RU2553561C2

RU2553561C2 - Средства ингибирования экспрессии протеинкиназы 3

Info

Publication number: RU2553561C2
Application number: RU2009106071/10A
Authority: RU
Inventors: Йорг КАУФМАНН; Оливер КАЙЛЬ; Ансгар ЗАНТЕЛЬ
Original assignee: Сайленс Терапьютикс Аг
Priority date: 2006-07-21
Filing date: 2007-07-20
Publication date: 2015-06-20
Also published as: WO2008009477A2; JP2009544281A; KR101670085B1; CN102321626B; CA2658550C; US8232256B2; WO2008009477A3; JP2015128433A; RU2009106071A; CN104531701A; KR20090039715A; EP2546337A1; JP2013172714A; BRPI0714875A2; EP2049658A2; CN101490253A; MX2009000654A; AU2007276388A1; US20090304678A1; CN102321626A

Abstract

Изобретение относится к области молекулярной биологии, генетической инженерии и медицины. Предложена молекула рибонуклеиновой кислоты, опосредующая интерференцию РНК, нацеленной против PKN3, а также содержащий её липокомплекс, фармацевтическая композиция, применение и способ лечения ракового заболевания, в которое вовлечен путь PI3-киназы. 12 н. и 36 з.п. ф-лы, 2 табл., 17 ил., 13 пр.

Description

Настоящее изобретение относится к двунитевой нуклеиновой кислоте, подходящей для ингибирования экспрессии протеинкиназы 3 (PKN 3), и к ее применению.

Канцерогенез описан Foulds (Foulds, 1958) как многостадийный биологический процесс, который, как известно в настоящее время, происходит в результате накопления генетических повреждений. На молекулярном уровне в многостадийный процесс образования опухолей вовлечено нарушение как позитивных, так и негативных регуляторных эффекторов (Weinberg, 1989). Vogelstein с соавторами (Fearon and Vogelstein, 1990) предположили, что молекулярная основа карцином ободочной кишки человека включает в себя ряд онкогенов, генов-супрессоров опухолей и генов репарации. Подобным образом, нарушения, приводящие к развитию ретинобластомы, связывали с другим геном супрессором опухоли (Lee et al., 1987). Также были идентифицированы другие онкогены и супрессоры опухолей в случае множества других злокачественных опухолей. К сожалению, все еще недостаточное количество злокачественных опухолей поддается лечению, и последствия злокачественных опухолей являются катастрофическими - более полумиллиона смертельных случаев в год только в Соединенных Штатах.

Злокачественная опухоль по существу является генетическим заболеванием, при котором повреждение клеточной ДНК приводит к нарушению нормальных механизмов, которые контролируют пролиферацию клеток. Два механизма действия, посредством которых супрессоры опухолей поддерживают целостность генома, заключаются в задержке клеточного цикла, обеспечивающей репарацию поврежденной ДНК, или в удалении поврежденной ДНК в результате апоптоза (Ellisen and Haber, 1998). Апоптоз, иначе называемый «запрограммированной гибелью клеток», представляет собой тщательно регулируемую сеть биохимических событий, которая действует как программа самоуничтожения клетки, нацеленная на удаление клеток с необратимыми повреждениями. Апоптоз может запускаться несколькими путями, включая связывание фактора некроза опухоли, повреждение ДНК, удаление факторов роста и поперечное связывание антителами рецепторов Fas. Хотя было идентифицировано несколько генов, которые играют роль в процессе апоптоза, пути, приводящие к апоптозу, полностью не выяснены. Многие исследователи пытались идентифицировать новые стимулирующие апоптоз гены с той целью, чтобы такие гены могли обеспечить средства для того, чтобы индуцировать апоптоз избирательно в неопластических клетках для лечения злокачественной опухоли у пациента. Альтернативный способ лечения злокачественной опухоли заключается в подавлении ангиогенеза таким средством, как эндостатин или анти-VEGF-антитела. Целью такого подхода является предотвращение дальнейшей васкуляризации первичной опухоли и возможное ограничение размера метастатических повреждений, при этом поддерживается жизнеспособность неопластических клеток без существенного роста сосудов.

Особую группу злокачественных заболеваний составляют такие злокачественных заболевания, которые являются агрессивными в отношении скорости роста опухоли, инвазии в нормальную ткань, резистентности к химиотерапии или другим обычным способам лечения и образования метастазов в организме. В случае более агрессивной злокачественной опухоли ткань злокачественной опухоли больше отличается от нормальной ткани и более вероятно распространение опухоли. Поэтому одной из целей современных исследований рака является разработка средств, которые ингибируют рост опухолей и/или уменьшают распространение злокачественных клеток в организме.

Определения того, какое заболевание является агрессивным злокачественным заболеванием, можно найти в Интернете на странице Национального института рака http://www.cancer.gov/Templates/db_alpha.aspx?CdrID=46053. Также для описания агрессивности злокачественного заболевания обычно используют оценку степени заболевания, которая представляет собой систему классификации злокачественных клеток в отношении того, насколько аномально они выглядят при исследовании в микроскопе. Целью системы классификации является предоставление информации о вероятной скорости роста опухоли и тенденции к ее распространению. Системы, применяемые для оценки степени опухолей, варьируют в зависимости от типа злокачественной опухоли. Определение степени играет роль для назначения лечения.

Такие системы оценки степени заболевания известны специалистам в данной области. Одной из таких систем является оценка по Глисону, которая представляет собой систему классификации злокачественной ткани простаты, основанной на том, как она выглядит под микроскопом. Шкала оценок по Глисону имеет диапазон от 2 до 10 и указывает насколько вероятно распространение опухоли. Низкая оценка по шкале Глисона означает, что ткань злокачественной опухоли сходна с нормальной тканью простаты, и менее вероятно распространение опухоли; высокая оценка по шкале Глисона означает, что ткань злокачественной опухоли сильно отличается от нормальной, и более вероятно распространение опухоли.

PKN3, которую также называют протеинкиназой N-бета или PKN-бета, является полезной мишенью в случаях рака и опухолей. Как описано в международной заявке на выдачу патента WO 2004/019973, протеинкиназа N-бета является ниже расположенной мишенью в пути PI-3-киназа/PTEN, который связан с канцерогенезом и метастазированием. В частности, последний эффект, по-видимому, строго связан с утратой супрессорной функции, более конкретно супрессорной по отношению к опухоли функции PTEN. Как показано в WO 2004/019973, протеинкиназа N-бета будет подвергаться повышающей регуляции в условиях, когда PTEN, который является ингибитором PI-3-киназного пути, не активен. Вследствие повышающей регуляции протеинкиназы N-бета клеток, в которых происходит такая повышающая регуляция, будут проявлять усиленное метастатическое поведение и миграционное поведение. Это означает, что ингибитор протеинкиназы N-бета является подходящим средством для контроля метастатического и миграционного поведения клеток и является подходящим средством для лечения опухолей и злокачественных опухолей, более конкретно, таких опухолей и злокачественных опухолей, которые являются метастатическими, и клеток, которые проявляют метастатическое и/или миграционное поведение.

В данной области сохраняется необходимость в средствах лечения неопластических заболеваний. Более конкретно, существует потребность в средствах, подходящих для лечения таких неопластических заболеваний, которые являются агрессивными и которые проявляют инвазивные свойства.

Также существует необходимость в средстве, подходящем для того, чтобы влиять на ангиогенез, более конкретно, на ангиогенез, вовлеченный в патологический механизм, лежащий в основе неопластического заболевания. Указанные потребности определяют проблему, лежащую в основе настоящего изобретения.

Проблема, лежащая в основе настоящего изобретения, решается с помощью объекта изобретения, указанного в прилагаемой формуле изобретения. Предпочтительные варианты могут быть получены, исходя из зависимых пунктов формулы изобретения.

Проблема, лежащая в основе настоящего изобретения, решается с использованием двунитевой молекулы нуклеиновой кислоты,

- при этом двунитевая структура содержит первую нить и вторую нить,

- при этом первая нить содержит первый участок непрерывно следующих друг за другом нуклеотидов, и указанный первый участок, по меньшей мере, частично комплементарен нуклеиновой кислоте-мишени, и

- при этом вторая нить содержит второй участок непрерывно следующих друг за другом нуклеотидов, и указанный второй участок, по меньшей мере, частично комплементарен первому участку, и

- при этом нуклеиновая кислота-мишень представляет собой мРНК, кодирующую PKN3.

Более конкретно, проблема, лежащая в основе настоящего изобретения, решается в первом аспекте с помощью молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей двунитевую структуру,

при этом двунитевая структура содержит первую нить и вторую нить,

при этом первая нить содержит первый участок непрерывно следующих друг за другом нуклеотидов и указанный первый участок, по меньшей мере, частично комплементарен нуклеиновой кислоте-мишени, и

при этом вторая нить содержит второй участок непрерывно следующих друг за другом нуклеотидов, и указанный второй участок, по меньшей мере, частично комплементарен первому участку,

при этом первый участок содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая, по меньшей мере, частично комплементарна нуклеотидной коровой последовательности из последовательности нуклеиновой кислоты согласно SEQ. ID. No. 1 (NM_013355) или ее части,

при этом нуклеотидная коровая последовательность содержит нуклеотидную последовательность

от положения нуклеотида 482 до положения 500 в SEQ.ID.No. 1 (SEQ.ID.No. 2);

от положения нуклеотида 1555 до положения 1573 в SEQ.ID.No. 1 (SEQ.ID.No. 4);

от положения нуклеотида 1556 до положения 1574 в SEQ.ID.No. 1 (SEQ.ID.No. 6);

от положения нуклеотида 1559 до положения 1577 в SEQ.ID.No. 1 (SEQ.ID.No. 8);

от положения нуклеотида 1566 до положения 1584 в SEQ.ID.No. 1 (SEQ.ID.No. 10);

от положения нуклеотида 2094 до положения 2112 в SEQ.ID.No. 1 (SEQ.ID.No. 12);

от положения нуклеотида 2102 до положения 2120 в SEQ.ID.No. 1 (SEQ.ID.No. 14);

от положения нуклеотида 2286 до положения 2304 в SEQ.ID.No. 1 (SEQ.ID.No. 16);

от положения нуклеотида 2761 до положения 2779 в SEQ.ID.No. 1 (SEQ.ID.No. 18);

от положения нуклеотида 2763 до положения 2781 в SEQ.ID.No. 1 (SEQ.ID.No. 20);

от положения нуклеотида 2764 до положения 2782 в SEQ.ID.No. 1 (SEQ.ID.No. 22);

от положения нуклеотида 2843 до положения 2861 в SEQ.ID.No. 1 (SEQ.ID.No. 24);

от положения нуклеотида 2844 до положения 2862 в SEQ.ID.No. 1 (SEQ.ID.No. 26); или

от положения нуклеотида 2846 до положения 2864 в SEQ.ID.No. 1 (SEQ.ID.No. 28),

предпочтительно нуклеотидная коровая последовательность содержит нуклеотидную последовательность

от положения нуклеотида 2094 до положения 2112 в SEQ.ID.No. 1 (SEQ.ID.No. 12); или

от положения нуклеотида 2286 до положения 2304 в SEQ.ID.No. 1 (SEQ.ID.No. 16),

при этом предпочтительно первый участок дополнительно, по меньшей мере, частично комплементарен области, предшествующей 5'-концу нуклеотидной коровой последовательности, и/или области, расположенной после 3'-конца нуклеотидной коровой последовательности.

В одном варианте согласно первому аспекту настоящего изобретения первый участок нуклеиновой кислоты комплементарен нуклеотидной коровой последовательности или ее части.

В одном варианте согласно первому аспекту настоящего изобретения первый участок нуклеиновой кислоты дополнительно комплементарен области, расположенной после 3'-конца нуклеотидной коровой последовательности, и/или области, предшествующей 5'-концу нуклеотидной коровой последовательности.

В одном варианте согласно первому аспекту настоящего изобретения первый участок нуклеиновой кислоты комплементарен нуклеиновой кислоте-мишени от 18 до 29 нуклеотида, предпочтительно от 19 до 25 нуклеотида и более предпочтительно от 19 до 23 нуклеотида.

В предпочтительном варианте согласно первому аспекту настоящего изобретения нуклеотиды нуклеиновой кислоты являются непрерывно следующими друг за другом нуклеотидами.

В одном варианте согласно первому аспекту настоящего изобретения первый участок и/или второй участок нуклеиновой кислоты содержит непрерывно следующие друг за другом нуклеотиды 18-29, предпочтительно непрерывно следующие друг за другом нуклеотиды 19-25 и более предпочтительно непрерывно следующие друг за другом нуклеотиды 19-23.

В одном варианте согласно первому аспекту настоящего изобретения первая нить нуклеиновой кислоты состоит из первого участка и/или вторая нить нуклеиновой кислоты состоит из второго участка.

Проблема, лежащая в основе настоящего изобретения, решается во втором аспекте с помощью молекулы нуклеиновой кислоты, предпочтительно молекулы нуклеиновой кислоты согласно первому аспекту, содержащей двунитевую структуру, при этом двунитевая структура образована первой нитью и второй нитью, при этом первая нить содержит первый участок следующих друг за другом нуклеотидов, и вторая нить содержит второй участок непрерывно следующих друг за другом нуклеотидов, и при этом указанный первый участок, по меньшей мере, частично комплементарен указанному второму участку, при этом

- первый участок состоит из нуклеотидной последовательности согласно SEQ.ID.No. 3, и второй участок состоит из нуклеотидной последовательности согласно SEQ.ID.No. 2;

- первый участок состоит из нуклеотидной последовательности согласно SEQ.ID.No. 5, и второй участок состоит из нуклеотидной последовательности согласно SEQ.ID.No. 4;

- первый участок состоит из нуклеотидной последовательности согласно SEQ.ID.No. 7, и второй участок состоит из нуклеотидной последовательности согласно SEQ.ID.No. 6;

- первый участок состоит из нуклеотидной последовательности согласно SEQ.ID.No. 9, и второй участок состоит из нуклеотидной последовательности согласно SEQ.ID.No. 8;

- первый участок состоит из нуклеотидной последовательности согласно SEQ.ID.No. 11, и второй участок состоит из нуклеотидной последовательности согласно SEQ.ID.No. 10;

- первый участок состоит из нуклеотидной последовательности согласно SEQ.ID.No. 13, и второй участок состоит из нуклеотидной последовательности согласно SEQ.ID.No. 12;

- первый участок состоит из нуклеотидной последовательности согласно SEQ.ID.No. 15, и второй участок состоит из нуклеотидной последовательности согласно SEQ.ID.No. 14;

- первый участок состоит из нуклеотидной последовательности согласно SEQ.ID.No. 17, и второй участок состоит из нуклеотидной последовательности согласно SEQ.ID.No. 16;

- первый участок состоит из нуклеотидной последовательности согласно SEQ.ID.No. 19, и второй участок состоит из нуклеотидной последовательности согласно SEQ.ID.No. 18;

- первый участок состоит из нуклеотидной последовательности согласно SEQ.ID.No. 21, и второй участок состоит из нуклеотидной последовательности согласно SEQ.ID.No. 20;

- первый участок состоит из нуклеотидной последовательности согласно SEQ.ID.No. 23, и второй участок состоит из нуклеотидной последовательности согласно SEQ.ID.No. 22;

- первый участок состоит из нуклеотидной последовательности согласно SEQ.ID.No. 25, и второй участок состоит из нуклеотидной последовательности согласно SEQ.ID.No. 24;

- первый участок состоит из нуклеотидной последовательности согласно SEQ.ID.No. 27, и второй участок состоит из нуклеотидной последовательности согласно SEQ.ID.No. 26; или

- первый участок состоит из нуклеотидной последовательности согласно SEQ.ID.No. 29, и второй участок состоит из нуклеотидной последовательности согласно SEQ.ID.No. 28;

- первый участок состоит из нуклеотидной последовательности согласно SEQ.ID.No. 31, и второй участок состоит из нуклеотидной последовательности согласно SEQ.ID.No. 30;

- первый участок состоит из нуклеотидной последовательности согласно SEQ.ID.No. 33, и второй участок состоит из нуклеотидной последовательности согласно SEQ.ID.No. 32;

- первый участок состоит из нуклеотидной последовательности согласно SEQ.ID.No. 35, и второй участок состоит из нуклеотидной последовательности согласно SEQ.ID.No. 34;

- первый участок состоит из нуклеотидной последовательности согласно SEQ.ID.No. 37, и второй участок состоит из нуклеотидной последовательности согласно SEQ.ID.No. 36;

- первый участок состоит из нуклеотидной последовательности согласно SEQ.ID.No. 39, и второй участок состоит из нуклеотидной последовательности согласно SEQ.ID.No. 38;

предпочтительно

- первый участок состоит из нуклеотидной последовательности согласно SEQ.ID.No. 17, и второй участок состоит из нуклеотидной последовательности согласно SEQ.ID.No. 16, или

- первый участок состоит из нуклеотидной последовательности согласно SEQ.ID.No. 31, и второй участок состоит из нуклеотидной последовательности согласно SEQ.ID.No. 30.

В одном варианте согласно первому и второму аспектам настоящего изобретения первый участок и/или второй участок молекулы нуклеиновой кислоты содержит множество групп модифицированных нуклеотидов, имеющих модификацию в 2'-положении, образующих правильную картину предпочтительно чередующихся положений, при этом в пределах участка каждая группа модифицированных нуклеотидов фланкирована с одной или обеих сторон фланкирующей группой нуклеотидов, причем фланкирующий нуклеотид(ы), образующие фланкирующую группу нуклеотидов, представляют собой либо немодифицированные нуклеотиды, либо нуклеотиды, имеющие другую модификацию, отличную от модификации модифицированных нуклеотидов.

В одном варианте согласно первому и второму аспектам настоящего изобретения первый участок нуклеиновой кислоты и/или второй участок нуклеиновой кислоты содержит структуру из групп модифицированных нуклеотидов и/или структуру фланкирующих групп нуклеотидов.

В одном варианте согласно первому и второму аспектам настоящего изобретения первый участок нуклеиновой кислоты и/или второй участок нуклеиновой кислоты содержат на 3'-конце динуклеотид, при этом таким динуклеотидом предпочтительно является TT.

В предпочтительном варианте согласно первому и второму аспектам настоящего изобретения длина первого участка нуклеиновой кислоты и/или второго участка нуклеиновой кислоты составляет от 19 до 21 нуклеотида.

В одном варианте согласно первому и второму аспектам настоящего изобретения первый и/или второй участок нуклеиновой кислоты содержит выступающие 1-5 нуклеотидов на 3'-конце.

В предпочтительном варианте согласно первому и второму аспектам настоящего изобретения длина двунитевой структуры нуклеиновой кислоты составляет примерно от 16 до 24 пар нуклеотидов, предпочтительно от 20 до 22 пар нуклеотидов.

В одном варианте согласно первому и второму аспектам настоящего изобретения первая нить нуклеиновой кислоты и вторая нить нуклеиновой кислоты ковалентно связаны друг с другом, предпочтительно 3'-конец первой нити ковалентно связан с 5'-концом второй нити.

В одном варианте согласно первому и второму аспектам настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты содержит каждую из двух указанных ниже нитей, где подчеркнутые нуклеотиды являются 2'-O-метилнуклеотидами:

предпочтительно

Проблема, лежащая в основе настоящего изобретения, решается в третьем аспекте с использованием липосомного препарата, содержащего нуклеиновую кислоту согласно первому или второму аспекту.

Проблема, лежащая в основе настоящего изобретения, решается в четвертом аспекте с использованием липоплекса, содержащего нуклеиновую кислоту согласно первому или второму аспекту и липосому.

В предпочтительном варианте согласно четвертому аспекту настоящего изобретения липосома липоплекса состоит из

a) примерно 50 моль% тригидрохлорида β-аргинил-2,3-диаминопропионовая кислота-N-пальмитил-N-олеиламида, предпочтительно (тригидрохлорида β-(L-аргинил)-2,3-L-диаминопропионовая кислота-N-пальмитил-N-олеиламида);

b) примерно от 48 до 49 моль% 1,2-дифитаноил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина (DPhyPE); и

c) примерно от 1 до 2 моль% 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламинполиэтиленгликоля, предпочтительно натриевой соли N-(карбонилметоксиполиэтиленгликоль-2000)-1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина.

В более предпочтительном варианте согласно четвертому аспекту настоящего изобретения дзета-потенциал липоплекса составляет примерно от 35 до 60 мВ, предпочтительно примерно от 45 до 50 мВ.

В одном варианте согласно четвертому аспекту настоящего изобретения липоплекс имеет размер примерно от 50 до 400 нм, предпочтительно примерно от 100 до 140 нм и более предпочтительно примерно от 110 нм до 130 нм, как определено с использованием QELS.

Проблема, лежащая в основе настоящего изобретения, решается в пятом аспекте с использованием вектора, предпочтительно экспрессирующего вектора, содержащего или кодирующего нуклеиновую кислоту согласно первому и второму аспекту.

Проблема, лежащая в основе настоящего изобретения, решается в шестом аспекте с использованием клетки, содержащей нуклеиновую кислоту согласно любому из предшествующих аспектов или вектор согласно любому из предшествующих аспектов.

Проблема, лежащая в основе настоящего изобретения, решается в седьмом аспекте с использованием композиции, предпочтительно фармацевтической композиции, содержащей нуклеиновую кислоту согласно первому или второму аспекту, липосомный препарат согласно третьему аспекту, липоплекс согласно четвертому аспекту, вектор согласно пятому аспекту и/или клетку согласно шестому аспекту.

В предпочтительном варианте согласно седьмому аспекту настоящего изобретения композиция представляет собой фармацевтическую композицию, необязательно дополнительно содержащую фармацевтически приемлемый носитель.

В более предпочтительном варианте согласно седьмому аспекту настоящего изобретения композиция представляет собой фармацевтическую композицию, и указанная фармацевтическая композиция предназначена для лечения зависимого от ангиогенеза заболевания, предпочтительно заболеваний, характеризуемых или вызванных недостаточным, аномальным или чрезмерным ангиогенезом.

В наиболее предпочтительном варианте согласно седьмому аспекту настоящего изобретения ангиогенез представляет собой ангиогенез жировой ткани, кожи, сердца, глаза, легкого, кишечника, репродуктивных органов, костей и суставов.

В одном варианте согласно седьмому аспекту настоящего изобретения заболевание выбрано из группы, состоящей из инфекционных болезней, аутоиммунных болезней, аномалий сосудистой системы, атеросклероза, трансплантационной артериопатии, ожирения, псориаза, бородавок, аллергического дерматита, синдрома персистирующего гиперпластического стекловидного тела, диабетической ретинопатии, ретролентальной фиброплазии, старческого заболевания сетчатки, хороидальной неоваскуляризации, первичной легочной гипертензии, астмы, носовых полипов, воспалительного заболевания кишечника и воспалительного периодонтального заболевания, асцитов, перитонеальных спаек, эндометриоза, маточного кровотечения, кист яичника, гиперстимуляции яичников, артрита, синовита, остеомиелита, образования остеофитов.

В одном варианте согласно седьмому аспекту настоящего изобретения фармацевтическая композиция предназначена для лечения неопластического заболевания, предпочтительно злокачественного заболевания и более предпочтительно солидной опухоли.

В одном варианте согласно седьмому аспекту настоящего изобретения фармацевтическая композиция предназначена для лечения заболевания, выбранного из группы, состоящей из рака костей, рака молочной железы, рака простаты, рака пищеварительной системы, рака прямой и ободочной кишки, рака печени, рака легкого, рака почек, рака мочеполовой системы, рака поджелудочной железы, рака гипофиза, рака семенников, рака глаз, рака головы и шеи, рака центральной нервной системы и рака дыхательной системы.

Проблема, лежащая в основе настоящего изобретения, решается в восьмом аспекте благодаря применению нуклеиновой кислоты согласно первому или второму аспекту, липосомного препарата согласно третьему аспекту, липоплекса согласно четвертому аспекту, вектора согласно пятому аспекту и/или клетки согласно шестому аспекту для производства лекарственного средства.

В одном варианте согласно восьмому аспекту настоящего изобретения лекарственное средство применяют для лечения любого из заболеваний, которые определены в связи с седьмым аспектом настоящего изобретения.

В предпочтительном варианте согласно восьмому аспекту настоящего изобретения лекарственное средство применяют в комбинации с одним или несколькими другими способами терапии.

В более предпочтительном варианте согласно восьмому аспекту настоящего изобретения терапия выбрана из группы, состоящей из химиотерапии, криотерапии, гипертермии, терапии антителами, лучевой терапии и терапии, направленной против ангиогенеза.

В наиболее предпочтительном варианте согласно восьмому аспекту настоящего изобретения терапия представляет собой терапию антителами и более предпочтительно терапию антителами с использованием анти-VEGF-антитела (такого как, например, антитело, поставляемое Genentech-Roche и продаваемое под названием авастин) или антитела против ангиопоэтина.

В одном варианте согласно восьмому аспекту настоящего изобретения в терапии, направленной против ангиогенеза, используют ингибитор киназного рецептора, предпочтительно ингибитор тирозинкиназного рецептора, при этом такой рецептор выбран из группы, состоящей из рецептора VEGF, рецептора PDGF, Tie-2, FGFR и EGFR. Примерами ингибиторов такого рода являются сорафениб (Bayer), мишенью которого являются VEGF-R и PDGF-R, и антитело эрбитукс (Merck/serono), мишенью которого является EGFR. Оба лекарственных средства рассматривают в качестве средств против ангиогенеза.

В предпочтительном варианте согласно восьмому аспекту настоящего изобретения ингибитор выбран из группы, состоящей из миРНК, антисмысловых молекул, аптамеров, шпигельмеров, высоко аффинных связывающих пептидов, пептидных аптамеров, антикалинов и антител.

В предпочтительном варианте согласно восьмому аспекту лекарственное средство применяют в комбинации с одним или несколькими другими способами терапии, предпочтительно противоопухолевой или противораковой терапии.

В более предпочтительном варианте согласно восьмому аспекту терапия выбрана из группы, состоящей из химиотерапии, криотерапии, гипертермии, терапии антителами и лучевой терапии.

В еще более предпочтительном варианте согласно восьмому аспекту терапия представляет собой антиангиогенную терапию и более предпочтительно терапию антителами с применением анти-VEGF-антитела или антитела против ангиопоэтина.

В следующем предпочтительном варианте согласно разным аспектам настоящего изобретения мРНК представляет собой мРНК PKN3 человека. В еще более предпочтительном варианте нуклеиновая кислота-мишень представляет собой мРНК, имеющую последовательность нуклеиновой кислоты согласно SEQ.ID.No. 1.

Как будет более подробно раскрыто в настоящем описании, молекулы нуклеиновых кислот и, соответственно, содержащее их лекарственное средство и препарат являются особенно подходящими для ингибирования или профилактики, или лечения инвазивной злокачественной опухоли, агрессивной злокачественной опухоли и злокачественных новообразований.

Предпочтительно в используемом в настоящем описании смысле инвазивная злокачественная опухоль представляет собой злокачественную опухоль, которая распространилась за пределы слоя ткани, в котором она образовалась, и разрастается в окружающие здоровые ткани. Ее также называют инфильтрующей злокачественной опухолью.

Предпочтительно в используемом в настоящем описании смысле агрессивная злокачественная опухоль представляет собой быстро растущую злокачественную опухоль.

Предпочтительно в используемом в настоящем описании смысле злокачественное новообразование означает злокачественную опухоль, которая может прорастать и разрушать близлежащую ткань и распространяться на другие части тела.

Специалистам в данной области известно, что могут иметь место одно или несколько изменений отдельных нуклеотидов в мРНК у разных индивидуумов или в группах индивидуумов, предпочтительно в популяции, по сравнению с мРНК, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ.ID.No. 1. Такая мРНК, имеющая одно или несколько изменений отдельных нуклеотидов по сравнению с мРНК, имеющей последовательность нуклеиновой кислоты SEQ.ID.No. 1, также может подпадать под термин «нуклеиновая кислота-мишень», который предпочтительно используется в настоящем описании. В еще одном варианте молекула нуклеиновой кислоты согласно различным аспектам изобретения применима для ингибирования экспрессии PKN3 и кодирующей ее мРНК. Более предпочтительно такая экспрессия ингибируется по механизму, который называют интерференцией РНК или посттранскрипционным сайленсингом генов. Таким образом, молекула миРНК и РНКi, соответственно, согласно настоящему изобретению применимы для инициации ответа в виде интерференции РНК, который предпочтительно приводит к нокдауну мРНК молекулы-мишени. В такой же мере указанный вид молекулы нуклеиновой кислоты применим для уменьшения экспрессии молекулы-мишени посредством снижения экспрессии на уровне мРНК. Специалисту в данной области будет понятно, что могут существовать дополнительные мРНК, кодирующие PKN3, которые также входят в объем настоящей заявки. Более конкретно, положения конкретных нуклеотидов, указанных в данном описании в последовательности SEQ.ID.No. 1, могут быть идентифицированы в таких дополнительных мРНК специалистом в данной области на основании технических инструкций, приведенных в настоящем описании.

Также должно быть понятно, что двунитевая нуклеиновая кислота согласно указанному аспекту настоящего изобретения может иметь любые конструкции, раскрытые в данном описании для такого вида молекулы нуклеиновой кислоты. Кроме того, следует понимать, что описанный выше механизм в предпочтительном варианте также применим по отношению к нуклеиновым кислотам, раскрытым в настоящем описании, в связи с различными аспектами и принципами конструирования, также указанными в настоящем описании в качестве дополнительных аспектов.

Интерференция РНК относится к процессу специфичного для последовательности посттраскрипционного сайленсинга генов у животных, опосредованного короткими интерферирующими РНК (миРНК) (Fire et al., 1998). Соответствующий процесс у растений обычно называют посттранскрипционным сайленсингом генов или РНК-сайленсингом, а у грибов также называют квеллингом. Считается, что процесс посттранскрипционного сайленсинга генов является эволюционно консервативным механизмом клеточной защиты, используемым для предотвращения экспрессии чужеродных генов, общих у организмов флоры и фауны (Fire, 1998, №263). Такая защита от экспрессии чужеродных генов могла возникнуть в процессе эволюции в ответ на продукцию двунитевых РНК (днРНК), возникающей в результате вирусной инфекции или случайной интеграции транспозируемых элементов в геном хозяина посредством клеточной реакции, которая специфично разрушает гомологичную однонитевую РНК или вирусную геномную РНК. Присутствие днРНК в клетках запускает РНКi-ответ посредством механизма, который еще полностью не охарактеризован. Такой механизм, который также существует в животных клетках и, в частности, в клетках млекопитающих, по-видимому, отличается от ответа на интерферон, который возникает в результате опосредованной днРНК активации протеинкиназы PKR и 2',5'-олигоаденилатсинтетазы, приводящей к неспецифичному расщеплению мРНК рибонуклеазой L.

Основная конструкция молекул миРНК или молекул РНКi, которые главным образом отличаются по размеру, по существу такова, что молекула нуклеиновой кислоты содержит двунитевую структуру. Двунитевая структура содержит первую нить и вторую нить. Более предпочтительно первая нить содержит первый участок непрерывно следующих друг за другом нуклеотидов, и вторая нить содержит второй участок непрерывно следующих друг за другом нуклеотидов. По меньшей мере первый участок и второй участок по существу комплементарны друг другу. Такая комплементарность обычно основана на спаривании оснований согласно Уотсону и Крику или другом механизме спаривания оснований, известном специалисту в данной области, включая без ограничения хугстиновское спаривание оснований и другие. Специалисту в данной области будет понятно, что в зависимости от длины такой двунитевой структуры идеально точное спаривание на основе комплементарности оснований не требуется обязательно. Однако в некоторых вариантах предпочтительна такая точная комплементарность. В особенно предпочтительном варианте комплементарность и/или идентичность составляет, по меньшей мере, 75%, 80%, 85%, 90% или 95%. В альтернативном особенно предпочтительном варианте комплементарность и/или идентичность такова, что комплементарная и/или идентичная молекула нуклеиновой кислоты гибридизуется с одной из нитей молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, более предпочтительно с одним из двух участков в следующих условиях: способна гибридизоваться с частью транскрипта гена-мишени в следующих условиях: 400 мМ NaCl, 40 мМ PIPES pH 6,4, 1 мМ EDTA, 50ºC или 70ºC, гибридизация в течение 12-16 часов, с последующей промывкой. Соответствующие условия реакции, наряду с другими публикациями, описаны в Европейском патенте EP 1230375.

Ошибочное спаривание также приемлемо, главным образом, при условии, что двунитевая структура еще пригодна для индукции механизма РНК-интерференции, и что предпочтительно такая двунитевая структура еще стабильно формируется в физиологических условиях, которые превалируют в клетке, ткани и, соответственно, в организме, который содержит или в принципе может содержать такую клетку, ткань и орган. Более предпочтительно двунитевая структура стабильна при 37ºC в физиологическом буфере. Специалистам в данной области будет понятно, что ошибочное спаривание предпочтительно может быть в положении в молекуле нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, которое отличается от положений коровой области.

Предпочтительно в используемом в настоящем описании смысле термин, указывающий, что молекула нуклеиновой кислоты или ее участок или часть частично комплементарны молекуле нуклеиновой кислоты-мишени, предпочтительно означает, что если такая нуклеиновая кислота-мишень либо прямо, либо косвенно является мишенью нуклеиновой кислоты, опосредующей интерференцию РНК, то комплементарность между нуклеиновой кислотой-мишенью и указанной нуклеиновой кислотой, ее участком или частью, или двунитевая структура, образованная вследствие такой комплементарности, способна запускать интерференцию РНК. Будет понятно, что требование такой комплементарности не ограничено механизмом интерференции РНК, а имеет отношение к любому механизму, который приводит к понижающей регуляции или уменьшению активности молекулы, такой как полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой-мишенью. В одном варианте молекула нуклеиновой кислоты, которая частично комплементарна другой молекуле нуклеиновой кислоты, содержит 1, 2, 3, 4 или 5 несовпадений при спаривании оснований обеих молекул нуклеиновой кислоты. Более предпочтительно двунитевая молекула нуклеиновой кислоты, образованная таким образом, содержит от 19 до 25 пар оснований.

Первый участок обычно, по меньшей мере, частично комплементарен или, по меньшей мере, частично идентичен нуклеиновой кислоте-мишени, и второй участок, особенно учитывая взаимосвязь между первым и вторым участком, соответственно, в смысле комплементарности оснований, по меньшей мере, частично идентичен или, по меньшей мере, частично комплементарен нуклеиновой кислоте-мишени. Нуклеиновая кислота-мишень предпочтительно представляет собой мРНК, хотя и другие формы РНК, такие как гяРНК, также являются подходящими в качестве молекулы нуклеиновой кислоты в указанных в описании целях. Предпочтительно в используемом в настоящем описании смысле мишенью является PKN3, и нуклеиновая кислота-мишень более предпочтительно представляет собой ДНК или РНК, которая кодирует PKN3 или ее часть, при условии, что такая часть предпочтительно, по меньшей мере, все еще обладает свойством полноразмерной PKN3, позволяющим действовать в качестве киназы.

Хотя интерференция РНК может наблюдаться при использовании длинных молекул нуклеиновой кислоты, содержащих несколько дюжин и иногда несколько сотен нуклеотидов и нуклеотидных пар, соответственно, в общем предпочтительны более короткие молекулы РНКi. Более предпочтительный диапазон длин первого участка и/или второго участка составляет примерно от 18 до 29 непрерывно следующих друг за другом нуклеотидов, предпочтительно от 19 до 25 непрерывно следующих друг за другом нуклеотидов, и более предпочтительно от 19 до 23 непрерывно следующих друг за другом нуклеотидов. Более предпочтительно и первый участок, и второй участок имеют одинаковую длину. В следующем варианте двунитевая структура содержит предпочтительно от 16 до 29, предпочтительно от 18 до 25, более предпочтительно от 19 до 23 и наиболее предпочтительно от 19 до 21 пар оснований.

Хотя согласно настоящему изобретению в принципе любую часть мРНК, кодирующей PKN3, можно использовать для конструирования такой молекулы миРНК и РНКi, соответственно, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что последовательность, начиная с положений нуклеотидов 1555, 1556, 1559, 1566, 2094, 2286 в мРНК по SEQ.ID.No. 1, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ.ID.No. 1, является особенно подходящей для адресного воздействия на нее молекулой(ами), опосредующей интерференцию РНК.

Более конкретно, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что хотя такие последовательности и начальные точки являются особенно предпочтительными последовательностями-мишенями для ингибирования экспрессии PKN3, существует кор нуклеотидов в пределах таких последовательностей, который является особенно эффективным. Таким кором в одном варианте является последовательность, состоящая примерно из 9-11 последних нуклеотидов указанных выше нуклеотидных последовательностей. Начиная с них, кор может быть продлен так, чтобы получить функционально активную двунитевую молекулу нуклеиновой кислоты, при этом предпочтительно функционально активная означает, что она пригодна для осуществления ингибирования экспрессии PKN3. Для такой цели второй участок, который по существу идентичен соответствующей части мРНК, т.е. коровой последовательности, соответственно удлиняют одним, предпочтительно несколькими нуклеотидами на 5'-конце, при этом добавляемые таким образом нуклеотиды по существу идентичны нуклеотидам, присутствующим в нуклеиновой кислоте-мишени в соответствующих положениях. Также для такой цели первую нить, которая по существу комплементарна нуклеиновой кислоте-мишени, соответственно удлиняют одним, предпочтительно несколькими нуклеотидами на 3'-конце, при этом добавляемые таким образом нуклеотиды по существу комплементарны нуклеотидам, присутствующим в нуклеиновой кислоте-мишени в соответствующих положениях, т.е. на 5'-конце.

В соответствии с указанным принципом конструирования коровые последовательности согласно настоящему изобретению суммарно можно представить следующим образом:

Более предпочтительно верхняя нить двунитевой молекулы в данном представлении является смысловой нитью, тогда как нижняя нить является антисмысловой нитью, обе нити изображены в направлении 5'->3'. Еще более предпочтительно в смысловой нити каждый второй нуклеотид, начиная со второго нуклеотида, модифицирован в 2'-положении так, чтобы он предпочтительно представлял собой 2'-O-Me-модифицированный нуклеотид, а в антисмысловой нити каждый второй нуклеотид, начиная с первого нуклеотида, модифицирован в 2'-пложении, чтобы он предпочтительно представлял собой 2'-O-Me-модифицированный нуклеотид. Такой вид модификации или правильной или пространственной картины модификации может быть реализован в предпочтительных вариантах в любой молекуле нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению.

В своем следующем варианте коровая последовательность идентична нуклеотидной последовательности второго участка двунитевой молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению и по существу комплементарному ему первому участку. В еще одном предпочтительном варианте длина двунитевой молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению находится в пределах, указанных в настоящем описании в связи с различными аспектами и подаспектами, соответственно.

Специалистам в данной области будет понятно, что конкретный дизайн молекул миРНК и молекул РНКi, соответственно, может варьировать в соответствии с современными и будущими принципами конструирования. В настоящее время существуют некоторые принципы конструирования, которые необходимо обсудить и раскрыть более подробно далее, и которые будут названы подаспектами или подаспкетами первого аспекта, относящегося к молекуле нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению. В объем настоящего изобретения входят все признаки и варианты осуществления, описанные в одном конкретном подаспекте, т.е. конструкции нуклеиновой кислоты также применимы для любого другого аспекта и подаспекта, относящегося к нуклеиновой кислоте согласно настоящему изобретению, и, следовательно, образуют его соответствующие варианты осуществления.

Первый подаспект имеет отношение к нуклеиновой кислоте согласно настоящему изобретению, при этом первый участок содержит множество групп модифицированных нуклеотидов, имеющих модификацию в 2'-положении, при этом в пределах участка каждая группа модифицированных нуклеотидов фланкирована с одной или обеих сторон фланкирующей группой нуклеотидов, при этом фланкирующий нуклеотид(ы), образующие фланкирующую группу (группы) нуклеотидов, являются либо немодифицированными нуклеотидами, либо нуклеотидами, имеющими другую модификацию, отличную от модификации модифицированных нуклеотидов. Такая конструкция описана, наряду с другими публикациями, в международной публикации WO 2004/015107. Нуклеиновая кислота согласно данному аспекту предпочтительно представляет собой рибонуклеиновую кислоту, хотя, как будет отмечено в некоторых вариантах, модификация в 2'-положении приводит к появлению нуклеотида, который как таковой с чисто химической точки зрения больше не является рибонуклеотидом. Однако в объеме настоящего изобретения такой модифицированный рибонуклеотид следует расценивать и называть рибонуклеотидом, а молекулу, содержащую такой модифицированный рибонуклеотид, рибонуклеиновой кислотой.

В одном варианте рибонуклеиновой кислоты согласно первому подаспекту настоящего изобретения рибонуклеиновая кислота имеет тупые концы либо с одной стороны, либо с обеих сторон двунитевой структуры. В более предпочтительном варианте двунитевая структура содержит или состоит из 18-25, предпочтительно 18-23 и более предпочтительно 19, 21 или 23 пар оснований, при этом такая двунитевая структура предпочтительно имеет тупые концы. В еще более предпочтительном варианте нуклеиновая кислота состоит только из первого участка и второго участка.

В следующем варианте рибонуклеиновой кислоты согласно первому подаспекту настоящего изобретения указанный первый участок и/или указанный второй участок содержат множество групп модифицированных нуклеотидов. В следующем предпочтительном варианте первый участок также содержит множество фланкирующих групп нуклеотидов. В предпочтительном варианте множество групп означает, по меньшей мере, две группы.

В другом варианте рибонуклеиновой кислоты согласно первому подаспекту настоящего изобретения указанный второй участок содержит множество групп модифицированных нуклеотидов. В следующем предпочтительном варианте второй участок также содержит множество фланкирующих групп нуклеотидов. В предпочтительном варианте множество групп означает, по меньшей мере, две группы.

В следующем предпочтительном варианте и первый, и второй участок содержат множество групп модифицированных нуклеотидов и фланкирующих групп нуклеотидов. В более предпочтительном варианте множество групп модифицированных нуклеотидов и фланкирующих групп нуклеотидов образуют картину, предпочтительно правильную и/или повторяющуюся картину на первом участке и/или втором участке, при этом еще более предпочтительно, чтобы такая картина была образована как на первом, так и на втором участке.

В предпочтительном варианте рибонуклеиновой кислоты согласно первому подаспекту настоящего изобретения группа модифицированных нуклеотидов и/или группа фланкирующих нуклеотидов содержит определенное количество нуклеотидов, при этом такое количество выбрано из группы, состоящей из одного-десяти нуклеотидов. Что касается любых диапазонов, указанных в настоящем описании, следует понимать, что каждый диапазон включает в себя любое целое число между соответствующими цифрами, используемыми для определения диапазона, включая указанные два числа, определяющие указанный диапазон. Следовательно, в данном случае группа включает в себя один нуклеотид, два нуклеотида, три нуклеотида, четыре нуклеотида, пять нуклеотидов, шесть нуклеотидов, семь нуклеотидов, восемь нуклеотидов, девять нуклеотидов и десять нуклеотидов.

В другом варианте рибонуклеиновой кислоты согласно первому подаспекту настоящего изобретения картина модифицированных нуклеотидов указанного первого участка одинакова с картиной модифицированных нуклеотидов указанного второго участка.

В предпочтительном варианте рибонуклеиновой кислоты согласно первому подаспекту настоящего изобретения картина указанного первого участка выровнена с картиной указанного второго участка.

В альтернативном варианте рибонуклеиновой кислоты согласно первому подаспекту настоящего изобретения картина указанного первого участка сдвинута на один или более нуклеотидов относительно картины второго участка.

В одном варианте рибонуклеиновой кислоты согласно первому подаспекту настоящего изобретения модификация в 2'-положении выбрана из группы, состоящей из аминогруппы, фтора, метоксигруппы, алкоксигруппы и алкила.

В другом варианте рибонуклеиновой кислоты согласно первому подаспекту настоящего изобретения двунитевая структура имеет тупые концы.

В предпочтительном варианте рибонуклеиновой кислоты согласно первому подаспекту настоящего изобретения двунитевая структура имеет тупые концы с обеих сторон двунитевой структуры.

В другом варианте рибонуклеиновой кислоты согласно первому подаспекту настоящего изобретения двунитевая структура имеет тупые концы с той стороны двунитевой структуры, которая определена 5'-концом первой нити и 3'-концом второй нити.

В еще одном варианте рибонуклеиновой кислоты согласно первому подаспекту настоящего изобретения двунитевая структура имеет тупые концы с той стороны двунитевой структуры, которая определена 3'-концом первой нити и 5'-концом второй нити.

В другом варианте рибонуклеиновой кислоты согласно первому подаспекту настоящего изобретения, по меньшей мере, одна из двух нитей имеет выступ длиной, по меньшей мере, один нуклеотид на 5'-конце.

В предпочтительном варианте рибонуклеиновой кислоты согласно первому подаспекту настоящего изобретения выступ состоит, по меньшей мере, из одного дезоксирибонуклеотида.

В следующем варианте рибонуклеиновой кислоты согласно первому подаспекту настоящего изобретения, по меньшей мере, одна из нитей имеет выступ длиной, по меньшей мере, один нуклеотид на 3'-конце.

В одном варианте рибонуклеиновой кислоты согласно первому подаспекту длина двунитевой структуры составляет примерно от 17 до 23 и более предпочтительно 18 или 19 оснований или пар оснований.

В другом варианте рибонуклеиновой кислоты согласно первому подаспекту длина указанной первой нити и/или длина указанной второй нити независимо друг от друга выбраны из группы, состоящей из диапазонов примерно от 15 до примерно 23 оснований, от 17 до 21 основания и 18 или 19 оснований, или пар оснований, и более предпочтительно из 19, 21 или 23 пар оснований.

В предпочтительном варианте рибонуклеиновой кислоты согласно первому подаспекту настоящего изобретения комплементарность между указанной первой нитью и нуклеиновой кислотой-мишенью является точной.

В одном варианте рибонуклеиновой кислоты согласно первому подаспекту дуплекс, образованный между первой нитью и нуклеиновой кислотой-мишенью, содержит по меньшей мере 15 нуклеотидов, при этом имеется одно ошибочное спаривание или два ошибочных спаривания оснований между указанной первой нитью и нуклеиновой кислотой-мишенью, образующими указанную двунитевую структуру.

В одном варианте рибонуклеиновой кислоты согласно первому подаспекту и первая нить, и вторая нить содержат, по меньшей мере, одну группу модифицированных нуклеотидов и, по меньшей мере, одну фланкирующую группу нуклеотидов, при этом каждая группа модифицированных нуклеотидов содержит, по меньшей мере, один нуклеотид, и при этом каждая фланкирующая группа нуклеотидов, содержащая, по меньшей мере, один нуклеотид, с каждой группой модифицированных нуклеотидов первой нити выровнена с фланкирующей группой нуклеотидов во второй нити, при этом самый крайний 5'-нуклеотид первой нити является нуклеотидом группы модифицированных нуклеотидов, и самый крайний 3'-нуклеотид второй нити является нуклеотидом фланкирующей группы нуклеотидов.

В предпочтительном варианте рибонуклеиновой кислоты согласно первому подаспекту каждая группа модифицированных нуклеотидов состоит из одного нуклеотида и/или каждая фланкирующая группа нуклеотидов состоит из одного нуклеотида.

В следующем варианте рибонуклеиновой кислоты согласно первому подаспекту в первой нити нуклеотид, образующий фланкирующую группу нуклеотидов, является немодифицированным нуклеотидом, который расположен в 3'-направлении относительно нуклеотида, образующего группу модифицированных нуклеотидов, и при этом во второй нити нуклеотид, образующий группу модифицированных нуклеотидов, является модифицированным нуклеотидом, который расположен в 5'-направлении относительно нуклеотида, образующего фланкирующую группу нуклеотидов.

В другом варианте рибонуклеиновой кислоты согласно первому подаспекту первая нить содержит от восьми до двенадцати, предпочтительно от девяти до тринадцати групп модифицированных нуклеотидов, и при этом вторая нить содержит от семи до тринадцати, предпочтительно от восьми до десяти групп модифицированных нуклеотидов.

Согласно настоящему изобретению все то, что указано выше, также применимо по отношению к первому и второму участку, соответственно. Это особенно верно в случае таких вариантов, в которых нить состоит только из участка.

Молекула рибонуклеиновой кислоты согласно такому первому подаспекту может быть сконструирована так, чтобы она имела свободную 5'-гидроксильную группу, также называемую свободной 5'-OH-группой, на первой нити. Следовательно, свободная 5'-OH-группа означает, что самый крайний нуклеотид, образующий первую нить, присутствует без модификации и, следовательно, не модифицирован, в частности, не имеет концевой модификации. Обычно концевая 5'-гидроксигруппа второй нити, соответственно, также присутствует в немодифицированной форме. В более предпочтительном варианте 3'-конец первой нити и первого участка, соответственно, немодифицирован, так что присутствует свободная OH-группа, которую также называют в данном описании свободной 3'-OH-группой, при этом конструкция 5'-концевого нуклеотида соответствует любому из описанных выше вариантов. Предпочтительно такая свободная OH-группа также присутствует на 3'-конце второй нити и второго участка, соответственно. В других вариантах молекул рибонуклеиновой кислоты, которые описаны ранее, согласно настоящему изобретению 3'-конец первой нити и, соответственно, первого участка и/или 3'-конец второй нити и, соответственно, второго участка может иметь концевую модификацию на 3'-конце.

В используемом в настоящем описании смысле термины свободная 5'-OH-группа и 3'-OH-группа также указывают, что в соответствующем самом крайнем нуклеотиде на 5'-конце и 3'-конце полинуклеотида, соответственно, т.е. либо нуклеиновой кислоты, либо нитей и участков, соответственно, образующих двунитевую структуру, присутствует OH-группа. Такая OH-группа может происходить либо из любого остатка сахара нуклеотида, более предпочтительно из 5'-положения в случае 5'-OH-группы и из 3'-положения в случае 3'-OH-группы, или из фосфатной группы, связанной с остатком сахара соответствующего концевого нуклеотида. Фосфатная группа в принципе может быть связана с любой OH-группой остатка сахара нуклеотида. Предпочтительно фосфатная группа связана с 5'-OH-группой остатка сахара в случае свободной 5'-OH-группы и/или с 3'-OH-группой остатка сахара в случае свободной 3'-OH-группы, обеспечивая при этом так называемую свободную 5'- или 3'-OH-группу.

В используемом в настоящем описании смысле, в случае любого из вариантов согласно первому подаспекту, термин концевая модификация означает добавление химического остатка к 5'- или 3'-нуклеотиду первой и/или второй нити. Примеры таких концевых модификаций включают без ограничения инвертированные (дезокси) AP-сайты, аминогруппу, фтор, хлор, бром, CN, CF, метоксигруппу, имидазол, карбоксилат, тиоат, низший C₁-C₁₀-алкил, замещенный низший алкил, алкарил или аралкил, OCF₃, OCN, O-, S- или N-алкил; O-, S- или N-алкенил; SOCH₃; SO₂CH₃; ONO₂; NO₂, N₃; гетероциклоалкил; гетероциклоалкарил; аминоалкиламиногруппу; полиалкиламиногруппу или замещенный силил, которые, наряду с другими публикациями, описаны в Европейских патентах EP 0 586 520 B1 или EP 0 618 925 B1.

В используемом в настоящем описании смысле алкил или любой термин, содержащий «алкил», означает любую цепь из атомов углерода, содержащую от 1 до 12, предпочтительно от 1 до 6 и более предпочтительно от 1 до 2 атомов C.

Следующей концевой модификацией является группа биотина. Такая группа биотина предпочтительно может быть связана либо с 5'-концевым, либо с 3'-концевым нуклеотидом первой и/или второй нити или с обоими концами. В более предпочтительном варианте группу биотина связывают с полипептидом или белком. Также в объем настоящего изобретения входит связывание полипептида или белка посредством любой другой из указанных выше концевых модификаций. Полипептид или белок может придавать дополнительные свойства молекулам нуклеиновой кислоты согласно изобретению. Наряду с прочим полипептид или белок может действовать в качестве лиганда по отношению к другой молекуле. В том случае, когда указанная другая молекула является рецептором, функция и активность рецептора может быть активирована связывающим лигандом. Рецептор может проявлять активность в интернализации, которая обеспечивает возможность эффективной трансфекции связанных с лигандом молекул нуклеиновой кислоты. Примером лиганда, связываемого с молекулой нуклеиновой кислоты согласно изобретению, является VEGF, и соответствующим рецептором является рецептор VEGF.

Различные возможные варианты РНКi согласно настоящему изобретению, имеющие разные виды концевых модификаций, представлены в следующей далее таблице 1.

Таблица 1 Различные варианты интерферирующей рибонуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению
		1-я нить/1-й участок	2-я нить/2-й участок
1.)	5'-конец	Свободная ОН	Свободная ОН
	3'-конец	Свободная ОН	Свободная ОН

2.)	5'-конец	Свободная ОН	Свободная ОН
	3'-конец	Концевая модификация	Концевая модификация
3.)	5'-конец	Свободная ОН	Свободная ОН
	3'-конец	Свободная ОН	Концевая модификация
4.)	5'-конец	Свободная ОН	Свободная ОН
	3'-конец	Концевая модификация	Свободная ОН
5.)	5'-конец	Свободная ОН	Концевая модификация
	3'-конец	Свободная ОН	Свободная ОН
6.)	5'-конец	Свободная ОН	Концевая модификация
	3'-конец	Концевая модификация	Свободная ОН
7.)	5'-конец	Свободная ОН	Концевая модификация
	3'-конец	Свободная ОН	Концевая модификация
8.)	5'-конец	Свободная ОН	Концевая модификация
	3'-конец	Концевая модификация	Концевая модификация

Различные концевые модификации, которые описаны в данной публикации, предпочтительно локализованы на остатке рибозы нуклеотида рибонуклеиновой кислоты. Более конкретно концевая модификация может быть связана или может заменять любую из OH-групп остатка рибозы, включая без ограничения положения 2'-OH, 3'-OH и 5'-OH, при условии, что модифицированный таким образом нуклеотид является концевым нуклеотидом. Инвертированными AP-сайтами являются нуклеотиды, либо дезоксирибонуклеотиды, либо рибонуклеотиды, которые не имеют остатка нуклеинового основания. Такой вид соединения наряду с другими публикациями описан в (Sternberger et al., 2002).

Любая из указанных выше концевых модификаций может быть использована в связи с различными вариантами РНКi, представленными в таблице 1. В связи с этим следует отметить, что особенно предпочтительна любая из форм или вариантов РНКi, раскрытых в данном описании, с инактивированной смысловой нитью, предпочтительно благодаря наличию концевой модификации, более предпочтительно на 5'-конце. Это обусловлено инактивацией смысловой нити, которая соответствует второй нити рибонуклеиновых кислот, описанных в данной публикации, которая в противном случае может интерферировать с неродственной однонитевой РНК в клетке. Следовательно, осуществляется более специфичное воздействие на экспрессию и особенно картину трансляции транскриптона клетки. Такой эффект также называют неспецифическим «off-target» эффектом. Обращаясь к таблице 1, видно, что варианты, изображенные как варианты 7 и 8, являются особенно предпочтительными в указанном выше смысле, так как модификация приводит к инактивации - неспецифичной для мишени - части РНКi (которая представляет собой вторую нить), тем самым уменьшая любое неспецифичное взаимодействие второй нити с однонитевой РНК в клеточной или сходной системе, откуда происходит РНКi согласно настоящему изобретению, чтобы использовать нокдаун специфичных рибонуклеиновых кислот и белков, соответственно.

В следующем варианте нуклеиновая кислота согласно первому подаспекту имеет выступающий конец на 5'-конце рибонуклеиновой кислоты. Более конкретно, такой выступающий конец, в принципе, может присутствовать на любой первой или второй нити или на обеих нитях рибонуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению. Длина указанного выступающего конца может составлять минимум один нуклеотид и до 2-8 нуклеотидов, предпочтительно 2, 4, 6 или 8 нуклеотидов. В объеме настоящего изобретения предусмотрено, что выступающий 5'-конец может быть локализован на первой нити и/или второй нити рибонуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению. Нуклеотиды (нуклеотид), образующие выступающий конец, могут представлять собой (a) дезоксирибонуклеотид(ы), (a) рибонуклеотид(ы) или их комбинацию.

Выступающий конец предпочтительно содержит, по меньшей мере, один дезоксирибонуклеотид, при этом указанный один дезоксирибонуклеотид предпочтительно является 5'-концевым дезоксирибонуклеотидом. В объеме настоящего изобретения предполагается, что 3'-конец соответствующей противоположной нити рибонуклеиновой кислоты согласно изобретению не имеет выступающего конца, более предпочтительно не имеет выступающего дезоксирибонуклеотида. И при этом опять-таки любая из рибонуклеиновых кислот согласно изобретению может содержать концевую модификацию согласно схеме, которая указана в связи с таблицей 1, и/или концевую модификацию, которая указана в данном описании.

Имея в виду участок непрерывно следующих друг за другом нуклеотидов, картина, предпочтительно правильная и/или повторяющаяся картина модификации(ий) нуклеотидов, образующих участок, может быть представлена в одном варианте так, что один нуклеотид или группа нуклеотидов, которые ковалентно связаны друг с другом посредством стандартных фосфодиэфирных связей или, по меньшей мере, частично посредством фосфоротиоатных связей, имеет такой вид модификации. В том случае, когда такой нуклеотид или группа нуклеотидов, которую также называют в данном описании группой модифицированных нуклеотидов, не образуют 5'-конец или 3'-конец указанного участка, за нуклеотидом или группой нуклеотидов с обеих сторон следует нуклеотид, который не имеет такой модификации, как предшествующий нуклеотид или группа нуклеотидов. Однако следует отметить, что такой вид нуклеотида или группы нуклеотидов может иметь другую модификацию. Такой вид нуклеотида или группы нуклеотидов также называют в данном описании фланкирующей группой нуклеотидов. Указанная последовательность модифицированного нуклеотида и группы модифицированных нуклеотидов, соответственно, и немодифицированного или иным образом модифицированного нуклеотида или группы немодифицированных или иным образом модифицированных нуклеотидов может повторяться один или несколько раз. Предпочтительно последовательность повторяется более одного раза. Для ясности картина обсуждается более подробно далее в описании, в общем относящемся к группе модифицированных нуклеотидов или группе немодифицированных нуклеотидов, при этом каждая из указанных групп в действительности может содержать всего один нуклеотид. Термин «немодифицированный» нуклеотид в используемом в настоящем описании смысле означает либо не имеющий какой-либо из указанных выше модификаций в соответствующем нуклеотиде или в нуклеотидах, образующих соответствующую группу нуклеотидов, или имеющий модификацию, которая отличается от модификации модифицированного нуклеотида и группы нуклеотидов, соответственно.

Также в объеме настоящего изобретения предполагается, что модификация немодифицированного нуклеотида(ов) в том случае, когда такой немодифицированный нуклеотид(ы) в действительности модифицирован, но иным образом, отличным от модификации модифицированного нуклеотида(ов), может быть одинаковой или разной для разных нуклеотидов, составляющих указанные немодифицированные нуклеотиды, или для различных фланкирующих групп нуклеотидов.

Картина распределения модифицированных и немодифицированных нуклеотидов может быть таковой, что 5'-конец нити или участка начинается с модифицированной группы нуклеотидов или начинается с немодифицированной группы нуклеотидов. Однако в альтернативном варианте также возможно, что 5'-концевой нуклеотид образован немодифицрованной группой нуклеотидов.

Указанный вид распределения может быть осуществлен либо на первом участке, либо на втором участке интерферирующей РНК, либо на обоих участках. Следует отметить, что 5'-фосфат на нити дуплекса миРНК, комплементарной мишени, требуется для функционирования миРНК, что свидетельствует о том, что клетки проверяют аутентичность миРНК по свободной 5'-OH (которая может быть фосфорилирована) и позволяют только таким истинным миРНК управлять разрушением РНК-мишени (Nykanen et al., 2001).

Предпочтительно на первом участке наблюдается такой вид картины распределения модифицированных и немодифицированных групп нуклеотидов, т.е. группы (групп) модифицированных нуклеотидов и флакирующей группы (групп) нуклеотидов, тогда как на втором участке не наблюдается такой картины распределения или совсем не наблюдается никакой картины распределения. Это может быть полезным, поскольку первый участок в действительности является более важным участком для специфичного для мишени процесса распада, лежащего в основе явления интерференции РНК, так что в свете специфичности второй участок может быть химически модифицирован так, чтобы был нефункциональным в опосредовании интерференции РНК.

Однако в объеме настоящего изобретения также предполагается, что оба, и первый участок, и второй участок, имеют такой вид картины распределения. Предпочтительно картина модификации и отсутствия модификации одинакова на обоих участках, и первом участке, и втором участке.

В предпочтительном варианте группа нуклеотидов, образующих второй участок и соответствующих модифицированной группе нуклеотидов первого участка, также модифицированы, тогда как немодифицированная группа нуклеотидов второго участка или образующих второй участок соответствует немодифицированной группе нуклеотидов первого участка или образующих первый участок. Другой альтернативный вариант заключается в том, что имеет место сдвиг по фазе картины модификации первого участка и первой нити, соответственно, по сравнению с картиной модификации второго участка и второй нити, соответственно. Предпочтительно сдвиг таков, что модифицированная группа нуклеотидов первой нити соответствует немодифицированной группе нуклеотидов второй нити и наоборот. Также в объеме настоящего изобретения предполагается, что сдвиг по фазе картины модификации перекрывается, но не полностью.

В предпочтительном варианте второй нуклеотид на конце нити и участка, соответственно, является немодифицированным нуклеотидом или началом группы немодифицированных нуклеотидов. Предпочтительно такой немодифицированный нуклеотид или немодифицированная группа нуклеотидов располагаются на 5'-конце первой и второй нити, соответственно, и еще более предпочтительно, первой нити. В следующем предпочтительном варианте немодифицированный нуклеотид или немодифицированная группа нуклеотидов расположена на 5'-конце первой нити и первого участка, соответственно. В предпочтительном варианте картина состоит из чередующихся отдельных модифицированных и немодифицированных нуклеотидов.

В следующем предпочтительном варианте данного аспекта настоящего изобретения интерферирующая рибонуклеиновая кислота содержит две нити, при этом 2'-O-метил-модифицированный нуклеотид и немодифицированный нуклеотид, предпочтительно нуклеотид, который не имеет 2'-O-метил-модификации, включены в обе нити, чередуясь при этом, что означает, что каждый второй нуклеотид является 2'-O-метил-модифицированным и немодифицированным нуклеотидом, соответственно. Это значит, что в первой нити за одним 2'-O-метил-модифицированным нуклеотидом следует немодифицированный нуклеотид, за которым в свою очередь следует 2'-O-метил-модифицированный нуклеотид и т.д. Такая же последовательность 2'-O-метил-модификации и отсутствия модификации существует во второй нити, при этом предпочтительно имеет место сдвиг по фазе, так что 2'-O-метил-модифицированный нуклеотид в первой нити образует пару оснований с немодифицированным нуклеотидом(ами) во второй нити и наоборот. Такое конкретное расположение, т.е. спаривание оснований 2'-O-метил-модифицированного и немодифицированный нуклеотида(ов) на обеих нитях, является особенно предпочтительным в случае коротких интерферирующих рибонуклеиновых кислот, т.е. коротких двунитевых рибонуклеиновых кислот со спаренными основаниями, поскольку предполагается, несмотря на то, что авторы настоящего изобретения не имеют намерения быть связанными с такой теорией, что существует некоторое отталкивание между двумя спаривающимися 2'-O-метил-модифицированными нуклеотидами, которое может дестабилизировать такой дуплекс, предпочтительно короткие дуплексы. Что касается конкретного расположения, то предпочтительным является вариант, когда антисмысловая нить начинается с 2'-O-метил-модифицированного нуклеотида на 5'-конце, следовательно при этом второй нуклеотид является немодифицированным, таким образом третий, пятый, седьмой и т.д. нуклеотиды снова являются 2'-O-метил-модифицированными, тогда как второй, четвертый, шестой, восьмой и тому подобные нуклеотиды являются немодифицированными нуклеотидами. И снова, не имея намерения быть связанными какой-либо теорией, авторы предполагают, что по-видимому особую важность можно приписать второму и необязательно четвертому, шестому, восьмому и/или подобному положению (положениям) на 5'-конце антисмысловой нити, которое не должно содержать никакой модификации, тогда как самый крайний 5'-концевой нуклеотид, т.е. первый 5'-концевой нуклеотид антисмысловой нити может иметь такую модификацию, а также любые нечетные положения, такие как первое, необязательно третье, пятое и подобное положение (положения) антисмысловой нити могут быть модифицированы. В следующих вариантах модификация и отсутствие модификации, соответственно модифицированного и немодифицированного нуклеотида(ов), соответственно, могут быть любыми, как описано в данной публикации. В более конкретном варианте двунитевая молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению состоит из первой нити из 19, 21 или 23 непрерывно следующих друг за другом нуклеотидов и второй нити из 19, 21 или 23 непрерывно следующих друг за другом нуклеотидов, при этом первая нить и вторая нить по существу комплементарны друг другу. Кроме того, в указанном более конкретном варианте двунитевая структура имеет тупые концы на обоих концах. Первая нить, которая по существу комплементарная нуклеиновой кислоте-мишени, т.е. мРНК, кодирующей PKN3, начинается на 5'-конце с нуклеотида, который метилирован по 2'-OH-группе с образованием 2'O-Me-группы. Каждый второй нуклеотид такой первой нити имеет такую же модификацию, т.е. метилирован по 2'-OH-группе. Таким образом, первое, третье, пятое и т.д., т.е. любое нечетное положение нуклеотида первой нити модифицировано таким образом. Нуклеотиды в четных положениях первой нити являются либо немодифицированными нуклеотидами, либо модифицированными нуклеотидами, при этом модификация отличается от модификации нуклеотидов в нечетных положениях нуклеотидов первой нити. Вторая нить, также предпочтительно содержащая 19, 21 или 23 нуклеотида, имеет модифицированный нуклеотид во втором, четвертом, шестом и т.д., т.е. в любом четном положении нуклеотида. Любые другие нуклеотиды являются немодифицированными нуклеотидами или модифицированными нуклеотидами, при этом модификация отличается от модификации нуклеотидов в четных положениях нуклеотидов первой нити. Следовательно, вторая нить начинается на 5'-конце с немодифицированного нуклеотида в указанном выше смысле. В более предпочтительном варианте модификация модифицированных нуклеотидов первой и второй нити одна и та же, и модификация немодифицированных нуклеотидов первой и второй нити также одна и та же. В предпочтительном варианте 5'-конец антисмысловой, т.е. первой нити, имеет OH-группу, которая предпочтительно может быть фосфорилирована в клетке, предпочтительно в клетке-мишени, при этом молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению должна быть активной или функциональной, или имеет фосфатную группу. 5'-конец смысловой нити, т.е. второй нити, предпочтительно также модифицирован, более предпочтительно модифицирован как описано в данной публикации. Любой или оба 3'-конца в одном варианте имеют концевой фосфат.

В объеме настоящего изобретения предполагается, что двунитевая структура образована двумя отдельными нитями, т.е. первой и второй нитью. Однако в объеме настоящего изобретения также предполагается, что первая нить и вторая нить ковалентно связаны друг с другом. Такая связь может иметь место между любыми нуклеотидами, образующими первую нить и вторую нить, соответственно. Однако предпочтительно, чтобы связь между двумя нитями была ближе к одному или к обоим концам двунитевой структуры. Такая связь может быть образована ковалентным или нековалентным связыванием. Ковалентная связь может быть образована в результате связывания двух нитей один или несколько раз и в нескольких положениях, соответственно, соединением, выбранным из группы, состоящей из метиленового синего и бифункциональных групп. Такие бифункциональные группы предпочтительно выбраны из группы, состоящей из бис(2-хлорэтил)амина, N-ацетил-N'-(п-глиоксилбензоил)цистамина, 4-тиоурацила и псоралена.

В следующем варианте рибонуклеиновой кислоты согласно любому из подаспектов первого аспекта настоящего изобретения первая нить и вторая нить связаны структурой петли.

В предпочтительном варианте рибонуклеиновой кислоты согласно подаспектам первого аспекта настоящего изобретения структура петли состоит из полимера, отличного от нуклеиновой кислоты.

В предпочтительном варианте полимером, отличным от нуклеиновой кислоты, является полиэтиленгликоль.

В одном варианте рибонуклеиновой кислоты согласно любому из подаспектов первого аспекта настоящего изобретения 5'-конец первой нити связан с 3'-концом второй нити.

В следующем варианте рибонуклеиновой кислоты согласно любому из аспектов настоящего изобретения 3'-конец первой нити связан с 5'-концом второй нити.

В одном варианте петля состоит из нуклеиновой кислоты. В используемом в данном описании смысле LNA, которая описана в Elayadi and Corey (Elayadi et al., 2001); (Orum and Wengel, 2001); и PNA рассматривают в качестве нуклеиновых кислот, и они также могут быть использованы в качестве полимеров, образующих петли. В основном, 5'-конец первой нити может быть связан с 3'-концом второй нити. В качестве альтернативы 3'-конец первой нити может быть связан с 5'-концом второй нити. Нуклеотидную последовательность, образующую указанную структуру петли, в общем не считают решающим фактором. Однако длина нуклеотидной последовательности, образующей такую петлю, по-видимому, важна по стерическим причинам. Соответственно, минимальная длина из четырех нуклеотидов, по-видимому, является подходящей для образования требуемой структуры петли. В принципе максимальное количество нуклеотидов, образующих шарнир или связь между обоими гибридизуемыми участками или нитями, не ограничено. Однако чем длиннее полинуклеотид, тем с большей вероятностью образуются вторичная и третичная структуры и соответственно возникает требуемая ориентация участков. Предпочтительно максимальное количество нуклеотидов, образующих шарнир, составляет примерно 12 нуклеотидов. В описании настоящей заявки показано, что любую из описанных выше конструкций можно комбинировать с любыми другими конструкциями, раскрытыми в настоящем описании и известными в данной области, соответственно, т.е. в результате ковалентного связывания двух нитей таким образом, что может возникать укладка в обратную сторону посредством структуры петли или сходной структуры.

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что если петля помещена на 3'-конце антисмысловой нити, т.е. первой нити рибонуклеиновой кислоты (кислот) согласно настоящему изобретению, то активности такого вида РНКi выше по сравнению с вариантом, когда петля размещена на 5'-конце антисмысловой нити. Следовательно, конкретное расположение петли относительно антисмысловой нити и смысловой нити, т.е. первой нити и второй нити, соответственно, является важным, и такой вывод отличается от представлений предшествующего уровня техники о том, что ориентация не имеет никакого значения. Однако такие представления, по-видимому, не верны, принимая во внимание экспериментальные результаты, представленные в настоящем описании. Представления предшествующего уровня техники основаны на предположении о том, что любая РНКi подвергается процессингу, во время которого образуется не связанная петлей РНКi. Однако если бы это имело место, то явно наблюдаемое повышение активности таких структур, имеющих петлю, находящуюся на 3'-конце антисмысловой нити, нельзя было бы объяснить. Итак, предпочтительное расположение в 5' → 3'-направлении для такого вида малых интерферирующих РНКi: вторая нить - петля - первая нить. Соответствующие конструкции могут быть введены в подходящие векторные системы. Предпочтительно вектор содержит промотор для экспрессии РНКi. Предпочтительно подходящим промотором является промотор pol III и более предпочтительно промоторами являются промоторы U6, H1, 7SK, которые описаны в Good et al. (Good et al., 1997).

Второй подаспект первого аспекта настоящего изобретения относится к нуклеиновой кислоте согласно настоящему изобретению, в которой первый участок и/или второй участок содержат на 3'-конце динуклеотид, при этом такой динуклеотид предпочтительно представляет собой TT. В предпочтительном варианте длина первого участка и/или второго участка равна 19 или 21 или 23 нуклеотидам, и более предпочтительно двунитевая структура содержит от 18 до 22 и более предпочтительно от 19 до 21 пар оснований. Конструкция нуклеиновой кислоты согласно данному подаспекту более подробно описана, например, в международной публикации WO 01/75164.

Третий подаспект первого аспекта настоящего изобретения относится к нуклеиновой кислоте согласно настоящему изобретению, в которой первый и/или второй участок содержит выступающий конец из 1-5 нуклеотидов на 3'-конце. Конструкция нуклеиновой кислоты согласно данному подаспекту более подробно описана в международной публикации WO 02/44321. Более предпочтительно такой выступающий конец представляет собой рибонуклеиновую кислоту. В предпочтительном варианте каждая из нитей и более предпочтительно каждый из участков, которые определены в данном описании, имеет длину от 19 до 25 нуклеотидов, при этом более предпочтительно нить состоит из участка. В предпочтительном варианте двунитевая структура нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению содержит от 17 до 25 пар оснований, предпочтительно от 19 до 23 пар оснований, более предпочтительно 19, 21 или 23 пар оснований.

Четвертый подаспект первого аспекта настоящего изобретения относится к нуклеиновой кислоте согласно настоящему изобретению, в которой первый и/или второй участок содержат выступающий конец из 1-5 нуклеотидов на 3'-конце. Конструкция нуклеиновой кислоты согласно данному подаспекту описана в WO 02/44321.

В пятом подаспекте первого аспекта настоящего изобретения нуклеиновая кислота согласно настоящему изобретению является двунитевой нуклеиновой кислотой, которая представляет собой химически синтезированную двунитевую молекулу малой интерферирующей нуклеиновой кислоты (миНК), которая вызывает расщепление мРНК CD31, предпочтительно посредством интерференции РНК, при этом каждая нить указанной молекулы миНК имеет длину от 18 до 27 или от 19 до 29 нуклеотидов, и указанная молекула миНК содержит, по меньшей мере, один химически модифицированный нуклеотид, который уже не является нуклеотидом. Конструкция нуклеиновой кислоты согласно данному подаспекту более подробно описана в международной публикации WO 03/070910 и в патенте UK 2397062.

В одном варианте молекула миНК не содержит рибонуклеотидов. В другом варианте молекула миНК содержит один или несколько нуклеотидов. В другом варианте химически модифицированный нуклеотид является 2'-дезоксинуклеотидом. В другом варианте химически модифицированный нуклеотид является 2'-дезокси-2'-фтор-нуклеотидом. В другом варианте химически модифицированный нуклеотид является 2'-O-метил-нуклеотидом. В другом варианте химически модифицированный нуклеотид содержит фосфоротиоатную межнуклеотидную связь. В следующем варианте остаток, не являющийся нуклеотидом, представляет собой остаток, лишенный азотистого основания, при этом предпочтительно остаток, лишенный азотистого основания, является инвертированным остатком дезоксирибозы, лишенным азотистого основания. В другом варианте остаток, не являющийся нуклеотидом, является остатком глицерила.

В следующем варианте первая нить и вторая нить связаны линкерной молекулой. Предпочтительно линкерной молекулой является полинуклеотидный линкер. Альтернативно линкерной молекулой является ненуклеотидный линкер.

В следующем варианте нуклеиновой кислоты согласно пятому подаспекту пиримидиновые нуклеотиды во второй нити являются 2'-O-метилпиримидиновыми нуклеотидами.

В следующем варианте нуклеиновой кислоты согласно пятому подаспекту пуриновые нуклеотиды во второй нити являются 2'-дезоксипуриновыми нуклеотидами.

В следующем варианте нуклеиновой кислоты согласно пятому подаспекту пиримидиновые нуклеотиды во второй нити являются 2'-дезокси-2'-фтор-пиримидиновыми нуклеотидами.

В следующем варианте нуклеиновой кислоты согласно пятому подаспекту вторая нить содержит остаток концевого кэпа на 5'-конце, 3'-конце или на обоих 5'- и 3'-конце.

В следующем варианте нуклеиновой кислоты согласно пятому подаспекту пиримидиновые нуклеотиды в первой нити являются 2'-дезокси-2'-фтор-пиримидиновыми нуклеотидами.

В следующем варианте нуклеиновой кислоты согласно пятому подаспекту пуриновые нуклеотиды в первой нити являются 2'-O-метил-пуриновыми нуклеотидами.

В следующем варианте нуклеиновой кислоты согласно пятому подаспекту пуриновые нуклеотиды в первой нити являются 2'-дезокси-пуриновыми нуклеотидами.

В следующем варианте нуклеиновой кислоты согласно пятому подаспекту первая нить содержит фосфоротиоатную межнуклеотидную связь на 3'-конце первой нити.

В следующем варианте нуклеиновой кислоты согласно пятому подаспекту первая нить содержит модификацию глицерилом на 3'-конце первой нити.

В следующем варианте нуклеиновой кислоты согласно пятому подаспекту примерно от 19 до 23 нуклеотидов и первой и второй нити спариваются основаниями, и при этом предпочтительно, по меньшей мере, два 3'-концевых нуклеотида каждой нити молекулы миНК не спарены основаниями с нуклеотидами другой нити. Предпочтительно каждый из двух 3'-концевых нуклеотидов каждой нити молекулы миНК является 2'-дезоксипиримидином. Более предпочтительно 2'-дезоксипиримидин представляет собой 2'-дезокситимидин.

В следующем аспекте нуклеиновая кислота согласно пятому подаспекту на 5'-конце первой нити содержит фосфатную группу.

В частности, в одном варианте пятого подаспекта нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению молекула миНК согласно изобретению содержит модифицированные нуклеотиды, при этом сохраняя способность опосредовать РНКi. Модифицированные нуклеотиды можно использовать для улучшения свойств in vitro или in vivo, таких как стабильность, активность и/или биодоступность. Например, молекула миНК согласно изобретению может содержать модифицированные нуклеотиды, составляющие определенный процент от общего количества нуклеотидов, присутствующих в молекуле миНК. Как таковая молекула миНК согласно изобретению в общем может содержать примерно от 5% до примерно 100% модифицированных нуклеотидов (например, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% модифицированных нуклеотидов). Фактическое процентное содержание модифицированных нуклеотидов, присутствующих в данной молекуле миНК, будет зависеть от общего количества нуклеотидов, присутствующих в миНК. Если молекула миНК является однонитевой, то модификация в процентах может быть основана на общем количестве нуклеотидов, присутствующих в однонитевых молекулах миНК. Подобным образом, если молекула миНК является двунитевой, то модификация в процентах может быть основана на общем количестве нуклеотидов, присутствующих в смысловой нити, антисмысловой нити или в обеих, смысловой и антисмысловой нитях.

В не ограничивающем примере введение химически модифицированных нуклеотидов в молекулы нуклеиновой кислоты, в частности в пятом подаспекте нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, обеспечивает эффективное средство преодоления возможных ограничений стабильности и биодоступности in vivo, присущих нативным молекулам РНК, которые доставляются экзогенно. Например, использование химически модифицированных молекул нуклеиновой кислоты может обеспечить более низкую дозу конкретной молекулы нуклеиновой кислоты для данного терапевтического эффекта, так как имеется тенденция к более длительному времени полужизни в сыворотке химически модифицированных молекул нуклеиновой кислоты. Кроме того, некоторые химические модификации могут улучшить биодоступность молекул нуклеиновой кислоты посредством целенаправленного воздействия на конкретные клетки или ткани и/или улучшить поглощение клетками молекулы нуклеиновой кислоты. Поэтому даже если активность химически модифицированной молекулы нуклеиновой кислоты снижена по сравнению с нативной молекулой нуклеиновой кислоты, например, при сравнении с молекулой нуклеиновой кислоты из суммарной РНК, общая активность модифицированной молекулы нуклеиновой кислоты может быть выше, чем активность нативной молекулы вследствие повышенной стабильности и/или доставки молекулы. В отличие от немодифицированной миНК, химически модифицированные миНК также могут минимизировать возможность активации активности интерферона у человека.

Предпочтительно в связи с пятым подаспектом нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению антисмысловая нить, т.е. первая нить молекулы миНК согласно изобретению может содержать фосфоротиоатную межнуклеотидную связь на 3'-конце указанной антисмысловой области. Антисмысловая нить может содержать примерно от одной до пяти фосфоротиоатных связей не 5'-конце указанной антисмысловой области. 3'-концевые нуклеотидные выступы молекулы миНК согласно изобретению могут содержать рибонуклеотиды или дезоксирибонуклеотиды, которые химически модифицированы по сахару, основанию или остову нуклеиновой кислоты. 3'-концевые нуклеотидные выступы могут содержать один или несколько универсальных основных рибонуклеотидов. 3'-концевые нуклеотидные выступы могут содержать один или несколько ациклических нуклеотидов.

Специалистам в данной области будет понятно, что особенно такой вариант осуществления настоящего изобретения, в случае которого имеется петля, состоящая из нуклеотидов, подходит для использования и экспрессии с помощью вектора. Предпочтительно вектор представляет собой экспрессирующий вектор. Такой экспрессирующий вектор особенно применим для способов генной терапии. Соответственно такой вектор можно использовать для производства лекарственного средства, которое предпочтительно применяют для лечения заболеваний, указанных в настоящем описании. Однако специалистам в данной области также будет понятно, что любой вариант нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, который содержит любую не встречающуюся в природе модификацию, не может быть непосредственно использован для экспрессии в векторе и экспрессирующей системе для такого вектора, такой как клетка, ткань, орган и организм. Однако в объеме настоящего изобретения предполагается, что модификация может быть добавлена или введена в полученную с использованием вектора или экспрессированную с вектора нуклеиновую кислоту согласно настоящему изобретению, обычно после экспрессии нуклеиновой кислоты вектором. Особенно предпочтительным вектором является плазмидный вектор или вирусный вектор. Технические инструкции относительно того, как использовать молекулы миРНК и молекулы РНКi в экспрессирующем векторе, описаны, например, в международной публикации WO 01/70949. Специалистам в данной области будет понятно, что такой вектор предпочтительно применим в любом терапевтическом или диагностическом способе, в случае которого требуется и соответственно полезно длительное присутствие нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, тогда как невекторная нуклеиновая кислота согласно настоящему изобретению и, в частности, химически модифицированная или химически синтезированная нуклеиновая кислота согласно настоящему изобретению, особенно применима в том случае, когда требуется или полезно временное присутствие молекулы.

Способы синтеза молекулы нуклеиновой кислоты, описанной в данной публикации, известны специалистам в данной области. Такие способы, наряду с другими публикациями, описаны в (Caruthers et al., 1992), Thompson et al., международная публикация PCT No. WO 99/54459, (Wincott et al., 1995), (Wincott и Usman, 1997), Brennan et al., 1998, Biotechnol Bioeng., 61, 33-45, и Brennan, патент США 6001311. Все указанные публикации включены в данное описание в виде ссылки.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к липосомному препарату, содержащему и более конкретно включающему в себя одну или несколько молекул нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению. Предпочтительно такой липосомный препарат состоит из липидов (липида), ограничивающих внутренний объем. Такой внутренний объем предпочтительно содержит молекулу (молекулы) нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению. Более предпочтительно такой препарат содержит липосомы, при этом в предпочтительном варианте липосома содержит или включает в себя один или несколько катионных липидов. В наиболее предпочтительном варианте липосомный препарат содержит одну или несколько молекул нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, так что молекула (молекулы) нуклеиновой кислоты не выявляется или не присутствует на наружной поверхности липосомы. Предпочтительно в используемом в настоящем описании смысле наружная поверхность липосомы представляет собой поверхность липосомы, которая находится в контакте со средой, окружающей липосому, особенно в отличие от поверхности липосомы, которая находится в контакте с жидкостью, заключенной в липосоме. В особенно предпочтительном варианте молекула (молекулы) нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению упакованы или инкапсулированы указанной липосомой или в указанном липосомном препарате, соответственно.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к липоплексам, содержащим нуклеиновую кислоту согласно настоящему изобретению, при этом такие липоплексы состоят из одной или нескольких молекул нуклеиновой кислоты и одной или нескольких липосом. В предпочтительном варианте липоплекс состоит из одной липосомы и нескольких молекул нуклеиновой кислоты.

Липоплекс можно охарактеризовать следующим образом. Липоплекс согласно настоящему изобретению имеет дзета-потенциал примерно от 40 до 55 мВ, предпочтительно примерно от 45 до 50 мВ. Размер липоплекса согласно настоящему изобретению составляет примерно от 80 до 200 нм, предпочтительно примерно от 100 до 140 нм и более предпочтительно примерно от 110 нм до 130 нм, который определяют посредством динамического светорассеяния (QELS), такого как, например, с использованием анализатора размера субмикронных частиц N5 Beckman Coulter, согласно рекомендациям производителя.

Липосома в качестве части, формирующей липоплекс согласно настоящему изобретению, предпочтительно является положительно заряженной липосомой, состоящей из

Липоплекс и липидная композиция, образующие липосомы, предпочтительно содержат носитель. Однако липоплекс также может быть представлен в лиофилизированной форме. Липидная композиция, находящаяся в носителе, обычно образует дисперсию. Более предпочтительно носитель представляет собой водную среду или водный раствор, который также дополнительно охарактеризован в настоящем описании. Липидная композиция в носителе обычно образует липосому, при этом такая липосома предпочтительно также содержит носитель внутри.

Липидная композиция, находящаяся в носителе, и носитель, соответственно, предпочтительно имеют осмолярность примерно от 50 до 600 миллиосмоль/кг, предпочтительно примерно 250-350 миллиосмоль/кг и более предпочтительно примерно 280-320 миллиосмоль/кг.

Липосомы, предпочтительно образованные первым липидным компонентом и необязательно также первым вспомогательным липидом, предпочтительно в комбинации с первым липидным компонентом, предпочтительно имеют размер частиц примерно от 20 до 200 нм, предпочтительно примерно от 30 до 100 нм и более предпочтительно примерно от 40 до 80 нм.

Кроме того, будет понятно, что размер частицы подчиняется определенному статистическому распределению.

Следующим необязательным признаком липидной композиции согласно настоящему изобретению является то, что pH носителя предпочтительно составляет примерно от 4,0 до 6,0. Однако в объем настоящего изобретения также включены другие диапазоны pH, такие как от 4,5 до 8,0, предпочтительно примерно от 5,5 до 7,5 и более предпочтительно примерно от 6,0 до 7,0.

Для реализации указанных конкретных признаков могут быть предприняты различные меры. Например, для корректировки осмолярности особенно применим сахар или комбинация сахаров. Поэтому липидная композиция согласно настоящему изобретению может содержать один или несколько из следующих сахаров: сахарозу, трегалозу, глюкозу, галактозу, маннозу, мальтозу, лактулозу, инулин и раффинозу, при этом особенно предпочтительны сахароза, трегалоза, инулин и раффиноза. В особенно предпочтительном варианте осмолярность, которую в основном доводят добавлением сахара, составляет примерно 300 миллиосмоль/кг, что соответствует раствору сахарозы с концентрацией 270 мМ или раствору глюкозы с концентрацией 280 мМ. Предпочтительно носитель является изотоничным по отношению к жидкости организма, в который вводят такую липидную композицию. В используемом в настоящем описании смысле выражение «осмолярность в основном доводят добавлением сахара» означает, что, по меньшей мере, примерно 80%, предпочтительно, по меньшей мере, примерно 90% осмолярности обеспечивается указанным сахаром или комбинацией указанных сахаров.

Если корректируют pH липидной композиции согласно настоящему изобретению, то это осуществляют, используя буферные вещества, которые как таковые по существу известны специалисту в данной области. Предпочтительно используют основные вещества, которые подходят для компенсирования основных свойств катионных липидов и более конкретно аммонийной группы катионной «головки». При добавлении основных веществ, таких как основные аминокислоты и слабые основания, соответственно, учитывают указанную выше осмолярность. Размер частиц такой липидной композиции и липосом, образованных такой липидной композицией, предпочтительно определяют с использованием динамического светорассеяния, например с использованием анализатора размера субмикронных частиц N5 Beckman Coulter согласно рекомендации производителя.

Если липидная композиция содержит одну или несколько нуклеиновых кислот, то такая липидная композиция обычно образует комплекс липоплекс, т.е. комплекс, состоящий из липосомы и нуклеиновой кислоты. Более предпочтительная концентрация общего липидного содержимого в липоплексе предпочтительно в изотоничной 270 мМ сахарозе или 280 мМ глюкозе составляет примерно от 0,01 до 100 мг/мл, предпочтительно от 0,01 до 40 мг/мл и более предпочтительно от 0,01 до 25 мг/мл. Необходимо понимать, что такая концентрация может быть увеличена, чтобы получить подходящий маточный раствор, обычно в 2-3 раза. Также в объеме настоящего изобретения предполагается, что на основании маточного раствора готовят разведение, при этом такое разведение обычно готовят так, чтобы осмолярность была в диапазоне, указанном выше. Более предпочтительно разведение готовят в носителе, который идентичен или по своей функции и более конкретно по осмолярности сходен с носителем, используемым в случае липидной композиции, или в котором находится липидная композиция. В варианте липидной композиции согласно настоящему изобретению, в котором липидная композиция также содержит нуклеиновую кислоту, предпочтительно функциональную нуклеиновую кислоту, такую как без ограничения миРНК, концентрация миРНК в липидной композиции составляет примерно от 0,2 до 0,4 мг/мл, предпочтительно 0,28 мг/мл, и общая концентрация липидов составляет примерно от 1,5 до 2,7 мг/мл, предпочтительно 2,17 мг/мл. Необходимо понимать, что указанное соотношение масс между фракцией нуклеиновой кислоты и липидной фракцией особенно предпочтительно, то же касается соотношения зарядов, достигаемого таким образом. Что касается любой дополнительной концентрации или разведения липидной композиции согласно настоящему изобретению, то предпочтительно, чтобы соотношение масс и соотношение зарядов, соответственно, достигаемых в таком конкретном варианте, предпочтительно сохранялось, несмотря на такую концентрацию или разведение.

Такая концентрация, которая, например, используется в фармацевтической композиции, может быть получена либо диспергированием липида в подходящем количестве среды, предпочтительно физиологически приемлемого буфера или любого носителя, описанного в настоящей публикации, либо концентрированием подходящими способами. Такими подходящими способами являются, например, способы ультрафильтрации, включая ультрафильтрацию с поперечным потоком. Мембранный фильтр может иметь размер пор с пределом отсекания по молекулярной массе (MWCO) от 1000 до 300000 Да или от 5 нм до 1 мкм. Особенно предпочтителен размер пор с MWCO примерно от 10000 до 100000 Да. Также специалисту в данной области будет понятно, что липидная композиция, более конкретно липоплексы согласно настоящему изобретению, могут быть представлены в лиофилизированной форме. Такую лиофилизированную форму обычно применяют для увеличения срока годности липоплекса. В указанной связи добавляемый сахар, который наряду с прочим нужен для обеспечения подходящей осмолярности, используют в качестве криопротектора. В связи с этим следует понимать, что указанные выше характеристики осмолярности, pH, а также концентрации липоплекса относятся к растворенной, суспендированной или диспергированной форме липидной композиции в носителе, при этом такой носитель в принципе может представлять собой любой носитель, описанный в данной публикации, и обычно водный носитель, такой как вода или физиологически приемлемый буфер, предпочтительно изотонический буфер или изотонический раствор.

Кроме такого конкретного препарата молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению также могут быть приготовлены в виде фармацевтических композиций, которые известны в данной области.

Соответственно молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению предпочтительно могут быть приспособлены для применения в качестве лекарственных средств и диагностических средств отдельно или в комбинации с другими способами терапии. Например, молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению может содержать носитель для доставки, включая липосомы, для введения субъекту, носители и разбавители и их соли, и/или может присутствовать в фармацевтически приемлемых препаратах. Способы доставки молекул нуклеиновой кислоты описаны в (Agrawal and Akhtar, 1995; Akhtar and Juliano, 1992), (Maurer et al., 1999); (Hofland and Huang, 1995); и Lee et al., 2000, ACS Symp. Ser., 752, 184-192, все публикации включены в данное описание в виде ссылки. Beigelman с соавторами в патенте США No. 6395713 и Sullivan с соавторами в публикации PCT WO 94/02595 дополнительно описывают общие способы доставки молекул нуклеиновой кислоты. Такие протоколы можно использовать для доставки практически любой молекулы нуклеиновой кислоты. Молекулы нуклеиновых кислот также могут быть введены в клетки множеством способов, известных специалистам в данной области, включая без ограничения инкапсулирование в липосомы, ионтофорез или введение в другие носители, такие как гидрогели, циклодекстрины (смотри, например, Gonzalez et al., 1999), биоразрушаемые нанокапсулы и биоадгезивные микросферы или белковые векторы (O'Hare and Normand, международная публикация PCT No. WO 00/53722). Альтернативно комбинацию нуклеиновая кислота/носитель доставляют местно прямой инъекцией или с использованием насоса для инфузии. Прямая инъекция молекул нуклеиновых кислот согласно изобретению, либо подкожная, либо внутримышечная, либо интрадермальная, может быть осуществлена со стандартными способами с использованием игл и шприцев или способами без применения игл, такими как способы, описанные в (Conry et al., 1999) и Barry et al., международная публикация PCT No. WO 99/31262. Молекулы согласно настоящему изобретению можно применять в качестве фармацевтических средств. Предпочтительно фармацевтические средства предотвращают, модулируют протекание или лечат (в определенной степени ослабляют симптом, предпочтительно все симптомы) патологическое состояния у субъекта.

Таким образом, настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей одну или несколько нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению в приемлемом носителе, таком как стабилизатор, буфер и тому подобное. Полинуклеотиды или нуклеиновая кислота (молекулы) согласно изобретению могут быть введены (например, РНК, ДНК или белок) субъекту стандартными способами вместе со стабилизаторами, буферами и тому подобным, или без таковых, в виде фармацевтической композиции. В том случае, когда требуется использование механизма липосомной доставки, можно следовать стандартным протоколам образования липосом. Композиции согласно настоящему изобретению также могут быть приготовлены и использованы в виде таблеток, капсул или эликсиров для перорального введения, суппозиториев для ректального введения, стерильных растворов, суспензий для инъекционного введения и других композиций, известных в данной области.

Кроме того, предлагаются фармацевтически приемлемые препараты молекул нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению. Такие препараты содержат соли указанных выше соединений, например, кислотно-аддитивные соли, например, соли хлористоводородной, бромистоводородной, уксусной кислоты и бензолсульфоновой кислоты.

Фармакологическая композиция или препарат относятся к композиции или препарату в форме, подходящей для введения, например, системного введения, в клетку или субъекту, включая, например, человека. Подходящие формы отчасти зависят от применения и пути поступления, например, перорального, трансдермального или посредством инъекции. Такие формы не должны препятствовать достижению композицией или препаратов клетки-мишени (т.е., клетки, к которой необходимо доставить отрицательно заряженную нуклеиновую кислоту). Например, фармакологические композиции, инъецированные в кровоток, должны быть растворимы. В данной области известны другие факторы, включая учет таких факторов, как токсичность и формы, которые препятствуют проявлению действия композиции или препарата.

Термин «системное введение» предпочтительно означает системное всасывание и накопление лекарственных средств in vivo в кровотоке с последующим распределением по всему организму. Пути введения, которые приводят к системному всасыванию, включают без ограничения: внутривенный, подкожный, внутрибрюшинный, ингаляционный, пероральный, внутрилегочный и внутримышечный. Каждый из таких путей введения подвергает доступную пораженную заболеванием ткань воздействию молекул миНК согласно изобретению. Показано, что скорость поступления лекарственного средства в циркуляцию является функцией молекулярной массы или размера. Использованием липосомы или другого носителя лекарственного средства, содержащих нуклеиновые кислоты согласно настоящему изобретению, потенциально может локализовать лекарственное средство, например, в некоторых типах тканей, таких как непластическая ткань (ткани). Также применим липосомный препарат, который может облегчать ассоциацию лекарственного средства с поверхностью клеток, таких как лимфоциты и макрофаги. Такой способ может обеспечивать усиленную доставку лекарственного средства к клеткам-мишеням благодаря использованию преимущества специфичности иммунного узнавания макрофагами и лимфоцитами аномальных клеток, таких как клетки, образующие неопластическую ткань.

«Фармацевтически приемлемый препарат» предпочтительно означает композицию или препарат, который обеспечивает эффективное распределение молекул нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению в физическом пространстве, наиболее подходящее для требуемой активности. Не ограничивающие примеры или средства, подходящие для приготовления препарата молекул нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, включают: ингибиторы P-гликопротеина (такие как плюроник P85), которые могут усиливать поступление лекарственных средств в ЦНС (Jolliet-Riant and Tillement, 1999); биоразрушаемые полимеры, такие как микросферы из поли(сополимер DL-лактид-гликолид) для доставки в результате длительного высвобождения после интрацеребральной имплантации (Emerich et al., 1999) (Alkermes, Inc. Cambridge, MA); и заполняемые наночастицы, такие как наночастицы, изготовленные из полибутилцианоакрилата, которые могут доставлять лекарственные средства через гематоэнцефалический барьер и могут изменять механизмы нейронного захвата (Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry, 23, 941-949, 1999). Другие не ограничивающие примеры способов доставки молекул нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению включают способ, описанный в (Boado et al., 1998); Tyler et al., 1999, FEBS Lett., 421, 280-284; Pardridge et al., 1995, PNAS USA., 92,5592-5596; Boado, 1995, Adv. Drug Delivery Rev., 15,73-107; Aldrian-Herrada et al., 1998, Nucleic Acids Res., 26, 4910-4916; и Tyler et al., 1999, PNAS USA, 96, 7053-7058.

Согласно настоящему изобретению также предлагается применение композиции, содержащей поверхностно-модифицированные липосомы, содержащие поли(этиленгликоль)липиды (PEG-модифицированные или длительно циркулирующие липосомы или стелс-липосомы). Такие препараты обеспечивают способ увеличения накопления лекарственных средств в тканях-мишенях. Такой класс носителей лекарственных средств не поддается опсонизации и элиминации системой мононуклеарных фагоцитов (MPS или RES), тем самым обеспечивая более длительную циркуляцию в крови и усиленное воздействие на ткань инкапсулированным лекарственным средством (Lasic et al. Chem. Rev. 1995, 95, 2601-2627; Ishiwata et al., Chem. Pharm. Bull. 1995, 43, 1005-1011). Показано, что такие липосомы избирательно накапливаются в опухолях, вероятно путем экстравазации и захвата в подвергнутых неоваскуляризации тканях-мишенях (Lasic et al., Science 1995, 267, 1275-1276; Oku et al., 1995, Biochim. Biophys. Acta, 1238, 86-90). Длительно циркулирующие липосомы усиливают фармакокинетику и фармакодинамику ДНК и РНК, особенно по сравнению с обычными катионными липосомами, которые, как известно, накапливаются в тканях MPS (Liu et al., J. Biol. Chem. 1995, 42,24864-24780; Choi et al., международная публикация PCT No. WO 96/10391; Ansell et al., международная публикация PCT No. WO 96/10390; Holland et al., международная публикация PCT No. WO 96/10392). Вероятно, длительно циркулирующие липосомы также в большей степени защищают лекарственные средства от разрушения нуклеазами по сравнению с катионными липосомами благодаря их способности избегать накопления в метаболически агрессивных тканях MPS, таких как печень и селезенка.

Кроме того, предлагаются композиции, приготовленные для хранения и введения, которые содержат фармацевтически эффективное количество требуемых соединений в фармацевтически приемлемом носителе или разбавителе. Приемлемые носители или разбавители для терапевтического применения хорошо известны в фармацевтической области и описаны, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro, edit. 1985), публикация включена в данное описание в виде ссылки. Например, могут быть предусмотрены консерванты, стабилизаторы, красители и корригенты. К ним относятся бензоат натрия, сорбиновая кислота и сложные эфиры п-гидроксибензойной кислоты. Кроме того, могут быть использованы антиоксиданты и суспендирующие агенты.

Фармацевтически эффективная доза представляет собой дозу, которая необходима для предотвращения, ингибирования распространения или лечения (в некоторой степени ослабления симптома, предпочтительно всех симптомов) патологического состояния. Фармацевтически эффективная доза зависит от типа заболевания, применяемой композиции, пути введения, вида млекопитающего, подвергаемого лечению, физических показателей конкретного рассматриваемого млекопитающего, сопутствующего лечения и других факторов, которые известны специалистам в области медицины. Как правило вводят количество активных ингредиентов от 0,1 мг/кг до 100 мг/кг массы тела/сутки в зависимости от эффективности отрицательно заряженного полимера.

Молекулы нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению и их препараты можно вводить перорально, местно, парентерально, с помощью ингаляции или спрея или ректально в виде стандартных дозированных препаратов, содержащих обычные нетоксичные фармацевтически приемлемые носители, адъюванты и/или наполнители. Термин «парентеральные» в используемом в настоящем описании смысле включает чрескожные, подкожные, внутрисосудистые (например, внутривенные), внутримышечные или интратекальные инъекционные или инфузионные способы и тому подобные. Кроме того, предлагается фармацевтический препарат, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты согласно изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Одна или несколько молекул нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению могут присутствовать в ассоциации с одним или несколькими нетоксичными фармацевтически приемлемыми носителями и/или разбавителями и/или адъювантами, и при необходимости другими активными ингредиентами. Фармацевтические композиции, содержащие молекулы нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению, могут быть в форме, подходящей для перорального применения, например, в виде таблеток, пилюль, лепешек, водных или масляных суспензий, диспергируемых порошков или гранул, эмульсии, твердых и мягких капсул или сиропов или эликсиров.

Композиции, и, в частности, фармацевтические композиции, предназначенные для перорального применения, могут быть приготовлены согласно любому способу, известному в данной области для производства фармацевтических композиций, и такие композиции могут содержать один или несколько подсластителей, корригентов, красителей или консервантов, чтобы получить хорошие с фармацевтической точки зрения и приятные на вкус препараты. Таблетки содержат активный ингредиент в смеси с нетоксичными фармацевтически приемлемыми эксципиентами, которые подходят для производства таблеток. Такими эксципиентами могут быть, например, инертные разбавители, такие как карбонат кальция, карбонат натрия, лактоза, фосфат кальция или фосфат натрия; гранулирующие и дезинтегрирующие средства, например, кукурузный крахмал или альгиновая кислота; связывающие агенты, например крахмал, желатин или аравийская камедь; и скользящие вещества, например стеарат магния, стеариновая кислота или тальк. Таблетки могут быть непокрытыми оболочкой или они могут быть покрыты известными способами. В некоторых случаях такие покрытия могут быть получены известными способами для того, чтобы замедлить распад и всасывание в желудочно-кишечном тракте и таким образом обеспечить продолжительное действие в течение более длительного периода времени. Например, можно использовать замедляющее вещество, такое как глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат.

Препараты для перорального применения также могут быть представлены в виде твердых желатиновых капсул, в которых активный ингредиент смешан с инертным твердым разбавителем, например, карбонатом кальция, фосфатом кальция или каолином, или в виде мягких желатиновых капсул, в которых активный ингредиент смешан с водой или масляной средой, например арахисовым маслом, жидким парафином или оливковым маслом.

Водные суспензии содержат активные вещества в смеси с эксципиентами, подходящими для производства водных суспензий. Такими эксципиентами являются суспендирующие агенты, например, натрий-карбоксиметилцеллюлоза, метилцеллюлоза, гидропропилметилцеллюлоза, альгинат натрия, поливинилпирролидон, трагакантовая камедь и аравийская камедь; диспергирующими средствами или увлажнителями могут быть встречающиеся в природе фосфатиды, например лецитин, или продукты конденсации алкиленоксида с жирными кислотами, например, стеарат полиоксиэтилена, или продукты конденсации этиленоксида с имеющими длинные цепи алифатическими спиртами, например, гептадекаэтиленоксиоктанол, или продукты конденсации этиленоксида с неполными сложными эфирами, полученными из жирных кислот и гексита, такие как моноолеат полиоксиэтиленсорбита, или продукты конденсации этиленоксида с неполными сложными эфирами, полученными из жирных кислот и ангидридов гексита, например, моноолеат полиэтиленсорбитана. Водные суспензии также могут содержать один или несколько консервантов, например этил- или н-пропил-п-гидроксибензоат, один или несколько красителей, один или несколько корригентов и один или несколько подсластителей, таких как сахароза или сахарин.

Масляные суспензии могут быть приготовлены суспендированием активных ингредиентов в растительном масле, например, арахисовом масле, оливковом масле, кунжутном масле или кокосовом масле, или в минеральном масле, таком как жидкий парафин. Масляные суспензии могут содержать загуститель, например, пчелиный воск, твердый парафин или цетиловый спирт. Могут быть добавлены подсластители и корригенты, чтобы получить приятные на вкус пероральные препараты. Такие композиции могут быть защищены добавлением антиоксиданта, такого как аскорбиновая кислота.

Дисперсные порошки и гранулы, подходящие для получения водной суспензии при добавлении воды, представляют собой активный ингредиент в смеси с диспергирующим агентом или увлажнителем, суспендирующим агентом и одним или несколькими консервантами. Примерами диспергирующих агентов или увлажнителей или суспендирующих агентов являются агенты, уже указанные выше. Также могут присутствовать дополнительные эксципиенты, например, подсластители, корригенты и красители.

Фармацевтические композиции согласно изобретению также могут быть в форме эмульсий типа «масло в воде». Масляная фаза может быть представлена растительным маслом или минеральным маслом или их смесью. Подходящими эмульгаторами могут быть встречающиеся в природе камеди, например, аравийская камедь или трагакантовая камедь, встречающиеся в природе фосфатиды, например из соевых бобов, лецитин и сложные эфиры или неполные сложные эфиры, полученные из жирных кислот и гексита, ангидриды, например, моноолеат сорбитана, и продукты конденсации указанных неполных сложных эфиров с этиленоксидом, например, моноолеат полиоксиэтиленсорбитана. Эмульсии также могут содержать подсластители и корригенты.

Сиропы и эликсиры могут быть приготовлены с подсластителями, например, глицерином, пропиленгликолем, сорбитом, глюкозой или сахарозой. Такие препараты также могут содержать средство, уменьшающее раздражение, консерванты и корригенты и красители. Фармацевтические композиции могут быть в форме стерильной инъекционной водной или масляной суспензии. Такая суспензия может быть приготовлена согласно известным в данной области способам с использованием подходящих диспергирующих средств или увлажнителей и суспендирующих агентов, которые указаны выше. Стерильный инъекционный препарат также может представлять собой стерильный инъекционный раствор или суспензию в нетоксичном парентерально приемлемом разбавителе или растворителе, например, в виде раствора в 1,3-бутандиоле. К приемлемым носителям и растворителям, которые можно использовать, относятся вода, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, в качестве растворителя или суспензионной среды обычно используют стерильные нелетучие масла. Для такой цели можно использовать любое мягкое нелетучее масло, включая синтетические моно- или диглицериды. Кроме того, жирные кислоты, такие как олеиновая кислота, находят применение при получении инъекционных средств.

Молекулы нуклеиновых кислот согласно изобретению также можно вводить в форме суппозиториев, например, для ректального введения лекарственного средства. Такие композиции могут быть получены смешиванием лекарственного средства с подходящим не раздражающим эксципиентом, который является твердым при обычных температурах, но становится жидким при ректальной температуре и поэтому будет плавиться в прямой кишке, высвобождая лекарственное средство. К таким веществам относятся масло какао и полиэтиленгликоли.

Молекулы нуклеиновых кислот согласно изобретению можно вводить парентерально в стерильной среде. Лекарственное средство в зависимости от используемого наполнителя и концентрации может быть либо суспендировано, либо растворено в наполнителе. Предпочтительно в наполнителе могут быть растворены адъюванты, такие как местные анестетики, консерванты и буферные средства.

Дозовые уровни лекарственного средства и фармацевтической композиции, соответственно, могут быть определены специалистами в данной области с помощью обычного экспериментирования.

Следует понимать, что конкретный уровень дозы для любого конкретного пациента зависит от множества факторов, включая активность конкретного применяемого соединения, возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол, диету, время введения, путь введения и скорость выведения, комбинацию лекарственных средств и тяжесть конкретного заболевания, подвергаемого лечению.

Для введения лекарственного средства согласно настоящему изобретению животным, отличным от человека, таким как собаки, кошки, лошади, крупный рогаты скот, свиньи, козы, овцы, мыши, крысы, хомячки и морские свинки, композицию также предпочтительно можно добавлять в корм животным или питьевую воду. Может быть удобным приготовление композиций в виде корма и питьевой воды для животных так, чтобы животное принимало композицию в терапевтически подходящем количестве во время приема пищи. Также может быть удобным поставка композиции в виде премикса для добавления в корм и питьевую воду.

Молекулы нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению также можно вводить пациенту с комбинации с другими терапевтическими соединениями, чтобы повысить общий терапевтический эффект. Применение нескольких соединений для лечения показания может увеличить положительный эффект, снижая при этом наличие побочных эффектов.

В одном варианте молекулы нуклеиновых кислот в их различных вариантах, формах и препаратах, соответственно, можно применять вместе с другими способами терапии, такими как химиотерапия, криотерапия, гипертермия, терапия антителами, лучевая терапия и терапия, направленная против ангиогенеза. Особенно предпочтительным способом терапии является терапия, направленная против ангиогенеза. В связи с терапией против ангиогенеза особенно предпочтительными мишенями являются рецептор VEGF и рецептор PDGF. Терапию, направленную против ангиогенеза, обычно осуществляют, используя ингибиторы связанных с ангиогенезом мишеней, таких как рецептор VEGF и рецептор PDGF. Кроме малых молекул также могут быть созданы или предложены или использованы другие виды соединений, которые действуют как ингибиторы таких мишеней. Соответственно можно использовать следующие классы соединений: миРНК, которые описаны в WO 00/44895 или WO 01/75164, а также в других публикациях; антисмысловые молекулы, которые описаны в US 5849902, US 5989912 и других публикациях или известны как блокаторы генов; аптамеры, которые описаны в EP 0 533 838 B1, а также в других публикациях; шпигельмеры, которые описаны в WO 98/08856, наряду с другими публикациями; высоко аффинные связывающие пептиды, которые могут быть идентифицированы в библиотеках случайных пептидных последовательностей, содержащих от 10² до 10¹⁸ пептидов, различающихся по своей аминокислотной последовательности, подобно аптамерам и поэтому иногда также называемых пептидными аптамерами; антикалины, которые описаны в DE 19742706, наряду с другими публикациями; и антитела, которые описаны в «Antibodies: A Laboratory Manual», Cold Spring Harbor Laboratory (eds. Harlow, E. и Lane D.), а также в других публикациях.

В одном варианте предлагаются композиции, подходящие для введения молекул нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению в конкретные типы клеток, при этом такие композиции обычно содержат один или несколько из следующих действующих начал и молекул, соответственно. Например, рецептор асиалогликопротеина (ASGPr) (Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262, 4429-4432) является уникальным для гепатоцитов и связывает разветвленные гликопротеины, имеющие концевую галактозу, такие как асиалоорозомукоид (ASOR). В другом примере рецептор фолата сверхэкспрессируется во многих злокачественных клетках. Связывание таких гликопротеинов, синтетических гликоконъюгатов или фолатов с рецептором происходит с аффинностью, которая сильно зависит от степени разветвления олигосахаридной цепи, например, трехантенные структуры связываются с большей аффинностью, чем двухантенные или моноантенные цепи (Baenziger and Fiete, 1980, Cell, 22, 611-620; Connolly et al., 1982, J. Biol. Chem., 257, 939-945). Lee и Lee, 1987. Glycoconjugate J., 4, 317-328, получили такую специфичность, используя N-ацетил-D-галактозамин в качестве углеводного остатка, который имеет более высокую аффинность по отношению к рецептору по сравнению с галактозой. Такой «эффект кластеризации» также описан для связывания и поглощения заканчивающихся маннозилом гликопротеинов или гликоконъюгатов (Ponpipom et al., 1981, J. Med. Chem., 24, 1388-1395). Применение основанных на галактозе, галактозамине или фолате конъюгатов для транспорта экзогенных соединений через клеточные мембраны может обеспечить способ целенаправленной доставки, например, для лечения заболевания печени, злокачественных опухолей печени или других злокачественных опухолей. Применение биоконъюгатов также может обеспечить снижение требуемой дозы терапевтических соединений, требуемых для лечения. Кроме того, терапевтическая биодоступность, фармакодинамика и фармакокинетические параметры могут быть модулированы посредством применения биоконъюгатов нуклеиновых кислот согласно изобретению. Не ограничивающие примеры таких биоконъюгатов описаны в заявках Vargeese et al., US 10/201394, поданной 13 августа 2001; и Matulic-Adamic et al., US 60/362016, поданной 6 марта 2002.

Молекулы нуклеиновых кислот в их различных вариантах согласно настоящему изобретению, вектор, клетка, лекарственное средство, композиция и, в частности, фармацевтическая композиция, содержащие такие молекулы, ткань и животное, соответственно, согласно настоящему изобретению, содержащие такую молекулу нуклеиновой кислоты, можно использовать как для терапии, так и для диагностики, и в области исследовании.

Вследствие распределения PKN3 в различных тканях и эндотелии сосудов, вовлеченного в указанные далее заболевания, молекулу нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению можно применять для лечения и/или профилактики указанных заболеваний, предпочтительно заболеваний, которые характеризуются вовлечением PKN3 предпочтительно в механизм патологии или присутствием в патологической ткани, клетках, предпочтительно опухолевых клетках, которые являются PTEN-негативными.

Соответственно молекулы нуклеиновых кислот, которые раскрыты в настоящем описании, и содержащие их лекарственные средства и фармацевтические композиции можно применять как для проангиогенной, так и для антиангиогенной терапии, включая заболевания, характеризуемые или вызванные недостаточным, аномальным или избыточным ангиогенезом. Такие заболевания включают инфекционные болезни, аутоиммунные заболевания, аномалию сосудистой системы, атеросклероз, трансплантационную артериопатию, ожирение, псориаз, бородавки, аллергический дерматит, синдром персистирующего гиперпластического стекловидного тела, диабетическую ретинопатию, ретролентальную фиброплазию, старческое заболевание сетчатки, хороидальную неоваскуляризацию, первичную легочную гипертензию, астму, носовые полипы, воспалительное заболевание кишечника и воспалительное периодонтальное заболевание, асциты, перитонеальные спайки, эндометриоз, маточное кровотечение, кисты яичника, гиперстимуляцию яичников, артрит, синовит, остеомиелит, образование остеофитов и инсульт, язвы, атеросклероз и ревматоидный артрит.

К дополнительным заболеваниям относятся заболевания, в которые вовлечена или которые характеризуются наличием неопластической ткани. Предпочтительно в используемом в настоящем описании смысле термин «неопластические ткани» относится к тканям, которые образованы организмом, тканью или клетками такого организма, которые не должны образовываться и которые считаются патологическими, т.е. не присутствуют у субъекта, который не страдает соответствующим заболеванием. Также предпочтительно в используемом в настоящем описании смысле неопластическое заболевание представляет собой любое заболевание, которое либо прямо, либо опосредованно возникает в результате наличия неопластической ткани, при этом предпочтительно такая неопластическая ткань появляется в результате нерегулируемого или неконтролируемого, предпочтительно автономного роста ткани. Термин «непластические заболевания» предпочтительно также включает доброкачественные, а также злокачественные неопластические заболевания. Более предпочтительно неопластические заболевания выбраны из группы, состоящей из злокачественной опухоли, например, костей, молочной железы, простаты, пищеварительной системы, прямой и ободочной кишки, печени, легкого, почки, мочеполовой системы, поджелудочной железы, гипофиза, семенников, глаз, головы и шеи, центральной нервной системы, дыхательной системы.

Другие конкретные заболевания, которые в принципе можно лечить, используя фармацевтическую композицию и лекарственное средство согласно настоящему изобретению, включая такую липидную композицию и липоплекс, соответственно, можно выбрать из следующего списка: острый лимфобластный лейкоз (взрослых), острый лимфобластный лейкоз (у детей), острый миелоидный лейкоз (взрослых), острый миелоидный лейкоз (у детей), адренокортикальная карцинома, адренокортикальная карцинома (у детей), связанные со СПИДом злокачественные опухоли, связанная со СПИДом лимфома, рак заднего прохода, астроцитома (у детей), астроцитома мозжечка (у детей), рак головного мозга, рак внепеченочных желчных протоков, рак мочевого пузыря, рак мочевого пузыря (у детей), рак костей, остеосаркома/злокачественная фиброзная гистиоцитома, глиома ствола головного мозга (у детей), опухоль головного мозга (взрослых), опухоль головного мозга, глиома ствола головного мозга (у детей), опухоль головного мозга, астроцитома мозжечка (у детей), опухоль головного мозга, астроцитома/злокачественная глиома мозжечка (у детей), опухоль головного мозга, эпендимома (у детей), опухоль головного мозга, медуллобластома (у детей), опухоль головного мозга, супратенториальные примитивные нейроэктодермальные опухоли (у детей), опухоль головного мозга, глиома зрительного пути и гипоталамуса (у детей), опухоль головного мозга (у детей), рак молочной железы, рак молочной железы (у детей), рак молочной железы у мужчин, бронхиальные аденомы/карциноиды (у детей), лимфома Беркитта, карциноидная опухоль (у детей), карциноидная опухоль желудочно-кишечного тракта, карцинома неизвестной первичной локализации, лимфома центральной нервной системы, первичная, астроцитома мозжечка (у детей), астроцитома/злокачественная глиома головного мозга (у детей), рак шейки матки, хронический лимфоцитарный лейкоз, хронический миелогенный лейкоз, хронические миелопролиферативные заболевания, рак ободочной кишки, рая прямой и ободочной кишки (у детей), кожная T-клеточная лимфома, рак эндометрия, эпендимома (у детей), рак пищевода, рак пищевода (у детей), семейство опухолей Юинга, внечерепная герминогенная опухоль (у детей), внегонадная герминогенная опухоль, рак внепеченочных желчных протоков, рак глаза, внутриглазная меланома, рак глаза, ретинобластома, рак желчного пузыря, рак желудка, рак желудка (у детей), карционоидная опухоль желудочно-кишечного тракта, герминогенная опухоль внечерепная (у детей), герминогенная опухоль внегонадная, герминогенная опухоль яичника, гестационная трофобластная опухоль, глиома (взрослых), глиома (у детей) глиома ствола головного мозга (у детей), астроцитома головного мозга, глиома (у детей) зрительного пути и гипоталамуса, лейкоз ворсистых клеток, рак головы и шеи, гепатоклеточный рак (печени) (взрослых) (первичный), гепатоклеточный рак (печени) (у детей) (первичный), лимфома Ходжкина (взрослых), лимфома Ходжкина (у детей), гипофарингеальный рак, глиома гипоталамуса и зрительного пути (у детей), внутриглазная меланома, карцинома островковых клеток (эндокринная поджелудочная железа), саркома Капоши, рак почек (почечноклеточный), рак почек (у детей), рак гортани, рак гортани (у детей), лейкоз острый лимфобластоидный (взрослых), лейкоз острый лимфобластоидный (у детей), лейкоз острый миелоидный (взрослых), лейкоз острый миелоидный (у детей), хронический лимфоцитарный лейкоз, хронический миелогенный лейкоз, ворсистых клеток, рак губ и ротовой полости, рак печени (взрослых) (первичный), рак печени (у детей) (первичный), рак легкого немелкоклеточный, рак легкого мелкоклеточный, лимфома, связанная со СПИДом, лимфома Беркитта, лимфома кожная T-клеточная, лимфома Ходжкина (взрослых), лимфома Ходжкина (у детей), лимфома неходжкинская (взрослых), лимфома неходжкинская (у детей), лимфома первичная центральной нервной системы, макроглобулинемия, злокачественная фиброзная гистиоцитома Вальденстрема костей/остеосаркома, медуллобластома (у детей), меланома, меланома внутриглазная (глаза), карцинома из клеток Меркеля, мезотелиома (взрослых) злокачественная, мезотелиома (у детей), метастатический плоскоклеточный рак шеи со скрытым первичным синдромом множественной эндокринной неоплазии (у детей), множественная миелома/неоплазма из плазматических клеток, грибовидная гранулема, миелодиспластические синдромы, миелодиспластические/миелопролиферативные заболевания, миелогенный лейкоз, хронический миелоидный лейкоз (взрослых), острый миелоидный лейкоз (у детей), острая миелома, множественная, миелопролиферативные расстройства, хронический рак носовой полости и придаточных пазух носа, рак носоглотки, рак носоглотки (у детей), нейробластома, неходжкинская лимфома (взрослых), неходжкинская лимфома (у детей), немелкоклеточный рак легкого, рак ротовой полости (у детей), рак ротовой полости, рак губ и ротовой полости и глотки, остеосаркома/злокачественная фиброзная гистиоцитома кости, рак яичника (у детей), эпителиальный рак яичника, герминогенная опухоль яичника, потенциально низкозлокачественная опухоль яичника, рак поджелудочной железы, рак поджелудочной железы (у детей), рак островковых клеток поджелудочной железы, рак околоносовой пазухи и носовой полости, рак паращитовидной железы, рак полового члена, феохромоцитома, пинеобластома и супратенториальные примитивные нейроэктодермальные опухоли (у детей), опухоль гипофиза, неоплазма из плазматических клеток/множественная миелома, плевролегочная бластома, рак молочной железы у беременных, лимфома Ходжкина у беременных, неходжкинская лимфома у беременных, первичная лимфома центральной нервной системы, рак простаты, рак прямой кишки, почечноклеточный рак (почек), почечноклеточный рак (почек) (у детей), переходно-клеточный рак почечной лоханки и мочеточника, ретинобластома, рабдомиосаркома (у детей), рак слюнных желез, рак слюнных желез (у детей), саркома Юинга, саркома Капоши мягких тканей (взрослых), саркома мягких тканей (у детей), саркома матки, синдром Сезари, рак кожи (не меланома), рак кожи (у детей), рак кожи (меланома), карцинома кожи из клеток Меркеля, мелкоклеточный рак легкого, рак тонкого кишечника, саркома мягких тканей (взрослых), саркома мягких тканей (у детей), плоско-клеточная карцинома, плоскоклеточный рак шеи со скрытым первичным метастатическим раком желудка, рак желудка (у детей), супратенториальные примитивные нейроэктодермальные опухоли (у детей), T-клеточная лимфома кожная, рак семенников, тимома (у детей), тимома и карцинома тимуса, рак щитовидной железы, рак щитовидной железы (у детей), переходно-клеточный рак почечной лоханки и мочеточника, трофобластная опухоль гестационная мочеточника и почечной лоханки, переходно-клеточный рак, уретральный рак, эндометриальный рак матки, саркома матки, вагинальный рак, глиома зрительного пути и гипоталамуса (у детей), рак вульвы, макроглобулинемия Вальденстрема, опухоль Вильмса.

Кроме участия PKN3 в ангиогенезе, более конкретно в ингибировании подвижности эндотелиальных клеток, вносящих вклад в ангиогенез опухолей и миграцию опухолей, более конкретно в случае рака простаты (смотри Leenders et al., 2004, EMBO J. 23 (16): 3303-3313), PKN3 является частью PI3-киназного пути.

PI3-киназный путь характеризуется активностью PI3-киназы при индукции фактором роста и параллельного пути передачи сигнала. Стимуляция клеток фактором роста приводит к активации узнающих его рецепторов на клеточной мембране, которые в свою очередь связаны и активируют молекулы внутриклеточной передачи сигнала, такие как PI3-киназа. Активация PI3-киназы (состоящей из регуляторной p85 и каталитической p110 субъединиц) приводит к активации Akt фосфорилированием, поддерживая при этом такие клеточные ответы, как пролиферация, жизнеспособность или дальнейшую миграцию. Соответственно PTEN является опухолевым супресором, который вовлечен в фосфатидилинозитол (PI)3-киназный путь, и который был широко исследован в прошлом в отношении его роли в регуляции клеточного роста и трансформации (обзор смотри в Stein, R. С and Waterfield, M. D. (2000). PI3-kinase inhibition: a target for drug development? Mol Med Today 6, 347-357; Vazquez, F. and Sellers, W. R. (2000). The PTEN tumor suppressor protein: an antagonist of phosphoinositide 3-kinase signaling. Biochim Biophys Acta 1470, M21-35; Roymans, D. and Siegers, H. (2001). Phosphatidylinositol 3-kinases in tumor progression. Eur J Biochem 268, 487-498). Опухолевый супрессор PTEN функционирует в качестве негативного регулятора PI3-киназы, обращая катализируемую PI3-киназой реакцию, и таким образом способствует тому, что активация пути происходит временным и контролируемым образом. Хроническая гиперактивация PI3-киназной передачи сигнала вызывается функциональной инактивацией PTEN. PI3-киназная активность может быть блокирована добавлением низкомолекулярного ингибитора LY294002 (малая молекула). Активность и дальнейшие ответы при передаче сигнала киназы MEK, которая действует в параллельном пути, можно, например, ингибировать низкомолекулярным ингибитором PD98059.

Хроническая активация PI3-киназного пути при утрате функции PTEN является основным фактором, вносящим вклад в образование опухолей и метастазов, что свидетельствует о том, что указанный опухолевый супрессор представляет собой важную контрольную точку для регулируемой пролиферации клеток. Клетки, нокаутированные по PTEN, имеют сходные характеристики с клетками, в которых PI3-киназный путь был постоянно индуцирован посредством активированных форм PI3-киназы (Di Cristofano, A., Pesce, В., Cordon-Cardo, C. and Pandolfi, P. P. (1998). PTEN is essential for embryonic development and tumour suppression. Nat Genet 19, 348-355. Klippel, A., Escobedo, M. A., Wachowicz, M. S., Apell, G., Brown, T. W., Giedlin, M. A., Kavanaugh, W. M. and Williams, L. T. (1998). Activation of phosphatidylinositol 3-kinase is sufficient for cell cycle entry and promotes cellular changes characteristic of oncogenic transformation. Mol Cell Biol 18, 5699-5711. Kobayashi, M., Nagata, S., Iwasaki, Т., Yanagihara, K., Saitoh, I., Karouji, Y., Ihara, S. and Fukui, Y. (1999). Dedifferentiation of adenocarcinomas by activation of phosphatidylinositol 3-kinase. Proc Natl Acad Sci U S A 96, 4874-4879).

PTEN вовлечен в несколько путей, которые также называют связанными с PTEN путями, такие как путь PI3K/PTEN, путь Akt, EGF-связанная аутокринная петля и путь mTOR. PI3-киназный путь фактически представляет собой любой путь, в который вовлечена PI3-киназа, либо прямо, либо опосредованно. PI3-киназа может действовать либо в качестве ингибитора, либо в качестве активатора в таком пути, или она может регулироваться другими элементами пути.

В известном уровне технике широко описаны заболевания и состояния, в которые вовлечен PI3-киназный путь. Следовательно, при любом из таких состояний и заболеваний могут быть использованы способы согласно изобретению и лекарственные и диагностические средства, инструкции по конструированию, скринингу или производству которых приведены в данном описании. В целях иллюстрации, но не ограничения, это относится к следующим заболеваниям: эндометриальному раку, карциномам прямой и ободочной кишки, глиомам, злокачественным опухолям эндометрия, аденокарциномам, гиперплазии эндометрия, синдрому Коудена, наследственной неполипозной карциноме прямой и ободочной кишки, синдрому Ли-Фраумени, раку молочной железы-яичников, раку простаты (Ali, I. U., Journal of the National Cancer Institute, Vol. 92, no. 11, June 07, 2000, page 861-863), синдрому Баннаяна-Зонана, LDD (синдрому Лермита-Дюкло) (Macleod, K., выше), заболеваниям гамартома-макроцефалия, включая коровье бешенство (CD) и синдром Баннаяна-Рувалькаба-Райли (BRR), повреждениям кожи и слизистой оболочки (например, опухоли воронки волосяных фолликулов), макроцефалию, задержку умственного развития, гамартомы желудочно-кишечного тракта, липомы, аденомы щитовидной железы, кистозно-фиброзное заболевание молочной железы, диспластическую ганглиоцитому мозжечка и злокачественные новообразования молочной железы и щитовидной железы (Vazquez, F., Sellers, W. R., выше).

С указанной точки зрения PKN3 является полезной расположенной ниже в PI3-киназном пути мишенью лекарственного средства, на которую можно воздействовать лекарственными средствами, которые будут оказывать меньше побочных эффектов, чем другие лекарственные средства, направленные к мишеням, расположенным выше PKN3. При наличии контроля указанной конкретной фракции эффекторных молекул, т.е. белка PKN3 и любой расположенной ниже молекулы, вовлеченной в данный путь, вероятно только очень ограниченное количество его параллельных ветвей или дополнительных расположенных выше мишеней в каскаде передачи сигнала будут вызывать нежелательные эффекты. Поэтому другие активности пути PI-3 киназа/PTEN, связанные с клеточным циклом, репарацией ДНК, апоптозом, транспортом глюкозы, трансляцией, не будут подвергнуты влиянию. Также не происходит индукции передачи сигнала инсулина, это означает, что удается избежать диабетических реакций или других побочных эффектов, наблюдаемых в связи с применением LY294002. LY294002 (2-(4-морфолинил)-8-фенилхромон) является одним из производных хромона, низкомолекулярным ингибитором, разработанным исследовательской лабораторией Lilly (Indianapolis) в качестве ингибитора PI-3K (Vlahos et al. 1994, JBC 269, 5241-5248). Его мишенью является каталитическая субъединица молекулы PI-3K, p110, и он функционирует посредством конкуренции со связыванием ADP в каталитическом центре. Однако LY294002 не может различать разные изоформы p110 (альфа, бета, гамма, дельта), которые предположительно имеют разные клеточные функции.

PKN3 также расположена ниже mTOR, на которую действует рапамицин. mTOR (мишень рапамицина у млекопитающих), также известная как Raft или FRAP, действует ниже PI3-киназы, регулируя такие процессы, как зависимое от pp70 S6-киназы вступление в клеточный цикл. mTOR действует в качестве детектора фактора роста и доступности питательных веществ, контролируя трансляцию, посредством активации киназы pp70 S6 и фактора инициации 4E. Функция mTOR ингибируется бактериальным макролидом рапамицином, который блокирует рост T-клеток и некоторых опухолевых клеток (Kuruvilla and Schreiber 1999, Chemistry and Biology 6, R129-R136).

Тот факт, что рапамицин и его производные являются подходящими лекарственными средствами, применяемыми в настоящее время в клинике, подтверждает, что мишень лекарственного средства является тем более полезной и имеет меньше побочных эффектов, чем более специфичной она является для конкретного молекулярного механизма, как показано, например, в Yu et al. (Yu, K. et al. (2001) Endrocrine-Relat. Canc. 8, 249).

PKN3 является представителем семейства протеинкиназ C, которые называют сериновыми/треониновыми протеинкиназами. Обычно протеинкиназа такого типа содержит одну регуляторную и одну каталитическую субъединицу и использует в качестве кофакторов ионы кальция и фосфолипиды. Диацилглицерины действуют в качестве активатора такого вида семейства протеинкиназ. Представители семейства протеинкиназ C вовлечены в несколько путей передачи сигнала, связанных с гормонами или нейромедиаторами. Такие протеинкиназы регулируют активность своих белков-мишеней посредством фосфорилирования. В данной области известно, что нефизиологическая длительная активация протеинкиназы C приводит к трансформированному фенотипу клеток, который может привести к образованию злокачественной опухоли.

Полная последовательность PKN3 в виде мРНК доступна из банков данных, например, с номерами доступа gi 7019488 или NM_013355. Используя генетический код, на основе такой мРНК можно рассчитать конкретную аминокислотную последовательность. Также аминокислотная последовательность PKN3 доступна в банках данных с номерами доступа gi 7019489 или NP_037487.1.

Гомологи PKN3 человека можно найти наряду с другими организмами в M. musculus, R norvegicus, A. thaliana, C. elegans, D. melanogaster и S. cerevisiae. Идентичность в процентах и длина выравниваемой области составляет 67% и 279 аминокислот, 51% и 866 аминокислот, 38% и 305 аминокислот, 36% и 861 аминокислот, 63% и 296 аминокислот и 44% и 362 аминокислот, соответственно, для разных указанных выше видов. Специалистам в данной области будет понятно, что указанные или другие гомологи, в принципе, будут применимы для практического осуществления настоящего изобретения, если лекарственное средство, созданное с использованием такого гомолога, не может взаимодействовать с протеинкиназой N-бета человека или любой другой предполагаемой протеинкиназой N-бета.

Аминокислотную последовательность человека также можно найти в ProtEST, номер доступа pir: JC7083, где соответствующая протеинкиназа N-бета названа протеинкиназой JC7083. Ген протеинкиназы N-бета человека локализован на хромосоме человека номер 9. Источниками кДНК протеинкиназы N-бета, в общем, являются некоторые злокачественные опухоли и различные зародышевые или эмбриональные ткани, более конкретно к ним относятся среди прочих ткани злокачественной опухоли желудка, аденокарциномы, рака головного мозга, молочной железы, лимфомы Беркитта, рака шейки матки, хондросаркомы, рака ободочной кишки, глаза плода, хрусталика плода, переднего отрезка глаза плода, зрительного нерва плода, сетчатки плода, фовеальной зоны сетчатки плода, желтого пятна плода, хороида плода, фибротеомы, зародышевой линии, головы и шеи, сердца, почек, крупноклеточной карциномы, лейомиосаркомы, метастатической хондросаркомы, яичник, паращитовидной железы, ретинобластомы, рабдомиосаркомы, мелкоклеточной карциномы, плоскоклеточной карциномы, семенников и матки. Из приведенного списка очевидно, что лекарственное средство, которое также называют в настоящем описании медикаментом, можно кроме любых других заболеваний, которые указаны в настоящем описании, и патологических состояний, которые указаны в настоящем описании, применять для лечения и/или профилактики любого из таких заболеваний или любого заболевания, в которое вовлечены конкретные клетки, ткани или органы. Такие заболевания и патологические состояния также будут охвачены термином «заболевание, которое описано в настоящей публикации».

Заболевания (заболевание), которые описаны в настоящей публикации, а также патологическое состояния (состояние), которые описаны в настоящей публикации, которые можно лечить и/или предотвращать с использованием молекул нуклеиновых кислот и лекарственных средств, содержащих такие молекулы, согласно настоящему изобретению также включают образование опухолей и метастазов. Особенно это применимо к таким заболеваниям, указанным в настоящем описании, и к таким патологическим состояниям, указанным в настоящем описании, при которых клетки, вовлеченные в такие заболевания или патологические состояния, являются PTEN-негативными, что означает, что опухолевый супрессор PTEN является неактивным или имеет пониженный уровень активности. Заболевания также включают такие заболевания, в которые, в общем, вовлечен PI3-киназный путь. Кроме метастатических опухолей к такому виду заболеваний и патологических состояний, соответственно, в частности, относится диабет. Поэтому клетки, особенно клетки, которые вовлечены в заболевание или патологическое состояние, которое описано в настоящей публикации, и которые являются PTEN-негативными, чувствительны к лечению лекарственным средством, способ действия которого заключается в уменьшении или устранении активности PKN3 в соответствующих клетках, вовлеченных в заболевание. Соответственно пациенты, опухоли у которых предпочтительно характеризуются гиперактивированным PI3-киназным путем, включая без ограничения либо в результате амплификации, либо в результате мутации генов, кодирующих компоненты PI3-киназного пути (p110, Akt), или являются PTEN-негативными, или пациенты, которые имеют клетки, которые являются PTEN-негативными, особенно если такие клетки вовлечены в заболевание, описанное в настоящей публикации, или в патологическое состояние, описанное в настоящей публикации, преимущественно можно лечить с использованием указанных лекарственных средств. Такое уменьшение активности может возникать либо в результате уменьшения на транскрипционном уровне, либо на уровне трансляции, т.е. ферментативной активности PKN3. Не имея намерения быть связанными с какой-либо теорией, предполагают, что последний аспект, т.е. модификация активности PKN3 также вызвана свойствами PKN3, а именно, что ферментативная активность PKN3 также может подвергаться повышающей и понижающей регуляции, более предпочтительно понижающей регуляции.

Следующей группой пациентов, которых предпочтительно можно лечить с использованием указанных лекарственных средств, являются пациенты, которые страдают от злокачественных опухолей, которые имеют высокую частоту утраты функции PTEN, особенно в опухолях на поздней стадии (Cantley and Neel, 1999). Утрата PTEN коррелирует с повышенным агрессивным и инвазивным поведением соответствующих опухолевых клеток.

Должно быть понятно, что различные заболевания, описанные в настоящей публикации, для лечения и профилактики которых можно применять фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению, также представляют собой такие заболевания, для профилактики и/или лечения которых можно использовать лекарственное средство, описанное в настоящей публикации, и наоборот.

В используемом в настоящем описании смысле термин «лечение заболевания» также будет включать профилактику такого заболевания.

Дополнительные признаки, варианты и преимущества можно увидеть на следующих фигурах.

Фиг.1 является схематичной диаграммой, иллюстрирующей участие PKN3 в пути PI3.

На фиг.2 показан результат Вестерн-блот-анализа в эксперименте по нокдауну с использованием PKN3-специфичных миРНК в линиях клеток человека (HeLa, HUVEC) и линии клеток мышей (EOMA).

На фиг.3 показан результат эксперимента по нокдауну с использованием разных концентраций PKN3-специфичной молекулы миРНК, приготовленной в виде липоплекса, для определения IC50 молекул миРНК в клетках HeLa и HUVEC.

На фиг.4 показан результат Вестерн-блот-анализа в эксперименте по нокдауну с использованием PKN3-специфичной молекулы миРНК и PKN3-специфичной антисмысловой молекулы в качестве контроля, при этом эффективность указанных молекул в отношении активности в нокдауне оценивали в разных временных точках.

На фиг.5 показан результат Вестерн-блот-анализа в эксперименте по нокдауну, при этом использовали разные концентрации PKN3-специфичных миРНК-липоплексов, которые либо имели, либо не имели фосфатной группы на 3'-конце.

На фиг.6 показан результат Вестерн-блот-анализа в эксперименте по нокдауну с использованием разных PKN3-специфичных молекул миРНК (фиг.6A) и микрофотографии, иллюстрирующие влияние утраты функции PKN3 на рост HUVEC на внеклеточном матриксе (фиг.6B).

Фиг.7 иллюстрирует дизайн эксперимента для тестирования эффективности in vivo PKN3-специфичных молекул миРНК (фиг.7A) и влияние таких молекул на объем опухоли (фиг.7B) и массу тела (фиг.7C) в модели подкожных ксенотрансплантатов опухолей PC-3 у мышей.

Фиг.8 иллюстрирует дизайн эксперимента для тестирования эффективности in vivo PKN3-специфичной молекулы миРНК (фиг.8A) и влияние разные доз такой молекулы миРНК, выраженное в виде процента от массы тела или объема опухоли (фиг.8B), и влияние разных схем обработки с использованием такой молекулы, выраженное в виде процента от массы тела или объема опухоли (фиг.8C) в модели подкожного ксенотрансплантата опухоли PC-3 у мышей.

Фиг.9 иллюстрирует дизайн эксперимента для тестирования эффективности in vivo PKN3-специфичной молекулы миРНК (фиг.9A), влияние указанной молекулы на объем опухоли простаты и метастазы в лимфатических узлах (фиг.9B) и влияние указанной молекулы на снижение мРНК PKN-3 и Tie2 в ткани легкого в модели ксенотрансплантата опухоли PC-3 в простате мышей (фиг.9C).

Фиг.10 иллюстрирует дизайн эксперимента для тестирования эффективности in vivo разных схем обработки с использованием специфичной молекулы миРНК при системном введении (фиг.10A) и влияние таких разных схем обработки на объем опухоли простаты (фиг.10B) и на объем метастазов в лимфатических узлах (фиг.10C) в модели ксенотрансплантата опухоли PC-3 в простате мышей.

Фиг.11 иллюстрирует дизайн эксперимента для тестирования эффективности in vivo разных доз PKN-3-специфичной молекулы миРНК при системном введении (фиг.11A) и влияние указанных разных доз на объем опухоли простаты (фиг.11B) и на объем метастазов в лимфатических узлах (фиг.11C).

На фиг.12A показаны соединения, образующие липоплекс.

На фиг.12B показана схема, иллюстрирующая структуру липоплексов согласно настоящему изобретению в сравнении с липосомами.

На фиг.13 показан результат Вестерн-блот-анализа в эксперименте по нокдауну с использованием PKN3-специфичной молекулы миРНК, имеющей либо 19 пар оснований, либо 23 пары оснований.

На фиг.14 показан результат Вестерн-блот-анализа в эксперименте по нокдауну с использованием разных PKN3-специфичных молекул миРНК.

На фиг.15 показан результат Вестерн-блот-анализа в эксперименте по нокдауну с использованием молекул миРНК, имеющих либо 19 пар оснований, либо 23 пары оснований, в трех разных линиях клеток, при этом молекулы миРНК использованы в разных концентрациях.

На фиг.16 показан дизайн эксперимента для тестирования эффективности in vivo PKN3-специфичных молекул миРНК (фиг.16A) и влияние таких PKN3-специфичных молекул миРНК, имеющих либо 19 пар оснований, либо 23 пары оснований, на уменьшение объема опухоли простаты (фиг.16B), объем метастазов в лимфатических узлах (фиг.16C) и распространенность метастазов в лимфатических узлах (фиг.16D) в модели ортотопической злокачественной опухоли простаты у мышей.

На фиг.17 показан дизайн эксперимента для тестирования эффективности in vivo разных доз PKN3-специфичной молекулы миРНК, содержащей 23 пары оснований (фиг.17A), и влияние таких разных доз на уменьшение объема опухоли простаты (фиг.17B), объема метастазов в лимфатических узлах (фиг.17C) и распространенность метастазов в лимфатических узлах (фиг.17D) в модели ортотопической злокачественной опухоли простаты у мышей.

Пример 1: Материалы и способы

Трансфекция in vitro и иммуноблоттинг; антитела

Линии клеток трансфицировали миРНК, используя катионные липосомы, описанные выше. Коротко, примерно через 12 часов после посева клеток различные количества раствора миРНК-липоплекса, разбавленного в среде, содержащей 10% сыворотку, добавляли к клеткам, чтобы получить концентрации для трансфекции в диапазоне 1-50 нМ миРНК. После трансфекции (48 часов) клетки лизировали и подвергали иммуноблоттингу, как описано (Klippel et al., 1998). Концентрацию белка определяли, используя анализ белков DC (BioRad), и наносили равные количества для иммуноблот-анализа, используя следующие антитела: антитело кролика против PTEN (Ab-2, Neomarkers), Akt-1, антитело кролика против PKN3 (Leenders et al., 2004).

Линии клеток

Линии клеток PC-2, HeLa, HUVEC (эндотелиальные клетки пупочной вены человека) и EOMA культивировали согласно рекомендациям ATCC.

Ксенотрансплантат опухоли

В данном исследовании использовали самцов мышей Hsd:NMRI-nu/nu (8-недельного возраста). Для экспериментов по терапии опухолей с использованием стабильных ксенотрансплантатов опухолей подкожно имплантировали всего 5,0 × 10⁶ опухолевых клеток/100 мкл PBS). Объем опухолей определяли, используя штангенциркуль, и вычисляли согласно формуле: объем=(длина × ширина²)/2. Для экспериментов по терапии раствор миРНК-липоплекса вводили в/в инъекцией в хвостовую вену при низком давлении и с использованием небольшого объема. В модели ортотопической опухоли 2,0 × 10⁶ клеток PC-3/30 мкл PBS инъецировали в левую дорсолатеральную долю предстательной железы под общей анестезией организма (Stephenson et al., 1992). Животных умерщвляли через 50 дней после операции и объемы опухолей (предстательной железы) и регионарных метастазов (метастазы каудального, люмбального и почечного лимфатического узла) определяли, как описано выше.

В случае внутривенной обработки миРНК-липоплексы доставляли введением липоплексов миРНК внутривенно посредством одной инъекции в хвостовую вену 200 мкл раствора с конечной дозой 1,88 мг/кг миРНК и 14,5 мг/кг липида, или в случае разных схем варианты таких доз (которые указаны).

Статистический анализ

Данные выражали в виде средних ± s.e.m. (стандартная ошибка средней). Статистическую значимость различий определяли, используя U-критерий Манна-Уитни. Значения P<0,05 считали статистически значимыми.

Анализа на Matrigel

Чтобы проанализировать рост клеток на матриксе Matrigel клетки HUVEC, трансфицировали миРНК в течение 48 часов. После обработки трипсином клетки высевали в двух повторах в 24-луночные планшеты (110000 клеток на лунку), предварительно покрытые 250 мкл матрикса Matrigel на основе базальных мембран, и делали микроскопические фотографии при увеличении × 1,25 или × 2,5, используя камеру Axiocam, смонтированную на микроскопе Axiovert S100, через 20 часов после повторного посева.

Пример 2: молекулы миРНК PKN3

Молекулы согласно настоящему изобретению, которые в настоящем описании также называют молекулами миРНК (AtuRNAi, смотри таблицу 1a и 1b) и которые использовали в данном исследовании, как таковые описаны в (Czauderna et al., 2003) и синтезированы в BioSpring (Frankfurt a. M., Germany).

Дуплексы указанных молекул образованы соответствующими смысловыми и антисмысловыми нитями, каждая из которых указана в таблице 1a и 1b в 5'->3'-направлении. Поэтому двунитевую молекулу образуют, объединяя соответствующую смысловую и антисмысловую нити, например, PKN3-hm-1s и PKN3-hm-1as, образующие молекулу, имеющую двунитевую структуру, которую в конкретном примере в настоящем описании также называют PKN3 (1). Молекулы имеют тупые концы, однако каждая нить, образующая двунитевую молекулу, имеет фосфат, связанный с 3'-концом, более конкретно с концевой 3'-OH-группой. Молекулы химически стабилизируют чередующимися 2'-O-метил-модификациями сахара на обеих нитях, при этом немодифицированные нуклеотиды расположены напротив модифицированных на противоположной нити, что также можно видеть в таблице 1a. Такие двунитевые молекулы являются особенно предпочтительными вариантами молекул нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению.

Таблица 1a

Нуклеотиды с 2'-O-метил-модификациями подчеркнуты; такое подчеркивание показывает, что каждый второй нуклеотид имеет такой вид модификации, при этом такая модификация начинается с первого нуклеотида на антисмысловой нити и со второго нуклеотида на смысловой нити (при условии, что и смысловая нить и антисмысловая нить изображены в 5'-3'-направлении с лева направо).

s-нити для смысловой нити, которую в настоящем описании также называют второй нитью; и

as-нити для антисмысловой нити, которые в настоящем описании также называют первой нитью, при этом первая нить содержит первый участок следующих друг за другом нуклеотидов, и указанный первый участок, по меньшей мере, частично комплементарен нуклеиновой кислоте-мишени, при этом нуклеиновая кислота-мишень, которая использована в настоящем описании, предпочтительно является нуклеиновой кислотой, которую необходимо разрушить или дестабилизировать.

Такие молекулы в настоящем описании также называют PKN3-специфичными миРНК, и их скрининг проводили в двух линиях клеток человека, а именно HeLa, HUVEC, и одной линии клеток мыши (EOMA). Трансфицировали 20 нМ миРНК и иммуноблоттинг проводили, используя лизаты целых клеток через 48 часов после трансфекции, как описано в примере 1. Результаты изображены на фиг.2. Как видно на фиг.2, особенно предпочтительными являются молекулы нуклеиновой кислоты PKN3 (2), PKN3 (3), PKN3 (4), PKN3 (5), PKN3 (6), PKN3 (8).

Еще более предпочтительной молекулой является PKN3 (3), которая стала объектом дальнейших исследований.

На основании PKN3 (3) конструировали дополнительные молекулы миРНК, которые представлены в следующей далее таблице 1b и в примечании указаны как PKN3-23-v1 в случае молекулы, состоящей из молекул PKN3-hm-3A23v1 и PKN3-hm-3B23v1, т.е. отдельных нитей, как PKN3-23-v2 в случае молекулы, состоящей из молекул PKN3-hm-3A23v2 и PKN3-hm-3B23v2, т.е. отдельных нитей, как PKN3-23-v3 в случае молекулы, состоящей из молекул PKN3-hm-3A23v3 и PKN3-hm-3B23v3, т.е. отдельных нитей, как PKN3-23-v4 в случае молекулы, состоящей из молекул PKN3-hm-3A23v4 и PKN3-hm-3B23v4, т.е. отдельных нитей, и как PKN3-23-v5 в случае молекулы, состоящей из молекул PKN3-hm-3A23v5 и PKN3-hm-3B23v5, т.е. отдельных нитей.

Молекулы миРНК представлены и сконструированы таким же образом, как описано в связи с молекулами миРНК, указанными в таблице 1a. Как можно видеть из таблицы 1b, начиная с PKN3 (3), называемой в таблице 1b PKN3-hm-3A19/PKN3-hm-3B19, всего четыре нуклеотида добавляли на 3'-конце смысловой нити и 5'-конце антисмысловой нити (PKN3-23-v1), всего четыре нуклеотида на 5'-конце смысловой нити и всего четыре нуклеотида на 3'-конце антисмысловой нити (PKN3-23-v2), один нуклеотид на 5'-конце и три нуклеотида на 3'-конце смысловой нити и три нуклеотиды на 5'-конце и один нуклеотид на 3'-конце антисмысловой нити (PKN3-23-v3), два нуклеотида на 5'-конце и два нуклеотида на 3'-конце смысловой нити и два нуклеотида на 5'-конце и два нуклеотида на 3'-конце смысловой нити (PKN3-23-v4), и три нуклеотида на 5'-конце и один нуклеотид на 3'-конце смысловой нити и один нуклеотид на 5'-конце и три нуклеотида на 3'-конце антисмысловой нити (PKN3-23-v5). Заново добавленные нуклеотиды показаны в таблице 1b курсивом.

Таблица 1b

Молекулы миРНК, указанные в таблице 1b, тестировали в отношении их эффективности в нокдауне и сравнивали с одной PKN3-специфичной миРНК, имеющей длину 19 нуклеотидов, более конкретно PKN3 (3). С указанной целью клетки HeLa B высевали в 6 лунок (40×10³), трансфицировали спустя 16 часов, используя 20 нМ, и лизировали для экстракции белка через 48 часов после трансфекции. Если в прямой форме не указано обратное, методики и способы, используемые в связи с такими молекулами миРНК, описаны в данной публикации в части примеров, и более конкретно описаны в примере 1.

Вестерн-блот лизатов с использованием в качестве зонда анти-PKN3-антитела и анти-PTEN-антитела, при этом последний использован в качестве контроля нанесения, изображен на фиг.13. Как видно на фиг.13, PKN3-23-v1 является особенно эффективным, за ней по эффективности следуют PKN3-23-v4, PKN3-23-v5, PKN3-23-v2 и PKN3-23-v3. В качестве контроля (KO) использовали специфичную по отношению к люциферазе молекулу миРНК, содержащую в качестве смысловой нити Luc-миРНК-2B (cguacgcggaauacuucga, SEQ.ID.No. 56) и в качестве антисмысловой нити Luc-миРНК-2A (ucgaaguauuccgcguacg, SEQ.ID.No. 57).

Проводили скрининг дополнительных возможных молекул миРНК, которые изображены в таблице 2, при этом представление и модификацию осуществляли таким же образом, как описано в связи с молекулами миРНК, показанными в таблицах 1a и 1b выше.

Таблица 2
Название	Последовательность

Проводили скрининг таких молекул миРНК, которые изображены в таблице 2, в первичном скрининге клеток HUVEC, как описано выше. Клетки высевали в 6 лунок (40×10³), трансфицировали спустя 16 часов, используя 20 нМ миРНК и 1 мкг/мл AtuFECT01, и лизировали для экстракции белка через 72 часа после трансфекции. Вестерн-блоты лизатов с использованием в качестве зондов анти-PKN3 и анти-PTEN, при этом последний действует в качестве контроля нанесения, изображены на фиг.14, при этом ut-нити означают необработанные; Luci-нити означают миРНК для люциферазы, которая определена выше; и co3 означает

Если ясно не указано обратное, методики и способы, используемые в связи с такими молекулами миРНК, описаны в данной публикации в части примеров, и более конкретно описаны в примере 1.

Пример 3: Липоплексный препарат PKN3-специфичных молекул миРНК

Липоплексный препарат готовили по существу, как описано в Santel (Santel et al. 2006).

Катионный липид AtuFECT01 (тригидрохлорид β-L-аргинил-2,3-L-диаминопропионовая кислота-N-пальмитил-N-олеиламид, Atugen AG), нейтральный фосфолипид 1,2-дифитаноил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DPhyPE) (Avanti Polar Lipids Inc., Alabaster, AL) и пегилированный липид натриевая соль N-(карбонилметоксиполиэтиленгликоль-2000)-1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина (DSPE-PEG) (Lipoid GmbH, Ludwigshafen, Germany) смешивали в молярном соотношении 50/49/1 посредством регидратации липидной пленки в стерильном 300 мМ растворе сахарозы, не содержащем РНКазы, до общей концентрации липидов 4,34 мг/мл. Если не указано обратное, то обычно проводят одну внутривенную инъекцию для мыши массой 30 г в стандартной дозе 1,88 мг/кг миРНК и 14,5 мг/кг липида. Также, если не указано обратное, PKN3-специфичной молекулой миРНК является молекула PKN3 (3), которая определена в примере 2. Различные соединения, образующие липоплексы согласно настоящему изобретению, включая PKN3 (3), изображены на фиг.12A, при этом необходимо понимать, что специфичная молекула миРНК, в принципе, может представлять собой любую молекулу миРНК, которая описана в настоящей публикации, предпочтительно любую молекулу миРНК, которая показана в таблицах 1a и 1b.

На фиг.12B показана схема, иллюстрирующая миРНК-липоплекс, т.е. комплекс, образованный молекулами миРНК с указанными выше липидами, т.е. катионным липидом, DPhyPE, который также называют вспомогательным липидом, и PG-липидом, т.е. DSPE-PEG. Нуклеотиды PKN3-специфичной миРНК, указанные жирным шрифтом, соответствуют 2'-O-метил-модификации отдельных нуклеотидов.

Пример 4: Определение IC50

IC50 липоплекса, образованного молекулами PKN3 (3) с липидами, указанными в примере 3, который также называют миРНК-PKN3(3)-липоплексом, определяли после трансфекции в клетки HeLa и HUVEC. Белковые лизаты готовили через 48 часов после трансфекции и подвергали иммуноблоттингу, используя PKN3- и PTEN-специфичные антитела.

Концентрации молекулы миРНК в липоплексе (приготовленной в виде препарата в липоплексе) («миРНК-PKN3 (3)») составляли 1, 5, 10 и 20 нМ.

Результаты изображены на фиг.3.

На фиг.3 можно видеть, что в клетках HeLa концентрация 5 нМ миРНК-PKN3 (3) уже является подходящей, чтобы в значительной степени осуществить нокдаун PKN3 на уровне белка. Указанное также верно в отношении клеток HUVEC, при этом необходима немного более высокая концентрация для достижения точно такой же степени нокдауна, как и в клетках HeLa. PTEN использовали в качестве контроля нанесения.

Кроме того, липоплексы, образованные молекулами PKN3, которые указаны в таблице 1b в настоящем описании, более конкретно PKN3-23-v1, подвергали дозовому титрованию в сравнении с PKN3 (3), являющейся 19-мером, в линиях клеток HUVEC и EOMA, соответственно. Как описано в предшествующих примерах, клетки высевали в 6 лунок (40×10³), трансфицировали спустя 16 часов указанной концентрацией миРНК и лизировали для экстракции белка через 48 часов после трансфекции. Вестерн-блот лизатов, который анализировали, используя в качестве зондов анти-PKN3-антитело и анти-PTEN-антитело, при этом последнее служило в качестве контроля нанесения, изображен на фиг.15.

Как видно на фиг.15, миРНК PKN3-23-v1 сравнима по эффективности с одной из PKN3 (3). IC₅₀ 19-мерной и 23-мерной молекулы оценивали в экспериментах по трансфекции культур клеток с последующим полуколичественным иммуноблоттингом и показали сходную активность (IC50~5 нМ) для трех разных линий клеток. Стоит указать, что EOMA является линией эндотелиальных клеток, полученных от мыши, что свидетельствует об активности для мыши и человека.

Пример 5: Временный эффект PKN3-специфичных молекул миРНК

Чтобы показать временный характер эффекта нокдауна PKN3-специфичной молекулы миРНК, а именно миРНК-PKN-3 (3), и PKN3-специфичной антисмысловой молекулы (GB-контроль) (Leenders et al., 2004) указанные молекулы трансфицировали в клетки HeLa. Белковые лизаты готовили через 48 часов, 96 часов, 144 часа и 192 часа. В каждом случае клетки подвергали воздействию миРНК-липоплексов, содержащих молекулы PKN3 (3), которые описаны в примере 3, в течение 24 часов, и указанные миРНК-липоплексы удаляли после указанных 24 часов.

Результаты изображены на фиг.4.

Как видно на фиг.4, действие миРНК PKN3(3) на PKN3 на уровне белка можно наблюдать вплоть до 96 часов, при этом видно, что через 144 часов эффективность конкретной молекулы миРНК снижается и через 192 часа эффект нокдауна по существу больше не наблюдается. Таким образом, сравниваемая с GB-контролем молекула миРНК согласно настоящему изобретению проявляет более длительную активность по сравнению с антисмысловой молекулой, нокдаун при действии которой существенно снижается уже через 96 часов.

Пример 6: Влияние фосфатной группы, связанной с 3'-концом молекулы миРНК согласно настоящему изобретению

В данном примере исследовали влияние модификации 3'-фосфатом на 3'-конце как смысловой, так и антисмысловой нити, образующих двунитевую структуру или молекулу согласно настоящему изобретению, при этом PKN3 (3) использовали в качестве молекулы нуклеиновой кислоты, опосредующей нокдаун, и указанную молекулу нуклеиновой кислоты готовили таким образом, чтобы образовать соответствующие липоплексы, которые описаны в примере 3. Полученные таким образом липоплексы тестировали в клетках HeLa, при этом трансфицировали различные количества указанной молекулы миРНК и липоплексов, соответственно, и белковые лизаты готовили через 48 часов после трансфекции. Иммуноблоты анализировали как описано в настоящей публикации, и результаты показаны на фиг.5.

Как видно на фиг.5, модификация фосфатом фактически не влияет на эффективность молекулы миРНК и содержащих такие молекулы липоплексы.

Пример 7: Влияние потери функции PKN3 на рост HUVEC на внеклеточном матриксе

Чтобы дополнительно показать, что при нокдауне PKN3 с использованием молекул согласно настоящему изобретению также происходят некоторые физиологические и морфологические изменения, использовали анализ роста на внеклеточном матриксе (Leenders et al., 2004).

Более конкретно HUVEC трансфицировали 4 разными миРНК-PKN3-липоплексамии, по отдельности содержащими PKN3 (1), PKN3 (3), PKN3 (4) и PKN3 (5) в качестве молекул миРНК, и миРНК-Luc-липоплексом (20 нМ) в качестве контроля. Рост клеток поддерживали до слияния в монослой в первые 48 часов после трансфекции. Через 48 часов клетки обрабатывали трипсином, пересевали, используя равные количества клеток (110000 клеток) и высевали в 24-луночный планшет, содержащий Matigel.

Отобраны типичные микроскопические картины, чтобы проследить за изменениями роста клеток HUVEC через 20 часов после повторного посева. Результаты изображены на фиг.6.

Как предполагалось, в случае эффективных липоплексов миРНК PKN3, предпочтительно липоплексов PKN3 (3) и липоплексов PKN3 (5), наблюдали явное ингибирование роста.

Пример 8: Ингибирование роста подкожного ксенотрансплантата опухоли PC-3

Модель опухолевого трансплантата PC-3 создавали подкожной инъекцией клеток PC3. Полученную таким образом опухоль затем обрабатывали липоплексами, описанными в примере 3. Молекулой миРНК, находящейся в таком липоплексе, была PKN3 (3). Дизайн основного эксперимента изображен на фиг.7A. Всего создавали три разных группы обработки, при этом каждая группа состояла из шести мышей. Первая группа получала только сахарозу, вторая группа получала липоплексы, содержащие миРНК против люциферазы (миРНКLuc-липоплекс), и третья группа получала липоплексы, содержащие миРНК, специфичные по отношению к PKN3 (миРНК PKN3-липоплекс).

После инокуляции опухолевых клеток вводили различные агенты, начиная с 25 по 35 день. Инъекции проводили восемь раз в день внутривенно. Дозы липоплекса миРНК составляли 1,88 мг/кг миРНК и 14,5 мг/кг общего липида (Santel et al., 2006a; Santel et al., 2006b).

Параллельно молекулу миРНК PKN3-23-v1 оценивали в сравнении с PKN3 (3). Дизайн соответствующего основного эксперимента изображен на фиг.16A, в котором после инокуляции опухолевых клеток вводили различные агенты, т.е. сахарозу, PKN3 (3) и PKN3-23-v1, начиная с 29 дня по 47 день, при этом введение осуществляли таким образом, что 10 × внутривенных инъекций проводили через день (в группе из двенадцати мышей). Дозы липоплекса миРНК составляли 2,8 мг/кг миРНК и 21,7 мг/кг общего липида (Santel et al., 2006a, Santel et al., 2006b).

Результат использования такой схемы обработки изображен на фиг.7B и фиг.7C для PKN3 (3) и на фиг.16B-16D для молекулы миРНК PKN3-23-v1 по сравнению с PKN3 (3).

Как видно на фиг.7B, рост развившихся ксенотрансплантатов PC-3 значимо ингибировали липоплексами миРНК PKN3 (ромбы) по сравнению с миРНК Luc-липоплексом (треугольники) при указанной обработке (стандартная доза 1,88 мг/кг/сутки миРНК; 14,5 мг/кг/сутки липида; стрелка) или изотоничным раствором сахарозы (заштрихованные кружки). Во время обработки контролировали изменения массы тела как показано на фиг.7B. Отдельные данные представляют собой средний суточный объем опухоли s.e.m. Только небольшое уменьшение массы тела можно было наблюдать при введении различных липоплексов, что подтверждает, что имеет место только минимальное влияние, если таковое вообще имеется, липидного компонента липоплексов на здоровье животного.

Как можно видеть на фиг.16B, 16C и 16D, обе тестированные молекулы миРНК, т.е. PKN3 (3), т.е «19-мер», и PKN3-23-v1, т.е. «23-мер», проявляют одинаковую эффективность в модели опухоли простаты, которая выражается в уменьшении объема опухоли простаты (фиг.16B), уменьшении объема метастазов лимфатических узлов (фиг.16C) и распространенность метастазов в лимфатических узлах (фиг.16D).

Пример 9: Ингибирование роста подкожного ксенотрансплантата опухоли PC-3: влияние различных доз липоплекса

Основной эксперимент осуществляли для того, чтобы исследовать влияние разных доз липоплекса на ингибирование роста подкожного ксенотрансплантата опухоли PC-3. Более конкретно, использовали липоплексы миРНК PKN3(3). Липоплексы готовили как описано в примере 3. Дизайн эксперимента показан на фиг.8A. Группы обработки состояли из 6 мышей, при этом одна группа животных получала сахарозу в качестве негативного контроля, тогда как другая группа получала миРНК PKN3-липоплексы, более конкретно миРНК PKN3 (3)-липоплексы. После подкожной инокуляции опухолевых клеток животным начиная с 22 дня по 38 день вводили одиннадцать внутривенных инъекций ежедневно и оценивали жизнеспособность вплоть до 67 дня.

Препарат липоплекса миРНК готовили следующим образом: 1,88 мг/кг миРНК + 14,5 мг/кг atuFect01/1% ПЭГ;

использовали следующие дозы липоплекса:

- 0,94 мг/кг миРНК ежедневно 22-32 день;

- 1,88 мг/кг миРНК ежедневно 22-32 день;

- 1,88 мг/кг миРНК дважды в день 50% доза, 22-28 день;

- 1,88 мг/кг через день 22-38 день.

Результат изображен на фиг.8B. Как видно на фиг.8B, доза 1,88 мг/кг ежедневно давала значимое уменьшение объема опухоли, при этом масса тела изменялась только незначительно, и по существу не наблюдалось негативных эффектов в случае липоплексных препаратов.

Пример 10: Ингибирование роста подкожных ксенотрансплантатов опухоли PC-3: влияние разных схем обработки

Дизайн эксперимента описан в связи с примером 8.

Результаты изображены на фиг.8C. Более конкретно на фиг.8C можно видеть, что эффект схемы обработки, исследованный в настоящем примере, не отличается в смысле влияния на объем опухоли. Однако схемы обработки, которые заключались во введении дважды в день, ежедневно и через день, давали одинаковое ингибирование объема опухоли, что свидетельствует о том, что обработка липоплексом PKN3-миРНК через день достаточна для поддержания терапевтических эффектов. Кроме того, обработка дважды в день давала значимое снижение массы тела, что свидетельствует об ограничении дозы без дополнительной терапевтической пользы (Santel et al., 2006a).

Пример 11: Системное лечение мышей липоплексами миРНК PKN3(3) в модели ортотопического ксенотрансплантата опухоли

Данный эксперимент осуществляли для исследования влияния системной обработки мышей липоплексами миРНК PKN3, и более конкретно липоплексами миРНК-PKN3 (3), на рост опухоли в модели ортотопического ксенотрансплантата опухоли (дизайн эксперимента смотри в (Santel et al., 2006a)).

Дизайн эксперимента для анализа эффективности обработки липоплексом миРНК PKN3 в модели ортотопической опухоли простаты PC-3 и метастазов лимфатических узлов изображен на фиг.9A. Всего использовали четыре группы обработки, каждая из которых состояла из 9 мышей, а именно группы, получающие сахарозу, миРНК Luc-липоплекс, миРНК PKN3-липоплекс и миРНК Tie2-липоплекс. После инокуляции опухолевых клеток в простату инъецировали липоплексы миРНК в дозах 1,88 мг/кг миРНК и 14,5 мг/кг atuFect01/1% ПЭГ с 35 по 49 день восемь инъекций, проводимых через день. На 35 день оценивали контроль до обработки.

В результате данного эксперимента наблюдали уменьшение объема опухоли простаты PC-3 и метастазов лимфатических узлов у мышей после обработки указанными липоплексами миРНК по сравнению с группами, обработанными сахарозой или специфичными для люциферазы молекулами миРНК (миРНК-Luc), которое более конкретно изображено на фиг.9B (величина объема опухоли простаты и объем метастазов лимфатических узлов).

Объемы метастазов опухоли до начала обработки указаны слева (d35, контроль). Статистическая значимость указана стрелкой. Как видно на указанных фигурах, PKN3-специфичная молекула миРНК, более конкретно липоплекс, содержащий такую молекулу, был высоко эффективным как в отношении объема опухоли простаты, так и в отношении объема метастазов лимфатических узлов.

Чтобы показать РНК-интерференцию in vivo при внутривенном введении PKN3-миРНК-липоплекса анализировали нокдаун мРНК в ткани легкого. Более конкретно, уменьшение уровней мРНК PKN-3 и Tie2 в ткани легкого мышей, обработанных соответствующими миРНК-липоплексами, которое выявляли количественной обратной транскрипций-полимеразной цепной реакций TaqMan, изображено на фиг.9C. Показано, что относительные средние уровни мРНК Tie2 или PKN3 в легком, нормализованные по отношению к мРНК CD34, свидетельствуют об опосредованной липоплексом интерференции in vivo. Контрольный специфичный для рецептора TIE-2 липоплекс миРНК тестировали параллельно и также показали уменьшение количества специфичной для мишени мРНК (фиг.9, правая панель), но не выявили значимого ингибирования роста опухоли или образования метастазов лимфатических узлов по сравнению с негативным специфичным для люциферазы миРНК-липоплексом. Полученные данные свидетельствуют о специфичном для гена-мишени терапевтическим эффекте при использовании PKN3-миРНК-липоплекса.

Пример 12: Системная обработка мышей миРНК-PKN3(3)-липоплексами в модели ортотопического ксенотрансплантата опухоли: влияние схемы обработки

Данный эксперимент осуществляли для того, чтобы тестировать разные схемы обработки в связи с системной обработкой мышей миРНК-PKN3-липоплексами и более конкретно миРНК-PKN3 (3)-липоплексами в модели ортотопического ксенотрансплантата опухоли.

Условия эксперимента изображены на фиг.10A. Исследовали две группы обработки, при этом каждая группа состояла из девяти мышей, которым вводили либо сахарозу, либо липоплекс миРНК PKN3. После инокуляцию опухолевых клеток в простату осуществляли 10/7× внутривенных инъекций в каждый второй или каждый третий день с 35 по 53 день. Применяли две разных дозы миРНК-липоплекса, а именно: 1,88/2,8 мг/кг миРНК 14,5/21,7 мг/кг atuFect01/1% ПЭГ, т.е. 14,5/21,7 мг/кг общего липида.

Результаты изображены в виде объема опухоли простаты (фиг.10B) и в виде объема метастазов лимфатических узлов (фиг.10C). По обоим параметрам: объему опухоли и образованию метастазов лимфатических узлов наблюдали ингибирование, однако не наблюдали значимого увеличения эффективности при обработке каждый второй день по сравнению с обработкой в каждый третий день. Однако при более высокой суточной дозе (2,8 мг/кг миРНК) наблюдали более явное ингибирование образования метастазов. Полученные данные показывают, что опосредованное миРНК ингибирование не ограничено ежедневным внутривенным введением, и терапевтический эффект может быть достигнут при использовании обработок через день.

Пример 13: Системная обработка мышей миРНК-PKN3(3)-липоплексами в модели ортотопического ксенотрансплантата опухоли: влияние разных доз

Данный эксперимент осуществляли для того, чтобы тестировать разные дозы миРНК-PKN3-липоплексов в связи с системной обработкой мышей такими липоплексами и более конкретно липоплексами миРНК-PKN3 (3) (фиг.11) и миРНК-PKN3-23-v1 (фиг.17) в модели ортотопического ксенотрансплантата опухоли.

Условия эксперимента изображены на фиг.11A. Исследовали три группы обработки, при этом каждая группа состояла из десяти мышей, которым вводили либо сахарозу, либо липоплекс миРНК-PKN3, либо только липоплекс. После инокуляцию опухолевых клеток в простату осуществляли 10 × внутривенных инъекций через день с 28 по 46 день. Применяли следующие дозы миРНК-липоплекса: 0,7/1,4/2,8 мг/кг миРНК; 5,4/10,9/21,7 мг/кг общего липида (в липоплексе все три вместе: atuFect01/вспомогательный липид/1% ПЭГ). Три схемы дозирования вводили внутривенной инъекцией через день.

Результаты изображены в виде объема опухоли простаты (фиг.11B) и в виде объема метастазов лимфатических узлов (фиг.11C). В обоих случаях наблюдали значимое ингибирование при ежедневных дозах 2,8 мг или 1,4 мг миРНК/кг, что указывает на наличие «терапевтического окна» для указанных молекул миРНК.

Также в случае липоплекса миРНК PKN3, содержащего PKN3-23-v1 в качестве вида миРНК, а не PKN3 (3), использовали три разных группы обработки, при этом каждая группа состояла из 7-8 мышей, которым вводили либо сахарозу, либо миРНК-PKN3-липоплекс, либо только липоплекс. После инокуляции опухолевых клеток в простату проводили 15 × внутривенных инъекций каждый 4-й день, начиная с 7 дня по 63 день. Дозы миРНК-липоплекса составляли 1,4 мг/кг миРНК (10,9 мг общего липида/кг)/и 0,7 мг/кг миРНК (5,4 мг общего липида/кг), соответственно.

Результаты изображены в виде объема опухоли простаты (фиг.17B) и в виде объема метастазов лимфатических узлов (фиг.17C). В обоих случаях наблюдали значимое ингибирование при использовании доз 1,4 мг/кг и 0,7 мг/кг миРНК, соответственно, что указывает на наличие «терапевтического окна» для указанных молекул миРНК.

Кроме того, регистрировали массу тела мышей после заражения клетками, значения которой изображены на фиг.17D. На указанной фигуре можно видеть, что при такой схеме обработки масса тела мышей не уменьшается, что свидетельствует об отсутствии общих токсических эффектов на массу тела, которая является общим показателем здоровья животного.

Ссылки

В объеме, в котором в данном описании приведены ссылки на различные документы известного уровня техники, такие документы, полные библиографические данные которых указаны далее, включены в настоящее описание в полном объеме в виде ссылки.

Agrawal, S. and Akhtar, S. (1995) Advances in antisense efficacy and delivery. Trends Biotechnol, 13, 197-199.

Akhtar, S. and Juliano, R.L. (1992) Cellular uptake and intracellular fate of antisense oligonucleotides. Trends Cell Biol, 2, 139-144.

Boado, R.J., Tsukamoto, H. and Pardridge, W.M. (1998) Drug delivery of antisense molecules to the brain for treatment of Alzheimer's disease and cerebral AIDS. J Pharm Sci, 87, 1308-1315.

Cantley, L.C. and Neel, B.G. (1999) New insights into tumor suppression: PTEN suppresses tumor formation by restraining the phosphoinositide 3-kinase/AKT pathway. Proc Natl Acad Sci USA, 96, 4240-4245.

Caruthers, M.H., Beaton, G., Wu, J.V. and Wiesler, W. (1992) Chemical synthesis of deoxyoligonucleotides and deoxyoligonucleotide analogs. Methods Enzymol, 211, 3-20.

Conry, R.M., Khazaeli, M.B., Saleh, M.N., Allen, K.O., Barlow, D.L., Moore, S.E., Craig, D., Arani, R.B., Schlom, J. and LoBuglio, A.F. (1999) Phase I trial of a recombinant vaccinia virus encoding carcinoembryonic antigen in metastatic adenocarcinoma: comparison of intradermal versus subcutaneous administration. Clin Cancer Res, 5, 2330-2337.

Czauderna, F., Fechtner, M., Dames, S., Aygun, H., Klippel, A., Pronk, G.J., Giese, K. and Kaufmann, J. (2003) Structural variations and stabilising modifications of synthetic siRNAs in mammalian cells. Nucleic Acids Res, 31, 2705-2716.

Elayadi, A.N., Demieville, A., Wancewicz, E.V., Monia, B.P. and Corey, D.R. (2001) Inhibition of telomerase by 2'-О-(2-methoxyethyl) RNA oligomers: effect of length, phosphorothioate substitution and time inside cells. Nucleic Acids Res, 29, 1683-1689.

Ellisen, L.W. and Haber, D.A. (1998) Hereditary breast cancer. Annu Rev Med, 49, 425-436.

Emerich, D.F., Tracy, M.A., Ward, K.L., Figueiredo, M., Qian, R., Henschel, С and Bartus, R.T. (1999) Biocompatibility of poly (DL-lactide-co-glycolide) microspheres implanted into the brain. Cell Transplant, 8, 47-58.

Fearon, E.R. and Vogelstein, B. (1990) A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell, 61, 759-767.

Fire, A., Xu, S., Montgomery, M.K., Kostas, S.A., Driver, S.E. and Mello, C.C. (1998) Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature, 391, 806-811.

Foulds, L. (1958) The natural history of cancer. J Chronic Dis, 8, 2-37.

Gonzalez, H., Hwang, S.J. and Davis, M.E. (1999) New class of polymers for the delivery of macromolecular therapeutics. Bioconjug Chem, 10, 1068-1074.

Good, P.D., Krikos, A.J., Li, S.X., Bertrand, E., Lee, N.S., Giver, L., Ellington, A., Zaia, J.A., Rossi, J.J. and Engelke, D.R. (1997) Expression of small, therapeutic RNAs in human cell nuclei. Gene Ther, 4, 45-54.

Hofland, H. and Huang, L. (1995) Inhibition of human ovarian carcinoma cell proliferation by liposome-plasmid DNA complex. Biochem Biophys Res Commun, 207, 492-496.

Jolliet-Riant, P. and Tillement, J.P. (1999) Drug transfer across the blood-brain barrier and improvement of brain delivery. Fundam Clin Pharmacol, 13, 16-26.

Klippel, A., Escobedo, M.A., Wachowicz, M.S., Apell, G., Brown, T.W., Giedlin, M.A., Kavanaugh, W.M. and Williams, L.T. (1998) Activation of phosphatidylinositol 3-kinase is sufficient for cell cycle entry and promotes cellular changes characteristic of oncogenic transformation. Mol Cell Biol, 18, 5699-5711.

Lee, W.H., Bookstein, R., Hong, F., Young, L.J., Shew, J.Y. and Lee, E.Y. (1987) Human retinoblastoma susceptibility gene: cloning, identification, and sequence. Science, 235, 1394-1399.

Leenders, F., Mopert, K., Schmiedeknecht, A., Santel, A., Czauderna, F., Aleku, M., Penschuck, S., Dames, S., Sternberger, M., Rohl, Т., Wellmann, A., Arnold, W., Giese, K., Kaufmann, J. and Klippel, A. (2004) PKN3 is required for malignant prostate cell growth downstream of activated PI 3-kinase. Embo J, 23, 3303-3313.

Maurer, N., Mori, A., Palmer, L., Monck, M.A., Мок, K.W., Mui, В., Akhong, Q.F. and Cullis, P.R. (1999) Lipid-based systems for the intracellular delivery of genetic drugs. Mol Membr Biol, 16, 129-140.

Nykanen, A., Haley, B. and Zamore, P.D. (2001) ATP requirements and small interfering RNA structure in the RNA interference pathway. Cell, 107, 309-321.

Orum, H. and Wengel, J. (2001) Locked nucleic acids: a promising molecular family for gene-function analysis and antisense drag development. Curr Opin Mol Ther, 3, 239-243.

Santel, A., Aleku, M., Keil, O., Endraschat, J., Esche, V., Durieux, В., Loffler, K., Fechtner, M., Rohl, Т., Fisch, G., Dames, S., Arnold, W., Giese, K., Klippel, A. and Kaufmann, J. (2006a) RNA interference in the mouse vascular endothelium by systemic administration of siRNA-lipoplexes for cancer therapy. Gene Ther.

Santel, A., Aleku, M., Keil, O., Endraschat, J., Esche, V., Fisch, G., Dames, S., Loffler, K., Fechtner, M., Arnold, W., Giese, K., Klippel, A. and Kaufmann, J. (2006b) A novel siRNA-lipoplex technology for RNA interference in the mouse vascular endothelium. Gene Ther.

Stephenson, R.A., Dinney, СР., Gohji, K., Ordonez, N.G., Killion, J.J. and Fidler, I.J. (1992) Metastatic model for human prostate cancer using orthotopic implantation in nude mice. J Natl Cancer Inst, 84, 951-957.

Sternberger, M., Schmiedeknecht, A., Kretschmer, A., Gebhardt, F., Leenders, F., Czauderna, F., Von Carlowitz, I., Engle, M., Giese, K., Beigelman, L. and Klippel, A. (2002) GeneBlocs are powerful tools to study and delineate signal transduction processes that regulate cell growth and transformation. Antisense Nucleic Acid Drug Dev, 12, 131-143.

Weinberg, R.A. (1989) Oncogenes, antioncogenes, and the molecular bases of multistep carcinogenesis. Cancer Res, 49, 3713-3721.

Wincott, F., DiRenzo, A., Shaffer, C, Grimm, S., Tracz, D., Workman, C, Sweedler, D., Gonzalez, C, Scaringe, S. and Usman, N. (1995) Synthesis, deprotection, analysis and purification of RNA and ribozymes. Nucleic Acids Res, 23, 2677-2684.

Wincott, F.E. and Usman, N. (1997) A practical method for the production of RNA and ribozymes. Methods Mol Biol, 74, 59-68.

Отличительные признаки настоящего изобретения, раскрытые в описании, формуле изобретения, списке последовательностей и/или чертежах, могут отдельно или в любой их комбинации быть материалом для реализации изобретения в его различных формах.

Claims

1. Молекула рибонуклеиновой кислоты, опосредующая процесс интерференции РНК, направленной против PKN3,
при этом молекула РНК состоит из первой нити и второй нити,
при этом и первая нить, и вторая нить содержит от 19 до 23 нуклеотидов, из которых по меньшей мере 19 смежных нуклеотидов в каждой нити являются комплементарными и образуют двунитевую структуру,
при этом указанные 19 смежных нуклеотидов первой нити комплементарны части последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:1 (NM_013355) от нуклеотида 1556 до нуклеотида 1574 в SEQ ID NO:1; и
однонитевые выступы, необязательно присутствующие на 3′-конце и/или 5′-конце первой нити и/или второй нити молекулы РНК, комплементарны области перед 5′-концом и/или области, следующей за 3′-концом указанной части SEQ ID NO:1.

2. Рибонуклеиновая кислота по п. 1, где первая нить дополнительно комплементарна области, следующей за 3′-концом указанной части SEQ ID NO:1, и/или области перед 5′-концом указанной части SEQ ID NO:1.

3. Молекула рибонуклеиновой кислоты, опосредующая процесс интерференции ДНК, направленной против PKN3, при этом молекула рибонуклеиновой кислоты является двунитевой структурой, образованной первой нитью и второй нитью, при этом первая нить состоит из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:7 или SEQ ID NO:31, а вторая нить состоит из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:6 или SEQ ID NO:30.

4. Молекула рибонуклеиновой кислоты по п. 1 или 3, где первая нить и/или вторая нить содержит множество групп модифицированных нуклеотидов, имеющих модификацию во 2′-м положении, образующих правильную, предпочтительно чередующуюся картину положений, при этом, предпочтительно в пределах нити каждая группа модифицированных нуклеотидов фланкирована с одной или обеих сторон фланкирующей группой нуклеотидов, причем фланкирующий нуклеотид(ы), образующие фланкирующую группу нуклеотидов, представляет(ют) собой либо не модифицированные нуклеотиды или нуклеотиды, имеющие модификацию, отличную от модификации модифицированных нуклеотидов.

5. Рибонуклеиновая кислота по п. 4, где первая нить и/или вторая нить содержат структуру из групп модифицированных нуклеотидов и/или структуру из фланкирующих групп нуклеотидов.

6. Рибонуклеиновая кислота по п. 1 или 3, где первая нить и/или вторая нить содержат на 3′-конце динуклеотид, при этом таким динуклеотидом предпочтительно является ТТ.

7. Рибонуклеиновая кислота по п. 6, где длина первой нити и/или второй нити составляет от 19 до 21 нуклеотида.

8. Рибонуклеиновая кислота по п. 1 или 3, где первая и/или вторая нити содержат выступ из 1-5 нуклеотидов на 3'-конце.

9. Рибонуклеиновая кислота по п. 8, где длина двунитевой структуры составляет от 20 до 22 пар нуклеотидов.

10. Рибонуклеиновая кислота по п. 1 или 3, где первая нить и вторая нить ковалентно связаны друг с другом, предпочтительно 3′-конец первой нити ковалентно связан с 5′-концом второй нити.

11. Рибонуклеиновая кислота по п. 1 или 3, где молекула состоит из двух следующих нитей, и в которых подчеркнутые нуклеотиды представляют собой 2′-О-метил-нуклеотиды:

12. Липоплекс, содержащий рибонуклеиновую кислоту по п. 1 или 3 и липосому, где липосома состоит из
a) примерно 50 моль% тригидрохлорида (β-аргинил-2,3-диаминопропионовая кислота-N-пальмитил-N-олеиламида, предпочтительно (тригидрохлорида(β-(L-аргинил)-2, 3-L-диаминопропионовая кислота-N-пальмитил-N-олеиламида);
b) примерно от 48 до 49 моль% 1,2-дифитаноил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина (DPhyPE); и
c) примерно от 1 до 2 моль% 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламинполиэтиленгликоля, предпочтительно натриевой соли N-(карбонилметоксиполиэтиленгликоль-2000)-1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина.

13. Липоплекс по п. 12, где дзета-потенциал липоплекса составляет примерно от 3540 до 6055 мВ, предпочтительно примерно от 4 5 до 50 мВ.

14. Липоплекс по п. 12 или 13, где липоплекс имеет размер примерно от 50 до 400 нм, предпочтительно примерно от 100 до 140 нм и более предпочтительно примерно от 110 нм до 130 нм, как определено с помощью QELS.

15. Фармацевтическая композиция, содержащая в эффективном количестве рибонуклеиновую кислоту по любому из пп. 1-11, для лечения зависимого от ангиогенеза заболевания, отличающегося чрезмерным ангиогенезом или вызванного чрезмерным ангиогенезом.

16. Фармацевтическая композиция, содержащая в эффективном количестве липоплекс по любому из пп. 12-14, для лечения зависимого от ангиогенеза заболевания, отличающегося чрезмерным ангиогенезом или вызванного чрезмерным ангиогенезом.

17. Фармацевтическая композиция по п. 15 или 16, где ангиогенез представляет собой ангиогенез жировой ткани, кожи, сердца, глаза, легкого, кишечника, репродуктивных органов, костей и суставов.

18. Фармацевтическая композиция по п. 15 или 16, где заболевание выбрано из группы, состоящей из инфекционных болезней, аутоиммунных болезней, аномалий сосудистой системы, атеросклероза, трансплантационной артериопатии, ожирения, псориаза, бородавок, аллергического дерматита, синдрома персистирующего гиперпластического стекловидного тела, диабетической ретинопатии, ретролентальной фиброплазии, старческого заболевания сетчатки, хороидальной неоваскуляризации, первичной легочной гипертензии, астмы, носовых полипов, воспалительного заболевания кишечника и воспалительного периодонтального заболевания, асцитов, перитонеальных спаек, эндометриоза, маточного кровотечения, кист яичника, гиперстимуляции яичников, артрита, синовита, остеомиелита, образования остеофитов.

19. Фармацевтическая композиция, содержащая в эффективном количестве рибонуклеиновую кислоту по любому из пп. 1-11, при этом композиция предназначена для лечения ракового заболевания, в которое вовлечен путь PI3-киназы.

20. Фармацевтическая композиция по п. 19, при этом раковое заболевание представляет собой метастатический рак.

21. Фармацевтическая композиция по п. 19, где раковое заболевание выбрано из группы, состоящей из карцином прямой и ободочной кишки, глиом, эндометриальных раковых заболеваний, аденокарцином, гиперплазии эндометрия, синдрома Коудена, наследственной неполипозной карциномы прямой и ободочной кишки, синдрома Ли-Фраумени, рака молочной железы-яичников, рака простаты, синдрома Баннаяна-Зонана, LDD (синдром Лермита-Дюкло), заболеваний гамартома-макроцефалия, включая коровье бешенство (CD) и синдром Баннаяна-Рувалькаба-Райли (BRR), гамартом желудочно-кишечного тракта, липом, аденом щитовидной железы, кистозно-фиброзного заболевания молочной железы, диспластической ганглиоцитомы мозжечка, злокачественных новообразований молочной железы и щитовидной железы, мелкоклеточной карциномы, крупноклеточной карциномы и плоскоклеточной карциномы.

22. Фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество липоплекса по любому из пп. 12-14, при этом композиция предназначена для лечения ракового заболевания, в которое вовлечен путь PI3-киназы.

23. Фармацевтическая композиция по п. 22, где раковое заболевание представляет собой метастатический рак.

24. Фармацевтическая композиция по п. 22, где раковое заболевание выбрано из группы, состоящей из карцином прямой и ободочной кишки, глиом, эндометриальных раковых заболеваний, аденокарцином, гиперплазии эндометрия, синдрома Коудена, наследственной неполипозной карциномы прямой и ободочной кишки, синдрома Ли-Фраумени, рака молочной железы-яичников, рака простаты, синдрома Баннаяна-Зонана, LDD (синдром Лермита-Дюкло), заболеваний гамартома-макроцефалия, включая коровье бешенство (CD) и синдром Баннаяна-Рувалькаба-Райли (BRR), гамартом желудочно-кишечного тракта, липом, аденом щитовидной железы, кистозно-фиброзных заболеваний молочной железы, диспластической ганглиоцитомы мозжечка, злокачественных новообразований молочной железы и щитовидной железы, мелкоклеточных карцином, крупноклеточных карцином и плоскоклеточных карцином.

25. Фармацевтическая композиция по п. 20 или 22 для лечения солидной опухоли.

26. Фармацевтическая композиция по п. 25 для лечения заболевания, выбранного из группы, состоящей из рака костей, рака молочной железы, рака простаты, рака пищеварительной системы, рака прямой и ободочной кишки, рака печени, рака легкого, рака почек, рака мочеполовой системы, рака поджелудочной железы, рака гипофиза, рака семенников, рака глаз, рака головы и шеи, рака центральной нервной системы и рака дыхательной системы.

27. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 16, 17, 19, 22 или 26, необязательно также содержащая фармацевтически приемлемый носитель.

28. Применение рибонуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-11 для производства лекарственного средства для лечения зависимого от ангиогенеза заболевания, характеризуемого или вызванного чрезмерным ангиогенезом.

29. Применение рибонуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-11 для получения лекарственного средства для лечения ракового заболевания, в которое вовлечен путь PI3-киназы.

30. Применение по п. 29, где раковое заболевание представляет собой метастатический рак.

31. Применение по п. 29, где раковое заболевание выбрано из группы, состоящей из карцином прямой и ободочной кишки, глиом, эндометриальных раковых заболеваний, аденокарцином, гиперплазий эндометрия, синдрома Коудена, наследственной неполипозной карциномы прямой и ободочной кишки, синдрома Ли-Фраумени, рака молочной железы-яичников, рака простаты, синдрома Баннаяна-Зонана, LDD (синдрома Лермита-Дюкло), заболеваний гамартома-макроцефалия, включая коровье бешенство (CD) и синдром Баннаяна-Рувалькаба-Райли (BRR), гамартом желудочно-кишечного тракта, липом, аденом щитовидной железы, кистозно-фиброзного заболевания молочной железы, диспластической ганглиоцитомы мозжечка, злокачественных новообразований молочной железы и щитовидной железы, мелкоклеточной карциномы, крупноклеточной карциномы и плоскоклеточной карциномы.

32. Применение липоплекса по любому из пп. 12-14 для получения лекарственного средства для лечения зависимого от ангиогенеза заболевания, отличающегося чрезмерным ангиогенезом или вызванного чрезмерным ангиогенезом.

33. Применение липоплекса по любому из пп. 12-14 для производства лекарственного средства для лечения ракового заболевания, в которое вовлечен путь PI3-киназы.

34. Применение по п. 33, где раковое заболевание представляет собой метастатический рак.

35. Применение по п. 33, где раковое заболевание выбрано из группы, состоящей из карцином прямой и ободочной кишки, глиом, эндометриальных раковых заболеваний, аденокарцином, гиперплазий эндометрия, синдрома Коудена, наследственной неполипозной карциномы прямой и ободочной кишки, синдрома Ли-Фраумени, рака молочной железы-яичников, рака простаты, синдрома Баннаяна-Зонана, LDD (синдром Лермита-Дюкло), заболеваний гамартома-макроцефалия, включая коровье бешенство (CD) и синдром Баннаяна-Рувалькаба-Райли (BRR), гамартом желудочно-кишечного тракта, липом, аденом щитовидной железы, кистозно-фиброзного заболевания молочной железы, диспластической ганглиоцитомы мозжечка, злокачественных новообразований молочной железы и щитовидной железы, мелкоклеточной карциномы, крупноклеточной карциномы и плоскоклеточной карциномы.

36. Способ лечения зависимого от ангиогенеза заболевания, отличающегося чрезмерным ангиогенезом или вызванного чрезмерным ангиогенезом, включающий введение субъекту эффективного количества рибонуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-11.

37. Способ лечения зависимого от ангиогенеза заболевания, отличающегося чрезмерным ангиогенезом или вызванного чрезмерным ангиогенезом, включающий введение субъекту эффективного количества липоплекса по любому из пп. 12-14.

38. Способ лечения ракового заболевания, в которое вовлечен путь PI3-киназы, включающий введение субъекту эффективного количества рибонуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-11.

39. Способ по п. 38, где раковое заболевание представляет собой метастатический рак.

40. Способ по п. 38, где раковое заболевание выбрано из группы, состоящей из карцином прямой и ободочной кишки, глиом, эндометриальных раковых заболеваний, аденокарцином, гиперплазий эндометрия, синдрома Коудена, наследственной неполипозной карциномы прямой и ободочной кишки, синдрома Ли-Фраумени, рака молочной железы-яичников, рака простаты, синдрома Баннаяна-Зонана, LDD (синдром Лермита-Дюкло), заболеваний гамартома-макроцефалия, включая коровье бешенство (CD) и синдром Баннаяна-Рувалькаба-Райли (BRR), гамартом желудочно-кишечного тракта, липом, аденом щитовидной железы, кистозно-фиброзного заболевания молочной железы, диспластической ганглиоцитомы мозжечка, злокачественных новообразований молочной железы и щитовидной железы, мелкоклеточной карциномы, крупноклеточной карциномы и плоскоклеточной карциномы.

41. Способ лечения ракового заболевания, в которое вовлечен путь PI3-киназы, включающий введение субъекту эффективного количества липоплекса по любому из пп. 12-14.

42. Способ по п. 41, где раковое заболевание представляет собой метастатический рак.

43. Способ по п. 41, где раковое заболевание выбрано из группы, состоящей из карцином прямой и ободочной кишки, глиом, эндометриальных раковых заболеваний, аденокарцином, гиперплазий эндометрия, синдрома Коудена, наследственной неполипозной карциномы прямой и ободочной кишки, синдрома Ли-Фраумени, рака молочной железы-яичников, рака простаты, синдрома Баннаяна-Зонана, LDD (синдром Лермита-Дюкло), заболеваний гамартома-макроцефалия, включая коровье бешенство (CD) и синдром Баннаяна-Рувалькаба-Райли (BRR), гамартом желудочно-кишечного тракта, липом, аденом щитовидной железы, кистозно-фиброзного заболевания молочной железы, диспластической ганглиоцитомы мозжечка, злокачественных новообразований молочной железы и щитовидной железы, мелкоклеточной карциномы, крупноклеточной карциномы и плоскоклеточной карциномы.

44. Способ лечения по любому из пп. 36, 37, 38 и 41, где способ включает одну или несколько других способов терапии.

45. Способ по п. 44, где терапия выбрана из группы, состоящей из химиотерапии, криотерапии, гипертермии, терапии антителами, лучевой терапии и терапии, направленной против ангиогенеза.

46. Способ по п. 45, где терапия представляет собой терапию антителами и более предпочтительно терапию антителами с использованием анти-VEGF-антитела или антитела против ангиопоэтина.

47. Способ по п. 45, где в терапии, направленной против ангиогенеза, используют ингибитор киназного рецептора, предпочтительно ингибитор тирозинкиназного рецептора, при этом такой рецептор выбран из группы, состоящей из рецептора VEGF, рецептора PDGF, Tie-2, FGFR и EGFR.

48. Способ по п. 47, где ингибитор выбран из группы, состоящей из миРНК, антисмысловых молекул, аптамеров, шпигельмеров, высокоаффинных связывающих пептидов, пептидных аптамеров, антикалинов и антител.