SE536400C2 - Ny metod för snabb detektion av hepatocyttillväxtfaktor i biologiska vätskor - Google Patents

Description

20 25 30 536 4ÜÜ vid infektionssjukdomar visats möjligen kunna visa på icke-fungerande terapi på ett tidigt stadium.

Insikt i den kliniska betydelsen och skillnader mellan rekommenderade terapier, differentialdiagnoser mellan inflammatoriska tillstånd i kroppen har varit änmet för ett flertal undersökningar. Ett stort kliniskt problem är att bestämma huruvida infektion eller andra inflarnrnatoriska störningar orsakar sjukdomen. Ett flertal markörer används typiskt av läkare för att ställa rätt diagnos, såsom mikroskopanalys och odling av kropsvätskor, antal vita blodkroppar, C-reaktivt protein, procalcitonin och laktat i plasma. Dock finns det ännu ingen gyllene standard att använda. Problem med att ställa rätt diagnos uppkommer dagligen vid behandling av inflammatoriska störningar i tarmen, ulcus, ledsjukdomar, störningar i centrala nervsystemet, utgjutningar i bukhinna, lungsäck och hjärtsäck, bland annat. Mängden rutinmarkörer som CRP och antal vita blodkroppar kan vara hög vid flera stömingar och odlingar är inte alltid positiva trots en infektion. Höga mängder HGF och dess användning i diagnos och prognos 'lör infektionssjukdomar diskuteras i PCT-ansökan PCT/SE200l/0O183l.

I dessa studier bestämdes dock hela mängden HGF i kroppsvätskoma med ELISA-metod.

Olika studier om HGF har rapporterats. Vissa studier har använt bestämning av HGF i plasma/serum och urin för diagnos och screening av sjukdomar som akut njursvikt, hjärtinfarkt, urinblåsecancer, akut bukspottkörtelinflannnation och akuta och kroniska lungsjukdomar. Av detta skäl har tidigare beskrivna metoder som ELISA och Westem blotting använts. Detektion av stora mängder cytokiner vid inflammatoriska sjukdomar är inget unikt fynd. Dock, i vissa fall, har bestämning av HGF funnits vara en känslig metod som kan detektera specifika kliniska problem mycket enklare än rutlnmetoderna (PCT-ansökan PCT/SE200l/001831).

Tidigare beskrivna metoder, som ELISA och Westem blotting baseras på en interaktion mellan HGF i proverna och en antikropp som binder specifikt till HGF. I ELISA bestäms mängden enkelkedj at och dubbelkedj at HGF. Genom Western blotting bestäms kvaliteten på HGF genom bestämning av synbara molekylvikter i provet. Dessa metoder är dock omständliga och arbetsintensiva. 10 15 20 25 536 4ÜO Den innovativa användningen av biosensorer är användbar, billig och snabb inom detta analysområde. Metoden ytplasmonresonans (BIACORE®) kan användas för detektion av HGFi feces (WO2005/031365). Tekniken kan detektera llGF-nivåer och kvalitet i samma körning.

WO20l0/151222 beskriver en metod för att bestämma närvaro, frånvaro eller mängd biologiskt aktivt eller inaktivt HGF i ett prov, innefattande att bringa provet i kontakt med en gel som innefattar en HGF-bindande komponent från extracellulära matrix eller cellmembran, tillsätta toluidinblått till gelen, och korrelera färgen på gelen och/eller en vätska i kontakt med gelen, med närvaro, frånvaro eller mängd biologiskt aktivt HGF i provet.

-I fallet infektion: I olika organ ökar nivåerna HGF lokalt vid infektionsstället. Hela mängden protein kan detekteras med ELISA. Med Biacore-teknologi är detektion av interaktionsnivån (signaler) till monoklonala, polyklonala antikroppar mot HGF såväl som chipimmobiliserat heparansulfatproteoglykan (HSPG) hög och korrclerar positivt med resultaten erhållna med ELISA.

-I fallet kronisk inflammation: Trots höga mängder HGF som kan hittas med ELISA i prov, observeras icke-signifikant korrelation mellan ELISA och resultat erhållna med Biacore. Det kan vara att ingen eller mycket låg signal dctekteras med Biacore som visar pâ en svag interaktion med liganderna. Interaktionen med protoonkogenreceptorn c-met kan vara hög och signalerna korrclcrar positivt med immobiliseringnivån. Det är en låg signalnivå i HSPG- kanalen. Tillsats av HSPG eller dextransulfat till proverna minst 10 minuter före analys minskar eventuellt inte signalen i HSPG-kanalen. Proteinet kan vara biologiskt inaktivt.

Metod tplattform) -Underliggande mekanism Tillväxtfalctorerna och cytokinerna som hepatocyttillväxtfaktor som produceras vid skador frisätts endokrint och produceras lokalt av intilliggande mesenkymala celler. Proteinet 10 15 20 25 30 535 400 interagerar med cellbindingsspecifika receptom med hög affmitet och skickar signaler in i cellen vilket resulterar i regeneration av det skadade organet. l fallet med HGF krävs en icke- specifik receptor på cellmembranet och den extracellulära matrixen (ECM) för att fånga cytokinet och göra det tillgängligt för den specifika receptom (c-Met-receptorn). Därför fångas inte varianter av HGF som inte uppvisar någon affinitet för H SPG eller andra proteoaminoglykaner av ECM efter frisättning och interagerar eventuellt inte med den specifika receptorn. Därför kan proteinet vara inaktivt trots hög affinítet till receptorn c-Met.

I våra tidigare arbeten har vi studerat HGF med SDS-PAGE, Western blot, ELISA och ytplasmonresonans och visat att HGF -proteinet (endogent och rekombinant) som inte band till proteoaminoglykan (HSPG, heparansulfat) eller dcxtransulfat, inte hade hade någon biologisk effekt i modellerna in vivo (hårtillväxt möss) eller in vitro (CCL-53.1 celler) som användes i vår grupp. Vi har sett skillnader i bindingsaffinitcter till HSPG i ytplasmonresonansmetoden för patienter med akuta infektioner jämfört med kroniska inflammationer. Vår primära slutsats är att i patienter med kronisk inflamrnation är höghierarkiska cytokiner som HGF inaktiverade och därför kan de behöva exogent biologiskt aktivt HGF för att stimulerar regenerering. Som ett exempel har behandling med exogent HGF visats vara fördelaktigt i behandling av vissa fall av kroniska bensår (PCT-ansökan PCT/SEZOOI/Ol 831 ). HGF har befunníts förstärka migration av friska intilliggande hudepitelceller mot det skadade området genom att ändra cellskelettstrukturen hos celler in vitro. Ett förhöjt uttryck av protoonkogenrcceptom met (c- met) i ulcusorrirådet hos patienter med kroniska ulcerationer observeras. Behandling med exogent HGF minskade uttrycket av c-met signifikant. Det farms en negativ korrelation mellan koncentration av biologiskt aktivt endogent HGF i utsöndringar från ulcerationer och uttryck av protoonkogenreceptorn met (c-met). Behandlingar med exogent HGF patienterna med en låg mängd endogent HGF och högt uttryck av protoonkogenreceptorn met (c-met) orsakade kärlproliferation och reduktion av ulcerationsarea. Denna modell av organskada i huden och besläktade händelser kan gälla även för andra organvävnader.

Sammanfattning av uppfinningen I en första aspekt hänför sig föreliggande uppfinning till en metod för att detektera närvaro eller frånvaro av biologiskt aktivt HGF i ett prov, innefattande att bringa ett HGF- 10 15 20 25 535 400 innehållande prov i kontakt med en porös fastfas som i sig har åtminstone en HGF-bindande komponent från extracellulär matrix (ECM) eller cellmembran, såsom en proteoaminoglykan eller en glukosaminoglykan, och en indikatorkomposition innefattande metylrött, bromtymolblått och en kvartenär ammoniumíörening.

I en andra aspekt hänför sig föreliggande uppfinning till en anordning innefattande en porös fastfas som i sig har åtminstone en HGF-bindnande komponent från extracellulär matrix (ECM) eller cellmembran, såsom en proteoaminoglykan eller en glukosaminoglykan, och en indikatorkomposition innefattande metylrött, bromtymolblått och en kvartenär ammoniumförening.

Definitioner och förkortningar Kvalitet på HGF indikerar fiânnågan hos HGF att binda till den extracelliilära matrixen och utöva sin biologiska effekt in vivo.

HGF betyder hepatocyttillväxtfaktor, även benämnd Scatter Factor på engelska.

ECM betyder extracellulär matrix.

HSPG betyder heparansulfatprotcoglykan.

MQ, eller Milli-Q, refererar till vatten som är böggradigt renat och avjoniserat.

PBS betyder fosfatbuffiad saltlösning.

Detaljerad beskrivning av upp/inningen Hepatocyttillväxtfaktor i sin biologiskt aktiva form har hög affmitet till proteoaminoglykaner som heparansulfatproteoglykan. och dextransulfat. Denna affmitet liknar bindningen av tillväxtfaktor till cellmembranet före interaktion med dess membranbindande receptor. 10 l5 20 25 535 4ÜÜ Denna affinitet används i följ ande aspekter och utföringsformer av föreliggande uppfinning.

Baserat på de tidigare resultaten med observationer från ytplasmonresonansmetoden som visade att cytokincr med hög affinitet till ECM-komponenter frisattes vid akut infektion, har uppfinnarna framställt en plattform genom tillsats av proteoarninoglykan i en basal fast matris, såsom cellulosa. Affrniteten för protein till proteoaminoglycan visualiseras därefter med fárgförändringar i närvaro av indikatorer innefattande bromtymolblått och en kvartenär arnmoniurnfórening och/eller metylrött.

Uppfinningen använder en kudd-fas innefattande innehållande en HGF-bindande komponent från den extracellulära matrixen eller cellmembran, företrädesvis dextransulfat eller HSPG.

Kudden är tillverkad av en porös fast fas, såsom cellulosa, nitrocellulosa eller papper. En for närvarande föredragen porös fast fas är ett tjockt cellulosa-baserat filterpapper med stor laddningskapacitet och genomsnittlig retention filterpapper 598 Schleicher & Schull. Följande recept föredras för närvarande: Den porösa fasta fasen impregneras med en lösning av 0,02% metylrött (Merck), 0,4% kvartenär arnrnoniumförening (Merck) och 0,l% bromtymolblått (Panreac) i metanol. All kemikalier fixeras till cellulosamatrisen genom att tillsätta 0,5% beläggnisngstabilisator (Acros). Pappren torkas i en ström varm luft.

Därefter dränks den porösa fasta fasen under 5 till l0 sekunder med en lösning sammansatt av 0,1 mM dextransulfat (Fluka) i avj oniserat destillerat vatten (MQ) och torkas i en ström av varm luft.

Den värmetorkade porösa fasta fasen innefattande proteoaminoglykan med indikatorkomposition kan senare fixeras på dubbelsidigt adhesivt papper och immobiliseras på ett fast underlag, såsom ett plastband, och skäras till remsor i storlek lämplig för användning, såsom med en bredd om 6 mm. 10 15 20 25 536 400 Vid användning, för enkel hantering, överförs en mängd feces till 0,5 ml spädningsbuffert (0,1 M PBS pH 7,4) och en testremsa innefattande en porös fastfas immobiliserad på ctt fast underlag doppas i lösningen. När testremsorna doppas i lösning innehållande HGF, beroende på mängd analyt, reagerar specifikt med dess konjugat eller receptor till exempel dextransulfat. Därför ändrar remsan färg från gul till olika observerbara intensiteter av grönt till marinblått.

De andra komponenterna av extracellulär matrix (glyko saminoglykaner) kan användas, men dextransulfat är billigare och visar liknande resultat. llppflnningenliänfór sig till en metod innefattande att doppa ner en remsa i ett biologiskt prov eller utspätt med buffert, företrädesvis PBS 0,5 M till 0,15 M, pH 6,00-8,00, varvid biologiskt aktivt HGF binder till dextransulfat.

Kvarvarande droppar av prov på remsans kanter avlägsnas genom att försiktigt knacka mot läskpapper. Interaktion mellan dextransulfat och indikator ändrar färgen på kudden från gult till ett spektrumav grön färg till mörkblått som positiv signal för närvaro av HGF.

Det finns en specifik interaktion mellan biologiskt aktivt HGF och dextransulfat i närvaro av indikatorer i det porösa fastfasmediet. Eftersom provet innehåller biologiskt aktivt HGF som binder till dextransulfat, ändras färgen på den porösa fasta fasen.

Intensiteten på den gröna färgen beror på affmiteten för HGF till dextransulfat och blockerand Hïj oner i den porösa fasta fasen.

Mängden HGF, som observerad intensitet av grön färg i den porösa fasta fasen, kan bestämmas genom jäiniörande mätning av HGF med användning av en standardmetod, till exempel en kvantitativ ELISA-metod. En eller flera referenslösningar med känt HGF-irmehåll 10 15 20 25 536 IlÜÜ används valfritt för att utvärdera reaktionsresultatet. En negativ referens kan användas (till exempel vatten eller PBS). En positiv referens kan vara ett prov av frisk kroppsvätska eller en HGF-innehållande produkt med känt HGF-innehåll.

Genom metoden enligt uppfinningen år det möjligt att snabbt särskilja mellan en akut inflammation såsom en bakteriell infektion i ett organ från en kronisk inflammation.

Metoderna och produkterna kan användas för att analysera följande: - Skillnader mellan septisk artrit och icke-septisk eller reaktiv artrit i leder - Skillnader mellan akut smittsam magtarmkatarr och kronisk inflammatorisk tarmsjukdom och andra orsaker till diarré - Skillnader mellan akut septisk hjärnhinneinflarmnation och icke-specifik pleocytos i cerebrospinalvätska - Skillnader mellan akut njursvikt såväl som pyelonefrit och distal urinvägsinfektion såväl som kronisk njurskada - Skillnadermellan lunginflammation och kronisk obstruktiv lungsjukdom i kondenserad utandningsluft - Skillnader mellan septisk inflammation i lungsäcksutgjutning och askites och icke- septisk inflammation - Närvaro av HGF i serum och plasma - Standradutvärdering av biologiskt aktivt HGF i läkemedel och blodprodukter - Övervakning av behandling med antibiotika - Lokalisering av infektiöst fokus vid sjukdom

Claims (1)

1. 0 15 20 25 30 536 4Ü0 PATENTKRAV . En metod för att bestämma närvaro, frånvaro eller mängd av biologiskt aktivt HGF i ett prov, innefattande stegen - bringa provet i kontakt med en porös fast fas innefattande en HGF-bindande komponent från extraeellulär matrix (ECM) eller eellmembran, samt en indikatorkomposition innefattande bromtymolblått, en kvartenär annnoniumförening, och metylrött, - korrelera färgen på den porösa fasta fasen med närvaron, frånvaron eller mängden biologiskt aktivt HGF i provet. . En anordning innefattande en porös fast fas innefattande åtminstone en HGF -bindande komponent från extraeellulär matrix (ECM) eller eellmembran, samt en indikatorkomposition innefattande bromtymolblått, en kvartenär arnmoniurniörening, och metylrött. . En metod enligt patentkrav 1 vari den HGF-bindande komponenten är en proteoaminoglykan eller glykosaminoglykan. . En metod enligt patentkrav 3, vari den HGF-bindande komponenten är heparansulfatproteoglykan eller dextransulfat. . En metod enligt något av patentkraven 1, 3 eller 4, vari nämnda prov är en vävnad, kroppsvätska eller exkrement från en patient. . En metod enligt något av patentkraven 1, 3-5, vari nämnda prov är en farmaeeutisk produkt. . En metod enligt något av patentkraven 1, 3-6, vari korreleringen av färgen på den porösa fasta fasen med närvaron, frånvaron eller mängden biologiskt aktivt HGF i provet inkluderar en jämförelse av färgen hos den porösa fasta fasen med en porös fast fas som har bringats i kontakt med åtminstone en referenslösning med känt HGF- innehåll. 535 4ÜÜ 10 8. En anordning enligt patentkrav 2, vari den HGF-bindande komponenten är en proteoaminoglykan eller glykosaminoglykan. 5 9. En anordning enligt patentkrav 8, vari den HGF-bindande komponenten år heparansulfatproteoglykan eller dextransulfat. 10. En anordning enligt något av patentkraven 2, 8 eller 9, vari den porösa fasta fasen innefattar cellulosa. 1 O