RU2515115C1 - RECOMBINANT PLASMID DNA pHIG05, CODING HYBRID PROTEIN WITH HUMAN PROINSULIN Glargine, CELL Escherichia coli, TRANSFORMED BY RECOMBINANT PLASMID DNA PHIG05, AND STRAIN OF BACTERIA Escherichia coli JM109/pHIG05-PRODUCENT OF HYBRID PROTEIN WITH HUMAN PROINSULIN Glargine - Google Patents
RECOMBINANT PLASMID DNA pHIG05, CODING HYBRID PROTEIN WITH HUMAN PROINSULIN Glargine, CELL Escherichia coli, TRANSFORMED BY RECOMBINANT PLASMID DNA PHIG05, AND STRAIN OF BACTERIA Escherichia coli JM109/pHIG05-PRODUCENT OF HYBRID PROTEIN WITH HUMAN PROINSULIN Glargine Download PDFInfo
- Publication number
- RU2515115C1 RU2515115C1 RU2013119785/10A RU2013119785A RU2515115C1 RU 2515115 C1 RU2515115 C1 RU 2515115C1 RU 2013119785/10 A RU2013119785/10 A RU 2013119785/10A RU 2013119785 A RU2013119785 A RU 2013119785A RU 2515115 C1 RU2515115 C1 RU 2515115C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- phig05
- human
- glargine
- hybrid protein
- recombinant plasmid
- Prior art date
Links
- COCFEDIXXNGUNL-RFKWWTKHSA-N Insulin glargine Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(=O)NCC(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 COCFEDIXXNGUNL-RFKWWTKHSA-N 0.000 title claims abstract description 51
- 229960002869 insulin glargine Drugs 0.000 title claims abstract description 49
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 44
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 44
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 title claims abstract description 38
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 37
- 108010057186 Insulin Glargine Proteins 0.000 title claims abstract description 36
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 title claims abstract description 33
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims abstract description 24
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 claims abstract description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 10
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims abstract description 9
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 22
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 21
- 210000004898 n-terminal fragment Anatomy 0.000 claims description 9
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 8
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 claims description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 4
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 claims description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 abstract description 3
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 abstract description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 37
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 28
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 17
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 17
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 16
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 13
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 11
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 10
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 10
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 8
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 8
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 7
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 6
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical class C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 6
- 230000009471 action Effects 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 4
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 4
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 4
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000002218 hypoglycaemic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 206010033675 panniculitis Diseases 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 108010066381 preproinsulin Proteins 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 3
- 210000004304 subcutaneous tissue Anatomy 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- YOBGUCWZPXJHTN-BQBZGAKWSA-N Gly-Ser-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N YOBGUCWZPXJHTN-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- 208000013016 Hypoglycemia Diseases 0.000 description 2
- 108010092217 Long-Acting Insulin Proteins 0.000 description 2
- 102000016261 Long-Acting Insulin Human genes 0.000 description 2
- 229940100066 Long-acting insulin Drugs 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010054805 Macroangiopathy Diseases 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- GJFYFGOEWLDQGW-GUBZILKMSA-N Ser-Leu-Gln Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N GJFYFGOEWLDQGW-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N Zinc dication Chemical compound [Zn+2] PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000003472 antidiabetic agent Substances 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 201000001421 hyperglycemia Diseases 0.000 description 2
- 229940126904 hypoglycaemic agent Drugs 0.000 description 2
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000003914 insulin secretion Effects 0.000 description 2
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 2
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000001235 sensitizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- KXEVYGKATAMXJJ-ACZMJKKPSA-N Ala-Glu-Asp Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O KXEVYGKATAMXJJ-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- 229940077274 Alpha glucosidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- UXJCMQFPDWCHKX-DCAQKATOSA-N Arg-Arg-Glu Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O UXJCMQFPDWCHKX-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- HAVKMRGWNXMCDR-STQMWFEESA-N Arg-Gly-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O HAVKMRGWNXMCDR-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 description 1
- GWTLRDMPMJCNMH-WHFBIAKZSA-N Asp-Asn-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O GWTLRDMPMJCNMH-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- XWKBWZXGNXTDKY-ZKWXMUAHSA-N Asp-Val-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O XWKBWZXGNXTDKY-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 1
- GCDLPNRHPWBKJJ-WDSKDSINSA-N Cys-Gly-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O GCDLPNRHPWBKJJ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- XTHUKRLJRUVVBF-WHFBIAKZSA-N Cys-Gly-Ser Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XTHUKRLJRUVVBF-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- GGRDJANMZPGMNS-CIUDSAMLSA-N Cys-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O GGRDJANMZPGMNS-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 1
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 description 1
- GNDJOCGXGLNCKY-ACZMJKKPSA-N Gln-Cys-Cys Chemical compound N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O GNDJOCGXGLNCKY-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- IWUFOVSLWADEJC-AVGNSLFASA-N Gln-His-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O IWUFOVSLWADEJC-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- ITYRYNUZHPNCIK-GUBZILKMSA-N Glu-Ala-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ITYRYNUZHPNCIK-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- ZOXBSICWUDAOHX-GUBZILKMSA-N Glu-Asn-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O ZOXBSICWUDAOHX-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- ZJICFHQSPWFBKP-AVGNSLFASA-N Glu-Asn-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O ZJICFHQSPWFBKP-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- ATVYZJGOZLVXDK-IUCAKERBSA-N Glu-Leu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O ATVYZJGOZLVXDK-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- UGSVSNXPJJDJKL-SDDRHHMPSA-N Glu-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N UGSVSNXPJJDJKL-SDDRHHMPSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UGVQELHRNUDMAA-BYPYZUCNSA-N Gly-Ala-Gly Chemical compound [NH3+]CC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC([O-])=O UGVQELHRNUDMAA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QPDUVFSVVAOUHE-XVKPBYJWSA-N Gly-Gln-Val Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CN)C(O)=O QPDUVFSVVAOUHE-XVKPBYJWSA-N 0.000 description 1
- BUEFQXUHTUZXHR-LURJTMIESA-N Gly-Gly-Pro zwitterion Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O BUEFQXUHTUZXHR-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- LPCKHUXOGVNZRS-YUMQZZPRSA-N Gly-His-Ser Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O LPCKHUXOGVNZRS-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- MKIAPEZXQDILRR-YUMQZZPRSA-N Gly-Ser-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN MKIAPEZXQDILRR-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- STOOMQFEJUVAKR-KKUMJFAQSA-N His-His-His Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(O)=O)C1=CNC=N1 STOOMQFEJUVAKR-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- TWROVBNEHJSXDG-IHRRRGAJSA-N His-Leu-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O TWROVBNEHJSXDG-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- YWCJXQKATPNPOE-UKJIMTQDSA-N Ile-Val-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N YWCJXQKATPNPOE-UKJIMTQDSA-N 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- CQGSYZCULZMEDE-UHFFFAOYSA-N Leu-Gln-Pro Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)N1CCCC1C(O)=O CQGSYZCULZMEDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QDSKNVXKLPQNOJ-GVXVVHGQSA-N Leu-Gln-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O QDSKNVXKLPQNOJ-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- NEEOBPIXKWSBRF-IUCAKERBSA-N Leu-Glu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O NEEOBPIXKWSBRF-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- CCQLQKZTXZBXTN-NHCYSSNCSA-N Leu-Gly-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O CCQLQKZTXZBXTN-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- WXUOJXIGOPMDJM-SRVKXCTJSA-N Leu-Lys-Asn Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O WXUOJXIGOPMDJM-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- GAOJCVKPIGHTGO-UWVGGRQHSA-N Lys-Arg-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O GAOJCVKPIGHTGO-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- GJJQCBVRWDGLMQ-GUBZILKMSA-N Lys-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O GJJQCBVRWDGLMQ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- BXPHMHQHYHILBB-BZSNNMDCSA-N Lys-Lys-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O BXPHMHQHYHILBB-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- HLYIDXAXQIJYIG-CIUDSAMLSA-N Met-Gln-Asp Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O HLYIDXAXQIJYIG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- QCHNRQQVLJYDSI-DLOVCJGASA-N Phe-Asn-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 QCHNRQQVLJYDSI-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- GOUWCZRDTWTODO-YDHLFZDLSA-N Phe-Val-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O GOUWCZRDTWTODO-YDHLFZDLSA-N 0.000 description 1
- FMLRRBDLBJLJIK-DCAQKATOSA-N Pro-Leu-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FMLRRBDLBJLJIK-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- FIDNSJUXESUDOV-JYJNAYRXSA-N Pro-Tyr-Val Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O FIDNSJUXESUDOV-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004088 Proprotein Convertase 2 Human genes 0.000 description 1
- 208000017442 Retinal disease Diseases 0.000 description 1
- 206010038923 Retinopathy Diseases 0.000 description 1
- 108010026951 Short-Acting Insulin Proteins 0.000 description 1
- 229940123958 Short-acting insulin Drugs 0.000 description 1
- PRNGXSILMXSWQQ-OEAJRASXSA-N Thr-Leu-Phe Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O PRNGXSILMXSWQQ-OEAJRASXSA-N 0.000 description 1
- NQQMWWVVGIXUOX-SVSWQMSJSA-N Thr-Ser-Ile Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O NQQMWWVVGIXUOX-SVSWQMSJSA-N 0.000 description 1
- TWAVEIJGFCBWCG-JYJNAYRXSA-N Tyr-Gln-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N TWAVEIJGFCBWCG-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- CDKZJGMPZHPAJC-ULQDDVLXSA-N Tyr-Leu-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 CDKZJGMPZHPAJC-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 1
- 239000003888 alpha glucosidase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229910001778 ammonium mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002269 analeptic agent Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 208000011775 arteriosclerosis disease Diseases 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 108010093581 aspartyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 1
- 108010016616 cysteinylglycine Proteins 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- FSXRLASFHBWESK-UHFFFAOYSA-N dipeptide phenylalanyl-tyrosine Natural products C=1C=C(O)C=CC=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FSXRLASFHBWESK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 235000012631 food intake Nutrition 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 108010057083 glutamyl-aspartyl-leucine Proteins 0.000 description 1
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010051307 glycyl-glycyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 1
- 108010036413 histidylglycine Proteins 0.000 description 1
- 230000003345 hyperglycaemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 1
- 206010062198 microangiopathy Diseases 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000944 nerve tissue Anatomy 0.000 description 1
- 201000001119 neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 230000007823 neuropathy Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000422 nocturnal effect Effects 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 235000011837 pasties Nutrition 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 208000033808 peripheral neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 1
- 101150078341 rop gene Proteins 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 108010048818 seryl-histidine Proteins 0.000 description 1
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 108010073969 valyllysine Proteins 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к генной инженерии, и касается нового штамма бактерий Escherichia coli JM109/pHIG05, который может быть использован для получения генно-инженерного инсулина Glargine - аналога инсулина человека пролонгированного действия, применяемого при изготовлении лекарственных препаратов для лечения инсулинозависимого сахарного диабета.The invention relates to the field of biotechnology, in particular to genetic engineering, and relates to a new strain of bacteria Escherichia coli JM109 / pHIG05, which can be used to obtain genetically engineered insulin Glargine - an analogue of human insulin, prolonged action, used in the manufacture of drugs for the treatment of insulin-dependent sugar diabetes.
В настоящее время сахарный диабет (обычно также называемый «диабет») является одним из наиболее распространенных заболеваний в мире. Диабет представляет собой метаболическое расстройство, вызванное абсолютным или относительным дефицитом инсулина, который представляет собой единственный гипогликемический гормон, и основным признаком сахарного диабета является постоянная гипергликемия. Непрерывность гипергликемического состояния не только усугубляет метаболические расстройства, вызванные недостатком инсулина, но также вызывает микроангиопатию в почках, нервной ткани, сетчатке и им подобных органах и макроангиопатию, такую как артериосклероз. Диабет ассоциирован также с целым рядом хронических осложнений, включающих микрососудистые заболевания, такие как ретинопатия, нефропатия и невропатия, и макрососудистые заболевания, такие как ишемическая болезнь сердца (RU 2358738, 2009).At present, diabetes mellitus (usually also called "diabetes") is one of the most common diseases in the world. Diabetes is a metabolic disorder caused by absolute or relative insulin deficiency, which is the only hypoglycemic hormone, and the main symptom of diabetes is persistent hyperglycemia. Continuity of the hyperglycemic state not only exacerbates metabolic disorders caused by insulin deficiency, but also causes microangiopathy in the kidneys, nerve tissue, retina and the like, and macroangiopathy such as arteriosclerosis. Diabetes is also associated with a number of chronic complications, including microvascular diseases such as retinopathy, nephropathy and neuropathy, and macrovascular diseases such as coronary heart disease (RU 2358738, 2009).
Во всем мире от сахарного диабета страдают примерно 120 миллионов людей. Среди них примерно 12 миллионов страдают диабетом типа I, для которых необходима замена отсутствующей эндокринной секреции инсулина (RU 2313362, 2007). Для лечения сахарного диабета предлагаются различные гипогликемические средства, такие как препараты инсулина, стимуляторы секреции инсулина, средства, сенсибилизирующие к инсулину, и ингибиторы α-глюкозидазы (RU 2358738, 2009). Хотя возможность применения указанных гипогликемических средств подтверждена в клинической практике, однако их практическое применение связано с целым рядом проблем. Например, в случае, когда у больных сахарным диабетом значительно снижается способность поджелудочной железы секретировать инсулин, эффективность средств, стимулирующих секрецию инсулина, и средств, сенсибилизирующих к инсулину, уменьшается.Worldwide, approximately 120 million people suffer from diabetes. Among them, approximately 12 million suffer from type I diabetes, for which replacement of the missing endocrine secretion of insulin is necessary (RU 2313362, 2007). Various hypoglycemic agents are offered for the treatment of diabetes mellitus, such as insulin preparations, insulin secretion stimulants, insulin sensitizing agents, and α-glucosidase inhibitors (RU 2358738, 2009). Although the possibility of using these hypoglycemic agents has been confirmed in clinical practice, their practical application is associated with a number of problems. For example, in patients with diabetes mellitus, the ability of the pancreas to secrete insulin is significantly reduced, the effectiveness of insulin secretion stimulating agents and insulin sensitizing agents decreases.
Долгие годы основным препаратом, применяемым для профилактики и лечения диабета, является инсулин. Человеческий инсулин представляет собой полипептид, содержащий А-цепь из 21 аминокислоты и В-цепь из 30 аминокислот и имеющий одну внутреннюю дисульфидную связь в А-цепи и две дисульфидные связи, которые связывают А-цепь и В-цепь (ЕА 05586, 2009). Инсулин первоначально биологически синтезируется как "препроинсулин" специализированными клетками в островках Лангерганса поджелудочной железы. Препроинсулин представляет собой линейную молекулу, содержащую сигнальный пептид из 24 аминокислот (SP), В-цепь (В), С-пептид из 31 аминокислоты (С) и А-цепь (А), присоединенные в порядке, представленном формулой "SP-B-С-А". После транспорта в эндоплазматический ретикулум, сигнальный пептид отщепляется от препроинсулина с продуцированием "проинсулина (В-С-А)". Проинсулин образует дисульфидные связи в эндоплазматическом ретикулуме, принимая свою трехмерную структуру. Проинсулин расщепляется ферментом PC1/3 в точке соединения В-С, а затем расщепляется ферментом РС2 в точке соединения С-А. И наконец, два N-концевых основных аминокислотных остатка у С-конца В-цепи отщепляются карбоксипептидазой с образованием инсулина.For many years, the main drug used to prevent and treat diabetes is insulin. Human insulin is a polypeptide containing an A chain of 21 amino acids and a B chain of 30 amino acids and having one internal disulfide bond in the A chain and two disulfide bonds that bind the A chain and B chain (EA 05586, 2009) . Insulin is initially biologically synthesized as “preproinsulin” by specialized cells in the pancreatic islets of Langerhans. Preproinsulin is a linear molecule containing a 24 amino acid signal peptide (SP), a B chain (B), a 31 amino acid C peptide (C) and an A chain (A) joined in the order represented by the formula "SP-B -SA. " After transport to the endoplasmic reticulum, the signal peptide is cleaved from preproinsulin to produce “proinsulin (B-C-A)." Proinsulin forms disulfide bonds in the endoplasmic reticulum, assuming its three-dimensional structure. Proinsulin is cleaved by the PC1 / 3 enzyme at junction B-C, and then cleaved by the PC2 enzyme at junction CA. Finally, the two N-terminal basic amino acid residues at the C-terminus of the B chain are cleaved by carboxypeptidase to form insulin.
Пораженным болезнью людям в течение всех оставшихся лет жизни предлагается вводить инсулин путем инъекции неоднократно несколько раз в сутки. При использовании препаратов обычного инсулина возникает опасность возникновения ранней послеобеденной гипергликемии, сопровождаемой гипогликемией перед следующим приемом пищи.Affected people throughout the remaining years of life are invited to administer insulin by injection repeatedly several times a day. When using conventional insulin preparations, there is a risk of early afternoon hyperglycemia, accompanied by hypoglycemia before the next meal.
Проблему удалось преодолеть после получения генно-инженерных аналогов инсулина с различным сроком воздействия на организм (Walsh G. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2005, v.67, p.151-159). Лечение больных сахарным диабетом I типа включает, в частности, использование комбинации препаратов инсулина человека быстрого (короткого) и длительного (пролонгированного) действия. Короткодействующий инсулин должен быстро достигать пика активности в соответствии с подъемом уровня глюкозы, связанным с приемом пищи, и прекращать свое действие после его падения. Инсулин пролонгированного действия, напротив, должен в течение длительного времени обеспечивать определенный базовый уровень глюкозы в промежутках между приемами пищи.The problem was overcome after obtaining genetically engineered analogues of insulin with different durations of exposure to the body (Walsh G. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2005, v.67, p.151-159). Treatment of patients with type I diabetes mellitus includes, in particular, the use of a combination of human insulin preparations of quick (short) and long (prolonged) action. Short-acting insulin should quickly reach a peak in activity in accordance with the rise in glucose levels associated with food intake and cease its effect after its fall. Long-acting insulin, on the contrary, should provide a certain basic level of glucose in between meals for a long time.
Известны различные быстродействующие аналоги инсулина человека (ЕР 0214826, ЕР 0375437, ЕР 0678522), имеющие определенные отличия в структуре инсулина, в частности, предлагается (ЕР 0124826) аналог инсулина с замещениями в положениях В27 и В28, аналоги, которые в положении В29 содержат различные аминокислоты, предпочтительно пролин, но не глутаминовую кислоту (ЕР 0678522). Эти замены уменьшили тенденцию молекул инсулина человека к агрегации и, соответственно, время абсорбции гормона из места инъекции (Setter S.M., Corbett C.F., Campbell P.K., White J.R. Ann. Pharmacother., 2000; v.34, p.1423-1431), что привело к значительному снижению времени начала действия препаратов, увеличению максимально достижимой концентрации препаратов в крови и более быстрому восстановлению исходного уровня гормонов в крови (Simpson K.L., Spenser C.M. Drugs, 1999, v.57, p.759-765).Various high-speed analogs of human insulin are known (EP 0214826, EP 0375437, EP 0678522), which have certain differences in the structure of insulin, in particular, it is proposed (EP 0124826) an insulin analog with substitutions at positions B27 and B28, analogues that at position B29 contain different amino acids, preferably proline, but not glutamic acid (EP 0678522). These substitutions reduced the tendency of human insulin molecules to aggregate and, accordingly, the time of hormone absorption from the injection site (Setter SM, Corbett CF, Campbell PK, White JR Ann. Pharmacother., 2000; v. 34, p. 1423-1431), which led to a significant reduction in the onset time of drugs, an increase in the maximum attainable concentration of drugs in the blood, and faster restoration of the initial level of hormones in the blood (Simpson KL, Spenser CM Drugs, 1999, v. 57, p.759-765).
Пролонгированным действием обладают аналоги инсулина, в которых по меньшей мере одна аминокислота в положениях В1-В6 заменена лизином или аргинином (WO 92/00321, ЕР0368187). Наиболее перспективным из этой группы препаратов является инсулин с удлиненной продолжительностью действия Glargine (Gly(A21)-Arg(B31)-Arg(B32)-человеческий инсулин. Инсулин Glargine вводят путем инъекции один раз в сутки в виде кислого прозрачного раствора и благодаря его свойствам в отношении растворения в физиологической области рН подкожной ткани он осаждается в виде стабильного гексамерного ассоциата. Именно при кислом значении рН инсулины проявляют пониженную стабильность и повышенную склонность к агрегации при термической и физико-механической нагрузке, которая может стать заметной в виде помутнений и выпадений осадков (образование частиц). Инсулин Glargine отличается своим низким сывороточным профилем и связанным с этим уменьшением опасности появления ночных гипогликемии (Brange и др., J. Ph. Sci., 86, 517-525, 1997).Prolonged action is possessed by insulin analogs in which at least one amino acid at positions B1-B6 is replaced by lysine or arginine (WO 92/00321, EP0368187). The most promising of this group of drugs is long-acting insulin Glargine (Gly (A21) -Arg (B31) -Arg (B32) -human insulin. Glargine insulin is injected once a day in the form of an acidic clear solution and due to its properties with respect to dissolution in the physiological region of the pH of the subcutaneous tissue, it precipitates in the form of a stable hexamer associate. It is at an acidic pH that insulins exhibit reduced stability and an increased tendency to aggregate during thermal and physico-mechanical load, which can become noticeable in the form of turbidity and precipitation (particle formation). Glargine insulin is distinguished by its low serum profile and the associated reduction in the risk of nocturnal hypoglycemia (Brange et al., J. Ph. Sci., 86, 517- 525, 1997).
Инсулин Glargine (гларгин) является рекомбинантным производным инсулина пролонгированного действия, которое продолжается в течение 24 часов после инъекции. Аминокислотная последовательность инсулина гларгин отличается от последовательности инсулина человека заменой остатка аспарагина в положении 21 А-цепи на глицин (GlyA21) и наличием двух дополнительных остатков аргинина в C-концевой части В-цепи, ArgB31, ArgB32 (Levien T.L., Baker D.E., White J.R., Campbell R.K. Ann. Pharmaco-ther., 2002, v.36, p.1019-1027). Эти модификации, а также добавление в небольшом количестве ионов цинка улучшают стабильность препарата и повышают изоэлектрическую точку аналога с 5,4 до 6,7, что приводит к уменьшению растворимости препарата в нейтральной среде подкожной клетчатки. Инсулин гларгин хорошо растворим при рН 4,0, кислый раствор препарата при подкожных инъекциях нейтрализуется, и аналог инсулина образует микропреципитаты, из которых происходит медленное высвобождение гексамеров инсулина и их диссоциация с образованием димеров и мономеров. Благодаря этим свойствам гларгин медленно всасывается из подкожной ткани в кровоток, не обладает выраженным пиком действия и обеспечивает практически постоянную концентрацию гормона в крови в течение суток. Добавление ионов цинка в препарат также замедляет процесс освобождения димеров и мономеров, что увеличивает время действия аналога (Dunn C.J., Ploscer G.L., Keating G.M., McKeage K., Scott L.J. Drugs, 2003; v.63, p.1743-1778).Glargine insulin (glargine) is a recombinant derivative of prolonged-acting insulin, which lasts for 24 hours after injection. The amino acid sequence of insulin glargine differs from the human insulin sequence by replacing the asparagine residue at position 21 of the A chain with glycine (GlyA21) and the presence of two additional arginine residues in the C-terminal portion of the B chain, ArgB31, ArgB32 (Levien TL, Baker DE, White JR Campbell RK Ann. Pharmaco-ther., 2002, v. 36, p. 1019-1027). These modifications, as well as the addition of a small amount of zinc ions improve the stability of the drug and increase the isoelectric point of the analog from 5.4 to 6.7, which leads to a decrease in the solubility of the drug in a neutral environment of subcutaneous tissue. Insulin glargine is readily soluble at pH 4.0, the acid solution of the drug is neutralized by subcutaneous injections, and the insulin analog forms microprecipitates, from which the slow release of insulin hexamers and their dissociation with the formation of dimers and monomers. Due to these properties, glargine is slowly absorbed from the subcutaneous tissue into the bloodstream, does not have a pronounced peak of action and provides an almost constant concentration of the hormone in the blood during the day. The addition of zinc ions to the drug also slows down the release of dimers and monomers, which increases the duration of action of the analogue (Dunn C.J., Ploscer G.L., Keating G.M., McKeage K., Scott L.J. Drugs, 2003; v.63, p.1743-1778).
Известен способ получения аналога инсулина Glargine, в котором искусственный ген проинсулина человека синтезируют из олигонуклеотидов и экспрессируют в клетках E.coli W3110 дикого типа (US 5656722, 1997).A known method of producing the Glargine insulin analogue, in which the artificial human proinsulin gene is synthesized from oligonucleotides and expressed in wild-type E. coli W3110 cells (US 5656722, 1997).
Одним из недостатков этого штамма-продуцента является неоптимальный для экспрессии рекомбинантных белков генетический фон бактериальных клеток, содержащих неизмененный набор генов протеолитических ферментов, которые участвуют в деградации рекомбинантных белков, образующихся в результате экспрессии рекомбинантных генов, что приводит к необходимости отделения аналога инсулина от продуктов его деградации и затрудняет очистку и уменьшает выход конечного продукта.One of the drawbacks of this producer strain is the genetic background of bacterial cells that is not optimal for the expression of recombinant proteins, containing an unchanged set of proteolytic enzyme genes that are involved in the degradation of recombinant proteins resulting from the expression of recombinant genes, which leads to the need to separate the insulin analog from its degradation products and complicates cleaning and reduces the yield of the final product.
Наиболее близким по технической сущности к предлагаемой группе изобретений является технология получения инсулина Glargine на основе использования рекомбинантной плазмидной ДНК pGG-1 с молекулярной массой 3,3 МДа, кодирующей гибридный полипептид массой около 17 кДа, в котором IgG-связывающий домен белка А из S.aureus соединен через пептидный линкер His6GlySerArg с аминокислотной последовательностью проинсулина Glargine человека и штамма Escherichia coli BGG18, представляющий собой клетки Escherichia coli BL21 трансформированные плазмидой pGG-1 (RU 2325440, 2008).The closest in technical essence to the proposed group of inventions is the technology for producing Glargine insulin based on the use of recombinant plasmid DNA pGG-1 with a molecular weight of 3.3 MDa encoding a hybrid polypeptide weighing about 17 kDa, in which the IgG-binding domain of protein A from S. aureus is connected via the peptide linker His 6 GlySerArg to the amino acid sequence of human Glargine proinsulin and Escherichia coli strain BGG18, which is Escherichia coli BL21 cells transformed with plasmid pGG-1 (RU 2325440, 2008).
Существенным недостатком штамма Е.coli BGG18 является высокая доля лидерного пептида в составе продуцируемого гибридного белка, при этом доля инсулина Glargine в гибридном белке, составляющая около 30%, что удорожает процесс производства и снижает выход целевого продукта.A significant drawback of the E. coli BGG18 strain is the high proportion of the leader peptide in the composition of the produced hybrid protein, while the proportion of Glargine insulin in the hybrid protein is about 30%, which makes the production process more expensive and reduces the yield of the target product.
Задачей заявляемой группы изобретений является создание нового штамма, продуцирующего гибридный белок с более высокой долей инсулина Glargine, что позволяет упростить дальнейшую технологию выделения инсулина Glargine и повысить его выход.The task of the claimed group of inventions is to create a new strain that produces a hybrid protein with a higher proportion of Glargine insulin, which allows to simplify the further technology for the isolation of Glargine insulin and increase its yield.
Техническая задача состояла в конструировании плазмиды, направляющей синтез гибридного белка с проинсулином Glargine с уменьшенной долей лидерного пептида в составе продуцируемого гибридного белка, и создании высокопродуктивного штамма Е.Coli на ее основе.The technical task was to construct a plasmid directing the synthesis of the hybrid protein with Glargine proinsulin with a reduced proportion of the leader peptide in the composition of the produced hybrid protein, and to create a highly productive E. Coli strain based on it.
Технический результат достигался конструированием рекомбинантной плазмиды pHIG05, детерминирующей синтез гибридного белка с молекулярной массой около 14,7 кДа, в котором N-концевой фрагмент гамма-интерферона человека (SEQ ID NO:3) соединен через пептидный линкер (SEQ ID NO:4) с аминокислотной последовательностью проинсулина Glargine человека (SEQ ID NO:5), и созданием штамма-продуцента Escherichia coli JM109/pHIG05, обеспечивающего индуцибельный биосинтез гибридного белка с долей инсулина Glargine 39% и с уровнем экспрессии гибридного белка в клетке не ниже 30% от суммарного клеточного белка.The technical result was achieved by constructing a recombinant plasmid pHIG05, which determines the synthesis of a hybrid protein with a molecular weight of about 14.7 kDa, in which the N-terminal fragment of human gamma interferon (SEQ ID NO: 3) is connected via a peptide linker (SEQ ID NO: 4) to the amino acid sequence of human Glargine proinsulin (SEQ ID NO: 5), and the creation of a producer strain Escherichia coli JM109 / pHIG05, providing inducible biosynthesis of the hybrid protein with a share of Glargine insulin of 39% and with a level of expression of the hybrid protein in the cell not less than 30% of the total glue full-time protein.
Получена рекомбинантная плазмида pHIG05 (фиг.1), содержащая ДНК, с последовательностью нуклеотидов, представленной на фиг.2, кодирующая гибридный белок (фиг.2), состоящий из аминокислотных последовательностей лидерного пептида, представляющего собой N-концевой фрагмент гамма-интерферона человека (SEQ ID NO:3), пептидного линкера (SEQ ID NO:4) и проинсулина Glargine человека (SEQ ID NO:5).A recombinant plasmid pHIG05 (Fig. 1) containing DNA was obtained with the nucleotide sequence shown in Fig. 2 encoding a hybrid protein (Fig. 2) consisting of the amino acid sequences of a leader peptide representing the N-terminal fragment of human gamma-interferon ( SEQ ID NO: 3), a peptide linker (SEQ ID NO: 4), and human Glargine proinsulin (SEQ ID NO: 5).
Новая рекомбинантная плазмида pHIG05 кодирует гибридный белок размером 134 а.о. с молекулярной массой 14,7 кДа, в котором аминокислотные последовательности лидерного пептида, представляющего собой N-концевой фрагмент гамма-интерферона человека (SEQ ID NO:3), и проинсулина Glargine человека (SEQ ID NO:5) соединены пептидным линкером (SEQ ID NO:4).The new recombinant plasmid pHIG05 encodes a 134 aa fusion protein. with a molecular weight of 14.7 kDa, in which the amino acid sequences of the leader peptide, which is the N-terminal fragment of human gamma interferon (SEQ ID NO: 3), and human Glargine proinsulin (SEQ ID NO: 5) are connected by a peptide linker (SEQ ID NO: 4).
Указанная плазмида состоит из фрагмента BamHI-EcoRI плазмиды рКК223-3 (Brosius J., Dull Т. J., Sleeter D.D., Noller H.F. J. Mol. Biol., 1981, v.148, р.107-127), содержащего промотор транскрипции tac; фрагмента ДНК EcoRI-BamHI (SEQ ID NO:1), содержащего ДНК (SEQ ID NO:6), содержащую последовательность Шайн-Дальгарно, которая расположена между EcoRI сайтом и стартовым кодоном гена гибридного белка, и последовательность, кодирующую N-концевой фрагмент гамма-интерферона человека (SEQ ID NO:3) и пептидный линкер (SEQ ID NO:4); фрагмента ДНК BamHI-HindIII (SEQ ID NO:2), кодирующего аминокислотную последовательность проинсулина Glargine человека (SEQ ID NO:5); фрагмента HindIII-SnaI плазмиды рКК223-3, содержащего терминатор транскрипции рибосомного оперона E.coli, ген β-лактамазы (bla), определяющий устойчивость клеток бактерий к ампициллину и участок инициации репликации (ori); и Eco47III-EheI фрагмента плазмиды рКК223-3; сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами, расположенные на следующем расстоянии вправо от сайта EcoRI: BamHI - 155 п.о., HpaI - 168 п.о., HindIII - 426 п.о., PvuI - 1366 п.о.The indicated plasmid consists of a fragment of the BamHI-EcoRI plasmid pKK223-3 (Brosius J., Dull T. J., Sleeter DD, Noller HFJ Mol. Biol., 1981, v.148, p. 107-127) containing the tac transcription promoter ; an EcoRI-BamHI DNA fragment (SEQ ID NO: 1) containing DNA (SEQ ID NO: 6) containing a Shine-Dalgarno sequence that is located between the EcoRI site and the start codon of the fusion protein gene, and a sequence encoding an N-terminal gamma fragment human interferon (SEQ ID NO: 3) and a peptide linker (SEQ ID NO: 4); a BamHI-HindIII DNA fragment (SEQ ID NO: 2) encoding the amino acid sequence of human Glargine proinsulin (SEQ ID NO: 5); a fragment of HindIII-SnaI of the plasmid pKK223-3 containing the transcription terminator of the ribosomal operon E. coli, β-lactamase gene (bla), which determines the resistance of bacterial cells to ampicillin and the site of replication initiation (ori); and Eco47III-EheI fragment of plasmid pKK223-3; recognition sites by restriction endonucleases located at the following distance to the right of the EcoRI site: BamHI - 155 bp, HpaI - 168 bp, HindIII - 426 bp, PvuI - 1366 bp
Оптимальные результаты достигаются при использовании в качестве ДНК с последовательностью Шайн-Дальгарно, ДНК, содержащую последовательность Шайн-Дальгарно и 7-10 нуклеотидов до стартового кодона гибридного белка, что обеспечивает эффективную трансляцию гибридного белка.Optimal results are achieved when using DNA with a Shine-Dalgarno sequence, DNA containing a Shine-Dalgarno sequence and 7-10 nucleotides to the start codon of the hybrid protein, which ensures efficient translation of the hybrid protein.
В качестве генетического маркера может использоваться не только ген β-лактамазы (bla), но и другие гены, определяющие устойчивость клеток бактерий к антибиотикам или иные последовательности, обеспечивающие достижение подобного или аналогичного эффекта.As a genetic marker, not only the β-lactamase (bla) gene can be used, but also other genes that determine the resistance of bacterial cells to antibiotics or other sequences that ensure the achievement of a similar or similar effect.
Достоинство заявляемой плазмидной конструкции и штамма-продуцента, содержащего эту плазмиду, заключается в биосинтезе гибридного полипептида с более высокой долей инсулина Glargine, которая составляет 39%, благодаря уменьшению размера лидерной последовательности.The advantage of the claimed plasmid construct and producer strain containing this plasmid is the biosynthesis of the hybrid polypeptide with a higher proportion of Glargine insulin, which is 39%, due to the reduction in the size of the leader sequence.
В заявляемую группу изобретений входят также трансформированные клетки Escherichia coli, содержащие указанную рекомбинантную плазмиду, кодирующую гибридный белок с проинсулином Glargine человека, а также штамм бактерий Escherichia coli JM109/pHIG05 - продуцент гибридного белка с проинсулином Glargine человека.The claimed group of inventions also includes transformed Escherichia coli cells containing the indicated recombinant plasmid encoding a fusion protein with human Glargine proinsulin, as well as the bacterial strain Escherichia coli JM109 / pHIG05, a producer of a hybrid protein with human Glargine proinsulin.
Также изобретение относится к трансформированным клеткам Escherichia coli, содержащим указанную рекомбинантную плазмиду, кодирующую гибридный белок с проинсулином Glargine человека, а также штамму бактерий Escherichia coli JM109/pHIG05 - продуценту гибридного белка с проинсулином Glargine человека.The invention also relates to transformed Escherichia coli cells containing the indicated recombinant plasmid encoding the human protein Glargine fusion protein, as well as the bacterial strain Escherichia coli JM109 / pHIG05, the producer of the human protein Glargine fusion protein.
Штамм-продуцент Е.coli JM109/pHIG05 получают путем трансформации компетентных клеток Escherichia coli JM109 рекомбинантной плазмидной ДНК pHIG05. После трансформации отбирают колонии, выращенные на среде с ампициллином, выделяют из них плазмиды и подвергают их рестрикционному анализу и секвенированию. Линию клеток, несущую плазмиду pHIG05, несколько раз пересевают на среду с агарозой с добавлением ампициллина и полученной моноклоновой культурой инокулируют 5 мл жидкой среды с ампициллином. Культуру проверяют на наличие индуцируемой экспрессии гибридного белка, фасуют, добавляют глицерин и хранят при минус 70°С.The E. coli JM109 / pHIG05 producer strain is obtained by transforming Escherichia coli JM109 competent cells with recombinant plasmid DNA pHIG05. After transformation, colonies grown on ampicillin medium are selected, plasmids are isolated from them and subjected to restriction analysis and sequencing. The cell line carrying the plasmid pHIG05 is plated several times on medium with agarose with the addition of ampicillin and the resulting monoclonal culture is inoculated with 5 ml of liquid medium with ampicillin. The culture is checked for the presence of inducible expression of the hybrid protein, packaged, glycerol is added and stored at minus 70 ° C.
Новый штамм Escherichia coli JM109/pHIG05, несущий плазмиду pHIG05, является продуцентом гибридного белка, содержащего аминокислотную последовательность проинсулина Glargine человека, и характеризуется следующими признаками.The new strain Escherichia coli JM109 / pHIG05, carrying the plasmid pHIG05, is a producer of a hybrid protein containing the amino acid sequence of human Glargine proinsulin and is characterized by the following features.
Морфологические признаки: клетки мелкие, палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные, размером 1×3,5 мкм, подвижные, с хорошо различимыми тельцами включения после индукции синтеза гибридного белка.Morphological features: small, rod-shaped cells, gram-negative, non-spore-bearing, 1 × 3.5 μm in size, motile, with well-defined inclusion bodies after induction of fusion protein synthesis.
Культуральные признаки: при росте на агаризованной среде LB колонии круглые, гладкие, полупрозрачные, блестящие, серые. Край ровный, диаметр колоний 1-3 мм, консистенция пастообразная. Рост в жидких средах (LB, минимальная среда с глюкозой) характеризуется ровным помутнением.Cultural traits: when growing on LB agar medium, the colonies are round, smooth, translucent, shiny, gray. The edge is even, the diameter of the colonies is 1-3 mm, the consistency is pasty. Growth in liquid media (LB, minimal medium with glucose) is characterized by even turbidity.
Физиолого-биохимические признаки: клетки растут при температуре 4-42°С, оптимум рН 6,8-7,6. В качестве источника азота используют как минеральные соли аммония, так и органические соединения: аминокислоты, пептон, триптон, дрожжевой экстракт. В качестве источника углерода при росте на минимальной среде используют глицерин, углеводы, аминокислоты.Physiological and biochemical characteristics: cells grow at a temperature of 4-42 ° C, optimum pH of 6.8-7.6. As a source of nitrogen, both ammonium mineral salts and organic compounds are used: amino acids, peptone, tryptone, yeast extract. When growing on a minimal medium, glycerin, carbohydrates, amino acids are used as a carbon source.
Устойчивость к антибиотикам: клетки штамма-продуцента проявляют устойчивость к ампициллину (до 500 мг/мл), обусловленную наличием в плазмиде гена β-лактамазы (bla).Antibiotic resistance: cells of the producer strain show resistance to ampicillin (up to 500 mg / ml) due to the presence of the β-lactamase (bla) gene in the plasmid.
Стабильность плазмиды в штамме. При поддержании клеток в течение нескольких месяцев на агаризованной среде LB, содержащей ампициллин, не наблюдаются потери или перестройки плазмиды, влияющие на экспрессию гибридного белка.Stability of the plasmid in the strain. When maintaining the cells for several months on an agarized LB medium containing ampicillin, no plasmid loss or rearrangement affecting the expression of the fusion protein is observed.
Новый штамм продуцирует гибридный белок, доля инсулина Glargine в котором составляет 39% и который после индуцированной экспрессии накапливается в виде телец включения, а его содержание в бактериальной клетке составляет не менее 30% от общего белка клетки.The new strain produces a hybrid protein, the proportion of Glargine insulin in which is 39% and which, after induced expression, accumulates in the form of inclusion bodies, and its content in the bacterial cell is at least 30% of the total cell protein.
Полученный штамм-продуцент Е.coli JM109/pHIG05 депонирован в ФГУП ГосНИИгенетики ВКПМ под номером В-11408 (справка о депонировании прилагается).The resulting producer strain E. coli JM109 / pHIG05 was deposited at the Federal State Unitary Enterprise GosNII Genetics VKPM under number B-11408 (a certificate of deposit is attached).
Сущность изобретения иллюстрируется следующими иллюстративными материалами.The invention is illustrated by the following illustrative materials.
На фиг.1 представлена физическая карта рекомбинантной плазмиды pHIG05, где используются следующие обозначения:Figure 1 presents the physical map of the recombinant plasmid pHIG05, where the following notation is used:
Ptac - промотор транскрипции; T1T2 - rrnB терминаторы транскрипции рибосомного оперона E.coli; ori - участок инициации репликации; bla - ген β-лактамазы; leader - лидер, N-концевой фрагмент гамма-интерферона человека (SEQ ID NO:3); LK (linker) - пептидный линкер (SEQ ID NO:4); proinsulin Glargine - проинсулин Glargine человека (SEQ ID NO:5). Указанные уникальные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции расположены на следующем расстоянии вправо от сайта EcoRI: BamHI - 155 п.о., HpaI - 168 п.o., HindIII - 426 п.o., PvuI - 1366 п.о.P tac - transcription promoter; T 1 T 2 - rrnB terminators of transcription of the ribosomal operon of E. coli; ori — replication initiation site; bla - β-lactamase gene; leader — leader, N-terminal fragment of human gamma interferon (SEQ ID NO: 3); LK (linker) - peptide linker (SEQ ID NO: 4); proinsulin Glargine - Human Glargine proinsulin (SEQ ID NO: 5). These unique recognition sites of restriction endonucleases are located at the following distance to the right of the EcoRI site: BamHI - 155 bp, HpaI - 168 bp, HindIII - 426 bp, PvuI - 1366 bp
На фиг.2 представлена нуклеотидная последовательность гена гибридного белка с проинсулином Glargine человека в составе рекомбинантной плазмиды pHIG05 и кодируемая им аминокислотная последовательность.Figure 2 presents the nucleotide sequence of the gene of the hybrid protein with human Glargine proinsulin in the recombinant plasmid pHIG05 and the amino acid sequence encoded by it.
Сущность и преимущества изобретения иллюстрируется следующими примерами.The essence and advantages of the invention are illustrated by the following examples.
Пример 1. Конструирование плазмиды pHIG05, направляющей синтез гибридного белка с проинсулином Glargine человека.Example 1. Construction of the plasmid pHIG05, directing the synthesis of a hybrid protein with human Glargine proinsulin.
Рекомбинантную плазмиду pHIG05 конструировали на основе вектора рКК223-3 (Brosius J., Dull Т. J., Sleeter D.D., Noller H.F. J. Mol. Biol., 1981, v.148, p.107-127), который предварительно модифицировали. На первом этапе из плазмидной ДНК рКК223-3 удаляют фрагмент BamHI-EheI размером примерно 830 п.о., путем (при помощи) достройки «липких» концов после частичного гидролиза по BamHI и полного гидролиза по Ehe I и последующего лигирования полученных «тупых» концов (RU2263147, 2005). Затем полученную плазмиду pКК223-3-del размером примерно 3750 п.о. делегировали по rop-гену (негативному регулятору копийности) для увеличения числа ее копий на бактериальную клетку (Twigg A.J. and Sherrat D. Nature, 1980, v.283, p.216-218). С этой целью ДНК плазмиды pКК223-3-del подвергали полному гидролизу рестриктазами Eco47III и SnaI, а полученный фрагмент Eco47III-SnaI (3,2 т.п.о.) лигировали. В результате получали плазмиду pКК223-3-del2 размером 3250 п.о., которую использовали в качестве вектора для клонирования фрагмента ДНК размером 160 п.о. (SEQ ID NO:1), фланкированного сайтами рестрикции EcoRI и BamHI, и содержащего последовательность Шайн-Дальгарно и последовательность, кодирующую N-концевой фрагмент гамма-интерферона человека и пептидный линкер. Указанный фрагмент ДНК (SEQ ID NO:1) синтезировали химическим способом и встраивали в плазмиду pКК223-3-del2 по сайтам EcoRI и BamHI. В результате получали плазмидную ДНК pKK-GI-del02 размером примерно 3400 п.о., содержащую между сайтами EcoRI и BamHI последовательность Шайн-Дальгарно и последовательность, кодирующую N-концевой фрагмент гамма-интерферона человека и пептидный линкер.The recombinant plasmid pHIG05 was constructed based on the pKK223-3 vector (Brosius J., Dull T. J., Sleeter D.D., Noller H.F. J. Mol. Biol., 1981, v.148, p.107-127), which was previously modified. At the first stage, approximately 830 bp BamHI-EheI fragment is removed from the pKK223-3 plasmid DNA by (using) completing the “sticky” ends after partial hydrolysis by BamHI and complete hydrolysis by Ehe I and subsequent ligation of the resulting “blunt” ends (RU2263147, 2005). Then, the resulting plasmid pKK223-3-del measuring about 3750 bp delegated to the rop gene (negative regulator of copy number) to increase the number of copies per bacterial cell (Twigg A.J. and Sherrat D. Nature, 1980, v. 283, p. 216-218). For this purpose, DNA of plasmid pKK223-3-del was subjected to complete hydrolysis with restriction enzymes Eco47III and SnaI, and the resulting Eco47III-SnaI fragment (3.2 kb) was ligated. As a result, a plasmid pKK223-3-del2 of 3250 bp was obtained, which was used as a vector for cloning a 160 bp DNA fragment. (SEQ ID NO: 1), flanked by EcoRI and BamHI restriction sites, and containing a Shine-Dalgarno sequence and a sequence encoding the N-terminal fragment of human gamma interferon and a peptide linker. The indicated DNA fragment (SEQ ID NO: 1) was chemically synthesized and inserted into the pKK223-3-del2 plasmid at the EcoRI and BamHI sites. As a result, a pKK-GI-del02 plasmid DNA of approximately 3400 bp was obtained, containing the Shine-Dalgarno sequence and the sequence encoding the N-terminal fragment of human gamma-interferon and a peptide linker between EcoRI and BamHI sites.
Далее плазмида pKK-GI-del02 была использована для конструирования плазмидной ДНК, кодирующей гибридный белок, в котором N-концевая последовательность гамма-интерферона (SEQ ID NO:3) через пептидный линкер (SEQ ID NO:4) соединена с последовательностью проинсулина Glargine человека (SEQ ID NO:5). Для этого синтезировали химическим способом фрагмент ДНК размером 410 п.о. (SEQ ID NO:2), фланкированный сайтами рестрикции BamHI и HindIII, содержащий кодон для аргинина и нуклеотидную последовательность, кодирующую проинсулин Glargine человека, оптимизированную с учетом частоты встречаемости кодонов в геноме Е.coli. Указанный фрагмент ДНК клонировали в плазмиду pKK-GI-del02 по BamHI и HindIII сайтам.Next, the plasmid pKK-GI-del02 was used to construct a plasmid DNA encoding a hybrid protein in which the N-terminal sequence of gamma interferon (SEQ ID NO: 3) is connected via a peptide linker (SEQ ID NO: 4) to the human Glargine proinsulin sequence (SEQ ID NO: 5). For this, a DNA fragment of 410 bp was synthesized chemically. (SEQ ID NO: 2), flanked by BamHI and HindIII restriction sites, containing a codon for arginine and a nucleotide sequence encoding human Glargine proinsulin, optimized for the frequency of codons in the E. coli genome. The indicated DNA fragment was cloned into the plasmid pKK-GI-del02 at BamHI and HindIII sites.
В результате получили рекомбинантную плазмидную ДНК pHIG05, строение которой подтверждали рестрикционным анализом. Структура гена, кодирующего гибридный белок, была подтверждена секвенированием.The result was a recombinant plasmid DNA pHIG05, the structure of which was confirmed by restriction analysis. The structure of the gene encoding the hybrid protein was confirmed by sequencing.
Плазмидная ДНК pHIG05 позволяет направлять синтез гибридного белка с более высокой долей инсулина Glargine, которая составляет 39%, благодаря уменьшению размера лидерной последовательности.Plasmid DNA pHIG05 allows you to direct the synthesis of a hybrid protein with a higher proportion of Glargine insulin, which is 39%, due to the reduction in the size of the leader sequence.
Пример 2. Получение штамма E.coli JM109/pHIG05 - продуцента гибридного белка с проинсулином Glargine человека.Example 2. Obtaining a strain of E. coli JM109 / pHIG05 - producer of a hybrid protein with human Glargine proinsulin.
Плазмидной ДНК pHIG05 трансформируют компетентные клетки штамма E.coli JM109 и высевают на LB-агар, содержащий 100 мкг/мл ампициллина. Отдельно локализованную колонию трижды пересевают на чашки с LB-агаром, содержащим 100 мкг/мл ампициллина. Полученной моноклоновой культурой инокулируют 5 мл жидкой среды LB с ампициллином и инкубируют в течение ночи, при интенсивном встряхивании, при 37°С. Полученный штамм-продуцент E.coli JM109/pHIG05 хранят в 15% глицерине при минус 70°С.Plasmid DNA pHIG05 transform competent cells of strain E. coli JM109 and plated on LB agar containing 100 μg / ml ampicillin. Separately, a localized colony is reseed three times on plates with LB agar containing 100 μg / ml ampicillin. The resulting monoclonal culture was inoculated with 5 ml of liquid LB medium with ampicillin and incubated overnight, with vigorous shaking, at 37 ° C. The resulting producer strain E. coli JM109 / pHIG05 was stored in 15% glycerol at minus 70 ° C.
Для определения уровня индуцируемой экспрессии гибридного белка, ночную культуру засевают в разведении 1:50 в 5 мл жидкой среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, и растят до мутности 0,8 при 37°С на качалке при 200 об/мин. К культуре добавляют ИПТГ до концентрации 1,0 мМ и продолжают инкубацию в тех же условиях в течение 3 часов. Клетки собирают центрифугированием, осадок суспендируют в буфере, содержащем 62,5 мМ трис-HCl, рН 6,8, 3% додецилсульфата натрия, 5% 2-меркаптоэтанола, 10% глицерина и 0,01% бромфенолового синего и прогревают 3 мин на кипящей водяной бане. Полученный лизат клеток анализируют электрофорезом в 18% полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. Гель окрашивают Coomassie R-250, сканируют и проводят его денситометрию. По данным денситометрии выход гибридного белка составляет 29±3% от общего белка клетки.To determine the level of inducible expression of the hybrid protein, the overnight culture was seeded at a dilution of 1:50 in 5 ml of LB liquid medium containing 100 μg / ml ampicillin and grown to a turbidity of 0.8 at 37 ° C on a rocking chair at 200 rpm. IPTG was added to the culture to a concentration of 1.0 mM and incubation was continued under the same conditions for 3 hours. Cells are collected by centrifugation, the pellet is suspended in a buffer containing 62.5 mM Tris-HCl, pH 6.8, 3% sodium dodecyl sulfate, 5% 2-mercaptoethanol, 10% glycerol and 0.01% bromophenol blue and heated for 3 minutes at boiling water bath. The resulting cell lysate was analyzed by electrophoresis on an 18% polyacrylamide gel with sodium dodecyl sulfate. The gel is stained with Coomassie R-250, scanned and densitometric. According to densitometry, the yield of the hybrid protein is 29 ± 3% of the total protein of the cell.
Преимуществом заявляемой группы изобретений по сравнению с аналогами является увеличение доли инсулина Glargine в гибридном белке, которая составляет 39%, что позволяет повысить выход конечного продукта при его производстве.An advantage of the claimed group of inventions in comparison with analogues is an increase in the proportion of Glargine insulin in the hybrid protein, which is 39%, which allows to increase the yield of the final product in its production.
Список последовательностейSequence List
SEQ ID NO:1SEQ ID NO: 1
Нуклеотидная последовательность, содержащая на концах сайты рестрикции EcoRI и BamHI и включающая последовательность Шайн-Дальгарно и последовательность, кодирующую N-концевой фрагмент гамма-интерферона человека и пептидный линкерA nucleotide sequence containing EcoRI and BamHI restriction sites at the ends and including a Shine-Dalgarno sequence and a sequence encoding the N-terminal fragment of human gamma-interferon and a peptide linker
5' GAATTCAGGAGGCCTCTAGATGCAGGACCCATATGTAAAAGAAGCAGAAAACCTTAAGAA 605 '
ATATTTTAATGCAGGTCATTCAGATGTAGCGGATAATGGAACTCTTTTCTTAGGCATTTT 120
GAAGAATGAGCTCCCGGGTTCTCATCATCATCATGGATCC 3'GAAGAATGAGCTCCCGGGTTCTCATCATCATCAT GGATCC 3 '
SEQ ID NO:2SEQ ID NO: 2
Нуклеотидная последовательность, содержащая на концах сайты рестрикции BamHI и HindIII и включающая последовательность, кодирующую проинсулин Glargine человекаA nucleotide sequence containing BamHI and HindIII restriction sites at the ends and comprising a sequence encoding human Glargine proinsulin
5' GGATCCCGTTTTGTTAACCAACACCTGTGCGGTTCTCACCTGGTTGAAGCTCTGTACCTG 605 '
GTTTGCGGTGAACGTGGTTTCTTCTACACCCCGAAGACCCGTCGTGAAGCTGAAGACCTG 120
CAGGTTGGTCAGGTTGAACTGGGTGGTGGTCCGGGTGCTGGTAGCCTGCAACCGCTGGCT 180
CTGGAAGGTTCTCTGCAGAAGCGTGGTATCGTTGAACAGTGCTGCACCTCTATCTGCTCT 240 CTGGAAGGTTCTCTGCAGAAGCGTGGTATCGTTGAACAGTGCTGCACCTCTATCTGCTCT 240
CTGTACCAGCTGGAAAACTACTGCGGCTAGTAAGCTT 3' CTGTACCAGCTGGAAAACTACTGCGGCTAGT AAGCTT 3 '
SEQ ID NO:3SEQ ID NO: 3
Аминокислотная последовательность N-концевого фрагмента гамма-интерферона человекаAmino acid sequence of the N-terminal fragment of human gamma interferon
Met Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys TyrMet Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr
1 5 10 15 1 5 10 15
Phe Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu PhePhe Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe
20 25 30 20 25 30
Leu Gly Ile Leu Lys Asn Leu Gly Ile Leu Lys Asn
35 35
SEQ ID NO:4SEQ ID NO: 4
Аминокислотная последовательность пептидного линкераAmino acid sequence of the peptide linker
Glu Leu Pro Gly Ser His His His His Gly Ser ArgGlu Leu Pro Gly Ser His His His His Gly Ser Arg
1 5 10 1 5 10
SEQ ID NO:5SEQ ID NO: 5
Аминокислотная последовательность проинсулина Glargine Glargine Proinsulin Amino Acid Sequence
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala LeuPhe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu
15 fifteen
Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys ThrTyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
30 thirty
Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu GlyArg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly
45 45
Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu GlyGly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly
60 60
Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser IleSer Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile
75 75
Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly
86 86
SEQ ID NO:6SEQ ID NO: 6
Нуклеотидная последовательность, содержащая последовательность Шайн-ДальгарноThe nucleotide sequence containing the Shine-Dalgarno sequence
5' AGGAGGCCTCTAG 3'5 ' AGGAGG CCTCTAG 3'
Claims (4)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013119785/10A RU2515115C1 (en) | 2013-04-29 | 2013-04-29 | RECOMBINANT PLASMID DNA pHIG05, CODING HYBRID PROTEIN WITH HUMAN PROINSULIN Glargine, CELL Escherichia coli, TRANSFORMED BY RECOMBINANT PLASMID DNA PHIG05, AND STRAIN OF BACTERIA Escherichia coli JM109/pHIG05-PRODUCENT OF HYBRID PROTEIN WITH HUMAN PROINSULIN Glargine |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013119785/10A RU2515115C1 (en) | 2013-04-29 | 2013-04-29 | RECOMBINANT PLASMID DNA pHIG05, CODING HYBRID PROTEIN WITH HUMAN PROINSULIN Glargine, CELL Escherichia coli, TRANSFORMED BY RECOMBINANT PLASMID DNA PHIG05, AND STRAIN OF BACTERIA Escherichia coli JM109/pHIG05-PRODUCENT OF HYBRID PROTEIN WITH HUMAN PROINSULIN Glargine |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2515115C1 true RU2515115C1 (en) | 2014-05-10 |
Family
ID=50629694
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013119785/10A RU2515115C1 (en) | 2013-04-29 | 2013-04-29 | RECOMBINANT PLASMID DNA pHIG05, CODING HYBRID PROTEIN WITH HUMAN PROINSULIN Glargine, CELL Escherichia coli, TRANSFORMED BY RECOMBINANT PLASMID DNA PHIG05, AND STRAIN OF BACTERIA Escherichia coli JM109/pHIG05-PRODUCENT OF HYBRID PROTEIN WITH HUMAN PROINSULIN Glargine |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2515115C1 (en) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2144957C1 (en) * | 1999-02-26 | 2000-01-27 | Институт биоорганической химии им.М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН | Recombinant plasmid dna ppins07 encoding fused polypeptide containing human proinsulin and strain of bacterium escherichia coli - producer of fused polypeptide containing human proinsulin |
| RU2325440C1 (en) * | 2006-11-21 | 2008-05-27 | Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук | RECOMBINANT PLASMID DNA pGG-1 CODING POLYPEPTIDE OF HUMAN PROINSULIN GLARGIN AND STRAIN OF BACTERIA ESCHERICHIA COLI BGG18-PRODUCER OF RECOMBINANT PROINSULIN GLARGIN |
-
2013
- 2013-04-29 RU RU2013119785/10A patent/RU2515115C1/en active IP Right Revival
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2144957C1 (en) * | 1999-02-26 | 2000-01-27 | Институт биоорганической химии им.М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН | Recombinant plasmid dna ppins07 encoding fused polypeptide containing human proinsulin and strain of bacterium escherichia coli - producer of fused polypeptide containing human proinsulin |
| RU2325440C1 (en) * | 2006-11-21 | 2008-05-27 | Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук | RECOMBINANT PLASMID DNA pGG-1 CODING POLYPEPTIDE OF HUMAN PROINSULIN GLARGIN AND STRAIN OF BACTERIA ESCHERICHIA COLI BGG18-PRODUCER OF RECOMBINANT PROINSULIN GLARGIN |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7252280B2 (en) | Novel insulin analogue and use thereof | |
| CN113502296B (en) | Recombinant engineering bacterium for expressing semaglutide precursor and construction method thereof | |
| RU2524423C2 (en) | Novel insulin derivatives with extremely delayed time/action profile | |
| RU2529952C2 (en) | Novel insulin derivatives with strongly slowed profile time/action | |
| KR940000756B1 (en) | Insulin analogues and process for their preparation | |
| CN106220724B (en) | Human fibroblast growth factor 21 recombinant protein and its preparation method and application | |
| RU2764197C1 (en) | Insulin analogues with reduced affinity to insulin receptor and their use | |
| CN113396157A (en) | Insulin analogs with reduced insulin receptor binding affinity | |
| CN113265007B (en) | A fusion protein for treating metabolic diseases and its preparation method and application | |
| CN111793126A (en) | Preparation method of GLP-1 analogue polypeptide and application thereof in type II diabetes | |
| CN109689086A (en) | Fusion protein with extended serum half-life | |
| CN106397607A (en) | Recombinant human fibroblast growth factor 21 fusion protein and application thereof in preparation of medicine for treating metabolic diseases | |
| CN113105561B (en) | Preparation method and application of double-target fusion protein | |
| KR20160007295A (en) | Insulin analog | |
| CN105884901B (en) | Recombinant human serum albumin/glucagon peptide fusion protein with the function of continuously controlling blood sugar content | |
| CN105254763A (en) | Recombinant insulin secretion promoter fusion protein and its preparation method and use | |
| CN1935846A (en) | Fusion protein for treating diabetes, and its preparing method and use | |
| CN112851791B (en) | Novel FGF analogue for resisting metabolic disorder and application thereof | |
| JP2021513330A (en) | Human insulin analog codon-optimized precursor gene and signal peptide gene | |
| RU2515115C1 (en) | RECOMBINANT PLASMID DNA pHIG05, CODING HYBRID PROTEIN WITH HUMAN PROINSULIN Glargine, CELL Escherichia coli, TRANSFORMED BY RECOMBINANT PLASMID DNA PHIG05, AND STRAIN OF BACTERIA Escherichia coli JM109/pHIG05-PRODUCENT OF HYBRID PROTEIN WITH HUMAN PROINSULIN Glargine | |
| RU2514480C1 (en) | RECOMBINANT PLASMID DNA pHILP07 ENCODING HYBRID PROTEIN WITH HUMAN PROINSULIN Lispro, CELL Escherichia coli TRANSFORMED BY RECOMBINANT PLASMID DNA pHILP07, AND STRAIN OF BACTERIA Escherichia coli JM109/pHILP07 - PRODUCER OF HYBRID PROTEIN WITH HUMAN PROINSULIN Lispro | |
| RU2514578C1 (en) | RECOMBINANT PLASMID DNA pHIASP03, ENCODING HYBRID PROTEIN WITH HUMAN PROINSULIN Aspart, CELL Escherichia coli TRANSFORMED BY RECOMBINANT PLASMID DNA pHIAsp03, AND STRAIN OF BACTERIA Escherichia coli JM109/pHIAsp03 - PRODUCER OF HYBRID PROTEIN WITH HUMAN PROINSULIN Aspart | |
| CN101698681B (en) | A chimeric polypeptide with dual targeting and its application | |
| CN100484957C (en) | Thymosin beta4 derivative and its use | |
| RU2729381C1 (en) | Recombinant plasmid dna pf644 coding hybrid polypeptide containing proinsulin glargine, and bacterial strain escherichia coli - producer of hybrid polypeptide containing proinsulin glargine |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20160430 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20170502 |
|
| PC41 | Official registration of the transfer of exclusive right |
Effective date: 20171204 |
|
| PC41 | Official registration of the transfer of exclusive right |
Effective date: 20201020 |