SE506908C2 - Medicinsk användning av padlockprober - Google Patents

Description

506 968 2 sträng kan inrymmas i den stora fåran i B-form DNA-duplexen för att bilda triplexstruktur.

Duplexigenkänning av en oligonukleotid innefattar bildande av tvà vätebindningar med purinerna av Watson-Crick-baspas inuti dubbelhelixens stora skära. Tymin, cytosin och guanin kan anta tvä olika orienteringar kallade 'Hoogsteen' och 'omvänd Hoogs- teen' enligt analogi med vätebindningsschemat upptäckt av Hoogsteen i ko-kristaller av A- och T-derivat. Däremot kan adenin och inosin bilda tvà vätebindningar med A.T-baspar i en enda orientering. Det bör noteras att i syfte att bilda tvâ vätebindningar med G, mäste cytosin protoneras. Därför är tripletter som involverar C- x G.C stabilare vid surt pH. Me- tylering vid C-5 av cytosin bidrar också till stabilisering av trippelhelixen.

Flera mekanismer föreligger med vilka trippelhelixbildning kan förändra gentranskription= 1. Trippelhelixbildning inuti promotorregionen kan förändra DNA-konformationen och därför förändra graden och effekti- viteten av RNA-polymerasinitiering. Detta kan leda till antingen aktivering eller inhibition av transkription. 2. Oligonukleotidbindning till en DNA-sekvens som överlappar ett transkriptionsfaktorbindningsställe kan inhibera dess transaktiverande kapacitet. 3. Triplexbildning inom eller intill regionen där RNA- polymeras binder kan inhibera transkriptionsinitiering även om RNA-polymeras och transkriptionsfaktorer fortfa- rande är bundna till promotorn. 4. Oligonukleotidbindning nedströms om RNA-polymeras- igenkänningsstället kan inhibera transskriptionsmaskineri- et utmed DNA-molekylen och därför blockera RNA-elongering. 506 908 3 Málsökning genom trippelhelixbildning är endast begränsat till en speciell underuppsättning av DNA-sekvenser, t.ex. de som är förknippade med homopurin-homopyrimidin-regioner.

Ett alternativt sätt att direkt inhibera DNA beskrivs i Nuc- leic Acids Research, 1993, vol. 21, nr 2, s. 197-200 av Niel- sen et al.. Författarna beskriver att PNA (peptidnukleinsyrachimärer, peptide gucleic gcids chimera), d.v.s. DNA-analoger i vilka deoxyribosfosfatryggraden har bytts ut mot en peptidryggrad som består av (2-aminoetyl) glycinenheter som har behållit DNA:ts hybridiseringsegenska- per. Man har visat att PNA binder kraftigare till komplementä- ra oligonukleotider än DNA i sig. Vidare kan PNA binda sek- vensspecifikt till dubbelsträngat DNA. Denna bindning äger rum genom strängförskjutning snarare än genom trippelhelixbild- ning. Samanfattningsvis bildas först ett relativt instabilt strängförskjutningskomplex med endast en PNA-molekyl bunden till målet genom Watson-Crick-vätebindning, vilket komplex därefter fångas genom bindning av en andra PNA-molekyl via Hoogsteen-vätebindning.

På grund av den relativt kraftiga bindningen minskar emeller- tid sekvensspecificiteten snabbt med PNA-probernas längd.

Squire et al. beskriver i Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1992, 31, nr 12, cirkulära hybridmolekyler som innehåller två oligo- nukleotiddomäner vilka bryggas av tvâ oligoetylenglykolkedjor.

Dessa molekyler binder med hög affinitet till komplementära strängar av RNA och DNA och uppvisar resistens mot nedbrytning av nukleaser. Vidare binder dessa prober endast till enkel- strángade molekyler.

Greninfàngningsreaktioner (branch capture reactions, BCRs) är riktade mot duplexrestriktionsfragment som slutar i överhäng- ande baser med korta homologa enkelsträngade DNA-oligonukleo- tider som kan paras med de oparade överhängande baserna och viss flankerande sekvens så att fullständig basparning för- 506 908 4 skjuter änden av den ena ingående strängen genom grenmigra- tion. Begränsningen för BCRs är att de endast kan vara riktade mot kända terminala sekvenser, varför de inte är särskilt lämpliga som terapeutiska medel.

I Nature Genetics, vol. 3, april 1993, beskrivs en annan probe-màlsökningsmetod där RecA protein-täckta korta enkel- strängade DNA-prober används för att bilda fyrsträngade hybri- der mellan prober och duplex-DNA-mål. Med denna metod kan in- ternt belägna ställen målsökas och de fyrsträngade hybriderna är stabila.

Alla ovan nämnda nukleinsyramålsökningsmetoder har nackdelar, varvid den viktigaste är den otillräckliga sekvensspecificite- ten för proberna. Detta är särskilt betydelsefullt med hänsyn till probernas potentiella användning som terapeutiska medel.

Föreliggande uppfinning härstamar från den samtidigt under behandling varande internationella ansökningen nr PCT/SE95/00163 med titel: Metod, reagens och kit för detektion av specifika nukleotidsekvenser. Denna ansökning hänvisas till och införlivas genom referens. I denna ansökning beskrivs så kallade padlockprober.

Sammanfattningsvis beskriver nämnda ansökning en probe som är utformad för att cirkuläriseras i närvaro av en màlsekvens, vari proben orsakas att sluta sig omkring màlnukleinsyran, t.ex. DNA eller RNA, så att den cykliska proben kommer att va- ra läst till och därigenom effektivt länkad till màlnukleinsy- ran på ett sätt liknande hänglàs ("padlocks"). Cirkularise- ringen av probeändarna uppnås med t.ex. ligas. Sådan kovalent katenering av probemolekyler till màlsekvenser resulterar i bildande av en extremt stabil hybrid.

Uppfinnaren har nu överraskande funnit att dessa padlock- prober har förmåga att påverka genfunktion direkt genom att binda till dubbelsträngade nukleinsyror, utan ett föregående 506 908 5 denatureringssteg, och därigenom påverka replikationen av transkriptionen av den bundna molekylen.

Föreliggande uppfinning tillhandahåller nukleinsyramàlsökande kompositioner som har ovan nämnda önskade egenskaper. Komposi- tionerna innefattar en effektiv mängd av en padlockprobe. Pad- lockproben har två fria nukleinsyraänddelar vilka är åtminsto- ne partiellt komplementära till och har förmåga att hybridise- ra med två åtminstone väsentligen intilliggande respektive re- gioner av en dubbelsträngad målnukleinsyra. Padlock-proben kan cirkuläriseras och katenera med målsekvensen i närvaro av ett länkande ämne. Kompositionerna som innefattar padlockproberna har inhiberande aktivitet på dubbelsträngade nukleinsyror och formuleras med en bärare som är lämplig för deras avsedda an- vändning.

Vidare tillhandahåller föreliggande uppfinning en metod för att inhibera dubbelsträngade nukleinsyror i vilken ovan be- skrivna kompositioner administreras.

Padlockprobe-målsökning till dubbelsträngat DNA innefattar ett länkande ämne som kan vara kemiskt eller biologiskt. Det är t.ex. en ligas-assisterad reaktion. Principen som används i en sådan reaktion är att två-probe-segment, som är komplementära till målsekvenser belägna i juxtaposition, förenas till en kontinuerlig probesekvens med hjälp av ett DNA-ligas. Exempel på ligaser är T4 DNA-ligas, T7 DNA-ligas, E. coli DNA-ligas och Thermus thermophilus DNA-ligas. Förutom ligaser kan pro- teiner såsom RecA eller enkelsträngsbindande protein möjlig- göra för cirkulariserade prover att kompletteras med, och kateneras till, basparat DNA.

Kompositionerna enligt uppfinningen kan innehålla ett länkande ämne beroende på användningen av kompositionerna. In vivo finns RecA och DNA-ligas redan och således är tillsats av ett länkande ämne inte nödvändigt för terapeutiska applikationer. 506 908 6 Enligt en ytterligare utföringsform av föreliggande uppfinning används padlockprober som in vitro-reagens. För denna applika- tion förbättras effekten av padlockprober vidare genom att partiellt bygga proberna av förändrade nukleinsyror, t.ex.

PNA, som har kraftigare basparning.

Padlockprober binder selektivt och stabilt till dubbelsträngat DNA och möjliggör sekvensspecifik modifikation av DNA. Faktum är att det beräknas att padlockproberna till och med kommer ha förmåga att inhibera genomiska punktmutationer eftersom liger- ingen är beroende pà den exakta màlsekvensen. Denna förhöjda specificitet uppnås genom det faktum att två kortare probeseg- ment màste samverka för att bindning skall ske. Ytterligare en fördel är att padlockprober inte är känsliga för exonukleaser pà grund av deras cirkulära form när de ligerats. Däremot ned- bryts överskott av padlockprober av exonukleaser vilket är en fördel vid, t.ex. läkemedelsformulering.

Uppfinningen komer nu att illustreras vidare pä exemplifie- rande sätt genom följande icke-begränsande specifika exempel.

EXEMPEL En padlockprobe oligonukleotid som har följande sekvens: 5' P- TGG TGT TTC CTA TGA-((HEG2)CB)4(HEG)2-AAG AAA TAT CAT CTT-3', där P är ett fosfatrest, HEG är hexaetylenglykol och C-B är biotinylerad C-rest, syntetiserade med användning av en kom- mersiell DNA-syntetiserare. Oligonukleotidens tvâ ändar kunde baspara intill varandra med exon 9 av CFTR-genen som fanns i den dubbelsträngade plasmiden pUC-19.

Proben märktes genom att man bytte ut den närvarande 5'- fosfatresten mot 32P med användning av polynukleotidkinas var- efter hybridisering fick ske med màlsekvensen. I en volym av 20 pl blandades 2 pmol probe med 0,2 pmol plasmid i närvaro av 24 pmol RecA-protein i en lösning av 10 mM Tris, pH 7,5, 10 mM 506 908 7 Mg(Ac)2, 50 mM KAc, 2 mM ATP med 5 enheter T4 DNA-ligas och inkuberades under 30 minuter vid 37°C.

Efter inkubering utfördes tvättning under icke-hybridiserande betingelser. Därefter separerades reaktionsprodukterna pà en denaturerande 6% polyakrylamidgel och den radioaktiva markören kvantifierades med Phosphorimager. Resultaten visade klart bindning av ovanstående padlock-probe till den dubbelstrângade plasmiden.

Claims (7)

506 908 8 PATENTKRAV

1. Farmaceutisk komposition för att màlsöka nukleinsyror, inne- fattande en effektiv mängd av en padlock probe som har två fria nukleinsyradelar, vilka är åtminstone delvis komplementära och har förmåga att hybridisera med tvä åtminstone väsentligen in- tilliggande respektive regioner av en màlnukleinsyrasekvens så att den kan cirkulàriseras och katenera med målsekvensen, kännetecknad av att kompositionen har förmåga att direkt mäl- söka dubbelsträngade nukleinsyror och att den har inhiberande aktivitet på dubbelsträngade nukleinsyror.

2. Farmaceutisk komposition enligt krav 1 i samblandning med en lämplig bärare.

3. Farmaceutisk komposition enligt krav 1 i samblandning med en farmaceutiskt godtagbar bärare.

4. Farmaceutisk komposition enligt något av kraven 1 - 3, som vidare innefattar ett länkande ämne.

5. Farmaceutisk komposition enligt krav 4, vari det länkande ämnet är valt från ett ligas, RecA eller enkelsträngsbindande protein.

6.Komposition för att målsöka nukleinsyror, innefattande en effektiv mängd av en padlock probe som har två fria nuklein- syradelar, vilka är åtminstone delvis komplementära och har förmåga att hybridisera med tvâ åtminstone väsentligen in- tilliggande respektive regioner av en målnukleinsyrasekvens sä att den kan cirkulàriseras och katenera med mälsekvensen, för användning som ett läkemedel.

7. Användning av en komposition för att mälsöka nukleinsyror, innefattande en effektiv mängd av en padlock probe som har två fria nukleinsyradelar, vilka är åtminstone delvis komplementära 506 908 9 och har förmåga att hybridisera med tvâ åtminstone väsentligen intilliggande respektive regioner av en màlnukleinsyrasekvens så att den kan cirkulâriseras och katenera med màlsekvensen, vid tillverkning av ett läkemedel för behandling av genetiska defekter.