RU2790039C2 - Method for preservation of biopharmaceuticals - Google Patents
Method for preservation of biopharmaceuticals Download PDFInfo
- Publication number
- RU2790039C2 RU2790039C2 RU2020103377A RU2020103377A RU2790039C2 RU 2790039 C2 RU2790039 C2 RU 2790039C2 RU 2020103377 A RU2020103377 A RU 2020103377A RU 2020103377 A RU2020103377 A RU 2020103377A RU 2790039 C2 RU2790039 C2 RU 2790039C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- preserved
- composition
- temperature
- shelf
- container
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 54
- 238000004321 preservation Methods 0.000 title abstract description 21
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 title description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 97
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims abstract description 67
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims abstract description 50
- 239000006260 foam Substances 0.000 claims abstract description 33
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 21
- 239000013078 crystal Substances 0.000 claims abstract description 14
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000012071 phase Substances 0.000 claims abstract description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 7
- 230000009477 glass transition Effects 0.000 claims abstract description 7
- 238000009835 boiling Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 230000007704 transition Effects 0.000 claims abstract description 3
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 claims abstract 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 24
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 24
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 24
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 claims description 22
- 239000003761 preservation solution Substances 0.000 claims description 18
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 claims description 17
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 claims description 17
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 claims description 17
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 claims description 14
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 11
- HOVAGTYPODGVJG-UVSYOFPXSA-N (3s,5r)-2-(hydroxymethyl)-6-methoxyoxane-3,4,5-triol Chemical compound COC1OC(CO)[C@@H](O)C(O)[C@H]1O HOVAGTYPODGVJG-UVSYOFPXSA-N 0.000 claims description 10
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 claims description 9
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims description 9
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 claims description 9
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims description 9
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 8
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims description 8
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 claims description 8
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 7
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 7
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 7
- HOVAGTYPODGVJG-UHFFFAOYSA-N methyl beta-galactoside Natural products COC1OC(CO)C(O)C(O)C1O HOVAGTYPODGVJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 claims description 7
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 claims description 7
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 claims description 7
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 7
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 claims description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 6
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 5
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 5
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 4
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 claims description 4
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 claims description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 4
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 claims description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 4
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 4
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 claims description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 claims description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 4
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 claims description 4
- 238000000227 grinding Methods 0.000 claims description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 4
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 claims description 4
- 239000004033 plastic Substances 0.000 claims description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 claims description 4
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 claims description 4
- SERLAGPUMNYUCK-DCUALPFSSA-N 1-O-alpha-D-glucopyranosyl-D-mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SERLAGPUMNYUCK-DCUALPFSSA-N 0.000 claims description 3
- 239000000905 isomalt Substances 0.000 claims description 3
- 235000010439 isomalt Nutrition 0.000 claims description 3
- HPIGCVXMBGOWTF-UHFFFAOYSA-N isomaltol Natural products CC(=O)C=1OC=CC=1O HPIGCVXMBGOWTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- VRYALKFFQXWPIH-PBXRRBTRSA-N (3r,4s,5r)-3,4,5,6-tetrahydroxyhexanal Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CC=O VRYALKFFQXWPIH-PBXRRBTRSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004386 Erythritol Substances 0.000 claims description 2
- UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N Erythritol Natural products OCC(O)C(O)CO UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229920001612 Hydroxyethyl starch Polymers 0.000 claims description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 claims description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 claims description 2
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N Xylitol Natural products OCCC(O)C(O)C(O)CCO TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 claims description 2
- PMMURAAUARKVCB-UHFFFAOYSA-N alpha-D-ara-dHexp Natural products OCC1OC(O)CC(O)C1O PMMURAAUARKVCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 claims description 2
- 235000019414 erythritol Nutrition 0.000 claims description 2
- UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N erythritol Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)CO UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N 0.000 claims description 2
- 229940009714 erythritol Drugs 0.000 claims description 2
- 229940050526 hydroxyethylstarch Drugs 0.000 claims description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 2
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 claims description 2
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 claims description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 2
- 235000013772 propylene glycol Nutrition 0.000 claims description 2
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 2
- 239000000811 xylitol Substances 0.000 claims description 2
- 235000010447 xylitol Nutrition 0.000 claims description 2
- HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N xylitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N 0.000 claims description 2
- 229960002675 xylitol Drugs 0.000 claims description 2
- 239000002002 slurry Substances 0.000 claims 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 18
- 238000007710 freezing Methods 0.000 abstract description 6
- 230000008014 freezing Effects 0.000 abstract description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 20
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 19
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 17
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 16
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 15
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 14
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 9
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 9
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 8
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 8
- 238000000498 ball milling Methods 0.000 description 7
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 7
- 238000004031 devitrification Methods 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 6
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 6
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 6
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 6
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 5
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 5
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 5
- 238000003801 milling Methods 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 5
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 4
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 4
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 4
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 4
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 4
- 238000011194 good manufacturing practice Methods 0.000 description 4
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000001938 differential scanning calorimetry curve Methods 0.000 description 3
- 101150020161 flu-2 gene Proteins 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 3
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 3
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 3
- 239000010802 sludge Substances 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 2
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 238000010382 chemical cross-linking Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 2
- 229960003971 influenza vaccine Drugs 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 2
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 2
- 238000000859 sublimation Methods 0.000 description 2
- 230000008022 sublimation Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000037317 transdermal delivery Effects 0.000 description 2
- FKHIQXACMFXULG-UHFFFAOYSA-N 2-amino-5-nitro-4-(trifluoromethyl)phenol Chemical compound NC1=CC(C(F)(F)F)=C([N+]([O-])=O)C=C1O FKHIQXACMFXULG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- WSVLPVUVIUVCRA-KPKNDVKVSA-N Alpha-lactose monohydrate Chemical compound O.O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O WSVLPVUVIUVCRA-KPKNDVKVSA-N 0.000 description 1
- 101100298998 Caenorhabditis elegans pbs-3 gene Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 208000000389 T-cell leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000028530 T-cell lymphoblastic leukemia/lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 238000011053 TCID50 method Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 238000009529 body temperature measurement Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 230000000254 damaging effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 229960001226 live attenuated influenza Drugs 0.000 description 1
- 229960005050 live attenuated rota virus Drugs 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000010951 particle size reduction Methods 0.000 description 1
- 239000012254 powdered material Substances 0.000 description 1
- 238000011028 process validation Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000002411 thermogravimetry Methods 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
Область техникиTechnical field
[0001] Данное изобретение относится в целом к биологическим материалам; и более конкретно к улучшенным способам для консервации биологических материалов с применением обычного лиофилизатора.[0001] This invention relates generally to biological materials; and more specifically to improved methods for preserving biological materials using a conventional lyophilizer.
Уровень техникиState of the art
[0002] Область, связанная с методиками консервации биологических материалов, в последнее время продвинулась и достигла значительного улучшения с появлением определенных высококачественных способов, известных как "консервация путем выпаривания (PBV)", как описано в патенте США №9469835, выданном 18 октября 2016 года.[0002] The field related to techniques for the preservation of biological materials has recently advanced and achieved significant improvement with the advent of certain high-quality methods known as "preservation by evaporation (PBV)", as described in US patent No. 9469835, issued October 18, 2016 .
[0003] В настоящее время обычные лиофилизаторы (сублимационная сушилка) не предназначены для осуществления консервации биологических материалов и других композиций с применением протоколов PBV.[0003] Currently, conventional lyophilizers (freeze dryer) are not designed to carry out the preservation of biological materials and other compositions using PBV protocols.
[0004] Кроме того, согласно обычным протоколам сублимационного высушивания биологические материалы часто подвергают воздействию чрезвычайно низких температур, которые, как правило, влияют на активность этих композиций.[0004] In addition, according to conventional freeze-drying protocols, biological materials are often exposed to extremely low temperatures, which tend to affect the activity of these compositions.
[0005] Поскольку множество лабораторий и промышленных объектов имеют обычную сублимационную сушилку, биологические материалы, как правило, консервируют с применением устаревших протоколов, например, с осуществлением обычного сублимационного высушивания, что приводит к более низкой активности и стабильности продукта.[0005] Since many laboratories and industrial facilities have a conventional freeze dryer, biological materials are typically preserved using outdated protocols, such as performing conventional freeze drying, resulting in lower product activity and stability.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯBRIEF DESCRIPTION OF THE INVENTION
Техническая задачаTechnical task
[0006] Существует необходимость в улучшенных способах консервации биологических материалов с применением обычных лиофилизаторов.[0006] There is a need for improved methods for preserving biological materials using conventional lyophilizers.
[0007] Более конкретно существует необходимость в улучшенных способах, которые предусматривают применение обычного лиофилизатора для консервации биологических материалов в соответствии с технологией PBV.[0007] More specifically, there is a need for improved methods that involve the use of a conventional lyophilizer for the preservation of biological materials in accordance with PBV technology.
[0008] Дополнительно существует необходимость в поддержании стерильной изоляции биологических материалов при консервации биологических материалов в соответствии с такими способами.[0008] Additionally, there is a need to maintain sterile isolation of biological materials while preserving biological materials in accordance with such methods.
[0009] Для защиты биологических материалов во время выполнения протоколов PBV будут необходимы уникальные подлежащие консервации составы.[0009] Unique preservative formulations will be needed to protect biological materials during PBV protocols.
Решение задачиThe solution of the problem
[0010] Изобретение относится к способам выполнения протоколов PBV для консервации биологических материалов с применением обычного лиофилизатора.[0010] The invention relates to methods for performing PBV protocols for the preservation of biological materials using a conventional lyophilizer.
[0011] Изобретение также относится к стадиям поддержания выделения биологических материалов для достижения высушивания в асептических условиях с применением обычного лиофилизатора.[0011] The invention also relates to steps for maintaining the release of biological materials to achieve drying under aseptic conditions using a conventional lyophilizer.
[0012] Кроме того, изобретение относится к способам, совместимым с надлежащими производственными правилами (GMP), для достижения высушивания в асептических условиях биологических материалов с применением обычного лиофилизатора, расположенного вне зоны чистого помещения.[0012] In addition, the invention relates to Good Manufacturing Practices (GMP) compliant methods for achieving aseptic drying of biological materials using a conventional lyophilizer located outside the cleanroom area.
[0013] Наконец, изобретение относится к способам и составам для получения микронизированных биологических материалов, стабильных при температуре окружающей среды, подходящих для доставки пациенту через слизистые оболочки или трансдермальной доставки.[0013] Finally, the invention relates to methods and compositions for obtaining micronized biological materials that are stable at ambient temperature, suitable for delivery to the patient through the mucous membranes or transdermal delivery.
[0014] Эти и другие решения задач будут понятны специалисту в данной области техники после тщательного рассмотрения прилагаемых описаний, графических материалов и формулы изобретения.[0014] These and other solutions to problems will be clear to a person skilled in the art after careful consideration of the accompanying descriptions, drawings and claims.
Преимущественные эффекты изобретенияAdvantageous Effects of the Invention
[0015] Консервация путем выпаривания (PBV) представляет собой предпочтительную методику в области технологий консервации биологического материала, поскольку способ включает одновременное кипячение воды, сублимацию кристаллов льда и выпаривание с целью достижения относительно мягкой среды во время исходного высушивания, также называемого стадией "первичного высушивания", которая является стадией, где большую часть воды удаляют из подлежащей консервации композиции. Мягкая среда является особенно чувствительной в отношении чувствительных белков, вирусов, бактерий и других клеточных элементов и может применяться для стабилизации вакцины, крови и компонентов микробиома при температуре окружающей среды. Последующее непрерывное высушивание (также известное как "вторичное высушивание") незначительно повышает температуру стеклования подлежащей консервации композиции так, чтобы достичь механически устойчивой аморфной сухой стекловидной пены, при этом биологические материалы, инкапсулированные в пену, защищают и консервируют для (i) хранения свыше девяноста дней ("долговременное хранение") и, (ii) через некоторое время, для восстановления или доставки пациенту. Раскрытые способы позволяют специалисту в данной области техники подвергать консервации биологические материалы в соответствии с протоколами PBV, адаптированными для выполнения с применением обычного лиофилизатора. Таким образом специализированное оборудование не является необходимым для консервации биологических материалов с применением технологии PBV.[0015] Preservation by evaporation (PBV) is a preferred technique in the field of biological material preservation technologies, since the method involves the simultaneous boiling of water, sublimation of ice crystals and evaporation in order to achieve a relatively soft environment during the initial drying, also called the "primary drying" stage , which is the step where most of the water is removed from the composition to be preserved. Soft media is particularly sensitive to sensitive proteins, viruses, bacteria, and other cellular elements and can be used to stabilize vaccine, blood, and microbiome components at ambient temperature. Subsequent continuous drying (also known as "secondary drying") slightly raises the glass transition temperature of the composition to be preserved so as to achieve a mechanically stable amorphous dry vitreous foam, while the biological materials encapsulated in the foam are protected and preserved for (i) storage in excess of ninety days ("long-term storage") and, (ii) over time, for reconstitution or delivery to a patient. The disclosed methods allow one of skill in the art to conserve biological materials according to PBV protocols adapted to be performed using a conventional lyophilizer. Thus, specialized equipment is not necessary for the conservation of biological materials using PBV technology.
[0016] Композиции биологических материалов, которые консервируют с применением технологии PBV, обеспечивают лучшую эффективность по сравнению с такими же композициями, консервируемыми с применением обычной методики сублимационного высушивания. Предполагается, что экстремальные температуры, которые используют при применении обычной методики сублимационного высушивания, как правило, приводят к разрушению эпитопов белка и полезных компонентов таких композиций и, таким образом, к становлению полученного продукта хуже композиций, консервированных путем PBV.[0016] Compositions of biological materials that are preserved using PBV technology provide better performance compared to the same compositions preserved using conventional freeze-drying techniques. It is believed that the extreme temperatures that are used in conventional freeze-drying techniques tend to destroy protein epitopes and beneficial components of such compositions and thus render the resulting product inferior to PBV-preserved compositions.
[0017] Получение композиций биологических материалов по GMP, таких как без ограничения вакцины, может быть достигнуто с применением способов, раскрытых в данном документе. Действительно, способы обеспечивают улучшенную и более эффективную GMP-совместимую обработку материалов для стабилизации для промышленных применений.[0017] Preparation of GMP biological material compositions, such as, without limitation, vaccines, can be achieved using the methods disclosed herein. Indeed, the methods provide improved and more efficient GMP-compliant processing of stabilization materials for industrial applications.
[0018] Раскрыты определенные составы и протоколы для консервации, которые защищают биологические материалы во время консервации и которые предотвращают расстекловывание материалов.[0018] Certain preservation formulations and protocols are disclosed that protect biological materials during preservation and that prevent materials from devitrifying.
[0019] Другие преимущественные эффекты будут понятны специалисту в данной области техники после тщательного рассмотрения данного документа.[0019] Other beneficial effects will become apparent to those skilled in the art upon careful consideration of this document.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВBRIEF DESCRIPTION OF GRAPHICS
[0020] На фиг.1 показан способ консервации биологических материалов.[0020] Figure 1 shows a method for preserving biological materials.
[0021] На фиг. 2 показана таблица результатов, связанных с экспериментальным испытанием активности PBV LAIV после микронизации и последующего хранения.[0021] In FIG. 2 shows a table of results associated with experimental testing of PBV LAIV activity after micronization and subsequent storage.
[0022] На фиг. 3 показан график DSC, связанный с одним экспериментом, подробно описанным в данном документе.[0022] FIG. 3 shows a DSC plot associated with one experiment detailed in this document.
[0023] На фиг. 4 показан график DSC, связанный с другим экспериментом, подробно описанным в данном документе.[0023] FIG. 4 shows a DSC plot associated with another experiment detailed in this document.
[0024] На фиг. 5 показан график DSC, связанный с другим экспериментом, подробно описанным в данном документе.[0024] FIG. 5 shows a DSC plot associated with another experiment detailed in this document.
ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯDESCRIPTION OF EMBODIMENTS
[0025] В целях пояснения, а не для ограничения, подробности и описания определенных предпочтительных вариантов осуществления далее представлены в данном документе так, чтобы специалист в данной области техники мог иметь возможность создавать и использовать настоящее изобретение в его различных аспектах и вариантах осуществления. Однако эти подробности и описания являются иллюстративными только для определенных предпочтительных вариантов осуществления, и большое количество других вариантов осуществления, которые не будут намеренно описаны, будет легко понять специалисту в данной области техники после тщательного рассмотрения настоящего изобретения. Соответственно, любой рецензент настоящего изобретения должен интерпретировать объем настоящего изобретения формулой изобретения, поскольку такой объем не предназначен для ограничения вариантами осуществления, описанными и проиллюстрированными в данном документе.[0025] For purposes of explanation, and not limitation, details and descriptions of certain preferred embodiments are hereinafter provided so that a person skilled in the art can make and use the present invention in its various aspects and embodiments. However, these details and descriptions are illustrative only of certain preferred embodiments, and a large number of other embodiments, which will not be intentionally described, will be readily understood by a person skilled in the art upon careful consideration of the present invention. Accordingly, any reviewer of the present invention should interpret the scope of the present invention by the claims, as such scope is not intended to be limited to the embodiments described and illustrated herein.
[0026] Теперь в общем варианте осуществления раскрыт способ консервации биологических материалов. Способ включает по порядку следующие стадии.[0026] Now, in a general embodiment, a method for preserving biological materials is disclosed. The method includes the following steps in order.
[0027] Стадия (i): предоставление подлежащей консервации водной композиции в контейнере, при этом подлежащая консервации композиция включает один или несколько биологических материалов.[0027] Step (i): providing an aqueous composition to be preserved in a container, wherein the composition to be preserved includes one or more biological materials.
[0028] Стадия (ii): размещение контейнера и подлежащей консервации композиции в нем на терморегулируемой полке в вакуумной камере лиофилизатора, при чем терморегулируемая полка приспособлена для обеспечения температуры полки и вакуумная камера приспособлена для обеспечения вакуумметрического давления в нем.[0028] Step (ii): placing the container and the composition to be preserved therein on a temperature-controlled shelf in the vacuum chamber of the lyophilizer, wherein the temperature-controlled shelf is adapted to provide the temperature of the shelf and the vacuum chamber is adapted to provide vacuum pressure therein.
[0029] Стадия (iii): снижение температуры полки ниже 0°С и уменьшение вакуумметрического давления ниже 1,0 торр, обеспечивая тем самым переход подлежащей консервации композиции в двухфазное шугообразное состояние, где подлежащая консервации композиция содержит кристаллы льда в двухфазном шугообразном состоянии.[0029] Step (iii): lowering the temperature of the shelf below 0°C and reducing the vacuum pressure below 1.0 Torr, thereby ensuring the transition of the composition to be preserved into a two-phase sludge state, where the composition to be preserved contains ice crystals in a two-phase sludge state.
[0030] Стадия (iv): повышение температуры полки выше 0°С и поддержание вакуумметрического давления ниже 1,0 торр, тем самым преобразование подлежащей консервации композиции в механически устойчивую стекловидную пену; и[0030] Step (iv): raising the temperature of the shelf above 0° C. and maintaining the vacuum pressure below 1.0 Torr, thereby converting the composition to be preserved into a mechanically stable vitreous foam; And
[0031] стадия (v): повышение температуры полки выше 40°С с целью повышения до температуры стеклования механически устойчивой стекловидной пены.[0031] step (v): raising the temperature of the shelf above 40° C. to raise the mechanically stable vitreous foam to the glass transition temperature.
[0032] Для целей настоящего изобретения термин "подлежащая консервации композиция" обычно означает подлежащую консервации композицию биологических материалов для долговременного хранения при температуре окружающей среды от -30°С до +40°С и последующее восстановление или доставку пациенту. Подлежащая консервации композиция обычно содержит один или несколько сахаров и один или несколько биологических материалов, при этом биологические материалы могут содержать одну или несколько бактерий, один или несколько вирусов, один или несколько белков или их комбинацию. Подлежащая консервации композиция является водной в своем исходном состоянии, т.е. представляет собой жидкость или гель с некоторым процентным содержанием в композиции воды, составляющим более одного процента. В этом исходном состоянии различные компоненты, такие как биологические материалы, сахара, сахароспирты и другие компоненты выбирают и смешивают вместе. Однако, во время исходной стадии высушивания по протоколу PBV, также известной как "первичное высушивание", воду удаляют посредством одновременного кипячения, выпаривания и сублимации из водной композиции под вакуумметрическим давлением. Таким образом, подлежащая консервации композиция после первичного высушивания будет по большей части лишена воды и, как правило, будет являться аморфной сухой стеклообразной матрицей или пеной (в данном документе "механически устойчивая стекловидная пена") с биологическими материалами, иммобилизированными в ней.[0032] For the purposes of the present invention, the term "composition to be preserved" generally means a composition of biological materials to be preserved for long-term storage at an ambient temperature of -30°C to +40°C and subsequent reconstitution or delivery to a patient. The composition to be preserved typically contains one or more sugars and one or more biological materials, wherein the biological materials may contain one or more bacteria, one or more viruses, one or more proteins, or a combination thereof. The composition to be preserved is aqueous in its original state, i. e. is a liquid or gel with some percentage of water in the composition of more than one percent. In this initial state, various components such as biological materials, sugars, sugar alcohols and other components are selected and mixed together. However, during the initial drying step of the PBV protocol, also known as "primary drying", water is removed by simultaneous boiling, evaporation and sublimation from the aqueous composition under vacuum pressure. Thus, the composition to be preserved after primary drying will be largely devoid of water and will typically be an amorphous dry glassy matrix or foam (herein "mechanically stable glassy foam") with biological materials immobilized therein.
[0033] Соответственно, а также для целей, указанных в данном документе, термин "механически устойчивая стекловидная пена" означает подлежащую консервации композицию после первичного высушивания с помощью PBV, где подлежащая консервации композиция практически лишена воды и образует аморфную сухую стекловидную пену, характеризующуюся механической прочностью, достаточной для поддержания структурной формы. В частности, во время консервации с помощью PBV, как только начинается кипение подлежащей консервации композиции, внутри композиции образуются и растут пузырьки, которые в начале процесса будут представлять собой движущуюся (неустойчивую) пену, пока вязкость композиции в результате дегидратации не предотвратит дополнительный рост пузырьков водного пара, и пузырьки не будут иммобилизованы внутри композиции под конец первичного высушивания или когда большая часть воды испаряется и пена становится механически устойчивой.[0033] Accordingly, and for the purposes of this document, the term "mechanically stable vitreous foam" means a composition to be preserved after primary drying with PBV, where the composition to be preserved is substantially devoid of water and forms an amorphous dry vitreous foam characterized by mechanical strength sufficient to maintain the structural shape. In particular, during preservation with PBV, as soon as the composition to be preserved begins to boil, bubbles form and grow inside the composition, which at the beginning of the process will be a moving (unstable) foam, until the viscosity of the composition due to dehydration prevents additional growth of water bubbles. steam, and the bubbles will not be immobilized within the composition at the end of the primary drying or when most of the water has evaporated and the foam has become mechanically stable.
[0034] В одном варианте осуществления во время стадии (iv) температуру полки повышают выше 20°С и вакуумметрическое давление снижают ниже 0,3 торр в вакуумной камере лиофилизатора.[0034] In one embodiment, during step (iv), the shelf temperature is raised above 20° C. and the vacuum pressure is reduced below 0.3 torr in the vacuum chamber of the lyophilizer.
[0035] В других вариантах осуществления во время стадии (iv) температуру полки повышают выше 20°С, а вакуумметрическое давление снижают ниже 0,3 торр в вакуумной камере в течение первого периода, а после первого периода температуру полки повышают выше 30°С, а вакуумметрическое давление поддерживается на уровне ниже 0,3 торр в вакуумной камере.[0035] In other embodiments, during step (iv), the shelf temperature is increased above 20°C and the vacuum pressure is reduced below 0.3 Torr in the vacuum chamber during the first period, and after the first period, the shelf temperature is increased above 30°C, and the vacuum pressure is maintained below 0.3 Torr in the vacuum chamber.
[0036] В некоторых вариантах осуществления во время стадии (v) температуру полки повышают выше 50°С.[0036] In some embodiments, during step (v), the temperature of the shelf is raised above 50°C.
[0037] В различных вариантах осуществления подлежащая консервации водная композиция (до первичного высушивания) содержит жидкость или гель.[0037] In various embodiments, the aqueous composition to be preserved (before primary drying) contains a liquid or gel.
[0038] Гель может быть получен путем химической сшивки полимеров, включенных в растворы для консервации, или полимеров и других молекул или ионов. Ионы могут включать катионы, т.е. Са++, или анионы.[0038] The gel can be obtained by chemical crosslinking of polymers included in preservation solutions, or polymers and other molecules or ions. Ions may include cations, ie. Ca++, or anions.
[0039] Гель может быть получен путем химического сшивания во время подогревания смесей замерзших капель, содержащих отдельные сшивающие компоненты. Замерзшие капли можно получить с применением криогрануляции, например, путем распыления раствора в криожидкости, такой как жидкий азот (LN2).[0039] The gel can be obtained by chemical crosslinking during heating of mixtures of frozen droplets containing individual crosslinking components. Frozen droplets can be obtained using cryogranulation, for example by spraying a solution into a cryofluid such as liquid nitrogen (LN2).
[0040] Гель также можно получить посредством охлаждения подлежащих консервации композиций, которые превращаются в гель при температуре ниже 0°С.[0040] The gel can also be obtained by cooling the compositions to be preserved, which turn into a gel at a temperature below 0°C.
[0041] В некоторых вариантах осуществления охлаждение полимерных растворов, которые могут превращаться в гель во время охлаждения, проводят путем криогрануляции. Криогрануляция является способом в котором перед охлаждением материал диспергируют на множество капель.[0041] In some embodiments, the implementation of the cooling of polymer solutions, which can turn into a gel during cooling, is carried out by cryogranulation. Cryogranulation is a process in which a material is dispersed into a plurality of droplets before cooling.
[0042] Хотя возможны множественные составы, подлежащая консервации композиция обычно содержит: один или несколько невосстанавливающих сахаров, один или несколько сахароспиртов или их комбинацию.[0042] Although multiple formulations are possible, the composition to be preserved typically contains: one or more non-reducing sugars, one or more sugar alcohols, or a combination thereof.
[0043] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из указанных одного или нескольких невосстанавливающих Сахаров выбран из группы, состоящей из: сахарозы, трегалозы, рафинозы, метилглюкозида и 2-дезоксиглюкозы. Однако другие невосстанавливающие сахара, известные специалисту в данной области техники, могут быть использованы подобным образом.[0043] In some embodiments, at least one of said one or more non-reducing sugars is selected from the group consisting of: sucrose, trehalose, raffinose, methyl glucoside, and 2-deoxyglucose. However, other non-reducing sugars known to those skilled in the art may be used in a similar manner.
[0044] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из указанных одного или нескольких сахароспиртов выбран из группы, состоящей из: маннита, изомальта, сорбита и ксилита. Однако другие невосстанавливающие сахара, известные специалисту в данной области техники, могут быть использованы подобным образом.[0044] In some embodiments, at least one of said one or more sugar alcohols is selected from the group consisting of: mannitol, isomalt, sorbitol, and xylitol. However, other non-reducing sugars known to those skilled in the art may be used in a similar manner.
[0045] Подлежащая консервации композиция может содержать: один или несколько внутриклеточных криопротекторов один или несколько внеклеточных криопротекторов или их комбинацию.[0045] The composition to be preserved may contain: one or more intracellular cryoprotectants, one or more extracellular cryoprotectants, or a combination thereof.
[0046] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из одного или нескольких внутриклеточных криопротекторов выбран из группы, состоящей из: глицерина, пропиленгликоля, эритритола, сорбита, маннита, метилглюкозида и полиэтиленгликоля.[0046] In some embodiments, at least one of one or more intracellular cryoprotectants is selected from the group consisting of: glycerol, propylene glycol, erythritol, sorbitol, mannitol, methyl glucoside, and polyethylene glycol.
[0047] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из одного или нескольких внеклеточных криопротекторов выбран из группы, состоящей из: глутаминовой кислоты, глицина, пролина, серина, треонина, валина, аргинина, аланина, лизина, цистеина, поливинилпирролидона, полиэтиленгликоля и гидроксиэтилкрахмала.[0047] In some embodiments, at least one of one or more extracellular cryoprotectants is selected from the group consisting of: glutamic acid, glycine, proline, serine, threonine, valine, arginine, alanine, lysine, cysteine, polyvinylpyrrolidone, polyethylene glycol, and hydroxyethyl starch .
[0048] Подлежащая консервации композиция может дополнительно содержать одно или несколько противовспенивающих средств.[0048] The composition to be preserved may further comprise one or more antifoam agents.
[0049] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно из одного или нескольких противовспенивающих средств выбрано из группы, состоящей из: полипропиленгликоля и этиленгликоля.[0049] In some embodiments, at least one of the one or more antifoam agents is selected from the group consisting of: polypropylene glycol and ethylene glycol.
[0050] В некоторых вариантах осуществления способ может дополнительно включать перед стадией (i) загрузку биологических материалов с одним или несколькими проникающими внутриклеточными криопротекторами и затем смешивание загруженных биологических материалов с раствором для консервации с образованием подлежащей консервации композиции.[0050] In some embodiments, the method may further comprise prior to step (i) loading the biological materials with one or more permeable intracellular cryoprotectants and then mixing the loaded biological materials with a preservation solution to form the composition to be preserved.
[0051] Один или несколько биологических материалов содержат: бактерию, вирус, белок или их комбинацию.[0051] One or more biological materials contain: a bacterium, a virus, a protein, or a combination thereof.
[0052] Один или несколько биологических материалов содержат комбинацию из одной или нескольких бактерий, одного или нескольких вирусов и одного или нескольких белков.[0052] One or more biological materials contain a combination of one or more bacteria, one or more viruses, and one or more proteins.
[0053] В различных вариантах осуществления контейнер может содержать одно из: пенициллинового флакона, пластиковой бутылкт, металлического контейнера или лотка.[0053] In various embodiments, the container may contain one of: a penicillin vial, a plastic bottle, a metal container, or a tray.
[0054] В некоторых вариантах осуществления контейнер может содержать пористую мембрану, характеризующуюся размером пор, который меньше или равняется 0,25 мкм, и подлежащая консервации композиция может быть выделена из среды вакуумной камеры через пористую мембрану. Пористая мембрана может содержать любой обычный фильтр, применяемый для стерилизации водных растворов.[0054] In some embodiments, the container may contain a porous membrane having a pore size less than or equal to 0.25 microns, and the composition to be preserved can be separated from the vacuum chamber environment through the porous membrane. The porous membrane may contain any conventional filter used to sterilize aqueous solutions.
[0055] В некоторых вариантах осуществления контейнер также запечатан в пакет для стерилизации.[0055] In some embodiments, the container is also sealed in a sterilization pouch.
[0056] В некоторых вариантах осуществления контейнер может содержать множество металлических или керамических шариков, которые предусмотрены в объеме контейнера наряду с подлежащей консервации композицией.[0056] In some embodiments, the implementation of the container may contain many metal or ceramic balls, which are provided in the volume of the container along with the composition to be preserved.
[0057] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает, после стадии (v) размалывание механически устойчивой стекловидной пены в контейнере с применением металлических или керамических шариков, содержащихся в нем ("шаровой размол") для преобразования механически устойчивой стекловидной пены в частицы/порошок.[0057] In some embodiments, the method further comprises, after step (v), grinding the mechanically stable vitreous foam in the container using the metal or ceramic balls contained therein ("ball milling") to convert the mechanically stable vitreous foam into particles/powder.
[0058] В некоторых вариантах осуществления, в частности, где биологические материалы предназначены для доставки через слизистые оболочки или трансдермальной доставки, подлежащая консервации композиция может содержать по меньшей мере пять частей дисахарида на одну часть сахароспиртов. Кроме того, подлежащая консервации композиция может дополнительно содержать водорастворимые аминокислоты или их соли. В некоторых вариантах осуществления водорастворимые аминокислоты или их соли могут содержать: аргинин, глутаминовую кислоту, глицин, пролин или их комбинацию.[0058] In some embodiments, particularly where the biological materials are intended for mucosal or transdermal delivery, the composition to be preserved may contain at least five parts of disaccharide to one part of sugar alcohols. In addition, the composition to be preserved may additionally contain water-soluble amino acids or their salts. In some embodiments, the implementation of water-soluble amino acids or their salts may contain: arginine, glutamic acid, glycine, proline, or a combination thereof.
[0059] В другом аспекте раскрыт способ стерильного получения термостабильных биологических материалов. Способ включает следующие стадии:[0059] In another aspect, a method for sterile production of thermostable biological materials is disclosed. The method includes the following steps:
[0060] в пределах первой зоны чистого помещения: размещение подлежащей консервации композиции внутри контейнера, при этом подлежащая консервации композиция содержит один или несколько биологических материалов; запечатывание отверстия контейнера пористой мембраной с образованием запечатанного мембраной контейнера, где пористая мембрана имеет отверстие, размер которого меньше или равняется 0,25 микрон; и размещение запечатанного мембраной контейнера в стерильном пакете для стерилизации предназначенном для использования в медицине и термическое сваривание пакета для стерилизации;[0060] within the first area of the cleanroom: placing the composition to be preserved inside a container, wherein the composition to be preserved contains one or more biological materials; sealing the opening of the container with a porous membrane to form a membrane-sealed container, wherein the porous membrane has an opening that is less than or equal to 0.25 microns; and placing the membrane-sealed container in a sterile sterilization pouch for medical use and heat sealing the sterilization pouch;
[0061] перемещение пакета для стерилизации и запечатанного мембраной контейнера в нем из первой зоны чистого помещения во вторую зону, при этом способ дополнительно включает: размещение пакета для стерилизации и запечатанногоо мембраной контейнера в нем на терморегулируемой полке в вакуумной камере лиофилизатора; регулирование вакуумметрического давления и температуры полки для выполнения протокола высушивания, при этом протокол высушивания включает преобразование подлежащей консервации композиции в механически устойчивую стекловидную пену; и[0061] moving the sterilization bag and the membrane-sealed container therein from the first zone of the cleanroom to the second zone, the method further comprising: placing the sterilization bag and the membrane-sealed container therein on a temperature-controlled shelf in the vacuum chamber of the lyophilizer; adjusting the vacuum pressure and temperature of the shelf to carry out the drying protocol, wherein the drying protocol includes converting the composition to be preserved into a mechanically stable vitreous foam; And
[0062] после выполнения протокола высушивания, удаление запечатанного мембраной контейнера из пакета для стерилизации перед возвратом запечатанного мембраной контейнера в первую зону чистого помещения, при этом в первой зоне чистого помещения способ дополнительно включает: замену пористой мембраны стерильной крышкой или покрытие фильтра водонепроницаемой стерильной наклейкой для обеспечения того, чтобы механически устойчивая стекловидная пена в контейнере оставалась изолированной от воздействия внешней влажности во время последующего хранения; и, необязательно, преобразование механически устойчивой стекловидной пены в контейнере в порошок.[0062] after performing the drying protocol, removing the membrane-sealed container from the sterilization pouch before returning the membrane-sealed container to the first cleanroom zone, wherein in the first cleanroom zone, the method further comprises: replacing the porous membrane with a sterile cap or covering the filter with a waterproof sterile sticker to ensuring that the mechanically stable vitreous foam in the container remains insulated from exposure to external moisture during subsequent storage; and optionally converting the mechanically stable vitreous foam in the container to a powder.
[0063] Чистые помещения, как правило, предназначены для включения трех зон, которые часто называют: А, В и С, А представляет собой первую и наиболее стерильную часть чистого помещения. В соответствии с правилами FDA индивиды могут выполнять какую-либо работу или могут находиться за пределами зоны А (в зонах В и С) чистого помещения, если они одеты в чистую одежду или/и на них есть другие покрытия. Индивидам не позволено находится в наиболее чистой зоне А. Только руки, покрытые стерильными перчатками, могут на короткий период времени пересекать линию разделения зоны А от зоны В для проведения небольших операций, таких как доставка флакона или инструмента в зону А или открытие или закрытие контейнера или подобное. Перед помещением инструмента или флакона в зону А они должны быть изолированы от воздействия окружающей среды, находясь за пределами зоны А. Например, они должны быть помещены внутрь стерильного пакета, который будет удален перед помещением инструмента или флакона в зону А для того, чтобы убедиться, что зона А остается стерильной.[0063] Cleanrooms are generally designed to include three zones, often referred to as A, B, and C, A being the first and most sterile part of the cleanroom. According to FDA regulations, individuals may perform any work or may be outside Zone A (Zones B and C) of a cleanroom if they are wearing clean clothes and/or other coverings. Individuals are not allowed in the cleanest area A. Only hands covered with sterile gloves may cross the line separating area A from area B for a short period of time to carry out minor operations such as delivering a vial or instrument to area A or opening or closing a container or similar. Before placing an instrument or vial in Zone A, they must be isolated from the environment while outside Zone A. For example, they must be placed inside a sterile bag, which will be removed before placing the instrument or vial in Zone A in order to ensure that that zone A remains sterile.
[0064] В различных вариантах осуществления сухая пена накапливается в результате образования и роста пузырьков пара во время кипения и проявляется в виде пены из пузырьков, которая формируется во время высушивания жидкости, или может проявляться в виде сухого гидрогеля, содержащего включения газа.[0064] In various embodiments, dry foam accumulates as a result of the formation and growth of vapor bubbles during boiling and appears as a foam of bubbles that forms during the drying of the liquid, or may appear as a dry hydrogel containing gas inclusions.
[0065] Эти и другие варианты осуществления созданы и обоснованы в соответствии со следующими экспериментальными примерами, где:[0065] These and other embodiments are created and validated in accordance with the following experimental examples, where:
Пример 1. Консервация путем выпаривания (PBV)Example 1 Preservation by Evaporation (PBV)
[0066] Консервация путем выпаривания (PBV) представляет собой относительно новую методику стабилизации неустойчивых вакцин и других биологических материалов при температуре окружающей среды (AT). Выполнение PBV требует одновременного контроля температуры и вакуумметрического давления. Это может быть сделано путем приведения в контакт сушильной камеры с источником вакуума и подачи тепла к образцам для высушивания для борьбы с охлаждением, происходящим в результате испарения воды. Источник тепла может быть представлен источником электромагнитного нагревания или обычным тепловым потоком из полки для нагревания, на которой образец размещали во время высушивания. Может быть много конструкций вакуумного сушильного оборудования, с помощью которого можно выполнять способ PBV. PBV можно также выполнять с применением обычного лиофилизатора, например, из тех, которые в настоящее время используются для получения сухих биологических препаратов с применением протоколов сублимационного высушивания. Поскольку выполнение сублимационного высушивания, как правило, требует применения относительно высокого вакуума, обычные лиофилизаторы не предназначены для контроля вакуумметрического давления автоматически, если давление внутри сушильной камеры является выше 1 торр, или, в некоторых случаях, выше 2 торр. Это ограничивает объем способов PBV, которые могут быть автоматически выполнены с использованием обычных лиофилизаторов. Однако в различных вариантах осуществления в данном документе раскрыто, как можно использовать обычные лиофилизаторы для консервации биологических материалов при температуре окружающей среды и как протокол высушивания может быть запрограммирован на автоматическое выполнение протоколов PBV без вовлечения оператора, который необходим для получения по GMP, и утверждения FDA, и утверждения различных контролирующих органов за пределами США.[0066] Preservation by evaporation (PBV) is a relatively new technique for stabilizing unstable vaccines and other biological materials at ambient temperature (AT). Performing PBV requires simultaneous control of temperature and vacuum pressure. This can be done by contacting the drying chamber with a vacuum source and applying heat to the samples to be dried to combat the cooling resulting from the evaporation of water. The heat source may be an electromagnetic heating source or conventional heat flow from the heating shelf on which the sample was placed during drying. There may be many designs of vacuum drying equipment with which the PBV process can be carried out. PBV can also be performed using a conventional lyophilizer, such as those currently used to prepare dry biologicals using freeze drying protocols. Since the performance of freeze drying typically requires the application of a relatively high vacuum, conventional lyophilizers are not designed to control the vacuum pressure automatically if the pressure inside the drying chamber is above 1 Torr, or in some cases above 2 Torr. This limits the scope of PBV methods that can be automatically performed using conventional lyophilizers. However, in various embodiments, this document discloses how conventional lyophilizers can be used to preserve biological materials at ambient temperature and how the drying protocol can be programmed to automatically perform PBV protocols without the operator involvement required for GMP preparation and FDA approval. and approvals from various regulatory agencies outside the US.
[0067] В соответствии с технологией PBV первичное высушивание должно проводиться из двухфазного шугообразного состояния. Таким образом, чтобы выполнить PBV для данной подлежащей консервации композиции, такой как образец, включая подлежащую консервации смесь (РМ) биологической суспензии с раствором для консервации (PS), или гидрогель, содержащий биологические препараты и PS, образец сначала следует частично заморозить. "Замороженный" означает, что внутри образца образуются кристаллы льда. "Частично замороженный" означает, что температура образца на по меньшей мере 10°С выше Tg', где Tg' представляет собой температуру, ниже которой подлежащая консервации композиция находится в твердом состоянии, включающем кристаллизированные твердые вещества и аморфные твердые вещества (стекло) без жидкой фазы. Одно ключевое отличие между PBV и обычным сублимационным высушиванием заключается в том, что температура образца должна быть на уровне или ниже Tg' во время первичного сублимационного высушивания (или лиофилизации). Однако, температура образца на стадии первичного высушивания PBV должна быть на по меньшей мере 10°С выше Tg', чтобы обеспечить наличие жидкой фазы между кристаллами льда. Также, для обеспечения того, что данная жидкость не только испаряется, но также кипит, вакуумметрическое давление в камере должно быть ниже равновесного давления водяного пара над жидкостью. В данном документе, в соответствии с общепринятой терминологией, первичное высушивание определено как стадия исходного высушивания, во время которой образец теряет примерно 90% исходного количества воды в образце.[0067] In accordance with the PBV technology, the primary drying must be carried out from a two-phase sludge state. Thus, to perform a PBV for a given composition to be preserved, such as a sample including a mixture to be preserved (PM) of a biological suspension with a preservation solution (PS), or a hydrogel containing biologicals and PS, the sample must first be partially frozen. "Frozen" means that ice crystals form inside the sample. "Partially frozen" means that the temperature of the sample is at least 10°C above Tg', where Tg' is the temperature below which the composition to be preserved is in a solid state, including crystallized solids and amorphous solids (glass) without liquid phases. One key difference between PBV and conventional freeze drying is that the temperature of the sample must be at or below Tg' during primary freeze drying (or lyophilization). However, the temperature of the sample during the primary drying of the PBV must be at least 10° C. above Tg' to ensure that there is a liquid phase between the ice crystals. Also, to ensure that a given liquid not only evaporates but also boils, the vacuum pressure in the chamber must be below the equilibrium pressure of water vapor above the liquid. In this document, in accordance with conventional terminology, primary drying is defined as the stage of initial drying, during which the sample loses approximately 90% of the original amount of water in the sample.
[0068] До консервации с помощью PBV биологические материалы необходимо смешать с растворами для консервации (PS), предназначенными для защиты биологических материалов от разрушающего действия заморозки и высушивания. Правильный отбор PS является важным для обеспечения успешной консервации. Чем ниже температура заморозки, тем более важно включить обычные криопротекторы в PS. Важно использовать как внутриклеточные криопротекторы, которые проникают внутрь клеточных элементов, так и внеклеточные криопротекторы, которые защищают клеточную и вирусную мембраны и оболочки.[0068] Prior to preservation with PBV, biological materials must be mixed with preservation solutions (PS) designed to protect biological materials from the damaging effects of freezing and drying. Proper selection of PS is essential to ensure successful preservation. The lower the freezing temperature, the more important it is to include conventional cryoprotectants in PS. It is important to use both intracellular cryoprotectants, which penetrate into cellular elements, and extracellular cryoprotectants, which protect cellular and viral membranes and membranes.
Пример 2. Консервация клеток животныхExample 2 Animal Cell Conservation
[0069] CTV-1 представляет собой клеточную линию Т-клеточного лейкоза человека. Клетки CTV-1 выращивали в инкубаторе при 37°С, 5% CO2 и культивировали в суспензии в среде RPMI (85-90%) и термически инактивированной FBS (10-15%) с пенициллин-стрептомицином. Клетки разделяли каждые 4-5 дней и поддерживали на уровне около 1Е6 клеток/мл. Клетки затем собирали и концентрировали посредством центрифугирования до приблизительно 0,5-1Е7 клеток/мл.[0069] CTV-1 is a human T-cell leukemia cell line. CTV-1 cells were grown in an incubator at 37°C, 5% CO2 and cultured in suspension in RPMI medium (85-90%) and thermally inactivated FBS (10-15%) with penicillin-streptomycin. Cells were separated every 4-5 days and maintained at about 1E6 cells/ml. Cells were then harvested and concentrated by centrifugation to approximately 0.5-1E7 cells/ml.
[0070] Процедура: 5,5 г культуры клеток смешивали с 0,5 мл 50% глицерина и загружали в течение 30 мин. при комнатной температуре (к. т.). Две подлежащие консервации смеси (РМ) получали путем смешивания загруженных клеток с в два раза большим объемом двух растворов для консервации: PS1, содержащий 30% сахарозы, 15% MAG; и PS2, содержащий 30% сахарозы, 15% метилглюкозида (MAG) и 5% поливинилпирролидона (PVP). РМ помещали в 5 мл пенициллиновые флаконы (0,5 мл на флаконы) и высушивали внутри сублимационной сушилки с применением протокола PBV, описанного ниже.[0070] Procedure: 5.5 g of cell culture was mixed with 0.5 ml of 50% glycerol and loaded for 30 minutes. at room temperature (k. t.). Two preservative mixtures (PM) were prepared by mixing loaded cells with twice the volume of two preservative solutions: PS1 containing 30% sucrose, 15% MAG; and PS2 containing 30% sucrose, 15% methyl glucoside (MAG) and 5% polyvinylpyrrolidone (PVP). PM was placed in 5 ml penicillin vials (0.5 ml per vial) and dried inside a freeze dryer using the PBV protocol described below.
[0071] Используемый протокол PBV включает следующие стадии:[0071] The PBV protocol used includes the following steps:
[0072] частичную заморозку указанной РМ путем уменьшения температуры полки до -18°С и поддержание в течение 18 мин. при -18°С;[0072] Partially freezing said RM by lowering the shelf temperature to -18°C and holding for 18 minutes. at -18°C;
[0073] уменьшение вакуумметрическоого давления внутри сушильной камеры до0,1 торр и поддержание этого давления в течение 5 мин. для того, чтобы убедиться, что РМ заморожена;[0073] reducing the vacuum pressure inside the drying chamber to 0.1 Torr and maintaining this pressure for 5 minutes. in order to make sure that the RM is frozen;
[0074] повышение температуры полки до 0°С и вакуумметрического давления до 0,9 торр и поддержание этого давления и температуры полки в течение 50 мин.;[0074] increasing the temperature of the shelf to 0° C. and the vacuum pressure to 0.9 Torr and maintaining this pressure and temperature of the shelf for 50 minutes;
[0075] повышение температуры полки до 10°С и вакуумметрического давления до 0,5 торр и поддержание этого давления и температуры полки в течение 22 мин.;[0075] increasing the temperature of the shelf to 10° C. and the vacuum pressure to 0.5 Torr and maintaining this pressure and temperature of the shelf for 22 minutes;
[0076] повышение температуры полки до 10°С и вакуумметрического давления до 0,5 торр и поддержание этого давления и температуры полки в течение 22 мин.;[0076] increasing the temperature of the shelf to 10° C. and the vacuum pressure to 0.5 Torr and maintaining this pressure and temperature of the shelf for 22 minutes;
[0077] повышение температуры полки до 20°С и уменьшение вакуумметрического давления до 0,1 торр и поддержание этого давления и температуры полки в течение 22 мин;[0077] Increasing the shelf temperature to 20° C. and decreasing the vacuum pressure to 0.1 Torr and maintaining this pressure and shelf temperature for 22 minutes;
[0078] повышение температуры полки до 30°С и поддержание вакуумметрического давления на уровне 0,1 торр и поддержание этого давления и температуры полки в течение 20 часов; и[0078] Raising the temperature of the shelf to 30° C. and maintaining a vacuum pressure of 0.1 Torr and maintaining this pressure and temperature of the shelf for 20 hours; And
[0079] повышение температуры полки до 40°С и поддержание вакуумметрического давления на уровне 0,1 торр и поддержание этого давления и температуры полки в течение 20 часов.[0079] Increasing the shelf temperature to 40° C. and maintaining the vacuum pressure at 0.1 Torr and maintaining this pressure and shelf temperature for 20 hours.
[0080] После консервации образцы PBV восстанавливали с помощью 0,5 мл среды для культивирования RPMI и дополнительно разбавляли средой для культивирования RPMI 1:2. Жизнеспособность клеток тестировали с применением цитометра с визуализацией mvitrogen Tali™ с набором для определения жизнеспособности Tali™ - Dead Cell Red, раствором пропидиум йодида. Пропидиум йодид неспособен к проникновению в живые клетки, но проникает в мертвые клетки (мембранно-поврежденные клетки) и флуоресцирует красным после связывания с нуклеиновыми кислотами. Набор для определения жизнеспособности включает протокол, который использовали для измерений: (https://tools. thermofisher. com/content/sfs/manuals/mp10786.pdf). Питометр Tali™ использовали для контроля состояния/жизнеспособности клетки с помощью протокола пропидиум йодида, подсчета процентного содержания живых/мертвых клеток и измерения среднего размера клетки. Измерения на приборе проводили с порогом флуоресценции пропидиум йодида (PIF), установленным на 440 RFU, а пороговый уровень среднего размера клетки ограничивали до 4-20 мкм.[0080] After preservation, PBV samples were reconstituted with 0.5 ml of RPMI culture medium and further diluted with RPMI culture medium 1:2. Cell viability was tested using the mvitrogen Tali™ Imaging Cytometer with Tali™ Viability Kit - Dead Cell Red, propidium iodide solution. Propidium iodide is incapable of penetrating living cells, but it does penetrate dead cells (membrane-damaged cells) and fluoresces red after binding to nucleic acids. The viability kit includes the protocol used for measurements: (https://tools. thermofisher. com/content/sfs/manuals/mp10786.pdf). The Tali™ pitometer was used to monitor cell health/viability using the propidium iodide protocol, to calculate the percentage of live/dead cells, and to measure the average cell size. Measurements on the instrument were performed with a propidium iodide fluorescence (PIF) threshold set at 440 RFU, and the average cell size threshold was limited to 4-20 µm.
[0081] Результаты: выживаемость клеток после высушивания с помощью PS1 составляла менее 10%; выживаемость клеток после высушивания с помощью PS2 составляла более 75%. Таким образом, PVP обеспечивал защиту клеточной мембраны во время консервации.[0081] Results: cell survival after drying with PS1 was less than 10%; cell survival after drying with PS2 was over 75%. Thus, PVP provided cell membrane protection during conservation.
Пример 3. Консервация бактериальных клетокExample 3 Bacterial Cell Conservation
[0082] Суспензию бактериальных клеток смешивали с 9% глицерином в PBS 3:1. После этого 3 РМ получали путем смешивания суспензии с в два раза большим объемом 3 растворов для консервации.[0082] The bacterial cell suspension was mixed with 9% glycerol in PBS 3:1. Thereafter, 3 PM was obtained by mixing the suspension with twice the volume of 3 preservation solutions.
[0083] (PS1): глутаминовая кислота 7,86%, сахароза 10%, маннит 5%, NaOH 2% и PVP 4,76%, доведенные до рН=7;[0083] (PS1): glutamic acid 7.86%, sucrose 10%, mannitol 5%, NaOH 2% and PVP 4.76% adjusted to pH=7;
[0084] (PS2): глутаминовая кислота 7,86%, сахароза 10%, маннит 5%, NaOH 2%, доведенные до рН=7; и[0084] (PS2): glutamic acid 7.86%, sucrose 10%, mannitol 5%, NaOH 2% adjusted to pH=7; And
[0085] (PS3): глутаминовая кислота 7,86%, сахароза 10%, маннит 5%, NaOH 2% и PEG 4.76%, доведенные до рН=7.[0085] (PS3): glutamic acid 7.86%, sucrose 10%, mannitol 5%, NaOH 2% and PEG 4.76% adjusted to pH=7.
[0086] Процедура: РМ помещали в 5 мл пенициллиновые флаконы (0,5 мл на флаконы) и высушивали внутри лиофилизатора с применением протокола PBV, описанного ниже.[0086] Procedure: PM was placed in 5 ml penicillin vials (0.5 ml per vial) and dried inside a lyophilizer using the PBV protocol described below.
[0087] Используемый протокол PBV включает следующие стадии:[0087] The PBV protocol used includes the following steps:
[0088] частичную заморозку указанной РМ путем уменьшения температуры полки до -18°С и поддержание в течение 18 мин при -18°С;[0088] partial freezing of said PM by lowering the shelf temperature to -18°C and maintaining for 18 minutes at -18°C;
[0089] уменьшение вакуумметрическоого давления внутри сушильной камеры до 0,1 торр и поддержание этого давления в течение 5 мин для того, чтобы убедиться, что РМ заморожена;[0089] reducing the vacuum pressure inside the drying chamber to 0.1 Torr and maintaining this pressure for 5 minutes in order to ensure that the PM is frozen;
[0090] повышение температуры полки до 0°С и вакуумметрического давления до 0,9 торр и поддержание этого давления и температуры полки в течение 50 мин.;[0090] increasing the temperature of the shelf to 0°C and the vacuum pressure to 0.9 Torr and maintaining this pressure and temperature of the shelf for 50 minutes;
[0091] повышение температуры полки до 10°С и вакуумметрического давления до 0,5 торр и поддержание этого давления и температуры полки в течение 22 мин.;[0091] increasing the temperature of the shelf to 10° C. and the vacuum pressure to 0.5 Torr and maintaining this pressure and temperature of the shelf for 22 minutes;
[0092] повышение температуры полки до 10°С и вакуумметрического давления до 0,5 торр и поддержание этого давления и температуры полки в течение 22 мин.;[0092] increasing the temperature of the shelf to 10° C. and the vacuum pressure to 0.5 Torr and maintaining this pressure and temperature of the shelf for 22 minutes;
[0093] повышение температуры полки до 20°С и уменьшение вакуумметрического давления до 0,1 торр и поддержание этого давления и температуры полки в течение 22 мин; и[0093] Raising the temperature of the shelf to 20° C. and reducing the vacuum pressure to 0.1 Torr and maintaining this pressure and temperature of the shelf for 22 minutes; And
[0094] повышение температуры полки до 30°С и поддержание вакуумметрического давления на уровне 0,1 торр и поддержание этого давления и температуры полки в течение 20 часов.[0094] Increasing the shelf temperature to 30° C. and maintaining the vacuum pressure at 0.1 Torr and maintaining this pressure and shelf temperature for 20 hours.
[0095] Результаты: после высушивания PBV материал восстанавливали с помощью 0,5 мл PBS и высевали на планшеты с агаром BHI после последовательных разведений. Планшеты хранили в инкубаторе при 37°С в течение 24 ч. Выживаемость бактерий после высушивания с помощью PS3 составляла менее 30%; выживаемость клеток после высушивания с помощью PS2 составляла менее 60%, выживаемость клеток после высушивания с помощью PS1 составляла более 90%. Таким образом, PVP обеспечивал дополнительную защиту бактерий во время консервации.[0095] Results: After drying the PBV, the material was reconstituted with 0.5 ml PBS and plated on BHI agar plates after serial dilutions. The plates were stored in an incubator at 37° C. for 24 hours. The bacterial survival after drying with PS3 was less than 30%; cell survival after drying with PS2 was less than 60%, cell survival after drying with PS1 was more than 90%. Thus, PVP provided additional protection for bacteria during preservation.
Пример 4. Валидация технологического процесса и увеличение масштаба высушивания в пенициллиновых флаконахExample 4 Process Validation and Scaling Up Drying in Penicillin Vials
[0096] Исследования проводили с целью валидации воспроизводимости способа высушивания PBV. Альбумин человека применяли в качестве модельного белка в этих экспериментах. 2 мл подлежащей консервации смеси, содержащей 20 мг рекомбинантного альбумина человека (Novozymes ALBiX), 266 мг сахарозы и 133 мг изомальта, заполняли 20 мл пенициллиновые флаконы, помещали на стальной лоток и помещали на полку в лиофилизаторе (сублимационной сушилке) от Virtis. Лоток полностью заполняли флаконами общим количеством 120. Протокол высушивания пены PBV состоял из 3 часов первичного высушивания при 1500 мторр при температурах, находящихся в диапазоне от -15°С до 30°С и 20 часов вторичного высушивания при 50°С. Внешне сухая пена (механически устойчивая стекловидная пена) выглядела очень однородно от флакона к флакону без видимых всплесков.[0096] Studies were conducted to validate the reproducibility of the method of drying PBV. Human albumin was used as a model protein in these experiments. 2 ml of a mixture to be preserved, containing 20 mg of recombinant human albumin (Novozymes ALBiX), 266 mg of sucrose and 133 mg of isomalt, was filled into 20 ml penicillin vials, placed on a steel tray and placed on a shelf in a lyophilizer (freeze dryer) from Virtis. The tray was completely filled with vials totaling 120. The PBV foam drying protocol consisted of 3 hours of primary drying at 1500 mTorr at temperatures ranging from -15°C to 30°C and 20 hours of secondary drying at 50°C. Externally, the dry foam (mechanically stable vitreous foam) appeared very uniform from vial to vial with no visible splashes.
Измерение температуры стеклования (Tg)Glass transition temperature measurement (Tg)
[0097] Цель: измерение Tg PBV образцов альбумина, взятых из различных областей лотка для высушивания, для проверки равномерности условий высушивания в лиофилизаторе.[0097] Purpose: To measure the Tg PBV of albumin samples taken from different areas of the drying tray to check the uniformity of the drying conditions in the lyophilizer.
[0098] Экспериментальная процедура: 5 флаконов с образцами PBV альбумина собирали из четырех углов полного лотка для высушивания (всего 20 флаконов с образцами). 3 DSC кювета для образцов получали с применением сухого материала из каждого флакона в сушильном отделении. Каждый образец содержал примерно 5 мг вручную размолотой PBV-пены. Анализ кювет для образцов проводили в DSC 8000 с помощью автоматического дозатора (Perkin Elmer, Массачусетс, США). Каждую кювету сканировали при температуре от -50°С до 80°С со скоростью 20°С/мин, a Tg рассчитывали с применением программного обеспечения Pyris Data Analysis (см. пример расчета ниже).[0098] Experimental procedure: 5 PBV albumin sample vials were collected from four corners of a full drying tray (20 sample vials in total). 3 DSC sample cuvettes were prepared using dry material from each vial in the dryer compartment. Each sample contained approximately 5 mg of hand ground PBV foam. Sample cuvettes were analyzed in a DSC 8000 using an automatic dispenser (Perkin Elmer, Massachusetts, USA). Each cuvette was scanned at -50°C to 80°C at 20°C/min and Tg was calculated using Pyris Data Analysis software (see calculation example below).
[0099] Результаты.[0099] Results.
Измерения водной активностиWater activity measurements
[0100] Цель: измерение водной активности (aw) PBV образцов альбумина, взятых из различных областей лотка для высушивания, для проверки равномерности условий высушивания в лиофилизаторе.[0100] Purpose: To measure the water activity (aw) of the PBV of albumin samples taken from different areas of the drying tray to check the uniformity of the drying conditions in the lyophilizer.
[0101] Экспериментальная процедура: 5 флаконов с образцами PBV альбумина собирали из четырех углов полного лотка для высушивания (всего 20 флаконов с образцами). PBV-пену в каждом флаконе вручную размалывали в порошок. Примерно 150 мг порошка из каждого флакона тестировали с помощью измерителя для водной активности Aqualab 4ТЕ (Decagon Devices, Вашингтон, США), помещенном в сушильное отделение.[0101] Experimental procedure: 5 PBV albumin sample vials were collected from four corners of a full drying tray (20 sample vials in total). The PBV foam in each vial was manually ground to a powder. Approximately 150 mg of powder from each vial was tested using an Aqualab 4TE water activity meter (Decagon Devices, Washington, USA) placed in the dryer compartment.
[0102] Результаты.[0102] Results.
Пример 5. Высушивание внутри 1-литровых пластиковых бутылок, накрытых и изолированных от среды камеры 0,2 мкм фильтром стерилизации (мембраной).Example 5 Drying inside 1 liter plastic bottles covered and isolated from the chamber environment with a 0.2 µm sterilization filter (membrane).
[0103] РМ получали аналогично предыдущему примеру и заполняли 1-литровые пластиковые контейнеры 150 г/контейнер. После получения РМ каждый контейнер накрывали 0,2 мкм фильтром, используемым для стерилизации водных растворов.[0103] PM was prepared similarly to the previous example, and 1 liter plastic containers were filled with 150 g/container. After receiving the RM, each container was covered with a 0.2 μm filter used to sterilize aqueous solutions.
[0104] Температуру хранения понижали до -18°С, после этого вакуумметрическое давление понижали до менее 0,1 торр и сохраняли равным 0,1 торр до конца процесса.[0104] The storage temperature was lowered to -18°C, after which the vacuum pressure was lowered to less than 0.1 Torr and kept equal to 0.1 Torr until the end of the process.
Далее температуру хранения повышали до 30°С и сохраняли при 30°С в течение 24 часов. Затем температуру хранения повышали до 40°С и сохраняли при 40°С в течение 24 часов.Next, the storage temperature was raised to 30°C and kept at 30°C for 24 hours. Then the storage temperature was raised to 40°C and kept at 40°C for 24 hours.
Пример 6. Консервация живой ослабленной гриппозной вакцины (LAIV)Example 6 Preservation of Live Attenuated Influenza Vaccine (LAIV)
[0105] Единственный исходный раствор с высоким титром замороженного штамма LAIV (A/17/Texas/2012/30 (H3N2)) консервировали с применением технологии консервации путем выпаривания (PBV). Для консервации LAIV размораживали и смешивали 1:1 с различными растворами для консервации (PS) с рН 7 с образованием подлежащих консервации смесей (РМ). РМ распределяли в пенициллиновые флаконы и высушивали с применением способа PBV с температурами вторичного высушивания, составляющими 45°С и 50°С. Испытание активности различных вакцинных препаратов проводили с применением модифицированного протокола анализа LAIV TCID50, предоставленного CDC. Эксперимент Flu-1.[0105] A single high titer stock solution of a frozen LAIV strain (A/17/Texas/2012/30 (H3N2)) was preserved using evaporation preservation (PBV) technology. For preservation, LAIV was thawed and mixed 1:1 with various preservation solutions (PS) at pH 7 to form mixtures to be preserved (PM). PM was dispensed into penicillin vials and dried using the PBV method with secondary drying temperatures of 45°C and 50°C. Activity testing of various vaccine formulations was performed using a modified LAIV TCID50 assay protocol provided by the CDC. Experiment Flu-1.
[0106] В эксперименте Flu-1 применяли 7 различных PS, содержащих:[0106] In the Flu-1 experiment, 7 different PSs were used containing:
[0107] PS1: сахарозы 30%, метилглюкозида (MAG) 10%, желатина 0,5%;[0107] PS1:
[0108] PS2: сахарозы 30%, метилглюкозида (MAG) 1170%, альбумина 0,5%;[0108] PS2:
[0109] PS3: сахарозы 30%, маннита 10%;[0109] PS3:
[0110] PS4: сахарозы 30%, маннита 10%, желатина 0,5%;[0110] PS4:
[0111] PS5: сахарозы 30%, ацетоглюкозы 10%;[0111] PS5:
[0112] PS6: сахарозы 30%, ацетоглюкозы 10%, желатина 0,5%; и[0112] PS6:
[0113] PS7: сахарозы 30%, MAG 10%.[0113] PS7:
[0114] К сожалению, PS6 кристаллизировался во время высушивания и впоследствии не изучался. Авторы настоящего изобретения предположили, что раствор PS6 был перенасыщен и желатин каким-то образом влиял на образование кристаллов ацетоглюкозы.[0114] Unfortunately, PS6 crystallized during drying and was not subsequently studied. The authors of the present invention suggested that the PS6 solution was supersaturated and gelatin somehow influenced the formation of crystals of acetoglucose.
[0115] Результаты. Активность (log10 TCID50/мл) высушенной вакцины после PBV и последующих 1,6 лет хранения при комнатной температуре (к. т.) показана в таблице ниже.
Эксперимент Flu-2.Flu-2 experiment.
[0116] В эксперименте Flu-2 авторы настоящего изобретения применяли PS, содержащий низкую концентрацию маннита (33% сахарозы+7% маннита) и температуру вторичного высушивания 50°С.[0116] In the Flu-2 experiment, the present inventors used PS containing a low concentration of mannitol (33% sucrose + 7% mannitol) and a secondary drying temperature of 50°C.
[0117] Данный эксперимент проводили во время, когда авторы настоящего изобретения впервые настраивали и оптимизировали свой внутренний протокол TCID50, и по этой причине авторы настоящего изобретения впервые измеряли активность консервированной вакцины только после 5 месяцев хранения при к. т., когда установили надежный способ измерения в рамках анализа. Титр вакцины (2Е7 TCID50/мл) проявлял снижение активности всего на 0,62 log по сравнению с замороженным контролем после высушивания PBV и 5 месяцев хранения при комнатной температуре. Образцы из данного препарата применяли в исследованиях микронизации ниже.[0117] This experiment was performed at a time when the present inventors were first setting up and optimizing their internal TCID50 protocol, and for this reason, the present inventors measured the potency of the canned vaccine for the first time only after 5 months of storage at RT, when they had established a reliable measurement method within the scope of the analysis. The titer of the vaccine (2E7 TCID 50 /ml) showed a decrease in activity of only 0.62 log compared to the frozen control after drying PBV and 5 months storage at room temperature. Samples from this formulation were used in the micronization studies below.
Эксперимент Flu-3.Experiment Flu-3.
[0118] В эксперименте Flu-3 авторы настоящего изобретения исследовали несколько новых составов, включая один с дополнительно сниженной концентрацией маннита (35% сахарозы + 5% маннита), и поддерживали более высокую температуру вторичного высушивания, составляющую 50°С.[0118] In the Flu-3 experiment, the present inventors tested several new formulations, including one with an additional reduced concentration of mannitol (35% sucrose + 5% mannitol), and maintained a higher secondary drying temperature of 50°C.
[0119] Результаты. Активность (TCID50/мл) составов FLU-3 после хранения при комнатной температуре (к. т.) и 37°С показаны в таблице ниже.[0119] Results. The activity (TCID 50 /ml) of the FLU-3 formulations after storage at room temperature (RT) and 37° C. is shown in the table below.
[0120] Вывод. Высушивание PBV LAIV с помощью состава с 35% сахарозы и 5% маннита способом, который включает стадию вторичного высушивания при 50°С, позволяет получить термостабильную LAIV.[0120] Conclusion. Drying PBV LAIV with a formulation of 35% sucrose and 5% mannitol in a manner that includes a secondary drying step at 50° C. allows thermostable LAIV to be obtained.
Пример 7. Получение сухой порошкообразной термостабилъной LAIV с диапазоном частиц, подходящим для доставки через слизистую оболочку носа, с применением технологии шарового размолаExample 7 Preparation of Dry Powdered Heat-Stable LAIV with a Particle Range Suitable for Nasal Mucosal Delivery Using Ball Milling Technology
Шаровой размол плацебо сухого PBV-составаBall milling placebo dry PBV formulation
[0121] Сперва авторы настоящего изобретения изучали шаровой размол PBV-составов с применением образцов плацебо. Образцы плацебо получали и оценивали следующим образом:[0121] First, the present inventors studied ball milling of PBV formulations using placebo samples. Placebo samples were received and evaluated as follows:
[0122] (i) для получения плацебо РМ, 100 г стерильной среды для культивирования клеток смешивали со 100 г PS, содержащим 33% сахарозы и 7% маннита; [0123] (ii) перед высушиванием РМ разделяли на аликвоты в 20 мл пенициллиновые флаконы (2 мл/флакон);[0122] (i) to obtain placebo PM, 100 g of sterile cell culture medium was mixed with 100 g of PS containing 33% sucrose and 7% mannitol; [0123] (ii) PM was aliquoted into 20 ml penicillin vials (2 ml/vial) before drying;
[0124] (iii) материал подвергали тому же протоколу PBV, который применяли для высушивания вакцины в ранних экспериментах с 1 дневным вторичным высушиванием при 45°С;[0124] (iii) the material was subjected to the same PBV protocol that was used to dry the vaccine in the early experiments with 1 day secondary drying at 45°C;
[0125] (iv) после высушивания плацебо PBV-пену сначала измельчали внутри пенициллиновых флаконов стерильным шпателем для разрушения PBV-пены, уменьшая размер частицы до нескольких сотен микрон;[0125] (iv) after placebo drying, the PBV foam was first pulverized inside the penicillin vials with a sterile spatula to break up the PBV foam, reducing the particle size to a few hundred microns;
[0126] (v) последующую микронизацию проводили с применением шаровой мельницы в лабораторных масштабах LabWizz в течение периодов времени 45, 75 или 90 минут с частотой 15 Гц, которую авторы настоящего изобретения ранее определили как подходящую частоту для получения частиц размером приблизительно 20 микрон;[0126] (v) post-micronization was performed using a LabWizz lab scale ball mill for periods of 45, 75, or 90 minutes at a frequency of 15 Hz, which the present inventors had previously determined to be a suitable frequency to obtain approximately 20 micron particles;
[0127] (vi) порошок пропускали через медное сито с размером отверстий сита 63 мкм для удаления любых комков или более крупных частиц. Части порошкообразного материала, которые не проходили через сито, регистрировали. Размер отверстий сита был выбран равным 63 мкм, поскольку этот размер указан для просеивания лактозного порошка LactoHale, который применяют в качестве разбавителя сухого порошка в препарате сухой вакцины LAIV для доставки через дыхательные пути. Авторы настоящего изобретения также обнаружили, что частицы, которые могут проходить через данное сито, существенно меньше, чем 63 мкм и хорошо подходят для доставки через дыхательные пути; и[0127] (vi) The powder was passed through a 63 µm copper sieve to remove any lumps or larger particles. The portions of the powdered material that did not pass through the sieve were recorded. The sieve size was chosen to be 63 µm because this size is specified for sifting LactoHale lactose powder, which is used as a dry powder diluent in the LAIV dry vaccine formulation for respiratory delivery. The present inventors have also found that the particles that can pass through this sieve are substantially smaller than 63 microns and are well suited for inhalation delivery; And
[0128] (vii) порошки суспендировали в минеральном масле внутри сушильного отделения и оценивали с применением традиционной микроскопии.[0128] (vii) the powders were suspended in mineral oil inside a drying chamber and evaluated using conventional microscopy.
[0129] Авторы настоящего изобретения обнаружили (см. таблицу ниже), что шарового размола PBV-пены до размеров частиц, достаточных для доставки через дыхательные пути, можно достичь с применением встряхивания с частотой 15 Гц и времени размалывания, находящегося в диапазоне 45-90 минут. Более короткое время размалывания, как правило, приводило к получению более разнообразных размеров частиц, увеличивая процентное содержание частиц, которые не проходили через сито с размером ячейки 63 мкм. Авторы настоящего изобретения пришли к выводу, что 75 минут размалывания при встряхивании с частотой 15 Гц представляют собой оптимальный протокол для получения микронизированных порошков вакцины для доставки через дыхательные пути.[0129] The present inventors have found (see table below) that ball milling of PBV foam to particle sizes sufficient for respiratory delivery can be achieved using 15 Hz shaking and a milling time ranging from 45-90 minutes. Shorter milling times generally resulted in more variable particle sizes, increasing the percentage of particles that did not pass through the 63 µm sieve. The present inventors have concluded that 75 minutes of milling with 15 Hz shaking is the optimal protocol for preparing micronized vaccine powders for respiratory delivery.
[0130] Результаты проиллюстрированы на фиг. 2.[0130] The results are illustrated in FIG. 2.
Активность PBV LAIV после микронизации и последующего хранения.PBV LAIV activity after micronization and subsequent storage.
[0131] В этой части исследования авторы настоящего изобретения оценивали влияние времени размалывания на вакцину, полученную в эксперименте Flu-2 с применением PS, содержащего 33% сахарозы и 7% маннита. Микронизацию вакцины проводили как описано выше, то есть для образцов плацебо.[0131] In this part of the study, the authors of the present invention evaluated the effect of grinding time on the vaccine obtained in the Flu-2 experiment using PS containing 33% sucrose and 7% mannitol. Vaccine micronization was performed as described above, i.e. for placebo samples.
[0132] Результаты. Активность (TCID50) на миллиграмм сухого порошка PBV[0132] Results. Activity (TCID50) per milligram dry PBV powder
LAIV, микронизированного при 15 Гц в течение 45, 75 и 90 минут и последующих 1,5 месяца хранения при 4°С, к. т. и 37°С, показана ниже.LAIV micronized at 15 Hz for 45, 75, and 90 minutes followed by 1.5 months of storage at 4°C, rt and 37°C, is shown below.
[0133] Шаровой размол приводил к низкой потере активности и микронизированная вакцина оставалась устойчивой при к. т.в течение по меньшей мере 1,5 месяца. Однако, авторы настоящего изобретения обнаружили значительное снижение стабильности микронизированной вакцины во время хранения при 37°С по сравнению с немикронизированными вакцинными препаратами. Это может быть связанно с кристаллизацией маннита или сахарозы из перенасыщенного сахарозой/маннитом стекловидного вещества. Эта кристаллизация может быть инициирована образованием кристаллов маннита на поверхности трещин, возникающих во время размалывания.[0133] Ball milling resulted in a low loss of potency and the micronized vaccine remained stable at RT for at least 1.5 months. However, the authors of the present invention found a significant decrease in the stability of the micronized vaccine during storage at 37°C compared to non-micronized vaccine preparations. This may be due to the crystallization of mannitol or sucrose from the glassy substance supersaturated with sucrose/mannitol. This crystallization can be initiated by the formation of mannitol crystals on the surface of cracks that occur during milling.
Пример 8. Влияние микронизации на PBV-консервированную живую ослабленную ротавирусную вакцину (LARV).Example 8 Effect of Micronization on PBV Preserved Live Attenuated Rotavirus Vaccine (LARV).
[0134] Вакцину LARV смешивали 1:1 с PS, содержащим 30% сахарозы и 10% маннита, и консервировали путем PBV. Как и в случае с обсуждаемой в настоящее время вакциной против гриппа, уменьшение размера частицы проводили в две стадии: размалывание вручную с последующим шаровым размолом (микронизация) с применением шаровой мельницы лабораторных размеров Laarmann Labwizz. Сначала флаконы, которые хранили при комнатной температуре в течение 3 месяцев, открывали и сухой вспененный материал во флаконах размалывали вручную с применением шпателя в сушильном отделении при относительной влажности 15-18%. Примерно 120 мг пены, которую размалывали вручную, извлекали из каждого флакона. Размер частицы после размалывания вручную, как правило, составлял несколько сотен микрон. Затем пену, которую размалывали вручную, помещали в 2 мл металлические контейнеры, содержащие 3×2 мм стальные шарики каждый. Контейнеры помещали внутрь шаровой мельницы и встряхивали со скоростью 15 Гц в течение 30 минут для уменьшения размера частиц до примерно 50 микрон. Часть порошков высушивали под вакуумом в течение одного дня при 45°С.[0134] The LARV vaccine was mixed 1:1 with PS containing 30% sucrose and 10% mannitol and preserved by PBV. As with the currently discussed influenza vaccine, particle size reduction was carried out in two steps: manual milling followed by ball milling (micronization) using a Laarmann Labwizz lab sized ball mill. First, the vials, which had been stored at room temperature for 3 months, were opened and the dry foam in the vials was ground by hand using a spatula in a dryer at a relative humidity of 15-18%. Approximately 120 mg of foam, which was ground by hand, was removed from each vial. The particle size after grinding by hand, as a rule, was several hundred microns. The foam, which had been ground by hand, was then placed in 2 ml metal containers containing 3×2 mm steel balls each. The containers were placed inside a ball mill and shaken at 15 Hz for 30 minutes to reduce the particle size to about 50 microns. Some of the powders were dried under vacuum for one day at 45°C.
[0135] Авторы настоящего изобретения обнаружили, что потеря вирусной активности после микронизации и последующих 5 месяцев хранения при к. т.была очень маленькой (<0,2 log). Однако, после 5 месяцев хранения при 37°С авторы настоящего изобретения наблюдали потерю 0,8 log активности, чего не наблюдали для немикронизированных составов. Это наблюдение коррелирует со снижением стабильности вакцины против гриппа PBV после микронизации выше.[0135] The authors of the present invention found that the loss of viral activity after micronization and subsequent 5 months of storage at RT was very small (<0.2 log). However, after 5 months of storage at 37°C, the present inventors observed a loss of 0.8 log of activity, which was not observed for non-micronized formulations. This observation correlates with a decrease in the stability of the PBV influenza vaccine after micronization above.
[0136] Измерения авторов настоящего изобретения Tg с применением дифференциального сканирующего калориметра подтвердили рабочую гипотезу о том, что снижение вирусной активности при 37°С в микронизированных образцах может быть ассоциировано с кристаллизацией сахара из кристаллов, образующихся на поверхности фракций.[0136] The inventors' measurements of Tg using a differential scanning calorimeter supported the working hypothesis that the reduction in viral activity at 37°C in micronized samples may be associated with the crystallization of sugar from crystals formed on the surface of the fractions.
[0137] Авторы настоящего изобретения исследовали составы PBV, полученные с помощью PS, содержащего 30% сахарозы и 10% маннита. Для каждого состава авторы настоящего изобретения получали 3 независимых образца, герметично запечатанных в алюминиевых кюветах. С немикронизированными составами авторы настоящего изобретения не обнаружили никаких неожиданных результатов и смогли измерить Tg во время первого, второго и третьего прогона DSC, находящуюся в диапазоне от -50 до 80°С. См. фиг. 3, на которой показано сканирование DSC порошка Rota-1 РМ4, который размалывали вручную, без микронизации, 3 прогона.[0137] The authors of the present invention investigated the formulations of PBV obtained using PS containing 30% sucrose and 10% mannitol. For each composition, the authors of the present invention received 3 independent samples, hermetically sealed in aluminum cuvettes. With non-micronized formulations, the present inventors found no unexpected results and were able to measure Tg during the first, second and third DSC run ranging from -50 to 80°C. See fig. 3, which shows a DSC scan of a Rota-1 PM4 powder that was hand milled, no micronization, 3 runs.
[0138] Однако только для микронизированного порошка первые прогоны каждой кюветы для образцов характеризовались наблюдаемым поведением перехода в стеклообразное состояние, после чего авторы настоящего изобретения четко наблюдали быстрое снижение выхода DSC, ассоциированное с кристаллизацией во время нагревания. Данное явление, также известное как расстеклование, часто наблюдают в метастабильных перенасыщенных смесях выше температуры стеклования, когда низкая вязкость не останавливает рост кристаллов, которые часто формируются на поверхности фракции в стеклообразном состоянии. На фиг. 4 показаны прогоны DSC для сухого микронизированного состава РМ4.[0138] However, only for the micronized powder, the first runs of each sample pan exhibited an observed glass transition behavior, after which the present inventors clearly observed a rapid decrease in DSC yield associated with crystallization during heating. This phenomenon, also known as devitrification, is often observed in metastable supersaturated mixtures above the glass transition temperature, when low viscosity does not stop the growth of crystals, which often form on the surface of the fraction in a glassy state. In FIG. 4 shows DSC runs for a dry micronized PM4 formulation.
[0139] Расстеклование представляет собой необратимый кинетический процесс кристаллизации в перенасыщенных растворах, которые не кристаллизируются во время охлаждения, и, таким образом, формируют устойчивые стекловидные вещества при температуре ниже Tg. Как правило, кристаллизация во время охлаждения не происходит, поскольку ядра кристаллов образуются при температурах ниже температуры, при которой кристаллы могут расти, или образование кристаллов может происходить только на поверхности трещин стеклообразного вещества. Во время нагревания выше Tg, когда вязкость раствора уменьшается, кристаллическое ядро, которое формируется при более низких температурах, начинает расти со скоростью, которая увеличивается с увеличением температуры, что необратимо преобразовывает материал в кристаллизированное состояние. Чем выше Tg, тем выше температура, при которой происходит расстеклование для данной скорости нагревания.[0139] Devitrification is an irreversible kinetic crystallization process in supersaturated solutions that do not crystallize during cooling, and thus form stable glassy substances below Tg. As a rule, crystallization does not occur during cooling, since crystal nuclei form at temperatures below the temperature at which crystals can grow, or crystal formation can only occur at the surface of cracks in the glassy substance. During heating above Tg, as the viscosity of the solution decreases, the crystal core that forms at lower temperatures begins to grow at a rate that increases with increasing temperature, which irreversibly transforms the material into a crystallized state. The higher the Tg, the higher the temperature at which devitrification occurs for a given heating rate.
[0140] Авторы настоящего изобретения также измеряли Tg в образцах микронизированного сухого состава, который высушивали в течение дополнительного дня при 45°С под вакуумом. В этих образцах не обнаружили эффекта расстеклования во время нагревания из стеклообразного состояния. Прогоны DSC для сухого микронизированного состава РМ4 после дополнительного высушивания при 45°С показаны на фиг. 5.[0140] The authors of the present invention also measured Tg in samples of micronized dry composition, which was dried for an additional day at 45°C under vacuum. In these samples, no devitrification effect was found during heating from the glassy state. The DSC runs for the dry micronized PM4 formulation after further drying at 45°C are shown in FIG. 5.
[0141] После дополнительного высушивания сухого микронизированного состава результаты измерения Tg были в значительной степени выше (Tg была немного выше 50°С), чем результаты, полученные для микронизированного состава (Tg была немного выше 30°С), который не подвергали стадии дополнительного высушивания. Это объясняет, почему не наблюдали расстеклование в дополнительно высушенных порошках.[0141] After additional drying of the dry micronized composition, the Tg measurements were significantly higher (Tg was slightly above 50°C) than the results obtained for the micronized composition (Tg was slightly above 30°C), which was not subjected to the additional drying step . This explains why no devitrification was observed in the further dried powders.
[0142] Расстеклование не обязательно происходит во всех стекловидных смесях и зависит от состава смеси. В соответствии с предварительными наблюдениями авторов настоящего изобретения оно более выражено в смесях, содержащих маннит, по сравнению со смесями, содержащими MAG. В данном документе предполагается, что увеличение Tg уменьшит или устранит расстеклование.[0142] Devitrification does not necessarily occur in all glassy mixtures and depends on the composition of the mixture. In accordance with the preliminary observations of the authors of the present invention, it is more pronounced in mixtures containing mannitol, compared with mixtures containing MAG. This document assumes that increasing Tg will reduce or eliminate devitrification.
ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬINDUSTRIAL APPLICABILITY
[0143] Заявленное изобретение применимо в фармацевтической промышленности, в частности в вакцинной промышленности, хотя в других частях фармацевтической промышленности является также применимым.[0143] The claimed invention is applicable in the pharmaceutical industry, in particular in the vaccine industry, although it is also applicable in other parts of the pharmaceutical industry.
СПИСОК ССЫЛОКLIST OF LINKS
[0144] Патент США №9469835, выданный 18 октября 2016 года.[0144] U.S. Patent No. 9,469,835 issued October 18, 2016.
[0145] Pushkar, N.S. и V.L. Bronshtein. 1988. The mechanism of ice formation on[0145] Pushkar, N.S. and V.L. Bronstein. 1988. The mechanism of ice formation on
rewarming of the frozen cryoprotectant solutions. Proc. Ukrainian Acad. Sci. 10: 68-70.rewarming of the frozen cryoprotectant solutions. Proc. Ukrainian Acad. sci. 10:68-70.
Claims (23)
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201762604591P | 2017-07-11 | 2017-07-11 | |
| US62/604,591 | 2017-07-11 | ||
| PCT/US2018/041626 WO2019014338A1 (en) | 2017-07-11 | 2018-07-11 | Method for preserving biopharmaceuticals |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2020103377A RU2020103377A (en) | 2021-08-11 |
| RU2020103377A3 RU2020103377A3 (en) | 2022-03-31 |
| RU2790039C2 true RU2790039C2 (en) | 2023-02-14 |
Family
ID=
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6673838B2 (en) * | 2001-02-12 | 2004-01-06 | Wyeth | Succinate salt of O-desmethyl-venlafaxine |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6673838B2 (en) * | 2001-02-12 | 2004-01-06 | Wyeth | Succinate salt of O-desmethyl-venlafaxine |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4902103B2 (en) | Preservation of bioactive materials in lyophilized foam | |
| US9469835B2 (en) | Preservation by vaporization | |
| JP5307801B2 (en) | Preservation of bioactive materials by freeze-drying foam | |
| Shukla | Freeze drying process: A review | |
| JPH05126696A (en) | Method and apparatus for preparing biological suspension at low temperature, drying and stabilizing liquidand reproducing water again | |
| EP1231837A2 (en) | Preservation of sensitive biological material | |
| JP7198264B2 (en) | Methods for storing biopharmaceuticals | |
| Kumar et al. | Fundamentals and applications of lyophilization | |
| US20140193456A1 (en) | Method for Drying-Conservation of Natural Substances | |
| RU2790039C2 (en) | Method for preservation of biopharmaceuticals | |
| WO2001037804A2 (en) | Preservation and formulation of bioactive materials | |
| AU2012204056B2 (en) | Preservation by vaporization | |
| Kasper et al. | Lyophilization of synthetic gene carriers | |
| Pandhare et al. | REVIEW ON: LYOPHILIZATION PROCESS OF PHARMACEUTICALS. | |
| Mariner | The use of lyophilization in the |