacija cvetov tik pred odprtjem cvetnega odevala na indukcijsko gojišče, ki vsebuje zadostno koncentracijo rastlinskih rastnih regulatorjev in hranilne komponente ter strjevalce gojišča za iniciacijo nastanka neposredne somatske organogeneze. Omenjeni rastni regulatorji v tej fazi vsebujejo učinkovito mešanico avksinov in citokininov, gojišče pa vsebuje mikro in makro elemente, vitamine, inozitol, prolin, ogljikove hidrate in strjevalce gojišč.

(ii) Po ustreznem času indukcije prenos cvetov z indukcijskih na diferenciacijska gojišča, ki vsebujejo zadostno količino citokininov ter mikro in makro elemente, vitamine, inozitol, prolin, saharozo in strjevalce gojišč do nastanka neposredne organogeneze.

(iii) Opcijsko odstranitev cvetnega odevala s cvetov in gojenje izoliranih ovarijev ob prenosu z indukcijskega na diferenciacij sko , gojišče, drugi postopki so enaki kot so opisani v točkah (i) in (ii) in vodijo do nastanka neposredne organogeneze.

(iv) Ločevanje v točkah (ii) ali (iii) nastalih skupkov somatskih poganjkov ter prenos večjih poganjkov na koreninjenje oziroma subkultiviranje preostalih kompaktnih organogenih struktur.

(v) Aklimatizacija ukoreninjenih prej omenjenih poganjkov.

Značilni parametri predmetnega postopka so navedeni v nadaljevanju, čeprav obseg izuma ni omejen nanje, ampak obsega vse možne variacije, ki so za strokovnjaka očitne iz opisa. Uporabljeno indukcijsko in diferenciacij sko gojišče vsebuje kot strjevalce gojišča gellan-gum, mešanico agarja in gellan-guma ali samo agar.

Gojenje na indukcijskem gojišču traja od 3 do 12 dni.

V indukcijskem in diferenciacijskem gojišču je vir ogljikovih hidratov saharoza, glukoza ali maltoza.

Indukcijska in/ali diferenciacij ska gojišča vsebujejo od 25 do 100 g/1 saharoze.

'6

Indukcijsko gojišče poleg citokinina vsebuje kot vir avksina 2,4-diklorfenoksiocetno kislino ali pikloram.

Indukcijsko gojišče poleg avksina ne vsebuje citokinina ali vsebuje benzilaminopurin, tidiazuron ali isopentenyladenine (2ip).

Diferenciacijsko gojišče vsebuje kot vir citokinina tidiazuron ali benzilaminopurin.

Proces indukcije in diferenciacije poteka na svetlobi ali v temi.

Sestava makro in mikro elementov v indukcijskih in diferenciacijskih gojiščih pripravljena po BDS (Dunstan and Short 1977), B5 (Gamborg et al. 1968) ali MS (Murashige in Skoog, 1962)*.

*Murashige T, Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: 473-497

Podroben opis postopka

Preizkušan rastlinski material je izviral iz različnih, javnosti dostopnih virov, kultivarji so bili prejeti iz genskih bank ali kupljeni na drobno, inbridirane linije so izvirale iz ameriškega javnega žlahtniteljskega programa (Dr. M.J. Havey, USDA, Madison, Wisconsin, ZDA). Preizkušam so bili naslednji genotipi čebule:

Belokranjka (Slovenija), Ptujska rdeča (Slovenija), Stuttgarter Riesen, Timor, Shenshu Yellow, Yamaguchi Koudaka, Texas Early Grano 502, eksperimentalni hibridi ΧΡΗ 3371 Fi (Asgrow) in križanca 70723 (B1717BxB2923B) in 70719 (B2371CxB2923B), inbridirane linije B2355B, B2923B, MSU2935B, MSU5718B, MSU8155B.

Cvetni brsti v zreli fazi tik pred odprtjem cveta so bili porezani s prej navedenih donorskih rastlin, ki so bile gojene v rastlinjaku. Površinska sterilizacija cvetov je bila dosežena z 10 minutno potopitvijo cvetov v dinatrijevo dikloroizocianumo kislino v koncentraciji 16.6 g/1 z dodatkom nekaj kapljic močila Tween 20. Po tretiranju so bili cvetovi 3 krat sprani v sterilizirani vodi.

Pri postopku 1 so bili cvetovi gojeni v petrijevkah premera 100 mm (30 cvetov na petrijevko), ki so vsebovale indukcijska gojišča, kot je opisano kasneje. Na indukcijskih gojiščih so bili cvetovi (kjer ni drugače rečeno) 6 dni. Po indukcijskem tretiranju so bili cvetovi preneseni na diferenciacijska gojišča, kot je opisano kasneje.

Pri postopku 2 smo za razliko od postopka 1 pred prenosom cvetov z indukcijskega na diferenciacijsko gojišče izrezali ovarije, torej odstranili cvetno odevalo in prašnike.

Petrijevke so bile zavite s Parafilmom™ (American National Can, Greenwich, CT, ZDA) za preprečitev izhlapevanja. Inokulirani cvetovi in ovariji so bili gojeni v rastnih komorah s 16/8 urno osvetlitvijo pri 21-23 °C in osvetlitvi približno 80 pmol m’²s'¹.

Gojišča so bila pripravljena v skladu z uveljavljeno prakso za delo s rastlinskimi tkivnimi kulturami, kot je na primer opisano v delu RLM Pierik (1987) In vitro culture of higher plants. Martinus Nijhoff Publishers, Dordrecht, Boston, Lancaster, pp. 344.

Osnovno gojišče je vsebovalo BDS makro in mikro elemente in vitamine (kjer ni drugače rečeno) kot sta jih opisala Dunstan in Short 1977 (komercialno dostopne pri Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Nizozemska) in 500 mg/1 inozitola, 200 mg/1 prolina, 100 g/l saharoze (kjer ni drugače rečeno); pH gojišča je bil uravnan na 6.0 pred avtoklaviranjem. Sestavine vseh gojišč so, za vsa v primerih navajana tretiranja, podrobneje navedene v Tabelah 11 A in 11 B.

Cvetovi, gojeni na indukcijskih gojiščih, so se v prvih dneh gojitve odprli, ovariji so se močno povečali. Po prestavitvi na diferenciacijska gojišča so se po treh tednih pojavile prve vidne tvorbe na bazi ovarijev. Formirane tvorbe so bile dobro vidne zlasti pri postopku 2, ko je bilo cvetno odevalo odstranjeno in so bile tvorbe vidne skozi gojišče. V začetni fazi so imele te tvorbe globularen embriogen videz in so bile popolnoma bele barve (priloga 1, risba 1).

Nadaljni razvoj je bil viden v 1 tednu. Globulame strukture so se povečale in vidni so bili posamični zametki poganjkov (priloga 1 risba 2). Del teh struktur se je v naslednjih dveh tednih izdolžil in formiral poganjke dolge približno 2 cm (priloga 1 risba 3). Tedaj je bilo poganjke možno oddvojiti in gojiti posamično ali v skupkih. Ostali del organogenih skupkov je ostal v osnovni kompaktni obliki in ob subkultiviranju na brezhormonsko gojišče je tvoril nove poganjke. Tvorba novih poganjkov je ostala na brezhormonskem gojišču ohranjena vsaj 3 subkulture. Najprimernejše gojišče za izdolževanje poganjkov je bilo osnovno gojišče (ali osnovno gojišče v polovični koncentraciji) brez dodanih fitohormonov ter z znižano koncentracijo saharoze ali glukoze (od 20 do 70 g/1, priporočljivo 30 g/1). Poganjki so postopoma postajali zeleni, izdolžili so se ter v tej ali naslednji subkulturi na istem gojišču tvorili korenine, enako kot z drugimi postopki pridobljeni mikropropagirani poganjki. Za pospešeno tvorbo korenin je bilo možno gojiščem tudi dodati avksine, na primer 0.5-1.0 mg/1 indolmaslene kisline (IBA).

Število posamičnih poganjkov, ki so se regenerirali, je bilo težko določiti, saj so poleg izdolženih poganjkov ostale prisotne še kompaktne organogene tvorbe. Povprečni nastal skupek je bil ob koncu gojenja na diferenciacijskem gojišču sestavljen iz 5-10 izdolženih poganjkov ter preostalega kompaktnega organogenega tkiva.

V tabelah 1-10 podani rezultati predstavljajo število cvetov (postopek 1) ali ovarijev (postopek 2), ki so tvorili organogene skupke. Statistično značilne razlike testirane z analizo variance in Duncanovim testom (p=0.05) so prikazane s črkami ki sledijo odstotkom regeneracije, ločeno za vsak genotip, skupine označene z različnimi črkami se statistično značilno razlikujejo.

Primer 1

Efekt strjevalcev gojišča

Indukcijska in diferenciacijska gojišča so vsebovala tri različne sestavine za strjevanje gojišč in sicer gellan-gum (Il/Dl), mešanica gellan-guma in agarja (Difco-Bacto™, Difco Laboratories, Detroit, MI, ZDA) (I2/D2) ter agar (Difco Bacto) (I3/D3). Učinek različnih strjevalcev gojišč je bil testiran z uporabo postopka 1 in postopka 2, cvetovi so bili prestavljeni z indukcijskega na diferenciacijsko gojišče po.6 dneh. Rezultati so prikazani v tabeli 1.

Tabela 1

	C v	e t o v i	0 v	ariji
Gojišče	Št. inokuliranih cvetov	Odstotek cvetov ki so tvorili organogene skupke	Št. izoliranih ovarijev	Odstotek ovarijev, ki so tvorili organogene skupke
Il/Dl	419	42.0 b	797	35.9 C
I2/D2	420	24.3 ab	814	24.0 b
I3/D3	388	15.7 a	872	10.7 a

Najvišji odstotek regeneracije je bil dosežen na gojiščih strjenih z gellan-gumom in to pri obeh uporabljenih postopkih. Na gojišču strjenem z gellan-gumom je več novonastalih poganjkov kazalo znake nezaželene hiperhidracije, manj hiperhidriranih poganjkov pa se je tvorilo na gojiščih z agarjem ali mešanico obeh sredstev.

Primer 2

Trajanje indukcijske faze

Preizkušeno je bilo različno trajanje indukcijske faze pred prestavitvijo na diferenciacijsko gojišče. Uporabljen je bil postopek 2 ter gojišči Il/Dl. Rezultati so prikazani v tabeli 2.

Tabela 2

Trajanje indukcijskega tretiranja	Št. inokuliranih ovarijev	Odstotek ovarijev, ki so tvorili organogene skupke	Odstotek vitrificiranih skupkov
3 dni	300	43.0 b	41.1
6 dni	300	61.0 c	29.8
12 dni	319	17.6 a	62.5

Trajanje indukcijske faze je imelo signifikanten učinek na regeneracijo. Najvišja regeneracija poganjkov je bila dosežena na ovarijih, ki so bili prestavljeni na diferenciacijsko gojišče po 6 dneh, krajše ali daljše indukcijsko tretiranje pa je rezultiralo z nižjo odzivnostjo; pri 6 dneh je bila tudi stopnja hiperhidriranosti najnižja.

Primer 3:

Vpliv vira ogljikovih hidratov

Proučevan je bil vpliv različnih ogljikovih hidratov v indukcijskih in diferenciacijskih gojiščih, in sicer 50 g/l saharoze (I4/D4) in ekvimolame koncentracije 26.3 g/l glukoze (I6/D6) in 52.6 g/l maltoze (I7/D7). Uporabljen je bil postopek 2, učinek ogljikovih hidratov pa je bil testiran na treh različnih genotipih čebule, kot je navedeno v tabeli 3. Rezultati so prikazani v tabeli 3,

Tabela 3

Gojišče	Genotip	Št. inokuliranih ovarijev	Odstotek ovarijev, ki so tvorili organogene skupke	Odstotek vitrificiranih skupkov
I4/D4	70719	177	19.2 a	16.2
I6/D6	70719	174	23.0 a	12.5
I7/D7	70719	180	16.1 a	13.8
I4/D4	Belokranjka	154	18.2 a	25.0
I6/D6	Belokranjka	119	10.1 a	16.7
I7/D7	Belokranjka	138	8.0 a	9.1
I4/D4	Ptujska rdeča	173	15.6 a	11.1
I6/D6	Ptujska rdeča	155	25.2 a	10.3
17/D7	Ptujska rdeča	155	21.3 a	15.2

Organogeni skupki so nastajali na vseh preizkušanih gojiščih ter pri vseh genotipih, med gojišči ni bilo statistično značilnih razlik, tudi stopnja hiperhidracije ni bila bistveno različna.

Primer 4:

Vpliv koncentracije saharoze v gojiščih

Proučevan je bil vpliv vsebnosti saharoze v indukcijskih in diferenciacij skih gojiščih, in sicer 100 g/1 (Il/Dl), 50 g/1 (I4/D4) in 25 g/1 (I5/D5). Uporabljen je bil postopek 2, učinek saharoze pa je bil testiran na treh različnih genotipih čebule, kot je navedeno v tabeli 4. Rezultati so prikazani v tabeli 4.

Tabela 4

Gojišče	Genotip	Š? inokuliranih ovarijev	Odstotek ovarijev, ki so tvorili organogene skupke	Odstotek vitrificiranih skupkov
Il/Dl	2923B	167	18.0 a	20.0
I4/D4	2923B	294	22.8 a	11.9
Il/Dl	Belokranjka	539	21.3 a	13.9
I4/D4	Belokranjka	538	26.2 a	3.5
I5/D5	Belokranjka	541	25.7 a	5.0
Il/Dl	MSU5718B	446	6.7 a	25.0
I4/D4	MSU5718B	451	17.7 b	11.2
I5/D5	MSU5718B	440	11.1 a	24.5

Organogeni skupki so nastajali na vseh preizkušanih gojiščih ter pri vseh genotipih, na gojišču s 50 g/1 saharoze je statistično značilno večje število skupkov nastajalo le pri genotipu MSU5718B. Pri dveh drugih genotipih je nižja koncentracija saharoze vplivala na manjši pojav hiperhidracije.

Primer 5:

Vpliv sestave avksinov v indukcijskih gojiščih

Proučevan je bil vpliv sestave avksinov v indukcijskih gojiščih. Uporabljen je bil postopek 2, učinek avksinov pa je bil testiran na štirih različnih genotipih čebule, kot je navedeno v tabeli

5. Indukcijska gojišča so vsebovala 2 mg/l 2,4-D (14), 1 mg/l. piklorama (18) in 2 mg/l piklorama (19) ali 5 mg/l NAA (110). Diferenciacijsko gojišče je bilo Dl ali D4.

Rezultati so prikazani v tabeli 5.

Tabela 5

Gojišče	Genotip	Št. inokuliranih ovarijev	Odstotek ovarijev, ki so tvorili organogene skupke	Odstotek vitrificiranih skupkov
I10/D1	MSU8155B	316	0	0
I10/D1	B2923B	333	0	0
I4/D4	Belokranjka	845	35.6 b	3.6
I8/D4	Belokranjka	540	11.7 a	13.5
I9/D4	Belokranjka	538	14.9 a	23.7
I4/D4	MSU5718B	362	26.2 b	11.0
I8/D4	MSU5718B	504	6.7 ^a	16.2
I9/D4	MSU5718B	476	6.9 a	27.3

Organogeni skupki so nastajali na treh od štirih preizkušanih gojišč, na gojišču I4/D4 jih je bilo pri obeh genotipih statistično značilno največ, tudi stopnja hiperhidriranosti je bila pri tej kombinaciji najmanjša.

Primer 6

Vpliv sestave citokininov v indukcijskih gojiščih

Proučevan je bil vpliv sestave citokininov v indukcijskih gojiščih. Uporabljen je bil postopek

2, učinek citokininov pa je bil testiran na dveh različnih genotipih čebule, kot je navedeno v tabeli 6. Indukcijska gojišča so vsebovala 2 mg/1 BAP (14), nič citokinina (111), 1 mg/1 tidiazurona (112) ali 2 mg/12ip (113), diferenciacijsko gojišče je bilo D4.

Rezultati so prikazani v tabeli 6.

Tabela 6

Gojišče	Genotip	Št. inokuliranih ovarijev	Odstotek ovarijev, ki so tvorili organogene skupke	Odstotek vitrificiranih skupkov
I4/D4	Belokranjka	845	35.6 c	3.6
I11/D4	Belokranjka	540	5.6 a	8.4
I12/D4	Belokranjka	532	43.2 c	0.4
I13/D4	Belokranjka	538	16.5 b	4.5
I4/D4	MSU5718B	362	26.2 c	11.0
I11/D4	MSU5718B	484	8.5 a	12.2
I12/D4	MSU5718B	482	19.3 bc	12.4
I13/D4	MSU5718B	482	12.2 ab	27.1

Statistično značilno najvišji odstotek indukcije je bil dosežen na gojišču 112 še posebej pri prvem genotipu, pri drugem pa je bil statistično neznačilno nižji od gojišča 14. Tudi stopnja hiperhidriranosti je bila na gojišču 112 zelo nizka. Odsotnost citokinina v indukcijskem gojišču (Il 1) je močno znižala odstotek regeneracije.

Primer 7

Vpliv sestave citokininov v diferenciacijskih gojiščih

Proučevan je bil vpliv sestave citokininov v diferenciacij skih gojiščih. Uporabljen je bil postopek 2, učinek citokininov pa je bil testiran na štirih različnih genotipih čebule, kot je navedeno v tabeli 7 ter na gojiščih z dvema različnima vsebnostima saharoze. Diferenciacijska gojišča so vsebovala 2 mg/1 TDZ (Dl) ali 5 mg/1 BAP (D10 in Dl 1), indukcijsko gojišče je bilo II ali 14. Rezultati so prikazani v tabeli 7.

Tabela 7

Gojišče	Genotip	§t- inokuliranih ovarijev	Odstotek ovarijev, ki so tvorili organogene skupke	Odstotek vitrificira= nih skupkov
Il/Dl	Belokranjka	718	39.4 b	8.8
I1/D10	Belokranjka	330	4.5 a	36.7
14/D4	Belokranjka	845	35.6 c	3.6
14/D8	Belokranjka	537	17.3 a	9.7
14/D9	Belokranjka	541	27.0 b	2.7
Il/Dl	70723	97	27.8 a	33.4
I4/D4	70723	98	54.1 a	9.4
I1/D10	70723	97	28.9 a	23.2
I4/D11	70723	97	43.3 a	5.9
14/D4	MSU5718B	362	26.2 a	11.0
I4/D8	MSU5718B	425	26.4 a	9.8
I4/D9	MSU5718B	423	21.0 a	9.0
Il/Dl	B2923B	164	12.8 a	28.6
I4/D4	B2923B	167	43.1 b	22.3
I1/D10	B2923B	166	18.7 a	32.3
14/011	B2923B	166	27.1 a	20.0

Organogeni skupki so nastajali na vseh preizkušanih gojiščih ter pri vseh genotipih. Nižja vsebnost saharoze je pri vseh preizkušanih genotipih zvišala regeneracijo in znižala hiperhidriranost.

Primer 8

Vpliv svetlobe

Proučevanje bil vpliv indukcije in diferenciacije organogenih skupkov na svetlobi ali v temi pri dveh genotipih. Uporabljen je bil postopek 2, gojišči sta bili I4/D4. Rezultati so podani v tabeli 8.

Tabela 8

Tretiranje	Genotip	Št. inokuliranih ovarijev	Odstotek ovarijev, ki so tvorili organogene skupke	Odstotek vitrificiranih skupkov
Svetloba	Belokranjka	539	34.3 b	2.2
Tema	Belokranjka	550	18.7 a	9.7
Svetloba	MSU5718B	433	21.2 a	15.2
Tema	MSU5718B	425	17.6 a	4.7

Organogeni skupki so nastajali na obeh preizkušanih tretiranjih ter pri obeh genotipih, v obeh primerih je bila regeneracija organogenih skupkov boljša na svetlobi kot v temi.

Primer 9

Vpliv sestave makro in mikro elementov

Proučevan je bil vpliv indukcije in diferenciacije organogenih skupkov na gojiščih, ki so vsebovala različne sestavine makro in mikro elementov v indukcijskem in diferenciacijskem gojišču in sicer BDS (I4/D4), B5 (I14/D12) ali MS (I15/D13). Uporabljen je bil postopek 2, rezultati so podani v tabeli 9.

Tabela 9

Gojišče	Genotip	Št. inokuliranih ovarijev	Odstotek ovarijev, ki so tvorili organogene skupke	Odstotek vitrificiranih skupkov
I4/D4	Belokranjka	486	39.5 b	4.9
I14/D12	Belokranjka	512	23.4 a	5.0
I15/D13	Belokranjka	534	30.7 ab	11.3
I4/D4	MSU5718B	459	21.8 a	14.5
I14/D12	MSU5718B	459	19.2 a	7.4
I15/D13	MSU5718B	442	24.9 a	11.4

Organogeni skupki so nastajali na vseh preizkušanih gojiščih ter pri obeh genotipih. Najnižja stopnja hiperhidriranosti je bila na gojiščih I14/D12.

Primer 10

Izvrednotenje efekta genotipa

Proučevan je bil vpliv genotipa na tvorbo organogenih skupkov nastalih po postopkih 1 in 2, gojišči sta bili II/Dl. Rezultati proučitve indukcije 12 genotipov čebule so podani v tabeli 10.

Tabela 10 A: postopek 1

Genotip	Št. inokuli= ranih cvetov	Odstotek ovarijev, ki so tvorili organogene skupke	Odstotek cvetov, ki je tvoril bazalni kalus	Odstotek poganjkov, ki so se tvorili na kalusu	Odstotek vitrifici= ranih skupkov
Belokranjka	712	45.4 ef	16.3	6.5	2.3
Stuttgarter Riesen	897	20.1 abc	18.6	6.7	5.2
Timor	399	10.8 ab	13.5	5.3	5.5
Shenshu Yellow	326	17.2 abc	22.4	5.5	10.1
Yamaguchi Koudaka	577	31.2 cde	9.5	2.8	0.5
ΧΡΗ3371 Fi (Asgrow)	368	25.5 bed	13.3	7.9	2.0
Texas Early Grano 502	309	15.9 abc	27.5	9.1	5.2
Inb. linija B2355B	477	19.5 abc	26.6	9.2	3.3
Inb. linija B2923B	1139	39.2 def	24.1	5.4	20.8
Inb. linija MSU2935B	446	57.2 f	8.8	2.5	13.2
Inb. linija MSU5718B	529	44.0 def	24.6	4.9	25.3
Inb. linija MSU8155B	748	3.6 a	2.5	1.1	10.0

B: postopek 2

Genotip	Število inokulirani h ovarijev	Odstotek ovarijev, ki so tvorili organogene skupke	Odstotek vitrificiranih skupkov
Belokranjka	718	39.4 d	8.8
Stuttgarter Riesen	947	14.6 ab	6.1
Timor	319	29.2 bed	30.1
Shenshu Yellow	419	25.8 bed	15.7
Yamaguchi Koudaka	584	28.8 bed	14.6
ΧΡΗ 3371 F] (Asgrow)	357	15.9 abc	18.4
Texas Early Grano 502	318	32.1 cd	3.4
Inb. linija B2355B	467	37.0 d	41.3
Inb. linija B2923B	1339	. 14.9 ab	22.4
Inb. linija MSU2935B	627	25.5 bed	21.6
Inb. linija MSU5718B	616	57.9 e	13.2
Inb. linija MSU8155B	955	4.1 a	23.1

Organogeni skupki so nastajali na vseh preizkušanih gojiščih ter pri vseh genotipih. Bistvena razlika med postopkom 1 in 2 je bila v formiranju kalusa ob bazi cvetov. V nekaterih primerih je prišlo do adventivne (nedirektne) regeneracije poganjkov iz nastalega kalusa, kot je v tabeli posebej prikazano. V primeru uporabe postopka 2 (izrez ovarijev) do tvorbe kalusa ni prišlo, regeneracija je nastala izključno po poti direktne organogeneze. Razlike med posameznimi kultivarji so bile statistično signifikantne pri obeh postopkih. Najvišji dosežen odstotek regeneracije je bil 57.9% (postopek 2) oziroma 45.4% (postopek 1). Najnižji odstotek regeneracije je bil pri obeh postopkih dosežen pri liniji MSU8155B, vendar je potrebno omeniti, da je ta linija cvetela 3 tedne kasneje kot ostale, v tem času so bile v rastlinjaku temperature (ki lahko vplivajo na odzivnost) že precej višje.

Del genotipov seje odzval podobno pri obeh testiranih postopkih, del pa se je odzval bolje pri enem ali drugem postopku. Variiral je tudi odstotek hiperhidriranosti poganjkov, nasplošno je bil nekoliko nižji pri postopku 1 kot pri postopku 2.

C3 »(/) 'c?

CD 03 2Z 00 ·' ΖΓ¹O LZ □ Ό C <

ω ω

<

H

Ο !

Oh sO

CS

			+		00	o			00
					kT)				CN
		+			o o	o	»>M		00
					k/Ί				CN
					o	Q			O
	+				o kT)				20
					00	o			00
	+				k/Ί				CN
					o	<**>			O
					o		*—«		O
	+								CN
					o				O
					o		·—¹	F—	O
				kT)				CN
	-t-
					o	f-*)			O
					o		r—*	F—l	O
	+				k/Ί				CN
					o	f—>			O
					o		F—	F—«	O
!	+				vn				CS
i					o				o
					o			F—*	o
	+				un				CN
	+				00	o			O o
					ΜΊ				CN
					o	f—>			O
	-r				o		F—>	<—1	o
					kn				CN
					o				O
	+				o		F—*	F-M	O
					k/Ί				CS
					o				o
	f				o		F—		o
					kO				CS
					o	Q			o
	+				o un				20
c

ε
	+				00	O			00
c					kn				CS


t				£
ζ·					o		_c
0				ς ' *»	'n	c	<Zi	r;	_c
	CZ)			I	o c	E	o X)	<5	o
sg	Q	k/Ί	CZ)		CQ	C	c3	D.
⁵	m	m	s	s	ε	H		Z	u

o

C;

·§

O k/Ί
j 05 j
1 ⁰⁵ 1
O kn
1⁵θ 1
o o
Hšo
1⁵⁰ 1
		kO CS k/Ί
	1 26.3 I
1 25
1 50 I
\| ooi
100 !
\| ioo
Saharoza	1 Glukoza \|	Maltoza \|

b<

£ 'S o

ε o

<

c

CN

CN *

O.

CN

		CN
		CS
		CS
		CS
		CS
		CN
		cs
		CS
		CS
		CS
		CS
		CS
r-
	3.5 1
		CS
Uf a) 00 <	Agar Gellan-gum	E ZJ 00 1 C <0 Ίυ o

filtersko steriliziran in dodan gojišču po avtoklaviranju

CN

CN ‘O >C/5

O

OD o

Ξ u

c £

Ό ca <

j ω

ca <

H »3 §

'·*.

-i:

'S •S

K.

$

CN

CN ir

		CN
		CN
		CN
		CN
		CN
		cn
		CN
		CN
		CN
		CN
Γ-
	vn m
		CN
. L, 03 oo <	Agar Gellan-gum	Gellan-gum \|

Claims

PATENTNI ZAHTEVKI

1. Postopek za indukcijo neposredne in vitro organogeneze pri čebuli, označen s tem, da obsega stopnje:

(i) inokulacija cvetov tik pred odprtjem cvetnega odevala na indukcijsko gojišče, ki vsebuje zadostno koncentracijo rastlinskih rastnih regulatorjev in hranilne komponente ter strjevalce gojišča za iniciacijo nastanka neposredne somatske organogeneze, pri čemer rastni regulatorji v tej fazi vsebujejo učinkovito mešanico avksinov in citokininov, gojišče pa vsebuje mikro in makro elemente, vitamine, inozitol, prolin, ogljikove hidrate in sttjevalce gojišč;

(ii) po ustreznem času indukcije prenos cvetov z indukcijskih na diferenciacijska gojišča, ki vsebujejo zadostno količino citokininov ter mikro in makro elemente, vitamine, inozitol, prolin, saharozo in strjevalce gojišč do nastanka neposredne organogeneze;

(iii) opcijsko odstranitev cvetnega odevala s cvetov in gojenje izoliranih ovarijev ob prenosu z indukcijskega na diferenciacijsko gojišče, drugi postopki so enaki kot opisani v točkah (i) in (ii) in vodijo do nastanka neposredne organogeneze;

(iv) ločevanje v točkah (ii) ali (iii) nastalih skupkov somatskih poganjkov ter prenos večjih poganjkov na koreninjenje oziroma subkultiviranje preostalih kompaktnih organogenih struktur;

(v) aklimatizacija ukoreninjenih pri (iv) dobljenih poganjkov.
2. Postopek po zahtevku 1, označen s tem, da indukcijsko gojišče vsebuje kot strjevalce gojišča gellan-gum, mešanico agarja in gellan-guma ali samo agar.
3. Postopek po zahtevku 1, označen s tem, da diferenciacijsko gojišče vsebuje kot stijevalce gojišča gellan-gum, mešanico agarja in gellan-guma ali samo agar.
4. Postopek po zahtevku 1, označen s tem, da gojenje na indukcijskem gojišču traja od 3 do 12 dni.
5. Postopek po zahtevku 1, označen s tem, da je v indukcijskem in diferenciacij skem gojišču vir ogljikovih hidratov saharoza, glukoza ali maltoza.
6. Postopek po zahtevku 1, označen s tem, da indukcijska in/ali diferenciacijska gojišča vsebujejo od 25 do 100 g/1 saharoze.
7. Postopek po zahtevku 1, označen s tem, da indukcijsko gojišče poleg citokinina vsebuje kot vir avksina 2,4-diklorfenoksiocetno kislino ali pikloram.
8. Postopek po zahtevku 1, označen s tem, da indukcijsko gojišče poleg avksina ne vsebuje citokinina ali vsebuje benzilaminopurin, tidiazuron ali 2ip.
9. Postopek po zahtevku 1, označen stem, da diferenciacij sko gojišče vsebuje kot vir citokinina tidiazuron ali benzilaminopurin.
10. Postopek po zahtevku 1, označen s tem, da proces indukcije poteka na svetlobi ali v temi.
11. Postopek po zahtevku 1, označen s tem, da proces diferenciacije poteka na svetlobi ali v temi.
12. Postopek po zahtevku 1, označen s tem, da sestava makro in mikro elementov v indukcijskih gojiščih vsebuje mešanice BDS, B5 ali MS.
13. Postopek po zahtevku 1, označen s tem, da sestava makro in mikro elementov v diferenciacijskih gojiščih vsebuje mešanice BDS, B5 ali MS.