RU2554499C2 - Method for measuring catecholamines and their metabolites with using solid-phase fluorescent biosensor - Google Patents
Method for measuring catecholamines and their metabolites with using solid-phase fluorescent biosensor Download PDFInfo
- Publication number
- RU2554499C2 RU2554499C2 RU2013123641/15A RU2013123641A RU2554499C2 RU 2554499 C2 RU2554499 C2 RU 2554499C2 RU 2013123641/15 A RU2013123641/15 A RU 2013123641/15A RU 2013123641 A RU2013123641 A RU 2013123641A RU 2554499 C2 RU2554499 C2 RU 2554499C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- biosensor
- metabolites
- catecholamines
- chitosan
- concentration
- Prior art date
Links
- 150000003943 catecholamines Chemical class 0.000 title claims abstract description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 title claims abstract description 20
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 title abstract description 7
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 19
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 claims abstract description 18
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims abstract description 12
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 5
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims abstract description 4
- 235000011330 Armoracia rusticana Nutrition 0.000 claims abstract description 3
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 claims abstract description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- 230000005284 excitation Effects 0.000 claims description 7
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 claims description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 6
- 229910052724 xenon Inorganic materials 0.000 claims description 6
- FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N xenon atom Chemical compound [Xe] FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 claims description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 2
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 claims 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 claims 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 abstract description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 9
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 abstract description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 abstract description 6
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 abstract description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 5
- PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N Ethylenediamine Chemical compound NCCN PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 abstract 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 abstract 1
- 125000001567 quinoxalinyl group Chemical class N1=C(C=NC2=CC=CC=C12)* 0.000 abstract 1
- 238000007493 shaping process Methods 0.000 abstract 1
- UCTWMZQNUQWSLP-UHFFFAOYSA-N adrenaline Chemical compound CNCC(O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 UCTWMZQNUQWSLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N dopamine Chemical compound NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 229960003638 dopamine Drugs 0.000 description 7
- 108010029541 Laccase Proteins 0.000 description 4
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 4
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- -1 tris (4,7-diphenyl-1,10-phenanthroline) ruthenium (II) dodecyl sulfate Chemical compound 0.000 description 2
- WOAHJDHKFWSLKE-UHFFFAOYSA-N 1,2-benzoquinone Chemical compound O=C1C=CC=CC1=O WOAHJDHKFWSLKE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012327 Ruthenium complex Substances 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- 238000012742 biochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- WZHCOOQXZCIUNC-UHFFFAOYSA-N cyclandelate Chemical class C1C(C)(C)CC(C)CC1OC(=O)C(O)C1=CC=CC=C1 WZHCOOQXZCIUNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 229930003935 flavonoid Natural products 0.000 description 1
- 235000017173 flavonoids Nutrition 0.000 description 1
- 150000002215 flavonoids Chemical class 0.000 description 1
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 1
- 229960004275 glycolic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000013307 optical fiber Substances 0.000 description 1
- 230000036284 oxygen consumption Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 150000003252 quinoxalines Chemical class 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области медицины и может быть применено для определения катехоламинов и их метаболитов в объектах на основе матриц сложного состава, в том числе нерастворимых в воде, без их дополнительной пробоподготовки.The invention relates to medicine and can be used to determine catecholamines and their metabolites in objects based on matrices of complex composition, including insoluble in water, without additional sample preparation.
Определение катехоламинов (КА) (допамин (ДА), адреналин (АД)) и их метаболитов (гомованилиновая и ванилилминдальная кислоты (ГВК и ВМК соответственно)) в биологических жидкостях и тканях человека является актуальной задачей современного химического анализа. Значимая проблема при определении перечисленных соединений в реальных биообъектах заключается в необходимости проведения дополнительной пробоподготовки анализируемого образца (использование токсичных или агрессивных органических растворителей, фильтрование, разделение), что существенно увеличивает погрешность результатов измерений и усложняет процедуру анализа. Перспективный подход к решению перечисленных проблем заключается в создании твердофазных оптических сенсоров, основанных на формировании и измерении аналитического сигнала не в растворе, а непосредственно на поверхности - в чувствительном слое сенсора, содержащем распознающие элементы (компоненты индикаторной системы, в том числе ферменты). Согласно исследованиям в областях, смежных биохимическому анализу, катехоламины и их метаболиты необходимо определять на наномолярном уровне и ниже. По этой причине наибольший интерес представляет разработка твердофазных оптических сенсоров с высокочувствительным детектированием отклика чувствительного слоя методом флуориметрии.Determination of catecholamines (CA) (dopamine (DA), adrenaline (AD)) and their metabolites (homovanilic and vanillyl mandelic acids (GVK and IUD, respectively)) in biological fluids and human tissues is an urgent task of modern chemical analysis. A significant problem in the determination of these compounds in real biological objects is the need for additional sample preparation of the analyzed sample (the use of toxic or aggressive organic solvents, filtering, separation), which significantly increases the error of the measurement results and complicates the analysis procedure. A promising approach to solving these problems is to create solid-phase optical sensors based on the formation and measurement of the analytical signal not in solution, but directly on the surface - in the sensitive layer of the sensor containing recognition elements (components of the indicator system, including enzymes). According to studies in areas related to biochemical analysis, catecholamines and their metabolites must be determined at the nanomolar level and below. For this reason, the development of solid-phase optical sensors with highly sensitive detection of the response of the sensitive layer by fluorimetry is of greatest interest.
Известен способ определения адреналина с помощью оптоволоконного флуоресцентного биосенсора на основе фермента - лакказы, иммобилизованной в матрице {тетрааминофталоцианин меди - Fe3O4} (Huang J., Fang H., Liu С., Gu E., Jiang D. A novel fiber optic biosensor for the determination of adrenaline based on immobilized laccase catalysis. Anal. Lett. 2008. V.41. №8. P.1430-1442). Сенсор представляет собой ячейку, в которую помещена матрица, содержащая иммобилизованную лакказу, а также отделенные от нее тефлоновой мембраной частицы додецилсульфата трис(4,7-дифенил-1,10-фенантролин) рутения (II). Через прозрачное окошко ячейка контактирует с оптическим волокном. Действие сенсора основано на реакции окисления фенола кислородом в присутствии лакказы до o-хинона, приводящей к потреблению кислорода в системе. Аналитическим сигналом служит уменьшение интенсивности флуоресценции комплекса рутения в присутствии кислорода. Аналитический сигнал регистрируют в режиме отражения непосредственно в растворе (λех=450 нм, λem=600 нм). Однако измерение аналитического сигнала непосредственно в растворе не позволяет анализировать непрозрачные и мутные среды без их дополнительной пробоподготовки (растворение в токсичных органических растворителях, экстракция, фильтрование).A known method for determining adrenaline using a fiber-optic fluorescent biosensor based on the enzyme laccase immobilized in a matrix {copper tetraaminophthalocyanine - Fe 3 O 4 } (Huang J., Fang H., Liu C., Gu E., Jiang D. A novel fiber optic biosensor for the determination of adrenaline based on immobilized laccase catalysis. Anal. Lett. 2008. V.41. No. 8. P.1430-1442). The sensor is a cell in which a matrix containing immobilized laccase is placed, as well as tris (4,7-diphenyl-1,10-phenanthroline) ruthenium (II) dodecyl sulfate particles separated from it by a teflon membrane. Through a transparent window, the cell is in contact with the optical fiber. The effect of the sensor is based on the reaction of phenol oxidation with oxygen in the presence of laccase to o-quinone, which leads to oxygen consumption in the system. An analytical signal is a decrease in the fluorescence intensity of the ruthenium complex in the presence of oxygen. Analytical signal recorded in the reflection mode, directly in solution (λ ex = 450nm, λ em = 600 nm). However, the measurement of the analytical signal directly in the solution does not allow the analysis of opaque and turbid media without additional sample preparation (dissolution in toxic organic solvents, extraction, filtration).
Известен принятый за прототип способ определения фенола, простейших изомерных o- и n-дифенольных соединений и флавоноидов с использованием твердофазных спектрофотометрических биосенсоров на основе оптически прозрачных пленок {хитозан-пероксидаза}, закрепленных на поверхности стеклянных пластинок (I.A. Veselova, L.I. Malinina, P.V. Rodionov, T.N. Shekhovtsova. Properties and analytical application of self-assembled complex {peroxidase-chitosan}. Talanta 102 (2012) 101-109). Действие биосенсора основано на ферментативном окислении фенольного соединения (до соответствующего o- или n-хинона) и последующем взаимодействии продукта окисления с хитозаном с образованием аддукта Михаэля, характеризующегося максимумом поглощения в области 345-355 нм. Формирование чувствительного слоя биосенсора осуществляют равномерным нанесением смеси {хитозан-пероксидаза} на поверхность горизонтально расположенной стеклянной пластинки и ее последующем высушивании на воздухе при комнатной температуре. Для проведения индикаторной реакции биосенсор выдерживают необходимое время в реакционной системе. Для измерения аналитического сигнала биосенсор извлекают из раствора, высушивают на воздухе при комнатной температуре и далее закрепляют на фронтальной поверхности кюветного отделения спектрофотометра. Аналитический сигнал регистрируют в режиме поглощения относительно чистой стеклянной пластинки. Окисление пероксидом водорода (H2O2, 1 мМ) проводят в 5 мМ фосфатном буферном растворе pH 6.5 в присутсвии пероксидазы из корней хрена (10 нМ) при комнатной температуре в течение 24 ч. Однако низкая технологичность указанного процесса обусловливается длительностью времени проведения анализа, кроме того, описанный спектрофотометрический биосенсор позволяет определять фенольные соединения на уровне не ниже микромолярного, а также не позволяет определять катехоламины и их метаболиты.A known method adopted for the prototype is the determination of phenol, the simplest isomeric o- and n-diphenol compounds and flavonoids using solid-phase spectrophotometric biosensors based on optically transparent films {chitosan peroxidase}, mounted on the surface of glass plates (IA Veselova, LI Malinina, PV Rodionov, TN Shekhovtsova. Properties and analytical application of self-assembled complex {peroxidase-chitosan}. Talanta 102 (2012) 101-109). The action of the biosensor is based on the enzymatic oxidation of the phenolic compound (to the corresponding o- or n-quinone) and the subsequent interaction of the oxidation product with chitosan with the formation of a Michael adduct, characterized by a maximum absorption in the region of 345-355 nm. The formation of a sensitive layer of the biosensor is carried out by uniformly applying a mixture of {chitosan peroxidase} on the surface of a horizontally placed glass plate and its subsequent drying in air at room temperature. To carry out an indicator reaction, the biosensor can withstand the necessary time in the reaction system. To measure the analytical signal, the biosensor is removed from the solution, dried in air at room temperature and then fixed on the front surface of the cuvette compartment of the spectrophotometer. An analytical signal is recorded in the absorption mode of a relatively clean glass plate. Oxidation with hydrogen peroxide (H 2 O 2 , 1 mM) is carried out in a 5 mM phosphate buffer solution pH 6.5 in the presence of peroxidase from horseradish roots (10 nM) at room temperature for 24 hours. However, the low processability of this process is due to the length of time the analysis takes place, in addition, the described spectrophotometric biosensor allows one to determine phenolic compounds at a level not lower than micromolar, and also does not allow to determine catecholamines and their metabolites.
Предлагаемое изобретение решает задачу простого и чувствительного определения катехоламинов и их метаболитов в объектах, анализ которых с использованием оптических методов детектирования по инструментальным причинам был ранее затруднен или невозможен вследствие мешающего влияния матрицы реального объекта, а также недостаточной чувствительности и воспроизводимости биосенсоров.The present invention solves the problem of simple and sensitive determination of catecholamines and their metabolites in objects whose analysis using optical detection methods for instrumental reasons was previously difficult or impossible due to the interfering effect of the matrix of the real object, as well as insufficient sensitivity and reproducibility of biosensors.
Поставленная задача решается изменением принципиальной схемы формирования и измерения аналитического сигнала - переходом к твердофазной флуоресценции. Новизна при этом заключается в том, что компоненты индикаторной реакции иммобилизованы в чувствительном слое на поверхности биосенсора, в результате флуоресцентный сигнал формируется и регистрируется непосредственно на твердой поверхности в режиме отражения. Действие предложенного авторами биосенсора основано на реакции ферментативной дериватизации катехоламинов и их метаболитов с органическими аминами (o-фенилендиамином, этилендиамином) с образованием производных хиноксалина, флуоресцирующих в области 450-550 нм.The problem is solved by changing the concept of the formation and measurement of the analytical signal - the transition to solid-phase fluorescence. In this case, the novelty lies in the fact that the components of the indicator reaction are immobilized in a sensitive layer on the surface of the biosensor, as a result a fluorescent signal is generated and recorded directly on a solid surface in reflection mode. The action of the biosensor proposed by the authors is based on the reaction of the enzymatic derivatization of catecholamines and their metabolites with organic amines (o-phenylenediamine, ethylenediamine) to form quinoxaline derivatives fluorescent in the region of 450-550 nm.
Наибольшую интенсивность флуоресцентного сигнала получают при использовании в качестве дериватизирующего агента o-фенилендиамина и проведении процесса при концентрации пероксидазы хрена - 10-25 нМ; концентрации пероксида водорода - 250-500 мкМ; концентрации o-фенилендиамина - 50-100 мкМ; концентрации катехоламинов и метаболитов - 5-2000 нМ. В качестве буферного раствора берут 5 мМ фосфатный буферный раствор pH 9.5-10.0. Чувствительный слой биосенсора представляет собой двухслойную пленку {хитозан - o-фенилендиамин/хитозан - пероксидаза}, нанесенную ровным слоем на поверхность стеклянной пластинки (14×40 мм). Объем смеси {хитозан - o-фенилендиамин} - 100 мкл, объем смеси {хитозан - пероксидаза} - 150 мкл, объемная доля хитозана в пленке 95%. Биосенсор устанавливают в кюветном отделении флуориметра перед отражающей поверхностью (зеркальная пластинка 14×40 мм) под углом 75 градусов относительно источника возбуждения (ксеноновая лампа).The highest fluorescence signal intensity is obtained when o-phenylenediamine is used as a derivatizing agent and the process is carried out at a concentration of horseradish peroxidase of 10-25 nM; the concentration of hydrogen peroxide is 250-500 μm; the concentration of o-phenylenediamine - 50-100 μm; the concentration of catecholamines and metabolites is 5-2000 nM. As a buffer solution take 5 mm phosphate buffer solution pH 9.5-10.0. The sensitive layer of the biosensor is a two-layer film {chitosan - o-phenylenediamine / chitosan - peroxidase}, applied evenly on the surface of a glass plate (14 × 40 mm). The volume of the mixture {chitosan - o-phenylenediamine} is 100 μl, the volume of the mixture {chitosan - peroxidase} is 150 μl, the volume fraction of chitosan in the film is 95%. The biosensor is installed in the cuvette compartment of the fluorimeter in front of the reflective surface (mirror plate 14 × 40 mm) at an angle of 75 degrees relative to the excitation source (xenon lamp).
Нами впервые был предложен подход, заключающийся в иммобилизации дериватизирующих агентов (o-фенилендиамина, этилендиамина) в хитозановой пленке на поверхности стекла и регистрации флуоресцентного сигнала непосредственно на твердой поверхности в чувствительном слое сенсора, что позволяет проводить анализ в непрозрачных и мутных средах.We were the first to propose an approach consisting in the immobilization of derivatizing agents (o-phenylenediamine, ethylenediamine) in a chitosan film on a glass surface and recording a fluorescent signal directly on a solid surface in a sensitive layer of the sensor, which allows analysis in opaque and turbid media.
Технический результат предлагаемого изобретения при этом состоит в улучшении технологичности процесса из-за исключения необходимости проведения дополнительной пробоподготовки анализируемого образца (кроме разбавления); чувствительность по сравнению с аналогом и прототипом возрастает до 3-70 нМ; время анализа сокращается до 30 с.The technical result of the invention in this case consists in improving the manufacturability of the process due to the elimination of the need for additional sample preparation of the analyzed sample (except for dilution); sensitivity in comparison with analog and prototype increases to 3-70 nM; analysis time is reduced to 30 s.
Анализ известных технических решений позволяет сделать вывод о том, что предлагаемое изобретение не известно из уровня техники, что свидетельствует о его соответствии критерию "новизна".Analysis of the known technical solutions allows us to conclude that the invention is not known from the prior art, which indicates its compliance with the criterion of "novelty."
Сущность настоящего изобретения для специалистов не следует явным образом из уровня техники, что позволяет сделать вывод о его соответствии критерию "изобретательский уровень".The essence of the present invention for specialists does not follow explicitly from the prior art, which allows us to conclude that it meets the criterion of "inventive step".
Возможность проведения способа на традиционном оборудовании с достижением поставленной задачи свидетельствует о соответствии изобретения критерию "промышленная применимость".The possibility of carrying out the method on traditional equipment with the achievement of the task indicates the compliance of the invention with the criterion of "industrial applicability".
На фиг.1 представлена схема формирования чувствительного слоя биосенсора.Figure 1 presents a diagram of the formation of a sensitive layer of a biosensor.
На фиг.2 представлена схема проведения индикаторной реакции.Figure 2 presents a diagram of an indicator reaction.
На фиг.3 представлена схема измерения аналитического сигнала с использованием оптического биосенсора.Figure 3 presents the measuring circuit of the analytical signal using an optical biosensor.
На фиг.4 представлены спектры флуоресценции чувствительного слоя биосенсора в отсутствие (1) и в присутствии АД (2) (сАД - 0.5 мкМ; время реакции 30 с).Figure 4 shows the fluorescence spectra of the sensitive layer of the biosensor in the absence of (1) and in the presence of AD (2) (sAD - 0.5 μM; reaction time 30 s).
Приведенные примеры подтверждают, но не ограничивают заявляемое изобретение.The above examples confirm, but do not limit, the claimed invention.
Пример 1. Способ получения в чувствительном слое биосенсора 2,3-бензо-7-метиламин-хиноксалина, флуоресцирующего производного катехоламинов, на примере ферментативной дериватизации ДА с o-фенилендиаминомExample 1. The method of obtaining in a sensitive layer of a biosensor of 2,3-benzo-7-methylamine-quinoxaline, a fluorescent derivative of catecholamines, by the example of enzymatic derivatization of DA with o-phenylenediamine
В качестве производного катехоламинов был взят допамин (ДА). Реакцию дериватизации ДА с o-фенилендиамином проводили по следующей методике: в стеклянную пробирку последовательно вводили 4.8 мл 5 мМ фосфатного буферного раствора (pH 9.5), раствор ДА (0.2-2.0 мкМ в системе) и 0.100 мл 25 мМ раствора Н2О2 (0.5 мМ в системе). Реакционную смесь тщательно перемешивали и погружали в нее биосенсор, чувствительный слой которого содержал пероксидазу (25 нМ в системе) и o-фенилендиамин (100 мкМ в системе). Биосенсор выдерживали в реакционной системе в течение 30 с, извлекали и высушивали на воздухе при комнатной температуре. Для измерения аналитического сигнала биосенсор устанавливали в кюветном отделении флуориметра перед отражающей поверхностью (зеркальная пластинка) под углом 75 градусов относительно источника возбуждения (ксеноновая лампа) и регистрировали интенсивность флуоресценции чувствительного слоя (λех=440-450 нм, λem=520 нм). Предел обнаружения - 70 нМ.Dopamine (DA) was taken as a derivative of catecholamines. The derivatization reaction of DA with o-phenylenediamine was carried out according to the following procedure: 4.8 ml of a 5 mM phosphate buffer solution (pH 9.5), a DA solution (0.2-2.0 μM in the system) and 0.100 ml of a 25 mM H 2 O 2 solution (sequentially) were introduced into a glass tube 0.5 mM in the system). The reaction mixture was thoroughly mixed and a biosensor was immersed in it, the sensitive layer of which contained peroxidase (25 nM in the system) and o-phenylenediamine (100 μM in the system). The biosensor was kept in the reaction system for 30 s, removed and dried in air at room temperature. To measure the analytical signal, the biosensor was installed in the cuvette compartment of the fluorimeter in front of the reflecting surface (mirror plate) at an angle of 75 degrees relative to the excitation source (xenon lamp) and the fluorescence intensity of the sensitive layer was recorded (λ ex = 440-450 nm, λ em = 520 nm). The detection limit is 70 nM.
Пример 2. Способ получения в чувствительном слое биосенсора 2,3-бензо-7-гидроксиметиламин-хиноксалина, флуоресцирующего производного катехоламинов, на примере ферментативной дериватизации АД с o-фенилендиаминомExample 2. The method of obtaining in a sensitive layer of a biosensor of 2,3-benzo-7-hydroxymethylamine-quinoxaline, a fluorescent derivative of catecholamines, by the example of enzymatic derivatization of blood pressure with o-phenylenediamine
В качестве производного катехоламинов был взят адреналин (АД). Реакцию дериватизации АД с o-фенилендиамином проводили по следующей методике: в стеклянную пробирку последовательно вводили 4.8 мл 5 мМ фосфатного буферного раствора (pH 9.75), раствор АД (0.1-1.0 мкМ в системе) и 0.070 мл 25 мМ раствора H2O2 (0.35 мМ в системе). Реакционную смесь тщательно перемешивали и погружали в нее биосенсор, чувствительный слой которого содержал пероксидазу (25 нМ в системе) и o-фенилендиамин (100 мкМ в системе). Биосенсор выдерживали в реакционной системе в течение 30 с, извлекали и высушивали на воздухе при комнатной температуре. Для измерения аналитического сигнала биосенсор устанавливали в кюветном отделении флуориметра перед отражающей поверхностью (зеркальная пластинка) под углом 75 градусов относительно источника возбуждения (ксеноновая лампа) и регистрировали интенсивность флуоресценции чувствительного слоя (λex=440-450 нм, λem=540 нм). Предел обнаружения - 50 нМ.Adrenaline (AD) was taken as a derivative of catecholamines. BP reaction is derivatization with o-phenylenediamine was performed by the following procedure: a glass tube was added successively 4.8 ml of 5 mM phosphate buffer solution (pH 9.75), BP solution (0.1-1.0 M in the system) and 0.070 ml of 25 mM H 2 O 2 solution ( 0.35 mm in the system). The reaction mixture was thoroughly mixed and a biosensor was immersed in it, the sensitive layer of which contained peroxidase (25 nM in the system) and o-phenylenediamine (100 μM in the system). The biosensor was kept in the reaction system for 30 s, removed and dried in air at room temperature. To measure the analytical signal, the biosensor was installed in the cuvette compartment of the fluorimeter in front of the reflecting surface (mirror plate) at an angle of 75 degrees relative to the excitation source (xenon lamp) and the fluorescence intensity of the sensitive layer was recorded (λ ex = 440-450 nm, λ em = 540 nm). The detection limit is 50 nM.
Пример 3. Способ получения в чувствительном слое биосенсора 2,3-бензо-хиноксалин-7-уксусной кислоты, флуоресцирующего производного метаболитов катехоламинов, на примере ферментативной дериватизации ГВК с o-фенилендиаминомExample 3. The method of obtaining in a sensitive layer of a biosensor of 2,3-benzo-quinoxaline-7-acetic acid, a fluorescent derivative of catecholamine metabolites, by the example of enzymatic derivatization of GVK with o-phenylenediamine
В качестве производного метаболитов катехоламинов была взята гомованилиновая кислота (ГВК). Реакцию дериватизации ГВК с o-фенилендиамином проводили по следующей методике: в стеклянную пробирку последовательно вводили 4.8 мл 5 мМ фосфатного буферного раствора (pH 10.0), раствор ГВК (10-100 нМ в системе) и 0.050 мл 25 мМ раствора H2O2 (0.25 мМ в системе). Реакционную смесь тщательно перемешивали и погружали в нее биосенсор, чувствительный слой которого содержал пероксидазу (10 нМ в системе) и o-фенилендиамин (100 мкМ в системе). Биосенсор выдерживали в реакционной системе в течение 30 с, извлекали и высушивали на воздухе при комнатной температуре. Для измерения аналитического сигнала биосенсор устанавливали в кюветном отделении флуориметра перед отражающей поверхностью (зеркальная пластинка) под углом 75 градусов относительно источника возбуждения (ксеноновая лампа) и регистрировали интенсивность флуоресценции чувствительного слоя (λех=440-450 нм, λem=540 нм). Предел обнаружения - 5 нМ.Homovanilinic acid (HVA) was taken as a derivative of catecholamine metabolites. The derivatization of GVA with o-phenylenediamine was carried out according to the following procedure: 4.8 ml of a 5 mM phosphate buffer solution (pH 10.0), a GVA solution (10-100 nM in the system) and 0.050 ml of a 25 mM H 2 O 2 solution were sequentially introduced into a glass tube 0.25 mM in the system). The reaction mixture was thoroughly mixed and a biosensor was immersed in it, the sensitive layer of which contained peroxidase (10 nM in the system) and o-phenylenediamine (100 μM in the system). The biosensor was kept in the reaction system for 30 s, removed and dried in air at room temperature. To measure the analytical signal, the biosensor was installed in the cuvette compartment of the fluorimeter in front of the reflecting surface (mirror plate) at an angle of 75 degrees relative to the excitation source (xenon lamp) and the fluorescence intensity of the sensitive layer was recorded (λ ex = 440-450 nm, λ em = 540 nm). The detection limit is 5 nM.
Пример 4. Способ получения в чувствительном слое биосенсора 2,3-бензо-хиноксалин-7-гидроксиуксусной кислоты, флуоресцирующего производного метаболитов катехоламинов, на примере ферментативной дериватизации ВМК с o-фенилендиаминомExample 4. A method of obtaining in a sensitive layer of a biosensor of 2,3-benzo-quinoxaline-7-hydroxyacetic acid, a fluorescent derivative of catecholamine metabolites, by the example of enzymatic derivatization of BMC with o-phenylenediamine
В качестве производного метаболитов катехоламинов была взята ванилилминдальная кислота (ВМК). Реакцию дериватизации ВМК с o-фенилендиамином проводили по следующей методике: в стеклянную пробирку последовательно вводили 4.8 мл 5 мМ фосфатного буферного раствора (pH 9.5), раствор ВМК (5-75 нМ в системе) и 0.070 мл 25 мМ раствора H2O2 (0.35 мМ в системе). Реакционную смесь тщательно перемешивали и погружали в нее биосенсор, чувствительный слой которого содержал пероксидазу (10 нМ в системе) и o-фенилендиамин (50 мкМ в системе). Биосенсор выдерживали в реакционной системе в течение 30 с, извлекали и высушивали на воздухе при комнатной температуре. Для измерения аналитического сигнала биосенсор устанавливали в кюветном отделении флуориметра перед отражающей поверхностью (зеркальная пластинка) под углом 75 градусов относительно источника возбуждения (ксеноновая лампа) и регистрировали интенсивность флуоресценции чувствительного слоя (λex=440-450 нм, λem=530 нм). Предел обнаружения - 3 нМ.As a derivative of catecholamine metabolites, vanillyl mindic acid (IUD) was taken. The BMC derivatization reaction with o-phenylenediamine was carried out according to the following procedure: 4.8 ml of a 5 mM phosphate buffer solution (pH 9.5), a BMC solution (5-75 nM in the system) and 0.070 ml of a 25 mM H 2 O 2 solution (sequentially) were introduced into a glass tube 0.35 mm in the system). The reaction mixture was thoroughly mixed and a biosensor was immersed in it, the sensitive layer of which contained peroxidase (10 nM in the system) and o-phenylenediamine (50 μM in the system). The biosensor was kept in the reaction system for 30 s, removed and dried in air at room temperature. To measure the analytical signal, the biosensor was installed in the cuvette compartment of the fluorimeter in front of the reflecting surface (mirror plate) at an angle of 75 degrees relative to the excitation source (xenon lamp) and the fluorescence intensity of the sensitive layer was recorded (λ ex = 440-450 nm, λ em = 530 nm). The detection limit is 3 nM.
Как видно из приведенных примеров, предлагаемое изобретение решает задачу получения флуоресцирующих производных катехоламинов и их метаболитов непосредственно в чувствительном слое твердофазного оптического биосенсора.As can be seen from the above examples, the present invention solves the problem of obtaining fluorescent derivatives of catecholamines and their metabolites directly in the sensitive layer of a solid-phase optical biosensor.
Claims (4)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013123641/15A RU2554499C2 (en) | 2013-05-23 | 2013-05-23 | Method for measuring catecholamines and their metabolites with using solid-phase fluorescent biosensor |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013123641/15A RU2554499C2 (en) | 2013-05-23 | 2013-05-23 | Method for measuring catecholamines and their metabolites with using solid-phase fluorescent biosensor |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2013123641A RU2013123641A (en) | 2014-11-27 |
| RU2554499C2 true RU2554499C2 (en) | 2015-06-27 |
Family
ID=53381243
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013123641/15A RU2554499C2 (en) | 2013-05-23 | 2013-05-23 | Method for measuring catecholamines and their metabolites with using solid-phase fluorescent biosensor |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2554499C2 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2708917C2 (en) * | 2017-09-29 | 2019-12-12 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | Test system for determining low-molecular markers of neurotransmitter metabolism in samples of biological fluids, method for production thereof and method for determining catecholamines and metabolites using thereof |
| RU2800474C1 (en) * | 2022-05-06 | 2023-07-21 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Санкт-Петербургский государственный университет" (СПбГУ) | Method of preparing urine samples based on the principles of micellar extraction for determining the content of adrenaline |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117589675B (en) * | 2023-11-21 | 2025-09-05 | 优彩科技(湖北)有限公司 | Catecholamine detection method, detection probe and detection sensor |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2207377C2 (en) * | 2000-11-02 | 2003-06-27 | Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН | Biosensor system for assay of 2,4-dinitrophenol and nitrite ion and biosensors for this system |
-
2013
- 2013-05-23 RU RU2013123641/15A patent/RU2554499C2/en active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2207377C2 (en) * | 2000-11-02 | 2003-06-27 | Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН | Biosensor system for assay of 2,4-dinitrophenol and nitrite ion and biosensors for this system |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| VESELOVA I.A. et al. Properties and analytical application of self-assembled complex { peroxidase-chitosan} . Talanta 102 (2012) 101-109. * |
| СИДОРОВА А.А. и др. Хроматографическое и электрофоретическое определение катехоламинов, метанефринов и 3,4-дигидроксифенилаланина в моче и плазме крови. Сорбционные и хроматографические процессы. 2009. Т. 9. Вып. 6. с. 774-782. МЯСНИКОВА Д.А. и др. Оптический сенсор на основе композита { пероксидаза-целлюлоза-ионная жидкость} для определения катехоламинов. Всероссийская конференция по аналитической спектроскопии с международным участием. г. Краснодар, 20012. Biosensors for the rapid detection of dopamine using bilayer lipid membranes (BLMs) with incorporated calyx[4]resorcinarene receptor. Nikolelis Dimitrios P., Petropoulou Syrago-Styliani E., Pergel Eva, Toth Klara. Electroanalysis. 2002. 14, N 11, с. 783"789. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2708917C2 (en) * | 2017-09-29 | 2019-12-12 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | Test system for determining low-molecular markers of neurotransmitter metabolism in samples of biological fluids, method for production thereof and method for determining catecholamines and metabolites using thereof |
| RU2800474C1 (en) * | 2022-05-06 | 2023-07-21 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Санкт-Петербургский государственный университет" (СПбГУ) | Method of preparing urine samples based on the principles of micellar extraction for determining the content of adrenaline |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2013123641A (en) | 2014-11-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Arabi et al. | Label-free SERS detection of Raman-Inactive protein biomarkers by Raman reporter indicator: Toward ultrasensitivity and universality | |
| Narimani et al. | Trend in creatinine determining methods: Conventional methods to molecular‐based methods | |
| Babu et al. | Conventional and nanotechnology based sensors for creatinine (A kidney biomarker) detection: A consolidated review | |
| Kong et al. | A paper disk equipped with graphene/polyaniline/Au nanoparticles/glucose oxidase biocomposite modified screen-printed electrode: Toward whole blood glucose determination | |
| Gabriel et al. | Highly sensitive colorimetric detection of glucose and uric acid in biological fluids using chitosan-modified paper microfluidic devices | |
| US7323315B2 (en) | Method for reducing effect of hematocrit on measurement of an analyte in whole blood | |
| He et al. | An ultra-fast illuminating fluorescent probe for monitoring formaldehyde in living cells, shiitake mushrooms, and indoors | |
| Tang et al. | Ratiometric fluorescence capillary sensor-integrated molecular imprinting for simultaneous detection of two biological indicators of Parkinson’s disease | |
| CN105940300B (en) | Devices for detecting hyperammonemia and methods of using such devices | |
| Arsawiset et al. | Ready-to-use, functionalized paper test strip used with a smartphone for the simultaneous on-site detection of free chlorine, hydrogen sulfide and formaldehyde in wastewater | |
| Worrall et al. | Portable method of measuring gaseous acetone concentrations | |
| Li et al. | Mapping hydrogen sulfide in rats with a novel azo-based fluorescent probe | |
| El Hassani et al. | Development of a highly sensitive and selective molecularly imprinted electrochemical sensor for sulfaguanidine detection in honey samples | |
| Chen et al. | A homogeneous capillary fluorescence imprinted nanozyme intelligent sensing platform for high sensitivity and visual detection of triclocarban | |
| Yuan et al. | A novel formaldehyde fluorescent probe based on 1, 8-naphthalimide derivative and its application in living cell | |
| Luo et al. | A novel dual-activatable ultrasensitive chemiluminescent probe for mercury (II) monitoring: from rational design to multiple application | |
| RU2554499C2 (en) | Method for measuring catecholamines and their metabolites with using solid-phase fluorescent biosensor | |
| CN106544007B (en) | Hypochlorous fluorescence probe and its application in a kind of detection biosystem | |
| CN103472041A (en) | Use method for creatinine content detection kit | |
| Tjandra et al. | Polydiacetylene/copolymer sensors to detect lung cancer breath volatile organic compounds | |
| Tarannum et al. | Paper based molecularly imprinted SERS substrate for early detection of lysophosphatidic acid in ovarian cancer | |
| Li et al. | Converting commonly-used paper into nano-engineered fluorescent biomass-based platform for rapid ClO− quantitative detection in living cells and water sources | |
| Qin et al. | One-step synthesized multisize AuAg alloy nanoparticles with high SERS sensitivity in directly detecting SARS-CoV-2 spike protein | |
| JP2010513935A5 (en) | ||
| CN108169196B (en) | A method for rapid detection of fluoride ions in the environment |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HZ9A | Changing address for correspondence with an applicant |