RU2847265C2 - Производное тетрапептида, косметическая композиция или фармацевтическая композиция и их применение - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к производному пептида формулы I: R₁-Pro-Lys-Glu-Lys-R₂, его косметической или фармацевтической композиции и их применению. Производное пептида получают путем ковалентного связывания ниацина или транексамовой кислоты с пептидом, оно обладает эффектами снятия воспалительной реакции кожи и ингибирования образования меланина и может применяться в области косметики или медицины для противовоспалительного действия, а также отбеливания и удаления веснушек с кожи, в особенности для уменьшения поствоспалительной гиперпигментации. 12 н. и 4 з.п. ф-лы, 4 ил., 3 табл., 11 пр.

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[1] Настоящая заявка относится к производному пептида, косметической композиции или фармацевтической композиции, включающим производное пептида, и их применению при лечении или уходу за кожей и слизистой оболочкой.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[2] Кожа подвергается воздействию внешней среды и легко подвергается различным физическим, химическим воздействиям и действию патогенных микроорганизмов, что приводит к повреждению клеток ткани кожи и инициирует воспалительную реакцию. Воспалительная реакция не только увеличивает проницаемость кожи, вызывая высвобождение коллагеназы и расщепление коллагена и эластина, в результате чего кожа находится в состоянии провисания и старения; более того, вырабатываемые воспалительные факторы, такие как интерлейкин IL-1α, IL-6 и фактор некроза опухоли ФНО-α, стимулируют миграцию, пролиферацию и дифференцировку меланоцитов, индуцируют продукцию кератиноцитами проопиомеланокортина (ПОМК) и α-меланоцитстимулирующего гормона (α-МСГ), а также усиливают активность тирозиназы, в результате в коже вырабатывается больше меланинов, и поверхность кожи становится темнее или локально появляются пятна.

[3] Поствоспалительная гиперпигментация (ПВГ) является одним из распространенных последствий воспалительной реакции кожи. В настоящее время специфический патогенез ПВГ полностью не выяснен, однако, как вторичная пигментная аномалия, она тесно связана со степенью повреждения базальных мембран, уровнем воспаления и меланоцитами. Э. Бастонини (Bastonini Е) обнаружила, что меланоциты и окружающие их кератиноциты и фибробласты играют важную роль в развитии ПВГ. В то же время миграция, пролиферация и дифференцировка меланоцитов, синтез и активация тирозиназы и перенос меланосом в кератиноциты также могут влиять на возникновение ПВГ. Некоторые модулирующие воспаление факторы, такие как воспалительные медиаторы, воспалительные цитокины и α-меланоцитстимулирующий гормон (α-МСГ), также играют роль в модуляции вышеуказанных активностей в разной степени.

[4] Основным способом лечения ПВГ является контроль воспалительной реакции и ингибирование синтеза меланина с целью снижения стойкой пигментации, связанной с микровоспалительным состоянием. В настоящее время для контроля воспалительной реакции в основном применяют глюкокортикоиды, такие как десонид и гидрокортизон. Кроме того, для ингибирования синтеза или отложения меланина применяются другие соединения. Например, арбутин, койевая кислота и аскорбиновая кислота могут ингибировать синтез меланина, ингибируя активность тирозиназы. Ниацин превращается в никотинамид in vivo и ингибирует транспорт меланиновых гранул из меланоцитов в кератиноциты. Однако эти соединения обычно обладают цитотоксичностью, раздражают кожу или химически нестабильны, при этом одно соединение оказывает лишь некоторый противовоспалительный эффект или ингибирует образование меланина, и его необходимо применять в комбинации. Таким образом, существует потребность в разработке нового соединения, которое сможет не только лечить воспалительную реакцию кожи, но и применяться для ингибирования меланиновой гиперпигментации, что позволит преодолеть существующие недостатки из предшествующего уровня техники.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[5] Настоящее изобретение направлено на создание производного полипептида с отбеливающим действием и противовоспалительной активностью. Такие производные пептидов и косметические композиции или фармацевтические композиции, включающие эти производные пептидов, могут производить отбеливание путем снижения экспрессии α-МСГ или проявлять противовоспалительную активность, подавляя экспрессию IL-6 и ФНО-α. Их можно применять в области косметики или медицины для противовоспалительного действия на кожу, а также для отбеливания и удаления веснушек на коже, в особенности для улучшения пигментации после воспаления.

[6] В этом отношении в настоящем изобретении предложено производное пептида, представленное Формулой (I), или его стереоизомер или смесь его стереоизомеров, или его косметически приемлемая соль, или его фармацевтически приемлемая соль,

в Формуле (I),

R1 выбран из заместителя (i), заместителя (ii) или заместителя (iii), где заместитель (i) представляет собой:

заместитель (ii) представляет собой:

заместитель (iii) представляет собой:

R2 выбран из -NR3R4 или -OR3, где каждый R3 и R4 независимо выбран из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного алкенила;

алкил относится к насыщенному алифатическому алкилу с нормальной или разветвленной цепью, имеющему 1-24 атома углерода (необязательно имеющему 1-16 атомов углерода; необязательно имеющему 1-14 атомов углерода; необязательно имеющему 1-12 атомов углерода; или необязательно имеющему 1, 2, 3, 4, 5 или 6 атомов углерода); необязательно выбранному из метила, этила, изопропила, изобутила, трет-бутила, пентила, гексила, гептила, октила, децила, додецила, тетрадецила, гексадецила, октадецила, 2-этилгексила, 2-метилбутила или 5-метилгексила;

алкенил относится к алкенилу с нормальной или разветвленной цепью, имеющему 2-24 атомов углерода (необязательно имеющему 2-16 атомов углерода; необязательно имеющему 2-14 атомов углерода; необязательно имеющему 2-12 атомов углерода; необязательно имеющему 2, 3, 4, 5 или 6 атомов углерода); алкенил имеет одну или больше углерод-углеродных двойных связей или необязательно имеет 1, 2 или 3 сопряженных или несопряженных углерод-углеродных двойных связей; алкенил связан с остальной частью молекулы через одинарную связь, необязательно выбран из винила, олеила или линолеила;

необязательно, заместитель в "замещенном алкиле" или "замещенном алкениле" выбран из С1-С4 алкила; гидроксила; С1-С4 алкокси; амино; С1-С4 аминоалкила; С1-С4 карбонилокси; С1-С4 оксикарбонила; галогена (такого как фтор, хлор, бром и иод); циано; нитро; азида; С1-С4 алкилсульфонила; тиола; С1-С4 алкилтио; С6-С30 арилокси, такого как фенокси; -NRb(C=NRb)NRbRc, где Rb и Rc независимо выбраны из Н, С1-С4 алкила, С2-С4 алкенила, С2-С4 алкинила, С3-С10 циклоалкила, С6-С18 арила, С7-С17 аралкила, гетероциклической группы, имеющей 3-10 членов, или защитной группы аминогруппы.

[7] Необязательно, каждый R3 и R4 независимо выбран из Н, метила, этила, гексила, додецила или гексадецила;

необязательно, R3 представляет собой Н, и R4 выбран из Н, метила, этила, гексила, додецила или гексадецила;

необязательно, R2 представляет собой -ОН или -NH₂.

[8] Производное пептида, представленное Формулой (I), или его стереоизомером или смесью его стереоизомеров, или его косметически приемлемой солью, или его фармацевтически приемлемой солью, выбрано из следующих производных пептидов (1)-(6):

[9] Производное пептида, представленное Формулой (I) настоящего изобретения, может присутствовать в виде его стереоизомера или смеси его стереоизомеров; например, эти аминокислоты, входящие в него, могут иметь L- или D-конфигурацию, или каждая из них независимо может быть рацемической. Таким образом, могут быть получены изомерные смеси, а также рацемические смеси или диастереомерные смеси, или чистые диастереомеры или энантиомеры, в зависимости от числа асимметричных атомов углерода и от того, какие изомеры или изомерные смеси присутствуют. Предпочтительные структуры производных пептида, представленные Формулой (I) настоящего изобретения, являются чистыми изомерами, т.е. энантиомерами или диастереомерами.

[10] Например, когда в настоящем изобретении указан -Lys-, следует понимать, что -Lys- выбран из -L-Lys-, -D-Lys- или их смеси и является рацемическим или нерацемическим. Способы получения, описанные в этом документе, позволяют специалисту в данной области получить каждый стереоизомер производных пептидов согласно настоящему изобретению путем подбора аминокислоты, имеющей правильную конфигурацию.

[11] Термин "косметически приемлемая соль или фармацевтически приемлемая соль" относится к соли, одобренной для применения у животных и, в частности, у людей, включая соль металла производного пептида, представленного Формулой (I), где металл включает, без ограничения, литий, натрий, калий, кальций, магний, марганец, медь, цинк или алюминий и т.д.; соль, образованную из производного пептида, представленного Формулой (I), и органического основания, где органическое основание включает, без ограничения, этиламин, диэтиламин, этилендиамин, этаноламин, диэтаноламин, аргинин, лизин, гистидин или пиперазин и т.д.; соль, образованную из производного пептида, представленного Формулой (I), и неорганической кислоты или органической кислоты, где органическая кислота включает, без ограничения, уксусную кислоту, лимонную кислоту, молочную кислоту, малоновую кислоту, малеиновую кислоту, винную кислоту, фумаровую кислоту, бензойную кислоту, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, янтарную кислоту, олеиновую кислоту, трифторуксусную кислоту, щавелевой кислоту, памовую кислоту или глюконовую кислоту и т.д.; неорганическая кислота включает, без ограничения, соляную кислоту, серную кислоту, борную кислоту или угольную кислоту.

[12] В другом аспекте настоящего изобретения предложена косметическая или фармацевтическая композиция, включающая эффективное количество производного пептида, представленного Формулой (I), или его стереоизомера или смеси его стереоизомеров, или его косметически приемлемой соли, или его фармацевтически приемлемой соли, и по меньшей мере одно вспомогательное вещество и, необязательно, косметически или фармацевтически приемлемый адъювант.

[13] Необязательно, адъювант выбран из стимулятора синтеза коллагена, средства, которое модулирует синтез PGC-1α, средства, которое модулирует активность PPARγ, средства, которое повышает или снижает содержание триглицеридов в адипоцитах, средства, которое стимулирует или задерживает дифференцировку адипоцитов, липолитического средства или средства, которое стимулирует липолиз, средства, выводящего жир, адипогенного средства, ингибитора агрегации ацетилхолиновых рецепторов, средства, которое ингибирует сокращение мышц, антихолинергического средства, ингибитора эластазы, ингибитора матриксных металлопротеиназ, стимулятора или ингибитора синтеза меланина, отбеливающего или обесцвечивающего средства, промотора пигментации, средства для автозагара, антивозрастного средства, ингибитора NO-синтазы, ингибитора 5α-редуктазы, ингибитора лизилгидроксилазы и/или пролилгидроксилазы, антиоксиданта, ловушки свободных радикалов и/или средства для борьбы с загрязнением воздуха, ловушки активных карбонильных соединений антигликирующего средства, антигистаминного средства противовирусного средства, противопаразитарного средства эмульгатора, смягчающего средства, органического растворителя жидкого пропеллента, кондиционера для кожи, увлажняющего вещества, влагоудерживающего вещества, альфа-гидроксикислоты, бета-гидроксикислоты, увлажнителя, эпидермальной гидролазы, витамина, аминокислоты, белка, пигмента или красящего вещества, красителя, биополимера, гелеобразующего полимера, загустителя, поверхностно-активного вещества, умягчителя, адгезива, консерванта, средства против морщин, средства, которое может уменьшать или лечить мешки под глазами, эксфолианта, средства, отшелушивающего кутикулу, кератолитического средства, противомикробного, противогрибкового, фунгистатического, бактерицидного, бактериостатического средства, средства, которое стимулирует синтез дермальных или эпидермальных макромолекул и/или ингибирует или предотвращает их деградацию, средства, которое стимулирует синтез эластина, средства, которое стимулирует синтез декорина, средства, которое стимулирует синтез ламинина, средства, которое стимулирует синтез дефензина, средства, которое стимулирует синтез белка-шаперона, средства, которое стимулирует синтез цАМФ, белка теплового шока, средства, которое стимулирует синтез HSP70, средства, которое стимулирует синтез белка теплового шока, средства, которое стимулирует синтез гиалуроновой кислоты, средства, которое стимулирует синтез фибронектина, средства, которое стимулирует синтез деацетилазы, средства, которое стимулирует синтез липида и компонента рогового слоя, церамида, жирной кислоты, средства, которое ингибирует деградацию коллагена, средства, которое ингибирует деградацию эластина, средства, которое ингибирует сериновую протеазу, средства, которое стимулирует пролиферацию фибробластов, средства, которое стимулирует пролиферацию кератиноцитов, средства, которое стимулирует пролиферацию адипоцитов, средства, которое стимулирует пролиферацию меланоцитов, средства, которое стимулирует дифференцировку кератиноцитов, средства, которое ингибирует ацетилхолинэстеразу, кожного релаксанта, средства, которое стимулирует синтез гликозаминогликанов, средства против гиперкератоза, комедолитического средства, противопсориазного средства, средства против дерматита, средства против экземы, средства для репарации ДНК, средства, защищающего ДНК, стабилизатора, противозудного средства, средства для лечения и/или ухода за чувствительной кожей, дубящего средства, подтягивающего средства, реструктурирующего средства, средства против растяжек, адгезива, средства, которое регулирует выработку кожного сала, антиперспиранта, средства, которое стимулирует заживление, средства, которое способствует заживлению, средства, которое стимулирует реэпителизацию, средства, которое способствует реэпителизации, фактора роста цитокинов, успокаивающего средства, противовоспалительного средства, анестезирующего средства, средства, действующего на капиллярное кровообращение и/или микроциркуляцию, средства, которое стимулирует ангиогенез, средства, которое ингибирует проницаемость сосудов, венотонизирующего средства, средства, действующего на клеточный метаболизм, средства для улучшения связи дермы и эпидермиса, средства, которое вызывает рост волос, средства, ингибирующего или замедляющего рост волос, ароматизатора, хелатообразователя, растительного экстракта, эфирного масла, экстракта морских водорослей, средств, полученных в результате биологического процесса ферментации, неорганической соли, клеточного экстракта, солнцезащитного фильтра и эффективного органического или неорганического фотопротектора против УФА и/или УФВ-излучения или их смесей.

[14] Необязательно, препарат косметической или фармацевтической композиции выбран из крема, масла, молочка, бальзама, пены, лосьона, геля, линимента, сывороток, мыла, шампуня, кондиционера для волос, сыворотки, мази, мусса, помады, пудры, бруска, карандаша, спрея, аэрозоля, капсулы, таблетки, гранулы, жевательной резинки, раствора, суспензии, эмульсии, сиропа, эликсира, полисахаридной пленки, желе или желатина;

необязательно, капсула включает мягкую капсулу, твердую капсулу, необязательно желатиновую капсулу;

необязательно, таблетка включает таблетку, покрытую сахарной оболочкой.

[15] Производные пептидов согласно настоящему изобретению имеют разную растворимость в воде в зависимости от природы их последовательностей или любых потенциальных модификаций на N-конце и/или С-конце. Производное пептида согласно настоящему изобретению может быть, таким образом, включено в композицию в виде водного раствора, а такие, которые нерастворимы в воде, могут быть растворимыми в обычных, косметически или фармацевтически приемлемых растворителях, включающих, без ограничения, этанол, пропанол, изопропанол, пропиленгликоль, глицерин, бутиленгликоль или полиэтиленгликоль или их любую комбинацию.

[16] Косметически или фармацевтически эффективные количества пептидных производных согласно настоящему изобретению, которые следует вводить, а также их дозы, будут зависеть от многих факторов, в том числе возраста, состояния пациента, тяжести нарушения или заболевания, пути и частоты введения и специфических свойств используемых производных пептидов.

[17] "Косметически или фармацевтически эффективное количество" относится к количеству одного или более производных пептидов согласно настоящему изобретению, которое не вызывает токсических эффектов, но является достаточным для получения требуемых эффектов. Производное пептида согласно настоящему изобретению применяется в косметической или фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению в косметически или фармацевтически эффективной концентрации для получения требуемых эффектов. В предпочтительной форме, по отношению к общему весу композиции, концентрация составляет от 0,00000001% (по весу) до 20% (по весу), предпочтительно от 0,000001% (по весу) до 15% (по весу), более предпочтительно от 0,0001% (по весу) до 10% (по весу) и еще более предпочтительно от 0,0001% (по весу) до 5% (по весу).

[18] В еще одном аспекте настоящего изобретения предложена косметически или фармацевтически приемлемая система доставки или система замедленного высвобождения для достижения лучшего проникновения активного ингредиента и/или улучшения его фармакокинетических и фармакодинамических свойств, которая включает эффективное количество производного пептида, представленного Формулой (I), или его стереоизомера или смеси его стереоизомеров, или его косметически приемлемой соли, или его фармацевтически приемлемой соли, или косметической или фармацевтической композиции, как указано выше.

[19] Термин "система доставки" относится к разбавителю, адъюванту, вспомогательному веществу или носителю, вводимому вместе с производным пептида согласно настоящему изобретению, выбранному из воды, масла или поверхностно-активных веществ, включая полученные из нефти, животного, растения или в результате синтеза. Примеры включают, без ограничения, арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло, касторовое масло, полисорбат, сложный эфир сорбитана, эфирсульфат, сульфат, бетаин, глюкозид, мальтозид, жирный спирт, ноноксинол, полоксамер, полиоксиэтилен, макрогол, декстрозу, глицерин, дигитонин и т.п. Разбавители, которые могут использоваться в различных системах доставки, в которые может быть введено производное пептида согласно настоящему изобретению, известны специалистам в данной области.

[20] Термин "замедленное высвобождение" используется в общепринятом смысле для обозначения системы доставки, которая обеспечивает постепенное высвобождение соединения в течение некоторого периода времени и, предпочтительно, но не обязательно, относительно постоянный уровень соединения высвобождается в течение всего периода времени.

[21] Примеры системы доставки или системы замедленного высвобождения включают липосому, олеосому, неионогенную поверхностно-активную липосомную везикулу, этосому, милликапсулу, микрокапсулу, нанокапсулу, наноструктурированный липидный носитель, губку, циклодекстрин, липоидную везикулу, мицеллу, миллисферу, микросферу, наносферу, липосферу, микроэмульсию, наноэмульсию, милличастицу, микрочастицу или наночастицу. Предпочтительной системой доставки или системой замедленного высвобождения является липосома и микроэмульсия, более предпочтительно микроэмульсия типа вода в масле, имеющая внутреннюю структуру обращенных мицелл.

[22] Система с замедленным высвобождением можно получать способами, известными в уровне техники, и можно вводить, например, путем наружного или трансдермального введения, включая клейкие пластыри, неклейкие пластыри, герметизирующие пластыри и микроэлектронные пластыри; или путем системного введения, например, без ограничения этим, пероральным или парентеральным путем, включая назальную, ректальную, подкожную имплантацию или инъекцию, или прямую имплантацию или инъекцию в определенные части тела. Предпочтительно должно высвобождаться относительно постоянное количество этих производных пептидов согласно настоящему изобретению. Количество производного пептида, содержащегося в системе с замедленным высвобождением, будет зависеть, например, от участка, в который нужно вводить композицию, от кинетики высвобождения и продолжительности действия производного пептида согласно настоящему изобретению, а также от природы состояния, нарушения и/или заболевания, которое подлежит лечению и/или уходу.

[23] В еще одном аспекте настоящего изобретения предложено применение производного пептида, представленного Формулой (I), или его стереоизомера, или смеси его стереоизомеров, или его косметически приемлемой соли, или его фармацевтически приемлемой соли, или косметической или фармацевтической композиции, как описано выше, или косметически или фармацевтически приемлемой системы доставки или системы замедленного высвобождения, как описано выше, при изготовлении косметической композиции или фармацевтической композиции для лечения или ухода за кожей или слизистой оболочкой.

[24] В еще одном аспекте настоящего изобретения предложено применение производного пептида, представленного Формулой (I), или его стереоизомера, или смеси его стереоизомеров, или его косметически приемлемой соли, или его фармацевтически приемлемой соли, или косметической или фармацевтической композиции, как описано выше, или косметически или фармацевтически приемлемой системы доставки или системы замедленного высвобождения, как описано выше, при изготовлении косметической композиции или фармацевтической композиции для отбеливания.

[25] В еще одном аспекте настоящего изобретения предложено применение производного пептида, представленного Формулой (I), или его стереоизомера, или смеси его стереоизомеров, или его косметически приемлемой соли, или его фармацевтически приемлемой соли, или косметической или фармацевтической композиции, как описано выше, или косметически или фармацевтически приемлемой системы доставки или системы замедленного высвобождения, как описано выше, при изготовлении косметической композиции или фармацевтической композиции для лечения воспаления.

[26] В еще одном аспекте настоящего изобретения предложено применение производного пептида, представленного Формулой (I), или его стереоизомера, или смеси его стереоизомеров, или его косметически приемлемой соли, или его фармацевтически приемлемой соли, или косметической или фармацевтической композиции, как описано выше, или косметически или фармацевтически приемлемой системы доставки или системы замедленного высвобождения, как описано выше, при изготовлении косметической композиции или фармацевтической композиции для улучшения поствоспалительной гиперпигментации.

[27] Для облегчения понимания настоящего изобретения значения некоторых терминов и выражений, используемых в настоящем изобретении, объяснены следующим образом.

[28] В настоящем изобретении термин "кожа" следует понимать как слои, которые ее составляют, от самого верхнего слоя или рогового слоя до самого нижнего слоя или подкожной ткани, оба включительно. Эти слои состоят из различных типов клеток, таких как кератиноциты, фибробласты, меланоциты и/или адипоциты, помимо прочих. В настоящем изобретении термин "кожа" включает кожу волосистой части головы.

[29] Термин "лечение" означает введение производного пептида согласно настоящему изобретению для облегчения или устранения заболевания или нарушения или уменьшения или устранения одного или более симптомов, связанных с заболеванием или нарушением. Термин "лечение" также охватывает способность облегчать или устранять физиологические последствия заболевания или нарушения.

[30] Термин "уход" включает профилактику заболевания и/или нарушения.

[31] В настоящем описании сокращенные обозначения, используемые для аминокислот, соответствуют правилам, установленным Комиссией по биохимической номенклатуре IUPAC-IUB в Европейском журнале биохимии (Eur. J. Biochem. 1984, 138:9-37).

[32] Таким образом, например, Lys обозначает NH2-СН(CH2CH2CH2CH2NH2)-СООН, Lys- обозначает NH2-СН(CH2CH2CH2CH2NH2)-СО-, -Lys обозначает -NH-СН(CH2CH2CH2CH2NH2)-СООН, и -Lys- обозначает -NH-СН(CH2CH2CH2CH2NH2)-СО-. Таким образом, дефис, обозначающий пептидную связь, удаляет ОН на 1-карбоксиле аминокислоты (в настоящем описании представлен в обычной неионизированной форме), если расположен справа от обозначения, и удаляет Н на 2-аминогруппе аминокислоты, если он расположен слева от обозначения; обе модификации могут быть применены к одному и тому же обозначению (см. Таблицу 1).

Таблица 1 Структуры аминокислотных остатков и их однобуквенные и трехбуквенные сокращенные обозначения

[33] Полезные эффекты, которые настоящее изобретение обеспечивает в сравнении с предшествующим уровнем техники, включают:

1. Производное пептида согласно настоящему изобретению получают путем искусственного конструирования и простого синтеза.

2. N-конец H-Pro-Lys-Glu-Lys-OH ковалентно связан с ниацином, транексамовой кислотой или койевой кислотой с получением соединения новой структуры, которое может снижать экспрессию α-МСГ, ингибировать образование меланина, производить отбеливающий эффект и иметь более высокую отбеливающую активность, чем один ниацин, транексамовая кислота или койевая кислота и один полипептид H-Pro-Lys-Glu-Lys-OH по отдельности.

3. N-конец H-Pro-Lys-Glu-Lys-OH ковалентно связан с ниацином, транексамовой кислотой или койевой кислотой с получением соединения новой структуры, которое может снижать экспрессию IL-6 и ФНО-α и проявляет неожиданную противовоспалительную активность на основе отбеливающего эффекта.

4. Производное пептида согласно настоящему изобретению обладает как отбеливающим эффектом, так и противовоспалительной активностью и может применяться в области косметики или медицины для противовоспалительного действия, а также отбеливания и удаления веснушек с кожи, в особенности для улучшения пигментации после воспаления.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[34]

ФИГ. 1 - график, на котором показано влияние производных пептидов согласно настоящему изобретению на жизнеспособность клеток НаСаТ (n=4).

ФИГ. 2 - график, на котором показаны результаты воздействия 100 м.д. производных пептидов согласно настоящему изобретению на экспрессию α-МСГ. * обозначает статистическое различие между группой лекарственного препарата и контрольной группой, р<0,05 (n=4). ** обозначает значимое различие между группой лекарственного препарата и контрольной группой, р<0,01 (n=4). *** обозначает сильное различие между группой лекарственного препарата и контрольной группой, р<0,001 (n=4).

ФИГ. 3 - график, на котором показаны результаты воздействия 50 м.д. производных пептидов согласно настоящему изобретению на экспрессию IL-6. ## обозначает значимое различие между УФ-группой и контрольной группой, р<0,01 (n=4). ** обозначает значимое различие между группой лекарственного препарата и УФ-группой, р<0,01 (n=4). *** обозначает сильное различие между группой лекарственного препарата и УФ-группой, р<0,001 (n=4).

ФИГ. 4 - график, на котором показаны результаты воздействия 50 м.д. производных пептидов согласно настоящему изобретению на экспрессию ФНО-α. ## обозначает значимое различие между УФ-группой и контрольной группой, р<0,01 (n=4). * обозначает статистическое различие между группой лекарственного препарата и УФ-группой, р<0,05 (n=4). ** обозначает значимое различие между группой лекарственного препарата и УФ-группой, р<0,01 (n=4). *** обозначает сильное различие между группой лекарственного препарата и УФ-группой, р<0,001 (n=4).

ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

[35] Для лучшего понимания настоящего изобретения оно будет подробно описано ниже в сочетании с примерами и чертежами. Однако следует понимать, что эти примеры и чертежи используются только в иллюстративных целях и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.

[36] Сокращения

[37] Сокращения, используемые для аминокислот, соответствуют правилам, установленным Комиссией по биохимической номенклатуре IUPAC-IUB в публикациях Eur J. Biochem. (198 4) 138:9-37 и J. Chem (1989) 264:633-673.

[38] 2-Cl-Trt смола: 2-хлортритильная смола, исходная смола для синтеза полипептидов (степень сшивания 1%, степень замещения 1,24 ммоль/г); Trt: тритил; ДМФА: N,N-диметилформамид; ДХМ: дихлорметан; DIPEA: диизопропилэтиламин; DIC: диизопропилкарбодиимид; пиперидин: пиперидин; HOBt: 1-гидроксибензотриазол; ТФУ: трифторуксусная кислота; TIS: триизопропилсилан; Pro: пролин; Lys: лизин; Glu: глутамат; Fmoc: 9-флуоренилметоксикарбонил; Boc: трет-бутоксикарбонил; OtBu: трет-бутоксил; CDI: N,N'-карбонилдиимидазол; Ру: пиридин;

[39] В соответствии с аминокислотной структурой С-конца полипептидной последовательности, в качестве носителя для твердофазного синтеза подбирали соответствующую смолу.

[40] Смолу добавляют для набухания и промывают растворителем. Добавляют активированные аминокислоты. Под воздействием системы связывания смола связывается с аминокислотами в порядке от С-конца к N-концу в растворителе для связывания в соответствии с последовательностью пептида, и смолу промывают с получением пептидильной смолы.

[41] В частности, Fmoc-Lys(Boc)-ОН, Fmoc-Glu(OtBu)-ОН, Fmoc-Lys(Boc)-ОН и Fmoc-Pro-OH добавляют для реакции до тех пор, пока все аминокислоты не будут связаны. Продукт реакции промывают дихлорметаном и затем сушат с получением Fmoc-Pro-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-смолы, которую делят на три порции.

[42] Одну порцию вышеуказанной пептидильной смолы используют для связывания с NA с получением NA-Pro-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-смолы, которую подвергают отщеплению, концентрированию, осаждению, центрифугированию и вакуумной сушке с получением неочищенного пептида; неочищенный пептид очищают с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии и подвергают лиофильной сушке с получением NA-Pro-Lys-Glu-Lys-OH или NA-Pro-Lys-Glu-Lys-NH2.

[43] Одну порцию вышеуказанной пептидильной смолы используют для связывания с Fmoc-TXC-OH с получением Fmoc-TXC-Pro-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-смолы, которую подвергают отщеплению, концентрированию, осаждению, центрифугированию и вакуумной сушке с получением неочищенного пептида; неочищенный пептид очищают с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии и подвергают лиофильной сушке с получением TXC-Pro-Lys-Glu-Lys-OH или TXC-Pro-Lys-Glu-Lys-NH2.

[44] КА не может напрямую образовывать амидную связь с N-концом полипептида, поэтому в присутствии Ру и ДМФА КА подвергают реакции с CDI с образованием промежуточного соединения КА-СО-имидазола, и затем ковалентно связывают с N-концом полипептида через промежуточное соединение.

[45] Одну порцию вышеуказанной пептидильной смолы используют для связывания с промежуточным соединением КА-СО-имидазолом с получением KA-CO-Pro-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-смолы, которую подвергают отщеплению, концентрированию, осаждению, центрифугированию и вакуумной сушке с получением неочищенного пептида; неочищенный пептид очищают с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии и подвергают лиофильной сушке с получением KA-CO-Pro-Lys-Glu-Lys-ОН или KA-CO-Pro-Lys-Glu-Lys-NH2.

[46] ПРИМЕР 1 Получение Fmoc-Pro-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-2-Cl-Trt смолы

[47] 1.1 Набухание смолы

200 мл ДМФА использовали для распыления на стенку колонки и оставляли для стекания на 3 минуты, 200 мл ДМФА снова использовали для распыления на стенку колонки и оставляли для стекания на 5 минут. 20 г 2-Cl-Trt смолы, имеющей степень замещения 1,42 ммоля/г, добавляли в твердофазную колонку, добавляли 200 мл ДМФА, полностью погрузив смолу, после чего пропускали азот и перемешивали при 100 об/мин в течение 5 минут, а затем растворитель сливали в течение 5 минут, снова добавляли 200 мл ДМФА, полностью погрузив смолу, после чего пропускали азот и перемешивали при 100 об/мин в течение 30 минут, и затем растворитель сливали. Добавляли еще 200 мл ДМФА, полностью погрузив смолу, после чего пропускали азот и перемешивали при 100 об/мин, а затем растворитель сливали в течение 5 минут, завершив набухание.

[48] 1.2 Удаление Fmoc-защиты

200 мл 20% пиперидина/ДМФА добавляли с пропусканием азота, перемешивали, проводили реакцию в течение 5 мин и сливали в течение 3 мин. Снова добавляли 200 мл 20% пиперидина/ДМФА с пропусканием азота, перемешивали в течение 8 мин и сливали в течение 3 мин. Затем добавляли 200 мл ДМФ с пропусканием азота, перемешивали в течение 1-2 мин и сливали в течение 3 мин. Смолу повторно промывали 7-8 раз.

[49] 1.3 Реакция подпитки

17,4 г Fmoc-Lys(Boc)-ОН растворяли в 100 мл ДМФА, содержащего 4,3 мл DIPEA (1,5 экв.) и добавляли в твердофазный реактор для связывания с 2-Cl-Trt смолой в реакции в течение 14 ч. После фильтрации и промывки продукт реакции обрабатывали метанолом в течение 1 ч для блокирования оставшихся хлоридных групп.

Степень замещения была определена как 0,55 ммоль/г, и масштаб синтеза был определен как 16,7 ммоль. Исходя из этого, количества оставшихся исходных аминокислот и реагентов рассчитывали, как показано в Таблице 2 ниже.

N-концевую Fmoc-группу удаляли и в присутствии 6,8 г HOBt и 7 г DIC 17,8 г активированного Fmoc-Glu(OtBu)-ОН связывали с пептидильными смолами при использовании ДМФА в качестве растворителя. Реакция продолжалась 2,5 ч. Затем смолы промывали и повторно подвергали обработке со снятием защитной Fmoc-группы для присоединения следующей аминокислоты.

При каждом присоединении, в присутствии 6,8 г HOBt и 7 г DIC и ДМФА в качестве растворителя, смолу последовательно связывали с 19,5 г Fmoc-Lys(Boc)-ОН и 14,1 г Fmoc-Pro-OH.

[50] 1.4 Промывание смолы после завершения реакции

После синтеза смолу промывали ДМФА, каждый раз по 100 мл. Смолу и растворитель однородно смешивали и затем перемешивали в течение 2 мин. Растворитель сливали. Смолу многократно промывали ДМФА, пока отфильтрованный растворитель не становился чистым и прозрачным. После усадки и высыхания получали смолу Fmoc-Pro-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-2-Cl-Trt.

[51] ПРИМЕР 2 Получение NA-Pro-Lys-Glu-Lys-OH

[52] 2.1 Получение NA-Pro-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-2-Cl-Trt смолы 10 г Fmoc-Pro-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-2-Cl-Trt смолы взвешивали и добавляли в 100 мл твердофазную колонку, а затем три раза промывали ДМФА после набухания в ДМФА. Fmoc снимали при использовании 20% раствора пиперидина/ДМФА, затем промывали, при этом К-тест (тест Кайзера, 5% этанольный раствор нингидрина) показал темно-синий цвет.

В присутствии 2,65 г DIC и 2,27 г HOBt, 1,71 г NA подвергали реакции с вышеуказанной Fmoc-деблокированной пептидильной смолой в течение 2 часов, при этом К-тест показал, что смола была бесцветной и прозрачной. Смолу три раза промывали по 30 мл ДМФА и два раза промывали по 30 мл ДХМ. Смолу подвергали усадке и сушке 30 мл метанола с получением NA-Pro-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-2-Cl-Trt смолы.

[53] 2.2 Получение NA-Pro-Lys-Glu-Lys-ОН

[54] 2.2.1 Получение буфера для лизиса

Отмеряли 24,75 мл ТФУ, 1,5 мл TIS и 1,5 мл воды, смешивали и перемешивали, после чего помещали в морозилку на -18°С для последующего использования.

[55] 2.2.2 Отщепление

Взвешивали 10 г NA-Pro-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-2-Cl-Trt смолы, добавляли в круглодонную колбу на 100 мл и для реакции добавляли 30 мл замороженного буфера для лизиса при перемешивании в течение 2 часов. После того, как продукт реакции был отфильтрован и сконцентрирован до 10 мл, добавляли изопропиловый эфир с осаждением белого твердого вещества, которое шесть раз промывали изопропиловым эфиром до рН 3-4 и сушили в вакууме. Получали 6 г неочищенного пептида (чистота 85%).

[56] 2.2.3 Очистка

6 г неочищенного пептида взвешивали и растворяли в 85 мл чистой воды, получив светло-желтую жидкость, которую фильтровали через микропористую фильтрующую мембрану с порами 0,22 мкм с получением светло-желтого чистого и прозрачного раствора. Раствор подвергали очистке с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ. Градиент очистки является следующим:

Отфильтрованный образец вводили и очищали. Фракции собирали, концентрировали и лиофилизировали с получением пептида (1) NA-Pro-Lys-Glu-Lys-OH, имеющего чистоту 97,97%.

[57] ПРИМЕР 3 Получение TXC-Pro-Lys-Glu-Lys-OH

[58] 3.1 Получение TXC-Pro-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-2-Cl-Trt смолы

10 г Fmoc-Pro-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-2-Cl-Trt смолы взвешивали, добавляли в 100 мл твердофазную колонку и три раза промывали ДМФА после набухания в ДМФА. Fmoc-защиту снимали при использовании 20% раствора пиперидина/ДМФА с последующей промывкой, при этом К-тест (5% этанольный раствор нингидрина) показал темно-синий цвет.

В присутствии 2,65 г DIC и 2,27 г HOBt, 5,31 г Fmoc-TXC-OH подвергали реакции в течение 2 ч с вышеуказанной пептидильной смолой после снятия Fmoc-защиты, при этом К-тест показал, что смола была бесцветной и прозрачной. Fmoc-защиту снимали при использовании 20% раствора пиперидина/ДМФА. Смолу три раза промывали по 30 мл ДМФА и два раза промывали по 30 мл ДХМ. Смолу подвергали усадке и сушке 30 мл метанола с получением TXC-Pro-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-2-Cl-Trt смолы.

[59] 3.2 Получение TXC-Pro-Lys-Glu-Lys-ОН,

[60] 3.2.1 Получение буфера для лизиса

Отмеряли 24,75 мл ТФУ, 1,5 мл TIS и 1,5 мл воды, смешивали и перемешивали, после чего помещали в морозилку на -18°С для последующего использования.

[61] 3.2.2 Отщепление

10 г TXC-Pro-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-2-Cl-Trt смолы взвешивали и добавляли в 100 мл круглодонную колбу и добавляли 30 мл замороженного буфера для лизиса для реакции с перемешиванием в течение 2 ч. После того, как продукт реакции отфильтровали и сконцентрировали до 10 мл, добавляли изопропиловый эфир с осаждением белого твердого вещества, которое шесть раз промывали изопропиловым эфиром до получения рН 3-4, и сушили в вакууме. Получали 5,7 г неочищенного пептида (чистота 87%).

[62] 3.2.3 Очистка

5,7 г сырого пептида были взвешены и распались в 85 мл чистой воды, с получением светло-желтую жидкость, отфильтрованную с 0,22 um микропористыми мембранами фильтра, с получением светло-желтое ясное и прозрачное решение. Решение было подвергнуто обратной фазе очистка HPLC. Градиент очистки следующие:

Отфильтрованный образец вводили и очищали. Фракции собирали, концентрировали и лиофилизировали с получением пептида (3) TXC-Pro-Lys-Glu-Lys-OH, имеющего чистоту 96,50%.

[63] ПРИМЕР 4 Получение KA-CO-Pro-Lys-Glu-Lys-OH

[64] 4.1 Синтез промежуточного КА-СО-имидазола

В трехгорлую колбу объемом 250 мл добавляли КА (50 г, 35,2 ммолей) и растворяли в 150 мл ДМФА; добавляли Ру (пиридин, 8 г, 100 ммоль); температуру снижали до 0°С; добавляли CDI (6,6 г, 40 ммоль) и проводили реакции в течение 4 ч. Анализ ТСХ показал, что реакция завершилась (проявляющий реагент: МеОН:ДХМ=1:20, значение Rf 0,67).

Реакционный раствор вливали в воду со льдом с образованием большого количества белого осадка. После фильтрации твердую фазу промывали водой со льдом до исчезновения запаха и сушили в вакууме с получением 74 г продукта с выходом 89,05%.

[65] 4.2 Получение KA-CO-Pro-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-2-Cl-Trt смолы

10 г смолы Fmoc-Pro-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-2-Cl-Trt взвешивали и добавляли в твердофазную колонку объемом 100 мл, три раза промывали ДМФА после набухания в ДМФА. Fmoc-защиту снимали при использовании 20% раствора пиперидина/ДМФА, затем промывали и проводили К-тест (5% раствор нингидрина в этаноле), показавший темно-синий цвет.

В присутствии 3,62 г DIPEA, 3,31 г промежуточного КА-СО-имидазола подвергали реакции с вышеуказанной пептидильной смолой после снятия Fmoc-защиты в течение 2 ч, и К-тест показал, что смола была бесцветной и прозрачной. Смолу три раза промывали по 30 мл ДМФА и два раза промывали по 30 мл ДХМ. Смолу подвергали усадке и сушке 30 мл метанола с получением КА-СО-Pro-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-2-Cl-Trt смолы.

[66] 4.3 Получение KA-CO-Pro-Lys-Glu-Lys-ОН

[67] 4.3.1 Получение буфера для лизиса

Отмеряли 24,75 мл ТФУ, 1,5 мл тиоанизола, 1,5 мл фенола, 1,5 мл воды и 0,75 мл EDT, смешивали и перемешивали, после чего помещали в холодильник на -18°С для последующего использования.

[68] 4.3.2 Отщепление

10 г смолы KA-CO-Pro-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-2-Cl-Trt взвешивали и добавляли в круглодонную колбу объемом 100 мл, и добавляли 30 мл замороженного буфера для лизиса для проведения реакции при перемешивании в течение 2 ч. После того, как продукт реакции был отфильтрован и сконцентрирован до 10 мл, добавляли изопропиловый эфир с осаждением белого твердого вещества, который шесть раз промывали изопропиловым эфиром до получения значения рН 3-4 и сушили в вакууме. Получали 5,7 г неочищенного пептида (чистота 83,5%).

[69] 4.3.3 Очистка

5,7 г неочищенного пептида взвешивали и растворяли в 65 мл чистой воды с получением светло-желтой жидкости, которую фильтровали через микропористую фильтрующую мембрану с порами 0,22 мкм с получением светло-желтого чистого и прозрачного раствора. Раствор подвергали очистке с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ. Градиент очистки являлся следующим:

Отфильтрованный образец вводили и очищали. Фракции собирали, концентрировали и лиофилизировали с получением пептида (5) KA-CO-Pro-Lys-Glu-Lys-OH, имеющего чистоту 97,34%.

[70] ПРИМЕР 5

Другие соединения Формулы (I) настоящего изобретения могут быть получены в аналогичных процессах.

Молекулярную массу полученных производных пептидов определяли с помощью ЭРИ-МС.Результаты анализа некоторых соединений показаны в Таблице 3 ниже.

[71] ПРИМЕР 6 Анализ жизнеспособности клеток

[72] 6.1 Реагенты и материалы

Фосфатно-солевой буфер (PBS) (Gibco), тиазолиловый синий (МТТ) (Sigma), диметилсульфоксид (ДМСО) (Sigma), питательная среда с высоким содержанием глюкозы (DMEM) (Gibco) и фетальная бычья сыворотка (Gibco).

[73] 6.2 Приборы

Микропланшетный спектрофотометр (MD, USA), CO₂-инкубатор (Shanghai Yiheng) и ультрачистый рабочий стол (Suzhou Purification).

[74] 6.3 Линии клеток

Человеческие кератиноциты (НаСаТ) были приобретены в Куныминском банке клеток Китайского центра коллекций типовых культур при Китайской академии наук.

[75] 6.4 Образцы для тестирования

Группы лекарственных препаратов:

пептид H-Pro-Lys-Glu-Lys-OH (далее именуемый референсным пептидом) в тестируемой концентрации 1 м.д., 10 м.д., 100 м.д. и 200 м.д. соответственно;

пептид (1) в тестируемой концентрации 1 м.д., 10 м.д., 100 м.д. и 200 м.д. соответственно;

пептид (3) в тестируемой концентрации 1 м.д., 10 м.д., 100 м.д. и 200 м.д. соответственно;

пептид (5) в тестируемой концентрации 1 м.д., 10 м.д., 100 м.д. и 200 м.д. соответственно.

Контрольная группа:

Пустой контроль PBS.

[76] 6.5 Цель эксперимента

Целью данного эксперимента является оценка жизнеспособности клеток через 72 часа после введения и определение влияния производных пептидов настоящего изобретения на жизнеспособность клеток с использованием клеток НаСаТ в качестве объекта эксперимента.

[77] 6.6 Протокол эксперимента

Замороженные клетки НаСаТ культивировали и пересевали в соотношении 1:2 примерно до 5-го поколения, и клетки с лучшими показателями роста отбирали в качестве объектов эксперимента.

Клетки инокулировали в 9б-луночный планшет в количестве 2000 клеток/лунка. После прикрепления клеток к стенке, образцы групп лекарственных препаратов и контрольной группы добавляли в соответствии с методом серийных разведений, добавляли культуральную среду до 200 мкл и культивировали в инкубаторе с 5% CO₂ при 37°С в течение 72 часов.

Затем в каждую лунку добавляли 20 мкл 5 мг/мл МТТ и продолжали инкубирование в инкубаторе с 5% CO₂ при 37°С в течение 4 ч. Исходный раствор удаляли и добавляли ДМСО в количестве 150 мкл/лунка. Через 5 мин микропланшетный спектрофотометр использовали для считывания контрольных значений OD при длинах волн 490 нм и 630 нм.

[78] 6.7 Результаты

Анализ МТТ представляет собой метод определения выживаемости и роста клеток. Измеренные значения OD прямо пропорциональны жизнеспособности клеток.

На ФИГ. 1 показаны результаты исследования жизнеспособности клеток НаСаТ. Результаты показали, что по сравнению с контрольной группой пептид (1), пептид (3) и пептид (5) не оказывали существенного влияния на жизнеспособность клеток НаСаТ, что указывает на то, что производные пептидов настоящего изобретения не оказывают токсического действия на клетки НаСаТ в количестве в пределах 0-200 м.д.

[79] Пример 7 Клеточный анализ на ингибирование образования α-МСГ

[80] 7.1 Реагенты и материалы

Фетальная бычья сыворотка, среда DMEM, пенициллин, стрептомицин и набор для ИФА α-МСГ.

[81] 7.2 Приборы

Микропланшетный спектрофотометр, CO₂-инкубатор и шейкер с постоянной температурой.

[82] 7.3 Линии клеток

Человеческие кератиноциты (НаСаТ) были приобретены в Куныминском банке клеток Китайского центра коллекций типовых культур при Китайской академии наук.

[83] 7.4 Образцы для тестирования

Группы лекарственных препаратов:

100 м.д. референсного пептида, 100 м.д. пептида (1), 100 м.д. пептида (3), 100 м.д. пептида (5), 100 м.д. NA, 100 м.д. ТХС и 100 м.д. КА.

Контрольная группа:

Пустой контроль PBS.

[84] 7.5 Протокол эксперимента

Замороженные клетки НаСаТ культивировали и пересевали в соотношении 1:2 примерно до 5-го поколения, и клетки с лучшими показателями ростом отбирали в качестве объектов эксперимента.

Приблизительно при 80% конфлюентности клеток образцы добавляли в каждую группу. В контрольной группе добавляли раствор PBS и добавляли культуральную среду до 1000 мкл. В группах лекарственных препаратов разбавленное активное вещество и культуральную среду добавляли до 1000 мкл, и группы дополнительно инкубировали в инкубаторе с 5% CO₂ при 37°С в течение 48 ч. После завершения культивирования растворы центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин, после чего собирали супернатанты клеток с получением образца жидкости. Операции производили в соответствии с инструкциями к набору α-МСГ.

[85] 7.6 Результаты

α-МСГ может вызывать образование меланина при активации тирозиназы. Следовательно, снижение экспрессии α-МСГ может уменьшить образование меланина и произвести отбеливающий эффект.

Результаты воздействия 100 м.д. производных пептидов согласно настоящему изобретению на экспрессию α-МСГ показаны на ФИГ. 2. Результаты показали, что по сравнению с контрольной группой, референсный пептид, NA, ТХС и КА в некоторой степени ингибировали экспрессию α-МСГ. Однако, за исключением ТХС, референсный пептид, NA и КА при 100 м.д. не показали статистического различия при ингибировании α-МСГ по сравнению с контрольной группой.

В отличие от этого, соединения с новыми структурами, пептид (1), пептид (3) и пептид (5), полученные в результате ковалентного связывания N-конца референсного пептида с NA, ТХС и КА соответственно, значимо снижали экспрессию α-МСГ и обладали более высокой активностью в сравнении NA, ТХС или КА в отдельности или референсным пептидом в отдельности, производя неожиданные технические эффекты, где пептид (1) демонстрировал наиболее сильное ингибирующее действие на α-МСГ. Таким образом, было показано, что производные пептидов согласно настоящему изобретению значимо снижали экспрессию α-МСГ, ингибируя, таким образом, продукцию меланина, и демонстрировали лучший отбеливающий эффект в сравнении с NA, ТХС или КА в отдельности или референсным пептидом в отдельности.

[86] ПРИМЕР 8 Противовоспалительный клеточный анализ

[87] 8.1 Реагенты и материалы

Фетальная бычья сыворотка, среда DMEM, пенициллин, стрептомицин, набор для ИФА IL-6 и набор для ИФА ФНО-α.

[88] 8.2 Приборы

Микропланшетный спектрофотометр, CO₂-инкубатор с постоянной температурой и шейкер с постоянной температурой.

[89] 8.3 Линии клеток

Человеческие кератиноциты (НаСаТ) были приобретены в Куныминском банке клеток Китайского центра коллекций типовых культур при Китайской академии наук.

[90] 8.4 Образцы для тестирования

Группы лекарственных препаратов:

50 м.д. референсного пептида, 50 м.д. пептида (1), 50 м.д. пептида (3) и 50 м.д. пептида (5). Контрольная группа: Пустой контроль PBS.

[91] 8.5 Протокол эксперимента

Замороженные клетки НаСаТ культивировали и пересевали в соотношении 1:2 примерно до 5-го поколения, и клетки с лучшими показателями роста отбирали в качестве объектов эксперимента.

Приблизительно при 80% конфлюентности клеток была создана модель стимулируемого УФ-излучением воспаления. В контрольной группе добавляли раствор PBS и культуральную среду до 1000 мкл, при этом УФ-облучение не проводили; группа УФ и группы лекарственных препаратов подвергали воздействию УФ-излучения с интенсивностью 80 Дж/см³. После облучения в группе УФ добавляли раствор PBS и культуральную среду до 1000 мкл, а в группах с лекарственными препаратами - разведенное активное вещество и культуральную среду до 1000 мкл. Контрольную группу, группу УФ и группы с лекарственными препаратами затем инкубировали в инкубаторе с 5% CO₂ при 37°С в течение 48 ч. После завершения культивирования растворы центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин и собирали клеточные супернатанты с получением образца жидкости. Операции производили в соответствии с инструкциями к наборам IL-6 и ФНО-α.

[92] 8.6 Результаты

Ультрафиолетовое излучение может стимулировать воспалительную реакцию кожи, что приводит к повышению секреции ФНО-α и IL-6. Следовательно, ингибирование секреции таких воспалительных факторов, как IL-6 и ФНО-α, может оказывать противовоспалительное действие.

Результаты воздействия 50 м.д. производных пептидов согласно настоящему изобретению на экспрессию воспалительных факторов, таких как IL-6 и ФНО-α, показаны на ФИГ. 3 и 4 соответственно. Результаты на ФИГ. 3 показали, что по сравнению с контрольной группой, IL-6 значительно повышался в группе УФ после ультрафиолетового облучения. После введения референсный пептид, пептид (1), пептид (3) и пептид (5) значимо снижали экспрессию IL-6, причем группы лекарственных препаратов пептида (1), пептида (3) и пептида (5) значимо отличались от группы УФ и демонстрировали более высокую противовоспалительную активность, чем референсный пептид.

Результаты на ФИГ. 4 показали, что по сравнению с контрольной группой, ФНО-α значительно повышался в группе УФ после ультрафиолетового облучения. После введения референсный пептид в некоторой степени ингибировал экспрессию ФНО-α, однако ингибирующий эффект не был очевидным; пептид (1), пептид (3) и пептид (5) значимо снижали экспрессию ФНО-α и обладали более высокой противовоспалительной активностью, чем референсный пептид.

Подводя итог, можно сказать, что соединения с новыми структурами, пептид (1), пептид (3) и пептид (5), полученные путем ковалентного связывания N-конца референсного пептида с NA, ТХС и КА соответственно, значимо снижали экспрессию IL-6 и ФНО-α и демонстрировали лучшее действие в сравнении с референсным пептидом в отдельности, показав неожиданную противовоспалительную активность на основе эффекта отбеливания. Таким образом, было показано, что производные пептидов согласно настоящему изобретению обладают как отбеливающим эффектом, так и противовоспалительной активностью и могут применяться в области косметики или медицины в качестве противовоспалительных средств, а также для отбеливания и удаления веснушек с кожи, в особенности для улучшения поствоспалительной гиперпигментации.

[93] ПРИМЕР 9 Изготовление тоника для кожи, включающего пептид (1)

Аллантоин и глицерин растворяли в воде и нагревали до 85°С, и при этой температуре выдерживали 30 мин; ПЭГ-7 глицерилкокоат и пептид (1) растворяли в воде; вышеуказанные растворы смешивали после охлаждения и однородно перемешивали с получением смешанного раствора; к вышеуказанному смешанному раствору поочередно добавляли пропиленгликоль, консервант и парфюмерную композицию, и добавляли воду с перемешиванием в однородную смесь с получением тоника для кожи.

[94] ПРИМЕР 10 Изготовление очищающего геля, включающего пептид (3)

Пептид (3) растворяли в воде и однородно перемешивали с получением раствора полипептида; карбомер и ЭДТА растворяли в воде и нагревали до 85°С; температуру поддерживали в течение 30 минут; после охлаждения добавляли триэтаноламин и однородно перемешивали с получением смешанного раствора; вышеуказанный смешанный раствор, раствор полипептида, консервант и парфюмерную композицию добавляли в воду поочередно и перемешивали до полного набухания с получением очищающего геля.

[95] ПРИМЕР 11 Композиция в виде эмульсии, включающая пептид (5)

0,01 г пептида (5) приготавливали в виде водного раствора 0,02 мг/мл; цетеариловый спирт (и) цетеарилглюкозид, масло жожоба, минеральное масло и изопропилпальмитат нагревали до 85°С и однородно перемешивали с получением фазы А; глицерин, аллантоин, полиакриламид (и) С13-14 изопарафин (и) лаурет-7 растворяли в воде и нагревали до 85°С с получением фазы В; фазу А быстро добавляли в фазу В, гомогенизировали при постоянной температуре в течение 3-5 минут и охлаждали; при охлаждении вышеуказанной смеси до температуры ниже 60°С добавляли консервант и однородно перемешивали; при охлаждении вышеуказанной смеси до температуры ниже 45°С добавляли раствор полипептида и парфюмерную композицию с получением эмульсии.

[96] Представленное выше представляет собой более подробное описание настоящего изобретения в сочетании с конкретными предпочтительными вариантами осуществления, однако не указано, что конкретные варианты осуществления настоящего изобретения ограничиваются этим. Для среднего специалиста в области, к которой относится настоящее изобретение, без отступления от концепции настоящего изобретения, некоторые простые выводы или замены, которые нужно сделать, следует считать относящимися к объему правовой охраны настоящего изобретения.

Claims (35)

1. Производное пептида, представленное Формулой (I), или его косметически приемлемая соль или его фармацевтически приемлемая соль,

R₁-Pro-Lys-Glu-Lys-R₂ (I)

в Формуле (I),

R₁ выбран из заместителя (i) или заместителя (ii), где

заместитель (i) представляет собой

заместитель (ii) представляет собой

R₂ выбран из –OH или –NH₂.

2. Производное пептида, представленное Формулой (I), по п.1, или его косметически приемлемая соль или его фармацевтически приемлемая соль, отличающееся тем, что оно выбрано из следующих производных пептидов (1)-(4):

.

3. Производное пептида, представленное Формулой (I), по п.1, или его косметически приемлемая соль или его фармацевтически приемлемая соль, отличающееся тем, что:

косметически приемлемая соль или фармацевтически приемлемая соль включает соль металла производного пептида, представленного Формулой (I), где металл включает литий, натрий, калий, кальций, магний, марганец, медь, цинк или алюминий;

необязательно, косметически приемлемая соль или фармацевтически приемлемая соль включает соль, образованную из производного пептида, представленного Формулой (I), и

органического основания, где органическое основание включает этиламин, диэтиламин, этилендиамин, этаноламин, диэтаноламин, аргинин, лизин, гистидин или пиперазин;

необязательно, косметически приемлемая соль или фармацевтически приемлемая соль включает соль, образованную из производного пептида, представленного Формулой (I), и

неорганической кислоты или органической кислоты, где органическая кислота включает уксусную кислоту, лимонную кислоту, молочную кислоту, малоновую кислоту, малеиновую кислоту, винную кислоту, фумаровую кислоту, бензойную кислоту, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, янтарную кислоту, олеиновую кислоту, трифторуксусную кислоту, щавелевую кислоту, памовую кислоту или глюконовую кислоту; необязательно, неорганическая кислота включает соляную кислоту, серную кислоту, борную кислоту или угольную кислоту.

4. Косметическая композиция для отбеливания или снятия воспаления, отличающаяся тем, что она включает эффективное количество производного пептида, представленного Формулой (I),

по любому из пп.1-3 или его косметически приемлемой соли, и по меньшей мере одно вспомогательное вещество и, необязательно, косметически приемлемый адъювант;

необязательно, адъювант выбран из стимулятора синтеза коллагена, средства, которое модулирует синтез PGC-1α, средства, которое модулирует активность PPARγ, средства, которое повышает или снижает содержание триглицеридов в адипоцитах, средства, которое стимулирует или задерживает дифференцировку адипоцитов, липолитического средства или средства, которое стимулирует липолиз, средства, выводящего жир, адипогенного средства,

ингибитора агрегации ацетилхолиновых рецепторов, средства, которое ингибирует сокращение мышц, антихолинергического средства, ингибитора эластазы, ингибитора матриксных металлопротеиназ, стимулятора или ингибитора синтеза меланина, отбеливающего или обесцвечивающего средства, промотора пигментации, средства для автозагара, антивозрастного средства, ингибитора NO-синтазы, ингибитора 5α-редуктазы, ингибитора лизилгидроксилазы и/или пролилгидроксилазы, антиоксиданта, ловушки свободных радикалов и/или средства для борьбы с загрязнением воздуха, ловушки активных карбонильных соединений, антигликирующего средства, антигистаминного средства, противовирусного средства, противопаразитарного средства, эмульгатора, смягчающего средства, органического растворителя, жидкого пропеллента, кондиционера для кожи, увлажняющего вещества, влагоудерживающего вещества, альфа-гидроксикислоты, бета-гидроксикислоты, увлажнителя, эпидермальной гидролазы, витамина, аминокислоты, белка, пигмента или красящего вещества,

красителя, биополимера, гелеобразующего полимера, загустителя, поверхностно-активного вещества, умягчителя, адгезива, консерванта, средства против морщин, средства, которое может уменьшать или лечить мешки под глазами, эксфолианта, средства, отшелушивающего кутикулу, кератолитического средства, противомикробного, противогрибкового, фунгистатического, бактерицидного, бактериостатического средства, средства, которое стимулирует синтез дермальных или эпидермальных макромолекул и/или ингибирует или предотвращает их деградацию, средства, которое стимулирует синтез эластина, средства, которое стимулирует синтез декорина, средства, которое стимулирует синтез ламинина, средства, которое стимулирует синтез дефензина, средства, которое стимулирует синтез белка-шаперона, средства, которое стимулирует синтез цАМФ, белка теплового шока, средства, которое стимулирует синтез HSP70, средства, которое стимулирует синтез белка теплового шока, средства, которое стимулирует синтез гиалуроновой кислоты, средства, которое стимулирует синтез фибронектина, средства, которое стимулирует синтез деацетилазы, средства, которое стимулирует синтез липида и компонента рогового слоя, церамида, жирной кислоты, средства, которое ингибирует деградацию коллагена, средства, которое ингибирует деградацию эластина, средства, которое ингибирует сериновую протеазу, средства, которое стимулирует пролиферацию фибробластов, средства, которое стимулирует пролиферацию кератиноцитов, средства, которое стимулирует пролиферацию адипоцитов, средства, которое стимулирует пролиферацию меланоцитов, средства, которое стимулирует дифференцировку кератиноцитов, средства, которое ингибирует ацетилхолинэстеразу, кожного релаксанта, средства, которое стимулирует синтез гликозаминогликанов, средства против гиперкератоза, комедолитического средства, противопсориазного средства,

средства против дерматита, средства против экземы, средства для репарации ДНК, средства, защищающего ДНК, стабилизатора, противозудного средства, средства для лечения и/или ухода за чувствительной кожей, дубящего средства, подтягивающего средства, реструктурирующего средства, средства против растяжек, адгезива, средства, которое регулирует выработку кожного сала, антиперспиранта, средства, которое стимулирует заживление, средства, которое способствует заживлению, средства, которое стимулирует реэпителизацию, средства, которое способствует реэпителизации, фактора роста цитокинов, успокаивающего средства, противовоспалительного средства, анестезирующего средства, средства, действующего на капиллярное кровообращение и/или микроциркуляцию, средства, которое стимулирует ангиогенез, средства, которое ингибирует проницаемость сосудов, венотонизирующего средства, средства, действующего на клеточный метаболизм, средства для улучшения связи дермы и эпидермиса, средства, которое вызывает рост волос, средства, ингибирующего или замедляющего рост волос, ароматизатора, хелатообразователя,

растительного экстракта, эфирного масла, экстракта морских водорослей, средств, полученных в результате биологического процесса ферментации, неорганической соли, клеточного экстракта, солнцезащитного фильтра и эффективного органического или неорганического фотопротектора против УФА и/или УФВ-излучения или их смесей.

5. Косметическая композиция по п.4, отличающаяся тем, что препарат косметической композиции выбран из крема, масла, молочка, бальзама, пены, лосьона, геля, линимента, сыворотки, мыла, шампуня, кондиционера для волос, сыворотки, мази, мусса, помады, пудры, бруска, карандаша, спрея, аэрозоля, гранулы, раствора, суспензии, эмульсии или желе.

6. Фармацевтическая композиция для отбеливания или снятия воспаления, отличающаяся тем, что она включает эффективное количество производного пептида, представленного Формулой (I), по любому из пп.1-3 или его фармацевтически приемлемой соли, и по меньшей мере одно вспомогательное вещество и, необязательно, фармацевтически приемлемый адъювант; необязательно, адъювант выбран из стимулятора синтеза коллагена, средства, которое модулирует синтез PGC-1α, средства, которое модулирует активность PPARγ, средства, которое повышает или снижает содержание триглицеридов в адипоцитах, средства, которое стимулирует или задерживает дифференцировку адипоцитов, липолитического средства или средства, которое стимулирует липолиз, средства, выводящего жир, адипогенного средства, ингибитора агрегации ацетилхолиновых рецепторов, средства, которое ингибирует сокращение мышц, антихолинергического средства, ингибитора эластазы, ингибитора матриксных металлопротеиназ, стимулятора или ингибитора синтеза меланина, отбеливающего или обесцвечивающего средства, промотора пигментации, средства для автозагара, антивозрастного средства, ингибитора NO-синтазы, ингибитора 5α-редуктазы, ингибитора лизилгидроксилазы и/или пролилгидроксилазы, антиоксиданта, ловушки свободных радикалов и/или средства для борьбы с загрязнением воздуха, ловушки активных карбонильных соединений, антигликирующего средства, антигистаминного средства, противовирусного средства, противопаразитарного средства, эмульгатора, смягчающего средства, органического растворителя, жидкого пропеллента, кондиционера для кожи, увлажняющего вещества, влагоудерживающего вещества, альфа-гидроксикислоты, бета-гидроксикислоты, увлажнителя, эпидермальной гидролазы, витамина, аминокислоты, белка, пигмента или красящего вещества, красителя, биополимера, гелеобразующего полимера, загустителя, поверхностно-активного вещества, умягчителя, адгезива, консерванта, средства против морщин, средства, которое может уменьшать или лечить мешки под глазами, эксфолианта, средства, отшелушивающего кутикулу, кератолитического средства, противомикробного, противогрибкового, фунгистатического, бактерицидного, бактериостатического средства, средства, которое стимулирует синтез дермальных или эпидермальных макромолекул и/или ингибирует или предотвращает их деградацию, средства, которое стимулирует синтез эластина, средства, которое стимулирует синтез декорина, средства, которое стимулирует синтез ламинина, средства, которое стимулирует синтез дефензина, средства, которое стимулирует синтез белка-шаперона, средства, которое стимулирует синтез цАМФ, белка теплового шока, средства, которое стимулирует синтез HSP70, средства, которое стимулирует синтез белка теплового шока, средства, которое стимулирует синтез гиалуроновой кислоты, средства, которое стимулирует синтез фибронектина, средства, которое стимулирует синтез деацетилазы, средства, которое стимулирует синтез липида и компонента рогового слоя, церамида, жирной кислоты, средства, которое ингибирует деградацию коллагена, средства, которое ингибирует деградацию эластина, средства, которое ингибирует сериновую протеазу, средства, которое стимулирует пролиферацию фибробластов, средства, которое стимулирует пролиферацию кератиноцитов, средства, которое стимулирует пролиферацию адипоцитов, средства, которое стимулирует пролиферацию меланоцитов, средства, которое стимулирует дифференцировку кератиноцитов, средства, которое ингибирует ацетилхолинэстеразу, кожного релаксанта, средства, которое стимулирует синтез гликозаминогликанов, средства против гиперкератоза, комедолитического средства, противопсориазного средства, средства против дерматита, средства против экземы, средства для репарации ДНК, средства, защищающего ДНК, стабилизатора, противозудного средства, средства для лечения и/или ухода за чувствительной кожей, дубящего средства, подтягивающего средства, реструктурирующего средства, средства против растяжек, адгезива, средства, которое регулирует выработку кожного сала, антиперспиранта, средства, которое стимулирует заживление, средства, которое способствует заживлению, средства, которое стимулирует реэпителизацию, средства, которое способствует реэпителизации, фактора роста цитокинов, успокаивающего средства, противовоспалительного средства, анестезирующего средства, средства, действующего на капиллярное кровообращение и/или микроциркуляцию, средства, которое стимулирует ангиогенез, средства, которое ингибирует проницаемость сосудов, венотонизирующего средства, средства, действующего на клеточный метаболизм, средства для улучшения связи дермы и эпидермиса, средства, которое вызывает рост волос, средства, ингибирующего или замедляющего рост волос, ароматизатора, хелатообразователя, растительного экстракта, эфирного масла, экстракта морских водорослей, средств, полученных в результате биологического процесса ферментации, неорганической соли, клеточного экстракта, солнцезащитного фильтра и эффективного органического или неорганического фотопротектора против УФА и/или УФВ-излучения или их смесей.

7. Фармацевтическая композиция по п.6, отличающаяся тем, что препарат фармацевтической композиции выбран из крема, масла, молочка, бальзама, пены, лосьона, геля, линимента, сыворотки, мыла, шампуня, кондиционера для волос, сыворотки, мази, мусса, помады, пудры, бруска, карандаша, спрея, аэрозоля, капсулы, таблетки, гранулы, жевательной резинки, раствора, суспензии, эмульсии, сиропа, эликсира, полисахаридной пленки, желе или желатина; необязательно, капсула включает мягкую капсулу, твердую капсулу, необязательно желатиновую капсулу; необязательно, таблетка включает таблетку, покрытую сахарной оболочкой.

8. Косметически приемлемая система доставки для отбеливания или для снятия воспаления, отличающаяся тем, что она включает эффективное количество производного пептида, представленного Формулой (I), по любому из пп.1-3 или его косметически приемлемой соли; косметически приемлемая система доставки выбрана из микроэмульсии или наноэмульсии; или, необязательно микроэмульсии; или, необязательно, водно-жировой микроэмульсии, имеющей внутреннюю структуру обратной мицеллы.

9. Применение производного пептида, представленного Формулой (I), по любому из пп.1-3 или его косметически приемлемой соли, или косметической композиции по п.4, или косметически приемлемой системы доставки по п.8 в производстве косметической композиции для снятия воспаления кожи, а также отбеливания и удаления веснушек, особенно для улучшения поствоспалительной пигментации.

10. Применение производного пептида, представленного Формулой (I), по любому из пп.1-3 или его фармацевтически приемлемой соли, или фармацевтической композиции по п.6 в производстве фармацевтической композиции для снятия воспаления кожи, а также отбеливания и удаления веснушек, особенно для улучшения поствоспалительной пигментации.

11. Применение производного пептида, представленного Формулой (I), по любому из пп.1-3 или его косметически приемлемой соли, или косметической композиции по п.4, или косметически приемлемой системы доставки по п.8 в производстве косметической композиции для отбеливания.

12. Применение производного пептида, представленного Формулой (I), по любому из пп.1-3 или его фармацевтически приемлемой соли, или фармацевтической композиции по п.6 в производстве фармацевтической композиции для отбеливания.

13. Применение производного пептида, представленного Формулой (I), по любому из пп.1-3 или его косметически приемлемой соли, или косметической композиции по п.4, или косметически приемлемой системы доставки по п.8 в производстве косметической композиции для снятия воспаления.

14. Применение производного пептида, представленного Формулой (I), по любому из пп.1-3 или его фармацевтически приемлемой соли, или фармацевтической композиции по п.6 в производстве фармацевтической композиции для снятия воспаления.

15. Применение производного пептида, представленного Формулой (I), по любому из пп.1-3 или его косметически приемлемой соли, или косметической композиции по п.4, или косметически приемлемой системы доставки по п.8 в производстве косметической композиции для улучшения поствоспалительной гиперпигментации.

16. Применение производного пептида, представленного Формулой (I), по любому из пп.1-3 или его фармацевтически приемлемой соли, или фармацевтической композиции по п.6 в производстве фармацевтической композиции для улучшения поствоспалительной гиперпигментации.