RU2508542C1 - Экспресс-способ определения риска злокачественности клеток - Google Patents
Экспресс-способ определения риска злокачественности клеток Download PDFInfo
- Publication number
- RU2508542C1 RU2508542C1 RU2012129708/15A RU2012129708A RU2508542C1 RU 2508542 C1 RU2508542 C1 RU 2508542C1 RU 2012129708/15 A RU2012129708/15 A RU 2012129708/15A RU 2012129708 A RU2012129708 A RU 2012129708A RU 2508542 C1 RU2508542 C1 RU 2508542C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- nad
- tumor
- cancer
- light
- Prior art date
Links
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 52
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 25
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 title claims abstract description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 8
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 claims abstract description 26
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 claims description 19
- 230000000254 damaging effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 abstract description 7
- 230000001146 hypoxic effect Effects 0.000 abstract description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 208000016691 refractory malignant neoplasm Diseases 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 abstract 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 65
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 15
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 12
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 6
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 6
- 102100033350 ATP-dependent translocase ABCB1 Human genes 0.000 description 5
- 108010047230 Member 1 Subfamily B ATP Binding Cassette Transporter Proteins 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 4
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 4
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 4
- 238000001782 photodegradation Methods 0.000 description 4
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 3
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000002407 ATP formation Effects 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108010072866 Prostate-Specific Antigen Proteins 0.000 description 2
- 102100038358 Prostate-specific antigen Human genes 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 2
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 2
- 102000015694 estrogen receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010038795 estrogen receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 238000001794 hormone therapy Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 2
- -1 nicotinamidine nucleotide phosphate Chemical class 0.000 description 2
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 2
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 102000003998 progesterone receptors Human genes 0.000 description 2
- 108090000468 progesterone receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 239000000439 tumor marker Substances 0.000 description 2
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 2
- 102100024321 Alkaline phosphatase, placental type Human genes 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010055113 Breast cancer metastatic Diseases 0.000 description 1
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 description 1
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 description 1
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 206010064912 Malignant transformation Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 206010048723 Multiple-drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 206010061309 Neoplasm progression Diseases 0.000 description 1
- 102000004108 Neurotransmitter Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000590 Neurotransmitter Receptors Proteins 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000008217 Pregnancy Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010035746 Pregnancy Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000031074 Reinjury Diseases 0.000 description 1
- 208000024313 Testicular Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010057644 Testis cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000006682 Warburg effect Effects 0.000 description 1
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 210000004100 adrenal gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000006536 aerobic glycolysis Effects 0.000 description 1
- 102000013529 alpha-Fetoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000006851 antioxidant defense Effects 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 1
- 239000003560 cancer drug Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 229940015047 chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 208000023965 endometrium neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 230000008175 fetal development Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000004153 glucose metabolism Effects 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 108091008039 hormone receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000013115 immunohistochemical detection Methods 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000010983 kinetics study Methods 0.000 description 1
- 230000003859 lipid peroxidation Effects 0.000 description 1
- 229940057995 liquid paraffin Drugs 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 230000036212 malign transformation Effects 0.000 description 1
- 230000005741 malignant process Effects 0.000 description 1
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 1
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 1
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 230000004108 pentose phosphate pathway Effects 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 1
- 108010031345 placental alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000006335 response to radiation Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 201000003120 testicular cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000005751 tumor progression Effects 0.000 description 1
- 235000021119 whey protein Nutrition 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для определения риска злокачественности клеток. Для этого из образца биопсии, полученного от субъекта, готовят клеточный отпечаток или суспензию клеток, создают условия гипоксии. Подвергают повторяющимся воздействиям повреждающего агента, выбранного из УФ-света. Проводят спектро-флурометрическое исследование образца после повторяющегося воздействия УФ-светом, и в случае, если в темповых условиях обнаружен прирост интенсивности флуоресценции NAD(P)H, диагностируют клетки как злокачественные. Изобретение обеспечивает выявить высоко-устойчивые раковые клетки как показатели негативного опухолевого прогноза in vivo для той опухоли, из которой взят исследуемый образец. Время выявления злокачественности и устойчивости опухолевых клеток составляет несколько минут. 6 ил., 1 пр.
Description
Изобретение относится к онкологической медицине, в частности к тестировнию злокачественного процесса, высоко-устойчивые клетки которого, могут быть обнаружены с помощью физического анализа биологических материалов, что может быть использовано для прогнозирования повышенной множественной устойчивости раковых клеток in vivo, при его тестировании in vitro.
Несмотря на серьезные и разносторонние исследования последних лет в области онкологии остается много нерешенных проблем, которые связаны в первую очередь с тем, что радиационная и химиотерапия во многих случаях остается малоэффективной. Главным фактором, ограничивающим успешность применения противораковых средств, является высокая устойчивость части опухолевых клеток к различным повреждениям, часто формирующаяся в условиях гипоксии. Такая устойчивость может быть: первичной и, следовательно, свойством злокачественных клеток до начала лечения; или вторичной, которая развивается в ответ на радиационное облучение и/или введение лекарств.
Обычно в начале лечения наблюдается положительная динамика, но через некоторое время она исчезает. Высокая изменчивость опухолевых клеток и постоянно действующий отбор клеток с большей выживаемостью и злокачественностью приводит к тому, что первоначально с помощью лечения удается уменьшить размер опухоли за счет гибели опухолевых клеток с низкой устойчивостью. Оставшаяся субпопуляция клеток приобретает повышенную способность к выживанию в неблагоприятных условиях и становится резистентной сразу к радиационному облучению и к целой группе лекарств, то есть развивается так называемая множественная устойчивость, сопровождающаяся часто рецидивом болезни и появлением метастазов. Одним из направлений своевременного выявления таких опухолей является поиск новых, специфических индикаторов, свойственных высоко-устойчивым опухолевым клеткам, а также разработка методов их быстрого определения in vitro с помощью как уже известных, так и новых опухолевых маркеров.
Обычно опухолевыми маркерами называют соединения (белки, биологически активные пептиды, гормоны, ферменты и метаболиты), которые синтезируются раковыми клетками и отсутствуют в нормальных клетках. Большинство известных опухолевых маркеров относятся к онкофетальным белкам, которые обнаруживаются в эмбриональных тканях человека и крови в период внутриутробного развития. Они исчезают полностью или остаются в следовых количествах после рождения. В ходе опухолевой прогрессии они начинают синтезироваться снова и секретируются в кровь. Однако конкретные онко-фетальные соединения синтезируются лишь в определенных эмбриональных и опухолевых тканях. Например, альфа-фетопротеин является нормальным сывороточным белком зародыша и синтезируется в печени плода, а также при развитии рака печени. В качестве онко-фетальных маркеров часто используют белки плаценты (хорионический гонадотропин или плацентарную щелочную фосфатазу). Иммуногистохимическое обнаружение таких белков служит хорошим онкологическим маркеров рака яичников или семенников, что позволяет следить за ходом их лечения. Для рака предстательной железы в качестве чувствительного онкомаркера используется простато-специфический антиген PSA (от англ., prostate specific antigen). Однако на большом материале, полученном не только на экспериментальных животных, но и на человеке, показано, что подавляющее большинство онко-фетальных биомаркеров является ткане-специфическими. Более того, эти онкомаркеры часто не определяются на ранней стадии болезни и могут индуцироваться также при воспалительных заболеваниях печени, поджелудочной железы и легких. Кроме того, известно, что онко-фетальные маркеры существуют не для всех солидных опухолей.
Хотя в процессе злокачественной трансформации нарушаются некоторые механизмы, контролирующие рост и дифференцировку тканей, но ряд опухолей все же не ускользает полностью из-под регуляторного влияния организма, сохраняя рецепторы гормонов и нейромедиаторов на поверхности или внутри клеток. К ним, в частности, относятся опухоли, происходящие из гормонозависимых тканей: молочной железы, матки, яичников, гипофиза, надпочечников, щитовидной и предстательной желез. Более половины опухолей молочной железы, яичников и эндометрия содержат рецепторы эстрогенов и прогестерона, которые служат онкомаркерами гормоно-чувствительных опухолей. Опухоли, не содержащие рецепторов, малочувствительны к гормонотерапии, поэтому определение уровня рецепторов эстрогенов и прогестинов широко используют для прогнозирования эффективности гормонотерапии при опухолях молочной железы, яичников и матки. Однако эти опухолевые маркеры не позволяют тестировать повышенную устойчивость раковых клеток к повреждающему действию химиотерапии или радиации.
Существуют разные механизмы возникновения множественной устойчивости опухолевых клеток, среди которых множественная лекарственная устойчивость является наиболее изученной. Такая устойчивость обычно тестируется по снижению накопления противо-опухолевых препаратов внутри клеток или по высокому уровню экспрессии АТФ-зависимого трансмембранного Р-гликопротеина, способного эффективно откачивать различные противоопухолевые препараты или красители из устойчивых, опухолевых клеток, таким путем повышая их выживаемость. Важно отметить, что Р-гликопротеин выявляется не только в опухолевых, но и в нормальных тканях, в частности в почках, печени, гемато-энцефалическом барьере. Уровень экспрессии Р-гликопротеин может также повышаться и при воспалении [Но Е., et al. Regulation of MDR by pro-inflammatory cytokines. "Curr. Cancer Drug Targets", 2006, 5(4), 295-301]. Более того, эффективность работы Р-гликопротеина тесно зависит от уровня образования АТФ в митохондриях [Zhou Y., et al. Intracellular ATP levels are a pivotal determinant of chemoresistance in colon cancer cell. "Cancer Res.", 2012, 72(1), 304-314]. Для опухолевых митохондрий характерно снижение уровня образования АТР, особенно в условиях гипоксии, что ограничивает работу Р-гликопротеина. Однако такие клетки при неблагоприятных условиях часто сохраняют высокую выживаемость, что достигается благодаря активации альтернативных путей метаболизм, в частности активации аэробного гликолиза, а также работы пентозофосфатного пути, интенсивно продуцирующего восстановленный NAD(P)H [никотинамиддинуклеотидфосфат].
Исследования последних лет убедительно показали, что устойчивые опухолевые клетки для своего выживания в условиях гипоксии и окислительного стресса, нуждаются в постоянном образовании NAD(P)H. [Tamada М., et al. Modulation of glucose metabolism by CD44 contributes to antioxidant status and drug resistance in cancer cells. Cancer Res." 2012, 72(6), 1438-1448]. NAD(P)H участвует в активации ключевой анти-оксидантной защиты опухолевых клеток, активируя ферменты, поддерживающие синтез глутатиона [Gruning N-M & Raiser М. Sacrifice for survival "Nature", 2011, 480:190-191; Hamanaka R & Chandel N. Warburg effect and redox balance. "Science", 2011, 334: 1219-1220]. Однако NAD(P)H нельзя отнести к числу классических опухолевых маркеров, так как он синтезируется и в нормальных клетках. Тем не менее показатели эндогенной флуоресценции NAD(P)H/NADH in vitro можно использовать при прогнозировании процессов метастазирования in vivo [Xu H.N., Nioka S., Clickon J.D., Chance В., Li L.Z. Quantitative mitochondrial redox imaging of breast cancer metastatic potential. "J Biomedical. Optics", 2010, 15 (3): 136010].
Техническая задача, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, состоит в обеспечении возможности тестировать наличие злокачественных клеток и степень их устойчивости к повреждениям (степень злокачественности), проводя измерения на живых клетках без их окрашивания.
Поставленная задача решена тем, что предложен экспресс-способ определения риска злокачественности клеток, заключающийся в том, что из образца биопсии, полученной от субъекта, готовят клеточный отпечаток или суспензию клеток, в котором создают условия гипоксии, подвергают повторяющимся воздействиям повреждающего агента, выбранного из УФ-света, проводят спектро-флурометрическое исследование образца после повторяющегося воздействия УФ-светом, и в случае, если в темновых условиях обнаружен прирост интенсивности флуоресценции NAD(P)H, диагностируют клетки как злокачественные.
В качестве повреждающего агента можно использовать в частности УФ-свет, или иной агент, например химический или фармакологический.
Способность к более продолжительному выживанию злокачественных клеток в условиях гипоксии и повторяющихся повреждений (повышенную устойчивость) оценивают по неоднократно повторяющейся репарации пула NAD(P)H, характерной только для опухолевых клеток. Репарацию пула NAD(P)H в условиях гипоксии оценивают по приросту интенсивности NAD(P)H флуоресценции после кратковременного выдерживания исследуемого образца клеток в темновых условиях, нахождение в которых следует за повторяющимися повреждениями (в частности УФ-светом), и по количеству циклов репарации NAD(P)H флуоресценции и величине их прироста в каждом цикле оценивают in vitro потенциальную устойчивость различных опухолевых клеток. Это позволяет выявить высоко-устойчивые раковые клетки как показатели негативного опухолевого прогноза in vivo для той опухоли, из которой взят исследуемый образец.
Предлагаемый способ экспресс-определения злокачественности является неспецифическим и позволяет в течение нескольких минут выявить злокачественные клетки и установить степень их устойчивости для всех типов рака, как асцитных, так и солидных.
Предложенный способ экспресс-определения степени злокачественности и устойчивости раковых клеток заключается в том, что из образца биопсии готовят клеточный отпечаток или суспензию клеток, которым создают условия гипоксии и повторяющееся воздействие повреждающего агента, например УФ-света, и проводят спектро-флурометрическое исследование этих клеток в динамике развития процесса фотодеструкции NAD(P)H флуоресценции, и по приросту интенсивности флуоресценции NAD(P)H в темновых условиях, судят о наличии опухолевых клеток и их потенциальной устойчивости.
Условия гипоксии могут быть созданы путем помещения суспензии клеток или клеточного отпечатка между двумя стеклами, края которых залиты парафином, для последующих цитологических исследований. Спектрофлурометрическое исследование может быть проведено в диапазоне 440-470 нм, при длине волны возбуждения 365-370 нм.
Сущность изобретения заключается в том, что экспериментальным путем были установлены принципиальные различия в потенциальной устойчивости опухолевых и нормальных клеток к выживанию в условиях действия гипоксии и УФ-света. При этом выживание клеток оценивали, в частности, по изменению интенсивности NAD(P)H флуоресценции и способности, присущей только раковым клеткам, частично восстанавливать пул NAD(P)H в темновых условиях. Сущность изобретения поясняется графическими материалами, где на фиг. 1 показана типичная кривая изменения суммарной интенсивности флуоресценции при λ=460 nm (I460), характерная для перевиваемых опухолевых клеток асцитной карциномы Эрлиха (АКЭ), находящихся в условиях гипоксии при действии на них УФ-света (заштрихованные участки) и в темновых условиях (после выключения УФ-света; не заштрихованные участки). Суммарная интенсивность эндогенной флуоресценции живых клеток (в полосе 440-470 nm) обусловлена флуоресценцией двух основных флуоресцентных компонентов: 1) флуоресцирующими продуктами перекисного окисления липидов (ФППОЛ), которые высокочувствительны к УФ-индуцируемой фотодеструкции [после 0,5-1 мин действия УФ-света (λ-365 nm), флуоресценция от ФППОЛ не обнаруживается] и 2) пулом восстановленных NAD(P)H, интенсивность флуоресценции которых достигает максимальна в условиях гипоксии. Доля каждого из этих компонентов (в процентах) в общей полосе флуоресценции (с максимумом I460), характерная для большинства опухолевых АКЭ клеток, указана на шкале ординат.
А - кинетика фотодеструкции флуоресценции (I460) опухолевых АКЭ клеток, при постоянном действии УФ-света (λ-365 nm)
В - репарация пула NAD(P)H, измеряемая по приросту интенсивности NAD(P)H-флуоресценции после нахождения гипоксических опухолевых АКЭ клеток в темновых условиях [т.е. без повреждающего действия УФ-света (λ-365 nm)]. Величина прироста I460 (в процентах) после каждого цикла восстановления NAD(P)H флуоресценции, обозначена величиной стрелок, направленных вверх.
На фиг.2 показаны кинетические особенности I460 фотодеструкции лимфоцитов, выделенных из лимфоузла здоровых животных и помещенных в условия гипоксии. Для нормальных лимфоцитов характерна, перманентная фотодеструкция флуоресценции (при I460), которая наблюдалась, как при действии УФ-света (λ-365 nm) (заштрихованные участки), так и в темновых условиях (при выключении УФ-света; не заштрихованные участки). Величина I460 фотодеструкции обозначена величиной стрелок, направленных вниз, что указывает на низкую устойчивость нормальных лимфоидных клеток к выживанию в условиях гипоксии. Противоположный эффект характерен для опухолевых АКЭ клеток (фиг.1), обладающих повышенной потенциальной устойчивостью в аналогичных условиях гипоксии. Обнаруженные различия между поведением (а именно выживанием) опухолевых и нормальных клеток в условиях повреждения могут быть использованы in vitro как индикатор злокачественности, с помощью которого можно идентифицировать единичные опухолевые клетки, а также прогнозировать их выживаемость in vivo в гипоксических зонах опухоли.
На фиг.3 аналогичные исследования представлены для другого типа высокоагрессивных опухолевых клеток - асцитной гепатомы Зайделя (АГЗ) [изучались АГЗ клетки, находящиеся в асцитной жидкости и при их метастазировании в селезенку, а также нормальные спленоциты, окружающие метастаз (фиг.4)]. Асцитные АГЗ клетки, а также АГЗ клетки метастаза (Фиг.3) отличались высокой потенциальной устойчивостью к повреждающему действию гипоксии и УФ-света, так как они были способны в 3-5-кратному восстановлению пула NAD(P)H, оцениваемому по приросту интенсивности I460 [величина прироста обозначена цифрами (в %) и отмечена стрелками, направленными вверх]. Время действия УФ-света на АГЗ клетки и их нахождение в темновых условиях обозначено в секундах на шкале абсцисс.
на фиг.4 - представлены аналогичные спектро-флуоресцентные исследования клеток от тканевого отпечатка селезенки опухоленосителя (фиг.3), проведены в условиях гипоксии для спленоцитов т.е. нетрансформированных клеток селезенки, окружающих клетки АГЗ метастаза. Такие спленоциты характеризовались низкой потенциальной устойчивостью к повреждающему действию УФ-света, так как для них была характерна перманентная фотодеструкции флуоресценции NAD(P)H при λ=460 нм (I460), выявляемая (в %) как при действии УФ-света, так и в него отсутствии.
на фиг.5 представлены результаты спектро-флуоресцентных исследований клеток [из биопсии подмышечного лимфатического узла пациентки (46 лет)], которые были диагностированы как раковые. В условиях гипоксии, эти клетки проявляли способность восстанавливать NAD(P)H флуоресценцию в темновых условиях [при выключении УФ-света (не заштрихованные участки)], которая измерялось по приросту I460 (в %). Величина прироста I460 обозначена стрелкой, направленной вверх. Количество циклов NAD(P)H флуоресценции в таких клетках было невелико (всего 2 цикла), однако прирост интенсивности NAD(P)H флуоресценции в первом цикле был весьма значительным, что указывало на повышенную устойчивость клеток этого метастаза к выживанию в неблагоприятных условиях in vivo.
на фиг.6 представлены результаты спектро-флуоресцентных исследования той же суспензии клеток (из биопсийного материала пациентки), которые были диагностированы как не трансформированные. Для этих клеток была характерна перманентная УФ-индуцируемая фотодеструкция I460, как при действии УФ-света (заштрихованные участки), так и в отсутствие УФ-света (не заштрихованные участки). Для этих клеток также была типично увеличение содержания ФППОЛ (в %) и снижение доли базальной NAD(P)H флуоресценции (I460, шкала ординат).
Сущность изобретения поясняется также примером конкретного осуществления.
ПРИМЕР.
У больной К. (46 лет), с подозрением на развитие процессов метастазирования рака молочной железы в близлежащий лимфоузел, был взят биопсийный материал (в виде клеточной суспензии) для цитологического и гистологического исследования. Часть изъятого биопсийного образца была помещена во влажную, охлаждаемую камеру, с целью сохранения клеток во время их транспортировки в лабораторию. Выявление злокачественности и устойчивости клеток было проведено через 1,5 часа после изъятия клеточного материала. С этой целью исследуемую суспензию клеток помещали между предметным и покровными стеклами, края которых плотно запечатывали жидким парафином для создания условий гипоксии в изучаемых клетках. Далее на люминесцентном микроскопе МЛД-2, используя ртутную лампу сверхвысокого давления ДРШ-250-2 в качестве источника УФ-света (1-365 nm), проводили спектрофлуоресцентные исследования кинетики фотодеструкции I460 в анализируемых клетках, находящихся в условиях гипоксии при действии на них УФ-света и при его выключении (темновые условия). Проводили поиск клеток, которые обладали способностью к репарации интенсивности NAD(P)H флуоресценции (I460) в темновых условиях. Такие клетки диагностировались как злокачественные (раковые) [фиг.5, эффект указан стрелкой, направленной вверх]. Другие же клетки, для которых была характерна перманентная УФ-индуцируемая фотодеструкция, как при действии УФ-света, так и при отсутствии УФ-воздействия, диагностировались как не трансформированные (фиг.6). Полученные результаты представлены на фиг.5 и фиг. 6. Как видно из фиг.5 и фиг.6., в условиях сохраняющейся гипоксии, среди анализируемых клеток были обнаружены клетки (фиг.5), способные к приросту интенсивности NAD(P)H флуоресценции (I460) в темновых условиях, что позволяло идентифицировать их как злокачественные клетки. Эти клетки обнаруживали единичные циклы репарации NAD(P)H флуоресценции в темновых условиях (единичная стрелка вверх), что позволяло их идентифицировать как раковые клетки, хотя они и не обладали столь высокой потенциальной устойчивость к гипоксии как АГЗ клетки (Фиг.3). Весь процесс тестирования от момента создания условий гипоксии для исследуемых клеток до получения результатов анализа составил не более 5 минут.
Большинство анализируемых клеток в образце не проявляло способность к репарации NAD(P)H флуоресценции в темновых условиях (Фиг.6), что позволяло их отнести к не трансформированным клеткам.
Диагноз затем был подтвержден гистологически.
Таким образом, приведенные выше данные подтверждают возможность экспресс тестирования образцов (отпечатков или клеточных взвесей) на злокачественность и потенциальную устойчивость тестируемых опухолей к повреждающим воздействиям.
Claims (1)
- Способ определения риска злокачественности клеток, заключающийся в том, что из образца биопсии, полученного от субъекта, готовят клеточный отпечаток или суспензию клеток, в котором создают условия гипоксии, подвергают повторяющимся воздействиям повреждающего агента, выбранного из УФ-света, проводят спектрофлурометрическое исследование образца после повторяющегося воздействия УФ-светом, и в случае, если в темновых условиях обнаружен прирост интенсивности флуоресценции NAD(P)H, диагностируют клетки как злокачественные.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012129708/15A RU2508542C1 (ru) | 2012-07-16 | 2012-07-16 | Экспресс-способ определения риска злокачественности клеток |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012129708/15A RU2508542C1 (ru) | 2012-07-16 | 2012-07-16 | Экспресс-способ определения риска злокачественности клеток |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2012129708A RU2012129708A (ru) | 2014-01-27 |
| RU2508542C1 true RU2508542C1 (ru) | 2014-02-27 |
Family
ID=49956670
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2012129708/15A RU2508542C1 (ru) | 2012-07-16 | 2012-07-16 | Экспресс-способ определения риска злокачественности клеток |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2508542C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2786007C1 (ru) * | 2022-02-25 | 2022-12-15 | Федеральное Государственное Автономное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр нейрохирургии имени академика Н.Н. Бурденко" Министерства Здравоохранения Российской Федерации | Способ оценки злокачественности клеток в культурах глиомы |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2315312C2 (ru) * | 2002-08-01 | 2008-01-20 | Мтм Лабораториес Аг | Способ диагностики на основе раствора |
| RU2405158C2 (ru) * | 2003-08-25 | 2010-11-27 | Мтм Лабораториес Аг | Способ обнаружения неопластических заболеваний исходя из солюбилизированного физиологического образца |
| RU2409817C2 (ru) * | 2005-08-16 | 2011-01-20 | Дженентек, Инк. | Анализы и способы применения биомаркеров |
| RU2450273C2 (ru) * | 2006-06-20 | 2012-05-10 | Дженентек, Инк. | Способы и материалы для обнаружения апоптоза |
-
2012
- 2012-07-16 RU RU2012129708/15A patent/RU2508542C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2315312C2 (ru) * | 2002-08-01 | 2008-01-20 | Мтм Лабораториес Аг | Способ диагностики на основе раствора |
| RU2405158C2 (ru) * | 2003-08-25 | 2010-11-27 | Мтм Лабораториес Аг | Способ обнаружения неопластических заболеваний исходя из солюбилизированного физиологического образца |
| RU2409817C2 (ru) * | 2005-08-16 | 2011-01-20 | Дженентек, Инк. | Анализы и способы применения биомаркеров |
| RU2450273C2 (ru) * | 2006-06-20 | 2012-05-10 | Дженентек, Инк. | Способы и материалы для обнаружения апоптоза |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| HE N.XU et al. Quantitative mitochondrial redox imaging of breast cancer metastatic potential // Journal of Biomedical Optics, 2010, Vol.15(3), 136010. * |
| IRENE GEORGAKOUDI et al. NAD(P)H and collagen as in vivo quantitative fluorescent biomarkers of epithelial precancerous changes // Cancer Research, 2002, 62, 682-687. * |
| IRENE GEORGAKOUDI et al. NAD(P)H and collagen as in vivo quantitative fluorescent biomarkers of epithelial precancerous changes // Cancer Research, 2002, 62, 682-687. HE N.XU et al. Quantitative mitochondrial redox imaging of breast cancer metastatic potential // Journal of Biomedical Optics, 2010, Vol.15(3), 136010. * |
| ШВАРЦБУРГ П.М. Окислительный стресс во взаимодействии опухоли и организма: Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук. - Пущино, 1997, с.44. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2786007C1 (ru) * | 2022-02-25 | 2022-12-15 | Федеральное Государственное Автономное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр нейрохирургии имени академика Н.Н. Бурденко" Министерства Здравоохранения Российской Федерации | Способ оценки злокачественности клеток в культурах глиомы |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2012129708A (ru) | 2014-01-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zhao et al. | A red emitting mitochondria-targeted AIE probe as an indicator for membrane potential and mouse sperm activity | |
| JP5107943B2 (ja) | 細胞の表現型を特定するための方法および組成物 | |
| Khan et al. | Early diagnostic value of survivin and its alternative splice variants in breast cancer | |
| Nanni et al. | Endothelial NOS, estrogen receptor β, and HIFs cooperate in the activation of a prognostic transcriptional pattern in aggressive human prostate cancer | |
| Sun et al. | Sudan black B reduces autofluorescence in murine renal tissue | |
| Sukumaran et al. | Iron overload exacerbates age-associated cardiac hypertrophy in a mouse model of hemochromatosis | |
| Lin et al. | Increased expression of annexin A1 predicts poor prognosis in human hepatocellular carcinoma and enhances cell malignant phenotype | |
| EP2698634B1 (en) | Biomarker for breast cancer | |
| Shibasaki et al. | Expression of indocyanine green-related transporters in hepatocellular carcinoma | |
| Zhang et al. | Highly sensitive naphthalene-based two-photon fluorescent probe for in situ real-time bioimaging of ultratrace cyclooxygenase-2 in living biosystems | |
| Namisaki et al. | Differential expression of drug uptake and efflux transporters in Japanese patients with hepatocellular carcinoma | |
| Shimada et al. | ROS generation via NOX4 and its utility in the cytological diagnosis of urothelial carcinoma of the urinary bladder | |
| O’Brien et al. | Monitoring metabolic responses to chemotherapy in single cells and tumors using nanostructure-initiator mass spectrometry (NIMS) imaging | |
| CN103740360B (zh) | 荧光比率法检测次氯酸的荧光探针及其制备方法 | |
| Zhong et al. | Examining Nek2 as a better proliferation marker in non-small cell lung cancer prognosis | |
| Cao et al. | Clinical and biological significance of never in mitosis gene A-related kinase 6 (NEK6) expression in hepatic cell cancer | |
| Zhang et al. | Identification of Annexin A1 protein expression in human gastric adenocarcinoma using proteomics and tissue microarray | |
| Djirackor et al. | Nestin expression in primary and metastatic uveal melanoma–possible biomarker for high‐risk uveal melanoma | |
| CN106932579A (zh) | 一种基于液体活检的肝癌检测的试剂盒 | |
| CN106489074A (zh) | 作为转移性乳腺癌的生物标志物的s100p和透明质酸 | |
| Kim et al. | Carcinogenic activity of PbS quantum dots screened using exosomal biomarkers secreted from HEK293 cells | |
| Descazeaud et al. | Characterization of ZAG protein expression in prostate cancer using a semi‐automated microscope system | |
| Hao et al. | Long-chain fluorescent probe for straightforward and nondestructive staining mitochondria in fixed cells and tissues | |
| Silva et al. | Role of Ca, Fe, Cu and Zn in breast cancer: study by X‐ray fluorescence techniques and immunohistochemical analysis | |
| RU2508542C1 (ru) | Экспресс-способ определения риска злокачественности клеток |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20170717 |