SE446405B - Forfarande for framstellning av enzymet kolesteras genom odling av achromobacter delicatulus nrrl b-12115 och for hydrolys av kolesterolestrar av fettsyror genom anvendning av detta enzym - Google Patents

Description

446 405 10 15 20 25 30 35 och fysiologiska egenskaper återges nedan.

A-ODLINGSEGENSKAPER l) 2) Fast medium: a) Pâ näringsagar: kolonier med en diameter av U .:. “Mm 2 mm efter 24 timmars inkubering vid 300 C, med hela kanter som tenderar att bli vâgformiga efter 7 dagars åldring. Konvexa gråvita kolonier av fuktig, krämartad konsistens, lätt genomskin- liga. Ingen flockbildning på agariserat medium. b) På agar-gelatin: ljusa, mjuka gelatinartade kolonier. e ' Flytande medium: a) På saltodlingsvätska + jästextrakt: krämartad grumlighet med ringa sediment. b) På peptoniserat vatten: god grumlighet efter 24 tinnar via 3o° c. sediment och ytfiim icke pâvísbara.

B-MORFOLOGISKA EGENSKAPER l) 2) 3) Gramnegativ stav med en medellängd av 2 mikrometer.

Positiv mobilitet (observation av hängande droppar).

Peritrichia-flimmerhâr. Förtätning vid polerna ej observerad.

C~FYSIOLOGISKA EGENSKAPER 1) 2) 3) 4) 5) 6) 7) 8) 9) 10) 11) 12) 13) Optimal tillväxttemperatur mellan 250 och 300 C. Tillr växer väl vid 20° C. Ingen tillväxt vid 42° C; Angriper icke agar.

Alstrar icke syra eller gas av glukos.

Utnyttja: icke karbamid.

Uppvisar icke cytokron-C oxidas.

Reducerar nitrater till nitriter. Är inert vid OX/F-testet.

Alstrar icke indol utgående från tryptofan.

Negativt metylrött.

Positiv katalys.

Alstrar icke syra eller gas utgående från laktos.

Förvätskar gelatin.

Lackmusmjölkz lätt surgöring efter 7 dagar.

För.identifieringsändamål användes de förfaranden un., “äävxfií ñftfïïpp", v r”- ~ .z qi t.) dä., f: 10 15 20 25 30 35 446 405 3 som anges i "Methods of detection and identification of bacteria" av B.M. MITRUKA och M.J. BONNER, CRC PRESS INC. 1976 och i "Bergey Manual of Determinative Bacteriology" 7:e uppl.

Stammen enligt föreliggande uppfinning kan odlas under aeroba betingelser genom submers odling under användning av omrörda fermentatorer.

Ett flytande odlingsmedium innehåller en källa till assimilerbart kol, en kvävekälla och mineralsalter. Kol- källor, som kan användas, innefattar aminosyror, glukos, oljesyra, linolensyra, kolesterolestrar och natrium- _ acetat. Kvävekällor, som kan'användas, innefattar orga- niska och oorganiska kväveföreningar, såsom köttextrakt, jästextrakt, pepton, triptan, aminosyror, hydrolyserat NH: , Ett lämpligt odlingsmedium har exempelvis följande kasein, sojamjöl, nitrater och salter av sammansättning: Jästextrakt l-5 g/1 Sojamjöl ) 1-5 g/1 KZHPO4 å ( Spår upp NaNO3, MgSO4 ) É till l g/l pH-värdet vid odlingen ligger mellan 6 och 8, företrädesvis mellan 6,8 och 7,2. Temperaturen ligger. mellan zo° och 37° c, företrädesvis mellan 2s° och 3z° c.

Enzymet bildas genom tillsats av kolesteryloleat eller naturliga vegetabiliska oljor till odlingsmediumet före ympning. Hydrolysen av nämnda estrar i odlingsmee diumet av det kolesteras som alstras av stammen _ Achromobacter delicatulus SM 1307 ligare aspekt av föreliggande uppfinning.

Induktionstiden kan variera från 24 timmar till 72 timmar, företrädesvis från 40 timmar till 48 timmarfi Den odlingsvätska som tillvaratas under eller vid utgör en ytter- slutet av jäsningen kan användas som sådan. Alternativt kan den överliggande vätskan från den filtrerade eller centrifugerade odlingsvätskan användas. ,_. _ ,,, rn " . Hu .mf!~.~-31' ßs- Q 'i ' '.n.~1" ' -'- *iifoözi oušnifrv 10 15 _20 25 30 35 446 405 í- En ytterligare teknisk och ekonomisk förbättring kan uppnås genom immobilisering av enzymet genom kombi- - nation med makromolekylära föreningar för bildning av kemiska bindningar med matrisen eller joniska bindningar. .u Wu) , Uppfinningen âskâdliggörs närmare medelst följande r utföringsexempel. t EXEMPEL l En odlingsvätska framställdes med följande saman- ' sättning: ' NaNO3 2 g/l K2HPO4 2 g/l - KCl 0,5 g/l MgSO4.7H2O 0,5 g/l Jästextrakt 10 g/l Kolesteryloleat 5 g/l Odlíngsvätskan erhölls genom att ovan angivna föreningar sattes till avjoniserat vatten. Odlingsvätskans pH-värde inställdes på 7,0 med utspädd klorvätesyra. Det på så sätt framställda mediumet fördelades på 250 ml kolvar genom tillsats av 50 ml odlingsvätska till varje kolv; de steriliserades därefter under 30 minuter vid ll6° C.

I varje kolv inympades l ml av en suspension av Achromobacter delicatulus SM-1302 genom tvättning med 10 ml fysiologisk lösning av patinan stammen som erhölls hos den kultur av 20 ml näringsagar i 200x20 mm rör, vilken kultur nada fatt växa 48 tinnar via 3o° c. . ~ Jäsningskolvarna inkuberades under orbital omröring (180-200 varv per minut) vid 300 C.

Odlingsvätskorna tillvaratogs 48 timmar efter ympning och provades med avseende på enzymatisk akti- vitet. l ml odlingsvätska innehöll 0,2 enzymenheter.

Den enzymatiska aktiviteten bestämdes pâ följande sätt: 1 _ l ml odlingsvätska, som var spädd pâ lämpligt sätt med en 0,1 M fosfatbuffert med pH 6,7, sattes till 5 ml av en lösning av kolesteryloleat innehållande 0,3 mikromol/ml i en 0,1 M fosfatbuffert med pH 6,7 innehållande 0,5 % 10 l5 20 25 30 446 405 P Triton x-1oo. Reaktiønen utfördes 10 minuter vid 37° c i ett omrört vattenbad och avbröts genom att man kokade från reaktionsblandningen avdragna prover under 3 minuter.

Koncentrationen av den genom hydrolys av kolesteryloleatet bildade kolesterolen bestämdes medelst den kollørimet- riska metoden, där den fria kolesterolen oxideras med hjälp av kolesteroloxidas till kolest-4-en-3-on under samtidig bildning av väteperoxid, som reagerar oxidativt med 4-aminoantipyrin och fenol i närvaro av peroxidas för framkallning av en kromogen, som har maximal absorp- tion vid 500 mu. _ Den optimala densiteten hos de färgade proverna uppmättes i en DB-GT Beckmann-spektrofotometer, där kuvetten hade en optimal längd av 0,1 dm vid en våglängd av soo mn.

Om en enhet definieras såsom den mängd enzym som alstrar l mikromol kolesterol per minut under de an- givna testbetingelserna, beräknas antalet enzymenheter per milliliter odlingsvätska med hjälp av följande formel: U 4 x 6 x (E10-EO) ml odl.vätska 5,45 x 0,1 x D där E10 = den optimala densiteten hos det efter 10 minuter avdragna provet Eo = den optimala densiteten hos det vid 0 minuter av- dragna provet 5,45 = den optimala densiteten hos en kolesterollösning med en koncentration av l mikromol/milliliter D = enzymutspädningen.

EXEMPEL 2 En odlingsvätska framställdes med följande samman- sättning: 1 ' POOR. QUALITY 10 15 20 25 30 35 446 405 6 _ g P NaN03 2 g/l KZHPO3 2 g/l KC1 0,5 g/l MgSO4.7H2O 0,5 g/1 Jästextrakt 10 g/1 Olivolja 5 g/l genom tillsats av ovan angivna föreningar till avjoni- serat vatten och inställning av pH på 6,7 med klorväte- syra.

Kulturer av stammen Achromobacter delicatulus SM-1307 i nämnda odlingsvätska, framställda såsom i exempel 1, inkuberades under orbital omröring (180 varv per minut) vid 3o° c.

Odlingsvätskorna tillvaratogs 72 timmar efter ympning och testades som sådana med avseende på kolesteras- aktivitet. l ml odlingsvätska innehöll 0,4 enzymenheter.

EXEMPEL 3 En odlingsvätska framställdes med denii exempel 2 angivna sammansättningen.

Kulturer av stammen Achromobacter åelicatulus SM-1307 i nämnda odlingsvätska, framställda såsom i exempel 1, inkuberades under orbital omröring (180 varv per minut) vid 300 C.

Odlingsvätskorna tillvaratogs 72 timmar efter ymp- ning och centrifugerades och kolesteraset i den över- liggande vätskan användes för bestämning av den totala kolesterolhalten i ett prov av humanblodserum.

För detta ändamål användes följande reagens: Natriumcholat 6 mM Triton X-100 15 g Fenol 7,5 mM 4-aminoantipyrin . 0,5 mM Peroxidas 16 400 U (Boehringer katalog- nummer 127361) 0,1 M natriumfosfatbuffert pH 7,0 1000 ml Kolesterolen bestämdes på följande sätt: 50 mikroliter humanserum och 0,25 ml odlingsvätska sattes MÉ u? 446 405 I* till 2,5 ml reagens. Reaktionen ägde rum direkt i glas- kuvetten, som hade optisk längd av l cm, och framkall- ningen av kromogenen följdes direkt i en DB-GT Beckmann~ spektofotometer vid en våglängd av 500 mn till dess den i serumet närvarande kolesterolen hade fullständigt om- vandlats. Under dessa betingelser erhölls en slutlig optisk densitet av 0,500 motsvarande l64 mg total kolesterolhalt per 100 ml humanserumprov.

Pooïafoflzxnrrï;

Claims (5)

1. 446 405 r B ' P Patentkrav l. Förfarande för framställning av enzymet kolesteras, k ä n n e t e c k n a t därav, att enzymet framställs genom odling av en mikroorganism tillhörande släktet Achromobacter delicatulus identifierad genom numret NRRL B-12115.

2. Förfarande enligt krav l, k ä n n e t e c k n a t därav, att mikroorganismen odlas inom ett pH-intervall av 6 - 8, företrädesvis 6,8 - 7,2.

3. Förfarande enligt krav l eller 2, k ä n n e t e c kj- n a t därav, att mikroorganismen odlas inom ett temperatur- intervall av zo° - 37° c, företrädesvis 2s° - 32° c.

4. Förfarande för hydrolys av kolesterolestrar av fettsyror, k ä n n e t e c k n a t därav, att man bringar nämnda estrar i kontakt med odlingsvätskor av stammen Achromobacter delicatulus NRRL B-1211

5. POOR QUALITY v fi?