RU2548741C2 - Активированная лейкоцитарная композиция - Google Patents
Активированная лейкоцитарная композиция Download PDFInfo
- Publication number
- RU2548741C2 RU2548741C2 RU2011139016/15A RU2011139016A RU2548741C2 RU 2548741 C2 RU2548741 C2 RU 2548741C2 RU 2011139016/15 A RU2011139016/15 A RU 2011139016/15A RU 2011139016 A RU2011139016 A RU 2011139016A RU 2548741 C2 RU2548741 C2 RU 2548741C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- wound
- composition
- leukocytes
- bag
- Prior art date
Links
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 124
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 61
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 53
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims abstract description 30
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 21
- 230000035939 shock Effects 0.000 claims abstract description 19
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 claims abstract description 11
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 6
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 claims description 75
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 claims description 74
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 60
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 48
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 48
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 claims description 32
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 29
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 claims description 21
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 15
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 13
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 13
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 claims description 12
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 claims description 12
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 claims description 10
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 claims description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 101001046686 Homo sapiens Integrin alpha-M Proteins 0.000 claims description 7
- 102100022338 Integrin alpha-M Human genes 0.000 claims description 7
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 7
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 claims description 6
- 208000004210 Pressure Ulcer Diseases 0.000 claims description 5
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000000701 coagulant Substances 0.000 claims description 5
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 5
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 claims description 5
- 208000014674 injury Diseases 0.000 claims description 5
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000003752 saphenous vein Anatomy 0.000 claims description 4
- 206010011985 Decubitus ulcer Diseases 0.000 claims description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 3
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000008733 trauma Effects 0.000 claims description 3
- 206010002153 Anal fissure Diseases 0.000 claims description 2
- 208000016583 Anus disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000009531 Fissure in Ano Diseases 0.000 claims description 2
- 229910001410 inorganic ion Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 230000000065 osmolyte Effects 0.000 claims description 2
- 210000001562 sternum Anatomy 0.000 claims description 2
- 208000005230 Leg Ulcer Diseases 0.000 claims 1
- 206010040943 Skin Ulcer Diseases 0.000 claims 1
- 208000000558 Varicose Ulcer Diseases 0.000 claims 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 16
- 239000010408 film Substances 0.000 description 16
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 230000008569 process Effects 0.000 description 9
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 8
- 101001018097 Homo sapiens L-selectin Proteins 0.000 description 7
- 101001070790 Homo sapiens Platelet glycoprotein Ib alpha chain Proteins 0.000 description 7
- 102100033467 L-selectin Human genes 0.000 description 7
- 102100034173 Platelet glycoprotein Ib alpha chain Human genes 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 239000000306 component Substances 0.000 description 7
- 206010054880 Vascular insufficiency Diseases 0.000 description 6
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 6
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 6
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 6
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 6
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 6
- 208000023577 vascular insufficiency disease Diseases 0.000 description 6
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 5
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 5
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 5
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 4
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 4
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 4
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 238000003466 welding Methods 0.000 description 4
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 206010063560 Excessive granulation tissue Diseases 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 239000008156 Ringer's lactate solution Substances 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 2
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 2
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 2
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 210000001126 granulation tissue Anatomy 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010023728 Alloderm Proteins 0.000 description 1
- 102100035248 Alpha-(1,3)-fucosyltransferase 4 Human genes 0.000 description 1
- 108010001781 Apligraf Proteins 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 208000010392 Bone Fractures Diseases 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 241001227713 Chiron Species 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 208000008960 Diabetic foot Diseases 0.000 description 1
- 206010056340 Diabetic ulcer Diseases 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108010080379 Fibrin Tissue Adhesive Proteins 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 101001022185 Homo sapiens Alpha-(1,3)-fucosyltransferase 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 1
- 101000619542 Homo sapiens E3 ubiquitin-protein ligase parkin Proteins 0.000 description 1
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 1
- 101000622137 Homo sapiens P-selectin Proteins 0.000 description 1
- 101000666340 Homo sapiens Tenascin Proteins 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 1
- 206010020843 Hyperthermia Diseases 0.000 description 1
- 208000007766 Kaposi sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 1
- 102100023472 P-selectin Human genes 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001529934 Simian T-lymphotropic virus 3 Species 0.000 description 1
- 206010072170 Skin wound Diseases 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 208000033809 Suppuration Diseases 0.000 description 1
- 102100038126 Tenascin Human genes 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 238000012084 abdominal surgery Methods 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 108010004469 allophycocyanin Proteins 0.000 description 1
- 230000000202 analgesic effect Effects 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000036436 anti-hiv Effects 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002617 apheresis Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001815 biotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 108010015046 cell aggregation factors Proteins 0.000 description 1
- 239000008004 cell lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 210000000038 chest Anatomy 0.000 description 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 1
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000011443 conventional therapy Methods 0.000 description 1
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 150000004683 dihydrates Chemical class 0.000 description 1
- 230000005059 dormancy Effects 0.000 description 1
- 238000002635 electroconvulsive therapy Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 230000003090 exacerbative effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000004835 fabric adhesive Substances 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 210000004475 gamma-delta t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 239000000416 hydrocolloid Substances 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 230000036031 hyperthermia Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 230000001418 larval effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 210000000207 lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 1
- 230000005389 magnetism Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 1
- 210000000651 myofibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 230000005305 organ development Effects 0.000 description 1
- 206010033675 panniculitis Diseases 0.000 description 1
- 102000045222 parkin Human genes 0.000 description 1
- 239000006072 paste Substances 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 238000001126 phototherapy Methods 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000010118 platelet activation Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000004814 polyurethane Substances 0.000 description 1
- 229920002635 polyurethane Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000035752 proliferative phase Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000000250 revascularization Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 102000035025 signaling receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091005475 signaling receptors Proteins 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 239000000344 soap Substances 0.000 description 1
- 208000010110 spontaneous platelet aggregation Diseases 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 210000004304 subcutaneous tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 238000011477 surgical intervention Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000006379 syphilis Diseases 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000000472 traumatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 210000005166 vasculature Anatomy 0.000 description 1
- 238000010792 warming Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/19—Platelets; Megacaryocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/15—Cells of the myeloid line, e.g. granulocytes, basophils, eosinophils, neutrophils, leucocytes, monocytes, macrophages or mast cells; Myeloid precursor cells; Antigen-presenting cells, e.g. dendritic cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/16—Blood plasma; Blood serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/18—Erythrocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L26/00—Chemical aspects of, or use of materials for, wound dressings or bandages in liquid, gel or powder form
- A61L26/0057—Ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P41/00—Drugs used in surgical methods, e.g. surgery adjuvants for preventing adhesion or for vitreum substitution
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0642—Granulocytes, e.g. basopils, eosinophils, neutrophils, mast cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Surgery (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Obesity (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к медицине и касается способа изготовления активированной лейкоцитарной композиции, включающего инкубацию лейкоцитов человека, подвергание лейкоцитов гипоосмотическому шоку и добавление к лейкоцитам физиологически приемлемого солевого раствора в количестве, достаточном для восстановления изотоничности. Группа изобретений также касается применения: активированной лейкоцитарной композиции в изготовлении лекарства для лечения ран; повязки для лечения ран, содержащей указанную композицию. Группа изобретений обеспечивает получение композиции, которая обладает в 90 раз большим количеством лейкоцитов по сравнению со способами, известными из уровня техники. 6 н. и 10 з.п. ф-лы, 3 ил., 6 табл., 3 пр.
Description
ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[1] Данная заявка объявляет приоритет заявки под серийным номером 61/209298, поданной 5 марта 2009 г. и озаглавленной «Активированная лейкоцитарная композиция», и заявки под серийным номером 61/211587, поданной 1 апреля 2009 г. и озаглавленной «Активированная лейкоцитарная композиция для сосудистой недостаточности», раскрытие которых приведено в настоящем тексте в качестве ссылки.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[2] Процесс заживления ран вовлекает участие белых клеток крови, также известных как лейкоциты. Лейкоциты включают лимфоциты, гранулоциты и моноциты. Существуют три основных типа лимфоцитов: T-клетки, B-клетки и натуральные клетки киллеры. T-клетки и B-клетки играют важную роль в распознавании антигенов в организме (Parkin, 2001). Натуральные клетки киллеры (НК) идентифицируют инфицированные клетки по изменениям уровней главного комплекса гистосовместимости (ГКГ) и уничтожают инфицированные клетки (Moretta, 2008). Участие лимфоцитов в процессе заживления во многом связано с выработкой ими цитокинов и факторов роста (Keen, 2008). В коже был описан новый класс гамма-дельта-T-клеток (Jameson, 2002. Havran, 2005). Среди различных типов гранулоцитов значимыми являются нейтрофилы, базофилы и эозинофилы. Моноциты дифференцируются в макрофаги, которые несут ответственность за разрушение остатков органических веществ тканей или проникающих чужеродных веществ. Макрофаги также вырабатывают молекулы, которые контролируют воспаление и заживление (Riches, 1996).
[3] Процесс заживления ран происходит в три перекрывающиеся фазы (Li, 2007; Broughton, 2006; Tsirogianni, 2006; Singer, 1999; Martin, 1997). Первая фаза представляет собой стадию воспаления. Она характеризуется привлечением нейтрофилов, а затем моноцитов, в область раны, где они убивают и фагоцитируют бактерии (Agaiby, 1999).
[4] Вторая фаза заживления раны, известная как пролиферативная фаза, включает в себя формирование новой грануляционной ткани. Фибробласты пролиферируют и мигрируют в раневое пространство и синтезируют коллаген и другие компоненты внеклеточного матрикса (Greiling, 1997). В то же время происходит ангиогенез, обеспечивая метаболически активную новую грануляционную ткань питательными веществами и кислородом (Tonnesen, 2000). Кератиноциты из интактного эпидермиса начинают мигрировать через временную матрицу и размножаться, что приводит к образованию новой эпителиальной ткани (Kim, 1992).
[5] Ремоделирование является третьей, заключительной фазой в заживлении ран. Эта фаза характеризуется дифференциацией фибробластов в миофибробласты, которые сокращаются и приводят края раны ближе друг к другу (Tomasek, 2002). Ремоделирование коллагеновых волокон посредством деградации и повторного синтеза позволяет ране набрать силу вследствие переориентации волокон коллагена (процесс надежно контролируется факторами роста) (Werner, 2003).
[6] Проблема лечения ран нередко усугубляется у пациентов с многочисленными патологиями, такими как диабет, ишемическая болезнь сердца и гипертензия. Эти заболевания имеют общий эффект обострения сосудистых осложнений из-за различных физиологических состояний. Осложнения ран могут привести к повышенной заболеваемости и смертности (Doshi, 2008).
[7] Обычные методы лечения ран включают хирургическую обработку, терапию антибиотиками и наложение различных повязок (Могап, 2008; Fonder, 2008). Раны, устойчивые к традиционной терапии, также называются рефрактерными ранами. Эти раны приводят к снижению качества жизни и могут приводить к росту заболеваемости и смертности. Таким образом, продолжает существовать необходимость в композициях и способах эффективного заживления ран.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[8] Один из аспектов настоящего изобретения относится к способу изготовления активированной лейкоцитарной композиции (АЛК), полученной из крови (например, получаемой или полученной из образца цельной крови). Способ включает этапы, при которых лейкоциты, которые могут быть получены из образцов цельной человеческой крови, подвергаются первой инкубации в течение периода времени и при температуре, позволяющей лейкоцитам становиться активированными, что в предпочтительных вариантах составляет приблизительно от 8 часов до приблизительно 20 часов, при комнатной температуре. После инкубации лейкоциты контактируют с физиологически приемлемым водным раствором, таким, как, например, стерильная дистиллированная вода, чтобы инициировать гипоосмотический шок, с последующим контактом лейкоцитов в состоянии шока с физиологически приемлемым солевым раствором для восстановления изотоничности. Данная активированная лейкоцитарная композиция (АЛК) может быть использована терапевтически. Тем не менее, в некоторых вариантах, отдельно, и по существу параллельно с первой инкубацией лейкоцитов, образец плазмы, который может быть получен из того же или из другого образца цельной крови (например, от того же или от другого человека), контактирует с коагулянтом при температуре приблизительно равной 37°C одновременно с лейкоцитарной инкубацией, которая, в предпочтительных вариантах, составляет приблизительно от 8 часов до 20 часов, с последующим отделением сыворотки от коагулированного образца плазмы. Лейкоциты ресуспендируют в сыворотке, собранной из образцов коагулированной плазмы, формируя таким образом АЛК. После первой инкубации лейкоциты могут быть дополнительно подвергнуты второй инкубации в течение приблизительно от 60 до 120 минут при температуре приблизительно равной 37°C.
[9] Другой аспект настоящего изобретения относится к АЛК, полученной из крови. Активированная лейкоцитарная композиция настоящего изобретения включает в себя, с точки зрения популяции лейкоцитов присутствующих в ней, приблизительно от 40% до 90% гранулоцитов, приблизительно от 5% до 20% моноцитов и приблизительно от 5% до 30% лимфоцитов, от общего количества лейкоцитов в АЛК. Как показано на рабочих примерах, изобретаемые АЛК также могут характеризоваться и отличаться от известных композиций с точки зрения минимального выхода лейкоцитов (относительно образца цельной крови), жизнеспособности лейкоцитов, а также минимальных уровней активации гранулоцитов, например, как указано CD lib. АЛК может дополнительно содержать остаточные уровни тромбоцитов (в количестве приблизительно равном 46,8+/-39,2 (103/мкл)), и эритроцитов (в количестве приблизительно равном 0,1+/-0,06 (106/мкл)) АЛК. Популяция лимфоцитов может включать приблизительно от 7% до 25% В-клеток (CD 19+), приблизительно от 20% до 30% клеток натуральных киллеров (CD3-/CD56+), приблизительно от 40% до 60% T-клеток (CD3+), приблизительно от 0,1% до приблизительно 30% клеток НКТ CD3+/CD56+, приблизительно от 8% до приблизительно 20% T-хелперов (CD4+/CD3+), и приблизительно от 20% до приблизительно 30% клеток CD8+/CD3+. Клетки могут быть суспендированы в носителе, таком как сыворотка (которая может быть аутологической или аллогенной по отношению к реципиенту), или в других физиологически приемлемых изонормальных жидкостях, подходящих для хранения и введения клеток, как, например, раствор, используемый для восстановления изотоничности.
[10] Еще один аспект настоящего изобретения относится к способу стимуляции заживления ран, который включает введение или нанесение АЛК на рану другим способом.
[11] Раскрытое изобретение достигает нескольких неожиданных результатов по сравнению, по меньшей мере, с одной известной композицией для заживления ран, содержащей лейкоциты. Как продемонстрировано в рабочих примерах настоящего изобретения, эти результаты включают повышение выхода и жизнеспособности лейкоцитов и более высокий процент активированных гранулоцитов. Также полагают, что описанное изобретение включает неожиданно более высокий процент активированных моноцитов и сравнительно более высокий процент Т-клеток CD4 по сравнению с Т-клетками CD8.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[12] Фиг. 1 схематически изображает первую часть репрезентативной системы для производства АЛК композиций по настоящему изобретению, включающая мешки A-C (Комплект-1), представляющие мешки или контейнеры для хранения крови, где мешок A содержит эритроцитарную массу, собранную у донора; мешок В содержит плазму, а мешок С содержит лейкоциты (которые после первоначального отделения от цельной крови образуют слой, который обычно называется лейкоцитная пленка).
[13] Фиг. 2 схематически изображает вторую часть репрезентативной системы для производства АЛК композиций по настоящему изобретению, включающая комплект из 7 мешков, после того, как из системы удален мешок А с эритроцитами, а мешки В и С из фиг. 1 соединены с мешками 1-5 (Комплект 2).
[14] Фиг. 3А и 3В являются графиками, иллюстрирующими общие тенденции экспрессии как CD62L, так и CD42b, которые являются индикаторами активации клеток.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[15] Кровь определяется здесь как цельная кровь или любая из ее составных частей (например, плазма, лейкоциты, тромбоциты или эритроциты). Количества тромбоцитов и эритроцитов, которые могут присутствовать в АЛК настоящего изобретения, могут быть ниже, чем количество, которое присутствует в цельной крови.
[16] Термин "приблизительно", как используется здесь в связи с любыми значениями (включая нижние и верхние пределы числовых диапазонов), как имеющий какое-либо значение допустимого диапазона отклонения от +/-0,5% до +/-20% (и значения между ними, например,±1%, ±1,5%, ±2%, ±2,5%, ±3%, ±3,5%, ±4%, ±4,5%, ±5%, ±5,5%, ±6%, ±6,5%, ±7%, ±7,5%, ±8%, ±8,5%, ±9%, ±9,5%, ±10%, ±10,5%, ±11%, ±11,5%, ±12%, ±12,5%, ±13, ±13,5%, ±14%, ±14,5%, ±15%, ±15,5%, ±16%, ±16,5%, ±17%, ±17,5%, ±18%, ±18,5%, ±19%, ±19,5% и ±20%).
[17] Исходные материалы для производства изобретаемых АЛК могут быть получены из нескольких источников. Цельная кровь или один или несколько ее компонентов (например, лейкоциты и плазма) могут быть получены из аутологических или аллогенных источников. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения образец крови, отобранный у пациента, которого в конечном итоге будут лечить АЛК, называется в этом документе аутологичным образцом или источником крови. В вариантах, в которых источник(и), т.е. кровь или ее компоненты, получены от индивидуумов, которые не являются планируемыми реципиентами АЛК, который(е) называется(ются) аллогенным образцом или источником крови, эти исходные материалы могут быть просто получены из банка крови. Образцы могут быть исследованы банком крови на группу крови и резус фактор (ABO, Rh), нерегулярные антитела к антигенам эритроцитов и заболеваниям, передающимся через переливание крови. В частности, исследование может быть проведено с использованием анализатора крови Abbott PRISM с антителами против: гепатитов B и C, ВИЧ-1/2, ЧТЛВ и сифилиса (HCV, HbsAg, anti-HIV ½ 0+; и anti-HTLV I/II). Образцы можно также обследовать на ВИЧ, ВГС и ВГВ молекулярными методами (тестирование нуклеиновых кислот - ТНК). Молекулярный скрининг может быть выполнен с использованием коммерчески доступных инструментов, например, системы TIGRIS (Chiron).
[18] В указанных вариантах с участием аллогенных источников образцы могут быть получены от доноров с тем же типом крови, как предполагаемый реципиент АЛК. Альтернативно, как дополнительно изложено здесь, образцы плазмы могут быть получены от доноров крови АВ+, лейкоциты могут быть получены от пациентов с группой крови 0-. Пациенты с группой крови АВ+ являются универсальными донорами плазмы, а пациенты с группой крови 0 - являются универсальными донорами лейкоцитов. Независимо от источника, вся необходимая обработка образца(ов) может быть проведена без необходимости в использовании высокоспециализированного оборудования.
[19] Предпочтительный способ получения АЛК композиции настоящего изобретения в настоящее время описан со ссылкой на Фиг. 1 и 2, которые отображают систему, содержащую два комплекта взаимосвязанных стерильных инфузионных мешков. Система герметизирована таким образом, что воздействия внешней среды отсутствуют. В частности, трубки, связывающие два комплекта, соединяются в одну систему, с использованием стерильного соединительного устройства (например, TSCD®-II, номер по каталогу МЕ-203АН, производитель Тегито). В частности, для обеспечения соблюдения стандартов стерильности соединение(сварка) и разрезание трубок осуществляются при помощи специальных пластин, предварительно нагретых до приблизительно 300°C. Такая высокая температура повышает стерильность процедуры сварки. Для дальнейшего обеспечения стерильности сварка может быть осуществлена в боксе биологической безопасности класса 100 внутри области локализации класса 100000.
[20] Как продемонстрировано на Фиг. 1 и 2, система содержит два стерильных комплекта мешков. Комплект 1, включающий мешки A, B и С, является стандартным, коммерчески доступным комплектом из трех мешков, обычно используемых для переливания крови. Образец крови человека, как правило, в объеме приблизительно от 400 мл до приблизительно 550 мл, собирают в банк крови через венепункцию и помещают в мешок A, а затем фракционируют на составные части с использованием стандартных способов в мешках A, B и C. Например, мешок A, содержащий образец крови, центрифугируют. После центрифугирования компоненты крови разделяются, например, с использованием экстрактора компонентов крови производства Baxter. Лейкоцитную пленку, содержащую лейкоциты, помещают в мешок C, плазму помещают в мешок B, а эритроциты остаются в мешке A. Таким образом, в результате этого процесса мешок A содержит эритроцитарную массу; мешок В содержит плазму; и мешок C содержит лейкоцитную пленку, содержащую лейкоциты (и, возможно, остаточную плазму и эритроциты). Кроме того, компоненты крови могут быть отделены от цельной крови с помощью способа афереза, известного в данной области техники.
[21] Мешок A затем отсоединяют от комплекта, состоящего из трех мешков. Как показано на Фиг.2, мешки B и C затем присоединяют к сделанным на заказ инфузионным мешкам 1-5 (Комплект-2) для формирования системы, которая используется для изготовления активированной лейкоцитарной композиции. Как описано выше, сваривание осуществляется со стерильным соединительным устройством. Мешок 1 содержит первый водный раствор (например, 200 мл стерильной дистиллированной воды), используемый с целью подвергнуть клетки лейкоцитной пленки гипоосмотическому шоку. Это служит для лизиса остаточных эритроцитов, которые могут присутствовать. Мешок 2 содержит второй раствор (например, 20 мл буферизованного раствора хлорида натрия (8,91% NaCl, фармакопея США), или любой другой физиологически приемлемый раствор, содержащий неорганические ионы, органические осмолиты такие, как сахароза, или какие-либо их комбинации, например, раствор лактата Рингера (по Хартману)), который служит для восстановления лейкоцитами изотоничности после гипоосмотического шока. Когда раствор хлорида натрия добавляют к 200 мл дистиллированной воды, она становится 0,9% раствором хлорида натрия. Мешок 3 содержит третий раствор (например, приблизительно 60 мл буферизованного раствора хлорида кальция (1,17% CaCl дигидрат, фармакопея США)), который влияет на коагуляцию плазмы в мешке В и на облегчение разделения на тромбоциты и сыворотку. Мешок 4 и мешок 5, каждый, содержит стерильный отфильтрованный воздух, приблизительно 60 мл и 500 мл, соответственно. Комплект упаковывают как единый блок и стерилизуют с применением пара высокого давления, что значительно снижает риск развития вторичной инфекции для пациента.
[22] Лейкоциты затем переносят из мешка С в мешок 4 (или мешок 5) и инкубируют, предпочтительно в вертикальном положении, чтобы дать им возможность активироваться. Для целей настоящего изобретения активация клеток определяется как процесс, при котором клеткам (лейкоцитам) предоставляют возможность стать активированными, а точнее, как переход от покоя к функционально активному состоянию, которое сопровождается синтезом биологически активных веществ или перемещением предварительно синтезированных веществ из цитоплазмы в клеточную мембрану, или их высвобождением из клеток. Эти вещества могут включать белки или полипептиды, липиды, сахара, кислородные радикалы и другие биохимические фрагменты, которые функционируют как молекулы адгезии, цитокины, факторы роста, ферменты, факторы транскрипции и рецепторы клеточной сигнализации и медиаторы. При обнаружении и идентификации внутри клеток или на клеточной поверхности эти молекулы называют маркерами активации.
[23] В некоторых вариантах лейкоциты инкубируют, просто оставляя их стоять при комнатной температуре. Для целей настоящего изобретения комнатная температура относится к температуре в диапазоне приблизительно от 12°C до приблизительно 28°C, а в некоторых вариантах приблизительно от 16°C до приблизительно 25°C. Период времени инкубации может изменяться в зависимости от температуры. Время инкубации будет ниже при повышенных температурах. Инкубационное время, необходимое для активации лейкоцитов, будет приблизительно обратно пропорционально температуре, при которой проводится инкубация. Например, в вариантах, где лейкоциты оставляют стоять при комнатной температуре, время инкубации обычно составляет приблизительно от 90 минут, и от более 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 часов до приблизительно 20 часов. В предпочтительных вариантах инкубационное время колеблется от приблизительно 8 до приблизительно 20 часов. В более предпочтительном варианте инкубация лейкоцитов происходит при температуре приблизительно от 18°C до 24°C в течение приблизительно от 8 часов до 12 часов. В других вариантах инкубация лейкоцитов включает их экспозицию к воздействию тепла, например, при температуре выше комнатной и примерно до 37°C. Срок инкубации при повышенной температуре обычно составляет от 5 часов до приблизительно 24 часов.
[24] Обращаясь снова к Фиг.2, лейкоциты из мешка C перемещают в мешок 4, который, как правило, меньше, чем мешок C (например, приблизительно 250 мл - приблизительно 500 мл). Также клетки могут быть перемещены в другой мешок объемом 500 мл (мешок 5). Чтобы предоставить возможность для активации лейкоцитов, мешок 4 (или мешок 5) помещают в вертикальное положение и инкубируют в течение приблизительно от 8 часов до приблизительно 20 часов при комнатной температуре.
[25] После инкубации лейкоциты подвергают гипоосмотическому шоку, который лизирует эритроциты. В предпочтительных вариантах гипоосмотический шок осуществляют немедленно (то есть, после завершения предыдущего этапа без какого-либо промежуточного этапа или ненужной задержки, как правило, меньше чем 2 минуты). Гипоосмотический шок может быть инициирован перемещением дистиллированной воды из мешка 1 в мешок 4 (или мешок 5), содержащий лейкоциты. Обработку с помощью гипоосмотического шока, как правило, проводят в течение приблизительно 45 секунд. Вслед за этим этапом и, желательно, сразу же после него, восстанавливают изотоничность лейкоцитов путем перемещения раствора хлорида натрия из мешка 2 в мешок 4 (или мешок 5). Отношение объема раствора хлорида натрия к клеточной суспензии в воде составляет, как правило, приблизительно 1:10. Содержимое мешка 4 затем переносят в мешок 1 (или оставляют в мешке 5), который больше по объему, чем мешок 4. Как описано выше, эта композиция в патентоспособных способах может быть использована терапевтически.
[26] Предпочтительный вариант включает, по меньшей мере, один дополнительный этап. Таким образом, в отдельном этапе, который может быть проведен одновременно с лейкоцитарной инкубацией, плазму разделяют на тромбоциты и сыворотку с помощью коагулянта, такого как СаСl2, с последующим центрифугированием. Таким образом, в этом типичном варианте СаСl2 из мешка 3 переносят в мешок B. Мешок B, который теперь содержит композицию плазмы и СаСl2, как правило, предоставляют возможность коагулировать при температуре приблизительно равной 37°C. Плазма остается в контакте с коагулянтом по существу такой же период времени, в течение которого инкубируют лейкоциты.
[27] После гипоосмотического шока и восстановления изотоничности лейкоцитов и последующего перемещения содержимого мешка 4 в мешок 1 (или оставления в мешке 5), и после коагуляции плазмы в мешке B всю систему, состоящую из 7 мешков, центрифугируют. В предпочтительных вариантах центрифугирование проводят сразу же после того, как лейкоциты перемещают в мешок 1 (или оставляют в мешке 5), чтобы не подвергать клетки воздействию гемолизата. После центрифугирования надосадочную жидкость из мешка 1 (или мешка 5) перемещают в мешок C, а лейкоцитарный осадок, сформированный в мешке 1 (или мешке 5) в результате центрифугирования, ресуспендируют в приблизительно от 20 мл до приблизительно 50 мл сыворотки из мешка B.
[28] В еще одном этапе предпочтительного варианта осуществления настоящего изобретения активированные лейкоциты могут быть инкубированы в упомянутой выше коагулированной плазме до того, как сделана финальная композиция. Как правило, этот второй период инкубации проводят в течение 1-2 часов при температуре 37°C.
[29] В других вариантах композиция АЛК может быть получена из меньших объемов образцов крови, с соразмерным снижением объемов всех растворов и с использованием мешков меньшего размера. Кроме того, использование мешков различных размеров приводит к получению различных композиций АЛК. Даже в этих вариантах, в качестве исходных материалов могут быть использованы аллогенные или аутологичные образцы крови. Использование меньших объемов предоставляет клиницисту возможность выполнять сбор крови автономно, без использования внешнего банка крови, например, в чрезвычайных ситуациях, при лечении пациентов со здоровой во всем остальном иммунной системой, но страдающих от некоторых типов травматических ран (например, на поле боя и в боевых условиях). В этих вариантах тестирование на заразные болезни и антигены может не проводиться. Однако, в таких случаях пациенты с рефрактерными ранами не являются клинически приемлемыми донорами крови для эффективного изготовления АЛК. Если возникает такая ситуация, АЛК будет производиться от аллогенных доноров с помощью средств, описанных здесь.
[30] АЛК настоящего изобретения включают лейкоциты, например гранулоциты, моноциты и лимфоциты. Гранулоциты включают нейтрофилы, эозинофилы и базофилы. В самом широком смысле популяция лейкоцитов АЛК, как правило, содержит приблизительно от 40% до приблизительно 90% гранулоцитов, приблизительно от 5% до приблизительно 20% моноцитов и приблизительно от 5% до приблизительно 30% лимфоцитов. Конкретное количество клеток может отличаться в зависимости от применяемых техник анализа. Если анализ проводят с использованием ФАКС (например, используя анализ точечной диаграммы рассеивания света под углом по сравнению с прямым рассеиванием), композиция лейкоцитов обычно содержит приблизительно от 55% до приблизительно 80% гранулоцитов, приблизительно от 5% до приблизительно 15% моноцитов и приблизительно от 5% до приблизительно 30% лимфоцитов, а в некоторых вариантах составляет приблизительно 58-76% гранулоцитов; приблизительно 5-11% моноцитов и приблизительно 9-23% лимфоцитов. Если анализ проводят с использованием анализатора Cell Dyn, композиция лейкоцитов обычно содержит: приблизительно от 50% до приблизительно 90% гранулоцитов; приблизительно от 5% до приблизительно 15% моноцитов; и приблизительно от 10% до приблизительно 25% лимфоцитов. Субпопуляция лимфоцитов в АЛК может поддерживать следующие клетки в общих пределах следующим образом: приблизительно от 7% до приблизительно 25% B-клеток (CD19+); приблизительно от 20% до приблизительно 30% НК клеток (CD3-/CD56+), приблизительно от 40% до приблизительно 60% T-клеток (CD3+), приблизительно от 0,1% до приблизительно 30% клеток НКТ CD3+/CD56+, приблизительно от 8% до приблизительно 20% клеток T-хелперов (CD4+/CD3+), и приблизительно от 20% до приблизительно 30% клеток CD8+/CD3+. В предпочтительных вариантах субпопуляция лимфоцитов обогащается, по меньшей мере, 9% CD56+ клеток (CD3-/CD56+; CD3+/CD56+; CD3+/CD56+/CD8+), количество Т-лимфоцитов хелперов (CD4+/CD3+) снижается до менее чем 20% и/или соотношение клеток Т-хелперов к Т-супрессорам (CD4+/CD3+: CD8+/CD3+) составляет меньше чем 0,8.
[31] Пациенты, страдающие от ран, могут быть с физиологическими осложнениями или здоровыми во всем остальном. Например, в связи с уже ослабленными метаболическими системами пациенты с сахарным диабетом и другими медицинскими осложнениями являются кандидатами на АЛК, произведенную из гетерологичной крови, поскольку свои собственные лейкоциты могут не быть оптимальными для данной процедуры. Тем не менее, здоровые во всем остальном пациенты, как в примере пациентов с травмами, также являются хорошими кандидатами для АЛК композиций настоящего изобретения.
[32] Настоящее изобретение пригодно для стимулирования заживления при множестве типов ран. Хотя на практике изобретение может быть использовано в сочетании с другими способами лечения, оно не требует использования дополнительных способов для достижения эффективного заживления ран. Изобретатели предлагают применение АЛК для любого типа раны и не предвидят никаких ограничений типов ран, которые можно лечить. Легкость нанесения, например, при помощи стандартного шприца или аналогичного устройства для применения делает изобретаемые композиции АЛК безопасными и простыми в использовании.
[33] Раны, которые поддаются лечению изобретением, как правило, представляют собой проколы, порезы или разрывы живых тканей. Раны кожи могут проникать внутрь эпидермиса, дермы или, в случае раны на всю толщину кожи, она может проникать в подкожные ткани. Таким образом, типичные образцы ран, которые поддаются лечению композициями и способами настоящего изобретения, включают декубитальные язвы или пролежни, диабетические язвы, глубокие раны грудины, например, после операции на открытом сердце (к большой подкожной вене после коронарной реваскуляризации и отбора большой подкожной вены), а также послеоперационные раны после абдоминального хирургического вмешательства и любого другого вида хирургического вмешательства. Другие раны, возникающие в результате травмы, как, например, от огнестрельного оружия, ножевые раны, или раны от воздействия любого другого объекта, способного вызвать разрез или разрыв кожи. Раны полости рта (например, зубов), а также раны, которые возникают как побочный эффект лечения или как симптом различных патологий (например, язвы, связанные с саркомой Капоши), а также внутренние раны (например, анальные трещины и раны или повреждения желудочно-кишечного тракта, такие как язвы в желудке или кишечнике) также могут поддаваться лечению с помощью настоящего изобретения.
[34] АЛК может также быть использована для лечения любых ран, осложненных сосудистой недостаточностью. Сосудистая недостаточность, для целей настоящего изобретения, относится к недостаточной циркуляции крови в результате недостаточной перфузии в пораженных областях. Такая недостаточность может быть вызвана травмой (например, повреждение сосудистой сети, прилегающей к костному перелому), или различными патологиями (например, сахарный диабет и атеросклероз). В любом случае сосудистая недостаточность, индуцированная травмой или болезнью, уменьшает вероятность эффективного заживления ран. Для улучшении результатов заживления ран у этих пациентов может быть пригодна АЛК, и ее следует вводить в соответствии со способами, описанными в настоящем документе. Кроме того, алгоритмы лечения не должны быть ограничены тяжестью и типом раны или степенью сосудистой недостаточности. АЛК может быть более эффективной у пациентов с наиболее тяжелыми ранами и сосудистой недостаточностью.
[35] В целом, аппликация активированной лейкоцитарной композиции осуществляется с помощью одной или нескольких инъекций АЛК непосредственно в рану или в ткани, окружающие рану. АЛК может быть непосредственно нанесена на открытую рану.
[36] Для инъекции в рану предпочтительно использовать шприц Луер-Лок или любой другой коммерчески доступный тип шприца, который имеет запирающий механизм между шприцем и иглой. Биологическое пространство раны, в частности пролежня, часто ограничено. При введении инъекции в рану существует риск давления, которое вызывает разъединение шприца от иглы. Использование шприца с закрепляющим механизмом устраняет этот риск.
[37] Если инъекция в ткани раны не представляется возможной, АЛК может быть непосредственно нанесена в полость раны. Аппликация таким способом может быть выполнена с использованием непосредственного нанесения с помощью шприца или трубок.
[38] АЛК может быть нанесена на рану или вокруг раны с помощью повязки. Сухие перевязочные материалы включают марлю и бинты, неклейкие сетки, мембраны и пленки, пены и тканевые клеи. Влагоудерживающие барьерные перевязочные материалы включают пасты, кремы и мази, непроницаемые или полупроницаемые мембраны или пленки, гидроколлоиды, гидрогели и комбинацию этих продуктов. Биологически активные перевязочные материалы включают антимикробные повязки, интерактивные повязки, однокомпонентные биологические повязки и комбинированные продукты. В некоторых вариантах рану тампонируют стерильной марлей, смоченной в АЛК. Перевязочный материал, например, такой как стерильные марлевые прокладки, может быть пропитан такой композицией, как раствор лактата Рингера (по Хартману), альгинатсодержащая повязка, полиуретановый перевязочный материал или повязка из карбоксиметилцеллюлозы применяются для покрытия ран с последующим применением сухой повязки. Если рана субъекта чрезвычайно инфицирована, то могут быть применены повязки с серебром, такие как Silverlon. Выбор послеинъекционной повязки основан на решении врача. Коммерческая доступность, история предыдущего клинического успеха и толерантность пациента - все это является факторами, которые необходимо учитывать при выборе повязки на рану. Перевязку можно периодически удалять, например, обычно, примерно через 24 часа, для того, чтобы орошать рану, например, стерильной водой и мылом.
[39] В другом варианте композиция может быть помещена на физиологически инертный и/или рассасывающийся матрикс или каркас (например, коллаген) и вставлена в рану с помощью прессования (тампонады). Это обеспечивает продолжительную доставку АЛК к месту, которая обеспечивает преимущества для пациента тем, что клетки имеют более длительный период нахождения на месте.
[40] АЛК композиции могут быть введены в рану один или несколько раз, например, через 4 недели, как только врач определяет, будет ли необходима повторная аппликация. Факторы, которые могут быть приняты во внимание, включают увеличенные размеры раны (ширина, длина и глубина), наличие нагноения, гипертермии или любого другого признака или симптома, указывающего на неподдающуюся лечению инфекцию, такую, при которой обосновано повторное лечение. В дополнение к повторной терапии, в любой момент, который врач сочтет подходящим, может быть назначено направление на хирургическую обработку.
[41] АЛК может быть использована в сочетании с любым другим традиционным лечением ран, таким как согревание (терапевтическое тепло), электростимуляция, магнетизм, лазерная фототерапия, циклоидальная вибрационная терапия и ультразвук. Она также может быть использована с биологической терапией, такой как личинкотерапия, заменители кожи, культура кератиноцитов (Epicel, Genzyme biosurgery), замена кожи человека (Dermagraft, Smith and Nephew Inc.), подвергнутая обработке дерма, полученная от трупа (Alloderm, Life Cell Corporation), двухслойный эквивалент кожи (Apligraf, Organogenesis Inc.), TransCyte (Smith and Nephew Inc.), факторы роста (PDGF (фактор роста тромбоцитов) в настоящее время является единственным фактором роста, лицензированным для наружного применения), и фибриновый герметик (клей). В некоторых вариантах АЛК используется в сочетании с вакуумной терапией (система VAC), которая является коммерчески доступной терапией ран производства KCI. VAC способствует заживлению ран путем воздействия на рану отрицательного давления. В этих вариантах АЛК предпочтительно наносят на рану перед проведением VAC терапии. В других вариантах АЛК используется в сочетании с гипербарической терапией (Thackham, 2008). Например, АЛК может быть нанесена на рану незадолго до того, как пациент получит гипербарическую терапию. АЛК может быть также использована в сочетании с низкоэнергетической ударно-волновой терапией (например, импульсы приблизительно равные 0,1 мДж/мм2; 5 Гц) на каждый сантиметр длины раны). См., например, Dumfarth, et al., Ann. Thorac. Surg. 86:1909-13 (2008).
[42] После лечения раны можно оценить измерением длины, ширины и высоты. Как правило, рана считается излеченной, когда все измерения этих параметров незначительны. АЛК также может обеспечить обезболивающий эффект.
[43] Активированная лейкоцитарная композиция особенно пригодна для лечения ран, включая диабетические язвы стопы и декубитальные язвы. Декубитальные язвы являются пролежневыми язвами, вызванными затруднением кровотока, как правило, из-за длительного давления на отдельную область (Berlowitz, 2007). Декубитальные язвы вызывают заболеваемость и смертность у пожилых людей. По крайней мере, 48% пролежневых язв IV степени остаются незажившими после одного года лечения (Girouard, 2008). Пациенты, страдающие от декубитальных язв, также часто имеют сопутствующие патологии, такие как диабет и гипертония. Эти патологии еще больше осложняют успешное лечение декубитальных язв.
[44] В одном из вариантов для лечения декубитальных язв композиция аспирируется в стерильный шприц любого размера, используя иглы 18-го калибра (18G). Аспирация проводится медленно, чтобы минимизировать повреждение клеток. Хотя размер шприца и иглы не являются ограничением, игла большого калибра является предпочтительной для аспирации. Это облегчает перемещение и уменьшает повреждение клеток.
[45] Аппликация активированной лейкоцитарной композиции на язву включает инъекционное введение композиции в рану. Может быть использован весь образец из шприца и, если на основании клинических параметров будет установлена необходимость, врач может выбрать введение дополнительной АЛК.
[46] Иглу 18G, используемую для аспирации, обменивают на иглу размером в пределах 22-35G. АЛК может быть введена путем инъекции в рану в различных местоположениях. В одном из вариантов инъекции вводят на расстоянии приблизительно от одного до приблизительно трех сантиметров друг от друга на протяжении всей длины раны. В каждое место инъекции вводят 0,1-0,3 мл АЛК.
[47] В другом варианте все содержимое шприца можно вводить в одно время в единственное место в пределах раны.
[48] Аспект(ы) настоящего изобретения будут описаны в соответствии со следующими неограничивающими примерами.
[49] Пример 1 - Анализ клеточной активации
[50] Активированная лейкоцитарная композиция, изготовленная в соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, была определена количественно с помощью анализа различных маркеров на клеточной поверхности. Увеличение агрегации тромбоцитов либо с моноцитами, либо с гранулоцитами является признаком активации моноцитов и гранулоцитов через экспрессию селектина P. CD62L является белком плазматической мембраны, который теряется во время активации и, следовательно, уменьшается при клеточной активации. CD42b является маркером активации тромбоцитов, вовлеченным в процесс коагуляции как фактор агрегации. Он взаимодействует с внеклеточным матриксом и с молекулами адгезии, а также используется в настоящем изобретении в качестве индикатора активации моноцитов и гранулоцитов.
[51] Для пробы в трех временных точках отбирают клетки: свежую лейкоцитную пленку (СвЛП); инкубированную лейкоцитную пленку (ИЛП); и финальную активированную лейкоцитарную композицию (ФП) (Таблица 1).
| Таблица 1 | |||
| Маркеры клеточной поверхности, свидетельствующие об активации лейкоцитов | |||
| % CD62L позитивных клеток | |||
| СвЛП | ИЛП | ФП | |
| Моноциты | 68 | 55 | 44 |
| Гранулоциты | 97 | 47 | 39 |
| % CD42b позитивных клеток | |||
| Моноциты | 26 | 74 | 92 |
| Гранулоциты | 3 | 15 | 39 |
[52] СвЛП отбирают сразу же после приготовления лейкоцитной пленки. ИЛП отбирают после первого периода инкубации и ФП отбирают из конечного продукта. В каждой точке времени, клетки помечают специфическими моноклональными антителами (аллофикоцианин (АФЦ), конъюгированный анти-CDH, фикоэритрин (ФЭ), конъюгированный анти-С042b и флуоресцеин-изотиоцианат (ФИТЦ), конъюгированный анти-СБ62b антителами), а затем анализируют при помощи ФАКС.
[53] Клетки из каждой временной точки промывают ФАКС красящим раствором (ФСБ, 2% нормальной мышиной сыворотки; 0,02% азида натрия), отбирают аликвоту и окрашивают в соответствии с протоколом окрашивания. Кратко, 0,5× (106/мкл) клеток инкубируют с соответствующими моноклональными антителами в течение 30 мин при комнатной температуре (КТ) или при температуре +4°C в темноте. После инкубации клеточную композицию обрабатывают буфером для лизиса эритроцитов, промывают, а затем, в заключение, ресуспендируют в ФСБ для восприимчивости к ФАКС. Для CD62L положительного (+) окрашивания, клеточную композицию инкубируют с анти-СЭ14 человека (АФЦ) и античеловеческими CD62L (ФИТЦ) антителами при температуре +4°C. Для окрашивания CD42b+, клеточную композицию инкубируют с античеловеческим ЭМ (АФЦ) и античеловеческим CD42b (ФЭ) при комнатной температуре (КТ). Отрицательную контрольную клеточную композицию инкубируют с античеловеческими CD 14 и контролируют соответствующий изотип в соответствующих условиях. Ассоциированное с клетками рассеивание света и флуоресценцию анализируют с использованием анализатора «ФАКС Калибур» (Becton Dickinson). Моноциты определяют как CD14-положительные клетки, а гранулоциты идентифицируют по их характерным свойствам рассеивания света. CD62L или CD42b позитивные клетки определяют как процент моноцитов и гранулоцитов с флуоресценцией больше, чем порог, установленный моноцитами и гранулоцитами, инкубированными с соответствующими антителами контроля изотипа.
[54] Как продемонстрировано на Фиг. 3А и 3В и в Таблице 1, результаты согласуются с ожиданием, что экспрессия CD62L будет уменьшаться по мере прогрессирования активации и уровень CD42b будет возрастать по мере прогрессирования активации. Эти данные демонстрируют, что лейкоциты становились активированными.
Пример 2 - АНАЛИЗ АКТИВИРОВАННОЙ ЛЕЙКОЦИТАРНОЙ КОМПОЗИЦИИ
[55] Таблицы 2 и 3 отображают клеточный состав конечной АЛК, как определено с помощью анализа анализатором Cell Dyn. Клетки анализируют после ресуспендирования активированных лейкоцитов в сыворотке. Жизнеспособные клетки окрашивают, используя изоляцию трипановым синим, и наблюдают под микроскопом.
| Таблица 2 | ||||||||
| Состав активированной лейкоцитарной композиции | ||||||||
| Тромбоциты (103/мкл) | Эритроциты (106/мкл) | Лейкоциты (103/мкл) | ||||||
| Концентрация в конечной АЛК | 46,8 | од | 6,8 | |||||
| Стандартное отклонение | 39,2 | 0,06 | 3,8 | |||||
| Таблица 3 | ||||||||
| Состав лейкоцитов в АЛК | ||||||||
| Лейкоциты | ||||||||
| Гранулоциты | ||||||||
| Нейтрофилы,% | Базофилы, % | Эозинофилы, % | Моноциты, % | Лимфоциты, % | ||||
| % в конечной АЛК | 65,5 | 1,6 | 4,6 | 9,1 | 18,5 | |||
| Стандартное отклонение | 8,2 | 0,3 | 3 | 2,1 | 4,1 | |||
| Диапазоны | 52-78 | 1-2 | 1-9 | 6-12 | 13-24 | |||
[0056] Результаты исследования анализатором Cell Dyn, как продемонстрировано в Таблице 2, показывают, что АЛК содержит тромбоциты в количестве 46,8+/-39,2 (103/мкл), эритроциты в количестве 0,1+/-0,03 (106/мкл) и лейкоциты в количестве 6,8+/-3,8(103/мкл). На основе анализа Cell Dyn, было также установлено, что состав лейкоцитов АЛК (как показано в Таблице 3), содержит 52%-78% нейтрофилов, 1-2% базофилов, 1-9% эозинофилов, 6%-12% моноцитов, и 13%-24% лимфоцитов, с учетом стандартного отклонения. Диапазоны, отображенные в этих таблицах, представляют высокие и низкие результаты после выполнения 8 отдельных анализов с использованием анализатора Cell Dyn.
[57] Пример 3
[58] Сравнение предлагаемого способа и существующего уровня техники процесса.
[59] Чтобы выделить различные неожиданные преимущества, связанные с настоящим изобретением, его варианты сравнивают с процессом, описанным в патенте США 6146890, с Данон ("Данон").
[60] Варианты воплощения изобретения
[61] Ссылаясь на Фиг. 1 и 2, сразу же после разделения цельной крови на ее основные компоненты, то есть на эритроциты, плазму и лейкоцитную пленку, лейкоцитную пленку перемещают из мешка С в мешок 4, и инкубируют в течение 12 часов ±2 часа при комнатной температуре. За этим этапом следует перемещение дистиллированной воды из мешка 1 в мешок 4 (или мешок 5) с целью проведения процедуры гипоосмотического шока (в результате чего получают гемолизат). Эту процедуру проводят приблизительно в течение 45 секунд. Сразу после этого буферизованный раствор хлорида натрия, содержащийся в мешке 2, перемещают в мешок 4 (или мешок 5) с целью восстановления изотоничности к лейкоцитной пленке (лейкоцитам).
[62] Одновременно с инкубацией лейкоцитной пленки, описанной выше, буферизованный раствор хлорида кальция из мешка 3 перемещают в мешок В, содержащий порцию плазмы, с целью обеспечения коагуляции плазмы. Этому процессу предоставляют возможность проходить в течение 12 часов ±2 часа, плюс дополнительный короткий срок, в течение которого лейкоциты подвергают гипоосмотическому шоку, а затем восстановлению изотоничности.
[63] Сразу же после восстановления изотоничности, весь комплект мешков центрифугируют (обычно, приблизительно от 8 до 10 минут), с последующим отделением клеток из гемолизата. При этом клетки подвергают воздействию гемолизата на минимальный период времени, т.е. приблизительно на 10 минут. После центрифугирования супернатант гемолизата из мешка 1 (или мешка 5) выбрасывают, и добавляют свежую среду в мешок 1 (или мешок 5), с последующей инкубацией в течение приблизительно 1-2 часов при температуре 37°C. После инкубации клетки подвергают этапу единственного промывания.
[64] Сравнительная (существующий уровень техники) процедура.
[65] В соответствии с учением Данон, лейкоцитную пленку подвергают гипоосмотическому шоку сразу после переработки цельной крови и разделения ее на 3 основных компонента, то есть, на эритроциты, плазму и лейкоцитную пленку. Таким образом, в резком контрасте с настоящим изобретением, процедура Данон не влечет за собой инкубации лейкоцитной пленки после выделения основных компонентов крови и перед тем, как лейкоцитную пленку подвергают гипоосмотическому шоку. Гипоосмотический шок проводят в то время как лейкоцитная пленка содержится в мешке РВ3.
[66] В качестве отдельного этапа, и после гипоосмотического шока буферизованный раствор хлорида кальция перемещают из мешка РВ6 в мешок РВ2, который содержит плазму, с последующей глубокой заморозкой плазмы в мешке РВ2 в течение 10 минут, а затем помещают его на водяную баню при температуре 37°C в течение дополнительного 30-минутного инкубационного периода. В течение этого времени фракции лейкоцитной пленки, которая была подвергнута гипоосмотическому шоку, предоставляют возможность отстояться, тогда как лейкоциты оставляют под воздействием гемолизата.
[67] После завершения указанного процесса коагуляции, который в общей сложности длится приблизительно 40 минут, всю систему мешков центрифугируют, и гемолизат выбрасывают. Таким образом, клетки подвергают воздействию гемолизата в течение, по меньшей мере, приблизительно 55 минут (то есть, период времени, в который входят 40-минутный период отстаивания, который совпадает с коагуляцией плазмы, и дополнительные 15 минут центрифугирования). В противоположность этому, в предлагаемом способе изобретения, лейкоциты центрифугируют сразу же в течение приблизительно 5 минут и, таким образом, подвергают гемолизату гораздо меньшее время, т.е. менее 10 минут.
[68] После того, как супернатант из мешка РВ3 выбрасывают, в него добавляют свежую среду, после чего перемещают всю суспензию обратно в РВ7, который затем инкубируют на протяжении приблизительно 17 часов при температуре 37°C. После инкубации клетки промывают 3 раза. Напротив, в вариантах осуществления настоящего изобретения, инкубационный период проводят в коагулированной плазме в течение 1-2 часов, и промывают только один раз.
[69] До того, как проводят вышеупомянутую инкубацию, все предыдущие этапы осуществляют в мешках для переливания, которые представляют собой мешки, в которые осуществлялся сбор цельной крови. В противоположность этому, воплощения настоящего изобретения закрепляют использование инфузионных мешков, которые обычно используются для введения внутривенных растворов, таких как физиологический раствор.
[70] Процедура Данон была проведена 4 раза и полученные результаты сравнили с результатами, полученными в вариантах осуществления настоящего изобретения. Результаты, изложенные ниже, являются усредненными.
[71] РЕЗУЛЬТАТЫ.
[72] Общее количество белых кровяных телец (лейкоцитов), полученных из стандартной единицы крови, рассчитанное как конечная концентрация умноженная на конечный объем клеточной суспензии, определяют для каждой партии цельной крови. Усредненные результаты для 111 партий цельной крови, переработанной в соответствии со способом настоящего изобретения, и четыре партии, которые были переработаны в соответствии с процедурой, раскрытой в Данон, приведены в Таблице 4.
[73]
| Таблица 4 | ||
| Выход лейкоцитов на единицу крови (настоящее изобретение дало выход количества лейкоцитов ~ в 90 раз выше) | ||
| Количество партий | Лейкоциты, (×106) | |
| Средняя величина | Стандартное отклонение (СО) | |
| Настоящее изобретение (n=111) | 449 | 220 |
| Данон (n=4) | 5 | 4 |
Результаты показывают, что в результате способа настоящего изобретения из стандартной единицы крови (около 450 мл), получают общее число лейкоцитов приблизительно в 90 раз больше по сравнению с процедурой Данон. В общем, в результате настоящего способа получают выход лейкоцитов, по меньшей мере, приблизительно 100×106, 125×106, 150×106, 175×106, 200×106, 225×106, 250×106, 275×106, 300×106, 325×106, 350×106, 375×106, 400×106, 425×106, 450×106, 475×106, 500×106 или выше на стандартную единицу крови (в том числе все их поддиапазоны).
[74] Количество жизнеспособных клеток, содержащихся в общей популяции клеток, выраженное в процентах, измеряют способом изоляции трипановым синим. Клетки подсчитывают в гемоцитометре Newbauer после взвешивания в трипановом синем (в соотношении 1:1) для оценки количества клеток и процента жизнеспособности. Результаты представлены в Таблице 5.
[75]
| Таблица 5 | ||
| Процедура | Жизнеспособность (% живых клеток) | |
| Средняя величина | Стандартное отклонение (СО) | |
| Настоящее изобретение (n=111) | 98% | 0.02% |
| Данон (n=4) | 77% | 6% |
Данные Таблицы 5 демонстрируют, что в дополнение к более низкому выходу (как показано в Таблице 4), процедура Данон привела к клеточной суспензии со значительно более низкой жизнеспособностью. То есть, почти на четверть (то есть, 23%) препарат состоял из мертвых лейкоцитов (более чем 10-кратное превышение процентного содержания мертвых клеток). В отличие от них, почти все лейкоциты, обработанные в соответствии со способом изобретения, были признаны жизнеспособными. В целом, патентоспособная АЛК может содержать, по меньшей мере, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или больше жизнеспособных лейкоцитов на основе общего количества этих клеток лейкоцитов в АЛК (включая все их поддиапазоны).
[76] Экспрессию CD11b маркера активации на гранулоцитах измеряют с помощью проточной цитометрии, и представляют в виде процента от CD11b положительных клеток в популяции гранулоцитов (CD15-положительные клетки). Клетки, отобранные из конечного продукта, совместно окрашивают с анти-CD11b, конъюгированным с флуоресцеина изотиоцианатом (ФИТЦ), и анти-CD15, конъюгированным с фикоэритрином (ФЭ), и анализируют с помощью проточного цитометра «ФАКС Калибур» (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, Сан-Хосе, Калифорния, США). Анализируют CD11b экспрессию на гранулоцитах в клетках из 81 партии конечного продукта, произведенного в соответствии с предлагаемым способом, и из 3 партий конечного продукта, произведенного в соответствии с процедурой Данон.
[77]
| Таблица 6 | |
| Экспрессия CD11b на гранулоцитах |
| Процедура | % гранулоцитов, экспрессирующих маркер активации CD lib | |
| Средняя величина | СО (Стандартное отклонение) | |
| Настоящее изобретение (n=81) | 84,6 | 6,2 |
| Данон (n=3) | 46,9 | 9,2 |
Как показывают данные, содержащиеся в Таблице 6, предлагаемый способ изобретения обеспечивает почти в два раза выше выход активированных гранулоцитов в процентном соотношении по сравнению с процедурой Данон. В целом, АЛК настоящего изобретения могут содержать, по меньшей мере, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85% или выше, CD11b(+) гранулоцитов, по отношению к общей популяции гранулоцитов в АЛК (включая все их поддиапазоны).
[78] Результаты сравнительных экспериментов показывают, что настоящее раскрытие изобретения достигает, по меньшей мере, 3 неожиданных результатов по сравнению с процессом, раскрытым в работе Данон, а именно больший выход жизнеспособных лейкоцитов, более высокий процент жизнеспособных клеток, а также более высокий уровень активации гранулоцитов, как демонстрирует более высокая экспрессия маркера активации CD11b. Эти увеличения являются существенными и неожиданными.
[79] Список публикаций, цитируемых в заявке
[80] J.Li, et al., Pathophysiology of Acute Wound Healing. Clinical Dermatol. 2007 Jan-Feb; 25(1):9-18.
[81] G.Broughton 2nd, et al., Wound Healing: An Overview. Plast Reconstr Surg. 2006 Jun; 117(7 Suppl):le-S-32e-S.
[82] AK Tsirogianni, et al., Wound Healing: Immunological Aspects. Injury. 2006 Apr; 37 Suppl 1:S5-12. Epub 2006
[83] AJ Singer, et al., Cutaneous Wound Healing. New Eng. J. Med. 1999; 341(10):738-46.
[84] P. Martin, Wound Healing - Aiming For Perfect Skin Regeneration. Science 1997; 276(5309):75-81.
[85] AD Agaiby, et al., Immuno-Inflammatory Cell Dynamics During Cutaneous Wound Healing. J. Anat. 1999 Nov; 195 (Pt 4): 531-42.
[86] DWH Riches, Macrophage Involvement In Wound Repair, Remodeling and ®brosis. In The Molecular and Cellular Biology of Wound Repair, (1996) lnd edn (ed. Clark RAF), pp.95±141. New York, London: Plenum Press.
[87] D.Greiling, et al., Fibronectin Provides a Conduit for Fibroblast Transmigration from Collagenous Stroma into Fibrin Clot Provisional Matrix. J. Cell. Sci. 1997;110:861-70
[88] MG Tonnesen, et al., Angiogenesis In Wound Healing. J. Investig. Dermatol. Symp. Proc. 2000; 5(1):40-6.
[89] JP Kim, et al., Mechanisms of Human Keratinocyte Migration on Fibronectin: Unique Role of RGD Site and Integrins. J. Cell. Physiol. 1992; 151:443-50.
[90] JJ Tomasek et al., Myofibroblasts and Mechano-Regulation of Connective Tissue Remodelling. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. (2002) 3:349-363
[91] S Werner, et al., Regulation of Wound Healing by Growth Factors and Cytokines. Physiol Rev. 2003 Jul; 83(3):835-70.
[92] D.A.Keen, Review of Research Examining the Regulatory Role of Lymphocytes in Normal Wound Healing. J. Wound Care. 2008
[93] J Jameson, et al., A Role for Skin - T Cells in Wound Repair. Science 296: 747-749, 1992.
[94] WL Havran, et al., Epithelial Cells and Their Neighbors. III. Interactions Between Intraepithelial Lymphocytes and Neighboring Epithelial Cells. Am. J. Physiol. Gastrointest Liver Physiol. 2005 Oct; 289 (4):G627-30.
[95] J Parkin, et al., An Overview of the Immune System. Lancet. 2001; 357:1777-1789.
[96] A Moretta, et al., Human NK Cells: From HLA Class I - Specific Killer Ig-like Receptors to the Therapy of Acute Leukemias. Immunol. Rev. 2008 Aug; 224:58-69.
[97] BM Doshi, et al., Wound Healing From a Cellular Stress Response Perspective. Cell Stress Chaperones. 2008 Dec; 13 (4):393-9.
[98] GJ Moran, et al., Antimicrobial Prophylaxis for Wounds and Procedures in the Emergency Department. Infect. Dis. Clin. North Am. 2008.
[99] MA Fonder, et al., Treating the Chronic Wound: A Practical Approach to the Care of Nonhealing Wounds and Wound Care Dressings. J. Am. Acad. Dermatol. 2008 Feb; 58 (2): 185-206.
[100] JA Thackham, et al., The Use of Hyperbaric Oxygen Therapy to Treat Chronic Wounds: A Review. Wound Repair Regen. 2008, 1998 May-Jun;16(3):321-30.
[101] DR Berlowitz, et al., Are all pressure ulcers the result of deep tissue injury? A Review of the Literature. Ostomy Wound Manage. 2007 Oct; 53 (10):34-8.
[102] K.Girouard, et al., The symptom of pain with pressure ulcers: a review of the literature. Ostomy Wound Manage. 2008 May; 54(5):30-40, 32.
[103] Все публикации, цитируемые в спецификации, включая как патентные публикации, так и непатентные публикации, указывают на уровень квалификации специалистов в той области техники, к которой это изобретение принадлежит. Все эти публикации включены в данный документ в качестве ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация была специально и индивидуально указана включенной в качестве ссылки.
[104] Хотя настоящее изобретение было описано со ссылкой на конкретные варианты, следует понимать, что эти варианты являются лишь иллюстрацией принципов и применения настоящего изобретения. Поэтому следует понимать, что могут быть сделаны многочисленные изменения в иллюстративных воплощениях и что могут быть разработаны другие схемы без отступления от сущности и объема настоящего изобретения, как определено прилагаемой формулой изобретения.
Claims (16)
1. Способ изготовления активированной лейкоцитарной композиции, включающий:
a) инкубацию лейкоцитов человека при:
i) температуре от приблизительно от 12°C до 28°C в течение от 90 минут до 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 12-20 часов, или
ii) температуре до приблизительно 37°C в течение приблизительно 5-24 часов;
b) подвергание лейкоцитов со стадии а) гипоосмотическому шоку; и
c) добавление к лейкоцитам этапа b) физиологически приемлемого солевого раствора, содержащего неорганические ионы, органические осмолиты или их комбинации, в количестве, достаточном для восстановления изотоничности.
a) инкубацию лейкоцитов человека при:
i) температуре от приблизительно от 12°C до 28°C в течение от 90 минут до 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 12-20 часов, или
ii) температуре до приблизительно 37°C в течение приблизительно 5-24 часов;
b) подвергание лейкоцитов со стадии а) гипоосмотическому шоку; и
c) добавление к лейкоцитам этапа b) физиологически приемлемого солевого раствора, содержащего неорганические ионы, органические осмолиты или их комбинации, в количестве, достаточном для восстановления изотоничности.
2. Способ по п. 1, дополнительно включающий контактирование отдельного образца плазмы человека с коагулянтом с получением сыворотки, где лейкоциты и плазма могут быть получены от одного и того же донора или от разных доноров, и смешивания лейкоцитов этапа с) с сывороткой.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что лейкоциты получают от донора, имеющего группу крови 0, резус отрицательный, а плазму получают от донора, имеющего группу крови АВ, резус положительный.
4. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что гипоосмотический шок включает контактирование лейкоцитов с водой, где физиологически приемлемым солевым раствором является раствор натрия хлорида.
5. Способ по пп. 1-3, отличающийся тем, что дополнительно включает инкубацию лейкоцитов в сыворотке при температуре от 29.6°C до 44.4°C.
6. Активированная лейкоцитарная композиция для лечения ран, полученная способом по п. 1, содержащая:
a) от 40% до 90% гранулоцитов;
b) от 5% до 20% моноцитов; и
c) от 5% до 30% лимфоцитов.
a) от 40% до 90% гранулоцитов;
b) от 5% до 20% моноцитов; и
c) от 5% до 30% лимфоцитов.
7. Активированная лейкоцитарная композиция для лечения ран, полученная способом по п. 1, содержащая:
a) по меньшей мере 95% жизнеспособных лейкоцитов на основе общего количества этих клеток лейкоцитов в активированной лейкоцитарной композиции; и/или
b) по меньшей мере 75% CD11b(+) гранулоцитов по отношению к общей популяции гранулоцитов в активированной лейкоцитарной композиции.
a) по меньшей мере 95% жизнеспособных лейкоцитов на основе общего количества этих клеток лейкоцитов в активированной лейкоцитарной композиции; и/или
b) по меньшей мере 75% CD11b(+) гранулоцитов по отношению к общей популяции гранулоцитов в активированной лейкоцитарной композиции.
8. Композиция по любому из пп. 6 или 7, где способ получения композиции дополнительно включает контактирование отдельного образца плазмы человека с коагулянтом с получением сыворотки, где лейкоциты и плазма могут быть получены от одного и того же донора или от разных доноров, и смешивания лейкоцитов этапа c) с сывороткой.
9. Композиция по любому из пп. 6-7, где гранулоциты содержат:
i) от 52% до 78% нейтрофилов;
ii) от 1% до 9% эозинофилов; и
iii) от 1% до 2% базофилов.
i) от 52% до 78% нейтрофилов;
ii) от 1% до 9% эозинофилов; и
iii) от 1% до 2% базофилов.
10. Композиция по п. 6, где лимфоциты содержат:
i) от 7% до 25% В-клеток (CD 19+);
ii) от 20% до 30% клеток НК (CD3-/CD56+);
iii) от 40% до 60% Т-клеток (CD3+);
iv) от 0% до 30% клеток НКТ (CD3+/CD56+);
v) от 8% до 20% клеток Т-хелперов, (CD4+/CD3+); и
vi) от 20% до 30% клеток CD8+/CD3+.
i) от 7% до 25% В-клеток (CD 19+);
ii) от 20% до 30% клеток НК (CD3-/CD56+);
iii) от 40% до 60% Т-клеток (CD3+);
iv) от 0% до 30% клеток НКТ (CD3+/CD56+);
v) от 8% до 20% клеток Т-хелперов, (CD4+/CD3+); и
vi) от 20% до 30% клеток CD8+/CD3+.
11. Композиция по любому из пп. 6-7 для применения в качестве лекарственного средства.
12. Композиция по любому из пп. 6-7 для применения в качестве агента для заживления ран.
13. Применение активированной лейкоцитарной композиции по любому из пп. 6-12 в изготовлении лекарства для лечения ран.
14. Применение по п. 13, где рана является декубитальной язвой, пролежневой язвой, язвой нижней конечности диабетического пациента, глубокой раной грудины, послеоперационной раной, рефрактерной послеоперационной раной области туловища, раной большой подкожной вены после отбора большой подкожной вены, раной, полученной в результате травмы, анальной трещиной или венозной язвой.
15. Повязка для лечения ран, содержащая композицию по любому из пп. 6-10.
16. Физиологически инертный и/или рассасывающийся матрикс или каркас для лечения ран, содержащий композицию по любому из пп. 6-10.
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US20929809P | 2009-03-05 | 2009-03-05 | |
| US61/209,298 | 2009-03-05 | ||
| US21158709P | 2009-04-01 | 2009-04-01 | |
| US61/211,587 | 2009-04-01 | ||
| PCT/IB2010/000882 WO2010100570A2 (en) | 2009-03-05 | 2010-03-05 | Activated leukocyte composition |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2015102067/15A Division RU2015102067A (ru) | 2009-03-05 | 2010-03-05 | Активированная лейкоцитарная композиция |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2011139016A RU2011139016A (ru) | 2013-04-10 |
| RU2548741C2 true RU2548741C2 (ru) | 2015-04-20 |
Family
ID=42710060
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2011139016/15A RU2548741C2 (ru) | 2009-03-05 | 2010-03-05 | Активированная лейкоцитарная композиция |
| RU2015102067/15A RU2015102067A (ru) | 2009-03-05 | 2010-03-05 | Активированная лейкоцитарная композиция |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2015102067/15A RU2015102067A (ru) | 2009-03-05 | 2010-03-05 | Активированная лейкоцитарная композиция |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP2650001B1 (ru) |
| JP (2) | JP5713924B2 (ru) |
| KR (1) | KR101548783B1 (ru) |
| CN (1) | CN102438635B (ru) |
| AU (1) | AU2010220132B2 (ru) |
| BR (1) | BRPI1006759A2 (ru) |
| CA (2) | CA2867976A1 (ru) |
| DK (1) | DK2403509T3 (ru) |
| ES (1) | ES2428102T3 (ru) |
| IL (1) | IL214953A0 (ru) |
| MX (1) | MX2011009277A (ru) |
| PL (1) | PL2403509T3 (ru) |
| RU (2) | RU2548741C2 (ru) |
| WO (1) | WO2010100570A2 (ru) |
| ZA (1) | ZA201107269B (ru) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8574902B2 (en) | 2009-03-05 | 2013-11-05 | Macrocure Ltd. | Activated leukocyte composition and uses for wound healing |
| AU2011300430C1 (en) | 2010-09-09 | 2014-07-17 | Macrocure, Ltd. | Activated leukocyte conditioned supernatant and uses for wound healing |
| US20150030635A1 (en) | 2012-03-15 | 2015-01-29 | Macrocure, Ltd. | Activated Immunostimulatory Cell Composition and Uses Thereof |
| US20150071892A1 (en) | 2012-03-15 | 2015-03-12 | Macrocure, Ltd. | Activated Immunostimulatory Cell Composition for Therapy of Infection |
| EP2781224A1 (en) * | 2013-03-18 | 2014-09-24 | Khorionyx | Implantable preparations comrpsing globin insoluble at physiological pH and serum for regeneration of tissues and treatment of wounds. |
| CN107427535A (zh) | 2015-02-16 | 2017-12-01 | 纳雅康医疗有限公司 | 经修饰的血凝块 |
| GB201618106D0 (en) | 2016-10-26 | 2016-12-07 | Lift Biosciences Ltd | Cancer-killing cells |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2143685C1 (ru) * | 1998-05-19 | 1999-12-27 | Коган Александр Харитонович | Способ дифференциального подсчета гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов |
| EP1731175A1 (en) * | 1998-11-12 | 2006-12-13 | Crosslink-D, Incorporated | Hemostatic polymer useful for rapid blood coagulation and hemostatis |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60120821A (ja) * | 1983-12-05 | 1985-06-28 | Asahi Chem Ind Co Ltd | 悪性腫瘍治療用白血球刺激材および刺激方法 |
| US4751001A (en) * | 1984-09-24 | 1988-06-14 | Becton Dickinson And Company | Blood partitioning apparatus |
| JPH02167071A (ja) * | 1988-12-19 | 1990-06-27 | Terumo Corp | 非ヒト動物由来白血球系細胞の分離材、分離器および分離方法 |
| JPH07102151B2 (ja) * | 1994-06-03 | 1995-11-08 | 中外製薬株式会社 | 新規なポリペプチドの製造法 |
| US6146890A (en) * | 1994-07-03 | 2000-11-14 | Danon; David | Method and system for cultivating macrophages |
| IL110195A (en) * | 1994-07-03 | 2003-10-31 | David Danon | Method and system for cultivating macrophages |
| KR19980703072A (ko) * | 1995-03-17 | 1998-09-05 | 스티븐슨 린다 에스 | 종양의 치료방법 |
| JPH10259134A (ja) * | 1997-01-16 | 1998-09-29 | Sekisui Chem Co Ltd | 創傷治癒促進剤 |
| JP2005519585A (ja) * | 2001-11-21 | 2005-07-07 | イエダ リサーチ アンド デベロップメント カンパニー リミテッド | ヒト単核食作用性白血球の製造法 |
| JP4108393B2 (ja) * | 2002-07-15 | 2008-06-25 | テルモ株式会社 | 細胞増殖剤の製造方法 |
| JP4245324B2 (ja) * | 2002-10-09 | 2009-03-25 | 旭化成クラレメディカル株式会社 | 単球の分離回収方法 |
| EP2198873A1 (en) * | 2008-12-18 | 2010-06-23 | Aposcience AG | Pharmaceutical preparation comprising supernatant of blood mononuclear cell culture |
| EP2201954A1 (en) * | 2008-12-18 | 2010-06-30 | Aposcience AG | Pharmaceutical preparation |
-
2010
- 2010-03-05 CN CN201080020134.XA patent/CN102438635B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2010-03-05 CA CA2867976A patent/CA2867976A1/en not_active Abandoned
- 2010-03-05 AU AU2010220132A patent/AU2010220132B2/en not_active Ceased
- 2010-03-05 RU RU2011139016/15A patent/RU2548741C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2010-03-05 JP JP2011552537A patent/JP5713924B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2010-03-05 BR BRPI1006759A patent/BRPI1006759A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2010-03-05 EP EP13176068.8A patent/EP2650001B1/en not_active Not-in-force
- 2010-03-05 KR KR1020117023251A patent/KR101548783B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 2010-03-05 RU RU2015102067/15A patent/RU2015102067A/ru not_active Application Discontinuation
- 2010-03-05 DK DK10723285.2T patent/DK2403509T3/da active
- 2010-03-05 ES ES10723285T patent/ES2428102T3/es active Active
- 2010-03-05 CA CA2754190A patent/CA2754190A1/en not_active Abandoned
- 2010-03-05 PL PL10723285T patent/PL2403509T3/pl unknown
- 2010-03-05 WO PCT/IB2010/000882 patent/WO2010100570A2/en not_active Ceased
- 2010-03-05 EP EP10723285.2A patent/EP2403509B1/en not_active Not-in-force
- 2010-03-05 MX MX2011009277A patent/MX2011009277A/es active IP Right Grant
-
2011
- 2011-09-04 IL IL214953A patent/IL214953A0/en unknown
- 2011-10-05 ZA ZA2011/07269A patent/ZA201107269B/en unknown
-
2015
- 2015-03-10 JP JP2015046833A patent/JP2015129180A/ja active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2143685C1 (ru) * | 1998-05-19 | 1999-12-27 | Коган Александр Харитонович | Способ дифференциального подсчета гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов |
| EP1731175A1 (en) * | 1998-11-12 | 2006-12-13 | Crosslink-D, Incorporated | Hemostatic polymer useful for rapid blood coagulation and hemostatis |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| FRENKEL O., et al., Activation of human monocytes/macrophages by hypo-osmotic shock. Clin Exp Immunol. 2001 Apr;124(1):103-9. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP2403509B1 (en) | 2013-08-21 |
| CA2867976A1 (en) | 2010-09-10 |
| DK2403509T3 (da) | 2013-09-16 |
| CN102438635B (zh) | 2014-09-17 |
| WO2010100570A3 (en) | 2010-12-16 |
| EP2650001B1 (en) | 2016-09-07 |
| MX2011009277A (es) | 2011-12-16 |
| CA2754190A1 (en) | 2010-09-10 |
| ZA201107269B (en) | 2014-03-26 |
| AU2010220132A1 (en) | 2011-10-13 |
| CN102438635A (zh) | 2012-05-02 |
| AU2010220132B2 (en) | 2013-10-10 |
| RU2015102067A (ru) | 2015-06-20 |
| WO2010100570A2 (en) | 2010-09-10 |
| EP2650001A1 (en) | 2013-10-16 |
| JP2012519681A (ja) | 2012-08-30 |
| ES2428102T3 (es) | 2013-11-05 |
| KR20120002530A (ko) | 2012-01-05 |
| IL214953A0 (en) | 2011-11-30 |
| JP5713924B2 (ja) | 2015-05-07 |
| JP2015129180A (ja) | 2015-07-16 |
| EP2403509A2 (en) | 2012-01-11 |
| BRPI1006759A2 (pt) | 2016-03-15 |
| KR101548783B1 (ko) | 2015-08-31 |
| PL2403509T3 (pl) | 2013-11-29 |
| RU2011139016A (ru) | 2013-04-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6892485B2 (ja) | トロンビン血清の調製、その利用およびその調製機器 | |
| RU2548741C2 (ru) | Активированная лейкоцитарная композиция | |
| US9439950B2 (en) | Activated leukocyte conditioned supernatant and uses for wound healing | |
| US9132154B2 (en) | Activated leukocyte composition and uses for wound healing | |
| Mustafa et al. | Application of platelet-rich plasma (PRP) in corneal lesions-a review. | |
| WO2016075542A1 (en) | Methods for extended storage of activated leukocyte compositions |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HE9A | Changing address for correspondence with an applicant | ||
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20170306 |