RU2750000C1 - Method for synthesis of modified hyaluronan and application thereof in medicine, including in endoprosthetics - Google Patents
Method for synthesis of modified hyaluronan and application thereof in medicine, including in endoprosthetics Download PDFInfo
- Publication number
- RU2750000C1 RU2750000C1 RU2019143704A RU2019143704A RU2750000C1 RU 2750000 C1 RU2750000 C1 RU 2750000C1 RU 2019143704 A RU2019143704 A RU 2019143704A RU 2019143704 A RU2019143704 A RU 2019143704A RU 2750000 C1 RU2750000 C1 RU 2750000C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- biopolymer
- sodium hyaluronate
- cross
- rpm
- linking
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 37
- 239000003814 drug Substances 0.000 title abstract description 22
- KIUKXJAPPMFGSW-MNSSHETKSA-N hyaluronan Chemical class CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)C1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H](C(O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-MNSSHETKSA-N 0.000 title description 16
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title description 2
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 claims abstract description 89
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 48
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 40
- 229920002385 Sodium hyaluronate Polymers 0.000 claims abstract description 38
- 229940010747 sodium hyaluronate Drugs 0.000 claims abstract description 38
- YWIVKILSMZOHHF-QJZPQSOGSA-N sodium;(2s,3s,4s,5r,6r)-6-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-acetamido-2-[(2s,3s,4r,5r,6r)-6-[(2r,3r,4r,5s,6r)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2- Chemical compound [Na+].CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 YWIVKILSMZOHHF-QJZPQSOGSA-N 0.000 claims abstract description 38
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims abstract description 20
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 claims abstract description 18
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 claims abstract description 18
- 210000001179 synovial fluid Anatomy 0.000 claims abstract description 16
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 claims abstract description 12
- 125000003700 epoxy group Chemical group 0.000 claims abstract description 12
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 claims abstract description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 10
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- AEMOLEFTQBMNLQ-WAXACMCWSA-N alpha-D-glucuronic acid Chemical compound O[C@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-WAXACMCWSA-N 0.000 claims abstract description 5
- GYZLOYUZLJXAJU-UHFFFAOYSA-N diglycidyl ether Chemical compound C1OC1COCC1CO1 GYZLOYUZLJXAJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 claims abstract description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 15
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 8
- 230000006870 function Effects 0.000 abstract description 7
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 abstract description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 abstract description 4
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 65
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 57
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 52
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 36
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 33
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 32
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 29
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 21
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 13
- 229940099552 hyaluronan Drugs 0.000 description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 12
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 11
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 11
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 10
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 10
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 10
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 9
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 8
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 8
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 8
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 8
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 8
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 6
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 5
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 5
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 229940043267 rhodamine b Drugs 0.000 description 5
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 4
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 4
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 4
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 4
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 4
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 4
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 4
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 4
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 4
- WCDDVEOXEIYWFB-VXORFPGASA-N (2s,3s,4r,5r,6r)-3-[(2s,3r,5s,6r)-3-acetamido-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-4,5,6-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](C(O)=O)O[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O WCDDVEOXEIYWFB-VXORFPGASA-N 0.000 description 3
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 3
- 229940014041 hyaluronate Drugs 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 3
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- SHKUUQIDMUMQQK-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(oxiran-2-ylmethoxy)butoxymethyl]oxirane Chemical compound C1OC1COCCCCOCC1CO1 SHKUUQIDMUMQQK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 description 2
- 101001018097 Homo sapiens L-selectin Proteins 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 102100033467 L-selectin Human genes 0.000 description 2
- 241000237852 Mollusca Species 0.000 description 2
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- KPKZJLCSROULON-QKGLWVMZSA-N Phalloidin Chemical compound N1C(=O)[C@@H]([C@@H](O)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C[C@@](C)(O)CO)NC(=O)[C@H](C2)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]3C[C@H](O)CN3C(=O)[C@@H]1CSC1=C2C2=CC=CC=C2N1 KPKZJLCSROULON-QKGLWVMZSA-N 0.000 description 2
- 241000219061 Rheum Species 0.000 description 2
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 2
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 235000021472 generally recognized as safe Nutrition 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- 210000001503 joint Anatomy 0.000 description 2
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 230000003020 moisturizing effect Effects 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 230000000399 orthopedic effect Effects 0.000 description 2
- 125000000466 oxiranyl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 2
- 230000037303 wrinkles Effects 0.000 description 2
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108091016585 CD44 antigen Proteins 0.000 description 1
- 208000028006 Corneal injury Diseases 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000020564 Eye injury Diseases 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 102000051366 Glycosyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 108700023372 Glycosyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 1
- 101001046686 Homo sapiens Integrin alpha-M Proteins 0.000 description 1
- 102000003918 Hyaluronan Synthases Human genes 0.000 description 1
- 108090000320 Hyaluronan Synthases Proteins 0.000 description 1
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 1
- 102100022338 Integrin alpha-M Human genes 0.000 description 1
- 208000003947 Knee Osteoarthritis Diseases 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 241001147138 Mytilus galloprovincialis Species 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108010009711 Phalloidine Proteins 0.000 description 1
- GOOHAUXETOMSMM-UHFFFAOYSA-N Propylene oxide Chemical compound CC1CO1 GOOHAUXETOMSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001237 Raman spectrum Methods 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 230000019552 anatomical structure morphogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000181 anti-adherent effect Effects 0.000 description 1
- 230000003416 augmentation Effects 0.000 description 1
- 150000001541 aziridines Chemical class 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- -1 carbonate-substituted pyridine Chemical class 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 210000003321 cartilage cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 230000007073 chemical hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000007334 copolymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 235000013766 direct food additive Nutrition 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- AFOSIXZFDONLBT-UHFFFAOYSA-N divinyl sulfone Chemical class C=CS(=O)(=O)C=C AFOSIXZFDONLBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 210000002310 elbow joint Anatomy 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N ether Substances CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000021045 exocrine pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 150000002337 glycosamines Chemical class 0.000 description 1
- 108700014210 glycosyltransferase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 229920000578 graft copolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000009499 grossing Methods 0.000 description 1
- 238000005570 heteronuclear single quantum coherence Methods 0.000 description 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000774 hypoallergenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 235000019531 indirect food additive Nutrition 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 230000008863 intramolecular interaction Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000006317 isomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003127 knee Anatomy 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000035407 negative regulation of cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000009965 odorless effect Effects 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- 150000002924 oxiranes Chemical class 0.000 description 1
- 230000037324 pain perception Effects 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000003200 peritoneal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 238000012667 polymer degradation Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000001012 protector Effects 0.000 description 1
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 210000000323 shoulder joint Anatomy 0.000 description 1
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 1
- ZFMRLFXUPVQYAU-UHFFFAOYSA-N sodium 5-[[4-[4-[(7-amino-1-hydroxy-3-sulfonaphthalen-2-yl)diazenyl]phenyl]phenyl]diazenyl]-2-hydroxybenzoic acid Chemical compound C1=CC(=CC=C1C2=CC=C(C=C2)N=NC3=C(C=C4C=CC(=CC4=C3O)N)S(=O)(=O)O)N=NC5=CC(=C(C=C5)O)C(=O)O.[Na+] ZFMRLFXUPVQYAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L sulfate group Chemical group S(=O)(=O)([O-])[O-] QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 231100000563 toxic property Toxicity 0.000 description 1
- 231100000820 toxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 231100000041 toxicology testing Toxicity 0.000 description 1
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 1
- 210000004127 vitreous body Anatomy 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
- C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
- C08B37/0072—Hyaluronic acid, i.e. HA or hyaluronan; Derivatives thereof, e.g. crosslinked hyaluronic acid (hylan) or hyaluronates
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
Abstract
Description
Область техникиTechnology area
Настоящее изобретение относится к области производства медицинских изделий, биотехнологии и медицины, в том числе эндопротезирования, а именно к способу получения биополимера на основе модифицированного сополимера гиалуроната натрия и применению его в различных областях медицины.The present invention relates to the field of production of medical devices, biotechnology and medicine, including endoprosthetics, and in particular to a method for producing a biopolymer based on a modified copolymer of sodium hyaluronate and its use in various fields of medicine.
Уровень техникиState of the art
Биополимеры на основе полисахаридов и их модифицированных производных, в частности, на основе гиалуроновой кислоты (далее ГК) находят применение в различных областях биотехнологии, медицины, общей и эстетической, в частности хирургической практике и эндопротезировании, они обладают такими важными свойствами, как биодеградируемость в живых тканях с течением времени, а скорость процесса биодеградации зависит от производного ГК или сложной композиции, его включающей. Указанные биополимеры должны отвечать таким важным критериям, как биосовместимость, неиммуногенность, биоинертность и гипоаллергенность. Из уровня техники известно, что в качестве такого биополимера широко распространен полисахарид - гиалуронат натрия, анионный гликозаминогликан.Biopolymers based on polysaccharides and their modified derivatives, in particular, based on hyaluronic acid (hereinafter referred to as HA), are used in various fields of biotechnology, medicine, general and aesthetic, in particular surgical practice and endoprosthetics, they have such important properties as biodegradability in living tissues over time, and the rate of the biodegradation process depends on the HA derivative or a complex composition that includes it. These biopolymers must meet such important criteria as biocompatibility, non-immunogenicity, bioinertness and hypoallergenicity. It is known from the prior art that as such a biopolymer, a polysaccharide is widespread — sodium hyaluronate, an anionic glycosaminoglycan.
Гликозаминогликаны (ГАГ) представляют собой линейные полисахариды, образующиеся из повторений дисахаридов, состоящих из аминосахаров - гексозаминов и остатков уроновых кислот (D-глюкуроновой или L-идуроновой). Гиалуроновая кислота (ГК) ([D-глюкуроновая кислота (1-β-3), N-ацетил-D-глюкозамин (1-β-4)]n) (фиг. 1), которая отличается отсутствием сульфатных групп, является биополимером широкого спектра и широко применяется в различных областях медицины. Эта макромолекула чаще всего упоминается как гиалуронан, из-за многих различные форм, которые молекула ГК может принимать в физиологических условиях (форма собственной кислоты, и соли, например гиалуронат натрия) [1].Glycosaminoglycans (GAGs) are linear polysaccharides formed from repeats of disaccharides consisting of amino sugars - hexosamines and uronic acid residues (D-glucuronic or L-iduronic). Hyaluronic acid (HA) ([D-glucuronic acid (1-β-3), N-acetyl-D-glucosamine (1-β-4)] n) (Fig. 1), which is characterized by the absence of sulfate groups, is a biopolymer a wide range and is widely used in various fields of medicine. This macromolecule is most often referred to as hyaluronan, because of the many different forms that the HA molecule can take under physiological conditions (a form of its own acid, and a salt such as sodium hyaluronate) [1].
Этот биополимер широко распространен в природе, будучи идентифицированным в мягких тканях позвоночных (например, суставы, синовиальная жидкость, кожа, стекловидное тело глаза, пуповина) [2], у водорослей [3], у моллюсков [4], и также в культивируемых эукариотических клеточных линиях и некоторых прокариот, где выполняет функцию защитной капсулы, окружающей клетку [5]. ГК, присутствующая у всех позвоночных, является основным компонентом внеклеточного матрикса: в стекловидном теле глаза человека (0,1 мг/мл) и в синовиальной суставной жидкости (3-4 мг/мл).This biopolymer is widespread in nature, being identified in the soft tissues of vertebrates (for example, joints, synovial fluid, skin, vitreous of the eye, umbilical cord) [2], in algae [3], in molluscs [4], and also in cultured eukaryotic cell lines and some prokaryotes, where it acts as a protective capsule surrounding the cell [5]. HA, present in all vertebrates, is the main component of the extracellular matrix: in the vitreous humor of the human eye (0.1 mg / ml) and in the synovial joint fluid (3-4 mg / ml).
У позвоночных ГК выполняет широкий спектр функций: в коже она поддерживает гидратацию тканей [8]; в хряще она питает хондроциты, регулирует обмен воды и содержание ионов, поддерживает физические свойства ткани и регулирует взаимодействие клеток хряща с межклеточным субстратом. Биологические эффекты, связанные с взаимодействием ГК-рецептора, вызывают изменения скорости в пролиферация клеток, их миграции и ангиогенез [9, 10]. Кроме того, перепроизводство ГК наблюдается при заболеваниях, связанных с воспалением, фиброзом и раком. В последнее время прямые доказательства свидетельствуют об участии ГК при метастазировании рака [11, 12]. Молярная масса природного гиалуронана варьируется от нескольких сотен Дальтон до 8 млн Дальтон, но среднее значение колеблется в интервале от 1 млн до 2 млн Дальтон.In vertebrates, HA performs a wide range of functions: in the skin, it maintains tissue hydration [8]; in cartilage, it nourishes chondrocytes, regulates water exchange and ion content, maintains the physical properties of tissue and regulates the interaction of cartilage cells with the intercellular substrate. Biological effects associated with the interaction of the GK-receptor cause changes in the rate of cell proliferation, migration, and angiogenesis [9, 10]. In addition, an overproduction of HA is observed in diseases associated with inflammation, fibrosis, and cancer. Recently, direct evidence indicates the involvement of HA in cancer metastasis [11, 12]. The molar mass of natural hyaluronan ranges from a few hundred Daltons to 8 million Daltons, but the average value ranges from 1 million to 2 million Daltons.
Гиалуронан, обладая хорошей растворимостью в воде, энергетически стабилен [13] и может существовать в разнообразных конформационных состояниях (вытянутые цепи, расслабленные спирали, стержневидные структуры и др.). Большая способность ГК удерживать воду связана с его гидрофильной химической природой. Такую структуру (Фиг. 2) поддерживают внутримолекулярные водородные связи, которые придают макромолекуле определенную жесткость и способствуют образованию на ее поверхности гидрофобных участков, что делает возможным поперечное связывание соседних молекул ГК, а также его взаимодействие с клеточными мембранами и липидными компонентами. Длинные полимерные молекулы гиалуроновой кислоты, формируют фибриллы, сети, стопки [14]. Вязкоупругая природа относится к реологическому поведению водных растворов ГК, которые проявляют эластичность геля в сочетании с вязкостью жидкости.Hyaluronan, having good solubility in water, is energetically stable [13] and can exist in various conformational states (elongated chains, relaxed helices, rod-like structures, etc.). The great ability of HA to retain water is due to its hydrophilic chemical nature. This structure (Fig. 2) is supported by intramolecular hydrogen bonds, which give the macromolecule a certain rigidity and promote the formation of hydrophobic regions on its surface, which makes it possible to cross-link adjacent HA molecules, as well as its interaction with cell membranes and lipid components. Long polymer molecules of hyaluronic acid form fibrils, networks, stacks [14]. The viscoelastic nature refers to the rheological behavior of aqueous HA solutions, which exhibit the elasticity of the gel in combination with the viscosity of the liquid.
Даже при небольших концентрациях гиалуронана происходит внутримолекулярное взаимодействие, возникает упорядоченная и относительно стабильная трехмерная структура в виде пластинок и трубочек, хотя молекулы полисахарида в растворе продолжают находиться в движении [17].Even at low concentrations of hyaluronan, intramolecular interaction occurs, an ordered and relatively stable three-dimensional structure in the form of plates and tubes appears, although the polysaccharide molecules in solution continue to be in motion [17].
Из-за вышеупомянутых выделенных свойств, разработка и коммерциализация продуктов на основе ГК находятся в непрерывном движении. ГК в основном используется в лечение остеоартроза, в косметике, в офтальмологии, в эстетической медицине, в хирургия и заживление ран, также при местной доставке лекарственных средств и тканевой инженерии [16, 18].Due to the aforementioned highlighted properties, the development and commercialization of HA-based products is in constant flux. HA is mainly used in the treatment of osteoarthritis, in cosmetics, in ophthalmology, in aesthetic medicine, in surgery and wound healing, as well as in local drug delivery and tissue engineering [16, 18].
В некоторых из вышеупомянутых областей применения ГК используется в естественном виде, а именно в линейной форме. Однако для многих целей необходимы модификации ГК. Инициируемые в линейной форме поперечные сшивки разделяют на физические (образованные в результате электростатического взаимодействия или водородных связей) и химические (ковалентные связи). Количество ковалентных сшивок оказывает влияние на свойства полученных гидрогелей, такие как степень набухания, механическая прочность и эластичность, проницаемость, характеристики, связанные с миграцией сквозь них лекарственных форм и малых молекул [19].In some of the aforementioned applications, HA is used in its natural form, namely in a linear form. However, for many purposes, modifications to the main body are required. Crosslinks initiated in a linear form are divided into physical (formed as a result of electrostatic interaction or hydrogen bonds) and chemical (covalent bonds). The number of covalent crosslinks affects the properties of the obtained hydrogels, such as the degree of swelling, mechanical strength and elasticity, permeability, characteristics associated with the migration of dosage forms and small molecules through them [19].
Применение линейных форм ГК в условиях in vivo приводит к скорой потере молекулярной массы, изменению вязкоупругих свойств и структуры в виду нестабильности из-за действия ферментов гиалуронидаз, свободных радикалов и температуры. Для решения вышеупомянутых проблем, можно реализовать подход, основанный на создании поперечных связей внутри и межмолекулярных связей в молекуле полимера ГК. Это обстоятельство уменьшает скорость биодеградации, подразумевает увеличение времени его местонахождения в тканях и его планирование в зависимости от типа модификации. Данные производные могут быть получены с помощью различных реагентов, например, карбодиимидов [US 7879818, US 20070224277], производных дивинилсульфона [US 4582865, US 4605601, US 4636524, EP 0939086], замещенных оксиранов [US 4716224, US 4772419, US 4716154], 1,4-бутандиолдиглицидилового эфира (БДДЭ) [WO 2013021249, US 4716224], многоатомных спиртов [US 4957744], органических альдегидов [US 4713448, US 5128326, US 4582865], бискарбодиимидов [US 5356883], полимеров карбоновых кислот [EP 0718312], карбонат-замещенного пиридина [EP 2408823], олиго- или полипептида [EP 2094736], производных азиридина [US 20050222081].The use of linear forms of HA in vivo leads to a rapid loss of molecular weight, a change in viscoelastic properties and structure due to instability due to the action of hyaluronidase enzymes, free radicals and temperature. To solve the above problems, it is possible to implement an approach based on the creation of cross-links within and intermolecular bonds in the HA polymer molecule. This circumstance reduces the rate of biodegradation, implies an increase in the time of its location in tissues and its planning, depending on the type of modification. These derivatives can be obtained using various reagents, for example, carbodiimides [US 7879818, US 20070224277], divinyl sulfone derivatives [US 4582865, US 4605601, US 4636524, EP 0939086], substituted oxiranes [US 4716224, US 4772419, US 4716154], 1,4-butanediol diglycidyl ether (BDDE) [WO 2013021249, US 4716224], polyhydric alcohols [US 4957744], organic aldehydes [US 4713448, US 5128326, US 4582865], biscarbodiimides [US 5356883], carboxylic acid polymers [EP 0718 , carbonate-substituted pyridine [EP 2408823], oligo- or polypeptide [EP 2094736], derivatives of aziridine [US 20050222081].
Таким образом, если линейная форма ГК используется для подкожных инъекций, то полезный эффект быстро проходит в определенный период времени. Модифицированная форма ГК, напротив, менее восприимчива к химическому и ферментативному гидролизу, показывает длительную устойчивость в естественных условиях, таким образом пролонгирует полезный эффект от применения [16]. Процессы модификации, особенно сшивки, значительно улучшают специфические механические свойства материала [16].Thus, if the linear form of HA is used for subcutaneous injection, then the beneficial effect quickly disappears in a certain period of time. The modified form of HA, on the contrary, is less susceptible to chemical and enzymatic hydrolysis, shows long-term stability in vivo, thus prolonging the beneficial effect of its use [16]. Modification processes, especially crosslinking, significantly improve the specific mechanical properties of the material [16].
Однако стоит упомянуть, что в результате использования сшивающих агентов различной природы, существует необходимость их своевременной дезактивации, поскольку в результате деградации полимера они могут высвобождаться с сохранением токсичных свойств.However, it is worth mentioning that as a result of the use of cross-linking agents of various nature, there is a need for their timely deactivation, since as a result of polymer degradation they can be released while maintaining toxic properties.
Полипропиленгликоль (ППГ) является нетоксичной, прозрачной и бесцветной жидкостью без запаха, которая широко используется в пищевой, фармацевтической и косметической промышленности в качестве прямой и непрямой добавки. Жидкость имеет низкое давление пара и вязкость. Коммерческий полипропиленгликоль обычно получают из воды и пропиленоксида, полученных из органических и неорганических источников.Polypropylene glycol (PPG) is a non-toxic, clear and colorless odorless liquid that is widely used in the food, pharmaceutical and cosmetic industries as a direct and indirect additive. The liquid has low vapor pressure and low viscosity. Commercial polypropylene glycol is usually obtained from water and propylene oxide obtained from organic and inorganic sources.
Управление по контролю за продуктами и лекарствами США присвоило полипропиленгликолю статус GRAS (общепризнанный как безопасный), поскольку он легко метаболизируется в организме человека в виде углеводов. В пищевой и фармацевтической индустрии ППГ используются уже более 50 лет. Инертное химическое вещество служит растворителем и стабилизатором, так как оно не реагирует и не изменяет ингредиенты конечного продукта.Polypropylene glycol has been designated GRAS (Generally Recognized as Safe) by the US Food and Drug Administration because it is easily metabolized in the human body as carbohydrates. In the food and pharmaceutical industries, PPGs have been in use for over 50 years. The inert chemical serves as a solvent and stabilizer as it does not react or alter the ingredients in the final product.
Таким образом, разработка новых подходом к созданию биополимеров (гелей) на основе модифицированной ГК является актуальной и важной задачей.Thus, the development of new approaches to the creation of biopolymers (gels) based on modified HA is an urgent and important task.
Раскрытие изобретенияDisclosure of invention
Задачей настоящего изобретения является разработка нового эффективного способа получения биополимера на основе модифицированного пространственно-сшитого сополимера гиалуроната натрия, способствующего полноценной замене эндопротезируемой биологической жидкости с сохранением основных природных свойств, включая структурную и транспортную функции.The objective of the present invention is to develop a new effective method for producing a biopolymer based on a modified spatially cross-linked copolymer of sodium hyaluronate, which promotes a complete replacement of the endoprosthetic biological fluid while maintaining basic natural properties, including structural and transport functions.
Техническим результатом настоящего изобретения является разработка нового эффективного способа получения биополимера на основе модифицированного сополимера гиалуроната натрия, способствующего наиболее полноценной замене эндопротезируемой биологической жидкости с сохранением основных природных свойств, включая структурную и транспортную функции. Указанный способ получения биополимера хорошо масштабируем, позволяет получать гипоаллергенный биополимер с высокой степенью чистоты и низким уровнем содержания эндотоксинов, то есть характеризующегося низкой токсичностью. Кроме того, указанный способ позволяет осуществлять регулировку создания поперечной сшивки с тем, чтобы получить биополимер с пространственной структурой, способный удерживать и/или высвобождать белки, то есть осуществлять депонирующую транспортную функцию. Биополимер, полученный заявленным способом, может найти широкое применение в медицине, в том числе хирургии и эндопротезировании, ортопедии, травматологии, офтальмологии, эстетической медицине.The technical result of the present invention is the development of a new effective method for producing a biopolymer based on a modified copolymer of sodium hyaluronate, which promotes the most complete replacement of endoprosthetic biological fluid while maintaining basic natural properties, including structural and transport functions. The specified method of obtaining a biopolymer is highly scalable, allows you to obtain a hypoallergenic biopolymer with a high degree of purity and a low level of endotoxin content, that is, characterized by low toxicity. In addition, this method makes it possible to regulate the creation of cross-linking in order to obtain a biopolymer with a spatial structure, capable of retaining and / or releasing proteins, that is, to carry out a depositing transport function. The biopolymer obtained by the claimed method can be widely used in medicine, including surgery and endoprosthetics, orthopedics, traumatology, ophthalmology, and aesthetic medicine.
Указанный технический результат достигается за счет осуществления способа получения биополимера на основе модифицированного сополимера гиалуроната натрия, включающий следующие стадии:The specified technical result is achieved by implementing a method for producing a biopolymer based on a modified copolymer of sodium hyaluronate, including the following stages:
- создание поперечных ковалентных связей между остатками D-глюкуроновой кислоты и D-N-ацетилглюкозамина, входящих в состав гиалуроната натрия, посредством введения двух и более сшивающих агентов различных молекулярных масс, в различном соотношении в основной среде, каждый из которых представляет собой (полипропиленгликоль)диглицидиловый эфир;- the creation of cross-linking covalent bonds between the residues of D-glucuronic acid and DN-acetylglucosamine, which are part of sodium hyaluronate, by introducing two or more cross-linking agents of different molecular weights, in different ratios in the basic medium, each of which is (polypropylene glycol) diglycidyl ether ;
- остановка стадии создания поперечных ковалентных связей и связывание свободных эпоксидных групп посредством добавления глицина.- stopping the stage of creating cross-linked covalent bonds and binding free epoxy groups by adding glycine.
В частных вариантах воплощения изобретения каждый сшивающий агент характеризуются молекулярную массу, имеющую значение в диапазоне от 500 до 8000 Да.In particular embodiments, each crosslinking agent has a molecular weight ranging from 500 to 8000 Da.
В частных вариантах воплощения изобретения мольное соотношение гиалуроната натрия и сшивающих агентов составляет 1:200 - 1:600. В более конкретных вариантах воплощения изобретения мольное соотношение гиалуроната натрия и сшивающих агентов составляет 1:400.In particular embodiments of the invention, the molar ratio of sodium hyaluronate and crosslinking agents is 1: 200 to 1: 600. In more specific embodiments, the molar ratio of sodium hyaluronate to crosslinking agents is 1: 400.
В частных вариантах воплощения изобретения после стадии добавления глицина реакционную смесь перемешивают при температуре 4-25°С и в течение 10-12 часов.In particular embodiments of the invention, after the step of adding glycine, the reaction mixture is stirred at a temperature of 4-25 ° C and for 10-12 hours.
В частных вариантах воплощения изобретения полученную реакционную смесь после стадии остановки и связывания эпоксидных групп нейтрализуют до значения pH 7,0±0,5, подвергают диализу в проточной системе с физиологическим фосфатным буфером, где pH принимает значение 7,3±0,2.In particular embodiments of the invention, the resulting reaction mixture, after the stage of stopping and binding of epoxy groups, is neutralized to a pH of 7.0 ± 0.5, dialyzed in a flow system with a physiological phosphate buffer, where the pH takes on a value of 7.3 ± 0.2.
В частных вариантах воплощения изобретения молекулярная масса гиалуроната натрия составляет от 1×106 Да до 2×106 Да.In particular embodiments of the invention, the molecular weight of sodium hyaluronate is from 1 × 10 6 Da to 2 × 10 6 Da.
В частных вариантах воплощения изобретения стадию создания поперечных ковалентных связей осуществляют в диапазоне температур от 0°С до 10°С.In particular embodiments of the invention, the covalent crosslinking step is carried out in a temperature range of 0 ° C to 10 ° C.
В частных вариантах воплощения изобретения стадию создания поперечных ковалентных связей осуществляют в течение 18-22 часов.In particular embodiments, the covalent crosslinking step is carried out for 18-22 hours.
В частных вариантах воплощения изобретения сшивающие агенты могут вводится одновременно, последовательно или через промежуток времени, в частности, промежуток времени составляет 3-5 часов.In particular embodiments of the invention, the crosslinking agents can be administered simultaneously, sequentially or over a period of time, in particular over a period of 3-5 hours.
В частных вариантах воплощения изобретения молярная масса получаемого биополимера не превышает 5000 кДа.In particular embodiments of the invention, the molar mass of the resulting biopolymer does not exceed 5000 kDa.
Настоящее изобретения также включает биополимер на основе модифицированного сополимера гиалуроната натрия, предназначенный для использования в качестве эндопротеза синовиальной жидкости и полученный способом по изобретению. В частных вариантах воплощения изобретения молярная масса биополимера не превышает 5000 кДа. В частных вариантах воплощения изобретения биополимер имеет степень сшивки 10±3%.The present invention also includes a biopolymer based on a modified sodium hyaluronate copolymer intended for use as a synovial fluid endoprosthesis and obtained by the method of the invention. In particular embodiments of the invention, the molar mass of the biopolymer does not exceed 5000 kDa. In particular embodiments of the invention, the biopolymer has a degree of crosslinking of 10 ± 3%.
Подробное раскрытие настоящего изобретенияDetailed Disclosure of the Present Invention
Краткое описание чертежей.Brief description of the drawings.
Фигура 1. Структурная формула мономерного звена молекулы гиалуронана.Figure 1. Structural formula of the monomeric unit of the hyaluronan molecule.
Фигура 2. Структурная формула тетрамера молекулы гиалуроновой кислоты в водном окружении в растворе.Figure 2. Structural formula of a tetramer of a hyaluronic acid molecule in an aqueous environment in solution.
Фигура 3. Химическая схема модификации гиалуронана посредством ППГДЭ для двух молекулярных масс.Figure 3. Chemical scheme of the modification of hyaluronan by means of PPHDE for two molecular weights.
Фигура 4. Общая структурная формула сшивающего агента ППГДЭ.Figure 4. General structural formula of the crosslinking agent PPHDE.
Фигура 5. Взаимодействие свободной эпоксидной группы с глицином.Figure 5. Interaction of the free epoxy group with glycine.
Фигура 6. Анализ цитотоксичности методом МТТ образца «Гируанана плюс» (HA) и образца биополимера (X1), полученного способом по изобретению. По оси Y указана безразмерная величина: индекс цитотоксичности (ЦИ), выражающегося в частном от деления количества клеток в опыте на количество клеток в контроле.Figure 6. MTT analysis of cytotoxicity of the sample "Giruanana plus" (HA) and a sample of biopolymer (X1) obtained by the method according to the invention. The Y-axis indicates a dimensionless value: the cytotoxicity index (CI), expressed in quotient from the division of the number of cells in the experiment by the number of cells in the control.
Фигура 7. Морфология клеток перитонеального экссудата (М1 и М2 соответствует популяция макрофагов, Ly - лимфоцитам):Figure 7. Morphology of cells of peritoneal exudate (M1 and M2 correspond to the population of macrophages, Ly - to lymphocytes):
(А) в контроле;(A) in control;
(Б) после в/б введения образца «Гируанана плюс» (HA);(B) after i.p. administration of the Giruanana plus (HA) sample;
(В) после в/б введения образца биополимера (Х1), полученного способом по изобретению.(C) after i.p. administration of a biopolymer sample (X1) obtained by the method according to the invention.
Фигура 8. Депонирование НА (А) и Х1 (Б) в жировых клетках через 7 дней после подкожного введения. НА и Х1 мечены родамином В (красный), ядра окрашены синим. Шкала 37 мкм.Figure 8. Deposition of HA (A) and X1 (B) in adipose cells 7 days after subcutaneous administration. HA and X1 are labeled with rhodamine B (red), the nuclei are colored blue.
Фигура 9. Захват макрофагами перитонеальной полости образца НА (А) или Х1 (Б) через 7 дней после в/б введения филлеров. Макрофаги окрашены антителами с CD11b (зеленый), филлеры окрашены родамином В (красный), ядра окрашены синим. Шкала 5-6 мкм.Figure 9. Capture by macrophages of the peritoneal cavity of the sample HA (A) or X1 (B) 7 days after the intravenous injection of fillers. Macrophages are stained with antibodies with CD11b (green), fillers are stained with rhodamine B (red), nuclei are colored blue. Scale 5-6 microns.
Фигура 10. Биораспределение образца НА (А-В) и Х1 (Д-З) через 10 дней после в/б введения 200 мкл образца с родамином В (красный). А, Д жировая ткань, шкала 17 мкм; Б, Е - почки, шкала 17 мкм (на врезке шкала 120 мкм); В, Ж - печень, шкала 30 мкм, З - печень, шкала 111 мкм; Г - печень, интактная мышь. Синим окрашены ядра клеток.Figure 10. Biodistribution of sample HA (A-B) and X1 (E-C) 10 days after i.p. injection of 200 μl of sample with rhodamine B (red). A, D adipose tissue, scale 17 microns; B, E - kidneys, scale 17 μm (inset, scale 120 μm); B, F - liver, scale 30 microns, H - liver, scale 111 microns; D - liver, intact mouse. Cell nuclei are colored blue.
Фигура 11. Биодеградация образца НА (А) и Х1 (Б) клетками кожи человека (линия HaCaT) на 9 день культивирования сфероидов. Шкала 22 мкм. Сфероиды получены на антиадгезивной подложке.Figure 11. Biodegradation of a sample of HA (A) and X1 (B) by human skin cells (HaCaT line) on day 9 of spheroid cultivation.
Фигура 12. Биодеградация НА (А, В) и Х1 (Б, Г) в мышах линии A/Sn через 20 дней после введения внутрибрюшинно (А, Б) или в область жировой подушки №3 мыши. Шкала 45 мкм. Ядра окрашены Хехст (синий), мембраны клеток - фаллоидином (зеленый).Figure 12. Biodegradation of HA (A, C) and X1 (B, D) in A / Sn mice 20 days after intraperitoneal injection (A, B) or in the area of fat pad No. 3 of the mouse. Scale 45 microns. Nuclei are stained with Hoechst (blue), cell membranes - with phalloidin (green).
Фигура 13. Наличие флуоресцентного сигнала в области родамина (FL2) в спленоцитах мышей линии A/Sn через 20 дней после введения внутрибрюшинно (А, Б) или в область жировой подушки №3 (В, Г).Figure 13. The presence of a fluorescent signal in the region of rhodamine (FL2) in splenocytes of mice line A / Sn 20 days after intraperitoneal injection (A, B) or in the area of fat pad # 3 (C, D).
Определения и терминыDefinitions and terms
Для лучшего понимания настоящего изобретения ниже приведены некоторые термины, использованные в настоящем описании изобретения.For a better understanding of the present invention, below are some of the terms used in the present description of the invention.
В описании данного изобретения термины «включает» и «включающий» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».In the description of this invention, the terms "includes" and "including" are interpreted as meaning "includes, among other things". These terms are not intended to be construed as “consists only of”.
В описании данного изобретения термин «расщепление или деполимеризация» относится к структурным изменениям биополимера (гиалуроната) из-за воздействия экологических, химических или термических факторов, которые влекут за собой уменьшение средней молекулярной массы биополимера, в том числе при автоклавировании, приводящем к изменению реологических свойств.In the description of this invention, the term "cleavage or depolymerization" refers to structural changes in a biopolymer (hyaluronate) due to the influence of environmental, chemical or thermal factors that entail a decrease in the average molecular weight of the biopolymer, including during autoclaving, leading to a change in rheological properties ...
В описании данного изобретения термин «деградация» относится к изменению физико-химических свойств, происходящему в результате действия температур, кислот, или щелочей, а также действию ферментов in vitro, в частности, гиулуронидазой. Деградация биополисахаридов, происходит в основном посредством расщепления гликозидных связей кислотно-каталитическим гидролизом.In the description of this invention, the term "degradation" refers to a change in physicochemical properties resulting from the action of temperatures, acids, or alkalis, as well as the action of enzymes in vitro , in particular, huluronidase. Degradation of biopolysaccharides occurs mainly through the cleavage of glycosidic bonds by acid catalytic hydrolysis.
В описании данного изобретения термин «биодеградация» относится к изменению физико-химических свойств, происходящему в течение определенного времени, в результате воздействия факторов иммунной системы и ферментативной активности межтканевой и межклеточной среды, куда был помещен имплантат in vivo.In the description of this invention, the term "biodegradation" refers to a change in physicochemical properties that occurs over a certain time, as a result of exposure to factors of the immune system and the enzymatic activity of the interstitial and intercellular environment, where the implant was placed in vivo .
Термин «молекулярная масса (средний молекулярный вес)» - это средняя статистическая величина относительных молекулярных масс макромолекул, составляющих биополимер.The term "molecular weight (average molecular weight)" is the statistical average of the relative molecular weights of the macromolecules that make up the biopolymer.
Термин «олигомер» в данном документе относится к молекуле в виде цепочки из небольшого количества одинаковых составных звеньев.The term "oligomer" in this document refers to a molecule in the form of a chain of a small number of identical constituent units.
Термин «мономер» в данном документе относится к молекуле (дисахарид), элементарной структурной единице из которой состоит биополимер в результате ее выстраивания в цепочку с многократным повторением.The term "monomer" in this document refers to a molecule (disaccharide), an elementary structural unit of which a biopolymer is composed as a result of its lining up in a chain with multiple repetitions.
В описании данного изобретения термины «гиалуронан» относится к несульфатированному гликозаминогликану, который представляет собой линейный, неразветвленный полимер, построенный из повторяющегося дисахаридного фрагмента гиалуроновой кислоты, состоящей из D-глюкуронида-β-(1,3)-(N-ацетил)-глюкозамина и соединенной β (1-4) гликозидной связью.In the description of this invention, the terms "hyaluronan" refers to a non-sulfated glycosaminoglycan, which is a linear, unbranched polymer built from a repeating disaccharide moiety of hyaluronic acid, consisting of D-glucuronide-β- (1,3) - (N-acetyl) -glucosamine and linked by a β (1-4) glycosidic bond.
(Полипропиленгликоль)диглицидиловый эфир - доступный и удобный в использовании, безопасный сшивающий агент, общая формула - C3H5O2-OCH(CH3)CH2)n-C3H5O (фиг. 4), где мономерами для дистанцирования цепей ГК являются молекулы полипропиленгликоля, с молярными массами от 500 до 800 0000 Да.(Polypropylene glycol) diglycidyl ether is an affordable and easy-to-use, safe cross-linking agent, the general formula is C 3 H 5 O 2 -OCH (CH 3 ) CH 2 ) n -C 3 H 5 O (Fig. 4), where the monomers for The spacing of HA chains are polypropylene glycol molecules, with molar masses from 500 to 8000000 Da.
Осуществление изобретенияImplementation of the invention
Способ получении биополимера на основе модифицированного сополимера гиалуроната натрия согласно изобретению заключается в создании поперечных ковалентных простых эфирных связей между остатками D-глюкуроновой кислоты и D-N-ацетилглюкозамина, входящих в состав гиалуроната натрия, в результате введения двух и более сшивающих бифункциональных агентов - (полипропиленгликоль)диглицидиловых эфиров (ППГДЭ) с различными молярными массами и в разных пропорциях в основной среде (фиг. 3). Основным сырьем для процесса служит гиалуроновая кислота, ее натриевая соль может быть получена, в частности, методом биотехнологического синтеза на основе бактериальных штаммов (Streptococcus, Bacillus subtilis). После процесса химической сополимеризации полученную реакционную смесь нейтрализуют до показателя pH около 7, оставшиеся свободные эпоксидные группы дезактивируют глицином (фиг. 5), затем полученный биополимер подвергают проточному диализу, гомогенизируют и после розлива по стеклянным флаконам или шприцам предварительного заполнения, стерилизуют паром. Использование стадии дезактивация эпоксидных групп глицином позволяет получить безопасный продукт, характеризующийся низкой токсичностью. При этом в ходе стадии диализа остатки глицина удаляются.The method of obtaining a biopolymer based on a modified copolymer of sodium hyaluronate according to the invention consists in creating transverse covalent ether bonds between the residues of D-glucuronic acid and DN-acetylglucosamine, which are part of sodium hyaluronate, as a result of the introduction of two or more cross-linking bifunctional agents - (polypropylene glycol) diglycidyl ethers (PPGDE) with different molar masses and in different proportions in the basic environment (Fig. 3). The main raw material for the process is hyaluronic acid, its sodium salt can be obtained, in particular, by the method of biotechnological synthesis based on bacterial strains ( Streptococcus, Bacillus subtilis ). After the chemical copolymerization process, the resulting reaction mixture is neutralized to a pH of about 7, the remaining free epoxy groups are deactivated with glycine (Fig. 5), then the resulting biopolymer is subjected to flow dialysis, homogenized and, after filling in glass vials or pre-filled syringes, sterilized with steam. The use of the stage of deactivation of epoxy groups with glycine allows obtaining a safe product characterized by low toxicity. This removes glycine residues during the dialysis step.
Исходным сырьем для осуществления способа по изобретению служит фармакопейно чистый гиалуронат натрия с молекулярной массой в диапазоне от 1×106 Да до 2×106 Да. Затем гиалуронан растворяют в растворе гидроксида натрия, что является необходимым условием для реакции с ППГДЭ и уменьшения конечной вязкости раствора, что в свою очередь улучшает реологические свойства раствора и делает возможным его равномерное перемешивание и гомогенизацию.The starting material for the implementation of the method according to the invention is pharmacopoeially pure sodium hyaluronate with a molecular weight in the range from 1 × 10 6 Da to 2 × 10 6 Da. Then hyaluronan is dissolved in a sodium hydroxide solution, which is a prerequisite for the reaction with PPHDE and a decrease in the final viscosity of the solution, which in turn improves the rheological properties of the solution and makes it possible for its uniform mixing and homogenization.
Сшивающие агенты ППГДЭ по отдельности, или смесь в определенной пропорции добавляют к раствору гиалуроната натрия, реакцию ведут в интервале температур от 0°С до 10°С. Реакция на каждой стадии (в том числе на стадии растворения ГК, стадии сшивки (создания поперечных связей), стадии остановки реакции, нейтрализации и диализа) длится не более 24 ч.Cross-linking agents PPGDE separately, or a mixture in a certain proportion is added to the sodium hyaluronate solution, the reaction is carried out in the temperature range from 0 ° C to 10 ° C. The reaction at each stage (including the stage of HA dissolution, the stage of cross-linking (creation of cross-links), the stage of stopping the reaction, neutralization and dialysis) lasts no more than 24 hours.
Основной особенностью изобретения является возможность точно контролировать (в частности, посредством метода одномерной (1H, 13C) и двумерной (1H-1H COSY, 1H-13C HSQC) спектроскопии ЯМР, а также посредством спектров комбинационного светорассеяния) условия реакции полимеризации, что позволит получать производные гиалуронана, обладающими уникальными свойствами, пространственной структурой молекулярной сети, влияющей на белковое взаимодействие, а именно с возможностью контролировать обмен и высвобождение белков. Способ по изобретению позволяет точно изменять реологические свойства полученного биополимера для обеспечения выполнения природных функций, протезируемой биологической жидкости, в частности, как эндопротез синовиальной жидкости с сохранением свойств беспрепятственного проникновения в губчатую межклеточную структуру хряща для доставки питательных компонентов хондроцитам. Другими словами, способ согласно настоящему изобретению позволяет получить биополимер с определенным размером пор, которые обеспечивают транспорт белков. Таким образом, способ по изобретению позволяет получить биополимер, который характеризуется не только необходимыми реологическими свойствами, но и транспортными функциями аналогичными для биологических жидкостей, в частности синовиальной жидкости.The main feature of the invention is the ability to accurately control (in particular, through the method of one-dimensional ( 1 H, 13 C) and two-dimensional ( 1 H- 1 H COZY, 1 H- 13 C HSQC) NMR spectroscopy, as well as through Raman spectra) the reaction conditions polymerization, which will make it possible to obtain hyaluronan derivatives with unique properties, the spatial structure of the molecular network that affects the protein interaction, namely, with the ability to control the exchange and release of proteins. The method according to the invention allows you to accurately change the rheological properties of the obtained biopolymer to ensure the performance of natural functions of the prosthetic biological fluid, in particular, as an endoprosthesis of synovial fluid, while maintaining the properties of unhindered penetration into the spongy intercellular structure of the cartilage to deliver nutrient components to chondrocytes. In other words, the method according to the present invention produces a biopolymer with a defined pore size that allows transport of proteins. Thus, the method according to the invention makes it possible to obtain a biopolymer, which is characterized not only by the necessary rheological properties, but also by transport functions similar to those for biological fluids, in particular synovial fluid.
Скорость взаимодействия гиалуроновой кислоты и эпоксидных групп сшивающих агентов не является линейной характеристикой. Необходимый процент сшивки, в частности 10±3 %, согласно способу по изобретению контролировался посредством методов ЯМР, таких как: 1H-ЯМР, 13С-ЯМР, 1H-1H COSY, 1H-13CHSQC, 1H-13CHMBC. Таким образом, способ по изобретению позволяет промышленно получать биополимер с воспроизводимыми физико-химическим характеристиками, с возможностью контроля структуру и количества свободных эпоксидных групп.The rate of interaction of hyaluronic acid and epoxy groups of cross-linking agents is not a linear characteristic. The required percentage of crosslinking, in particular 10 ± 3%, according to the method according to the invention was monitored by means of NMR methods such as: 1 H-NMR, 13 C-NMR, 1 H- 1 H COZY, 1 H- 13 CHSQC, 1 H- 13 CHMBC. Thus, the method according to the invention makes it possible to industrially obtain a biopolymer with reproducible physicochemical characteristics, with the possibility of controlling the structure and amount of free epoxy groups.
Основным преимуществом данного способа (двойной сшивки) является возможность получать близкие по реологическим свойствам к биологической жидкости человека биополимеры, при этом контролируя среднюю молекулярную массу полученных полимерных сшитых цепей. Например, при замене синовиальной жидкости на биополимер, полученный способом по изобретению, не происходит изменение локомоции сустава, куда был помещен эндопротез синовиальной жидкости, и нет препятствий для проникновения в межклеточное пространство, а именно в поры хрящевой ткани. В связи с чем нет прерывания питания хрящевой ткани при данного рода терапии.The main advantage of this method (double crosslinking) is the ability to obtain biopolymers similar in rheological properties to human biological fluid, while controlling the average molecular weight of the obtained polymer crosslinked chains. For example, when replacing synovial fluid with a biopolymer obtained by the method according to the invention, there is no change in the locomotion of the joint where the endoprosthesis of the synovial fluid was placed, and there are no obstacles to penetration into the intercellular space, namely into the pores of the cartilage tissue. In this connection, there is no interruption in the supply of cartilage tissue with this type of therapy.
Биополимер на основе модифицированного гиалуроната натрия по изобретению является биосовместимым, неиммуногенным, более устойчивым к ферментативному расщеплению, чем немодифицированный гиалуронан, что позволяет использовать его в различных областях общей медицины, в частности:The biopolymer based on modified sodium hyaluronate according to the invention is biocompatible, non-immunogenic, more resistant to enzymatic degradation than unmodified hyaluronan, which allows it to be used in various fields of general medicine, in particular:
1) в ревматологии, ортопедии и травматологии в качестве средства для внутрисуставного введения пролонгированного действия при терапии остеоартрозов дегенеративно-дистрофического и постравматического генеза различной локализации (не только крупных суставов, а именно коленного и тазобедренного, но более мелких, таких как плечевой и локтевой суставы). При внутрисуставных инъекциях сшитых и линейных форм ГК обнаружено, что гиалуронан оказывает терапевтическое воздействие при остеоартрите. Несколько исследований были проведены для изучения эффектов, показывающих, что ГК способна подавлять дегенерация хряща, обеспечивать защиту мягких тканей поверхностей суставов, нормализует реологические свойства синовиальной жидкости и приводит к снижению болевого восприятия [20, 21, 18].1) in rheumatology, orthopedics and traumatology as a means for intra-articular administration of prolonged action in the treatment of osteoarthritis of degenerative-dystrophic and post-traumatic genesis of various localization (not only large joints, namely the knee and hip, but smaller ones, such as the shoulder and elbow joints) ... With intra-articular injections of cross-linked and linear forms of HA, hyaluronan was found to have a therapeutic effect in osteoarthritis. Several studies have been conducted to investigate the effects showing that HA is able to suppress cartilage degeneration, protect the soft tissue of the joint surfaces, normalize the rheological properties of synovial fluid, and reduce pain perception [20, 21, 18].
2) в офтальмологии в качестве активного ингредиента для увлажнения глаз, также биополимер по изобретению может быть использован при хирургическом лечении офтальмологических заболеваний, травм глаза, повреждений роговицы в качестве вископротектора, протектора клеток эндотелия при операциях;2) in ophthalmology as an active ingredient for moisturizing the eyes, the biopolymer according to the invention can also be used in the surgical treatment of ophthalmic diseases, eye injuries, corneal injuries as a viscoprotector, protector of endothelial cells during operations;
3) в качестве депонирующего агента для инъекционной имплантации в пораженную ткань, или орган с последующим высвобождением биологически активных веществ и лекарственных средств: как малых молекул, так и терапевтических биополимеров, в частности, пептидной природы;3) as a depositing agent for injection implantation into the affected tissue or organ with the subsequent release of biologically active substances and drugs: both small molecules and therapeutic biopolymers, in particular, of a peptide nature;
4) в эстетической медицине в качестве кожных наполнителей по безоперационному увеличению мягких тканей, в том числе для сглаживания морщин и увеличения объема мягких тканей, такие как губы и грудь.4) in aesthetic medicine as dermal fillers for non-surgical augmentation of soft tissues, including for smoothing wrinkles and increasing the volume of soft tissues, such as lips and breasts.
5) в косметике в качестве увлажняющего компонента. Использование биополимера, полученного способом по изобретению, может способствовать увлажнению кожи и таким образом восстанавливать эластичность, уменьшая тем самым глубину морщин. Кроме того, указанный биополимер может стимулировать эпидермальные клетки к пролиферации и делению, а также способствовать защите коже человека от ультрафиолетового излучения.5) in cosmetics as a moisturizing component. The use of a biopolymer obtained by the method according to the invention can help to moisturize the skin and thus restore elasticity, thereby reducing the depth of wrinkles. In addition, this biopolymer can stimulate epidermal cells to proliferate and divide, as well as help protect human skin from ultraviolet radiation.
6) применение при местной доставке лекарств.6) application for local drug delivery.
Реализацию способа получения сополимера с межмолекулярной и внутримолекулярной сшитой структурой можно продемонстрировать на следующих примерах.The implementation of the method for producing a copolymer with an intermolecular and intramolecular crosslinked structure can be demonstrated in the following examples.
Пример 1.Example 1.
В колбу, снабженную верхнеприводной мешалкой, объемом 50 мл поместили 25 мл 1%-ного раствора гидроксида натрия и 1,3 г гиалуроната натрия. Смесь оставили перемешиваться в течение 3 ч при +20°С (160 об/мин). Затем к реакционной смеси добавили 1,5 мл ППГДЭ (M=1500 Да, ρ = 1,10 г/см3) и 4,0 мл ППГДЭ (M=640 Да, ρ = 1,06 г/см3). Реакцию проводили еще в течение 20 ч при перемешивании (160 об/мин, +4°С).In a flask equipped with an overhead stirrer with a volume of 50 ml was placed 25 ml of 1% sodium hydroxide solution and 1.3 g of sodium hyaluronate. The mixture was left stirring for 3 h at + 20 ° C (160 rpm). Then, 1.5 ml of PPHDE (M = 1500 Da, ρ = 1.10 g / cm 3 ) and 4.0 ml of PPHDE (M = 640 Da, ρ = 1.06 g / cm 3 ) were added to the reaction mixture. The reaction was carried out for another 20 h with stirring (160 rpm, + 4 ° C).
Реакцию остановили добавлением 0,2 г глицина, предварительно растворенного в 1 мл ddH2O (стерильная ультрачистая вода) и оставляли перемешиваться в течение 10 ч при +4°С (30 об/мин). Полученный биополимер нейтрализовали раствором 1 М соляной кислоты до рН 7,0, затем перенесли в диализный мешок (Viking, 12 кДа). Биополимер диализовали, меняя 4 раза физиологический фосфатный буфер (PBS, 1 л, 2 мМ Na2HPO4/NaH2PO4, 145,5 мМ NaCl, pH 7,2±0,2). Полученный продукт довели необходимым количеством буфера до концентрации 20 мг/мл. Полученный биополимер перемешивали посредством верхнеприводной мешалки еще в течение 2 ч при 30 об/мин для его полной гомогенизации при температуре +4°С.The reaction was stopped by adding 0.2 g of glycine, previously dissolved in 1 ml of ddH 2 O (sterile ultrapure water) and left stirring for 10 h at + 4 ° C (30 rpm). The resulting biopolymer was neutralized with a 1 M hydrochloric acid solution to pH 7.0, then transferred to a dialysis bag (Viking, 12 kDa). The biopolymer was dialyzed by changing the physiological phosphate buffer 4 times (PBS, 1 L, 2 mM Na 2 HPO 4 / NaH 2 PO 4 , 145.5 mM NaCl, pH 7.2 ± 0.2). The resulting product was brought with the required amount of buffer to a concentration of 20 mg / ml. The resulting biopolymer was stirred with an overhead stirrer for another 2 h at 30 rpm for its complete homogenization at a temperature of + 4 ° C.
Пример 2.Example 2.
В колбу, снабженную верхнеприводной мешалкой, объемом 50 мл поместили 25 мл 1%-ного раствора гидроксида натрия и 2 г гиалуроната натрия. Смесь оставили перемешиваться в течение 3 ч при +10°С (160 об/мин). Затем к реакционной смеси добавили 1,0 мл ППГДЭ (M=1500 Да, ρ = 1,10 г/см3) и 4,0 мл ППГДЭ (M=640 Да, ρ = 1,06 г/см3). Реакцию проводили еще в течение 24 ч при перемешивании (160 об/мин, +10°С).In a flask equipped with an overhead stirrer with a volume of 50 ml was placed 25 ml of 1% sodium hydroxide solution and 2 g of sodium hyaluronate. The mixture was left stirring for 3 h at + 10 ° C (160 rpm). Then, 1.0 ml of PPHDE (M = 1500 Da, ρ = 1.10 g / cm 3 ) and 4.0 ml of PPHDE (M = 640 Da, ρ = 1.06 g / cm 3 ) were added to the reaction mixture. The reaction was carried out for another 24 h with stirring (160 rpm, + 10 ° С).
Реакцию остановили добавлением 0,4 г глицина, предварительно растворенного в 1 мл ddH2O и оставляли перемешиваться в течение 12 ч при +4°С (30 об/мин). Полученный биополимер нейтрализовали раствором 1 М соляной кислоты до рН 7,0, затем перенесли в диализный мешок (Viking, 12 кДа). Биополимер диализовали, меняя 4 раза физиологический фосфатный буфер (PBS, 1л, 2 мМ Na2HPO4/NaH2PO4, 145,5 мМ NaCl, pH 7,2±0,2). Полученный продукт довели необходимым количеством буфера до концентрации 30 мг/мл. Полученный биополимер перемешивали посредством верхнеприводной мешалки еще в течение 2 ч при 30 об/мин для его полной гомогенизации при температуре +4°С.The reaction was stopped by the addition of 0.4 g of glycine, previously dissolved in 1 ml of ddH 2 O, and the mixture was left stirring for 12 h at + 4 ° C (30 rpm). The resulting biopolymer was neutralized with a 1 M hydrochloric acid solution to pH 7.0, then transferred to a dialysis bag (Viking, 12 kDa). The biopolymer was dialyzed by changing the physiological phosphate buffer 4 times (PBS, 1 L, 2 mM Na 2 HPO 4 / NaH 2 PO 4 , 145.5 mM NaCl, pH 7.2 ± 0.2). The resulting product was brought with the required amount of buffer to a concentration of 30 mg / ml. The resulting biopolymer was stirred with an overhead stirrer for another 2 h at 30 rpm for its complete homogenization at a temperature of + 4 ° C.
Пример 3.Example 3.
В колбу, снабженную верхнеприводной мешалкой, объемом 50 мл поместили 25 мл 1%-ного раствора гидроксида натрия и 0,9 г гиалуроната натрия. Смесь оставили перемешиваться в течение 3 ч при +20°С (160 об/мин). Затем к реакционной смеси добавили 2,0 мл ППГДЭ (M=1500 Да, ρ = 1,10 г/см3) и 4,0 мл ППГДЭ (M=640 Да, ρ = 1,06 г/см3). Реакцию проводили еще в течение 18 ч при перемешивании (160 об/мин, +10°С).In a flask equipped with an overhead stirrer with a volume of 50 ml was placed 25 ml of 1% sodium hydroxide solution and 0.9 g of sodium hyaluronate. The mixture was left stirring for 3 h at + 20 ° C (160 rpm). Then, 2.0 ml of PPHDE (M = 1500 Da, ρ = 1.10 g / cm 3 ) and 4.0 ml of PPHDE (M = 640 Da, ρ = 1.06 g / cm 3 ) were added to the reaction mixture. The reaction was carried out for another 18 h with stirring (160 rpm, + 10 ° C).
Реакцию остановили добавлением 0,2 г глицина, предварительно растворенного в 1 мл ddH2O и оставляли перемешиваться в течение 10 ч при +4°С (30 об/мин). Полученный биополимер нейтрализовали раствором 1 М соляной кислоты до рН 7,0, затем перенесли в диализный мешок (Viking, 12 кДа). Биополимер диализовали, меняя 4 раза физиологический фосфатный буфер (PBS, 1л, 2 мМ Na2HPO4/NaH2PO4, 145,5 мМ NaCl, pH 7,2±0,2). Полученный продукт довели необходимым количеством буфера до концентрации 15 мг/мл. Полученный Биополимер перемешивали посредством верхнеприводной мешалки еще в течение 2 ч при 30 об/мин для его полной гомогенизации при температуре +4°С.The reaction was stopped by the addition of 0.2 g of glycine, previously dissolved in 1 ml of ddH 2 O, and the mixture was left stirring for 10 h at + 4 ° C (30 rpm). The resulting biopolymer was neutralized with a 1 M hydrochloric acid solution to pH 7.0, then transferred to a dialysis bag (Viking, 12 kDa). The biopolymer was dialyzed by changing the physiological phosphate buffer 4 times (PBS, 1 L, 2 mM Na 2 HPO 4 / NaH 2 PO 4 , 145.5 mM NaCl, pH 7.2 ± 0.2). The resulting product was brought with the required amount of buffer to a concentration of 15 mg / ml. The obtained biopolymer was stirred by means of an overhead stirrer for another 2 h at 30 rpm for its complete homogenization at a temperature of + 4 ° C.
Пример 4.Example 4.
В колбу, снабженную верхнеприводной мешалкой, объемом 50 мл поместили 25 мл 1%-ного раствора гидроксида натрия и 1,4 г гиалуроната натрия. Смесь оставили перемешиваться в течение 3 ч при +20°С (160 об/мин). Затем к реакционной смеси добавили 3,0 мл ППГДЭ (M=1500 Да, ρ = 1,10 г/см3) и 4,0 мл ППГДЭ (M=640 Да, ρ = 1,06 г/см3). Реакцию проводили еще в течение 18 ч при перемешивании (160 об/мин, +4°С).In a flask equipped with an overhead stirrer with a volume of 50 ml was placed 25 ml of 1% sodium hydroxide solution and 1.4 g of sodium hyaluronate. The mixture was left stirring for 3 h at + 20 ° C (160 rpm). Then 3.0 ml of PPHDE (M = 1500 Da, ρ = 1.10 g / cm 3 ) and 4.0 ml of PPHDE (M = 640 Da, ρ = 1.06 g / cm 3 ) were added to the reaction mixture. The reaction was carried out for another 18 h with stirring (160 rpm, + 4 ° C).
Реакцию остановили добавлением 0,2 г глицина, предварительно растворенного в 1 мл ddH2O и оставляли перемешиваться в течение 10 ч при +4°С (30 об/мин). Полученный биополимер нейтрализовали раствором 1 М соляной кислоты до рН 7,0, затем перенесли в диализный мешок (Viking, 12 кДа). Биополимер диализовали, меняя 4 раза физиологический фосфатный буфер (PBS, 1л, 2 мМ Na2HPO4/NaH2PO4, 145,5 мМ NaCl, pH 7,2±0,2). Полученный продукт довели необходимым количеством буфера до концентрации 20 мг/мл. Полученный биополимер перемешивали посредством верхнеприводной мешалки еще в течение 2 ч при 30 об/мин для его полной гомогенизации при температуре +4°С.The reaction was stopped by the addition of 0.2 g of glycine, previously dissolved in 1 ml of ddH 2 O, and the mixture was left stirring for 10 h at + 4 ° C (30 rpm). The resulting biopolymer was neutralized with a 1 M hydrochloric acid solution to pH 7.0, then transferred to a dialysis bag (Viking, 12 kDa). The biopolymer was dialyzed by changing the physiological phosphate buffer 4 times (PBS, 1 L, 2 mM Na 2 HPO 4 / NaH 2 PO 4 , 145.5 mM NaCl, pH 7.2 ± 0.2). The resulting product was brought with the required amount of buffer to a concentration of 20 mg / ml. The resulting biopolymer was stirred with an overhead stirrer for another 2 h at 30 rpm for its complete homogenization at a temperature of + 4 ° C.
Пример 5.Example 5.
В колбу, снабженную верхнеприводной мешалкой, объемом 50 мл поместили 25 мл 1%-ного раствора гидроксида натрия и 1,4 г гиалуроната натрия. Смесь оставили перемешиваться в течение 3 ч при +20°С (160 об/мин). Затем к реакционной смеси добавили 0,2 мл ППГДЭ (M=1500 Да, ρ = 1,10 г/см3) и 4,0 мл ППГДЭ (M=640 Да, ρ = 1,06 г/см3). Реакцию проводили еще в течение 18 ч при перемешивании (160 об/мин, +4°С).In a flask equipped with an overhead stirrer with a volume of 50 ml was placed 25 ml of 1% sodium hydroxide solution and 1.4 g of sodium hyaluronate. The mixture was left stirring for 3 h at + 20 ° C (160 rpm). Then 0.2 ml of PPHDE (M = 1500 Da, ρ = 1.10 g / cm 3 ) and 4.0 ml of PPHDE (M = 640 Da, ρ = 1.06 g / cm 3 ) were added to the reaction mixture. The reaction was carried out for another 18 h with stirring (160 rpm, + 4 ° C).
Реакцию остановили добавлением 0,2 г глицина, предварительно растворенного в 1 мл ddH2O и оставляли перемешиваться в течение 10 ч при +4°С (30 об/мин). Полученный биополимер нейтрализовали раствором 1 М соляной кислоты до рН 7,0, затем перенесли в диализный мешок (Viking, 12 кДа). Биополимер диализовали, меняя 4 раза физиологический фосфатный буфер (PBS, 1л, 2 мМ Na2HPO4/NaH2PO4, 145,5 мМ NaCl, pH 7,2±0,2). Полученный продукт довели необходимым количеством буфера до концентрации 20 мг/мл. Полученный биополимер перемешивали посредством верхнеприводной мешалки еще в течение 2 ч при 30 об/мин для его полной гомогенизации при температуре +4°С.The reaction was stopped by the addition of 0.2 g of glycine, previously dissolved in 1 ml of ddH 2 O, and the mixture was left stirring for 10 h at + 4 ° C (30 rpm). The resulting biopolymer was neutralized with a 1 M hydrochloric acid solution to pH 7.0, then transferred to a dialysis bag (Viking, 12 kDa). The biopolymer was dialyzed by changing the physiological phosphate buffer 4 times (PBS, 1 L, 2 mM Na 2 HPO 4 / NaH 2 PO 4 , 145.5 mM NaCl, pH 7.2 ± 0.2). The resulting product was brought with the required amount of buffer to a concentration of 20 mg / ml. The resulting biopolymer was stirred with an overhead stirrer for another 2 h at 30 rpm for its complete homogenization at a temperature of + 4 ° C.
Пример 6.Example 6.
В колбу, снабженную верхнеприводной мешалкой, объемом 50 мл поместили 12,5 мл 1%-ного раствора гидроксида натрия и 0,65 г гиалуроната натрия. Смесь оставили перемешиваться в течение 3 ч при +20°С (160 об/мин). Затем к реакционной смеси добавили 1,5 мл ППГДЭ (M=1500 Да, ρ = 1,10 г/см3), реакцию проводили в течение 6 ч при перемешивании. Далее дополнительно в реакционный объем поместили смесь 12,5 мл 1%-ного раствора гидроксида натрия и 0,65 г гиалуроната натрия, оставили перемешиваться в течение часа (160 об/мин, +4°С). Затем добавили 4,0 мл ППГДЭ (M=640 Да, ρ = 1,06 г/см3). Реакцию проводили еще в течение 20 ч при перемешивании (160 об/мин, +4°С).In a flask equipped with an overhead stirrer with a volume of 50 ml was placed 12.5 ml of 1% sodium hydroxide solution and 0.65 g of sodium hyaluronate. The mixture was left stirring for 3 h at + 20 ° C (160 rpm). Then, 1.5 ml of PPHDE (M = 1500 Da, ρ = 1.10 g / cm 3 ) was added to the reaction mixture, the reaction was carried out for 6 h with stirring. Then, additionally, a mixture of 12.5 ml of 1% sodium hydroxide solution and 0.65 g of sodium hyaluronate was placed in the reaction volume, left stirring for an hour (160 rpm, + 4 ° C). Then 4.0 ml of PPHDE was added (M = 640 Da, ρ = 1.06 g / cm 3 ). The reaction was carried out for another 20 h with stirring (160 rpm, + 4 ° C).
Реакцию остановили добавлением 0,2 г глицина, предварительно растворенного в 1 мл ddH2O и оставляли перемешиваться в течение 10 ч при +4°С (30 об/мин). Полученный биополимер нейтрализовали раствором 1 М соляной кислоты до рН 7,0, затем перенесли в диализный мешок (Viking, 12 кДа). Биополимер диализовали, меняя 4 раза физиологический фосфатный буфер (PBS, 1л, 2 мМ Na2HPO4/NaH2PO4, 145,5 мМ NaCl, pH 7,2±0,2). Полученный продукт довели необходимым количеством буфера до концентрации 20 мг/мл. Полученный биополимер перемешивали посредством верхнеприводной мешалки еще в течение 2 ч при 30 об/мин для его полной гомогенизации при температуре +4°С.The reaction was stopped by the addition of 0.2 g of glycine, previously dissolved in 1 ml of ddH 2 O, and the mixture was left stirring for 10 h at + 4 ° C (30 rpm). The resulting biopolymer was neutralized with a 1 M hydrochloric acid solution to pH 7.0, then transferred to a dialysis bag (Viking, 12 kDa). The biopolymer was dialyzed by changing the physiological phosphate buffer 4 times (PBS, 1 L, 2 mM Na 2 HPO 4 / NaH 2 PO 4 , 145.5 mM NaCl, pH 7.2 ± 0.2). The resulting product was brought with the required amount of buffer to a concentration of 20 mg / ml. The resulting biopolymer was stirred with an overhead stirrer for another 2 h at 30 rpm for its complete homogenization at a temperature of + 4 ° C.
Пример 7.Example 7.
В колбу, снабженную верхнеприводной мешалкой, объемом 50 мл поместили 12,5 мл 1%-ного раствора гидроксида натрия и 1,00 г гиалуроната натрия. Смесь оставили перемешиваться в течение 3 ч при +20°С (160 об/мин). Затем к реакционной смеси добавили 1,5 мл ППГДЭ (M=1500 Да, ρ = 1,10 г/см3), реакцию проводили в течение 6 ч при перемешивании. Далее дополнительно в реакционный объем поместили смесь 12,5 мл 1%-ного раствора гидроксида натрия и 0,40 г гиалуроната натрия, оставили перемешиваться в течение часа (160 об/мин, +4°С). Затем добавили 4,0 мл ППГДЭ (M=640 Да, ρ = 1,06 г/см3). Реакцию проводили еще в течение 20 ч при перемешивании (160 об/мин, +4°С).In a flask equipped with an overhead stirrer with a volume of 50 ml was placed 12.5 ml of 1% sodium hydroxide solution and 1.00 g of sodium hyaluronate. The mixture was left stirring for 3 h at + 20 ° C (160 rpm). Then, 1.5 ml of PPHDE (M = 1500 Da, ρ = 1.10 g / cm 3 ) was added to the reaction mixture, the reaction was carried out for 6 h with stirring. Then, additionally, a mixture of 12.5 ml of 1% sodium hydroxide solution and 0.40 g of sodium hyaluronate was placed in the reaction volume, left stirring for an hour (160 rpm, + 4 ° C). Then 4.0 ml of PPHDE was added (M = 640 Da, ρ = 1.06 g / cm 3 ). The reaction was carried out for another 20 h with stirring (160 rpm, + 4 ° C).
Реакцию остановили добавлением 0,2 г глицина, предварительно растворенного в 1 мл ddH2O и оставляли перемешиваться в течение 10 ч при +4°С (30 об/мин). Полученный биополимер нейтрализовали раствором 1 М соляной кислоты до рН 7,0, затем перенесли в диализный мешок (Viking, 12 кДа). Биополимер диализовали, меняя 4 раза физиологический фосфатный буфер (PBS, 1л, 2 мМ Na2HPO4/NaH2PO4, 145,5 мМ NaCl, pH 7,2±0,2). Полученный продукт довели необходимым количеством буфера до концентрации 20 мг/мл. Полученный биополимер перемешивали посредством верхнеприводной мешалки еще в течение 2 ч при 30 об/мин для его полной гомогенизации при температуре +4°С.The reaction was stopped by the addition of 0.2 g of glycine, previously dissolved in 1 ml of ddH 2 O, and the mixture was left stirring for 10 h at + 4 ° C (30 rpm). The resulting biopolymer was neutralized with a 1 M hydrochloric acid solution to pH 7.0, then transferred to a dialysis bag (Viking, 12 kDa). The biopolymer was dialyzed by changing the physiological phosphate buffer 4 times (PBS, 1 L, 2 mM Na 2 HPO 4 / NaH 2 PO 4 , 145.5 mM NaCl, pH 7.2 ± 0.2). The resulting product was brought with the required amount of buffer to a concentration of 20 mg / ml. The resulting biopolymer was stirred with an overhead stirrer for another 2 h at 30 rpm for its complete homogenization at a temperature of + 4 ° C.
Пример 8.Example 8.
В колбу, снабженную верхнеприводной мешалкой, объемом 50 мл поместили 12,5 мл 1%-ного раствора гидроксида натрия и 0,65 г гиалуроната натрия. Смесь оставили перемешиваться в течение 3 ч при +20°С (160 об/мин). Затем к реакционной смеси добавили 3,0 мл ППГДЭ (M=1500 Да, ρ = 1,10 г/см3), реакцию проводили в течение 6 ч при перемешивании. Далее дополнительно в реакционный объем поместили смесь 12,5 мл 1%-ного раствора гидроксида натрия и 0,65 г гиалуроната натрия, оставили перемешиваться в течение часа (160 об/мин, +4°С). Затем добавили 4,0 мл ППГДЭ (M=640 Да, ρ = 1,06 г/см3). Реакцию проводили еще в течение 20 ч при перемешивании (160 об/мин, +4°С).In a flask equipped with an overhead stirrer with a volume of 50 ml was placed 12.5 ml of 1% sodium hydroxide solution and 0.65 g of sodium hyaluronate. The mixture was left stirring for 3 h at + 20 ° C (160 rpm). Then 3.0 ml of PPHDE (M = 1500 Da, ρ = 1.10 g / cm 3 ) was added to the reaction mixture, the reaction was carried out for 6 h with stirring. Then, additionally, a mixture of 12.5 ml of 1% sodium hydroxide solution and 0.65 g of sodium hyaluronate was placed in the reaction volume, left stirring for an hour (160 rpm, + 4 ° C). Then 4.0 ml of PPHDE was added (M = 640 Da, ρ = 1.06 g / cm 3 ). The reaction was carried out for another 20 h with stirring (160 rpm, + 4 ° C).
Реакцию остановили добавлением 0,2 г глицина, предварительно растворенного в 1 мл ddH2O и оставляли перемешиваться в течение 10 ч при +10°С (30 об/мин). Полученный биополимер нейтрализовали раствором 1 М соляной кислоты до рН 7,0, затем перенесли в диализный мешок (Viking, 12 кДа). Биополимер диализовали, меняя 4 раза физиологический фосфатный буфер (PBS, 1л, 2 мМ Na2HPO4/NaH2PO4, 145,5 мМ NaCl, pH 7,2±0,2). Полученный продукт довели необходимым количеством буфера до концентрации 20 мг/мл. Полученный биополимер перемешивали посредством верхнеприводной мешалки еще в течение 2 ч при 30 об/мин для его полной гомогенизации при температуре +5°С.The reaction was stopped by the addition of 0.2 g of glycine, previously dissolved in 1 ml of ddH 2 O, and the mixture was left stirring for 10 h at + 10 ° C (30 rpm). The resulting biopolymer was neutralized with a 1 M hydrochloric acid solution to pH 7.0, then transferred to a dialysis bag (Viking, 12 kDa). The biopolymer was dialyzed by changing the physiological phosphate buffer 4 times (PBS, 1 L, 2 mM Na 2 HPO 4 / NaH 2 PO 4 , 145.5 mM NaCl, pH 7.2 ± 0.2). The resulting product was brought with the required amount of buffer to a concentration of 20 mg / ml. The resulting biopolymer was stirred with an overhead stirrer for another 2 h at 30 rpm for its complete homogenization at a temperature of + 5 ° C.
Пример 9.Example 9.
В колбу, снабженную верхнеприводной мешалкой, объемом 50 мл поместили 25 мл 1%-ного раствора гидроксида натрия и 0,9 г гиалуроната натрия. Смесь оставили перемешиваться в течение 4 ч при +10°С (160 об/мин). Затем к реакционной смеси добавили 4,0 мл ППГДЭ (M=1500 Да, ρ = 1,10 г/см3) и 2,5 мл ППГДЭ (M=640 Да, ρ = 1,06 г/см3). Реакцию проводили еще в течение 24 ч при перемешивании (160 об/мин, +10°С).In a flask equipped with an overhead stirrer with a volume of 50 ml was placed 25 ml of 1% sodium hydroxide solution and 0.9 g of sodium hyaluronate. The mixture was left stirring for 4 h at + 10 ° C (160 rpm). Then, 4.0 ml of PPHDE (M = 1500 Da, ρ = 1.10 g / cm 3 ) and 2.5 ml of PPHDE (M = 640 Da, ρ = 1.06 g / cm 3 ) were added to the reaction mixture. The reaction was carried out for another 24 h with stirring (160 rpm, + 10 ° С).
Реакцию остановили добавлением 0,2 г глицина, предварительно растворенного в 1 мл ddH2O и оставляли перемешиваться в течение 10 ч при +4°С (30 об/мин). Полученный биополимер нейтрализовали раствором 1 М соляной кислоты до рН 7,0, затем перенесли в диализный мешок (Viking, 12 кДа). Биополимер диализовали, меняя 4 раза физиологический фосфатный буфер (PBS, 1л, 2 мМ Na2HPO4/NaH2PO4, 145,5 мМ NaCl, pH 7,2±0,2). Полученный продукт довели необходимым количеством буфера до концентрации 15 мг/мл. Полученный биополимер перемешивали посредством верхнеприводной мешалки еще в течение 2 ч при 30 об/мин для его полной гомогенизации при температуре +4°С.The reaction was stopped by the addition of 0.2 g of glycine, previously dissolved in 1 ml of ddH 2 O, and the mixture was left stirring for 10 h at + 4 ° C (30 rpm). The resulting biopolymer was neutralized with a 1 M hydrochloric acid solution to pH 7.0, then transferred to a dialysis bag (Viking, 12 kDa). The biopolymer was dialyzed by changing the physiological phosphate buffer 4 times (PBS, 1 L, 2 mM Na 2 HPO 4 / NaH 2 PO 4 , 145.5 mM NaCl, pH 7.2 ± 0.2). The resulting product was brought with the required amount of buffer to a concentration of 15 mg / ml. The resulting biopolymer was stirred with an overhead stirrer for another 2 h at 30 rpm for its complete homogenization at a temperature of + 4 ° C.
Пример 10.Example 10.
В колбу, снабженную верхнеприводной мешалкой, объемом 50 мл поместили 25 мл 1%-ного раствора гидроксида натрия и 1,95 г гиалуроната натрия. Смесь оставили перемешиваться в течение 3 ч при +20°С (160 об/мин). Затем к реакционной смеси добавили 1,0 мл ППГДЭ (M=1500 Да, ρ = 1,10 г/см3) и 4,5 мл ППГДЭ (M=640 Да, ρ = 1,06 г/см3). Реакцию проводили еще в течение 24 ч при перемешивании (160 об/мин, +4°С).In a flask equipped with an overhead stirrer with a volume of 50 ml was placed 25 ml of 1% sodium hydroxide solution and 1.95 g of sodium hyaluronate. The mixture was left stirring for 3 h at + 20 ° C (160 rpm). Then, 1.0 ml of PPHDE (M = 1500 Da, ρ = 1.10 g / cm 3 ) and 4.5 ml of PPHDE (M = 640 Da, ρ = 1.06 g / cm 3 ) were added to the reaction mixture. The reaction was carried out for another 24 h with stirring (160 rpm, + 4 ° C).
Реакцию остановили добавлением 0,2 г глицина, предварительно растворенного в 1 мл ddH2O и оставляли перемешиваться в течение 12 ч при +4° С (30 об/мин). Полученный биополимер нейтрализовали раствором 1 М соляной кислоты до рН 7,0, затем перенесли в диализный мешок (Viking, 12 кДа). Биополимер диализовали, меняя 4 раза физиологический фосфатный буфер (PBS, 1л, 2 мМ Na2HPO4/NaH2PO4, 145,5 мМ NaCl, pH 7,2±0,2). Полученный продукт довели необходимым количеством буфера до концентрации 30 мг/мл. Полученный биополимер перемешивали посредством верхнеприводной мешалки еще в течение 2 ч при 30 об/мин для его полной гомогенизации при температуре +4ºС.The reaction was stopped by the addition of 0.2 g of glycine, previously dissolved in 1 ml of ddH 2 O, and the mixture was left stirring for 12 h at + 4 ° C (30 rpm). The resulting biopolymer was neutralized with a 1 M hydrochloric acid solution to pH 7.0, then transferred to a dialysis bag (Viking, 12 kDa). The biopolymer was dialyzed by changing the physiological phosphate buffer 4 times (PBS, 1 L, 2 mM Na 2 HPO 4 / NaH 2 PO 4 , 145.5 mM NaCl, pH 7.2 ± 0.2). The resulting product was brought with the required amount of buffer to a concentration of 30 mg / ml. The resulting biopolymer was mixed by means of an overhead stirrer for another 2 h at 30 rpm for its complete homogenization at a temperature of + 4 ° C.
Исследования токсичности биополимера по изобретениюToxicity studies of the biopolymer of the invention
Одной из основных проблем с использованием диглициловых эфиров в создании поперечных связей в ГК является наличие оксирановых групп, оставшихся после технологического цикла приготовления биополимера. В настоящем изобретении предлагается введение дополнительной стадии, включающей в себя обработку реакционной массы сшитого биополимера раствором глицина, данный этап позволяет остановить реакцию полимеризации в короткие сроки и дополнительно решить вопрос свободных эпоксидных групп, обуславливающих токсичность получаемого биополимера, поскольку в результате изомеризации оксирановые группы изомеризуются с образованием альдегида, что и определяет токсичность биополимера. В результате глицин, как нуклеофильный агент, присоединяется и блокирует эпоксидную группу. Используя данную технологию полученный сшитый биополимер не обладает токсическим действием.One of the main problems with the use of diglycyl ethers in the creation of cross-linking in HAs is the presence of oxirane groups remaining after the technological cycle of biopolymer preparation. The present invention proposes the introduction of an additional stage, including the treatment of the reaction mass of the crosslinked biopolymer with a glycine solution, this stage allows you to stop the polymerization reaction in a short time and additionally solve the problem of free epoxy groups that cause the toxicity of the resulting biopolymer, since as a result of isomerization, oxirane groups are isomerized to form aldehyde, which determines the toxicity of the biopolymer. As a result, glycine, as a nucleophilic agent, attaches and blocks the epoxy group. Using this technology, the resulting crosslinked biopolymer does not have a toxic effect.
Были проведены испытания на токсичность в сравнении с аналогом эндопротеза синовиальной жидкости, содержащим только раствор ГК без сшивки, «Гируан плюс». Также результатом испытаний стало описание влияния препарата на иммунную систему мыши и предоставление данных с показателями изменения маркерных клеток, воспалительных реакциях, депонирующего эффекта препарата и предположение путей выведения.Toxicity tests were carried out in comparison with the analogue of the synovial fluid endoprosthesis containing only HA solution without cross-linking, "Giruan plus". Also, the test result was a description of the effect of the drug on the mouse immune system and the provision of data with indicators of changes in marker cells, inflammatory reactions, the deposition effect of the drug and the assumption of ways of excretion.
В данном эксперименте исследовали токсичность и биораспределение имплантата «Гируан плюс» (HA) - препарат, содержащий ГК без химической модификации в концентрации 10 мг/мл, фосфатно-физиологический буфер, а также препарата эндопротеза синовиальной жидкости ESL-HA-PPEGDE-1 (X1) - препарат, приготовленный согласно способу по изобретению, представляющий собой раствор 10 мг/мл сшитого биополимера (получен согласно примеру 2 настоящего документа), фосфатно-физиологический буфер.In this experiment, the toxicity and biodistribution of the "Giruan plus" (HA) implant, a preparation containing HA without chemical modification at a concentration of 10 mg / ml, a phosphate-physiological buffer, and a synovial fluid endoprosthesis preparation ESL-HA-PPEGDE-1 (X1 ) - a preparation prepared according to the method according to the invention, which is a solution of 10 mg / ml of a cross-linked biopolymer (obtained according to example 2 of this document), phosphate-physiological buffer.
Вязкостные свойства.Viscous properties.
Оба препарата вязкие, прозрачные, полностью растворимы в воде, в виде равномерных капель проходят через иглу 30Gx1/2''.Both preparations are viscous, transparent, completely soluble in water, in the form of uniform drops pass through a 30Gx1 / 2 '' needle.
Токсичность Toxicity in vitroin vitro ....
Для оценки токсичности препараты разводили в 8 раз и оценивали методом МТТ на линии клеток карциномы поджелудочной железы Т3М4. Результаты эксперимента показали, что оба препарата низкотоксичны (фиг.6).To assess toxicity, the preparations were diluted 8-fold and evaluated by the MTT method on the pancreatic carcinoma cell line T3M4. The experimental results showed that both drugs are low toxic (Fig. 6).
Токсичность Toxicity in vivoin vivo ....
Токсичность in vivo оценивали на мышах линии A/Sn. Филлеры вводили мышам внутрибрюшинно иглой 30G в объемах 50, 100, 150 и 200 мкл на мышь. Мышей выводили из эксперимента через 7, 8 и 10 дней. Забирали перитонеальный экссудат и селезенки. Оценивали количество и субпопуляционный состав клеток в экссудате и селезенках. Для сравнения использовали интактную мышь. Результаты исследований показали, что количество клеток и субпопуляционный состав в брюшной полости находится в пределах нормы (фиг.7, Таблица 1). In vivo toxicity was assessed in A / Sn mice. Fillers were injected into mice intraperitoneally with a 30G needle in volumes of 50, 100, 150, and 200 μl per mouse. Mice were removed from the experiment after 7, 8 and 10 days. Peritoneal exudate and spleen were collected. The number and subpopulation composition of cells in the exudate and spleen were assessed. An intact mouse was used for comparison. The research results showed that the number of cells and subpopulation composition in the abdominal cavity is within normal limits (Fig. 7, Table 1).
Таблица 1. Субпопуляционный состав перитонеального экссудата на 7 сутки после в/б введения препарата «Гируан плюс» (HA) или препарата по изобретению (Х1).Table 1. Subpopulation composition of peritoneal exudate on the 7th day after intravenous administration of the drug "Giruan plus" (HA) or the drug according to the invention (X1).
Анализ количества и субпопуляционного состава селезенки показал незначительные изменения, также находящиеся в пределах нормы (Таблица 2). Наблюдается снижение отношения CD4/CD8, однако это также в пределах нормы. Различий между образцами HA и X1 не выявили.Analysis of the number and subpopulation composition of the spleen showed insignificant changes, also within the normal range (Table 2). There is a decrease in the CD4 / CD8 ratio, but this is also within the normal range. No differences were found between samples HA and X1.
Таблица 2. Субпопуляционный состав селезенки на 7 сутки после внутрибрюшинного введения препарата «Гируан плюс» (HA) или препарата по изобретению (Х1).Table 2. Subpopulation composition of the spleen on day 7 after intraperitoneal administration of the drug "Giruan plus" (HA) or the drug according to the invention (X1).
Биораспределение препаратов эндопротеза синовиальной жидкости (ЭСЖ).Biodistribution of synovial fluid endoprosthesis preparations (ESF).
В ходе проведения данного эксперимента изучали биораспределение препаратов эндопротеза синовиальной жидкости при подкожном и внутрибрюшинном введении геля с включением флуоресцентной метки родамина В. Мышам вводили филлеры подкожно (п/к) в объеме 50 мкл под лапу №3 или внутрибрюшинно (в/б) в объеме 200 мкл. Мышей выводили из эксперимента через 8 и 10 дней. В месте инъекции (п/к или в/б) свободный гель не обнаруживался. Забирали печень, селезенку, почки, мышцы и жировую ткань. Результаты проведенных экспериментов показали, что основным депо являются жировые клетки (фиг.8). При в/б введении часть геля уносится макрофагами в региональные лимфоузлы (фиг. 9) и селезенку, откуда гель попадает в печень и почки (фиг.10). Остатки выводятся через мочу (почки) и кал (печень) (Таблица 3). Различий по биораспределению между образцами HA и X1 не выявили.In the course of this experiment, the biodistribution of preparations of the endoprosthesis of synovial fluid was studied with subcutaneous and intraperitoneal administration of a gel with the inclusion of a fluorescent label of rhodamine B. 200 μl. The mice were removed from the experiment after 8 and 10 days. No free gel was found at the injection site (sc or ip). The liver, spleen, kidneys, muscles, and adipose tissue were collected. The results of the experiments showed that the main depot are fat cells (Fig. 8). When administered intravenously, part of the gel is carried away by macrophages to the regional lymph nodes (Fig. 9) and the spleen, from where the gel enters the liver and kidneys (Fig. 10). Residues are excreted through urine (kidney) and feces (liver) (Table 3). No differences in biodistribution were found between HA and X1 samples.
Биоразложение эндопротеза синовиальной жидкости (ЭСЖ).Biodegradation of the synovial fluid endoprosthesis (ESF).
Биоразложение эндопротеза синовиальной жидкости изучали в 3D культуре in vitro на клетках линии кератиноцитов человека HaCaT. Результат проведенных исследований показал, что образцы захватываются клетками и сохраняются в них не менее 10 дней без значительного гидролиза (фиг. 11).Biodegradation of the synovial fluid endoprosthesis was studied in 3D in vitro culture on cells of the HaCaT human keratinocyte line. The result of these studies showed that the samples are captured by cells and remain in them for at least 10 days without significant hydrolysis (Fig. 11).
Биодеградация эндопротеза синовиальной жидкости (ЭСЖ) Biodegradation of the synovial fluid endoprosthesis (ESF) in vivoin vivo ::
Часть мышей выводили из эксперимента через 20 дней, забирали жировую ткань из места инъекций (брюшной полости и в области подкожного введения). Анализ жировой ткани осуществляли с помощью гистологии. Результаты проведенных исследований показали, что через 20 дней в брюшной полости и в области подкожного введения образцов частично гидролизуются, но достоверно детектируются (фиг. 12).Some of the mice were removed from the experiment after 20 days, and adipose tissue was taken from the injection site (abdominal cavity and in the area of subcutaneous injection). Analysis of adipose tissue was performed using histology. The results of the studies showed that after 20 days in the abdominal cavity and in the area of subcutaneous injection, the samples are partially hydrolyzed, but reliably detected (Fig. 12).
Таблица 3. Анализ биораспределения препарата «Гируан плюс» (HA) и препарата по изобретению (Х1) на 7-10 день после введения подкожно под лапу №3 (sc) или внутрибрюшинно (ip).Table 3. Analysis of the biodistribution of the preparation "Giruan plus" (HA) and the preparation according to the invention (X1) on the 7-10th day after subcutaneous injection under paw No. 3 (sc) or intraperitoneally (ip).
*Органы гомогенизировали в физрастворе, добавляли равный объем 70% этилового спирта, экстрагировали родамин В в течение 12 часов, центрифугировали при 15 тыс об/мин 20 мин, осветленные надосадки переносили в планшеты и измеряли флуоресценцию на ридере при длине волны 525 нм. Приведены данные по средней интенсивности флюоресценции (MFI) за вычетом контроля для интактной мыши. Данные не нормированы на вес органов.* Organs were homogenized in saline, an equal volume of 70% ethanol was added, rhodamine B was extracted for 12 hours, centrifuged at 15 thousand rpm for 20 min, the clarified supernatants were transferred to plates and the fluorescence was measured on a reader at a wavelength of 525 nm. Data on mean fluorescence intensity (MFI) minus control for intact mice are shown. Data are not normalized to organ weights.
Гидролиз в тканях ассоциирован с захватом дебриса макрофагами, его гидролизом и частичным транспортом его в селезенку (фиг. 13) и в печень. Различий по гидролизу и транспорту образцов не было.Hydrolysis in tissues is associated with the capture of debris by macrophages, its hydrolysis and its partial transport to the spleen (Fig. 13) and to the liver. There were no differences in the hydrolysis and transport of the samples.
Таким образом, проведенные исследования показали, что препараты «Гируан плюс» (HA) и препарат по изобретению ESL-HA-PPEGDE-1 (X1) не отличаются по токсичности, биораспределению и биоразложению, путям выведения полупродуктов и продуктов биораспада. Как следствие можно сделать вывод о том, что способ согласно данному изобретению позволяет получить такой же низкотоксичный биополимер на основе модифицированного сополимера гиалуроната натрия, как и сам гиалуронат.Thus, the studies carried out have shown that the preparations "Giruan plus" (HA) and the preparation according to the invention ESL-HA-PPEGDE-1 (X1) do not differ in toxicity, biodistribution and biodegradation, ways of excretion of intermediates and biodegradation products. As a consequence, it can be concluded that the method according to the present invention makes it possible to obtain the same low-toxicity biopolymer based on the modified copolymer of sodium hyaluronate as the hyaluronate itself.
Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.Although the invention has been described with reference to the disclosed embodiments, it should be apparent to those skilled in the art that the specific experiments described in detail are provided for the purpose of illustrating the present invention only and should not be construed as in any way limiting the scope of the invention. It should be understood that various modifications are possible without departing from the spirit of the present invention.
Список литературы, которая включена в настоящее описание изобретения в качестве ссылок:List of literature, which is included in the present description of the invention by reference:
1. Balazs E.A. and Gibbs D.A. The rheological properties and biological function of hyaluronic acid // Chem Mol Biol Intercell Matrix. - 1970. - Vol. 3. - P. 1241-1245.1. Balazs E.A. and Gibbs D.A. The rheological properties and biological function of hyaluronic acid // Chem Mol Biol Intercell Matrix. - 1970. - Vol. 3. - P. 1241-1245.
2. Balazs E.A., Leshchiner E., Larsen N.E. and Band P. Applications of hyaluronan and its derivates / Gebelein CG (ed) Biotechnological polymers. Technomic, Lancaster. - 1993. - P. 41-65.2. Balazs E.A., Leshchiner E., Larsen N.E. and Band P. Applications of hyaluronan and its derivates / Gebelein CG (ed) Biotechnological polymers. Technomic, Lancaster. - 1993. - P. 41-65.
3. De Angelis P.L. Hyaluronan synthases: fascinating glycosyltransferases from vertebrates, bacterial pathogens, and algal viruses // Cell. Mol. Life. Sci. - 1999. - Vol. 56. - P. 670-682.3. De Angelis P.L. Hyaluronan synthases: fascinating glycosyltransferases from vertebrates, bacterial pathogens, and algal viruses // Cell. Mol. Life. Sci. - 1999. - Vol. 56. - P. 670-682.
4. Volpi N. and Maccari F. Purification and characterization of hyaluronic acid from the mollusc bivalve Mytilus galloprovincialis // Biochimie. - 2003. - Vol. 85. - P. 619-625.4. Volpi N. and Maccari F. Purification and characterization of hyaluronic acid from the mollusc bivalve Mytilus galloprovincialis // Biochimie. - 2003. - Vol. 85. - P. 619-625.
5. O'Regan M., Martini I., Crescenzi F., De Luca C., Lansing M. Molecular mechanisms and genetics of hyaluronan biosynthesis // Int. J. Biol. Macromol. - 1994. - Vol. 16. - No. 6. - P. 283-286.5. O'Regan M., Martini I., Crescenzi F., De Luca C., Lansing M. Molecular mechanisms and genetics of hyaluronan biosynthesis // Int. J. Biol. Macromol. - 1994. - Vol. 16. - No. 6. - P. 283-286.
6. Toole B.P. Hyaluronan in morphogenesis // J. Intern. Med. - 1997. - Vol. 242. - No. 1. - P. 35-40.6. Toole B.P. Hyaluronan in morphogenesis // J. Intern. Med. - 1997. - Vol. 242. - No. 1. - P. 35-40.
7. Marcellin E., Chen W., Nielsen L.K. Microbial hyaluronic caid biosynthesis in Microbial production of biopolymers and polymers precursors application and perspectives // Caisters academic press. - 2009. - Vol. 7. - P. 163-179.7. Marcellin E., Chen W., Nielsen L.K. Microbial hyaluronic caid biosynthesis in Microbial production of biopolymers and polymers precursors application and perspectives // Caisters academic press. - 2009. - Vol. 7. - P. 163-179.
8. Bettelheim F.A. and Popdimirova N. Hyaluronic acid-synergetic glycosaminoglycan // Curr. Eye. Res. - 1992. - Vol. 11. - P. 411-419.8. Bettelheim F.A. and Popdimirova N. Hyaluronic acid-synergetic glycosaminoglycan // Curr. Eye. Res. - 1992. - Vol. 11. - P. 411-419.
9. Goldberg R.L. and Toole B.P. Hyaluronate inhibition of cell proliferation // Arthritis Rheum. - 1987. - Vol. 30. - P. 769-778.9. Goldberg R.L. and Toole B.P. Hyaluronate inhibition of cell proliferation // Arthritis Rheum. - 1987. - Vol. 30. - P. 769-778.
10. Alho A.M. and Underhill C.B. The hyaluronate receptor is referentially expressed on proliferating epithelial cells // J. Cell. Biol. - 1989. - Vol. 108. - P. 1557-1565.10. Alho A.M. and Underhill C.B. The hyaluronate receptor is referentially expressed on proliferating epithelial cells // J. Cell. Biol. - 1989. - Vol. 108 .-- P. 1557-1565.
11. Stern R. Hyaluronan metabolism: a major paradox in cancer biology // Pathol. Biol. - 2005. - Vol. 53. - No. 7. - P. 372-382.11. Stern R. Hyaluronan metabolism: a major paradox in cancer biology // Pathol. Biol. - 2005. - Vol. 53. - No. 7. - P. 372-382.
12. Heldin P. Importance of hyaluronan biosynthesis and degradation in cell differentiation and tumour formation // Braz. J. Med. Biol. Res. - 2003. - Vol. 36. - No. 8. - P. 967-973.12. Heldin P. Importance of hyaluronan biosynthesis and degradation in cell differentiation and tumor formation // Braz. J. Med. Biol. Res. - 2003. - Vol. 36. - No. 8. - P. 967-973.
13. Scott J.E. Secondary structures in hyaluronan solutions: chemical and biological implications. The biology of hyaluronan // Ciba Found. Symp. - 1989. - Vol. 143. - P. 6-15.13. Scott J.E. Secondary structures in hyaluronan solutions: chemical and biological implications. The biology of hyaluronan // Ciba Found. Symp. - 1989. - Vol. 143. - P. 6-15.
14. Хабаров В.Н., Бойков П.Я., Селянин М.А. Гиалуроновая кислота: получение, свойства, применение в биологии и медицине. - М., Практическая медицина, 2012. - 224 с.14. Khabarov V.N., Boykov P.Ya., Selyanin M.A. Hyaluronic acid: production, properties, use in biology and medicine. - M., Practical Medicine, 2012 .-- 224 p.
15. Lapcik L., Lapcik L. Hyaluronan: preparation, structure, properties and applications // Chem. Rev. - 1998. - Vol. 98. - No. 8. - P. 2663-2684.15. Lapcik L., Lapcik L. Hyaluronan: preparation, structure, properties and applications // Chem. Rev. - 1998. - Vol. 98. - No. 8. - P. 2663-2684.
16. Brown M.B., Jones S.A. Hyaluronic acid: a unique topical vehicle for the localized delivery of drugs to the skin // J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. - 2005. - Vol. 19. - No. 3. - P. 308-18.16. Brown M.B., Jones S.A. Hyaluronic acid: a unique topical vehicle for the localized delivery of drugs to the skin // J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. - 2005. - Vol. 19. - No. 3. - P. 308-18.
17. Белодед А.В. Микробиологический синтез и деградация гиалуроновой кислоты бактериями P. Streptococcus: дис. канд. биол. наук. - М., 2008. - С. 174.17. Beloded A.V. Microbiological synthesis and degradation of hyaluronic acid by bacteria P. Streptococcus : dis. Cand. biol. sciences. - M., 2008 .-- S. 174.
18. Girish K.S., Kemparaju K. The magic glue hyaluronan and its eraser hyaluronidases: a biological review. Life Sciences. - 2007. - Vol. 80. - P. 1921-1943.18. Girish K.S., Kemparaju K. The magic glue hyaluronan and its eraser hyaluronidases: a biological review. Life Sciences. - 2007. - Vol. 80. - P. 1921-1943.
19. Lolvmcin A.M., Peppcis N.A. Molecular analysis of interpolymer complexation in graft copolymer networks // Polymer. - 2000. - Vol.41. - No. 1. - P. 73-80.19. Lolvmcin A.M., Peppcis N.A. Molecular analysis of interpolymer complexation in graft copolymer networks // Polymer. - 2000. - Vol.41. - No. 1. - P. 73-80.
20. Altman R.D. Intra-articular sodium hyaluronate in the osteoarthritis of the knee // Semin. Arthritis. Rheum. - 2000. - Vol.41. - No. 30. - P. 11-18.20. Altman R.D. Intra-articular sodium hyaluronate in the osteoarthritis of the knee // Semin. Arthritis. Rheum. - 2000. - Vol.41. - No. 30. - P. 11-18.
21. Uthman I., Raynauld J.P., Haraoui B. Intra-articular therapy of osteoarthritis // J. Postgrad. Med. - 2003. - Vol.41. - No. 79. - P. 449-453.21. Uthman I., Raynauld J. P., Haraoui B. Intra-articular therapy of osteoarthritis // J. Postgrad. Med. - 2003. - Vol.41. - No. 79. - P. 449-453.
Claims (15)
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019143704A RU2750000C1 (en) | 2019-12-25 | 2019-12-25 | Method for synthesis of modified hyaluronan and application thereof in medicine, including in endoprosthetics |
| PCT/RU2019/001019 WO2021133190A1 (en) | 2019-12-25 | 2019-12-26 | Method for producing modified hyaluronan |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019143704A RU2750000C1 (en) | 2019-12-25 | 2019-12-25 | Method for synthesis of modified hyaluronan and application thereof in medicine, including in endoprosthetics |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2750000C1 true RU2750000C1 (en) | 2021-06-21 |
Family
ID=76504805
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019143704A RU2750000C1 (en) | 2019-12-25 | 2019-12-25 | Method for synthesis of modified hyaluronan and application thereof in medicine, including in endoprosthetics |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2750000C1 (en) |
| WO (1) | WO2021133190A1 (en) |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4886787A (en) * | 1984-07-23 | 1989-12-12 | Pharmacia Ab | Method of preventing adhesion between body tissues, means for preventing such adhesion, and process for producing said means |
| RU2386641C2 (en) * | 2008-07-09 | 2010-04-20 | Институт синтетических полимерных материалов (ИСПМ) им. Н.С. Ениколопова РАН | Method for synthesis of cross-linked retinol-modified salt of hyaluronic acid |
| CN104086788A (en) * | 2014-07-17 | 2014-10-08 | 华熙福瑞达生物医药有限公司 | Modified sodium hyaluronate gel for injection |
| RU2582702C1 (en) * | 2015-08-19 | 2016-04-27 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи" Минздрава России) | Method for preparing composition based on modified sodium hyaluronate, composition based on modified sodium hyaluronate and use thereof |
| CN109161037A (en) * | 2018-07-18 | 2019-01-08 | 江苏地韵医疗科技有限公司 | A kind of hydrogel composites, preparation method and application |
| US20190055368A1 (en) * | 2017-08-16 | 2019-02-21 | Hangzhou Singclean Medical Products Co., Ltd. | Method of Preparing Single-Phase Modified Sodium Hyaluronate Gel |
| CN109513043A (en) * | 2017-09-20 | 2019-03-26 | 刘宏飞 | A kind of injection modification hyaluronic acid sodium gel and preparation method thereof |
-
2019
- 2019-12-25 RU RU2019143704A patent/RU2750000C1/en active
- 2019-12-26 WO PCT/RU2019/001019 patent/WO2021133190A1/en not_active Ceased
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4886787A (en) * | 1984-07-23 | 1989-12-12 | Pharmacia Ab | Method of preventing adhesion between body tissues, means for preventing such adhesion, and process for producing said means |
| RU2386641C2 (en) * | 2008-07-09 | 2010-04-20 | Институт синтетических полимерных материалов (ИСПМ) им. Н.С. Ениколопова РАН | Method for synthesis of cross-linked retinol-modified salt of hyaluronic acid |
| CN104086788A (en) * | 2014-07-17 | 2014-10-08 | 华熙福瑞达生物医药有限公司 | Modified sodium hyaluronate gel for injection |
| RU2582702C1 (en) * | 2015-08-19 | 2016-04-27 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи" Минздрава России) | Method for preparing composition based on modified sodium hyaluronate, composition based on modified sodium hyaluronate and use thereof |
| US20190055368A1 (en) * | 2017-08-16 | 2019-02-21 | Hangzhou Singclean Medical Products Co., Ltd. | Method of Preparing Single-Phase Modified Sodium Hyaluronate Gel |
| CN109513043A (en) * | 2017-09-20 | 2019-03-26 | 刘宏飞 | A kind of injection modification hyaluronic acid sodium gel and preparation method thereof |
| CN109161037A (en) * | 2018-07-18 | 2019-01-08 | 江苏地韵医疗科技有限公司 | A kind of hydrogel composites, preparation method and application |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2021133190A1 (en) | 2021-07-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Li et al. | Click chemistry-based biopolymeric hydrogels for regenerative medicine | |
| Fakhari et al. | Applications and emerging trends of hyaluronic acid in tissue engineering, as a dermal filler and in osteoarthritis treatment | |
| US8481080B2 (en) | Method of cross-linking hyaluronic acid with divinulsulfone | |
| RU2360928C2 (en) | Complex matrix for medico-biological application | |
| AU2003227050B2 (en) | Ester derivatives of hyaluronic acid for the preparation of hydrogel materials by photocuring | |
| CA2550718C (en) | Cohesive gels from cross-linked hyaluronan and/or hylan, their preparation and use | |
| KR100674177B1 (en) | Cross-linked hyaluronic acid and its medical uses | |
| BRPI0708128A2 (en) | hyaluronic acid derivative, process for producing a hyaluronic acid derivative, composition, cosmetic article, sanitary, medical or surgical article, drug capsule or microcapsule, methods for performing ophthalmic procedures, treating osteoarthritis, and treating cancer , to perform transdermal and dermal administration of a pharmacologically active agent, and dermal administration of a cosmetic, and to perform procedures in the treatment of hair loss or baldness, ophthalmic methods, treatment of osteoarthritis, a wound, and hair loss. or baldness, and, use of a hyaluronic acid derivative | |
| CN114502599B (en) | Hyperbranched polyglycerol polyglycidyl ether and application thereof as polysaccharide cross-linking agent | |
| RU2582702C1 (en) | Method for preparing composition based on modified sodium hyaluronate, composition based on modified sodium hyaluronate and use thereof | |
| Giri et al. | Polysaccharide Hydrogels for Drug Delivery and Regenerative Medicine | |
| RU2477138C1 (en) | Method for preparing filling material for plastic surgery and instrumental cosmetology, filling material and method for introducing filling material into problem area | |
| WO2014096257A1 (en) | Freeze-dried cross-linked hyaluronic acid sponge | |
| Fakhari | Biomedical application of hyaluronic acid nanoparticles | |
| Vasiliu et al. | Microbial exopolysaccharides for biomedical applications | |
| RU2750000C1 (en) | Method for synthesis of modified hyaluronan and application thereof in medicine, including in endoprosthetics | |
| WO2013164782A1 (en) | Shape-memory cross-linked polysaccharides | |
| Brekke et al. | Hyaluronan as a biomaterial | |
| Wei et al. | Heparosan crosslinked hydrogels for injectable dermal fillers: fabrication, physicochemical properties and biocompatibility | |
| CN119505032B (en) | A bifunctionalized pyran ring derivative, its preparation method and application | |
| JPWO2018079812A1 (en) | Gel composition and method for producing the same | |
| Ivanov | Hyaluronic Acid-Based Biomaterials | |
| HK40072935B (en) | A hyperbranched polyglycerol polyglycidyl ether and its use as crosslinker for polysaccharides | |
| De Silva | Characterization of single network and interpenetrating network hydrogels of natural and synthetic polymers | |
| WO2014201618A1 (en) | Use of xanthan gum in preparation of injectable beauty products |