RU2668805C1 - Штамм Vibrio parahaemolyticus, используемый в качестве продуцента прямого термостабильного гемолизина (TDH) - Google Patents
Штамм Vibrio parahaemolyticus, используемый в качестве продуцента прямого термостабильного гемолизина (TDH) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2668805C1 RU2668805C1 RU2017141330A RU2017141330A RU2668805C1 RU 2668805 C1 RU2668805 C1 RU 2668805C1 RU 2017141330 A RU2017141330 A RU 2017141330A RU 2017141330 A RU2017141330 A RU 2017141330A RU 2668805 C1 RU2668805 C1 RU 2668805C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- tdh
- parahaemolyticus
- strain
- hemolysin
- direct
- Prior art date
Links
- 241000607272 Vibrio parahaemolyticus Species 0.000 title claims abstract description 34
- 239000003228 hemolysin Substances 0.000 title claims abstract description 14
- 108010006464 Hemolysin Proteins Proteins 0.000 title claims description 13
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 claims abstract description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 13
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 abstract description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 6
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 abstract description 4
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 abstract description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108010050736 thermostable direct hemolysin Proteins 0.000 description 29
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 15
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 13
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 13
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 12
- 206010047400 Vibrio infections Diseases 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 8
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 8
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 7
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N Indole Chemical compound C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010022678 Intestinal infections Diseases 0.000 description 2
- 241000282342 Martes americana Species 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- AFVLVVWMAFSXCK-UHFFFAOYSA-N α-cyano-4-hydroxycinnamic acid Chemical compound OC(=O)C(C#N)=CC1=CC=C(O)C=C1 AFVLVVWMAFSXCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WWYNJERNGUHSAO-XUDSTZEESA-N (+)-Norgestrel Chemical compound O=C1CC[C@@H]2[C@H]3CC[C@](CC)([C@](CC4)(O)C#C)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 WWYNJERNGUHSAO-XUDSTZEESA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 101000583089 Anemonia sulcata Delta-actitoxin-Avd1d Proteins 0.000 description 1
- 108010082340 Arginine deiminase Proteins 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 238000009631 Broth culture Methods 0.000 description 1
- 206010048610 Cardiotoxicity Diseases 0.000 description 1
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 description 1
- 102000000634 Cytochrome c oxidase subunit IV Human genes 0.000 description 1
- 108050008072 Cytochrome c oxidase subunit IV Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N D-Cellobiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen sulfide Chemical compound S RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 206010015719 Exsanguination Diseases 0.000 description 1
- 206010016952 Food poisoning Diseases 0.000 description 1
- 208000019331 Foodborne disease Diseases 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 208000005577 Gastroenteritis Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010048581 Lysine decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 108090000913 Nitrate Reductases Proteins 0.000 description 1
- 102000052812 Ornithine decarboxylases Human genes 0.000 description 1
- 108700005126 Ornithine decarboxylases Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- NGFMICBWJRZIBI-JZRPKSSGSA-N Salicin Natural products O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1)c1c(CO)cccc1 NGFMICBWJRZIBI-JZRPKSSGSA-N 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 101000685040 Tityus serrulatus Alpha-toxin Ts5 Proteins 0.000 description 1
- 241000428124 Vibrio parahaemolyticus O3 Species 0.000 description 1
- 206010048038 Wound infection Diseases 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- NGFMICBWJRZIBI-UHFFFAOYSA-N alpha-salicin Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1=CC=CC=C1CO NGFMICBWJRZIBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000006161 blood agar Substances 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 231100000259 cardiotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 231100000174 enterotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000008214 highly purified water Substances 0.000 description 1
- 229910000037 hydrogen sulfide Inorganic materials 0.000 description 1
- PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N indole Natural products CC1=CC=CC2=C1C=CN2 PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N indolenine Natural products C1=CC=C2CC=NC2=C1 RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- NGFMICBWJRZIBI-UJPOAAIJSA-N salicin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC=CC=C1CO NGFMICBWJRZIBI-UJPOAAIJSA-N 0.000 description 1
- 229940120668 salicin Drugs 0.000 description 1
- 239000013535 sea water Substances 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- -1 sodium thiolate Chemical class 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000011877 solvent mixture Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/107—Vibrio
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/63—Vibrio
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Mycology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии. Штамм бактерий Vibrio parahaemolyticus, обладающий гемолитической и цитотоксической активностями, депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора» под регистрационным номером KM 2027. Изобретение обеспечивает получение TDH-гемолизина для исследований и создания диагностических препаратов. 3 ил., 2 пр.
Description
Предлагаемое изобретение относится к биотехнологии и микробиологии и может быть использовано для получения и изучения функциональных особенностей термостабильного прямого гемолизина (TDH) Vibrio parahaemolyticus, который необходим в лабораторной диагностике для получения сывороток и препаратов.
V. parahaemolyticus относится к патогенным для человека микроорганизмам рода Vibrio. Средой обитания V. parahaemolyticus является морская вода, а основным фактором передачи человеку служат инфицированные ими гидробионты. Парагемолигические вибрионы вызывают острые кишечные инфекции, гастроэнтериты, раневые инфекции.
Патогенность V. parahaemolyticus связывают с продукцией токсинов - гемолизинов: термостабильного прямого гемолизина (TDH - thermostable direct hemolysin) и TDH- родственного гемолизина (TRH - TDH-related hemolysin). Оба токсина имеют генетическое и иммунологическое родство и проявляют одинаковую биологическую активность: гемолитичность, энтеротоксичность, цитотоксичность в отношении различных типов клеток, кардиотоксичность, но различаются по термостабильности и спектру гемолитической активности. TDH и TRH практически в равной степени проявляют биологическую активность. Они вызывают лизис эритроцитов человека, барана, кур, телят, мышей и кроликов, но различаются спектром гемолитической активности. Большинство штаммов парагемолитических вибрионов продуцируют токсины в достаточно низких количествах, что затрудняет в лабораторных условиях дать количественную оценку гемолитической активности данных культур (1). Способность парагемолитических вибрионов к продукции TDH определяют на специальной среде Вагатцума, содержащей эритроциты человека или кролика, по наличию зон гемолиза (2). Данное свойство штаммов называют феноменом Канагава.
Штамм Vibrio parahaemolyticus КМ 2027 содержит ген прямого термостабильного гемолизина (TDH), лишен гена TDH-подобного гемолизина (TRH) и обладает высокой гемолитической и цитотоксической активностями.
Известен штамм V. parahaemolyticus КМ 187, применяемый в качестве тест-штамма (положительного контроля) при стандартизации оценки вирулентности парагемолитических вибрионов в тесте Канагава (3), при этом данный штамм обладает высокой гемолитической активностью, определяемой на среде Вагатцума, и используется в качестве тест-штамма (положительного контроля) при оценке способности парагемолитических вибрионов лизировать эритроциты в тесте Канагава.
Однако использование данного штамма, несмотря на его высокую гемолитическую активность, в качестве штамма-продуцента гемолизина TDH не предлагалось.
В качестве прототипа был выбран рекомбинантный штамм Е.coli К12 
, содержащий плазмиду pJET2-TDH2 с генами штамма V. parahaemolyticus О3:К6, выделенного во время вспышки пищевого отравления в Чили (1).
Недостатком прототипа является то, что для синтеза прямого термостабильного гемолизина необходимо наличие микроорганизма-реципиента, обладающего определенными свойствами.
При этом способ получения плазмиды, содержащей гены штамма-продуцента, достаточно трудоемкий, длительный процесс, требующий дорогостоящего оборудования и квалификации персонала.
Технической задачей предлагаемого изобретения является разработка нового штамма V. parahaemolyticus КМ 2027, позволяющего продуцировать TDH-гемолизин для лабораторных исследований и создания диагностических препаратов.
Поставленная задача достигается получением штамма бактерий V. parahaemolyticus КМ 2027 (Государственная коллекция патогенных бактерий «Микроб»), используемого в качестве штамма-продуцента термостабильного прямого гемолизина (TDH).
Способ получения штамма
Штамм бактерий V. parahaemolyticus КМ 2027 получают путем селекции клонов штамма V. parahaemolyticus, отобранного из двухсот штаммов коллекции Ростовского противочумного института, образующих на кровяном агаре Вагатцума четкую зону гемолиза, у которых величина зоны гемолиза через 48 часов составила более 5 мм.
Наибольшую цитотоксическую активность на культуре клеток L-929 проявил штамм V. parahaemolyticus 958, выделенный от больного в 1974 году в г. Новороссийске (серогруппа О4:К12).
Затем путем селекции клеток данного штамма был получен клон V. parahaemolyticus, у которого величина зоны гемолиза составила 7 мм (фиг. 2).
На фиг. 2. представлены результаты опыта по отбору штаммов парагемолитических вибрионов по степени их гемолитической активности.
А - штамм V. parahaemolyticus КМ 2027. Величина зоны гемолиза - 7 мм.
Б - штамм V. parahaemolyticus, содержащий гены гемолизина TDH, но обладающий меньшей гемолитической активностью. Величина зоны гемолиза - 3 мм.
В - штамм V. parahaemolyticus, не содержащий генов TDH. На фото показано отсутствие зоны гемолиза.
Таким образом, исходя из данных, представленных на фото, видно, что штамм V. parahaemolyticus КМ 2027 имеет большую зону гемолиза, что свидетельствует об увеличении продукции гемолизина.
При проверке цитотоксических свойств на культуре клеток отмечены изменения морфологии и гибель эукариотических клеток L-929, Нер2 иМсСоу (см. фиг. 3).
На фиг. 3,Г представлены исходные (неповрежденные) эукариотические клетки культур клеток - клетки ровные, окрулые; монослой ровный.
На фиг. 3,Д показаны эукариотические клетки, проинкубированные со штаммом V. parahaemolyticus КМ 2027. На фото видны разрушенные клетки, клетки с измененной морфологией, что характерно для действия гемолизина парагемолитических вибрионов.
Следовательно, на фиг. 3 показано, что штамм V. parahaemolyticus КМ 2027 обладает продукцией прямого термостабильного гемолизина (TDH), что проявляется изменением морфологии культур клеток и их гибелью.
Следующим этапом осуществляют выращивание штамма для получения термостабильного прямого гемолизина TDH.
Для получения препарата TDH-токсина штамм-продуцент V. parahaemlyticus КМ 2027 культивируют при 37°С в бульоне Вагатцума. Культуру, выращенную в питательной жидкой среде, центрифугируют при 10000 об/мин 20 минут на холоду. Культуральную жидкость переносят в колбу 500 мл и обеззараживают добавлением мертиолята натрия 1:10000 с экспозиией 2 часа при +4°С.
После этого выделяют и очищают препарат, для этого к обеззараженной культуральной жидкости штамма-продуцента V. parahaemlyticus КМ 2027 добавляют сульфат аммония (СА) до концентрации 150 мМ и Трис-HCl рН - 7.0 до 50 мМ. Очистку токсина проводят на FPLC Pathfinder Duoflow Bio-Rad. Культуральную жидкость наносят на колонку с матрицей для ХОФ (хроматография в обращенной фазе) Butyl Toyopaerl 650 М. Промывают буфером 150 мМ СА и 50 мМ Трис-HCl рН - 7.0. Токсин элюируют снижающимся градиентом СА от 150 до 0 мМ. Фракции, содержащие токсин (их отбирают по гемолитической активности), объединяют и наносят на колонку UNO-Q6 Bio-Rad, уравновешенную 50 мМ Трис-HCl рН - 7,0, промывают, токсин элюируют повышающимся градиентом хлорида калия от 0 до 1 М. Фракции, содержащие токсин, объединяют, диализуют против забуференного физиологического раствора рН - 7.2 измеряют количество белка методом Лоури. Полученный препарат содержит не менее 100 мкг/мл белка.
Данный штамм V. parahaemolyticus был депонирован под № КМ 2027 в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» (ГКПБ «Микроб»).
Культурально-морфологические признаки
В мазках из агаровых и бульонных культур, окрашенных по Граму, клетки парагемолитических вибрионов имеют вид грамотрицательных полиморфных палочек. Подвижные (при выращивании в 0,3% агаре с 3% NaCl наблюдается помутнение столбика агара). Спор и капсул не образуют.
На твердых питательных средах (1,5% агаре Мартена с 3% NaCl, рН 7,6±0,2) вибрионы образуют колонии округлой формы, гладкие, полупрозрачные, размером 2-2,5 мм в диаметре, с ровным краем при выращивании при 37°С в течение 18-24 часов.
На жидких питательных средах (бульон Мартена с 3% NaCl, рН 7,6±0,2) дает равномерное помутнение, растет на средах с NaCl от 2% до 8%, не растет в 1% пептонной воде без NaCl.
Физиолого-биохимические свойства
Ферментирует и окисляет глюкозу на среде Хью-Лейфсона, расщепляет арабинозу, маннозу, 7анит, не активен по отношению к лактозе, сахарозе, целлобиозе, салицину. Обладает цитохромоксидазой, нитратредуктазой, лизин- и орнитиндекарбоксилазой при отсутствии аргининдигидролазы и β-галактозидазы, образует индол, не продуцирует сероводород, расщепляет мочевину. На среде Вагатцума лизирует эритроциты человека.
Оптимальные показатели температуры и рН среды культивирования V. parahaemolyticus - 37°С, рН 7,6±0,2. Для оптимального роста необходимо наличие в среде культивирования 3% NaCl.
Серологические свойства
Не агглютинируется холерными диагностическими сыворотками О-, RO-, Инаба, Огава, моноварными вибрионными сыворотками других (О2-О83) О-сероваров. Агглютинируется диагностическими сыворотками О:4 и К:12.
Пример 1
Подтверждение и идентификация препарата термостабильного прямого гемолизина (TDH), полученного из штамма V. parahaemolyticus КМ 2027
Для идентификации и анализа препарата термостабильного прямого гемолизина (TDH) V. parahaemolyticus используют метод MALDI-ToF масс-спектрометрии с использованием масс-спектрометра Autoflex speed III Bruker Daltonics (Германия) с программным обеспечением Biotyper.
Приготовление раствора матрицы
В качестве матрицы используют α-циано-4-гидроксикоричную кислоту.
Во-первых, готовят 5% раствор трифторуксусной кислоты. Для этого смешивают 950 мкл высокоочищенной воды для масс-спектрометрии и 50 мкл чистой трифторуксусной кислоты. Полученный раствор перемешивают. Затем к 500 мкл 5% раствора трифторуксусной кислоты добавляют 500 мкл чистого ацетонитрила. Получившуюся смесь растворителей (OS) используют для приготовления матрицы. При необходимости OS можно хранить при комнатной температуре (+22-25°С) несколько недель.
Во-вторых, 2,5 мг α-циано-4-гидроксикоричной кислоты (НССА) смешивают с 250 мкл OS. Перемешивают несколько минут на вортексе при комнатной температуре (+22 - +25°С) до полного растворения. Готовую матрицу можно хранить при комнатной температуре несколько недель.
В эппендорфе смешивают 1 мкл препарата токсина и 10 мкл раствора матрицы. На мишень для масс-спектрометрии наносят полученную смесь. Высушивают на воздухе. Для получения четких пиков соотношение препарата токсина и матрицы составляет 1:10.
Снятие белковых спектров
Снятие белковых спектров проводят в программе Flex Control в диапазоне 2000-20000 m/z, а их обработку в программе Flex Analysis. При масс-спектрометрии препарата термостабильного прямого гемолизина (TDH) V. parahaemolyticus выявляются масс-пики с m/z 2452±5, 4911±7, 7517±5, 8602±5, которые соответствуют масс-пикам полученного токсина TDH (фиг. 1).
На фиг. 1 показаны масс-пики препаратов TDH-токсина парагемолитических вибрионов, полученных из штамма-продуцента V. parahaemolyticus КМ 2027, выявленные методом масс-спекрометрического анализа. Видны пики с m/z 2452±5, 4911±7, 7517±5, 8602±5, которые соответствуют масс-пикам полученного токсина TDH.
Пример 2
Применение полученного препарата для изготовления иммунных сывороток
Для получения иммунных кроличьих сывороток используют беспородных кроликов обоего пола в возрасте 8-10 месяцев, массой 2,5-3 кг.
Препатат TDH-токсина V. parahaemolyticus КМ 2027 вводят по 0,3 мл и 0,3 мл полного адъюванта Фрейнда подкожно в холку на 1-й, 7-й, 14-й, 24-й день иммунизации. Пробное взятие крови у кроликов проводят на 7-й, 14-й, 24-й и 31 день. Обескровливание животных проводят на 33 день от начала иммунизации. Титры антител полученных сывороток проверяют в реакции преципитации по Оухтерлони и в ДОТ-ИФА. Полученные сыворотки содержат антитела к TDH-токсину V. parahaemolyticus.
Использование предлагаемого изобретения позволяет с помощью нового штамма V. parahaemolyticus КМ 2027 получать высокоактивный препарат прямого термостабильного гемолизина - TDH, который дает возможность наиболее полно осуществлять изучение функциональных особенностей препарата гемолизина V. parahaemolyticus с применением в лабораторной практике для получения иммунных сывороток и диагностических препаратов, направленных на выявление острых кишечных инфекций, вызванных V. parahaemolyticus.
Источники информации
1. Bechlars S., 
D.А., 
K., Dieckmann R., Strauch E.,. Kubick S. Cell-free synthesis of functional thermostable direct hemolysins of Vibrio parahaemolyticus // Toxicon. - 2013. - Vol. 76. - P. 132-142.
2. Park K.-S., Iida Т., Yamaichi Y. et al. Genetic characterization of DNA region containing the trh and ure genes of Vibrio parahaemolyticus // Infect. Immun. - 2000. - Vol. 68, No. 10. - P. 5742-5748.
3. Рыковская О.А., Смоликова Л.M., Монахова Е.В., Чемисова О.С, Подойницына О.А., Голенищева Е.Н и др. Коллекция представителей вида Vibrio parahaemolyticus: фенотипические и генотипические характеристики // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - №6 - 2014. - с. 3-8
Claims (1)
- Штамм бактерий Vibrio parahaemolyticus KM 2027 (Государственная коллекция патогенных бактерий «Микроб»), используемый в качестве продуцента прямого термостабильного гемолизина.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017141330A RU2668805C1 (ru) | 2017-11-27 | 2017-11-27 | Штамм Vibrio parahaemolyticus, используемый в качестве продуцента прямого термостабильного гемолизина (TDH) |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017141330A RU2668805C1 (ru) | 2017-11-27 | 2017-11-27 | Штамм Vibrio parahaemolyticus, используемый в качестве продуцента прямого термостабильного гемолизина (TDH) |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2668805C1 true RU2668805C1 (ru) | 2018-10-02 |
Family
ID=63798548
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017141330A RU2668805C1 (ru) | 2017-11-27 | 2017-11-27 | Штамм Vibrio parahaemolyticus, используемый в качестве продуцента прямого термостабильного гемолизина (TDH) |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2668805C1 (ru) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1391091A1 (ru) * | 1986-08-11 | 1990-04-30 | Ростовский-На-Дону Государственный Научно-Исследовательский Противочумный Институт | Штамм вибриона VIвRIо сноLеRае сноLеRае - продуцент гемолизина |
| WO2015190107A1 (ja) * | 2014-06-11 | 2015-12-17 | 東洋製罐グループホールディングス株式会社 | ビブリオ・パラヘモリティカスの検出方法、及びビブリオ・パラヘモリティカス検出用担体 |
-
2017
- 2017-11-27 RU RU2017141330A patent/RU2668805C1/ru active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1391091A1 (ru) * | 1986-08-11 | 1990-04-30 | Ростовский-На-Дону Государственный Научно-Исследовательский Противочумный Институт | Штамм вибриона VIвRIо сноLеRае сноLеRае - продуцент гемолизина |
| WO2015190107A1 (ja) * | 2014-06-11 | 2015-12-17 | 東洋製罐グループホールディングス株式会社 | ビブリオ・パラヘモリティカスの検出方法、及びビブリオ・パラヘモリティカス検出用担体 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| РЫКОВСКАЯ О.А. и др. "Поиск штамма-продуцента термостабильного прямого гемолизина (ТDH) Vibrio parahaemolyticus".// Сборник статей ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора, 2016, Ростов-на-Дону, выпуск N 29, с.202-205. * |
| РЫКОВСКАЯ О.А. и др. "Разработка комплексного метода оценки вирулентности парагемолитических вибрионов".// Клиническая лабораторная диагностика, 2013, N 2, с. 38-41. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ohman et al. | Toxin A-deficient mutants of Pseudomonas aeruginosa PA103: isolation and characterization | |
| US4902616A (en) | Process for the preparation of capsular polysaccharides of staphylococci, the polysaccharides obtained, uses of these polysaccharides and strains for carrying out of the process | |
| WO1999024613A1 (en) | Human blood bacterium | |
| Naseri et al. | Prevalence of the most common virulence-associated genes among Brucella Melitensis isolates from human blood cultures in Hamadan Province, West of Iran | |
| CN112961805B (zh) | 一种喹诺酮类药物耐药基因gyrA和parE同时发生突变的鼠伤寒沙门菌及其应用 | |
| CN112961804B (zh) | 一种鼠伤寒沙门菌及其应用 | |
| RU2668805C1 (ru) | Штамм Vibrio parahaemolyticus, используемый в качестве продуцента прямого термостабильного гемолизина (TDH) | |
| Digranes et al. | Characterization of Micrococcaceae from the urinary tract | |
| Shaaban et al. | Evaluation of a new antimicrobial agent production (RSMM C3) by using metagenomics approaches from Egyptian marine biota | |
| Shidan et al. | First report of Streptococcus agalactiae isolated from a healthy captive sichuan golden snub-nosed monkey (Rhinopithecus roxellana) in China | |
| RU2268942C1 (ru) | СПОСОБ ВНУТРИВИДОВОЙ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ Vibrio cholerae О139 | |
| RU2085584C1 (ru) | Способ получения рекомбинантных туляремийных микроорганизмов - продуцентов факторов вирулентности, рекомбинантный штамм francisella tularensis subspecies, holarctica r5s - продуцент фактора вирулентности francisella tularensis nearctica shu, рекомбинантный штамм francisella tularensis holarctica rn4 - продуцент фактора вирулентности pseudomonas pseudomallei c 141, рекомбинантный штамм francisella tularensis subspecies holarctica r1a - продуцент фактора вирулентности francisella tularensis nearctica b 399 a cole | |
| RU2169187C1 (ru) | Штамм бактерий vibrio cholerae 2414 классического биовара серовара огава - продуцент холерного токсина и токсинкорегулируемых пилей адгезии | |
| Blomqvist et al. | Phylogenetic placement and characterization of a new alpha-2 proteobacterium isolated from a patient with sepsis | |
| CN115725758A (zh) | 含特异分子靶标的唐菖蒲伯克霍尔德菌及其椰毒致病型标准菌株及其检测和应用 | |
| AL-Hassani et al. | Molecular detection of some virulence genes of Enterococcus faecalis isolated from different clinical samples in Babylon province/Iraq | |
| Parida et al. | Isolation and identification of pathogenic bacteria from brackish waters of Chilika Lagoon, Odisha, India for pharmaceutical use | |
| Arzumanian et al. | Communities of skin propionic bacteria: cultivation and antifungal antagonistic activity | |
| CN111978380A (zh) | 野生型气肿疽梭菌细胞毒素a及其制备方法、应用和疫苗 | |
| RU2254371C1 (ru) | АВИРУЛЕНТНЫЙ ТЕСТ-ШТАММ БАКТЕРИЙ Vibrio cholerae БИОВАРА eltor СЕРОВАРА Ogawa (ctxA-, tcpA-, toxR-, zot-), ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ В ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ, ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ И УЧЕБНОМ ПРОЦЕССЕ | |
| RU2262529C1 (ru) | Способ биотестирования токсигенности кишечной палочки | |
| RU2791744C1 (ru) | Штамм Streptococcus pneumoniae серотип 19A | |
| SU1400075A1 (ru) | Штамм бактерий VIвRIо сноLеRае сноLеRае OGaWa, используемый дл получени холерного токсина | |
| RU2784070C1 (ru) | Штамм Streptococcus pneumoniae серотип 15F | |
| RU2787399C1 (ru) | Способ идентификации возбудителя кишечного иерсинеоза бактериофагом yersinia enterocolitica 2021 (фк-115) |