RU2846915C2

RU2846915C2 - Новое антитело против muc1 и его применение

Info

Publication number: RU2846915C2
Application number: RU2024103475A
Authority: RU
Inventors: Хоил ЧХВЕ
Original assignee: Пептрон, Инк.
Priority date: 2021-08-27
Filing date: 2022-08-25
Publication date: 2025-09-18

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии. Представлены: антитело и его применение, конъюгат антитела с лекарственным средством, фармацевтическая композиция, для профилактики или лечения рака. Также раскрыты нуклеиновая кислота, кодирующая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вектор, клетка-хозяин, содержащая указанную нуклеиновую кислоту, и способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. Изобретение применяется для лечения или профилактики рака. 7 н. и 2 з.п. ф-лы, 5 ил., 2 пр.

Description

Область техники

Настоящее изобретение относится к антителу к MUC1, которое специфично связывается с муцином 1 (MUC1), и его применению, причем антитело к MUC1 или его антигенсвязывающий фрагмент имеют аминокислотную последовательность, способствующую повышению их чистоты в процессе получения. Кроме того, настоящее изобретение относится к конъюгату антитела с лекарственным средством (конъюгат антитело-лекарственное средство) или биспецифичному антителу, содержащим антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, фармацевтической композиции для профилактики или лечения рака, содержащей конъюгат антитела с лекарственным средством или биспецифичное антитело, нуклеиновой кислоте, кодирующей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вектору и клетке-хозяину, содержащим нуклеиновую кислоту, и способу получения антитела к MUC1 или его антигенсвязывающего фрагмента с использованием вектора и клетки-хозяина.

Уровень техники

Муцин 1 (MUC1) представляет собой трансмембранный гликопротеин, содержащий множество гликозилированных внеклеточных доменов. Длина MUC1 на поверхности клетки составляет от 200 до 500 нм, и MUC1 расположен на апикальной мембране нормальных эпителиальных клеток. MUC1 экспрессируется в железистых или люминальных эпителиальных клетках многих органов, таких как молочная железа, желудок, пищевод, поджелудочная железа, уретра, легкие, почки и желчный пузырь. В нормальных тканях отрицательно заряженные углеводы белка MUC1 образуют физический барьер, который защищает базальный эпителий от обезвоживания, изменений рН, воздействия пыльцы и проникновения микроорганизмов. Ген MUC1 кодирует один транскрипт. После трансляции MUC1 происходит аутопротеолитическое расщепление по мотиву GSVVV, расположенному в домене SEA, первоначально идентифицированном в белке спермы морского ежа, белках энтерокиназы и агрина (Sea urchin sperm protein, Enterokinase and Agrin domain). Ген MUC1 кодирует два пептидных фрагмента, N-концевой субъединицы (MUC1-N) и С-концевой субъединицы (MUC1-C).

После первоначальной экспрессии белка MUC1 в муцине MUC1 область, связанная с клеткой, и область, которая может высвобождаться во внеклеточное пространство, связываются друг с другом посредством нековалентного взаимодействия. В этом случае расщепление осуществляется ферментом под названием «шеддаза». Комплекс MUC1 выделяется при стимуляции цитокинами, такими как IFN-γ и TNF-α. MUC1-N высвобождается ферментами, включая TNF-α-конвертирующий фермент (ТАСЕ) и матриксную металлопротеазу (ММР). Эти ферменты расщепляют внеклеточный домен MUC1-C на два фрагмента. По мере прогрессирования рака эти внеклеточные фрагменты выделяются из раковых клеток и циркулируют в кровеносном русле организма, тогда как фрагменты, связанные с клетками, существуют в непрерывной связи с раковыми клетками.

MUC1 важен для роста раковых клеток, поскольку он играет критическую роль в пролиферации раковых клеток, путем передачи непрерывного сигнала клеточной пролиферации через связь с белками клеточной мембраны, которые ассоциированы с пролиферацией раковых клеток и присутствуют в других раковых клетках. Кроме того, этот фрагмент всегда присутствует рядом с раковой клеткой на протяжении всего периода ее роста и гибели, действуя, таким образом, как хорошая мишень для обнаружения рака и как критический биомаркер для устранения рака. Кроме того, в отличие от других фрагментов MUC1, это единственная известная область MUC1, которая не подвергается гликозилированию, и рассматривалась как отличительная область, которая демонстрирует явное отличие при различении MUC1 в нормальных клетках от MUC1 в раковых клетках. Соответственно, авторы настоящего изобретения обнаружили, что связанная с клеткой область MUC1 ассоциирована с раком и что этот фрагмент является оптимальным антигеном для антитела, позволяющим отличить MUC1 в нормальных клетках от MUC1 в раковых клетках, и разработали антитело, нацеленное на С-концевой участок MUC1 (MUC1-C).

Информация, представленная в разделе «Уровень техники», предназначена только для лучшего понимания предпосылок настоящего изобретения в уровне техники. Соответственно, информация, составляющая уровень техники, известная специалистам в данной области техники, к которой относится настоящее изобретение, может не быть включена.

Раскрытие изобретения

Техническая задача

Объектом настоящего изобретения является обеспечение антитела к MUC1 или его антигенсвязывающего фрагмента, которые специфично связываются с «клеточно-связывающей/связанной с клеткой областью» MUC1 и имеют сниженное гликозилирование по определенному остатку. Задачей настоящего изобретения является обеспечение антитела к MUC1 или его антигенсвязывающего фрагмента, которые специфично связываются с «клеточно-связывающей областью» MUC1 и имеют сниженное гликозилирование по определенному остатку.

Другим объектом настоящего изобретения является обеспечение конъюгата антитело-лекарственное средство, в котором лекарственное средство конъюгировано с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, биспецифичного антитела, содержащего антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, или CAR-T клетки (Т-клетки с химерным антигенным рецептором), CAR-NK клетки (клетки естественного киллера с химерным антигенным рецептором) и/или CAR-MA (клетки макрофага с химерным антигенным рецептором) в виде иммунных клеток, содержащих химерный антигенный рецептор (CAR), содержащий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

Еще одним объектом настоящего изобретения является обеспечение композиции для предупреждения или лечения рака и способа лечения рака, композиция содержит антитело к MUC1 или его антигенсвязывающий фрагмент, конъюгат антитело-лекарственное средство или биспецифичное антитело.

Еще одним объектом настоящего изобретения является обеспечение композиции для диагностики рака и способа диагностики, включающих антитело к MUC1 или его антигенсвязывающий фрагмент.

Еще одним объектом настоящего изобретения является обеспечение нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело к MUC1 или его антигенсвязывающий фрагмент, вектора и клетки-хозяина, содержащих нуклеиновую кислоту, и способа получения антитела к MUC1 или его антигенсвязывающего фрагмента с использованием вектора и клетки-хозяина.

Техническое решение

Для достижения вышеуказанной задачи в одном аспекте настоящего изобретения предложены антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, в которых некоторые аминокислотные остатки замещены, в виде антитела к MUC1 или его антигенсвязывающего фрагмента, которые распознают полипептид, содержащий пять или более последовательных аминокислот в С-концевом внеклеточном домене MUC1.

Предпочтительно антитело к MUC1 или его антигенсвязывающий фрагмент содержат шесть определяющих комплементарность участков (CDR, complementarity determining region). Антитело к MUC1 или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать по меньшей мере одну последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательности CDR1 тяжелой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 1 (GYTFTSYWMH); CDR2 тяжелой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 2 (YINPGTGYIEYNQKFKD); CDR3 тяжелой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 3 (STAPFDY); CDR1 легкой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 4 (XASQDIXSYLS); CDR2 легкой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 5 (YATRLAD); и CDR3 легкой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 6 (LQYDESPYT), и остаток лизина (K), содержащийся в последовательности CDR легкой цепи, может быть замещен другой аминокислотой.

В другом аспекте настоящего изобретения предложена гибридома для получения антитела к MUC1.

Еще в одном аспекте настоящего изобретения предложен конъюгат антитело-лекарственное средство, или биспецифичное антитело, или клетки CAR-T, CAR-NK и/или CAR-MA в виде иммунных клеток, содержащих химерный антигенный рецептор (CAR), включающий антитело к MUC1 или его антигенсвязывающий фрагмент.

В еще одном аспекте в настоящем изобретении предложены фармацевтическая композиция для предотвращения или лечения рака и способ лечения рака, включающие антитело к MUC1 или его антигенсвязывающий фрагмент, конъюгат антитело-лекарственное средство, или биспецифичное антитело.

Еще в одном аспекте настоящего изобретения предложены композиция для диагностики рака и способ диагностики, включающие антитело к MUC1 или его антигенсвязывающий фрагмент.

Еще в одном аспекте настоящего изобретения предложены нуклеиновая кислота, кодирующая антитело к MUC1 или его антигенсвязывающий фрагмент, вектор и клетка-хозяин, содержащие нуклеиновую кислоту, и способ получения антитела к MUC1 или его антигенсвязывающего фрагмента, с использованием вектора и клетки-хозяина.

Муцин 1 (MUC1) в основном экспрессируется на одной стороне (апикальной мембране) нормальной эпителиальной клетки, а также аномально экспрессируется на высоком уровне в различных раковых клетках. MUC1, экспрессируемый в раковых клетках, имеет пониженную степень гликозилирования, экспрессируется одинаково на всей поверхности клеток и участвует в стимулировании пролиферации, инвазии, метастазирования и ангиогенеза раковых клеток. Специфичный для рака муцин 1 (MUC1), экспрессируемый в раковых клетках, обычно экспрессируется на одной стороне (апикальной мембране) нормальных эпителиальных клеток, а также аномально экспрессируется на высоких уровнях в различных раковых клетках. MUC1, экспрессируемый при раке, имеет пониженную степень гликозилирования, экспрессируется одинаково на всей поверхности клеток и участвует в стимулировании пролиферации, инвазии, метастазирования и ангиогенеза раковых клеток, так что MUC1, экспрессируемый в раковых клетках, является мишенью для специфичного лечения рака.

В частности, домен MUC1-C (С-концевая субъединица MUC1) является трансмембранным или расположен в цитоплазме, и после расщепления MUC1 ферментом концевой участок MUC1-C (внеклеточный домен) остается на поверхности клетки. В настоящем изобретении предложено новое антитело, которое специфично связывается с С-концом MUC1, нацеливаясь на него, в частности, антитело к MUC1-C или его антигенсвязывающая фрагмент, в которых некоторые остатки лизина (K), содержащиеся в CDR антитела, замещены, тем самым снижая гликозилирование соответствующей области.

Таким образом, в одном аспекте настоящее изобретение относится к антителу к MUC1 или его антигенсвязывающему фрагменту, которые специфично связываются с MUC1.

Более конкретно, антитело или антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению представляют собой антитело к MUC1 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые распознают полипептид, содержащий пять или более последовательных аминокислот в С-концевом внеклеточном домене MUC1, и могут содержать замену одного или более аминокислотных остатков в последовательности CDR антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.

В настоящей заявке термин «антитело» относится к общему названию веществ, продуцируемых иммунной системой в ответ на стимуляцию антигенами, и типы этих веществ не ограничены. Антитело представляет собой молекулу иммуноглобулина, которая иммунологически реактивна по отношению к специфичному антигену, и относится к белковой молекуле, которая действует как рецептор, специфично распознающий антиген, и может включать все поликлональные антитела и моноклональные антитела, а также полноразмерное антитело и фрагменты антитела. Антитело может быть получено искусственным путем, например, рекомбинантно или синтетически. Антитело может представлять собой антитело животного происхождения (например, мышиное антитело и т.д.), химерное антитело, гуманизированное антитело или человеческое антитело. Антитело может представлять собой моноклональное антитело. Кроме того, если не указано иное, следует понимать, что антитело также включает антигенсвязывающий фрагмент антитела, обладающий антигенсвязывающей способностью.

В настоящей заявке термин «определяющие комплементарность участки (CDR)» относится к участкам, которые придают специфичность связывания по отношению к антигену вариабельным областям антитела. Антигенсвязывающий фрагмент антитела, описанного выше, может представлять собой фрагмент антитела, содержащий один или более определяющих комплементарность участков.

В настоящем изобретении антитело к MUC1 может быть получено с помощью гибридомы.

Кроме того, антитело к MUC1 или его антигенсвязывающий фрагмент имеют определяющие комплементарность участки CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 или вариабельные области тяжелой цепи и вариабельные области легкой цепи антитела, полученные с помощью гибридомы.

В одном аспекте антитело к MUC1 или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению включают шесть определяющих комплементарность участков (CDR). Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат по меньшей мере одну последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей CDR1 тяжелой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 1 (GYTFTSYWMH); CDR2 тяжелой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 2 (YINPGTGYIEYNQKFKD); CDR3 тяжелой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 3 (STAPFDY); CDR1 легкой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 4 (XASQDLXSYLS); CDR2 легкой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 5 (YATRLAD); и CDR3 легкой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 6 (LQYDESPYT), и один или более аминокислотных остатков в CDR антитела могут быть замещены другими аминокислотами.

Более конкретно, замещенные аминокислоты в антителе или антигенсвязывающей фрагменте согласно настоящему изобретению представляют собой аминокислотные остатки в положениях 1 и 7 в последовательности CDR легкой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 4. Таким образом, аминокислотный остаток, подлежащий замене, представляет собой лизин K24 или K30 CDR легкой цепи антитела к MUC1 согласно настоящему изобретению. Аминокислота, на которую происходит замена, не ограничивается ее типом, но предпочтительно может быть выбрана из группы, состоящей из аргинина (R), гистидина (Н), аспарагиновой кислоты (D) или глутаминовой кислоты (G), представляющих собой аминокислоты, содержащие электрически полярные боковые цепи, или глицина (G), аланина (А), валина (V), метионина (М), фенилаланина (F), тирозина (Y), триптофана (W), лейцина (L) или изолейцина (I), представляющих собой аминокислоты, содержащие гидрофобные боковые цепи, и более предпочтительно аргинина (R) или глицина (G). Таким образом, поскольку посттрансляционная модификация путем гликозилирования остатков не происходит благодаря замене остатков лизина в CDR, сложность протеома снижается, что позволяет получать антитела или их антигенсвязывающие фрагменты высокой чистоты.

В настоящем изобретении антитело к MUC1 или его антигенсвязывающий фрагмент могут характеризоваться способностью к распознаванию или специфичному связыванию с полипептидом (эпитопом), содержащим по меньшей мере 5, 7, 10, 12 или предпочтительно 15 или более аминокислот в пределах белка MUC1, более конкретно С-концевого внеклеточного домена белка MUC1. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут характеризоваться способностью к распознаванию и/или специфичному связыванию с внеклеточным доменом белка MUC1, доменом SEA белка MUC1 или С-концевым внеклеточным доменом белка MUC1. В настоящей заявке термин «MUC1-специфичное антитело» или «антитело, специфично связывающееся с MUC1» относятся к антителу, которое связывается с MUC1, вызывая ингибирование биологической активности MUC1, и используется взаимозаменяемо с термином «антитело к MUC1». В настоящей заявке термин «антитело к MUC1» может представлять собой антитело животного происхождения (например, мышиное антитело), химерное антитело (например, химерное антитело мыши-человека) или гуманизированное антитело и может представлять собой моноклональное антитело или поликлональное антитело, например, моноклональное антитело. Термин «антитело к MUC1» представляет собой понятие, которое включает как поликлональное антитело, так и моноклональное антитело, предпочтительно моноклональное антитело, и может быть в форме интактного полноразмерного антитела. Полноразмерное антитело представляет собой структуру с двумя полноразмерными легкими цепями и двумя полноразмерными тяжелыми цепями, и структуру, содержащую константные области, и каждая легкая цепь соединена с тяжелой цепью дисульфидными связями.

Термин «полноразмерное антитело к MUC1» согласно настоящему изобретению представляет собой понятие, включающее классы антител IgA, IgD, IgE, IgM и IgG, и класс IgG в качестве подклассов включает IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4.

Интактное антитело класса IgG имеет структуру, содержащую две полноразмерные легкие цепи и две полноразмерные тяжелые цепи, и каждая легкая цепь соединена с тяжелой цепью дисульфидными связями. Константная область антитела разделена на константную область тяжелой цепи и константную область легкой цепи, и константная область тяжелой цепи имеет типы гамма (γ), мю (μ), альфа (α), дельта (δ) и эпсилон (ε), а подклассы включают гамма 1 (γ1), гамма 2 (γ2), гамма 3 (γ3), гамма 4 (γ4), альфа 1 (α1) и альфа 2 (α2). Константная область легкой цепи имеет типы каппа (κ) и лямбда (λ).

В настоящей заявке термин «тяжелая цепь» интерпретируется как включающий всю полноразмерную тяжелую цепь, содержащую домен вариабельной области VH, включая аминокислотную последовательность, имеющую достаточную последовательность вариабельной области для придания специфичности по отношению к антигену, три домена константной области CH1, СН2, СН3 и шарниры, и ее фрагменты. Кроме того, термин «легкая цепь» интерпретируется как включающий всю полноразмерную легкую цепь, содержащую домен вариабельной области VL, включая аминокислотную последовательность, имеющую последовательность вариабельной области, достаточную для придания специфичности по отношению к антигену, и домен константной области CL, и ее фрагменты.

В настоящей заявке «определяющий комплементарность участок (CDR)» относится к аминокислотной последовательности гипервариабельной области тяжелых и легких цепей иммуноглобулина. Тяжелая и легкая цепи могут включать по три CDR - CDRH1, CDRH2, CDRH3 и CDRL1, CDRL2, CDRL3, соответственно. CDR могут обеспечивать ключевые контактные остатки для связывания антитела с антигеном или эпитопом.

При этом термин «специфичное связывание» или «специфичное распознавание» имеет то же значение, которое общеизвестно специалистам в данной области техники, и означает, что антиген и антитело специфично взаимодействуют друг с другом, вызывая иммунный ответ.

Термин «антигенсвязывающий фрагмент» антитела к MUC1 согласно настоящему изобретению относится к фрагменту, который обладает функцией способности антитела к MUC1 связываться с антигеном, то есть с MUC1, и соответствует понятию, включающему Fab, Fab', F(ab')2, scFv, (scFv)2, scFv-Fc и Fv, и используется взаимозаменяемо с тем же значением, что и термин «фрагмент антитела». Например, антигенсвязывающий фрагмент может представлять собой scFv, (scFv)2, Fab, Fab' или F(ab')2, но не ограничен ими. Среди перечисленных выше антигенсвязывающих фрагментов Fab представляет собой структуру, включающую вариабельные области легкой и тяжелой цепей, константную область легкой цепи и первую константную область (СН1) тяжелой цепи, и имеющую один антигенсвязывающий участок. Fab' отличается от Fab наличием шарнирной области, содержащей один или более остатков цистеина на С-конце домена СН1 тяжелой цепи. Фрагмент F(ab')2 антитела образуется, когда остатки цистеина в шарнирной области фрагмента Fab' формируют дисульфидные связи. Фрагмент Fv представляет собой минимальный фрагмент антитела, имеющий только вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, и метод рекомбинации для получения фрагмента Fv широко известен в данной области техники. В двуцепочечном фрагменте Fv вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи соединены нековалентными связями, и одноцепочечный фрагмент Fv обычно может образовывать димероподобную структуру, такую как двуцепочечный Fv, поскольку вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи ковалентно связаны друг с другом через пептидный линкер или непосредственно на С-конце. Антигенсвязывающие фрагменты могут быть получены с использованием протеазы (например, при ограниченном расщеплении папаином полноразмерного антитела получают фрагмент Fab, а при расщеплении пепсином получают фрагмент F(ab')2), а также могут быть получены с помощью методов генетической рекомбинации.

В настоящей заявке термин "шарнирная область" относится к области, содержащейся в тяжелой цепи антитела, и означает область, которая находится между областями СН1 и СН2 и функционирует для обеспечения подвижности антигенсвязывающего участка внутри антитела.

Антитело к MUC1 может представлять собой моноклональное антитело. Моноклональное антитело может быть получено в соответствии с методами, хорошо известными в данной области техники. Например, моноклональное антитело может быть получено с использованием метода фагового дисплея. В качестве альтернативы, моноклональное антитело может быть получено в виде моноклонального антитела мышиного происхождения обычным способом с использованием антитела к MUC1.

При этом отдельные моноклональные антитела могут быть подвергнуты скринингу на основе способности связывания с MUC1 с использованием типичного формата твердофазного иммуноферментного анализа (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA). Конъюгаты могут быть протестированы на ингибирующую активность с помощью функциональных анализов, таких как конкурентный анализ ELISA или клеточные анализы для тестирования молекулярных взаимодействий. Затем моноклональные антитела, отобранные на основе сильной ингибирующей активности, проверяют на их соответствующую аффинность (значения Kd) к MUC1.

Объем притязаний, относящийся к заявленному антителу к MUC1 или его антигенсвязывающему фрагменту согласно настоящему изобретению включает пептиды и аптамеры, которые обладают по существу такой же способностью к связыванию и специфичностью в отношении антигена MUC1, при этом имеют по меньшей мере один из CDR1-CDR3 легкой и тяжелой цепей, содержащихся в антителе к MUC1 или его антигенсвязывающем фрагменте согласно настоящему изобретению.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к гибридоме для получения антитела к MUC1. В настоящем изобретении предложено антитело к MUC1 или его антигенсвязывающий фрагмент, продуцируемые гибридомой. В качестве другого примера в настоящем изобретении предложено антитело к MUC1 или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие определяющий комплементарность участок тяжелой цепи (CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 или их комбинацию), определяющий комплементарность участок легкой цепи (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 или их комбинацию) или их комбинацию антитела к MUC1, продуцируемого гибридомой; или вариабельную область тяжелой цепи, вариабельную область легкой цепи или их комбинацию антитела к MUC1, продуцируемого гибридомой.

В этом случае участок, определяющий комплементарность, может быть определен всеми общепринятыми способами, например, определением в соответствии с системой IMGT или определением в соответствии с системой Kabat, но не ограничиваясь ими.

В настоящем изобретении антитело к MUC1 или его антигенсвязывающий фрагмент специфично распознают С-концевой внеклеточный домен MUC1, так что антитело к MUC1 или его антигенсвязывающий фрагмент могут специфично действовать на раковые или опухолевые клетки, в которых С-концевой внеклеточный домен MUC1 экспрессируется на более высоком уровне и менее гликозилирован, чем в нормальных клетках, и могут распознавать/связываться с белком MUC1, экспрессируемым не только на одной стороне поверхности клетки, но и на всей поверхности клетки. Кроме того, антитело к MUC1 или его антигенсвязывающий фрагмент не только связываются с белком MUC1, особенно с С-концевым внеклеточным доменом MUC1, но также эффективно ингибируют опосредованный белком MUC1 путь с помощью интернализации в клетку, тем самым максимизируя фармакологический эффект. Кроме того, свойство интернализации антитела к MUC1 или его антигенсвязывающего фрагмента имеет преимущество, заключающееся в эффективной доставке конъюгированного лекарственного средства в клетки при применении в виде конъюгата антитело-лекарственное средство (ADC).

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к иммунной клетке, включающей химерный антигенный рецептор (chimeric antigen receptor, CAR), содержащий антитело к MUC1 или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению, более конкретно, к клетке CAR-T, клетке CAR-NK и/или клетке CAR-MA, и терапевтическому средству, включающему иммунную клетку. Форма антитела к MUC1 или его антигенсвязывающего фрагмента, используемых в клетках CAR-T, CAR-NK, CAR-MA или терапевтическом средстве, включающем их, предпочтительно, но не исключительно, представляет собой фрагмент scFv.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к конъюгату антитело-лекарственное средство (ADC, antibody-drug conjugate), в котором лекарственное средство конъюгировано с антителом к MUC1 или его антигенсвязывающим фрагментом.

В конъюгате антитело-лекарственное средство (ADC) противораковое лекарственное средство должно быть стабильно связано с антителом вплоть до доставки противоракового лекарственного средства в целевую раковую клетку. Лекарственное средство, доставляемое к мишени, должно высвобождаться из антитела, чтобы вызвать гибель клетки-мишени. Для достижения этой цели лекарственное средство должно быть стабильно связано с антителом, в то же время обладая достаточной цитотоксичностью, чтобы индуцировать гибель клетки-мишени при высвобождении в клетке-мишени.

В настоящем изобретении конъюгат антитело-лекарственное средство может быть получен в соответствии с методикой, хорошо известной в данной области техники, к которой относится настоящее изобретение.

В настоящем изобретении конъюгат антитело-лекарственное средство может быть охарактеризован тем, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связываются с лекарственным средством посредством линкера.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к биспецифичному антителу, содержащему антитело к MUC1 или его антигенсвязывающий фрагмент. Биспецифичное антитело означает форму, в которой в двух «плечах» антитела одно плечо содержит антитело к MUC1 или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению, а другое плечо содержит антитело, специфичное к антигену, отличному от MUC1, предпочтительно к антигену, ассоциированному с раком, или к антигену иммунной контрольной точки, или антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфично связывающееся с антигеном, ассоциированным с иммунной эффекторной клеткой.

Антиген, связывающийся с антителом, отличным от антитела к MUC1, содержащегося в биспецифичном антителе согласно настоящему изобретению, может быть выбран предпочтительно из антигенов Her2, EGFR, VEGF, VEGF-R, CD-20, MUC16, CD30, CD33, CD52, PD-1, PD-L1, CTLA4, BTLA4, EphB2, Е-селектина, EpCam, СЕА, PSMA, PSA, ERB3, с-МЕТ и т.д. в качестве антигена, ассоциированного с раком, или антигена белка иммунной контрольной точки, и выбран из TCR/CD3, CD16(FcγRIIIa) CD44, CD56, CD69, CD64(FcγRI), CD89, CD11b/CD18(CR3) и т.д. в качестве антигена, ассоциированного с иммунной эффекторной клеткой, но не ограничивается ими.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для предотвращения и/или лечения заболевания, связанного с MUC1, включающей антитело к MUC1 или его антигенсвязывающий фрагмент и конъюгат антитело-лекарственное средство, биспецифичное антитело или иммунную клетку, содержащую химерный антигенный рецептор (CAR), содержащий антитело к MUC1 или его антигенсвязывающий фрагмент.

Заболевания, связанные с MUC1, могут представлять собой заболевания, связанные с экспрессией или сверхэкспрессией MUC1, экспрессией MUC1 на всех поверхностях клеток и/или снижением гликозилирования белка MUC1 по сравнению с нормальными клетками, например, рак. Нормальные клетки могут представлять собой неопухолевые клетки. Соответственно, ассоциированное с MUC1 заболевание предпочтительно представляет собой рак или опухоль, но не ограничивается ими.

Термин «рак» или «опухоль» относится к или означает физиологическое состояние у млекопитающих, обычно характеризующееся неконтролируемым ростом/пролиферацией клеток.

Виды рака или опухоли, которые можно лечить композицией согласно настоящему изобретению, конкретно не ограничены и включают как солидные опухоли, так и гематологические опухоли. Примеры таких заболеваний раком могут быть выбраны из группы, состоящей из рака кожи, такого как меланома, рака печени, гепатоцеллюлярной карциномы, гепатоцеллюлярной карциномы, рака желудка, рака молочной железы, рака легкого, рака яичника, рака бронха, рака носоглотки, рака гортани, рака поджелудочной железы, рака мочевого пузыря, колоректального рака, рака толстой кишки, рака поджелудочной железы, рака шейки матки, рака головного мозга, рака предстательной железы, рака кости, рака кожи, рака щитовидной железы, рака паращитовидной железы, рака почки, рака пищевода, рака желчных путей, рака яичка, рака прямой кишки, рака головы и шеи, рака шейного отдела позвоночника, рака мочеточника, остеосаркомы, нейробластомы, фибросаркомы, рабдомиосаркомы, астроцитомы, нейробластомы, глиомы, острого миелоидного лейкоза (ОМЛ), острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ), Т-клеточного лейкоза взрослых, хронического лимфоцитарного лейкоза (ХЛЛ), волосатоклеточного лейкоза, миелодиспластического синдрома (миелодисплазии), миелопролиферативного заболевания, хронического миелоидного лейкоза (ХМЛ), миелодиспластического синдрома (МДС), лейкоза, вызванного Т-клеточным лимфотропным вирусом человека типа 1 (HTLV-1, Human T-cell lymphotropic virus type 1), мастоцитоза, острого лимфобластного лейкоза, лимфомы, неходжкинской лимфомы, лимфомы Ходжкина, множественной миеломы или солитарной миеломы, но не ограничиваются перечисленным.

Более конкретно, рак характеризуется экспрессией белка MUC1 и может включать рак молочной железы, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак легких, рак щитовидной железы, рак желудка, рак яичников, рак толстой кишки, рак печени, рак желчного пузыря, рак почки, рак шейки матки или рак мочевого пузыря, но не ограничивается ими. Рак может представлять собой первичный рак или метастатический рак.

Заболевания, связанные с MUC1, могут представлять собой неалкогольный стеатогепатит (НАСГ) или TGF-β-опосредованные иммунные заболевания, но не ограничиваются ими. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения в фармацевтической композиции, способе и применении для предупреждения и/или лечения рака антитело к MUC1 или его антигенсвязывающий фрагмент могут быть предоставлены в виде отдельного активного ингредиента, введенного в комбинации с цитотоксическим веществом, таким как противораковое средство, или предоставлено в форме конъюгата антитело-лекарственное средство (ADC) с цитотоксическим веществом, таким как противораковое средство.

Кроме того, антитело к MUC1 или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению и фармацевтическая композиция, содержащая антитело к MUC1 или его антигенсвязывающий фрагмент, могут быть использованы в комбинации с обычными терапевтическими средствами. Таким образом, антитело к MUC1 или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению и фармацевтическая композиция, содержащая антитело к MUC1 или его антигенсвязывающий фрагмент, могут быть введены одновременно или последовательно с обычными терапевтическими средствами, такими как противораковые средства.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу предупреждения и/или лечения заболевания, связанного с MUC1, включающему введение терапевтически эффективного количества антитела к MUC1 или его антигенсвязывающего фрагмента, или конъюгата антитело-лекарственное средство пациенту, нуждающемуся в предупреждении и/или лечении заболевания, асоциированного с MUC1. Способ предупреждения и/или лечения может дополнительно включать идентификацию пациента, нуждающегося в предупреждении и/или лечении заболевания, до этапа введения.

Применение конъюгата антитела для локальной (местной) доставки лекарственного средства в композиции позволяет доставлять лекарственное средство в клетки, экспрессирующие антиген, на который нацелено антитело к MUC1.

Фармацевтическая композиция может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтически приемлемый носитель обычно используется для приготовления лекарственного средства и может представлять собой по меньшей мере один носитель, выбранный из группы, состоящей из лактозы, декстрозы, сахарозы, сорбита, маннита, крахмала, аравийской камеди, фосфата кальция, альгината, желатина, силиката кальция, микрокристаллической целлюлозы, поливинилпирролидона, целлюлозы, воды, сиропа, метилцеллюлозы, метилгидроксибензоата, пропилгидроксибензоата, талька, стеарата магния, минерального масла и тому подобного, но не ограничиваясь перечисленным. Фармацевтическая композиция может дополнительно содержать по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из разбавителя, вспомогательного вещества, смазывающего вещества, смачивающего агента, подсластителя, ароматизатора, эмульгатора, суспендирующего агента, консерванта и т.д., которое обычно используется при получении фармацевтической композиции.

Фармацевтическую композицию можно вводить перорально или парентерально. В случае парентерального введения фармацевтическую композицию можно вводить путем внутривенной инъекции, подкожной инъекции, внутримышечной инъекции, внутрибрюшинной инъекции, эндотелиального введения, интраназального введения, внутрилегочного введения, внутриректального введения, местного введения в месте поражения или тому подобного.

При пероральном введении, поскольку белок или пептид расщепляется, пероральная композиция может быть составлена таким образом, чтобы покрывать активный агент или быть защищенной от разложения в желудке. Кроме того, композицию можно вводить с помощью любого устройства, позволяющего доставить активное вещество в клетку-мишень.

Содержание или доза антитела к MUC1 или его антигенсвязывающего фрагмента в фармацевтической композиции могут меняться в зависимости от таких факторов как способ приготовления, тип введения, возраст, масса и пол пациента, патологическое состояние, питание, время введения, интервал между введениями, путь введения, скорость выведения, чувствительность пациента и восприимчивость его к ответу. Например, суточная доза антитела к MUC1 или его антигенсвязывающего фрагмента может находиться в диапазоне от 0,001 до 1000 мг/кг, в частности от 0,01 до 100 мг/кг, более конкретно от 0,1 до 50 мг/кг и еще более конкретно от 0,1 до 20 мг/кг, но не ограничиваться этим. Суточная доза может быть приготовлена в виде отдельного препарата в форме разовой дозы, в виде требуемых порций или может быть приготовлена путем помещения ее в контейнер для нескольких доз.

Фармацевтическая композиция может быть приготовлена в форме растворов, суспензий, сиропов или эмульсий в масляной или водной средах, или в форме экстрактов, порошков, порошков, гранул, таблеток или капсул и может дополнительно содержать в составе диспергирующее или стабилизирующее вещества для приготовления.

Пациентом, которому вводят фармацевтическую композицию, могут быть млекопитающие, включая приматов, включая человека и обезьян, и грызунов, включая мышей и крыс.

В настоящей заявке лечение рака может означать любую противораковую активность, которая предотвращает, облегчает или ослабляет ухудшение симптомов рака, например, ингибирует пролиферацию раковых клеток, убивает раковые клетки, или ингибирует метастазирование, или частично или полностью уничтожает рак,

Антитело к MUC1 или его антигенсвязывающий фрагмент специфично связываются с белком MUC1, особенно с С-концевым внеклеточным доменом MUC1, для обнаружения или идентификации белка MUC1 или С-концевого внеклеточного домена MUC1. Соответственно, в еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу обнаружения MUC1, включающему обработку антителом к MUC1 или его антигенсвязывающий фрагментом композиции и биологического образца для обнаружения белка MUC1, например, С-концевого внеклеточного домена MUC1, включающий антитело к MUC1 или его антигенсвязывающий фрагмент.

Способ обнаружения может дополнительно включать в себя, после этапа обработки, этап определения наличия реакции антиген-антитело. В способе обнаружения, при обнаружении реакции антиген-антитело, может быть определено (установлено), что белок MUC1, например, С-концевой внеклеточный домен MUC1, присутствует в биологическом образце. Соответственно, способ может дополнительно включать этап определения того, что характеризуется белок MUC1 присутствует в биологическом образце, при обнаружении реакции антиген-антитело после этапа идентификации. Биологический образец может быть выбран из группы, состоящей из (выделенных) клеток, тканей, жидкостей организма, их культур и т.д., полученных от млекопитающего, такого как человек (например, больной раком).

Экспрессия белка MUC1, такого как С-концевая область белка MUC1 (или домен SEA, или С-концевой внеклеточный домен белка MUC1), ассоциирована с несколькими заболеваниями, такими как рак. Таким образом, в другом аспекте настоящее изобретение относится к композиции для обнаружения или диагностики заболевания, связанного с белком MUC1, такого как рак, или к способу обнаружения или диагностики рака, или к способу обеспечения информации для обнаружения или диагностики, включающему обработку (введение) антителом к MUC1 или его антигенсвязывающим фрагментом биологического образца, выделенного от субъекта.

Способ обнаружения или диагностики может дополнительно включать этап подтверждения наличия реакции антиген-антитело после этапа обработки. В способе при обнаружении реакции антиген-антитело может быть определено, что в биологическом образце или у пациента, от которого получен биологический образец, обнаружено заболевание, ассоциированное с MUC1, такое как рак. Соответственно, способ может дополнительно включать этап определения пациента или биологического образца, полученного от него, в качестве пациента с заболеванием, связанным с MUC1, такого как больной раком, при обнаружении реакции антиген-антитело, после этапа идентификации. Биологический образец может быть выбран из группы, состоящей из (выделенных) клеток, тканей, жидкостей организма, их культур и т.д., полученных от млекопитающего, такого как человек (например, больной раком).

Идентификация реакции антиген-антитело может быть выполнена различными способами, известными в данной области техники. Например, реакция антиген-антитело может быть измерена с помощью обычных ферментативных реакций, флуоресценции, люминесценции и/или измерения радиоактивного излучения и, в частности, может быть измерена с помощью способа, выбранного из группы, состоящей из иммунохроматографии, иммуногистохимии, твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), радиоиммуноанализа (РИА), иммуноферментного анализа (ИФА), флуоресцентного иммуноанализа (ФИА), люминесцентного иммуноанализа (ЛИА), вестерн-блоттинга, иммуноанализа на микрочипах, иммунопреципитационного анализа и т.д., но не ограничиваясь ими.

В этом случае антитело к MUC1 или его антигенсвязывающий фрагмент могут дополнительно содержать маркирующее вещество (метку). Маркирующее вещество может представлять собой одно или более одного вещества, выбранного из группы, состоящей из радиоизотопов, флуоресцентных веществ, хромогенов, красящих веществ и т.д.

Маркирующее вещество может быть связано с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом обычным способом (например, химическими связями, такими как ковалентные связи, координационные (донорно-акцепторные) связи или ионные связи). Связывание антитела (или антигенсвязывающего фрагмента) и маркирующего вещества может быть выполнено в соответствии с методиками, хорошо известными в данной области техники, к которой относится настоящее изобретение.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей антитело к MUC1 согласно настоящему изобретению. Нуклеиновая кислота, используемая в настоящем изобретении, может существовать в клетке и лизате клеток или также существовать в частично очищенной или по существу чистой форме. Нуклеиновую кислоту «выделяют» или «по существу очищают» при очистке или высвобождении от других клеточных компонентов или других загрязняющих веществ, например, нуклеиновых кислот или белков других клеток, с помощью стандартных методов, включая обработку щелочью/SDS (sodium dodecyl sulphate, додецилсульфат натрия, ДСН), разделение в CsCl (разделение в градиенте хлорида цезия), колоночную хроматографию, электрофорез в агарозном геле и другие, хорошо известные в данной области техники. Нуклеиновая кислота согласно настоящему изобретению может представлять собой, например, ДНК или РНК и может содержать или не содержать последовательность интрона.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к рекомбинантному вектору экспрессии, содержащему нуклеиновую кислоту. Для экспрессии антитела к MUC1 или его антигенсвязывающего фрагмента согласно настоящему изобретению ДНК, кодирующая частичные или полноразмерные легкие и тяжелые цепи, может быть получена с помощью стандартных методов молекулярной биологии (например, ПЦР-амплификация или клонирование кДНК с использованием гибридом, экспрессирующих целевое антитело), и ДНК может быть «функционально связана» с регуляторными последовательностями, обеспечивающими транскрипцию и трансляцию, и вставлена в вектор экспрессии.

В настоящей заявке термин «функционально связанный» может означать, что ген, кодирующий антитело, лигирован в вектор таким образом, что последовательности в векторе, регулирующие транскрипцию и трансляцию, выполняют предназначенную им функцию регуляции транскрипции и трансляции гена антитела.

Вектор экспрессии и последовательности регуляции экспрессии выбраны таким образом, чтобы они были совместимы с клеткой-хозяином, которая будет использоваться для экспрессии. Ген легкой цепи антитела и ген тяжелой цепи антитела встраивают в отдельные векторы, или оба гена встраивают в один и тот же вектор экспрессии.

Антитело встраивают в вектор экспрессии стандартным методом (например, лигированием фрагмента гена антитела и комплементарного сайта фермента рестрикции в вектор или лигированием тупым концом, если сайт фермента рестрикции отсутствует). В некоторых случаях рекомбинантный вектор экспрессии может кодировать сигнальный пептид, который способствует секреции цепей антител из клетки-хозяина. Ген цепи антитела может быть клонирован в вектор таким образом, что сигнальный пептид соединен с аминоконцом гена цепи антитела в рамке считывания. Сигнальный пептид может представлять собой сигнальный пептид иммуноглобулина или гетерологичный сигнальный пептид (то есть сигнальный пептид, полученный из белка, отличного от иммуноглобулина). Кроме того, рекомбинантный вектор экспрессии имеет регуляторную последовательность, которая контролирует экспрессию гена цепи антитела в клетке-хозяине. «Регуляторная последовательность» может включать промотор, энхансер и другие регуляторные элементы экспрессии (например, сигнал полиаденилирования), которые регулируют транскрипцию или трансляцию гена цепи антитела. Специалисты в данной области техники могут понять, что конструкция вектора экспрессии может варьировать путем выбора различных регуляторных последовательностей в зависимости от таких факторов, как выбор клетки-хозяина, подлежащей трансформации, уровень экспрессии белка и т.д.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей нуклеиновую кислоту или вектор. Клетка-хозяин согласно настоящему изобретению предпочтительно выбрана из группы, состоящей из клеток животных, растительных клеток, дрожжей, прокариотических клеток и клеток насекомых, но не ограничена ими.

В частности, клетка-хозяин согласно настоящему изобретению может представлять собой прокариотическую клетку, такую как Escherichia coli, Bacillus subtilis, Streptomyces sp., Pseudomonas sp., Proteus mirabilis или Staphylococcus sp.Кроме того, клетка-хозяин может представлять собой эукариотическую клетку, такую как клетка грибов, таких как Aspergillus sp., дрожжей, таких как Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces sp., и Neurospora crassa, клетки других низших эукариот и клетки высших эукариот, такие как клетки насекомых.

Кроме того, клетка-хозяин может происходить из растений или млекопитающих. Предпочтительно, но не исключительно, в качестве клетки-хозяина можно использовать клетки почки обезьяны (COS7), клетки NSO, SP 2/0, клетки яичника китайского хомячка (СНО), W138, клетки почки новорожденного хомячка (BHK), MDCK, линию клеток миеломы, клетки HuT 78, клетки HEK293 и т.д., но не ограничиваясь этим. Особенно предпочтительно можно использовать клетки СНО.

Нуклеиновую кислоту или вектор трансфицируют, или переносят, в клетку-хозяин. Для «трансфекции» может быть использован ряд различных методов, обычно применяемых для введения экзогенной нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) в прокариотическую или эукариотическую клетку-хозяин, например, электрофорез, осаждение фосфатом кальция, трансфекция ДЭАЭ-декстраном или липофекция. Для экспрессии антитела к глипикану 3 согласно настоящему изобретению могут быть использованы различные комбинации хозяин/вектор экспрессии. Векторы экспрессии, подходящие для хозяев-эукариот, включают, но не ограничиваются ими, последовательности регуляции экспрессии, полученные из вируса SV40, вируса папилломы крупного рогатого скота, аденовируса, аденоассоциированного вируса, цитомегаловируса и ретровируса. Векторы экспрессии, которые могут быть использованы в бактериальных хозяевах, включают бактериальные плазмиды, полученные из Escherichia coli, такие как рЕТ, pRSET, pBluescript, pGEX2T, векторы pUC, pColE1, pCR1, pBR322, pMB9 и их производные; плазмиды с более широким диапазоном хозяев, такие как RP4; фаговую ДНК, которая может быть проиллюстрирована широким рядом производных фага лямбда, такими как λgt10, λgt11 и NM989, и другими ДНК-фагами, такими как М13, и нитевидные фаги, содержащие одноцепочечную ДНК. Векторы экспрессии, применимые для дрожжевых клеток, включают 2μ-плазмиды и их производные. Вектор, пригодный для клеток насекомых, представляет собой pVL 941.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу получения антитела к MUC1 или его антигенсвязывающего фрагмента в соответствии с настоящим изобретением, включающему экспрессию антитела к MUC1 или его антигенсвязывающего фрагмента в соответствии с настоящим изобретением путем культивирования клетки-хозяина.

Когда рекомбинантный вектор экспрессии, способный экспрессировать антитело к MUC1 или его антигенсвязывающий фрагмент, вводят в клетку-хозяин млекопитающего, антитело может быть получено путем культивирования клетки-хозяина в течение периода времени, достаточного для экспрессии антитела в клетке-хозяину, или, более предпочтительно, в течение периода времени, достаточного для секреции антитела в культуральную среду, в которой культивируют клетку-хозяин.

В некоторых случаях экспрессированное антитело может быть выделено из клетки-хозяина и очищено до однородного состояния. Выделение или очистка антитела могут быть выполнены обычным способом выделения и очистки, используемым для белка, например, хроматографией. Хроматография может включать, например, аффинную хроматографию, включая колонку с белком А и колонку с белком G, ионообменную хроматографию или гидрофобную хроматографию. В дополнение к хроматографии антитело может быть выделено и очищено путем дополнительного сочетания фильтрации, ультрафильтрации, высаливания, диализа и т.д.

ПОЛЕЗНЫЕ ЭФФЕКТЫ

Согласно настоящему изобретению, поскольку антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфично связывающиеся с MUC1, проявляют превосходную аффинность и силу связывания с MUC1, конъюгат антитело-лекарственное средство, биспецифичное антитело или химерный антигенный рецептор (CAR), содержащие антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфично связываются с экспрессирующей белок MUC1 клеткой, тем самым эффективно и специфично, или селективно, доставляя лекарственное средство. Кроме того, поскольку посттрансляционная модификация, в которой аминокислотные остатки гликозилируются, не происходит благодаря замене некоторых аминокислотных остатков, включенных в последовательность CDR антитела, сложность протеома снижается, что позволяет получать антитела или их антигенсвязывающие фрагменты высокой чистоты. Следовательно, антитело к MUC1 и конъюгат антитело-лекарственное средство согласно настоящему изобретению могут применяться для лечения заболеваний, связанных с MUC1, таких как рак.

Описание Фигур

На Фиг. 1 показаны результаты подтверждения пиков гликозилирования исходной формы антитела PAb001, в которой отсутствует точечная мутация.

На Фиг. 2 показаны результаты подтверждения пиков гликозилирования при точечном мутагенезе, в котором лизин K30 замещен аргинином в легкой цепи антитела PAb001.

На Фиг. 3 показаны результаты подтверждения пиков гликозилирования при точечном мутагенезе, в котором лизин K24 и K30 замещен аргинином в легкой цепи антитела PAb001.

На Фиг. 4 показаны результаты подтверждения пиков гликозилирования при точечном мутагенезе, в котором лизин K30 замещен аргинином в легкой цепи антитела PAb001, а лизин K24 замещен глицином в легкой цепи антитела PAb001.

На Фиг. 5 показаны результаты подтверждения антигенсвязывающей активности антитела PAb001 с точечными мутациями. [Наилучший вариант осуществления изобретения]

Здесь и далее настоящее раскрытие будет подробно описано со ссылкой на Примеры для конкретной иллюстрации. Однако Примеры согласно настоящему раскрытию могут быть модифицированы в различные другие формы, и не следует понимать, что объем настоящего описания ограничен Примерами, подробно описанными ниже. Примеры осуществления, описанные здесь, приведены для более полного объяснения настоящего раскрытия специалистам в данной области.

Пример 1. ВАС-анализ вариантов антител к MUC1

Чтобы идентифицировать аминокислотные остатки, которые вызывали гликозилирование, влияющее на чистоту антитела, с использованием антитела к MUC1 (PAb001), полученного в корейском патенте №10-2127421, был проведен ВАС-анализ (boronate affinity chromatography, боронатная аффинная хроматография) исходной формы и вариантов антитела PAb001. Аминокислотные остатки K24 и K30 в CDR легкой цепи антитела PAb001 заменяли аргинином (R) или глицином (G) и подтверждали замену путем проведения экспериментов трижды для каждого образца.

В результате, как показано на Фиг. 1, в исходной форме (KK) PAb001 наблюдали пики как негликозилированной формы, так и гликозилированной формы. Однако, как показано на Фиг. 2-4, при замещении остатка K30 аргинином (R) или глицином (G) пик гликозилирования не наблюдали. Это свидетельствует о том, что гликозилирование антитела PAb001 изменяется в результате замены аминокислоты K30.

Пример 2. Анализ антигенсвязьтвающей активности вариантов антител к MUC1

В результате подтверждения антигенсвязывающей активности исходной формы и вариантов антитела PAb001, как показано на Фиг. 5, тенденции были сходными и не имели существенных различий. Это показывает, что точечная мутация K30 не влияла на антигенсвязывающую активность антитела.

В результате можно видеть, что, когда точечная мутация вызвана заменой остатка K30 легкой цепи антитела PAb001 на R или G, гликозилирование антитела снижается, не вызывая функциональных различий в PAb001, что позволяет получить антитело высокой чистоты.

Выше настоящее изобретение было описано со ссылкой на его предпочтительные примеры. Специалистам в данной области техники будет понятно, что настоящее изобретение может быть реализовано в виде модифицированных форм без отклонения от существенной характеристики настоящего изобретения. Следовательно, вышеуказанные примеры реализации следует рассматривать с иллюстративной точки зрения, а не с ограничительной. Объем настоящего изобретения определяется прилагаемой формулой изобретения, а не приведенным выше описанием, и все различия в объеме ее эквивалентов следует рассматривать как включенные в настоящее изобретение. [Вариант осуществления изобретения]

В качестве аспекта настоящего изобретения настоящее изобретение относится к антителу к MUC1 или его антигенсвязывающему фрагменту, которые специфично связываются с полипептидом, содержащим непрерывную последовательность аминокислот в С-концевом внеклеточном домене MUC1, и включают одну или более вариабельных областей тяжелой цепи, включая CDR1 тяжелой цепи, CDR2 тяжелой цепи или CDR3 тяжелой цепи; и вариабельную область легкой цепи, включая CDR1 легкой цепи, CDR2 легкой цепи или CDR3 легкой цепи, где остаток лизина (K), включенный в последовательность CDR легкой цепи, заменен другой аминокислотой.

Согласно одному аспекту остаток лизина (K), включенный в последовательность CDR легкой цепи согласно настоящему изобретению, представляет собой аминокислотные остатки K24 или K30 последовательности CDR легкой цепи.

В другом аспекте остаток лизина (K), включенный в последовательность CDR легкой цепи согласно настоящему изобретению, замещен аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из аргинина (R), гистидина (Н), аспарагиновой кислоты (D) или глутаминовой кислоты (G), глицина (G), аланина (А), валина (V), метионина (М), фенилаланина (F), тирозина (Y), триптофана (W), лейцина (L) и изолейцина (I).

В еще одном аспекте вариабельная область тяжелой цепи по настоящему изобретению содержит последовательность CDR1 тяжелой цепи, приведенную в SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи, приведенную в SEQ ID NO: 2, или CDR3 тяжелой цепи, приведенную в SEQ ID NO: 3, и вариабельная область легкой цепи содержит последовательность CDR1 легкой цепи, приведенную в SEQ ID NO: 4, CDR2 легкой цепи, приведенную в SEQ ID NO: 5, или CDR3 легкой цепи, приведенную в SEQ ID NO: 6.

В качестве еще одного аспекта настоящего изобретения настоящее изобретение относится к конъюгату антитело-лекарственное средство, включающему антитело к MUC1 или его антигенсвязывающий фрагмент.

В качестве еще одного аспекта настоящего изобретения настоящее изобретение относится к биспецифичному антителу, включающему антитело к MUC1 или его антигенсвязывающий фрагмент.

В качестве еще одного аспекта настоящего изобретения настоящее изобретение относится к химерному антигенному рецептору (CAR), включающему антитело к MUC1 или его антигенсвязывающий фрагмент.

В качестве еще одного аспекта настоящего изобретения настоящее изобретение относится к иммунной клетке, включающей химерный антигенный рецептор, включающий антитело к MUC1 или его антигенсвязывающий фрагмент.

В одном аспекте настоящего изобретения иммунная клетка выбрана из CAR-T, CAR-NK и CAR-MA.

В качестве еще одного аспекта настоящего изобретения настоящее изобретение относится к композиции для предотвращения или лечения рака, включающей одно или более из перечисленного: конъюгат антитело-лекарственное средство, биспецифичное антитело, химерный антигенный рецептор, содержащий антитело к MUC1 или его антигенсвязывающий фрагмент, и иммунная клетка, содержащая химерный антигенный рецептор.

В аспекте настоящего изобретения рак выбран из группы, состоящей из рака кожи, такого как меланома, рака печени, гепатоцеллюлярной карциномы, гепатоцеллюлярной карциномы, рака желудка, рака молочной железы, рака легкого, рака яичника, рака бронха, рака носоглотки, рака гортани, рака поджелудочной железы, рака мочевого пузыря, колоректального рака, рака толстой кишки, рака поджелудочной железы, рака шейки матки, рака головного мозга, рака предстательной железы, рака кости, рака кожи, рака щитовидной железы, рака паращитовидной железы, рака почки, рака пищевода, рака желчных путей, рака яичка, рака прямой кишки, рака головы и шеи, рака шейного отдела позвоночника, рака мочеточника, остеосаркомы, нейробластомы, фибросаркомы, рабдомиосаркомы, астроцитомы, нейробластомы, глиомы, острого миелоидного лейкоза (ОМЛ), острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ), Т-клеточного лейкоза взрослых, хронического лимфоцитарного лейкоза (ХЛЛ), волосатоклеточного лейкоза, миелодиспластического синдрома, миелопролиферативного заболевания, хронического миелоидного лейкоза (ХМЛ), миелодиспластического синдрома (МДС), лейкоза, вызванного Т-клеточным лимфотропным вирусом человека типа 1 (HTLV-1, Human T-cell lymphotropic virus type 1), мастоцитоза, острого лимфобластного лейкоза, лимфомы, неходжкинской лимфомы, лимфомы Ходжкина, множественной миеломы или солитарной миеломы.

В качестве еще одного аспекта настоящего изобретения настоящее изобретение относится к композиции для диагностики рака, включающей антитело к MUC1 или его антигенсвязывающий фрагмент.

В качестве еще одного аспекта настоящего изобретения настоящее изобретение относится к способу получения антитела к MUC1 или его антигенсвязывающего фрагмента, включающему экспрессию вектора экспрессии, включающего нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело к MUC1 или его антигенсвязывающий фрагмент, в клетке-хозяину.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3"

fileName="BPX230050PCT-SEQUENCE.xml" softwareName="WIPO Sequence"

softwareVersion="2.3.0" productionDate="2024-02-19">

</ApplicationIdentification>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ko">Пептрон</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Peptron Inc</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="en">Новое антитело против MUC1 и его

применение</InventionTitle>

<InventionTitle languageCode="ko">Новое антитело против MUC1 и его

применение</InventionTitle>

<INSDSeq_length>10</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>РЕГИОН</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..10</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>примечание:</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>CDR1 тяжёлой цепи антитела к белку

MUC1</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..10</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>синтетическая

конструкция</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>GYTFTSYWMH</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>РЕГИОН</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>примечание:</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>CDR2 тяжёлой цепи антитела к белку

MUC1</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>синтетическая

конструкция</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>YINPGTGYIEYNQKFKD</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>7</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>РЕГИОН</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..7</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>примечание:</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>CDR3 тяжёлой цепи антитела к белку

MUC1</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..7</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>синтетическая

конструкция</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>STAPFDY</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>11</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>РЕГИОН</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..11</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>примечание:</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>CDR1 лёгкой цепи антитела к белку

MUC1</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>SITE (функциональный ключ SITE - любой другой

интересующий сайт (участок) в последовательности)</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>примечание:</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>прочий_признак (MISC_FEATURE) - X -

замещаемый остаток.</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_location>7</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>примечание:</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>прочий_признак (MISC_FEATURE) - X -

замещаемый остаток.</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..11</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>синтетическая

конструкция</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>XASQDIXSYLS</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>7</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>РЕГИОН</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..7</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>примечание:</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>CDR2 лёгкой цепи антитела к белку

MUC1</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..7</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>синтетическая

конструкция</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>YATRLAD</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>9</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>РЕГИОН</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..9</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>примечание:</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>CDR3 лёгкой цепи антитела к белку

MUC1</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..9</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>синтетическая

конструкция</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>LQYDESPYT</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Claims

1. Антитело к MUC1 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфично связываются с полипептидом, содержащим непрерывную аминокислотную последовательность в пределах С-концевого внеклеточного домена MUC1, причём указанное антитело к MUC1 содержит CDR1 тяжёлой цепи согласно SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжёлой цепи согласно SEQ ID NO: 2 или CDR3 тяжёлой цепи согласно SEQ ID NO: 3, и указанная вариабельная область лёгкой цепи содержит CDR1 лёгкой цепи согласно SEQ ID NO: 4, CDR2 лёгкой цепи согласно SEQ ID NO: 5 или CDR3 лёгкой цепи, согласно SEQ ID NO: 6.

2. Антитело к MUC1 или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, отличающиеся тем, что указанный остаток Х, содержащийся в последовательности CDR1 лёгкой цепи, представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из аргинина (R), гистидина (H), аспарагиновой кислоты (D) или глутаминовой кислоты (Е), глицина (G), аланина (A), валина (V), метионина (M), фенилаланина (F), тирозина (Y), триптофана (W), лейцина (L) и изолейцина (I).

3. Конъюгат антитела с лекарственным средством для предотвращения или лечения рака, содержащий антитело к MUC1 или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1 и лекарственное средство, причём указанное лекарственное средство конъюгировано с антителом к MUC1 или его антигенсвязывающим фрагментом.

4. Химерный антигенный рецептор (CAR) для предотвращения или лечения рака, содержащий антитело к MUC1 или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1.

5. Иммунная клетка для предотвращения или лечения рака, содержащая химерный антигенный рецептор по п. 4, где указанная иммунная клетка выбрана из CAR-T, CAR-NK и CAR-MA.

6. Композиция для предотвращения или лечения рака, содержащая один или более из: антитела к MUC1 или его антигенсвязывающего фрагмента по п. 1, конъюгата антитела с лекарственным средством по п. 3, химерного антигенного рецептора по п. 4 и иммунной клетки по п. 5, и фармацевтически приемлемый носитель.

7. Композиция для предупреждения или лечения рака по п. 6, отличающаяся тем, что указанный рак выбран из группы, состоящей из рака кожи, такого как меланома, рака печени, гепатоцеллюлярной карциномы, гепатоцеллюлярной карциномы, рака желудка, рака молочной железы, рака лёгкого, рака яичника, рака бронха, рака носоглотки, рака гортани, рака поджелудочной железы, рака мочевого пузыря, колоректального рака, рака толстой кишки, рака поджелудочной железы, рака шейки матки, рака головного мозга, рака предстательной железы, рака кости, рака кожи, рака щитовидной железы, рака паращитовидной железы, рака почки, рака пищевода, рака жёлчных путей, рака яичка, рака прямой кишки, рака головы и шеи, рака шейного отдела позвоночника, рака мочеточника, остеосаркомы, нейробластомы, фибросаркомы, рабдомиосаркомы, астроцитомы, нейробластомы, глиомы, острого миелоидного лейкоза (ОМЛ), острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ), Т-клеточного лейкоза взрослых, хронического лимфоцитарного лейкоза (ХЛЛ), волосатоклеточного лейкоза, миелодисплазии, миелопролиферативного заболевания, хронического миелоидного лейкоза (ХМЛ), миелодиспластического синдрома (МДС), лейкоза, вызванного Т-клеточным лимфотропным вирусом человека типа 1 (HTLV-1, Human T-cell lymphotropic virus type 1), мастоцитоза, острого лимфобластного лейкоза, лимфомы, неходжкинской лимфомы, лимфомы Ходжкина, множественной миеломы или солитарной миеломы.

8. Композиция для диагностики рака, содержащая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1 и метку.

9. Способ получения антитела к MUC1 или его антигенсвязывающего фрагмента, включающий экспрессию вектора экспрессии, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело к MUC1 или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, в клетке-хозяине.