RU2761876C1

RU2761876C1 - Humanised 5d3hu antibody binding to the prame tumour antigen, dna fragments encoding said antibody, and antigen-binding fragment of the antibody

Info

Publication number: RU2761876C1
Application number: RU2020139036A
Authority: RU
Inventors: Теймур Кантамирович Алиев; Михаил Петрович Кирпичников; Екатерина Николаевна ЛАРИНА; Мария Викторовна Ларина; Всеволод Андреевич Мисюрин; Ольга Николаевна Солопова; Юлия Павловна Финашутина
Priority date: 2020-11-27
Filing date: 2020-11-27
Publication date: 2021-12-13

Abstract

FIELD: biotechnology.SUBSTANCE: described are a humanised monoclonal antibody selectively binding to the human PRAME tumour antigen, as well as DNA fragments encoding sections of the light and heavy chains of said antibody, and an antigen-binding fragment of said humanised monoclonal antibody.EFFECT: invention provides a possibility of producing a new humanised monoclonal antibody of the IgG1 isotype, capable of binding to the human PRAME tumour antigen, and characterised by the antigen-antibody complex dissociation constant of 1.2 nM.4 cl, 7 dwg, 6 ex

Description

Область техникиTechnology area

Изобретение относится к биотехнологии и биохимии, а именно к гуманизированному моноклональному антителу, связывающемуся c опухолевым антигеном PRAME человека, а также изолированному фрагменту ДНК, кодирующему участки легкой и тяжелой цепи указанного антитела, и антиген-связывающему фрагменту указанного моноклонального антитела. Специфичность моноклонального антитела к опухолевому антигену PRAME человека подтверждена методами иммуноблоттинга и измерения константы диссоциации комплекса антитела с антигеном с использованием биосенсора в реальном времени.The invention relates to biotechnology and biochemistry, namely to a humanized monoclonal antibody that binds to a human PRAME tumor antigen, as well as an isolated DNA fragment encoding portions of the light and heavy chains of said antibody, and an antigen-binding fragment of said monoclonal antibody. The specificity of the monoclonal antibody to human PRAME tumor antigen was confirmed by immunoblotting and real-time measurement of the dissociation constant of the antibody-antigen complex using a biosensor.

Уровень техникиState of the art

Антиген PRAME, представляющий собой значимую мишень для моноклональных антител, является онкоспецифическим маркером, который активен на всех стадиях дифференцировки опухолевых клеток, и вызывает спонтанный T-клеточный ответ. Иммуногенность опухолевых клеток во многом опосредована активностью раково-тестикулярных антигенов. Эти антигены экспрессируются в различных тканях эмбриона, но неактивны у взрослого человека, за исключением клеток гамет. Поскольку гаметы расположены в иммунопривилегированных областях организма человека, раково-тестикулярные антигены не могут быть представлены иммунной системе.The PRAME antigen, which is a significant target for monoclonal antibodies, is a cancer-specific marker that is active at all stages of tumor cell differentiation and induces a spontaneous T-cell response. The immunogenicity of tumor cells is largely mediated by the activity of testicular cancer antigens. These antigens are expressed in various tissues of the embryo, but are inactive in the adult, with the exception of gamete cells. Since gametes are located in immunoprivileged areas of the human body, testicular cancer antigens cannot be presented to the immune system.

Белок PRAME был открыт при исследовании причин спонтанной ремиссии меланомы у человека. Опухолевые клетки больного LB33, из которых была получена клеточная линия, подвергались атаке аутологичных CD8-позитивных T-клеток. Белок PRAME состоит из 509 аминокислотных остатков, в его структуре было выявлено большое количество потенциальных T-клеточных эпитопов. Наиболее изученным является взаимодействие пептидов белка PRAME с молекулой главного комплекса гистосовместимости HLA-A2, которая является наиболее распространенным вариантом в генотипе европейцев. Из множества предсказанных пептидов 19 демонстрировали высокую аффинность связывания с молекулой HLA-A2 [ Kessler J.H., Beekman N.J., Bres-Vloemans S.A., Verdijk P., van Veelen P.A., Kloosterman-Joosten A.M., Vissers D.C., ten Bosch G.J., Kester M.G., Sijts A., Wouter Drijfhout J., Ossendorp F., Offringa R., and Melief C.J. (2001) Efficient identification of novel HLA-A(*)0201-presented cytotoxic T lymphocyte epitopes in the widely expressed tumor antigen PRAME by proteasome-mediated digestion analysis. J Exp Med. 193(1): p. 73-88]. Большое разнообразие иммуногенных эпитопов делает белок PRAME очень привлекательным для использования в терапии. При сопоставлении иммуногенности белков PRAME и BCR-ABL, характерного для хронического миелоидного лейкоза, последний показал очень низкую иммуногенность. Объясняется это тем, что BCR-ABL образован двумя белками, которые экспрессируются в соматических тканях человека и поэтому являются неиммуногенными. Однако остальные известные раково-тестикулярные антигены (РТА), такие как MAGE-A3, SSXIP2, HAGE и некоторые другие, реже по сравнению с PRAME вызывают T-клеточный иммунный ответ [ Greiner J., Schmitt M., Li L., Giannopoulos K., Bosch K., Schmitt A., Dohner K., Schlenk R.F., Pollack J.R., Dohner H., and Bullinger L. (2006) Expression of tumor-associated antigens in acute myeloid leukemia: Implications for specific immunotherapeutic approaches. Blood. 108(13): p. 4109-4117.]; [ Schneider V., Zhang L., Rojewski M., Fekete N., Schrezenmeier H., Erle A., Bullinger L., Hofmann S., Gotz M., Dohner K., Ihme S., Dohner H., Buske C., Feuring-Buske M., and Greiner J. (2015) Leukemic progenitor cells are susceptible to targeting by stimulated cytotoxic T cells against immunogenic leukemia-associated antigens. Int J Cancer. 137(9): p. 2083-2092.]; [ Babiak A., Steinhauser M., Gotz M., Herbst C., Dohner H., and Greiner J. (2014) Frequent T cell responses against immunogenic targets in lung cancer patients for targeted immunotherapy. Oncol Rep. 31(1): p. 384-390.]. Белок PRAME относится к группе РТА, экспрессирующихся в основном в клетках гамет и в опухолевых клетках.The PRAME protein was discovered in the study of the causes of spontaneous remission of melanoma in humans. The tumor cells of patient LB33, from which the cell line was derived, were attacked by autologous CD8-positive T cells. The PRAME protein consists of 509 amino acid residues, and a large number of potential T-cell epitopes have been identified in its structure. The most studied is the interaction of the PRAME protein peptides with the HLA-A2 major histocompatibility complex molecule, which is the most common variant in the European genotype. Of the many predicted peptides, 19 showed high binding affinity to the HLA-A2 molecule [Kessler JH, Beekman NJ, Bres-Vloemans SA, Verdijk P., van Veelen PA, Kloosterman-Joosten AM, Vissers DC, ten Bosch GJ, Kester MG, Sijts A., Wouter Drijfhout J., Ossendorp F., Offringa R., and Melief CJ (2001) Efficient identification of novel HLA-A (*) 0201-presented cytotoxic T lymphocyte epitopes in the widely expressed tumor antigen PRAME by proteasome-mediated digestion analysis. J Exp Med. 193 (1): p. 73-88]. The wide variety of immunogenic epitopes makes the PRAME protein very attractive for use in therapy. When comparing the immunogenicity of the PRAME and BCR-ABL proteins, characteristic of chronic myeloid leukemia, the latter showed very low immunogenicity. This is explained by the fact that BCR-ABL is formed by two proteins that are expressed in human somatic tissues and therefore are non-immunogenic. However, the rest of the known testicular cancer antigens (PTA), such as MAGE-A3, SSXIP2, HAGE and some others, less often in comparison with PRAME, cause a T-cell immune response [Greiner J., Schmitt M., Li L., Giannopoulos K ., Bosch K., Schmitt A., Dohner K., Schlenk RF, Pollack JR, Dohner H., and Bullinger L. (2006) Expression of tumor-associated antigens in acute myeloid leukemia: Implications for specific immunotherapeutic approaches. Blood. 108 (13): p. 4109-4117.]; [Schneider V., Zhang L., Rojewski M., Fekete N., Schrezenmeier H., Erle A., Bullinger L., Hofmann S., Gotz M., Dohner K., Ihme S., Dohner H., Buske C., Feuring-Buske M., and Greiner J. (2015) Leukemic progenitor cells are susceptible to targeting by stimulated cytotoxic T cells against immunogenic leukemia-associated antigens. Int J Cancer. 137 (9): p. 2083-2092.]; [Babiak A., Steinhauser M., Gotz M., Herbst C., Dohner H., and Greiner J. (2014) Frequent T cell responses against immunogenic targets in lung cancer patients for targeted immunotherapy. Oncol Rep. 31 (1): p. 384-390.]. The PRAME protein belongs to the PTA group, which is expressed mainly in gamete cells and tumor cells.

При меланоме и некоторых других солидных опухолях экспрессия PRAME в основном ассоциирована с метастазированием и лекарственной устойчивостью, а также с неблагоприятным исходом заболевания. При солидных опухолях негативное влияние на прогноз заболевания объясняется функциями белка. Так, PRAME блокирует сигнальный путь ретиноевой кислоты, в результате чего останавливается дифференцировка клеток [Epping M.T., Wang L., Edel M.J., Carlee L., Hernandez M., and Bernards R. (2005) The human tumor antigen PRAME is a dominant repressor of retinoic acid receptor signaling. Cell. 122(6): p. 835-847.]. Экспрессия PRAME наблюдается при меланоме (100% случаев), раке головы и шеи (в 39% случаев), мелкоклеточном раке лёгких (25%), аденокарциноме лёгких (46%), раке почки (61%), раке простаты (10%), раке мочевого пузыря (9%), раке щитовидной железы (60%), cаркомах (29%), хроническом лимфоидном лейкозе (16-50%), нейробластоме (67%), медуллабластоме (30%), детских острых милеомных лейкозах (75%), множественной миеломе (25%), неходжкинских лимфомах, в том числе при лимфогрануломатозе (лимфоме Ходжкина) (67%). Клетки Березовского – опухолевый субстрат лимфомы Ходжкина.In melanoma and some other solid tumors, PRAME expression is mainly associated with metastasis and drug resistance, as well as with poor disease outcomes. In solid tumors, the negative effect on the prognosis of the disease is explained by the functions of the protein. So, PRAME blocks the signaling pathway of retinoic acid, as a result of which cell differentiation stops [Epping MT, Wang L., Edel MJ, Carlee L., Hernandez M., and Bernards R. (2005) The human tumor antigen PRAME is a dominant repressor of retinoic acid receptor signaling. Cell. 122 (6): p. 835-847.]. PRAME expression is observed in melanoma (100% of cases), head and neck cancer (in 39% of cases), small cell lung cancer (25%), lung adenocarcinoma (46%), kidney cancer (61%), prostate cancer (10%) , bladder cancer (9%), thyroid cancer (60%), sarcomas (29%), chronic lymphoid leukemia (16-50%), neuroblastoma (67%), medullablastoma (30%), childhood acute myeoma leukemias ( 75%), multiple myeloma (25%), non-Hodgkin's lymphomas, including lymphogranulomatosis (Hodgkin's lymphoma) (67%). Berezovsky's cells are a tumor substrate of Hodgkin's lymphoma.

Из уровня техники известны антитела, связывающиеся с антигеном PRAME, описанные в патенте США № 8846872 B2, опубл. 30.09.2014 года. Данные антитела являются мышиными мАТ, полученными с использованием гибридомной технологии. Данное изобретение относится к антителам к преимущественно экспрессируемому антигену при меланоме (PRAME) и антигенам синовиальной саркомы X breakpoint 2 (SSX-2), способам их применения и диагностическим наборам [US8846872B2, 30.09.2014]. Данное изобретение описывает мАТ, либо один или несколько его антиген-связывающих фрагментов, специфично связывающихся с эпитопом, включающим аминокислотные остатки 123-132 белка PRAME. Также изобретение описывает мАТ, либо один или несколько его антиген-связывающих фрагментов, специфично связывающихся с эпитопом, включающим аминокислотные остатки 276-286 белка PRAME.Antibodies that bind to the PRAME antigen are known from the prior art, as described in US Pat. No. 8,846,872 B2, publ. 09/30/2014. These antibodies are murine mAbs obtained using hybridoma technology. This invention relates to antibodies to predominantly expressed antigen in melanoma (PRAME) and antigens of synovial sarcoma X breakpoint 2 (SSX-2), methods of their use and diagnostic kits [US8846872B2, 09.30.2014]. This invention describes an mAb, or one or more antigen-binding fragments thereof, that specifically bind to an epitope comprising amino acid residues 123-132 of the PRAME protein. The invention also describes an mAb, or one or more of its antigen-binding fragments, specifically binding to an epitope comprising amino acid residues 276-286 of the PRAME protein.

Известно терапевтическое антитело Pr20, имитирующее T-клеточный рецептор, и связывающее пептид опухоле-ассоциированного белка PRAME в комплексе с молекулой главного комплекса гистосовместимости I класса (HLA-I) [Chang AY, Dao T, Gejman RS, Jarvis CA, Scott A, Dubrovsky L, Mathias MD, Korontsvit T, Zakhaleva V, Curcio M, Hendrickson RC. A therapeutic T cell receptor mimic antibody targets tumor-associated PRAME peptide/HLA-I antigens. The Journal of clinical investigation. 2017 Jun 30;127(7):2705-18]. Описано человеческое антитело подкласса IgG1, связывающее пептид PRAME 300-309 с аминокислотной последовательностью ALYVDSLFFL, представленный в комплексе с HLA-A2 на поверхности опухолевых клеток, экспрессирующих белок PRAME и HLA-A2.Known therapeutic antibody Pr20, mimicking a T-cell receptor, and binding peptide tumor-associated protein PRAME in a complex with a molecule of the major histocompatibility complex I class (HLA-I) [Chang AY, Dao T, Gejman RS, Jarvis CA, Scott A, Dubrovsky L, Mathias MD, Korontsvit T, Zakhaleva V, Curcio M, Hendrickson RC. A therapeutic T cell receptor mimic antibody targets tumor-associated PRAME peptide / HLA-I antigens. The Journal of clinical investigation. 2017 Jun 30; 127 (7): 2705-18]. Described is a human IgG1 subclass antibody that binds the PRAME 300-309 peptide with the amino acid sequence ALYVDSLFFL, presented in complex with HLA-A2 on the surface of tumor cells expressing the PRAME protein and HLA-A2.

Известны генетически модифицированные T-клетки с T-клеточным рецептором, специфически связывающим пептид белка PRAME в комплексе с HLA-A2. Описано получение таких клеток и их противоопухолевое действие по отношению к клеткам линии медулобластомы (HLA-A2+) in vitro. Также описано терапевтическое действие в модели медуллобластомы in vivo при использовании клеточной линии DAOY и мышей NSG [Orlando D, Miele E, De Angelis B, Guercio M, Boffa I, Sinibaldi M, Po A, Caruana I, Abballe L, Carai A, Caruso S. Adoptive immunotherapy using PRAME-specific T cells in medulloblastoma. Cancer research. 2018 Jun 15;78(12):3337-49]. В отличие от моноклональных антител, генетически модифицированные T-клетки с T-клеточным рецептором, специфически связывающим пептид белка PRAME, связываются только с пептидом в комплексе с молекулой главного комплекса гистосовместимости I класса (MHC I). Для дальнейшей активации таких клеток и элиминации экспрессирующих PRAME опухолевых клеток требуется получение T-клетками костимуляторных сигналов. Однако известно, что опухолевые клетки могут влиять на костимуляторные сигналы и блокировать активацию T-клеток, а также для многих типов опухолей характерно снижение экспрессии MHC I, что помогает опухолевым клеткам маскировать их присутствие от генетически-модифицированных T-клеток. Также получение генетически модифицированных T-клетки с T-клеточным рецептором, специфически связывающим пептид белка PRAME, является трудоемким и очень дорогим процессом, требующим выделения аутологичных T-клеток из крови пациента, их генетической модификации и выращивания ex vivo.Known genetically modified T-cells with a T-cell receptor that specifically binds the peptide of the PRAME protein in a complex with HLA-A2. The production of such cells and their antitumor effect on cells of the meduloblastoma line (HLA-A2 +) in vitro are described. Also described is the therapeutic effect in an in vivo medulloblastoma model using the DAOY cell line and NSG mice [Orlando D, Miele E, De Angelis B, Guercio M, Boffa I, Sinibaldi M, Po A, Caruana I, Abballe L, Carai A, Caruso S. Adoptive immunotherapy using PRAME-specific T cells in medulloblastoma. Cancer research. 2018 Jun 15; 78 (12): 3337-49]. In contrast to monoclonal antibodies, genetically modified T cells with a T cell receptor that specifically binds the peptide of the PRAME protein bind only to the peptide in a complex with a major histocompatibility complex class I (MHC I) molecule. Further activation of such cells and elimination of PRAME-expressing tumor cells requires T-cells to receive co-stimulatory signals. However, it is known that tumor cells can influence co-stimulatory signals and block the activation of T cells, and many types of tumors are characterized by a decrease in the expression of MHC I, which helps tumor cells to mask their presence from genetically modified T cells. Also, obtaining genetically modified T cells with a T cell receptor that specifically binds the peptide of the PRAME protein is a laborious and very expensive process that requires the isolation of autologous T cells from the patient's blood, their genetic modification, and ex vivo cultivation.

Ряд исследований показывает [R. Fagnani, Immunol. Ser. 61 (1994) 3-22; M.B. Khazaeli, R.M. Conry, A.F. LoBuglio, J Immunother. 15 (1994) 42-52; K. Kuus-Reichel, L.S. Grauer, L.M. Karavodin, C. Knott, M. Krusemeier, N.E. Kay, Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1 (1994) 365-372], что введение чужеродного антитела может вызывать сильный иммунный ответ у пациента, прежде всего образование анти-мышиных антител (HAMA - human anti-mose antibody). В результате мышиные антитела оказываются нейтрализованы человеческими и довольно быстро выводятся из организма, что в конечном итоге приводит к ограниченной эффективности терапии уже на ранней стадии лечения. Более того, при использовании мышиных или других чужеродных (для человека) антител для лечения различных заболеваний, последующее лечение другими мышиными антителами может быть неэффективно или даже опасно из-за кросс-реактивности используемых антител.A number of studies show [R. Fagnani, Immunol. Ser. 61 (1994) 3-22; M.B. Khazaeli, R.M. Conry, A.F. LoBuglio, J Immunother. 15 (1994) 42-52; K. Kuus-Reichel, L.S. Grauer, L.M. Karavodin, C. Knott, M. Krusemeier, N.E. Kay, Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1 (1994) 365-372] that the introduction of a foreign antibody can induce a strong immune response in a patient, primarily the formation of human anti-mose antibodies (HAMA). As a result, mouse antibodies are neutralized by human antibodies and are quickly eliminated from the body, which ultimately leads to limited effectiveness of therapy already at an early stage of treatment. Moreover, when using mouse or other foreign (for humans) antibodies for the treatment of various diseases, subsequent treatment with other mouse antibodies may be ineffective or even dangerous due to the cross-reactivity of the antibodies used.

Для снижения иммуногенности мышиных мАТ и возможных неблагоприятных реакций, обусловленных иммуногенностью, антитела или их части могут быть гуманизированы для того, чтобы быть менее иммуногенными, чем их мышиные прототипы. Клинические исследования показали, что гуманизированные антитела в целом являются значительно менее иммуногенными, чем мышиные и химерные мАТ, более безопасны и лучше переносятся пациентами [C. Mateo, E. Moreno, K. Amour, J. Lombardero, W. Harris, R. Perez, Immunotechnology 3 (1997) 71-81; S. Stephens, S. Emtage, O. Vetterlein, L. Chaplin, C. Bebbington, A. Nesbitt, M. Sopwith, D. Athwal, C. Novak, M. Bodmer, Immunology 85 (1995) 668-674]. Так, авторы настоящего изобретения сконструировали на основе мышиного мАТ, обладающего способностью с высокой специфичностью и высоким аффинитетом связываться с антигеном PRAME человека, и каркасных участков антител человека гуманизированное антитело к белку PRAME. Для гуманизации мАТ 5D3 использовали метод пересадки CDR-участков. Этот метод достаточно широко используется для получения гуманизированных терапевтических мАТ. Хотя известно, что пересадка CDR-участков была успешна в некоторых случаях, было показано, что большинство гуманизироваванных антител, полученных таким методом, не сохраняют антиген-связывающие свойства (аффинность) по отношению к антигену по сравнению с родительскими мышиными антителами. Потеря аффинности связана с заменой определенных аминокислотных остатков каркасных областей мАТ, тесно взаимодействующих с аминокислотными остатками CDR-участков в вариабельных доменах, и, таким образом влияют на структуру антиген-связывающего сайта. Поэтому перенос только CDR-участков при гуманизации антител часто приводит к потере антиген-связывающих свойств [C. Queen, W.P. Schneider, H.E. Selick, P.W. Payne, N.F. Landolfi, J.F. Duncan, N.M. Avdalovic, M. Levitt, R.P. Junghans, T.A. Waldmann, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033]. Quenn с соавторами предположили наличие ключевых аминокислотных остатков в каркасных областях, взаимодействующих с CDR-участками и, таким образом, влияющих на правильную структуру антигенсвязывающего сайта. Такие остатки по мнению авторов, должны быть перенесены в гуманизированную версию антитела наряду с CDR-участками мышиных мАТ. Для того, чтобы установить, какие из аминокислотных остатков являются ключевыми, используют полученные in silico трехмерные модели мАТ и различные методы анализа. Такие методы часто позволяют установить аминокислотные остатки, замена которых в гуманизированном антителе приводит к значительному изменению его структуры. Однако, такие методы не всегда могут предсказать ключевые аминокислотные остатки. Очень важным этапом процесса гуманизации мышиных антител является построение надежных трехмерных моделей вариабельных доменов антитела. Также необходимо выбрать источник человеческих последовательностейй каркасных областей мАТ, на которые будет осуществляться пересадка CDR-участков мышиного мАТ. Источником таких последовательностей могут быть как мАТ с известной первичной последовательностью, так и гены зародышевой линии антител человека. Преимуществом использования последовательностей известных мАТ является доступность их пространственных моделей, полученных на основе экспериментальных данных (рентгено-структурного анализа). В то же время использование генов зародышевой линии позволяет избежать потенциальной иммуногенности, связанной с гиперсоматичекими мутациями, которые присутствуют в генах известных ранее антител. При гуманизации антител также могут быть использованы консенсусные последовательности каркасных областей вариабельных доменов антител.To reduce the immunogenicity of murine mAbs and possible adverse reactions associated with immunogenicity, antibodies or parts of them can be humanized in order to be less immunogenic than their murine counterparts. Clinical studies have shown that humanized antibodies in general are significantly less immunogenic than murine and chimeric mAbs, are safer and better tolerated by patients [C. Mateo, E. Moreno, K. Amour, J. Lombardero, W. Harris, R. Perez, Immunotechnology 3 (1997) 71-81; S. Stephens, S. Emtage, O. Vetterlein, L. Chaplin, C. Bebbington, A. Nesbitt, M. Sopwith, D. Athwal, C. Novak, M. Bodmer, Immunology 85 (1995) 668-674]. Thus, the authors of the present invention have constructed a humanized antibody to the PRAME protein on the basis of a murine mAb having the ability to bind with high specificity and high affinity to the human PRAME antigen, and the framework regions of human antibodies. To humanize mAb 5D3, we used the method of CDR transplantation. This method is widely used to obtain humanized therapeutic mAbs. Although CDR grafting is known to be successful in some cases, it has been shown that most humanized antibodies obtained by this method do not retain antigen binding properties (affinity) for antigen compared to parental mouse antibodies. The loss of affinity is associated with the replacement of certain amino acid residues of the mAb framework regions, which closely interact with the amino acid residues of the CDR regions in the variable domains, and thus affect the structure of the antigen-binding site. Therefore, the transfer of only CDR-regions during the humanization of antibodies often leads to the loss of antigen-binding properties [C. Queen, W.P. Schneider, H.E. Selick, P.W. Payne, N.F. Landolfi, J.F. Duncan, N.M. Avdalovic, M. Levitt, R.P. Junghans, T.A. Waldmann, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033]. Quenn et al. Hypothesized the presence of key amino acid residues in the framework regions that interact with the CDR regions and thus influence the correct structure of the antigen-binding site. According to the authors, such residues should be transferred into the humanized version of the antibody along with the CDR regions of the murine mAbs. In order to establish which of the amino acid residues are key, three-dimensional mAb models obtained in silico and various methods of analysis are used. Such methods often allow the identification of amino acid residues, the replacement of which in a humanized antibody leads to a significant change in its structure. However, such methods cannot always predict key amino acid residues. A very important step in the humanization of mouse antibodies is the construction of reliable three-dimensional models of variable domains of antibodies. It is also necessary to select a source of human mAb framework sequences to which the CDR regions of the murine mAb will be transplanted. The source of such sequences can be both mAbs with a known primary sequence and germline genes of human antibodies. The advantage of using sequences of known mAbs is the availability of their spatial models obtained on the basis of experimental data (X-ray structural analysis). At the same time, the use of germline genes avoids the potential immunogenicity associated with hypersomatic mutations that are present in the genes of previously known antibodies. In the humanization of antibodies, the consensus sequences of the framework regions of the variable domains of antibodies can also be used.

Авторы настоящего изобретения использовали гены зародышевой линии антител человека для гуманизации мышиного мАТ 5D3. С помощью сервиса ROSETTA были построены, а затем оптимизированы пространственные модели мышиного и различных вариантов гуманизированного мАТ 5D3. В результате были выявлены 3 ключевых аминокислотных остатка каркасных областей мышиного антитела (2 в тяжелой цепи мАТ и 1 в легкой цепи), необходимых для поддержания структуры антиген-связывающего центра мАТ 5D3. Совместная пересадка CDR-участков с тремя ключевыми аминокислотными остатками каркасных областей позволила получить авторам изобретения гуманизированное мАТ 5D3Hu, характеризующееся аффинностью, не уступающей родительскому мышиному мАТ.The present inventors used the germline genes of human antibodies to humanize the murine mAb 5D3. Using the ROSETTA service, spatial models of mouse and various variants of humanized mAb 5D3 were built and then optimized. As a result, 3 key amino acid residues of the framework regions of the mouse antibody (2 in the heavy chain of mAb and 1 in the light chain) were identified, which are necessary to maintain the structure of the antigen-binding center of mAb 5D3. Co-transplantation of CDR regions with three key amino acid residues of the framework regions allowed the inventors to obtain a humanized mAb 5D3Hu, characterized by an affinity that is not inferior to the parental murine mAb.

Наиболее близким к заявляемому изобретению (прототипом) является мышиное мАТ 5D3, селективно связывающееся с опухолевым антигеном PRAME человека, описанное в статье [В. А. Мисюрин, Ю. П. Финашутина, А. А. Турба, М. В. Ларина, О. Н. Солопова, Н. А. Лыжко, Л. А. Кесаева, Н. Н. Касаткина, Т. К. Алиев, А. В. Мисюрин, М. П. Кирпичников.(2019) Эпитопный анализ мышиных и химерных моноклональных антител, распознающих раково-тестикулярный антиген PRAME. Доклады академии наук, Том 492, номер. 1, стр. 135-138]. В статье описано мАТ, связывающееся с антигеном PRAME, полученное с помощью гибридомной технологии при иммунизации мышей рекомбинантным белком PRAME. Данное антитело характеризуется высокой аффинностью 1.4 нМ по отношению к антигену PRAME. Однако, использование моноклональных антител животного происхождения имеет ряд недостатков при терапии заболеваний человека, особенно выраженных при повторных введениях препарата. Например, мышиные моноклональные антитела имеют короткое время циркуляции в организме человека, а также вследствие неспособности их Fc-фрагмента связываться с человеческими рецепторами на поверхности эффекторных клеток не обладают важными функциональными характеристиками. Так, например, такие антитела не могут обеспечивать развитие антитело-зависимой клеточной цитотоксичности, которая является важным механизмом разрушения опухолевых клеток.Closest to the claimed invention (prototype) is the mouse mAb 5D3, which selectively binds to the human PRAME tumor antigen, described in the article [V. A. Misyurin, Yu. P. Finashutina, A. A. Turba, M. V. Larina, O. N. Solopova, N. A. Lyzhko, L. A. Kesaeva, N. N. Kasatkina, T. K. Aliev, A. V. Misyurin, M. P. Kirpichnikov. (2019) Epitope analysis of murine and chimeric monoclonal antibodies recognizing the testicular cancer PRAME antigen. Reports of the Academy of Sciences, Volume 492, no. 1, pp. 135-138]. The article describes an mAb that binds to the PRAME antigen, obtained using hybridoma technology when mice are immunized with the recombinant PRAME protein. This antibody has a high affinity of 1.4 nM for the PRAME antigen. However, the use of monoclonal antibodies of animal origin has a number of disadvantages in the treatment of human diseases, especially pronounced with repeated injections of the drug. For example, murine monoclonal antibodies have a short circulation time in the human body, and due to the inability of their Fc fragment to bind to human receptors on the surface of effector cells, they do not have important functional characteristics. For example, such antibodies cannot provide for the development of antibody-dependent cellular cytotoxicity, which is an important mechanism for the destruction of tumor cells.

Также важной особенностью мышиных моноклональных антител является то, что они содержат аминокислотные последовательности, которые являются иммуногенными для человека.Also an important feature of murine monoclonal antibodies is that they contain amino acid sequences that are immunogenic in humans.

Раскрытие изобретенияDisclosure of invention

Технической проблемой, решаемой настоящим изобретением, было получение гуманизированного моноклонального антитела, способного к селективному связыванию с опухолевым антигеном PRAME человека, и обладающих низкой иммуногенностью для человека по сравнению с мышиными моноклональными антителами.The technical problem solved by the present invention was to obtain a humanized monoclonal antibody capable of selectively binding to the human PRAME tumor antigen and having low immunogenicity for humans as compared to murine monoclonal antibodies.

А также получение изолированных фрагментов ДНК, кодирующих участки легкой и тяжелой цепей указанного антитела и антигенсвязывающего фрагмента, указанного гуманизированного моноклонального антитела.And also obtaining isolated DNA fragments encoding regions of the light and heavy chains of the specified antibody and antigen-binding fragment of the specified humanized monoclonal antibody.

Техническим результатом является получение нового гуманизированного моноклонального антитела IgG1-изотипа, способного к связыванию с опухолевым антигеном PRAME человека, и характеризующегося константой диссоциации комплекса антиген-антитело 1,4 нМ с допустимой величиной погрешности 10%. что не уступает константе диссоциации ближайшего аналога, мышиного мАТ 5D3. При этом гуманизированное мАТ 5D3Hu можно использовать для лечения человека. The technical result is to obtain a new humanized monoclonal antibody IgG1-isotype, capable of binding to the human PRAME tumor antigen, and characterized by a constant of dissociation of the antigen-antibody complex of 1.4 nM with an acceptable margin of error of 10%. which is not inferior to the dissociation constant of the closest analogue, murine mAb 5D3. Moreover, the humanized mAb 5D3Hu can be used to treat humans.

Техническая проблема решается получением гуманизированного мАТ 5D3Hu, селективно связывающего белок PRAME человека, включающего вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина (VH), который содержит последовательность гипервариабельных регионов CDRH1, CDRH2 и CDRH3, и вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина (VL), который содержит последовательность гипервариабельных регионов CDRL1, CDRL2 и CDRL3. При этом вариабельный участок тяжелой цепи (VH) указанного антитела, содержащит последовательность аминокислот, не менее чем на 90% гомологичную SEQ ID NO:1; а вариабельный участок легкой цепи (VL) указанного антитела содержит последовательность аминокислот, не менее чем на 90% гомологичную SEQ ID NO:2, а также фрагменты ДНК, кодирующие вариабельные фрагменты легкой и тяжелой цепей указанного антитела.The technical problem is solved by obtaining a humanized mAb 5D3Hu, selectively binding the human PRAME protein, including the variable domain of the heavy chain of immunoglobulin (VH), which contains the sequence of hypervariable regions CDRH1, CDRH2 and CDRH3, and the variable domain of the light chain of immunoglobulin (VL), which contains the sequence of hypervariable regions CDRL1, CDRL2 and CDRL3. The variable region of the heavy chain (VH) of the specified antibody contains an amino acid sequence not less than 90% homologous to SEQ ID NO: 1; and the variable region of the light chain (VL) of the specified antibody contains an amino acid sequence that is at least 90% homologous to SEQ ID NO: 2, as well as DNA fragments encoding the variable fragments of the light and heavy chains of the specified antibody.

Техническая проблема решается также тем, что получен фрагмент ДНК, кодирующий антитело или его фрагмент. Изолированный фрагмент ДНК, кодирующий VH гуманизированного антитела 5D3Hu, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 3. Изолированный фрагмент ДНК, кодирующий VL указанного антитела, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 4.The technical problem is also solved by the fact that a DNA fragment is obtained that encodes an antibody or a fragment thereof. Isolated DNA fragment encoding VH of humanized antibody 5D3Hu with nucleotide sequence SEQ ID NO: 3. Isolated DNA fragment encoding VL of said antibody with nucleotide sequence SEQ ID NO: 4.

Техническая проблема решается также тем, что получен антиген-связывающий фрагмент указанного гуманизированного моноклонального антитела, селективно связывающий опухолевый антиген PRAME человека, представляет собой комбинацию вариабельного участка тяжелой цепи (VH) указанного антитела с последовательностью аминокислот, не менее чем на 90% гомологичную SEQ ID NO: 1, и вариабельного участка легкой цепи (VL) указанного антитела с последовательностью аминокислот, не менее чем на 90% гомологичную SEQ ID NO: 2.The technical problem is also solved by the fact that an antigen-binding fragment of the said humanized monoclonal antibody that selectively binds the human PRAME tumor antigen is obtained, is a combination of the variable region of the heavy chain (VH) of the specified antibody with an amino acid sequence that is at least 90% homologous to SEQ ID NO : 1, and the variable region of the light chain (VL) of the specified antibody with an amino acid sequence not less than 90% homologous to SEQ ID NO: 2.

Краткое описание чертежейBrief Description of Drawings

Изобретение поясняется следующими чертежами.The invention is illustrated by the following drawings.

На Фиг. 1 показано расположение участков CDRs в вариабельном домене легкой 5D3HuL и тяжелой 5D3HuH цепей гуманизированного мАТ 5D3Hu. Участки CDRs подчеркнуты.FIG. 1 shows the location of CDRs in the variable domain of the 5D3HuL light and 5D3HuH heavy chains of the humanized mAb 5D3Hu. Sites of CDRs are underlined.

На Фиг. 2 показана гель-электрофореграмма очищенного рекомбинантного гуманизированного мАТ 5D3Hu и мАТ трастузумаб в 10%-ом полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS) и β-меркаптоэтанола (лунки +); либо без него. (лунки -). М - белковые маркеры молекулярного веса, На ПААГ нанесены гуманизированное мАТ 5D3Hu и мАТ трастузумаб в невосстанавливающих (-) и восстанавливающих (+) условиях.FIG. 2 shows a gel electrophoregram of purified recombinant humanized mAb 5D3Hu and mAb trastuzumab in 10% polyacrylamide gel in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS) and β-mercaptoethanol (wells +); or without it. (holes -). M - protein markers of molecular weight, Humanized 5D3Hu mAb and trastuzumab mAb were applied on PAGE under non-reducing (-) and reducing (+) conditions.

На Фиг. 3 показан иммуноблот связывания гуманизированного мАТ 5D3Hu с рекомбинантным белком PRAME. 1, 2 – 2 и 1 мкг нанесенного на дорожку рекомбинантного белка PRAME соответственно, m - белковые маркеры молекулярного веса.FIG. 3 shows an immunoblot of binding of the humanized mAb 5D3Hu to the recombinant PRAME protein. 1, 2 - 2 and 1 μg of the recombinant PRAME protein applied to the lane, respectively, m - protein markers of molecular weight.

На Фиг. 4 показано измерение аффинности гуманизированного мАТ 5D3Hu по отношению к рекомбинантному белку PRAME. Измерение проводили на биосенсоре Attana Cell A200.FIG. 4 shows the measurement of the affinity of the humanized mAb 5D3Hu for the recombinant PRAME protein. The measurement was performed on an Attana Cell A200 biosensor.

На Фиг.5 показана схема экспрессионного вектора на основе плазмиды pcDNA3.4, кодирующего легкую цепь гуманизированного мАТ 5D3Hu.Figure 5 shows a diagram of an expression vector based on plasmid pcDNA3.4 encoding the light chain of humanized mAb 5D3Hu.

На Фиг.6 показана схема экспрессионного вектора на основе плазмиды pcDNA3.4, кодирующего тяжелую цепь гуманизированного мАТ 5D3Hu.Figure 6 shows a diagram of an expression vector based on plasmid pcDNA3.4 encoding the heavy chain of humanized mAb 5D3Hu.

Фиг. 7 - изменение клеточного импеданса линии Mel P при инкубации их с гуманизированным и мышиным антителами (5D3 Hu и 5D3 mouse) с конечной концентрацией в лунке 100 мкг\мл (красная линия- 1C5 - антитело к гликопротеину вируса бешенства,100 мкг\мл, зеленая линия - 5D3 Hu, 100 мкг\мл, синяя линия-5D3mouse,100 мкг\мл).FIG. 7 - change in the cell impedance of the Mel P line during their incubation with humanized and mouse antibodies (5D3 Hu and 5D3 mouse) with a final concentration in the well of 100 μg / ml (red line - 1C5 - antibody to rabies virus glycoprotein, 100 μg / ml, green line - 5D3 Hu, 100 μg / ml, blue line - 5D3mouse, 100 μg / ml).

Осуществление изобретенияImplementation of the invention

Как хорошо известно, минорные изменения аминокислотной последовательности, такие как делеция, добавление или замена одной, небольшого количества или даже нескольких аминокислот, могут приводить к получению аллельной формы исходного белка, которая обладает практически идентичными свойствами.As is well known, minor changes in the amino acid sequence, such as deletion, addition, or substitution of one, small amount, or even several amino acids, can lead to an allelic form of the original protein that has almost identical properties.

Антитела обычно состоят из двух тяжелых цепей, связанных между собой дисульфидными связями, и легких цепей, ассоциированными с N-концом каждой из тяжелых цепей. Каждая тяжелая цепь содержит на N-конце вариабельный домен с константным доменом на другом конце. Каждая легкая цепь содержит на N-конце вариабельный домен с константным доменом на другом конце. Вариабельные домены каждой пары легкой и тяжелой цепей образуют антигенсвязывающий участок. Вариабельные домены легкой и тяжелой цепей обладают похожей общей структурой, и каждый домен включает каркас из четырех участков, последовательности которых являются относительно консервативными, связанных посредством трех участков, определяющих комплементарность (complementarity determining regions, CDRs). Четыре каркасных участка формируют конформацию типа бета-складчатого слоя. Участки CDRs расположены в близком соседстве друг с другом благодаря каркасным участкам и вносят вклад в образование антигенсвязывающего участка. Участки CDRs и каркасные участки антител могут быть определены путем ссылки на нумерационную систему Кабата [Kabat numbering system, Kabat et al., 1987 “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, US Dept. of Health and Human Services, US Government Printing Office] в сочетании c данными рентгеноструктурного анализа, как указано в заявке WO 91/09967. Участки CDRs и каркасные участки антител могут также быть определены по номенклатуре Международной информационной системы по иммуногенетике (International Immunogenetics Information System, www.imgt.org).Antibodies usually consist of two heavy chains linked by disulfide bonds and light chains associated with the N-terminus of each of the heavy chains. Each heavy chain contains a variable domain at the N-terminus with a constant domain at the other end. Each light chain contains a variable domain at the N-terminus with a constant domain at the other end. The variable domains of each pair of light and heavy chains form an antigen-binding site. The variable domains of the light and heavy chains have a similar overall structure, and each domain includes a framework of four regions, the sequences of which are relatively conserved, linked by three complementarity determining regions (CDRs). The four scaffolds form a beta-sheet conformation. The CDRs are located in close proximity to each other due to the framework regions and contribute to the formation of the antigen-binding site. The CDRs and antibody framework regions can be identified by reference to the Kabat numbering system [Kabat numbering system, Kabat et al., 1987 “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” US Dept. of Health and Human Services, US Government Printing Office] in combination with X-ray structural analysis data, as indicated in WO 91/09967. CDRs and antibody frameworks can also be identified using the International Immunogenetics Information System (www.imgt.org) nomenclature.

Если не указано иное, любая представленная в описании полипептидная цепь имеет аминокислотную последовательность, которая начинается на N-конце и заканчивается на С-конце. Если антигенсвязывающий центр содержит и VH-, и VL-области, то они могут быть расположены на одной и той же полипептидной молекуле или предпочтительно каждая область может располагаться на разных цепях, VH-область может быть частью тяжелой цепи иммуноглобулина или ее фрагмента, а VL-область - частью легкой цепи иммуноглобулина или ее фрагмента. Консервативные участки тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина IgG, IgM, IgA, IgD или IgE могут быть использованы в качестве консервативных участков для тяжелой цепи согласно настоящему изобретению. Также могут быть использованы тяжелые цепи подклассов IgG2, IgG3, IgG4. Консервативные участки легкой цепи человеческого иммуноглобулина каппа или лямбда могут быть использованы в качестве консервативных участков для легкой цепи антитела согласно настоящему изобретению. Под фрагментами антител понимают одноцепочечное антитело (вариабельные домены легкой и тяжелой цепей антитела, объединенных с помощью линкерной белковой последовательности в любой ориентации), Fab-фрагмент антитела, (Fab)₂- фрагмент антитела, а также любые другие фрагменты, включающие вариабельный участок тяжелой цепи (VH) указанного антитела, содержащий последовательность аминокислот, не менее чем на 90% гомологичную SEQ ID NO: 1, а вариабельный участок легкой цепи (VL) указанного антитела содержит последовательность аминокислот, не менее чем на 90% гомологичную SEQ ID NO: 2Unless otherwise indicated, any polypeptide chain described herein has an amino acid sequence that begins at the N-terminus and ends at the C-terminus. If the antigen-binding site contains both VH and VL regions, then they can be located on the same polypeptide molecule, or, preferably, each region can be located on different chains, the VH region can be part of an immunoglobulin heavy chain or a fragment thereof, and VL -area - part of the light chain of an immunoglobulin or a fragment thereof. Conserved regions of the heavy chain of human immunoglobulin IgG, IgM, IgA, IgD or IgE can be used as conserved regions for the heavy chain of the present invention. Heavy chains of the IgG2, IgG3, IgG4 subclasses can also be used. Conserved regions of the light chain of human immunoglobulin kappa or lambda can be used as conserved regions for the light chain of the antibody of the present invention. Antibody fragments are understood as a single-chain antibody (variable domains of the light and heavy chains of an antibody, combined using a linker protein sequence in any orientation), Fab-fragment of an antibody, (Fab) ₂ - an antibody fragment, as well as any other fragments including the variable region of the heavy chain (VH) of the specified antibody containing an amino acid sequence not less than 90% homologous to SEQ ID NO: 1, and the variable region of the light chain (VL) of the specified antibody contains an amino acid sequence not less than 90% homologous to SEQ ID NO: 2

Последующие примеры приведены для целей объяснения и не ограничивают каким-либо образом рамки настоящего изобретения.The following examples are provided for purposes of explanation and do not limit the scope of the present invention in any way.

Пример 1. Гуманизация моноклонального антитела 5D3 и биосинтез полученного гуманизированного моноклонального антитела 5D3Hu в клетках эукариот.Example 1. Humanization of monoclonal antibody 5D3 and biosynthesis of the obtained humanized monoclonal antibody 5D3Hu in eukaryotic cells.

Гуманизированное моноклональное антитело 5D3Hu получали на основе мышиного моноклонального антитела 5D3, полученного путем иммунизации мышей Balb/C человеческим рекомбинантным белком PRAME, экспрессированным в E.coli, для дальнейшего получения и селекции линий гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к рекомбинантному белку PRAME человека, анализа аффинности и специфичности отобранного моноклонального антитела, определения нуклеотидной и аминокислотной последовательности его вариабельных доменов.Humanized monoclonal antibody 5D3Hu was obtained on the basis of murine monoclonal antibody 5D3, obtained by immunizing Balb / C mice with human recombinant PRAME protein expressed in E. coli for further production and selection of hybridoma lines producing monoclonal antibodies to the recombinant human PRAME protein, and affinity analysis specificity of the selected monoclonal antibody, determination of the nucleotide and amino acid sequence of its variable domains.

Метод «пересадки CDR» заключается в нахождении последовательностей зародышевых линий антител человека, наиболее гомологичных последовательностям моноклональных мышиных антител, и создании гибридных молекул, содержащих каркасные участки антител человека и гипервариабельные участки исходных мышиных антител. Путем сравнения с последовательностями зародышевых линий человека в сервисе IgBLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) определяют наиболее гомологичные антителу 5D3 зародышевые линии антител человека и отбирают линии с большей степенью гомологии и меньшим числом неблагоприятных замен. Для легкой цепи моноклонального антитела 5D3 наибольшую степень гомологии демонстрирует последовательность линии IGKV2-30*02 для V-сегмента и IGKJ1*01 для J-сегмента, а для тяжелой цепи наиболее гомологичный V-сегмент относится к зародышевой линии IGHV3-48*01 и J-сегмент к линии IGHJ4*03. The CDR grafting method consists in finding the sequences of germ lines of human antibodies that are most homologous to the sequences of monoclonal mouse antibodies, and creating hybrid molecules containing framework regions of human antibodies and hypervariable regions of the original mouse antibodies. By comparison with the sequences of human germ lines in the IgBLAST service (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/), the most homologous to the 5D3 antibody germ lines of human antibodies are determined and lines with a greater degree of homology and fewer unfavorable substitutions are selected. For the light chain of monoclonal antibody 5D3, the sequence of the IGKV2-30 * 02 line for the V segment and IGKJ1 * 01 for the J segment demonstrates the greatest degree of homology, and for the heavy chain the most homologous V segment belongs to the germ line IGHV3-48 * 01 and J -segment to line IGHJ4 * 03.

Участки CDRs оставляют без изменения, а каркасные участки мышиного антитела заменяют на гомологичные человеческие.The CDRs are left unchanged, and the mouse antibody frameworks are replaced with homologous human ones.

Проводили оптимизацию полученных последовательностей путем создания моделей пространственной структуры гуманизированного антитела методом моделирования на основании гомологии (веб-сервис Rosetta Antibody). Реализация этого метода включает следующие шаги: 1) поиск шаблонов среди антител с известной пространственной структурой и сходной аминокислотной последовательностью, 2) построение начальных моделей с использованием консервативных фрагментов шаблонов и VH/VL последовательности запроса, 3) улучшение начальных моделей путем подбора оптимальных конформаций основной цепи VH/VL и боковых цепей по всем моделям в целом. Полученные стартовые модели дополнительно оптимизировали с учетом окружающего растворителя, для чего в программе Gromacs (http://www.gromacs.org/) с использованием силового поля charmm36 проводили расчет молекулярной динамики (МД) моделей в водном растворе при температуре 300К и физиологической концентрации NaCl в течение 10 нс. Анализ МД показал, что модели принимают свои равновесные конформации уже через 1 нс. Полученные траектории МД подвергали кластерному анализу и наиболее представительные конформации для каждой из стартовых моделей в дальнейшем использовали в качестве окончательных моделей, анализ которых позволял сформулировать ряд «возвратных» замен в каркасных участках VH (F27I, R94H) и VL (R46L) гуманизированного моноклонального антитела к опухолевому антигену PRAME человека. The obtained sequences were optimized by creating models of the spatial structure of a humanized antibody by modeling based on homology (Rosetta Antibody web service). The implementation of this method includes the following steps: 1) searching for templates among antibodies with a known spatial structure and a similar amino acid sequence, 2) building initial models using conservative template fragments and VH / VL query sequence, 3) improving the initial models by selecting the optimal conformations of the backbone VH / VL and side chains on all models in general. The resulting starting models were additionally optimized taking into account the surrounding solvent, for which purpose, in the Gromacs program (http://www.gromacs.org/), using the force field charmm36, we calculated the molecular dynamics (MD) of the models in an aqueous solution at a temperature of 300 K and the physiological concentration of NaCl within 10 ns. The MD analysis showed that the models take their equilibrium conformations already after 1 ns. The obtained MD trajectories were subjected to cluster analysis and the most representative conformations for each of the starting models were subsequently used as final models, the analysis of which made it possible to formulate a number of "recurrent" substitutions in the framework regions VH (F27I, R94H) and VL (R46L) of a humanized monoclonal antibody to human PRAME tumor antigen.

На основании полученных аминокислотных последовательностей вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей гуманизированного антитела 5D3Hu (SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2) путем оптимизации кодонов составляли кодирующие последовательности тяжелой и легкой цепей гуманизированного антитела 5D3Hu (SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4). Аминокислотные последовательности легкой и тяжелой цепей полученного гуманизированного антитела 5D3Hu с отмеченными гипервариабельными участками представлены на Фиг. 1. Кодирующие последовательности тяжелой и легкой цепей гуманизированного антитела 5D3Hu получали методом химико-ферментативного синтеза [Ильина Е.Н., Солопова О.Н., Балабашин Д.С., Ларина М.В., Алиев Т.К., Гребенникова Т.В., Лосич М.А., Зайкова О.Н., Свешников П.Г., Долгих Д.А., Кирпичников М.П. Получение и характеризация нейтрализующего моноклонального антитела против вируса бешенства. Биоорганическая химия. 2019;45(1):58-68]. Последовательности VL и VH мАТ 5D3Hu были синтезированы из перекрывающихся олигонуклеотидов с помощью полимеразно-цепной реакции (ПЦР). Олигонуклеотиды имели длину от 40 до 50 оснований, при этом они попарно перекрывались между собой (10-12 оснований) и имели приблизительно одинаковую температуру отжига (~50°С). Вариабельные домены были объединены с лидерным пептидом и соответствующими константными областями (константным доменом легкой каппа-цепи человека и константной областью антитела IgG1 человека). Также на 5’-конец каждой цепи антитела была добавлена последовательность Козак, важная для инициации трансляции. Все части перед клонированием в экспрессионный вектор объединяли методом SOE-ПЦР (Single overlap extention- ПЦР, ПЦР с перекрывающимися областями). При наработке фрагментов ДНК, кодирующих легкую и тяжелую цепь мАТ, лидерный пептид и последовательность Kozak использовали внешние праймеры, содержащие последовательности узнавания эндонуклеаз рестрикции NheI (в прямом праймере) и XhoI (в реверсном праймере). Экспрессионные кассеты, кодирующие легкую и тяжелую цепь мАТ 5D3Hu клонировали отдельно по сайтам NheI/XhoI в экспрессионый вектор pcDNA3.4, под контроль промотора CMV [Ильина Е.Н., Солопова О.Н., Балабашин Д.С., Ларина М.В., Алиев Т.К., Гребенникова Т.В., Лосич М.А., Зайкова О.Н., Свешников П.Г., Долгих Д.А., Кирпичников М.П. Получение и характеризация нейтрализующего моноклонального антитела против вируса бешенства. Биоорганическая химия. 2019;45(1):58-68]. Также могут быть использованы другие коммерческие экспрессионные векторы, содержащие последовательности промоторов CMV, EF-1alpha и других, позволяющими экспрессировать рекомбинантные белки в клетках млекопитающих. в частности в клетках CHO. Такими плазмидными векторами могут быть плазмиды pcDNA3.3, pMG, pCEP4, pOptiVec и другие. Полученные экспрессионные векторы (схемы кодирующие легкую и тяжелую цепи мАТ 5D3Hu представлены на Фиг. 5 и 6) использовали для биосинтеза гуманизированного моноклонального антитела 5D3Hu в клетках CHO.Based on the obtained amino acid sequences of the variable domains of the heavy and light chains of the humanized antibody 5D3Hu (SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2), the coding sequences of the heavy and light chains of the humanized antibody 5D3Hu (SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: : 4). The amino acid sequences of the light and heavy chains of the obtained humanized antibody 5D3Hu with the hypervariable regions marked are shown in FIG. 1. The coding sequences of the heavy and light chains of the humanized antibody 5D3Hu were obtained by the method of chemical-enzymatic synthesis [Ilyina E.N., Solopova ON, Balabashin D.S., Larina M.V., Aliev T.K., Grebennikova T V.V., Losich M.A., Zaikova O.N., Sveshnikov P.G., Dolgikh D.A., Kirpichnikov M.P. Preparation and characterization of anti-rabies virus neutralizing monoclonal antibody. Bioorganic chemistry. 2019; 45 (1): 58-68]. The VL and VH sequences of mAb 5D3Hu were synthesized from overlapping oligonucleotides using polymerase chain reaction (PCR). The oligonucleotides were 40 to 50 bases in length, while they overlapped in pairs (10-12 bases) and had approximately the same annealing temperature (~ 50 ° C). The variable domains were combined with the leader peptide and corresponding constant regions (human kappa light chain constant domain and human IgG1 antibody constant region). Also on the 5'-end of each antibody chain was added a Kozak sequence, which is important for the initiation of translation. All parts were combined by SOE-PCR (Single overlap extention-PCR, PCR with overlapping regions) before cloning into the expression vector. When generating DNA fragments encoding the light and heavy chains of mAbs, the leader peptide and the Kozak sequence, external primers containing the recognition sequences of restriction endonucleases NheI (in the forward primer) and XhoI (in the reverse primer) were used. Expression cassettes encoding the light and heavy chains of mAb 5D3Hu were cloned separately at the NheI / XhoI sites into the pcDNA3.4 expression vector, under the control of the CMV promoter [Ilyina E.N., Solopova O.N., Balabashin D.S., Larina M. V., Aliev T.K., Grebennikova T.V., Losich M.A., Zaykova O.N., Sveshnikov P.G., Dolgikh D.A., Kirpichnikov M.P. Preparation and characterization of anti-rabies virus neutralizing monoclonal antibody. Bioorganic chemistry. 2019; 45 (1): 58-68]. Other commercial expression vectors can also be used containing the sequences of the CMV, EF-1alpha and others promoters, allowing the expression of recombinant proteins in mammalian cells. in particular in CHO cells. Such plasmid vectors can be pcDNA3.3, pMG, pCEP4, pOptiVec and others. The resulting expression vectors (the schemes encoding the light and heavy chains of mAb 5D3Hu are shown in Figs. 5 and 6) were used for biosynthesis of humanized monoclonal antibody 5D3Hu in CHO cells.

Клетки яичника китайского хомячка CHO DG44 (dhfr -/-) использовали для секретируемой экспрессии рекомбинантного гуманизированного моноклонального антитела 5D3Hu. Для этого клетки культивировали в колбах Эрленмейера в CO₂-инкубаторе при 37°C, 95% влажности и 8% CO₂ в стандартной бессывороточной среде CD DG44 (Invitrogen) с добавлением 200 мМ раствора L-Глутамина до конечной концентрации 8 мМ и содержащей 0,18% (v/v) Pluronic F-68 (Invitrogen, USA) до концентрации 4х10⁶ клеток/мл 24 часа до трансфекции. Во флаконы Эрленмейера объемом 125 мл засевали 30 мл клеточной суспензии (4,5 млн клеток) при постоянном перемешивании на орбитальном шейкере с частотой 130 об/мин и через 20-24 ч проводили трансфекцию с использованием трансфецирующего реагента Lipofectamine-3000 Transfection Kit (Invitrogen, USA) согласно стандартному протоколу производителя [Lipofectamine-3000 Reagent Protocol, https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/lipofectamine3000_protocol.pdf]. Плазмидную ДНК (экспрессионные векторы, кодирующие легкую и тяжелую цепи мАТ) (Фиг. 4 и 5) добавляли к клеткам в виде ДНК-липосомного преципитата. Культуральный флакон инкубировали при температуре 37°C, 95% влажности, в атмосфере 8% CO₂ и непрерывном перемешивании 130 об/мин. После 7-9 дней инкубации культуры осаждали центрифугированием при 1200 оборотах/мин в течение 10 минут. Супернатант дополнительно центрифугировали при 4000 оборотов/мин в течение 15 минут.Chinese hamster ovary cells CHO DG44 (dhfr - / -) were used for secreted expression of recombinant humanized monoclonal antibody 5D3Hu. For this, the cells were cultured in Erlenmeyer flasks in a CO ₂ incubator at 37 ° C, 95% humidity and 8% CO ₂ in a standard serum-free CD DG44 medium (Invitrogen) supplemented with a 200 mM L-Glutamine solution to a final concentration of 8 mM and containing 0 , 18% (v / v) Pluronic F-68 (Invitrogen, USA) to a concentration of 4x10 ⁶ cells / ml 24 hours before transfection. In 125 ml Erlenmeyer flasks, 30 ml of cell suspension (4.5 million cells) were inoculated with constant stirring on an orbital shaker at 130 rpm, and after 20-24 hours transfection was carried out using the Lipofectamine-3000 Transfection Kit transfection reagent (Invitrogen, USA) according to the manufacturer's standard protocol [Lipofectamine-3000 Reagent Protocol, https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/lipofectamine3000_protocol.pdf]. Plasmid DNA (expression vectors encoding mAb light and heavy chains) (FIGS. 4 and 5) was added to the cells as a DNA liposome precipitate. The culture flask was incubated at a temperature of 37 ° C, 95% humidity, in an atmosphere of 8% CO ₂ and continuous stirring at 130 rpm. After 7-9 days of incubation, the cultures were precipitated by centrifugation at 1200 rpm for 10 minutes. The supernatant was additionally centrifuged at 4000 rpm for 15 minutes.

Измерение концентрации клеток и их жизнеспособности проводили с использованием 0.04% раствора трипанового синего в камере Горяева. Продуктивность измеряли с помощью иммуноферментного анализа по стандартной методике.The concentration of cells and their viability were measured using a 0.04% trypan blue solution in a Goryaev chamber. Productivity was measured using enzyme-linked immunosorbent assay according to the standard method.

Проводили выделение антитела 5D3Hu из культуральной жидкости на колонке с носителем HiTrap MabSelect SuRe (GE Healtcare) объемом 5 мл. К культуральной жидкости добавляли 0,1 объема 10-кратного Tris-HCl буфера (200 мМ Tris-HCl, 1,5 М NaCl рН 7.2) и наносили на предварительно уравновешенную колонку при скорости потока 2-3 мл/мин при давлении не более 0,5 МПа. Колонку промывали буфером Tris-HCl объемом равным 5 объемам колонки. Элюцию осуществляли с помощью глицинового буфера (0.1 М глицин, рН 3.0). Элюированный раствор нейтрализовали, добавляя 0,1 объема буфера для нейтрализации (1 M Tris pH 8.0). Полученный раствор белка диализировали против фосфатного буфера (0,01 М Na₂HPO₄, 0.137 М NaCl, 0.0027 М KCl, рН 7,2) и стерилизовали через мембранные фильтры 0.22 мкм. Оценку гомогенности и степени очистки препарата проводили с использованием электрофоретического метода. Дополнительно образцы характеризовали с помощью гель-фильтрации по стандартной методике.The 5D3Hu antibody was isolated from the culture liquid on a column with a HiTrap MabSelect SuRe carrier (GE Healtcare) with a volume of 5 ml. 0.1 volume of 10-fold Tris-HCl buffer (200 mM Tris-HCl, 1.5 M NaCl pH 7.2) was added to the culture liquid and applied to a pre-equilibrated column at a flow rate of 2-3 ml / min at a pressure of no more than 0 , 5 MPa. The column was washed with 5 column volumes Tris-HCl buffer. Elution was performed using glycine buffer (0.1 M glycine, pH 3.0). The eluted solution was neutralized by adding 0.1 volume of neutralization buffer (1 M Tris pH 8.0). The resulting protein solution was dialyzed against a phosphate buffer (0.01 M Na ₂ HPO ₄ , 0.137 M NaCl, 0.0027 M KCl, pH 7.2) and sterilized through 0.22 µm membrane filters. The homogeneity and degree of purification of the preparation was assessed using the electrophoretic method. Additionally, the samples were characterized by gel filtration according to the standard method.

Антитела были выделены (Фиг. 2) и их аффинность и специфичность, а также способность ингибировать рост клеточных линий, экспрессирующих белок PRAME человека изучены. Antibodies were isolated (Fig. 2) and their affinity and specificity, as well as the ability to inhibit the growth of cell lines expressing the human PRAME protein, were studied.

Пример 2. Анализ связывания мышиного моноклонального антитела 5D3 и гуманизированного моноклонального антитела 5D3Hu с опухолевым белком PRAME человека.Example 2. Binding assay of murine monoclonal antibody 5D3 and humanized monoclonal antibody 5D3Hu to human PRAME tumor protein.

Электрофорез белков проводили по методу Лэммли. На одну дорожку 10%-го ПААГ наносили 1 или 2 мкг рекомбинантного белка PRAME (в буфере с 100 мМ DTT для восстанавливающих условий либо без DTT для невосстанавливающих). После электрофореза перенос белков из геля на Hybond-P PVDF мембрану (GE Healthcare, Великобритания) осуществляли методом полусухого электроблоттинга в течение часа. В качестве первичного антитела использовали гуманизированное антитело 5D3Hu в концентрации 3 мкг/мл. Затем инкубировали мембрану с вторичным антителом 4G7-HRP (ОАО «ВЦМДЛ», Россия) в разведении 1:50000 в течение 1 ч при комнатной температуре. Иммуноблот представлен на Фиг. 3.Protein electrophoresis was performed according to the Laemmli method. One lane of 10% PAGE was loaded with 1 or 2 μg of the recombinant PRAME protein (in buffer with 100 mM DTT for reducing conditions or without DTT for non-reducing conditions). After electrophoresis, the transfer of proteins from the gel to a Hybond-P PVDF membrane (GE Healthcare, UK) was carried out by semi-dry electroblotting for an hour. Humanized 5D3Hu antibody at a concentration of 3 μg / ml was used as the primary antibody. Then, the membrane was incubated with a secondary antibody 4G7-HRP (JSC "VTsMDL", Russia) at a dilution of 1: 50,000 for 1 h at room temperature. The immunoblot is shown in FIG. 3.

Пример 3. Измерение константы диссоциации (Кд) комплекса гуманизированного антитела 5D3Hu с рекомбинантным белком PRAME, полученным в E. coli. Example 3. Measurement of the dissociation constant (Kd) of the complex of the humanized antibody 5D3Hu with the recombinant PRAME protein obtained in E. coli.

Аффинность моноклонального гуманизированного антитела 5D3Hu измеряли на биосенсоре, использующим технологию QCM (quartz crystal microbalance), Attana Cell A200 (Attana, Швеция). Рекомбинантный белок PRAME (40 мкг/мкл) иммобилизировали на LNB-carboxyl сенсорный чип, пришивая белок ковалентно через аминогруппы. Эксперименты по связыванию гуманизированного антитела 5D3Hu с рекомбинантным белком PRAME проводили в буферном растворе HEPES, содержащим 0.005% полисорбата 20 (25 мкл/мин, 22°C). Четыре серийных разведения гуманизированного антитела 5D3Hu (в концентрации 12.5-1.6 мкг/мл) наносили на чип с иммобилизованным белком PRAME (Фиг. 4) в трех повторах каждая в случайном порядке. Чип регенерировали раствором глицина 10 мМ, pH=1.5 в течение 30 секунд перед каждым циклом связывания. Перед каждой инъекцией антитела проводили инъекцию буфера, которую использовали как референс при обработке результатов с помощью программного обеспечения Attana Attester (Attana, Швеция). Для расчета константы диссоциации используют модель связывания 1:1. The affinity of the monoclonal humanized antibody 5D3Hu was measured on a biosensor using the technology QCM (quartz crystal microbalance), Attana Cell A200 (Attana, Sweden). The recombinant PRAME protein (40 μg / μL) was immobilized on an LNB-carboxyl sensory chip by covalently attaching the protein through amino groups. Experiments on binding of the humanized 5D3Hu antibody to the recombinant PRAME protein were carried out in a HEPES buffer solution containing 0.005% polysorbate 20 (25 μL / min, 22 ° C). Four serial dilutions of the humanized 5D3Hu antibody (at a concentration of 12.5-1.6 μg / ml) were applied to the chip with immobilized PRAME protein (Fig. 4) in triplicate each in random order. The chip was regenerated with a 10 mM glycine solution, pH = 1.5 for 30 seconds before each binding cycle. Before each injection of the antibody, a buffer was injected, which was used as a reference when processing the results using the Attana Attester software (Attana, Sweden). A 1: 1 binding model is used to calculate the dissociation constant.

Пример 4. Example 4.

С целью подтверждения того, что при замене отдельных а.о. в каркасных регионах на другие а.о. остатки было получено модифицированное антитело, в котором отдельные а.о. изменены на человеческие. Были получены модифицированные последовательности SEQ ID NO: 1М и SEQ ID NO: 2М, имеющая гомологию не менее чем на 90 % (модифицированные а.о. выделены жирным) с SEQ ID NO: 1 (степень гомологии - 93,16%) и SEQ ID NO: 2 (степень гомологии - 94,64%).In order to confirm that when replacing individual JSCs. in frame regions to other JSCs residues were obtained modified antibody, in which individual amino acids. changed to human. Modified sequences of SEQ ID NO: 1M and SEQ ID NO: 2M were obtained, having a homology of at least 90% (modified amino acids are highlighted in bold) with SEQ ID NO: 1 (degree of homology - 93.16%) and SEQ ID NO: 2 (degree of homology - 94.64%).

Полученное антитело специфически взаимодействовало с рекомбинантным белком PRAME и значение констант диссоциации комплексов антиген-антитело, равное 1.6 нМ, не отличалось в пределах статистической погрешности от антитела с последовательностями SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2.The resulting antibody specifically interacted with the recombinant PRAME protein, and the value of the dissociation constants of antigen-antibody complexes equal to 1.6 nM did not differ within the statistical error from the antibody with the sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.

Пример 5. Ингибирование роста клеточных линий, экспрессирующих PRAME с использованием системы xCELLigence.Example 5. Inhibition of the growth of cell lines expressing PRAME using the xCELLigence system.

Анализ влияния гуманизированного антитела 5D3Hu на пролиферацию опухолевых клеток проводили в режиме реального времени с использованием системы xCELLigence.Analysis of the effect of the humanized 5D3Hu antibody on the proliferation of tumor cells was performed in real time using the xCELLigence system.

Изучение изменений пролиферативного потенциала клеток на приборе с использованием системы xCELLigence происходит за счет измерения прибором электрического импеданса. Электрический импеданс, который измеряется прибором при контакте плазматической мембраны клетки с поверхностью электрода, выражается в изменении электрического потенциала клетки. Изменение величины электрического импеданса под действием антител (либо других цитотоксических агентов, например, клеток) показывает изменение клеточного индекса. Данные изменения выражаются в виде графика в логарифмической системе координат в режиме реального времени.The study of changes in the proliferative potential of cells on the device using the xCELLigence system occurs by measuring the electrical impedance with the device. The electrical impedance, which is measured by the device when the cell plasma membrane contacts the electrode surface, is expressed as a change in the cell's electrical potential. The change in the electrical impedance value under the action of antibodies (or other cytotoxic agents, for example, cells) shows a change in the cell index. These changes are expressed as a graph in a logarithmic coordinate system in real time.

Проводили серию экспериментов по изучению изменений клеточного индекса линии меланомы Mel P совместной инкубации с гуманизированным антителом 5D3Hu и мышиным мАТ 5D3 с конечными концентрациями в лунке 100 мкг/мл.A series of experiments was carried out to study changes in the cell index of the melanoma line Mel P of co-incubation with the humanized antibody 5D3Hu and mouse mAb 5D3 with final concentrations in the well of 100 μg / ml.

В качестве отрицательного контроля использовали гуманизированное мАТ 1C5Hu (специфичное к гликопротеину вируса бешенства) с конечной концентрацией в лунке 100 мкг/мл и раствор фосфатно-солевого буфера. Клетки линии MelP снимали с подложки с помощью среды RPMI 1640 (Sigma Aldrich, США) и ресуспендировали в той же среде. Затем подсчитывали концентрации клеток в камере Горяева, клетки засевали в лунки 16 луночного культурального планшета с концентрацией клеток 25000/мл для линии MelP c содержанием фетальной бычьей сыворотки равной 10%. Время инкубации клеток в лунках прибора xCELLingence составляло 24 часа при условии температуры +37С° и содержании СО₂, равном 5%. После 24 часов инкубации клеток очередной цикл работы прибора приостанавливали. К клеткам в лунках культурального 16-луночного планшета добавляли гуманизированное антитело 5D3Hu, мышиное мАТ 5D3 и контрольное мАТ 1C5Hu (специфичное к гликопротеину вируса бешенства).Humanized mAb 1C5Hu (specific to the glycoprotein of the rabies virus) with a final concentration in the well of 100 μg / ml and a solution of phosphate-buffered saline were used as a negative control. MelP cells were removed from the support using RPMI 1640 medium (Sigma Aldrich, USA) and resuspended in the same medium. Then the concentration of cells in the Goryaev chamber was calculated, the cells were seeded into the wells of a 16-well culture plate with a cell concentration of 25000 / ml for the MelP line with a fetal bovine serum content equal to 10%. The incubation time of cells in the wells of the xCELLingence device was 24 hours under the condition of a temperature of + 37C ° and a CO ₂ content of 5%. After 24 hours of cell incubation, the next cycle of the device was suspended. Humanized antibody 5D3Hu, mouse mAb 5D3, and control mAb 1C5Hu (specific to rabies virus glycoprotein) were added to the cells in the wells of a 16-well culture plate.

Полученные результаты эксперимента по совместной инкубации антител с клетками линии Mel P, демонстрирующие ингибирующую пролиферацию активность в отношении PRAME-позитивной клеточной линии, представлены на Фиг 7.The results of an experiment on co-incubation of antibodies with Mel P cells showing proliferation-inhibiting activity against a PRAME-positive cell line are shown in FIG. 7.

Пример 6. Фрагменты ДНК, кодирующий вариабельные тяжелую и легкую цепи гуманизированного мАТ, селективно связывающего антиген PRAME, содержащего последовательность аминокислот, гомологичную SEQ ID NO: 1 и последовательность аминокислот, гомологичную SEQ ID NO: 2 приведены в перечне последовательностей - SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4.Example 6. DNA fragments encoding the variable heavy and light chains of a humanized mAb selectively binding the PRAME antigen containing an amino acid sequence homologous to SEQ ID NO: 1 and an amino acid sequence homologous to SEQ ID NO: 2 are shown in the sequence listing - SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4.

--->--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙLIST OF SEQUENCES

<110> Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова" (МГУ)<110> Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Professional Education "Lomonosov Moscow State University" (MSU)

<120> ГУМАНИЗИРОВАННОЕ АНТИТЕЛО 5D3HU, СВЯЗЫВАЮЩЕЕСЯ С ОПУХОЛЕВЫМ АНТИГЕНОМ PRAME, ФРАГМЕНТЫ ДНК, КОДИРУЮЩИЕ УКАЗАННОЕ АНТИТЕЛО И АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЙ ФРАГМЕНТ АНТИТЕЛА<120> HUMANIZED ANTIBODY 5D3HU BINDING WITH TUMOR ANTIGEN PRAME, DNA FRAGMENTS ENCODING THE SPECIFIED ANTIBODY AND ANTIGEN BINDING FRAGMENT ANTIGEN

<160> SEQ ID NО:1<160> SEQ ID NO: 1

<210> 1<210> 1

<211> 117<211> 117

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<223> Variable domain of heavy chain of monoclonal humanized antibody 5D3Hu to human antigen PRAME<223> Variable domain of heavy chain of monoclonal humanized antibody 5D3Hu to human antigen PRAME

<400> 1<400> 1

1 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGITFS DYGMVWVRQA PGKGLEWVSY 1 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGITFS DYGMVWVRQA PGKGLEWVSY

51 ISSGSSTIYY ADTVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAHYY 51 ISSGSSTIYY ADTVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAHYY

101 GFGFSYWGQG TLVTVSS101 GFGFSYWGQG TLVTVSS

<160> SEQ ID NО:1M<160> SEQ ID NO: 1M

<400> 1M<400> 1M

1 EVQLVETGAG VVQPGGSLKL SCAATGITFS DYGMVWVRQA PGKGLEWVSY1 EVQLVETGAG VVQPGGSLKL SCAATGITFS DYGMVWVRQA PGKGLEWVSY

51 ISSGSSTIYY ADTVKGRFTI SRDNAKNTIY LQMNSLRAED TGVYYCAHYY51 ISSGSSTIYY ADTVKGRFTI SRDNAKNTIY LQMNSLRAED TGVYYCAHYY

101 GFGFSYWGQG TLVTVSS101 GFGFSYWGQG TLVTVSS

<160> SEQ ID NО:2<160> SEQ ID NO: 2

<210> 1<210> 1

<211> 112<211> 112

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<223> Variable domain of light chain of monoclonal humanized antibody 5D3Hu to human antigen PRAME<223> Variable domain of light chain of monoclonal humanized antibody 5D3Hu to human antigen PRAME

<400> 2<400> 2

1 DVVMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCRSSQSLV HSNGNTYSHW FQQRPGQSPR 1 DVVMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCRSSQSLV HSNGNTYSHW FQQRPGQSPR

51 LLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCSQSTHVP 51 LLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCSQSTHVP

101 FTFGQGTKVE IK101 FTFGQGTKVE IK

<160> SEQ ID NО:2M<160> SEQ ID NO: 2M

<400> 2M<400> 2M

1 DVVMTQTPLT IPVTLAQPAS ISCRSSQSLV HSNGNTYSHW FQQRPAQSPR1 DVVMTQTPLT IPVTLAQPAS ISCRSSQSLV HSNGNTYSHW FQQRPAQSPR

51 LLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTIKI SRVEAEDVGV YYCSQSTHVP51 LLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTIKI SRVEAEDVGV YYCSQSTHVP

101 FTFGQGTKVE IK101 FTFGQGTKVE IK

<160> SEQ ID NО:3 <160> SEQ ID NO: 3

<210> 1<210> 1

<211> 351<211> 351

<212> DNA<212> DNA

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<400> 3<400> 3

1 GAGGTGCAGC TGGTGGAGAG CGGCGGCGGC CTGGTGCAGC CCGGCGGCAG1 GAGGTGCAGC TGGTGGAGAG CGGCGGCGGC CTGGTGCAGC CCGGCGGCAG

51 CCTGAGGCTG AGCTGCGCCG CCAGCGGCAT CACCTTCAGC GACTACGGCA51 CCTGAGGCTG AGCTGCGCCG CCAGCGGCAT CACCTTCAGC GACTACGGCA

101 TGGTGTGGGT GAGGCAGGCC CCCGGCAAGG GCCTGGAGTG GGTGAGCTAC101 TGGTGTGGGT GAGGCAGGCC CCCGGCAAGG GCCTGGAGTG GGTGAGCTAC

151 ATCAGCAGCG GCAGCAGCAC CATCTACTAC GCCGACACCG TGAAGGGCAG151 ATCAGCAGCG GCAGCAGCAC CATCTACTAC GCCGACACCG TGAAGGGCAG

201 GTTCACCATC AGCAGGGACA ACGCCAAGAA CAGCCTGTAC CTGCAGATGA201 GTTCACCATC AGCAGGGACA ACGCCAAGAA CAGCCTGTAC CTGCAGATGA

251 ACAGCCTGAG GGCCGAGGAC ACCGCCGTGT ACTACTGCGC CCACTACTAC251 ACAGCCTGAG GGCCGAGGAC ACCGCCGTGT ACTACTGCGC CCACTACTAC

301 GGCTTCGGCT TCAGCTACTG GGGCCAGGGC ACCCTGGTGA CCGTGAGCAG301 GGCTTCGGCT TCAGCTACTG GGGCCAGGGC ACCCTGGTGA CCGTGAGCAG

<160> SEQ ID NО:4 <160> SEQ ID NO: 4

<210> 1<210> 1

<211> 336<211> 336

<212> DNA<212> DNA

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<400> 4<400> 4

1 GACGTGGTGA TGACCCAGAG CCCCCTGAGC CTGCCCGTGA CCCTGGGCCA1 GACGTGGTGA TGACCCAGAG CCCCCTGAGC CTGCCCGTGA CCCTGGGCCA

51 GCCCGCCAGC ATCAGCTGCA GGAGCAGCCA GAGCCTGGTG CACAGCAACG51 GCCCGCCAGC ATCAGCTGCA GGAGCAGCCA GAGCCTGGTG CACAGCAACG

101 GCAACACCTA CAGCCACTGG TTCCAGCAGA GGCCCGGCCA GAGCCCCAGG101 GCAACACCTA CAGCCACTGG TTCCAGCAGA GGCCCGGCCA GAGCCCCAGG

151 CTGCTGATCT ACAAGGTGAG CAACAGGTTC AGCGGCGTGC CCGACAGGTT151 CTGCTGATCT ACAAGGTGAG CAACAGGTTC AGCGGCGTGC CCGACAGGTT

201 CAGCGGCAGC GGCAGCGGCA CCGACTTCAC CCTGAAGATC AGCAGGGTGG201 CAGCGGCAGC GGCAGCGGCA CCGACTTCAC CCTGAAGATC AGCAGGGTGG

251 AGGCCGAGGA CGTGGGCGTG TACTACTGCA GCCAGAGCAC CCACGTGCCC251 AGGCCGAGGA CGTGGGCGTG TACTACTGCA GCCAGAGCAC CCACGTGCCC

301 TTCACCTTCG GCCAGGGCAC CAAGGTGGAG ATCAAG301 TTCACCTTCG GCCAGGGCAC CAAGGTGGAG ATCAAG

<---<---

Claims

1. Humanized monoclonal antibody 5D3Hu, selectively binding the human PRAME tumor antigen, comprising the variable region of the heavy chain (VH) of the specified antibody, containing an amino acid sequence not less than 90% homologous to SEQ ID NO: 1, and the variable region of the light chain (VL) the specified antibody contains an amino acid sequence that is not less than 90% homologous to SEQ ID NO: 2.

2. An isolated DNA fragment encoding an antibody VH according to claim 1, with the nucleotide sequence SEQ ID NO: 3.

3. An isolated DNA fragment encoding an antibody VL according to claim 1, with the nucleotide sequence SEQ ID NO: 4.

4. An antigen-binding fragment of a monoclonal antibody according to claim 1, selectively binding a human PRAME tumor antigen containing a variable region of the heavy chain (VH) of said antibody with an amino acid sequence not less than 90% homologous to SEQ ID NO: 1, and a variable region of the light chain (VL) said antibody with an amino acid sequence not less than 90% homologous to SEQ ID NO: 2.