RU2758260C1 - Method for producing autologous fibrin with controlled fibrinogen content without using exogenous thrombin - Google Patents
Method for producing autologous fibrin with controlled fibrinogen content without using exogenous thrombin Download PDFInfo
- Publication number
- RU2758260C1 RU2758260C1 RU2020143003A RU2020143003A RU2758260C1 RU 2758260 C1 RU2758260 C1 RU 2758260C1 RU 2020143003 A RU2020143003 A RU 2020143003A RU 2020143003 A RU2020143003 A RU 2020143003A RU 2758260 C1 RU2758260 C1 RU 2758260C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- fibrin
- fibrinogen
- thrombin
- precipitate
- controlled
- Prior art date
Links
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 92
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 title claims abstract description 83
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 title claims abstract description 83
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 title claims abstract description 83
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 title claims abstract description 58
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 title claims abstract description 56
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 title claims abstract description 55
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 title claims abstract description 54
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 title claims abstract description 54
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 6
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims abstract description 39
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 38
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims abstract description 29
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 22
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims abstract description 11
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 claims abstract description 5
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims abstract description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims abstract description 4
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 claims abstract 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims abstract 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims abstract 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 claims description 19
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 10
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 abstract description 19
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 14
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 11
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 238000007865 diluting Methods 0.000 abstract description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 25
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 14
- 108010080379 Fibrin Tissue Adhesive Proteins 0.000 description 13
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 11
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 11
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 11
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 11
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 9
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 7
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 7
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 6
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 6
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 6
- 239000000306 component Substances 0.000 description 6
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 5
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 5
- 210000004623 platelet-rich plasma Anatomy 0.000 description 5
- 208000010110 spontaneous platelet aggregation Diseases 0.000 description 5
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 4
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 4
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 4
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 4
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 4
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 4
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 4
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 4
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 4
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 4
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 4
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 230000020764 fibrinolysis Effects 0.000 description 4
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 4
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 4
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 4
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 3
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 3
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 3
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 3
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 3
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 3
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 108010073651 fibrinmonomer Proteins 0.000 description 3
- 210000003709 heart valve Anatomy 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 3
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 3
- PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methylpiperazin-1-yl)-2,5'-bibenzimidazole Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1C1=NC2=CC=C(C=3NC4=CC(=CC=C4N=3)N3CCN(C)CC3)C=C2N1 PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJRKANNOPXMZSG-SSPAHAAFSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;(2r,3s,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O IJRKANNOPXMZSG-SSPAHAAFSA-N 0.000 description 2
- XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 5'-adenylphosphoric acid Chemical class C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 2
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010014172 Factor V Proteins 0.000 description 2
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 2
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 2
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 2
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 2
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 230000008614 cellular interaction Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 2
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 2
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 2
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 2
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 230000000379 polymerizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 230000002787 reinforcement Effects 0.000 description 2
- 239000000565 sealant Substances 0.000 description 2
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 239000004753 textile Substances 0.000 description 2
- 239000003106 tissue adhesive Substances 0.000 description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 102100033312 Alpha-2-macroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229930183010 Amphotericin Natural products 0.000 description 1
- QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N Amphotericin A Natural products OC1C(N)C(O)C(C)OC1OC1C=CC=CC=CC=CCCC=CC=CC(C)C(O)C(C)C(C)OC(=O)CC(O)CC(O)CCC(O)C(O)CC(O)CC(O)(CC(O)C2C(O)=O)OC2C1 QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010002198 Anaphylactic reaction Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108010091326 Cryoglobulins Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 229940124255 Factor V inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108010071289 Factor XIII Proteins 0.000 description 1
- 108010000196 Factor XIIIa Proteins 0.000 description 1
- 101800000974 Fibrinopeptide A Proteins 0.000 description 1
- 101800003778 Fibrinopeptide B Proteins 0.000 description 1
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010061216 Infarction Diseases 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 238000000585 Mann–Whitney U test Methods 0.000 description 1
- 241000410159 Matticnemis doi Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108010022425 Platelet Glycoprotein GPIIb-IIIa Complex Proteins 0.000 description 1
- 108010015078 Pregnancy-Associated alpha 2-Macroglobulins Proteins 0.000 description 1
- 208000002847 Surgical Wound Diseases 0.000 description 1
- 229940122388 Thrombin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 1
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 108060008539 Transglutaminase Proteins 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 108090000183 alpha-2-Antiplasmin Proteins 0.000 description 1
- 102000003801 alpha-2-Antiplasmin Human genes 0.000 description 1
- VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N alprazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NN=C2CN=C1C1=CC=CC=C1 VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 229940009444 amphotericin Drugs 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 230000036783 anaphylactic response Effects 0.000 description 1
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000006427 angiogenic response Effects 0.000 description 1
- 229940030225 antihemorrhagics Drugs 0.000 description 1
- 230000000712 assembly Effects 0.000 description 1
- 238000000429 assembly Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- -1 bioactive molecules Substances 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 229940019700 blood coagulation factors Drugs 0.000 description 1
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 238000013130 cardiovascular surgery Methods 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000000038 chest Anatomy 0.000 description 1
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 229940012444 factor xiii Drugs 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000003527 fibrinolytic agent Substances 0.000 description 1
- 230000003480 fibrinolytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000004023 fresh frozen plasma Substances 0.000 description 1
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000001631 haemodialysis Methods 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 230000000322 hemodialysis Effects 0.000 description 1
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 1
- 239000002874 hemostatic agent Substances 0.000 description 1
- 230000002439 hemostatic effect Effects 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-UHFFFAOYSA-N hexane-1,2,3,4,5,6-hexol Chemical compound OCC(O)C(O)C(O)C(O)CO FBPFZTCFMRRESA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 230000000642 iatrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000007574 infarction Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002649 leather substitute Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000037081 physical activity Effects 0.000 description 1
- 238000002616 plasmapheresis Methods 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 108010015680 recombinant human thrombin Proteins 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000009392 systemic autoimmunity Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229960003766 thrombin (human) Drugs 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- GYDJEQRTZSCIOI-LJGSYFOKSA-N tranexamic acid Chemical compound NC[C@H]1CC[C@H](C(O)=O)CC1 GYDJEQRTZSCIOI-LJGSYFOKSA-N 0.000 description 1
- 229960000401 tranexamic acid Drugs 0.000 description 1
- 102000003601 transglutaminase Human genes 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 230000000472 traumatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/16—Blood plasma; Blood serum
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Virology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области регенеративной медицины и тканевой инженерии. Полученный таким образом аутологичный фибрин может быть использован как самостоятельный каркас, биоматрикс или в качестве модифицирующего покрытия. Изобретение будет полезным также для экспериментальной медицины при моделировании фибрин-заинтересованных процессов in vitro и in vivo (клеточных взаимодействий, влияния лекарственных, физических или химических факторов).The invention relates to the field of regenerative medicine and tissue engineering. The autologous fibrin obtained in this way can be used as an independent scaffold, biomatrix, or as a modifying coating. The invention will also be useful for experimental medicine when modeling fibrin-interested processes in vitro and in vivo (cellular interactions, the influence of medicinal, physical or chemical factors).
Фибрин представляет собой биополимер, который, благодаря своим уникальным свойствам, широко используется в различных областях медицины. Фибриновый гель с успехом применяют в медицине для остановки кровотечений (US 8821861 B2. Fibrin sealant. Stephanie A. Smith (US), James H. Morrissey (US). Appl. No.: 12/680,947. Date of Patent: Sep.2, 2014), как средство ускоряющее заживление ран, в качестве герметика при повреждениях тканей (Breen AM, Dockery Р, O'Brien Т, Pandit AS. The use of therapeutic gene eNOS delivered via a fibrin scaffold enhances wound healing in a compromised wound model. Biomaterials. 2008 Jul; 29(21):3143-51. doi:10.1016/j.biomaterials.2008.04.020). Большие перспективы для применения фибрина раскрываются в тканевой инженерии и регенеративной медицине. Клеточная терапия создает условия для лучшей регенерации и восстановления функциональности ткани путем непосредственного введения стволовых или прогениторных клеток в область повреждения (клеточная терапия). В клеточной терапии фибрин может быть полезен в качестве биоматрикса или клеточного каркаса для прогениторных или стволовых клеток (WO 2003093433 A3. Fibrin-based biomatrix. Jianyi Zhang (US), Zong Li Wang (US), publication 2004-07-29. US 7442397 B2. Pegylated fibrinogen-based biomatrix. Jianyi Zhang (US), Date of Patent: Oct. 28, 2008). Доказано, что имплантация клеток непосредственно в мышцу неэффективна и клетки удаляются или погибают примерно через 24 часа после имплантации (Martens TP, Godier AF, Parks JJ, et al. Percutaneous cell delivery into the heart using hydrogels polymerizing in situ. Cell Transplant. 2009; 18(3): 297-304. doi:10.3727/096368909788534915. Nakamuta JS, Danoviz ME, Marques FL, dos Santos L, Becker C, Goncalves GA, Vassallo PF, Schettert IT, Tucci PJ, Krieger JE. Cell therapy attenuates cardiac dysfunction post myocardial infarction: effect of timing, routes of injection and a fibrin scaffold. PLoS One. 2009; 4(6): e6005. doi: 10.1371/journal.pone.0006005). Введение клеток в составе биополимеров, таких как фибрин, помогает сохранить и обеспечить жизнеспособность клеток в месте имплантации, делая ее эффективной (Christman KL, Vardanian AJ, Fang Q, Sievers RE, Fok HH, Lee RJ. Injectable fibrin scaffold improves cell transplant survival, reduces infarct expansion, and induces neovasculature formation in ischemic myocardium. J Am Coll Cardiol. 2004; 44(3): 654-60. doi: 10.1016/j.jacc.2004.04.040. Hunt NC, Grover LM. Cell encapsulation using biopolymer gels for regenerative medicine. Biotechnol Lett. 2010; 32(6): 733-42. doi: 10.1007/s 10529-010-0221-0).Fibrin is a biopolymer that, due to its unique properties, is widely used in various fields of medicine. Fibrin gel has been successfully used in medicine to stop bleeding (US 8821861 B2. Fibrin sealant. Stephanie A. Smith (US), James H. Morrissey (US). Appl. No .: 12 / 680,947. Date of Patent: Sep.2) , 2014), as a means of accelerating wound healing, as a sealant for tissue damage (Breen AM, Dockery P, O'Brien T, Pandit AS. The use of therapeutic gene eNOS delivered via a fibrin scaffold enhances wound healing in a compromised wound model . Biomaterials. 2008 Jul; 29 (21): 3143-51. Doi: 10.1016 / j.biomaterials. 2008.04.020). Great prospects for the use of fibrin are revealed in tissue engineering and regenerative medicine. Cell therapy creates conditions for better regeneration and restoration of tissue functionality by direct injection of stem or progenitor cells into the damaged area (cell therapy). In cell therapy, fibrin can be useful as a biomatrix or scaffold for progenitor or stem cells (WO 2003093433 A3. Fibrin-based biomatrix. Jianyi Zhang (US), Zong Li Wang (US), publication 2004-07-29. US 7442397 B2 Pegylated fibrinogen-based biomatrix Jianyi Zhang (US) Date of Patent: Oct 28, 2008). It has been proven that implanting cells directly into the muscle is ineffective and cells are removed or killed approximately 24 hours after implantation (Martens TP, Godier AF, Parks JJ, et al. Percutaneous cell delivery into the heart using hydrogels polymerizing in situ. Cell Transplant. 2009; 18 (3): 297-304. Doi: 10.3727 / 096368909788534915. Nakamuta JS, Danoviz ME, Marques FL, dos Santos L, Becker C, Goncalves GA, Vassallo PF, Schettert IT, Tucci PJ, Krieger JE. Cell therapy attenuates cardiac dysfunction post myocardial infarction: effect of timing, routes of injection and a fibrin scaffold.PLoS One. 2009; 4 (6): e6005.doi: 10.1371 / journal.pone.0006005). The introduction of cells in the composition of biopolymers such as fibrin helps to maintain and ensure the viability of cells at the implantation site, making it effective (Christman KL, Vardanian AJ, Fang Q, Sievers RE, Fok HH, Lee RJ. Injectable fibrin scaffold improves cell transplant survival, reduces infarct expansion, and induces neovasculature formation in ischemic myocardium. J Am Coll Cardiol. 2004; 44 (3): 654-60. doi: 10.1016 / j.jacc. 2004.04.040. Hunt NC, Grover LM. Cell encapsulation using biopolymer gels for regenerative medicine Biotechnol Lett 2010; 32 (6): 733-42 doi: 10.1007 / s 10529-010-0221-0).
Фибриновый гель предложен в качестве системы доставки факторов роста, биоактивных молекул, лекарственных средств (Wong С, Inman Е, Spaethe R, Helgerson S. Fibrin-based biomaterials to deliver human growth factors. Thromb Haemost. 2003; 89(3): 573-82. PMID: 12624643. Rubalskii, E., Ruemke, S., Salmoukas, C. et al. Fibrin glue as a local drug-delivery system for bacteriophage PA5. Sci Rep 9, 2091 (2019). doi:10.1038/s41598-018-38318-4) с возможностью регулирования кинетики высвобождения веществ за счет изменения состава композиции, аффинности и количества ковалентных связей (Spicer РР, Mikos AG. Fibrin glue as a drug delivery system. J Control Release. 2010; 148(1):49-55. doi:10.1016/j.jconrel.2010.06.025). Широкий спектр применения фибрина в тканевой инженерии в качестве самостоятельного каркаса или модифицирующего покрытия при создании сердечно-сосудистых протезов (Moreira R, Neusser С, Kruse М, Mulderrig S, Wolf F, Spillner J, Schmitz-Rode T, Jockenhoevel S, Mela P. Tissue-Engineered Fibrin-Based Heart Valve with Bio-Inspired Textile Reinforcement. Adv Healthc Mater. 2016; 5(16): 2113-21. doi: 10.1002/adhm.201600300. T.C. Flanagan, C. Cornelissen, S. Koch, B. Tschoeke, J.S. Sachweh. The in vitro development of autologous fibrin-based tissue-engineered heart valves through optimised dynamic conditioning. Biomater. 2007, 28 (23), 3388-3397, 7-10. Aper T, Wilhelmi M, Gebhardt C, Hoeffler K, Benecke N, Hilfiker A, Haverich A. Novel method for the generation of tissue-engineered vascular grafts based on a highly compacted fibrin matrix. Acta Biomater. 2016; 29: 21 -32. doi: 10.1016/j.actbio.2015.10.012. Gui L, Boyle MJ, Kamin YM, Huang AH, Starcher ВС, Miller CA, Vishnevetsky MJ, Niklason LE. Construction of tissue-engineered small-diameter vascular grafts in fibrin scaffolds in 30 days. Tissue Eng Part A. 2014; 20(9-10): 1499-507. doi: 10.1089/ten.TEA.2013.0263), как основы герметика для восстановление дефектов костной и хрящевой ткани (US 8986304 B2. Injection of fibrin sealant using reconstituted components in spinal applications. Brian D. Burkinshaw (US), Steven I. Whitlock (US), Kevin Pauza (US), Mark I. Richards (US), James B. Rogan (US). Date of Patent: Mar. 24, 2015. EP1395298B1. Fibrin porous structure. Yves Delmotte (BE). Publication 26.07.2006.
Каркасы в тканевой инженерии являются главной составляющей и должны соответствовать ряду общих требований (быть биосовместимым, соответствовать по физико-механическим свойствам тканям замещения, обладать биоактивностью, при этом не вызывать воспалительной и иммунной реакции организма при отсутствие потенциальной возможности передачи инфекции), а также специфических для каждого вида тканей. К примеру, для сосудистого каркаса такими специфическими требованиями является гемосовместимость, включающая отсутствие возможности активировать коагуляцию, агрегацию тромбоцитов и не вызывать гемолиз.Scaffolds in tissue engineering are the main component and must comply with a number of general requirements (be biocompatible, correspond to the physical and mechanical properties of replacement tissues, possess bioactivity, while not causing an inflammatory and immune response of the body in the absence of the potential for transmission of infection), as well as specific for each type of fabric. For example, for the vascular framework, such specific requirements are hemocompatibility, including the inability to activate coagulation, platelet aggregation and not cause hemolysis.
Различные синтетические полимеры и их сополимеры способны обеспечить необходимые физико-механические свойства (Pashneh-Tala S, MacNeil S, Claeyssens F. The Tissue-Engineered Vascular Graft-Past, Present, and Future. Tissue Eng Part В Rev. 2016; 22(1):68-100. doi: 10.1089/ten.teb.2015.0100). Однако, эти материалы обладают недостаточной биосовместимостью из-за отсутствия сайтов для клеточной адгезии, могут демонстрировать токсическое разложение, вызывать воспалительные и иммунные реакции (Mariani Е, Lisignoli G, Borzi RM, Pulsatelli L. Biomaterials: Foreign Bodies or Tuners for the Immune Response. Int J Mol Sci. 2019; 20(3):636. Published 2019 Feb 1. doi:10.3390/ijms20030636). Для повышения биосовместимости полимеров предлагаются различные способы их модификации среди которых создание на поверхности изолирующего, биосовместимого слоя. В качестве модифицирующего биосовместимого слоя, а в некоторых случаях и основного материала часто используют фибрин. Будучи натуральным физиологическим каркасом, он поддерживает ангиогенез и репарацию тканей (Hadjipanayi Е, Kuhn РН, Moog Р, et al. The Fibrin Matrix Regulates Angiogenic Responses within the Hemostatic Microenvironment through Biochemical Control. PLoS One. 2015; 10(8): e0135618). Волокна фибрина содержат сайты необходимые для адгезии, миграции и пролиферации клеток, создают условия для формирования полноценной ткани (Podolnikova NP, Yakovlev S, Yakubenko VP, et al. The interaction of integrin αIIbβ3 with fibrin occurs through multiple binding sites in the αIIb β-propeller domain. J Biol Chem. 2014; 289(4): 2371-2383. doi: 10.1074/jbc.M113.518126). Трехмерная пористая структура фибрина поддерживает жизнедеятельность клеток благодаря диффузии питательных веществ и кислорода внутрь фибринового каркаса и удалению отработанных продуктов (Aper Т, Teebken ОЕ, Steinhoff G, Haverich A. Use of a fibrin preparation in the engineering of a vascular graft model. Eur J Vasc Endovasc Surg 2004; 28: 296-302. doi: 10.1016/j.ejvs.2004.05.016). Фибрин имеет высокое сродство к различным биологическим поверхностям, способен повышать устойчивость клеток к смыванию током жидкости (удержание клеток на поверхности)
Фибрин является самым доступным из всех биополимеров. Фибриновые гели просто, в короткие сроки и в достаточном количестве могут быть получены из собственной крови пациентов. Использование аутологичного фибрина исключает риск переноса различных патогенов, не вызывает активации иммунной реакции организма на инородное тело. Наиболее доступным и дешевым способом получения аутологичного фибрина является выделение из плазмы крови преципитата, содержащего фибриноген, и последующая его полимеризация с помощью тромбина и ионов кальция.Fibrin is the most readily available of all biopolymers. Fibrin gels can be obtained simply, in a short time and in sufficient quantities from the patients' own blood. The use of autologous fibrin eliminates the risk of transferring various pathogens, does not activate the body's immune response to a foreign body. The most accessible and inexpensive way to obtain autologous fibrin is the isolation of a precipitate containing fibrinogen from the blood plasma, and its subsequent polymerization using thrombin and calcium ions.
Этап получения преципитата.The stage of obtaining the precipitate.
Преципитат получают путем осаждения белков плазмы крови. Помимо фибриногена в преципитате содержатся другие белки, в том числе фактор XIII, α2-антиплазмин, α2-макроглобулин, растворимая форма фибронектина (Ismail, Ayman Е. Purification of fibrinogen from human plasma. (2012) Chemical & Biomolecular Engineering Theses, Dissertations, & Student Research. 13), что является крайне полезным для стабилизации и сохранения сгустка фибрина.The precipitate is obtained by precipitation of blood plasma proteins. In addition to fibrinogen, the precipitate contains other proteins, including factor XIII, α2-antiplasmin, α2-macroglobulin, a soluble form of fibronectin (Ismail, Ayman E. Purification of fibrinogen from human plasma. (2012) Chemical & Biomolecular Engineering Theses, Dissertations, & Student Research 13), which is extremely beneficial for stabilizing and maintaining the fibrin clot.
Известны и подробно описаны различные методы получения преципитата, среди них наиболее популярны криопреципитация, преципитация этанолом (EtOH), преципитация аммония сульфатом ((NH4)2SO4), полиэтиленгликолем (ПЭГ), комбинацией преципитации аммония сульфатом с криопреципитацией, полиэтилен гликоля (ПЭГ) с криопреципитацией.Various methods for obtaining a precipitate are known and described in detail, among them the most popular are cryoprecipitation, precipitation with ethanol (EtOH), precipitation of ammonium sulfate ((NH 4 ) 2 SO 4 ), polyethylene glycol (PEG), a combination of ammonium sulfate precipitation with cryoprecipitation, polyethylene glycol (PEG ) with cryoprecipitation.
1. Метод криопреципитации (В. Casali, F. Rodeghiero, A. Tosetto, В. Palmieri, R. Immovilli, С. Ghedini, P. Rivasi. Fibrin glue from single-donation autologous plasmapheresis. Transfusion 1992, Volume32, Issue7, pp 641-643) очень длительный и на приготовление фибрина уходит до 30 часов. Плазма замораживается при -80°С и оставляется на 18 часов, после чего медленно размораживается при 4°С 16 часов. В результате в осадок выпадает криопреципитат содержащий фракцию криоглобулинов. Центрифугирование проводят при температуре 4°С 1000g 15 минут. Кроме длительности выполнения данный метод имеет еще один важный недостаток - крайне низкий итоговый выход фибриногена, по данным различных авторов от 24 до 36% от фибриногена, содержащегося в плазме (Galanakis, D.K. Plasma cryoprecipitation studies: major increase in fibrinogen yield by albumin enrichment of plasma. Thromb Res 78, 303, 1995. Weis-Fogh, U.S. Fibrinogen prepared from small blood samples for autologous use in a tissue adhesive system. Eur Surg Res 20, 381, 1988). Для повышения выхода фибриногена цикл замораживания/оттаивания иногда повторяют.1. Cryoprecipitation method (B. Casali, F. Rodeghiero, A. Tosetto, B. Palmieri, R. Immovilli, C. Ghedini, P. Rivasi. Fibrin glue from single-donation autologous plasmapheresis. Transfusion 1992, Volume32, Issue7, pp. 641-643) is very long and takes up to 30 hours to prepare fibrin. Plasma is frozen at -80 ° C and left for 18 hours, after which it is slowly thawed at 4 ° C for 16 hours. As a result, a cryoprecipitate containing a fraction of cryoglobulins precipitates. Centrifugation is carried out at a temperature of 4 ° C 1000g for 15 minutes. In addition to the duration of execution, this method has another important drawback - an extremely low final yield of fibrinogen, according to various authors, from 24 to 36% of fibrinogen contained in plasma (Galanakis, DK Plasma cryoprecipitation studies: major increase in fibrinogen yield by albumin enrichment of plasma Thromb Res 78, 303, 1995. Weis-Fogh, US Fibrinogen prepared from small blood samples for autologous use in a tissue adhesive system.
2. Преципитация аммония сульфатом с и без криопреципитации дает хороший выход фибриногена (54,8±5,3; 69,5±9,9), однако присутствие соли сульфата аммония в толще фибрина закисляет среду и поддерживает нестабильность рН. При этом полностью избавиться от солей с помощью промывания невозможно, поскольку фибрин имеет пористую структуру, в которой заключен большой объем остаточной жидкости. Данный факт негативно влияет на клеточную жизнедеятельность - значительно замедляется миграция клеток в толщу и синтез белков внеклеточного матрикса (ВКМ). Как результат происходит снижение прочностных характеристик образцов после заселения клетками за счет превалирования процессов фибринолиза и деградации над синтетическими (Dietrich М, Heselhaus J, Wozniak J, et al. Fibrin-based tissue engineering: comparison of different methods of autologous fibrinogen isolation. Tissue Eng Part С Methods. 2013; 19(3): 216-226. doi: 10.1089/ten.TEC2011.0473).2. Precipitation of ammonium sulfate with and without cryoprecipitation gives a good yield of fibrinogen (54.8 ± 5.3; 69.5 ± 9.9), however, the presence of ammonium sulfate salt in the fibrin mass acidifies the medium and maintains pH instability. At the same time, it is impossible to completely get rid of salts by washing, since fibrin has a porous structure, which contains a large volume of residual liquid. This fact has a negative effect on cellular activity - the migration of cells into the thickness and the synthesis of extracellular matrix proteins (ECM) are significantly slowed down. As a result, there is a decrease in the strength characteristics of the samples after colonization with cells due to the prevalence of fibrinolysis and degradation processes over synthetic ones (Dietrich M, Heselhaus J, Wozniak J, et al. Fibrin-based tissue engineering: comparison of different methods of autologous fibrinogen isolation. Tissue Eng Part C Methods. 2013; 19 (3): 216-226. Doi: 10.1089 / ten.TEC2011.0473).
3. Преципитация ПЭГ с и без криопреципитации дает высокий выход фибриногена (61,3±9,4%), однако демонстрирует самые низкие показатели физико-механики. Заселение клетками не улучшает прочностные свойства, что объясняется определенным негативным влиянием ПЭГ на синтез клетками белков ВКМ.3. PEG precipitation with and without cryoprecipitation gives a high yield of fibrinogen (61.3 ± 9.4%), but demonstrates the lowest indicators of physical mechanics. Population with cells does not improve the strength properties, which is explained by a certain negative effect of PEG on the synthesis of ECM proteins by cells.
4. Метод этаноловой преципитации достаточно прост и позволяет в течение 1-1,5 часов получать до 80% фибриногена, содержащегося в плазме крови (Weis-Fogh, U.S. Fibrinogen prepared from small blood samples for autologous use in a tissue adhesive system. Eur Surg Res 20, 381, 1988. Dietrich M, Heselhaus J, Wozniak J, et al. Fibrin-based tissue engineering: comparison of different methods of autologous fibrinogen isolation. Tissue Eng Part С Methods. 2013; 19(3): 216-226. doi: 10.1089/ten.TEC2011.0473). Полимеризованный из такого фибриногена фибрин обладает наилучшими прочностными характеристиками, при этом не зарегистрировано негативного влияния этаноловой преципитации на клеточную жизнедеятельность и синтез белков ВКМ. Данные преимущества делают метод этаноловой преципитации лидером среди описанных выше вариантов.4. The ethanol precipitation method is quite simple and allows for 1-1.5 hours to obtain up to 80% of fibrinogen contained in blood plasma (Weis-Fogh, US Fibrinogen prepared from small blood samples for autologous use in a tissue adhesive system.
Этап полимеризации фибриногена.Fibrinogen polymerization stage.
Следующим этапом является полимеризация фибриногена под действием тромбина и ионов кальция. Тромбин в присутствии ионов кальция последовательно отщепляет фибринопептиды А и В от молекулы фибриногена (Weisel JW, Litvinov RI. Fibrin Formation, Structure and Properties. Subcell Biochem. 2017; 82:405-456. doi:10.1007/978-3-319-49674-0_13). После отделения фибринопептидов происходит самосборка мономеров фибрина в димеры, далее в олигомеры и полимеры, которые удлиняются с образованием двухцепочечных протофибрилл. Время свертывания - это определенная задержка во времени от момента внесения активаторов свертывания до момента образования макроскопического сгустка. В условиях in vitro время свертывания преципитата фибриногена довольно короткое всего несколько секунд и зависит от активности тромбина и концентрации ионов кальция. Боковая сборка протофибрилл происходит только в конце времени свертывания, и может длиться от нескольких секунд до часов в зависимости от рН и ионной силы (Scheraga, Н.A. The thrombin-fibrinogen interaction. Biophys. Chem. 2004; 112, 117-130). Протофибриллы собираются в поперечном и продольном направлении, образуя разветвленные волокна трехмерной гелеобразной сети или фибринового сгустка. Полимер фибрина стабилизируется посредством ковалентного сшивания XIIIa фактором (трансглутаминазой) с образованием механически и химически более стабильного зрелого фибринового сгустка.The next step is fibrinogen polymerization under the action of thrombin and calcium ions. Thrombin in the presence of calcium ions sequentially cleaves fibrinopeptides A and B from the fibrinogen molecule (Weisel JW, Litvinov RI. Fibrin Formation, Structure and Properties. Subcell Biochem. 2017; 82: 405-456. Doi: 10.1007 / 978-3-319-49674 -0_13). After the separation of fibrinopeptides, fibrin monomers self-assemble into dimers, then into oligomers and polymers, which elongate to form double-stranded protofibrils. Clotting time is a certain delay in time from the moment of introduction of coagulation activators to the moment of formation of a macroscopic clot. Under in vitro conditions, the clotting time of fibrinogen precipitate is rather short, only a few seconds, and depends on the activity of thrombin and the concentration of calcium ions. Lateral assembly of protofibrils occurs only at the end of clotting time, and can last from a few seconds to hours depending on pH and ionic strength (Scheraga, N. A. The thrombin-fibrinogen interaction. Biophys. Chem. 2004; 112, 117-130) ... Protofibrils are collected in the transverse and longitudinal directions, forming branched fibers of a three-dimensional gel-like network or fibrin clot. The fibrin polymer is stabilized by covalent crosslinking of factor XIIIa (transglutaminase) to form a mechanically and chemically more stable mature fibrin clot.
В большинстве случаев при получении фибринового клея, каркаса или покрытия используют коммерческий, экзогенный тромбин из плазмы крови человека (Moreira R, Neusser С, Kruse М, Mulderrig S, Wolf F, Spillner J, Schmitz-Rode T, Jockenhoevel S, Mela P. Tissue-Engineered Fibrin-Based Heart Valve with Bio-Inspired Textile Reinforcement. Adv Healthc Mater. 2016; 5(16): 2113-21. doi: 10.1002/adhm.201600300) или животных (Pankajakshan D, Krishnan V K, Krishnan LK. Functional stability of endothelial cells on a novel hybrid scaffold for vascular tissue engineering. Biofabrication. 2010; 2(4): 041001. doi: 10.1088/1758-5082/2/4/041001).In most cases, commercial, exogenous human plasma thrombin (Moreira R, Neusser C, Kruse M, Mulderrig S, Wolf F, Spillner J, Schmitz-Rode T, Jockenhoevel S, Mela P. Tissue-Engineered Fibrin-Based Heart Valve with Bio-Inspired Textile Reinforcement.Adv Healthc Mater. 2016; 5 (16): 2113-21.doi: 10.1002 / adhm.201600300) or animals (Pankajakshan D, Krishnan VK, Krishnan LK. Functional stability of endothelial cells on a novel hybrid scaffold for vascular tissue engineering. Biofabrication. 2010; 2 (4): 041001. doi: 10.1088 / 1758-5082 / 2/4/041001).
Сочетание криопреципитации и полимеризации экзогенным тромбином представлены в патенте получения фибринового клея для герметизация хирургических ран (US 4627879 A. Fibrn adhesive prepared as a concentrate from single donor fresh frozen plasma. Eric Rose, Arthur Dresdale. Publication 1986-12-09). Недостатком данного метода является использование менее эффективного и более длительного метода криопреципитации по сравнению с этаноловым. Кроме того, использование экзогенного тромбина создает предпосылки для активации иммунного и воспалительного ответа. Несмотря на принимаемые производителем меры по снижению риска вирусного заражения препаратов из компонентов крови человека или животных, все же существует опасность переноса различных инфекционных заболеваний. Кроме того, введенные в организм реципиента чужеродные белки способны вызывать иммунную реакцию и формирование аутореактивных антител. Сообщалось о ксеногенной иммунизации пациентов бычьим тромбином и последующим формированием у них аутореактивных антител к собственному тромбину и фактору V (Berruyer М, Amiral J, Ffrench Р, et al. Immunization by bovine thrombin used with fibrin glue during cardiovascular operations: development of thrombin and factor V inhibitors. J. Thorac Cardiovasc Surg. 1993; 105: 892-897. Rapaport SI, Zivelin A, Minow RA, Hunter CS, Donnelly K. Clinical significance of antibodies to bovine and human thrombin and factor V after surgical use of bovine thrombin. Am J Clin Pathol. 1992; 97: 84-91. Flaherty MJ, Henderson R, Wener MH. Iatrogenic immunization with bovine thrombin: a mechanism for prolonged thrombin times after surgery. Ann Intern Med. 1989; 111(8): 631-4. doi: 10.7326/0003-4819-111-8-631. PMID: 2802417). Представлены неутешительные данные о сенсибилизации и аллергических реакциях на бычий тромбин при местном применении у пациентов, находящиеся на гемодиализе (Wai Y, Tsui V, Peng Z, Richardson R, Oreopoulos D, Tarlo SM. Anaphylaxis from topical bovine thrombin (Thrombostat) during haemodialysis and evaluation of sensitization among a dialysis population. Clin Exp Allergy. 2003; 33(12): 1730-4. doi: 10.1111/j. 1365-2222.2003.01806.x). Доказана возможность препаратов бычьего тромбина вызывать патологический системный аутоиммунный синдром с волчаночноподобной серологией (Schoenecker JG, Johnson RK, Lesher АР, Day JD, Love SD, Hoffman MR, Ortel TL, Parker W, Lawson JH: Exposure of mice to topical bovine thrombin induces systemic autoimmunity. Am J Pathol 2001, 159: 1957-1969). Реже для полимеризации фибриногена используют рекомбинантный тромбин (WO 2007103447 A2. А method for the preparation of recombinant human thrombin. Kurt Osther (US). Publication 2007-09-13) технология получения и очистки которого сложна и затратна, при этом, сохраняется возможность иммунной реакции реципиента на чужеродный белок (Schellekens Н, Casadevall N. Immunogenicity of recombinant human proteins: causes and consequences. J Neurol. 2004; 251 Suppl 2: II4-9. doi: 10.1007/s00415-004-1202-9).The combination of cryoprecipitation and exogenous thrombin polymerization is presented in the patent for the preparation of fibrin glue for sealing surgical wounds (US 4627879 A. Fibrn adhesive prepared as a concentrate from single donor fresh frozen plasma. Eric Rose, Arthur Dresdale. Publication 1986-12-09). The disadvantage of this method is the use of a less effective and more time-consuming cryoprecipitation method compared to ethanol. In addition, the use of exogenous thrombin creates prerequisites for the activation of the immune and inflammatory response. Despite the measures taken by the manufacturer to reduce the risk of viral infection of preparations made from human or animal blood components, there is still a risk of transferring various infectious diseases. In addition, foreign proteins introduced into the recipient's body are capable of causing an immune response and the formation of autoreactive antibodies. It was reported about xenogeneic immunization of patients with bovine thrombin and the subsequent formation of autoreactive antibodies to their own thrombin and factor V (Berruyer M, Amiral J, Ffrench P, et al. Immunization by bovine thrombin used with fibrin glue during cardiovascular operations: development of thrombin and factor V inhibitors. J. Thorac Cardiovasc Surg. 1993; 105: 892-897. Rapaport SI, Zivelin A, Minow RA, Hunter CS, Donnelly K. Clinical significance of antibodies to bovine and human thrombin and factor V after surgical use of bovine thrombin Am J Clin Pathol. 1992; 97: 84-91. Flaherty MJ, Henderson R, Wener MH. Iatrogenic immunization with bovine thrombin: a mechanism for prolonged thrombin times after surgery. Ann Intern Med. 1989; 111 (8): 631 -4. Doi: 10.7326 / 0003-4819-111-8-631. PMID: 2802417). Disappointing data on sensitization and allergic reactions to bovine thrombin when applied topically in hemodialysis patients (Wai Y, Tsui V, Peng Z, Richardson R, Oreopoulos D, Tarlo SM. Anaphylaxis from topical bovine thrombin (Thrombostat) during haemodial and evaluation of sensitization among a dialysis population. Clin Exp Allergy. 2003; 33 (12): 1730-4. doi: 10.1111 / j. 1365-2222.2003.01806.x). The possibility of bovine thrombin preparations to cause pathological systemic autoimmune syndrome with lupus-like serology has been proven (Schoenecker JG, Johnson RK, Lesher AR, Day JD, Love SD, Hoffman MR, Ortel TL, Parker W, Lawson JH: Exposure of mice to topical bovine thrombin induces systemic autoimmunity Am J Pathol 2001,159: 1957-1969). Less commonly, recombinant thrombin is used for fibrinogen polymerization (WO 2007103447 A2. A method for the preparation of recombinant human thrombin. Kurt Osther (US). Publication 2007-09-13), the production and purification technology of which is complex and costly, while maintaining the possibility of immune recipient reactions to a foreign protein (Schellekens H, Casadevall N. Immunogenicity of recombinant human proteins: causes and consequences. J Neurol. 2004; 251 Suppl 2: II4-9. doi: 10.1007 / s00415-004-1202-9).
Изобретение RU 2653434 C1 (Способ создания биорезорбируемого клеточного скаффолда на основе фибрина плазмы крови» Егорихина М.Н., Левин Г.Я., Чарыкова И.Н., Алейник Д.Я., Соснина Л.Н. Дата публикации 2018-05-08) позволяет получить биорезорбируемый клеточный скаффолд на основе фибрина плазмы крови, имеющий 3D структуру и содержащий равномерно распределенные по всей толще клетки. Однако данный способ так же предполагает использование криопреципитата плазмы крови и экзогенного тромбина с описанными выше особенностями и возможными вариантами негативного воздействия.Invention RU 2653434 C1 (A method for creating a bioresorbable cellular scaffold based on blood plasma fibrin "Egorikhina M.N., Levin G.Ya., Charykova I.N., Aleinik D.Ya., Sosnina L.N. Publication date 2018-05 -08) allows to obtain a bioresorbable cellular scaffold based on blood plasma fibrin, which has a 3D structure and contains cells evenly distributed throughout the entire thickness of the cell. However, this method also involves the use of blood plasma cryoprecipitate and exogenous thrombin with the above-described features and possible negative effects.
Известен способ промышленного получения фибрин-мономера из плазмы крови (RU 2522237. Способ промышленного получения фибрин-мономера из плазмы крови. Момот А.П., Шахматов И.И., Ломаев И.С., Терехов С.С. Дата публикации 10.07.2014). В данном варианте фибриноген выделяют из плазмы крови с помощью преципитации сульфатом аммония, полимеризацию запускают внесением экзогенного тромбина. Сгустки фибрина отмывают и растворяют в ацетатном буфере с мочевиной, получая фибрин-мономеры. Фибрин-мономер может быть использован как местное или системное кровоостанавливающее средство, для ускорения заживления швов и ран в хирургии, травматологии, гинекологии, спортивной медицине и т.д. Способ направлен на изготовление фибрин-мономеров, а не фибрин-полимера, кроме того, используется преципитация сульфатом аммония и экзогенный тромбин.A known method of industrial production of fibrin monomer from blood plasma (RU 2522237. Method of industrial production of fibrin monomer from blood plasma. Momot AP, Shakhmatov II, Lomaev IS, Terekhov SS Publication date 10.07 .2014). In this embodiment, fibrinogen is isolated from blood plasma by precipitation with ammonium sulfate; polymerization is started by introducing exogenous thrombin. Fibrin clots are washed and dissolved in acetate buffer with urea to obtain fibrin monomers. Fibrin monomer can be used as a local or systemic hemostatic agent to accelerate the healing of sutures and wounds in surgery, traumatology, gynecology, sports medicine, etc. The method is aimed at the production of fibrin monomers, but not fibrin polymer, in addition, precipitation with ammonium sulfate and exogenous thrombin are used.
Вариант получения двухкомпонентного фибринового клея описан в патенте RU 2704256 C1 (Способ приготовления аутологичного двухкомпонентного фибринового клея» Гаврилюк И.О., Куликов А.Н., Кузнецова А.Ю., Гаврилюк В.Н., Чурашов С.В., Черныш В.Ф. Дата публикации 2019-10-25). Для этого из крови пациента получают обогащенную живыми тромбоцитами плазму, содержащую фибриноген в физиологических концентрациях, факторы свертывания крови и живые тромбоциты, продуцирующие различные факторы роста. Использование физиологических концентраций фибриногена позволяет создать фибриновый продукт с исходно слабыми механическими характеристиками. Поскольку изобретение является клеем и не несет значительной физической нагрузки, использование физиологических концентраций фибриногена вполне допустимо. Однако, данная технология не применима для создания каркасов подверженных физическому воздействию, поскольку не подразумевается использование методов концентрации и обогащения фибриногена. Второй компонент, как и в предыдущих вариантах, включает раствор кальция хлорида (CaCl2) и экзогенный тромбин с его отрицательными влияниями на организм.A variant of obtaining two-component fibrin glue is described in patent RU 2704256 C1 (Method for preparing autologous two-component fibrin glue "Gavrilyuk I.O., Kulikov A.N., Kuznetsova A.Yu., Gavrilyuk V.N., Churashov S.V., Chernysh V.F.Publication date 2019-10-25). For this, plasma enriched with live platelets, containing fibrinogen in physiological concentrations, blood coagulation factors and live platelets, producing various growth factors, is obtained from the patient's blood. The use of physiological concentrations of fibrinogen makes it possible to create a fibrin product with initially weak mechanical characteristics. Since the invention is an adhesive and does not carry significant physical activity, the use of physiological concentrations of fibrinogen is quite acceptable. However, this technology is not applicable for the creation of scaffolds subject to physical stress, since it does not imply the use of methods of concentration and enrichment of fibrinogen. The second component, as in the previous versions, includes a solution of calcium chloride (CaCl 2 ) and exogenous thrombin with its negative effects on the body.
С целью нивелирования инфекционных, иммунных и аллергических рисков наиболее безопасно использовать аутологичный тромбин. Вариант решения предлагается в изобретении, которое направлено на получение фибринового геля, способствующего клеточной пролиферации из собственной крови (WO 2013016836 A1. Preparation of fibrin gel for use as implant system. Manuel Eduardo Young Anze, Caroline Ruth Weinstein Oppenheimer, Donald Irving Brown
Ближайшим прототипом нашего предложения является вариант, представленный в патенте US 5643192 A, который направлен на получение аутологичного фибринового клея для остановки кровотечения и ускорения заживления раны при различных видах повреждений (травматические, хирургические) (US 5643192 А. Autologous fibrin glue and methods for its preparation and use. Jack Hirsh Marilyn Johnston, Kevin Teoh. Publication 1997-07-01). Методом криопреципитации выделяют преципитат фибриногена, а из супернатанта, после удаления резидуального фибриногена, получают тромбин-содержащую сыворотку. Смешивание преципитата фибриногена с тромбин-содержащей сывороткой и CaCl2 в соотношении 1:1 вызывает быстрое формирование фибрина. Получения аутологичного тромбина в данном варианте возможно лишь при использовании криопреципитации, поскольку извлечение идет из сыворотки, которая в других случаях будет разведена и контаминирована этанолом, аммония сульфатом или ПЭГ. При этом, как известно, метод криопреципитации более длительный и менее эффективный по сравнению с этаноловым. В результате средняя концентрация фибриногена в преципитате составляет 20 мг/мл (данные патента), что достаточно для использования средства в качестве клея, но слишком мало для формирования каркаса протезов. Кроме того, получение аутологичного тромбина требует выполнения дополнительного этапа по удалению резидуального фибриногена из тромбин-содержащей сыворотки, который включает полимеризацию фибриногена, центрифугирование и фильтрование.The closest prototype of our proposal is a variant presented in patent US 5643192 A, which is aimed at obtaining autologous fibrin glue for stopping bleeding and accelerating wound healing in various types of injuries (traumatic, surgical) (US 5643192 A. Autologous fibrin glue and methods for its preparation and use. Jack Hirsh, Marilyn Johnston, Kevin Teoh. Publication 1997-07-01). Fibrinogen precipitate is isolated by cryoprecipitation, and thrombin-containing serum is obtained from the supernatant, after removal of residual fibrinogen. Mixing fibrinogen precipitate with thrombin-containing serum and CaCl 2 in a 1: 1 ratio causes rapid fibrin formation. Obtaining autologous thrombin in this embodiment is possible only when using cryoprecipitation, since the extraction is from serum, which in other cases will be diluted and contaminated with ethanol, ammonium sulfate or PEG. At the same time, as is known, the cryoprecipitation method is longer and less effective in comparison with ethanol. As a result, the average concentration of fibrinogen in the precipitate is 20 mg / ml (patent data), which is sufficient for using the agent as an adhesive, but too little for forming the framework of prostheses. In addition, obtaining autologous thrombin requires an additional step to remove residual fibrinogen from thrombin-containing serum, which includes fibrinogen polymerization, centrifugation, and filtration.
Техническим результатом нашего изобретения является создание простой технологии получения аутологичного, биосовместимого, безопасного материала для регенеративной и тканевой инженерии, поддерживающего высокую интеграцию с организмом хозяина и имеющим регулируемые свойства.The technical result of our invention is the creation of a simple technology for obtaining an autologous, biocompatible, safe material for regenerative and tissue engineering, maintaining high integration with the host organism and having regulated properties.
Технический результат достигается за счет использования аутологичного фибрина, который получают из фибриногена, выделенного из плазмы крови этаноловой преципитацией, и активации присутствующего в преципитате эндогенного тромбина ионами кальция. Этаноловая преципитация позволяет просто и в короткие сроки получить из плазмы крови фибриноген в высокой концентрации и регулировать его концентрацию путем разведения преципитата буфером рН 7,2-7,5.The technical result is achieved through the use of autologous fibrin, which is obtained from fibrinogen isolated from blood plasma by ethanol precipitation, and the activation of endogenous thrombin present in the precipitate with calcium ions. Ethanol precipitation makes it possible to easily and quickly obtain fibrinogen from blood plasma in high concentration and to regulate its concentration by diluting the precipitate with a buffer of pH 7.2-7.5.
Теоретическая предпосылка изобретения.The theoretical premise of the invention.
Ионы кальция придают активную конформацию белковым факторам свертывания крови. Для получения преципитата кровь забирают с цитратом натрия или цитратом декстрозы (состав А) в качестве антикоагулянта, которые связывают ионы кальция и блокируют переход протромбина в тромбин. Соответственно коагуляционный каскад не запускается и свертывания крови не происходит. Процесс приготовления преципитата включает этап осаждения белков и центрифугирования с последующим удалением надосадка. С надосадком окончательно удаляются ионы кальция. Важным моментом является то, что преципитат фибриногена содержит осажденные белки плазмы крови в том числе и протромбин. Восстановление концентрации ионов кальция при нормальных значениях рН приведет к активации эндогенного протромбина в тромбин и запуску каскада полимеризации фибриногена.Calcium ions impart an active conformation to protein coagulation factors. To obtain a precipitate, blood is taken with sodium citrate or dextrose citrate (composition A) as an anticoagulant, which bind calcium ions and block the transition of prothrombin to thrombin. Accordingly, the coagulation cascade does not start and blood clotting does not occur. The process of preparing the precipitate includes the stage of protein precipitation and centrifugation, followed by the removal of the supernatant. With the supernatant, calcium ions are finally removed. An important point is that fibrinogen precipitate contains precipitated blood plasma proteins, including prothrombin. Restoring the concentration of calcium ions at normal pH values will lead to the activation of endogenous prothrombin to thrombin and the start of the fibrinogen polymerization cascade.
Предлагаемый способ реализуется согласно следующей методике:The proposed method is implemented according to the following technique:
1. Проводим забор собственной крови пациента в стерильные пробирки, содержащие цитрат натрия 3,8% или ACD-A (антикоагулянт цитрат декстроза (состав А)).1. We take the patient's own blood into sterile tubes containing sodium citrate 3.8% or ACD-A (anticoagulant citrate dextrose (composition A)).
2. С помощью центрифугирования получаем плазму крови. В зависимости от целей можно использовать как обогащенную, так обедненную тромбоцитами и бестромбоцитарную плазму. Для предотвращения повреждения клеток рекомендуем использовать скорости не более 2000 G.2.Using centrifugation, we obtain blood plasma. Depending on the purpose, both platelet-rich and platelet-depleted and platelet-free plasma can be used. To prevent cell damage, we recommend using speeds of no more than 2000 G.
3. Из плазмы крови методом этаноловой преципитации получаем преципитат фибриногена. Для этого плазму отбираем в отдельные пробирки и при постоянном перемешивании на вортексе по каплям добавляем ледяной (4°С) раствор 10-20%) этанола (мы использовали 16%) рН 7,4 до соотношения с плазмой 1:1. Проводим инкубацию при температуре 4°С и постоянном перемешивании в течение 60 минут, затем центрифугируем 20-30 минут при температуре 4°С и скорости вращения 1000-1200 G. Надосадок удаляем. Полученный преципитат содержит концентрацию фибриногена в среднем диапазоне 70-100 мг/мл.3. Fibrinogen precipitate is obtained from blood plasma by ethanol precipitation. To do this, we take the plasma into separate test tubes and, with constant stirring on a vortex, add dropwise an ice-cold (4 ° C) solution of 10-20%) ethanol (we used 16%) pH 7.4 to a ratio with plasma of 1: 1. We incubate at a temperature of 4 ° C and constant stirring for 60 minutes, then centrifuge for 20-30 minutes at a temperature of 4 ° C and a rotation speed of 1000-1200 G. Remove the supernatant. The resulting precipitate contains a fibrinogen concentration in the average range of 70-100 mg / ml.
4. Для достижения необходимой концентрации фибриногена в полученный преципитат вносим Hepes-буфер на NaCl рН 7,2-7,5 и хорошо перемешиваем.4. To achieve the required fibrinogen concentration, add Hepes-buffer on NaCl pH 7.2-7.5 to the resulting precipitate and mix well.
5. Для запуска полимеризации в подготовленный преципитат добавляем раствор CaCl2 (или сбалансированной смеси солей, содержащий CaCl2) в финальной концентрации 0,1-2%).5. To start polymerization, add CaCl 2 solution (or a balanced mixture of salts containing CaCl 2 ) in the final concentration of 0.1-2% to the prepared precipitate.
6. Образцы выдерживаем в течение 30-60 минут до полной полимеризации.6. The samples are kept for 30-60 minutes until complete polymerization.
Отличительной особенностью предлагаемого способа получения фибрина является простота и отсутствие дополнительных этапов очищения аутологичного тромбина, включающих удаление резидуального фибриногена, центрифугирование и фильтрование. Данный способ позволяет получать аутологичный фибрин в условиях обычной лаборатории, без использования дополнительной сложной техники.A distinctive feature of the proposed method for obtaining fibrin is the simplicity and the absence of additional stages of purification of autologous thrombin, including the removal of residual fibrinogen, centrifugation and filtration. This method allows you to obtain autologous fibrin in a conventional laboratory, without the use of additional complex technology.
Предложенное решение избавляет от необходимости использовать экзогенный тромбин (аутологичный или ксеногенный). Полученный аутологичный фибрин не несет риска инфицирования, формирования иммунных реакций и в дальнейшем может быть имплантирован в виде самостоятельного каркаса, в качестве покрытия для протезов, биоматрикса для клеточной терапии. Изобретение может быть использовано в экспериментальной медицине для моделирования фибрин-заинтересованных процессов in vitro и in vivo (клеточных взаимодействий, влияния лекарственных, физических или химических факторов).The proposed solution eliminates the need to use exogenous thrombin (autologous or xenogenic). The obtained autologous fibrin does not carry the risk of infection, the formation of immune reactions and can later be implanted in the form of an independent framework, as a coating for prostheses, as a biomatrix for cell therapy. The invention can be used in experimental medicine for modeling fibrin-interested processes in vitro and in vivo (cellular interactions, the influence of medicinal, physical or chemical factors).
В зависимости от концентрации ионов кальция и активности эндогенного тромбина полимеризация наступает в течение 40-70 секунд, что является достоинством, поскольку позволяет управлять процессом полимеризации и контролировать равномерность заполнения формы. Высокая скорость формирования фибринового сгустка ограничивает возможность равномерного заполнения (удаление воздуха, пузырей) и распределения фибрина в сложной или узкой форме, а попытка коррекции распределения смеси в условиях начавшейся полимеризации приводит к дефекту сгустка, разрыву или неправильному формированию волокон.Depending on the concentration of calcium ions and the activity of endogenous thrombin, polymerization occurs within 40-70 seconds, which is an advantage, since it allows you to control the polymerization process and control the uniformity of filling the mold. The high rate of formation of a fibrin clot limits the possibility of uniform filling (removal of air, bubbles) and distribution of fibrin in a complex or narrow form, and an attempt to correct the distribution of the mixture under conditions of the onset of polymerization leads to a clot defect, rupture or improper formation of fibers.
Данный способ позволяет регулировать физико-механические свойства фибрина, а так же клеточные и фибринолитические процессы за счет использования различных видов плазмы (обогащенная, обедненная тромбоцитами или бестромбоцитарная), а так же изменения концентрации фибриногена в преципитате с помощью разведения, поскольку в преципитате одновременно с фибриногеном содержатся XIII фактор, фибронектин, ингибиторы фибринолиза, ростовые факторы.This method allows you to regulate the physicomechanical properties of fibrin, as well as cellular and fibrinolytic processes through the use of various types of plasma (enriched, depleted of platelets or platelet-free), as well as changes in the concentration of fibrinogen in the precipitate by dilution, since in the precipitate simultaneously with fibrinogen contains XIII factor, fibronectin, inhibitors of fibrinolysis, growth factors.
Пример 1. Фибрин, полученный без экзогенного тромбина, имеет структуру аналогичную фибрину, полученному с использованием экзогенного тромбина (Фигура 1.).Example 1. Fibrin obtained without exogenous thrombin has a structure similar to fibrin obtained using exogenous thrombin (Figure 1.).
Тестирование образцов выполнено с помощью СЭМ. Для этого в форму залиты образцы, содержащие одинаковую исходную концентрацию фибриногена (20 мг/мл), который выделяли с помощью преципитации 16% этанолом. Для образцов без использования экзогенного тромбина полимеризацию активировали 0,2% раствором CaCl2. В случае использования экзогенного тромбина - тромбин-кальциевой смесью, содержащей 500 UI|/мл тромбина из бычьей плазмы и 0,2% раствор CaCl2. После прохождения полной полимеризации все образцы фибрина отделяли от формы и подвергали пробоподготовке для проведения СЭМ. На фотографиях со СЭМ измеряли диаметр волокон и размер пор.Sample testing was performed using SEM. For this, samples containing the same initial concentration of fibrinogen (20 mg / ml), which were isolated by precipitation with 16% ethanol, were filled into the mold. For samples without the use of exogenous thrombin, polymerization was activated with 0.2% CaCl 2 solution. In the case of using exogenous thrombin, a thrombin-calcium mixture containing 500 UI | / ml of thrombin from bovine plasma and 0.2% CaCl 2 solution. After complete polymerization, all fibrin samples were detached from the mold and subjected to sample preparation for SEM. The SEM photographs measured the fiber diameter and pore size.
Обработку всех полученных данных выполняли в программе GraphPad. Распределение в группах отличалось от нормального, поэтому результаты представлены в виде медианы и квартилей. Достоверность различий между двумя независимыми группами оценивали с помощью U-критерия Манна-Уитни. Сравнение между несколькими группами проведено методом ANOVA с коррекцией результатов с учетом множественности сравнения методом FDR. Статистически значимыми считали различия при уровне значимости р<0,05.All obtained data were processed using the GraphPad software. The distribution in the groups was different from normal, so the results are presented as median and quartiles. The significance of differences between the two independent groups was assessed using the Mann-Whitney U-test. Comparison between groups was performed by ANOVA with correction of the results taking into account the multiplicity of comparison by the FDR method. Differences were considered statistically significant at a significance level of p <0.05.
Не зарегистрировано различий размера пор и диаметра волокон в образцах без- и с использованием экзогенного тромбина.No differences in pore size and fiber diameter were recorded in samples without and with the use of exogenous thrombin.
Описание Фигуры 1.Description of Figure 1.
- А - внешний вид фибриновых матриц, залитых в форму (верхний ряд концентрация фибриногена 10 мг/мл, средний - 20 мг/мл, нижний - 30 мг/мл. Левый столбец - образцы полимеризованы экзогенным тромбином (Экзо Тр), правый - эндогенным тромбином (Эндо Тр));- A - appearance of fibrin matrices, poured into a mold (top row -
- Б - внешний вид фибриновых каркасов после отделения от формы и усадки (концентрация фибриногена 30 мг/мл);- B - appearance of fibrin scaffolds after separation from the mold and shrinkage (
- В, Г - фотографии со СЭМ (ув. 6000).- C, D - photos from SEM (uv. 6000).
- Д - графическое распределение диаметра волокон и размера пор в образцах (данные СЭМ).- D - graphical distribution of fiber diameter and pore size in samples (SEM data).
Пример 2. Фибрин, полученный без- и с использованием экзогенного тромбина не нарушает клеточную жизнедеятельность ни на поверхности, ни в толще матрикса (Фигура 2.).Example 2. Fibrin obtained without and with the use of exogenous thrombin does not disrupt cellular activity either on the surface or in the matrix (Figure 2.).
С помощью этанолового метода получали преципитат.Фибробласты кожи человека 5 пассажа из расчета 100 тыс.на 1 мл готового фибрина вносили в Hepes-буфер с апротинином, 100 КИЕ/мл. В преципитат добавляли Hepes-буфер с клетками до достижения концентрации фибриногена 20 мг/мл и равномерно перемешивали. Полимеризацию фибриногена активировали в одном случае солевым раствором, содержащим 0,1% CaCl2, 0,8% NaCl, 0,03% KCl, в другом тромбин-кальциевой смесью, содержащей 500 IU|/мл тромбина из бычьей плазмы и аналогичным солевым раствором (0,1% CaCl2, 0,8% NaCl, 0,03%) KCl). Изменение состава раствора, содержащего ионы кальция обусловлено необходимостью сохранять и поддерживать жизнеспособность клеток, соответственно, раствор должен быть изотоническим и содержать набор солей, необходимых для жизнедеятельности. Смесь преципитата с клетками и полимеризующего компонента была немедленно залита в лунки 24-луночного планшета и помещена в CO2-инкубатор. После полимеризации в лунки вносили культуральную среду, содержащую DMEM с 10% фетальной бычьей сывороткой, а так же Hepes, L-глутамин, пенициллин, стрептомицин и амфотерицин. Образцы культивировали в СО2-инкубаторе при 37°С 5% СО2 в течение 14 суток. Жизнеспособность клеток на поверхности и на дне матрикса оценивали с помощью флуоресцентой микроскопии после прижизненного окрашивания образцов этидиумом бромидом 30 мкг/мл и Hoechst 33342 10 мг/мл в фосфатно-солевом буфере (ФСБ). В лунки с образцами вносили теплый раствор Hoechst 33342, инкубировали 10 минут при 37°С, далее образцы отмывали ФСБ и добавляли этидиум бромид на 1 минуту. Далее образцы повторно отмывали теплым раствором ФСБ и просматривали на флуоресцентном микроскопе. Контролем служили пустые лунки планшета, заселенные фибробластами. Данные обрабатывали в программе GraphPad как описано выше. Жизнеспособность клеток на поверхности матриц, на дне матриц и в контрольных лунках не отличалась и составила 96-100%.Using the ethanol method, a precipitate was obtained. Fibroblasts of the human skin of the 5th passage at the rate of 100 thousand per 1 ml of finished fibrin were introduced into Hepes-buffer with aprotinin, 100 KIE / ml. Hepes-buffer with cells was added to the precipitate until a fibrinogen concentration of 20 mg / ml was reached and mixed uniformly. Fibrinogen polymerization was activated in one case with a saline solution containing 0.1% CaCl 2 , 0.8% NaCl, 0.03% KCl, in another case with a thrombin-calcium mixture containing 500 IU | / ml thrombin from bovine plasma and a similar saline solution (0.1% CaCl 2 , 0.8% NaCl, 0.03%) KCl). The change in the composition of the solution containing calcium ions is due to the need to preserve and maintain the viability of cells, respectively, the solution must be isotonic and contain a set of salts necessary for vital activity. A mixture of precipitate with cells and polymerizing component was immediately poured into the wells of a 24-well plate and placed in a CO 2 incubator. After polymerization, a culture medium containing DMEM with 10% fetal bovine serum, as well as Hepes, L-glutamine, penicillin, streptomycin, and amphotericin was added to the wells. The samples were cultured in a CO 2 incubator at 37 ° C with 5% CO 2 for 14 days. Cell viability on the surface and at the bottom of the matrix was assessed using fluorescence microscopy after in vivo staining of samples with
Описание Фигуры 2. - Жизнеспособность фибробластов в толще фибриновой матрицы через 14 суток культивирования:Description of Figure 2. - Viability of fibroblasts in the thickness of the fibrin matrix after 14 days of cultivation:
- А, Б - фотографии клеток (А. световая микроскопия, Б. флуоресцентная микроскопия, ув. об ×10);- A, B - photographs of cells (A. light microscopy, B. fluorescence microscopy, magnification × 10);
- В - график жизнеспособности фибробластов на различных носителях.- B - graph of the viability of fibroblasts on various carriers.
Пример 3. Фибрин, полученный без использования ЭТ обладает более низкой тромбогенностью по сравнению фибрином, полимеризованным с помощью экзогенного тромбина (Фигура 3.).Example 3. Fibrin obtained without the use of ET has a lower thrombogenicity compared to fibrin polymerized with exogenous thrombin (Figure 3.).
Нами была оценена тромбогенность образцов на основании изменения показателей коагуляционного и тромбоцитарного звена гемостаза.We assessed the thrombogenicity of the samples on the basis of changes in the parameters of the coagulation and platelet hemostasis.
Для исследования контактной активации коагуляционного звена гемостаза измеряли активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ). Образцы готовили аналогично описанию, представленного в примере 2, но без заселения клетками. После отделения от формы и процесса усадки, образцы (n=7 на каждый вариант) погружали в отдельные лунки, заливали донорской обедненной тромбоцитами плазмой и инкубировали 30 минут при температуре 37°С. После инкубации плазму отбирали и измеряли АЧТВ. Контролем служила плазма, подвергшаяся инкубации в лунках планшета, но без погружения образцов фибрина.To study the contact activation of the coagulation link of hemostasis, the activated partial thromboplastin time (APTT) was measured. Samples were prepared similarly to the description presented in example 2, but without colonization with cells. After separation from the mold and the shrinkage process, the samples (n = 7 for each variant) were immersed in separate wells, flooded with donor platelet-depleted plasma and incubated for 30 minutes at 37 ° C. After incubation, plasma was collected and the APTT was measured. Plasma incubated in the wells of the plate, but without immersion of the fibrin samples, served as a control.
Способность фибрина активировать тромбоцитарную агрегацию исследовали согласно международным стандартам ISO 10993-4. Из свежей донорской цитратной крови с помощью центрифугирования получали обогащенную тромбоцитами плазму (ОТП). Интактную ОТП использовали в качестве контроля. Для регистрации изменения агрегации тромбоцитов после контакта с поверхностью фибрина образцы инкубировали с ОТП 5 мин при температуре 37°С. В контроле и образцах проводили измерение спонтанной агрегации тромбоцитов и активированной индуктором аденозин 5'-дифосфатом (АДФ) на анализаторе агрегации тромбоцитов - 4004 (АРАСТ, Беларусь). Соотношение индуктора и ОТП составило 25 мкл + 250 мкл соответственно. Графическая и статистическая обработка данных выполнена в программе GraphPad в соответствие с описанием в примере 1.The ability of fibrin to activate platelet aggregation was investigated according to international standards ISO 10993-4. Platelet-rich plasma (PRP) was obtained from fresh donor citrated blood by centrifugation. Intact PRP was used as a control. To register changes in platelet aggregation after contact with the fibrin surface, the samples were incubated with PRP for 5 min at 37 ° C. In control and samples, spontaneous platelet aggregation and inducer-activated adenosine 5'-diphosphate (ADP) were measured on a platelet aggregation analyzer - 4004 (ARAST, Belarus). The ratio of inductor and PRP was 25 μl + 250 μl, respectively. Graphical and statistical data processing was performed in the GraphPad program in accordance with the description in example 1.
Описание Фигуры 3.Description of Figure 3.
- А - показатели контактной активации коагуляционного звена гемостаза на поверхности фибрина;- A - indicators of contact activation of the coagulation link of hemostasis on the fibrin surface;
- Б - тромбоцитарного звена гемостаза на поверхности фибрина- B - platelet hemostasis on the fibrin surface
АЧТВ достоверно укорачивалось после контакта плазмы с образцами фибрина, полученными при использовании экзогенного тромбина (р<0,0002). Агрегация тромбоцитов происходила более активно на образцах фибрина с экзогенным тромбином по сравнению с контролем и использованием эндогенного тромбина. Таким образом, тромбогенность фибрина без экзогенного тромбина ниже и это делает его более предпочтительным вариантом для покрытия сердечно-сосудистых протезов. Полагаем, что после внесения экзогенного тромбина и закончившейся полимеризации, в составе фибрина может оставаться свободный, не связавшийся тромбин, который после контакта с кровью или имплантации в кровеносное русло запускает процессы свертывания и стимулирует образование тромбов, что крайне нежелательно в сердечно-сосудистой хирургии.APTT was significantly shortened after plasma contact with fibrin samples obtained using exogenous thrombin (p <0.0002). Aggregation of platelets was more active on fibrin samples with exogenous thrombin compared with control and using endogenous thrombin. Thus, the thrombogenicity of fibrin without exogenous thrombin is lower and this makes it a more preferable option for covering cardiovascular prostheses. We believe that after the introduction of exogenous thrombin and completed polymerization, free, unbound thrombin may remain in the fibrin composition, which, after contact with blood or implantation into the bloodstream, triggers clotting processes and stimulates the formation of blood clots, which is extremely undesirable in cardiovascular surgery.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020143003A RU2758260C1 (en) | 2020-12-24 | 2020-12-24 | Method for producing autologous fibrin with controlled fibrinogen content without using exogenous thrombin |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020143003A RU2758260C1 (en) | 2020-12-24 | 2020-12-24 | Method for producing autologous fibrin with controlled fibrinogen content without using exogenous thrombin |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2758260C1 true RU2758260C1 (en) | 2021-10-27 |
Family
ID=78289762
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2020143003A RU2758260C1 (en) | 2020-12-24 | 2020-12-24 | Method for producing autologous fibrin with controlled fibrinogen content without using exogenous thrombin |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2758260C1 (en) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5643192A (en) * | 1995-04-06 | 1997-07-01 | Hamilton Civic Hospitals Research Development, Inc. | Autologous fibrin glue and methods for its preparation and use |
| WO2013016836A1 (en) * | 2011-08-03 | 2013-02-07 | Manuel Eduardo Young Anze | Preparation of fibrin gel for use as implant system |
| RU2704256C1 (en) * | 2019-02-18 | 2019-10-25 | Федеральное государственное бюджетное военное образовательное учреждение высшего образования "Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова" Министерства обороны Российской Федерации (ВМедА) | Method of preparation of autologous two-component fibrin adhesive |
-
2020
- 2020-12-24 RU RU2020143003A patent/RU2758260C1/en active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5643192A (en) * | 1995-04-06 | 1997-07-01 | Hamilton Civic Hospitals Research Development, Inc. | Autologous fibrin glue and methods for its preparation and use |
| WO2013016836A1 (en) * | 2011-08-03 | 2013-02-07 | Manuel Eduardo Young Anze | Preparation of fibrin gel for use as implant system |
| RU2704256C1 (en) * | 2019-02-18 | 2019-10-25 | Федеральное государственное бюджетное военное образовательное учреждение высшего образования "Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова" Министерства обороны Российской Федерации (ВМедА) | Method of preparation of autologous two-component fibrin adhesive |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Dietrich M, Heselhaus J, Wozniak J, et al. Fibrin-based tissue engineering: comparison of different methods of autologous fibrinogen isolation.//Tissue Eng Part С Methods. 2013; 19(3): 216-226. doi: 10.1089/ten.TEC2011.0473. * |
| Dietrich M, Heselhaus J, Wozniak J, et al. Fibrin-based tissue engineering: comparison of different methods of autologous fibrinogen isolation.//Tissue Eng Part С Methods. 2013; 19(3): 216-226. doi: 10.1089/ten.TEC2011.0473. Scheraga, Н.A. The thrombin-fibrinogen interaction. Biophys. Chem. 2004; 112, 117-130. * |
| Scheraga, Н.A. The thrombin-fibrinogen interaction. Biophys. Chem. 2004; 112, 117-130. * |
| МАТВЕЕВА В.Г. и др. Фибрин - перспективный материал для тканевой сосудистой инженерии //Вестник трансплантологии и искусственных органов. М.:ГЭОТАР - Медиа, том XXII, N 1-2020. С.196-208. DOI: 10.15825/1995-1191-2020-1-196-208. . * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US12533398B2 (en) | Process, tube and device for the preparation of wound healant composition | |
| Thorn et al. | Autologous fibrin glue with growth factors in reconstructive maxillofacial surgery | |
| Ding et al. | Novel applications of platelet concentrates in tissue regeneration | |
| Mourão et al. | Characterization of a new membrane from concentrated growth factors associated with denaturized Albumin (Alb-CGF) for clinical applications: A preliminary study | |
| US4442655A (en) | Fibrinogen-containing dry preparation, manufacture and use thereof | |
| US20100028311A1 (en) | Using of scaffold comprising fibrin for delivery of stem cells | |
| Khodakaram-Tafti et al. | An overview on autologous fibrin glue in bone tissue engineering of maxillofacial surgery | |
| US8357402B2 (en) | Flowable wound matrix and its preparation and use | |
| US20120201897A1 (en) | Composition for inducing tissue regeneration by activating platelet-rich plasma (prp), and method for manufacturing same | |
| US8999001B2 (en) | Biocompatible implant | |
| Valbonesi | Fibrin glues of human origin | |
| US20130177623A1 (en) | Preparation Rich in Growth Factor-Based Fibrous Matrices for Tissue Engeering, Growth Factor Delivery, and Wound Healling | |
| JP2002531176A (en) | Spray transport of cells | |
| Bai et al. | Impact of a Novel Hydrogel with Injectable Platelet‐Rich Fibrin in Diabetic Wound Healing | |
| Cheng et al. | Processing, characterization and hemostatic mechanism of a ultraporous collagen/ORC biodegradable composite with excellent biological effectiveness | |
| JP2016514716A (en) | Implantable formulations for tissue regeneration and wound treatment, methods for their formulation, and patient treatment methods using the implantable formulations | |
| RU2758260C1 (en) | Method for producing autologous fibrin with controlled fibrinogen content without using exogenous thrombin | |
| US8124075B2 (en) | Enhanced biological autologous tissue adhesive composition and methods of preparation and use | |
| CN103209682A (en) | Activated leukocyte conditioned supernatant and uses for wound healing | |
| CN106902398B (en) | Cationized silk fibroin material, preparation method and application thereof | |
| Hou et al. | A facile way to fabricate a thrombin immobilized composite sponge with dual hemostatic effects for acute hemorrhage control | |
| WO2024151852A2 (en) | Devices and methods of a medicament-producing implantable matrix | |
| CN114177346B (en) | Hemostatic composition and hemostatic patch and application thereof | |
| KR100825995B1 (en) | Bone graft material comprising nano-sized polymer and autologous blood gel and method for preparing same | |
| Jameel et al. | Investigation of Entrapment of Therapeutic Agents, Enzymes, and Drug Targeting in Erythrocytes |