RU2431639C1 - Method of producing conjugate of fragment of human alpha-fetoprotein with ciprofloxacin - Google Patents
Method of producing conjugate of fragment of human alpha-fetoprotein with ciprofloxacin Download PDFInfo
- Publication number
- RU2431639C1 RU2431639C1 RU2010103748/10A RU2010103748A RU2431639C1 RU 2431639 C1 RU2431639 C1 RU 2431639C1 RU 2010103748/10 A RU2010103748/10 A RU 2010103748/10A RU 2010103748 A RU2010103748 A RU 2010103748A RU 2431639 C1 RU2431639 C1 RU 2431639C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- ciprofloxacin
- fetoprotein
- fragment
- human alpha
- solution
- Prior art date
Links
- MYSWGUAQZAJSOK-UHFFFAOYSA-N ciprofloxacin Chemical compound C12=CC(N3CCNCC3)=C(F)C=C2C(=O)C(C(=O)O)=CN1C1CC1 MYSWGUAQZAJSOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 48
- 229960003405 ciprofloxacin Drugs 0.000 title claims abstract description 24
- 101000848653 Homo sapiens Tripartite motif-containing protein 26 Proteins 0.000 title claims abstract description 20
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims abstract description 20
- 102000046101 human AFP Human genes 0.000 title claims abstract description 20
- 101000827785 Homo sapiens Alpha-fetoprotein Proteins 0.000 title claims abstract description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 12
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 claims abstract description 11
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims abstract description 11
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 claims abstract description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 16
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 10
- 102000013529 alpha-Fetoproteins Human genes 0.000 description 9
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 description 9
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 6
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 4
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 3
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 3
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 3
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 3
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 3
- 125000002768 hydroxyalkyl group Chemical group 0.000 description 3
- 208000013371 ovarian adenocarcinoma Diseases 0.000 description 3
- 201000006588 ovary adenocarcinoma Diseases 0.000 description 3
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 3
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 208000036832 Adenocarcinoma of ovary Diseases 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 2
- 206010061328 Ovarian epithelial cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide Chemical compound [Br-].S1C(C)=C(C)N=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=CC=C1 AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 7-Cyan-hept-2t-en-4,6-diinsaeure Natural products C1=2C(O)=C3C(=O)C=4C(OC)=CC=CC=4C(=O)C3=C(O)C=2CC(O)(C(C)=O)CC1OC1CC(N)C(O)C(C)O1 STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N Cytarabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N 0.000 description 1
- 108010054814 DNA Gyrase Proteins 0.000 description 1
- 108010041052 DNA Topoisomerase IV Proteins 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- WEAHRLBPCANXCN-UHFFFAOYSA-N Daunomycin Natural products CCC1(O)CC(OC2CC(N)C(O)C(C)O2)c3cc4C(=O)c5c(OC)cccc5C(=O)c4c(O)c3C1 WEAHRLBPCANXCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- ZDZOTLJHXYCWBA-VCVYQWHSSA-N N-debenzoyl-N-(tert-butoxycarbonyl)-10-deacetyltaxol Chemical compound O([C@H]1[C@H]2[C@@](C([C@H](O)C3=C(C)[C@@H](OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)OC(C)(C)C)C=4C=CC=CC=4)C[C@]1(O)C3(C)C)=O)(C)[C@@H](O)C[C@H]1OC[C@]12OC(=O)C)C(=O)C1=CC=CC=C1 ZDZOTLJHXYCWBA-VCVYQWHSSA-N 0.000 description 1
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N Vinblastine Natural products O=C(O[C@H]1[C@](O)(C(=O)OC)[C@@H]2N(C)c3c(cc(c(OC)c3)[C@]3(C(=O)OC)c4[nH]c5c(c4CCN4C[C@](O)(CC)C[C@H](C3)C4)cccc5)[C@@]32[C@H]2[C@@]1(CC)C=CCN2CC3)C JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 229940124350 antibacterial drug Drugs 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 229930188550 carminomycin Natural products 0.000 description 1
- XREUEWVEMYWFFA-CSKJXFQVSA-N carminomycin Chemical compound C1[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1C2=C(O)C(C(=O)C3=C(O)C=CC=C3C3=O)=C3C(O)=C2C[C@@](O)(C(C)=O)C1 XREUEWVEMYWFFA-CSKJXFQVSA-N 0.000 description 1
- XREUEWVEMYWFFA-UHFFFAOYSA-N carminomycin I Natural products C1C(N)C(O)C(C)OC1OC1C2=C(O)C(C(=O)C3=C(O)C=CC=C3C3=O)=C3C(O)=C2CC(O)(C(C)=O)C1 XREUEWVEMYWFFA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950001725 carubicin Drugs 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000006364 cellular survival Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000007398 colorimetric assay Methods 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 229960000684 cytarabine Drugs 0.000 description 1
- STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N daunorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(C)=O)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 229960003668 docetaxel Drugs 0.000 description 1
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 229940124307 fluoroquinolone Drugs 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- SGDBTWWWUNNDEQ-LBPRGKRZSA-N melphalan Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(N(CCCl)CCCl)C=C1 SGDBTWWWUNNDEQ-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 229960001924 melphalan Drugs 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 239000013081 microcrystal Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 1
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960003048 vinblastine Drugs 0.000 description 1
- JXLYSJRDGCGARV-XQKSVPLYSA-N vincaleukoblastine Chemical compound C([C@@H](C[C@]1(C(=O)OC)C=2C(=CC3=C([C@]45[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]6(CC)C=CCN([C@H]56)CC4)(O)C(=O)OC)N3C)C=2)OC)C[C@@](C2)(O)CC)N2CCC2=C1NC1=CC=CC=C21 JXLYSJRDGCGARV-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 1
- 229960004528 vincristine Drugs 0.000 description 1
- OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N vincristine Chemical compound C([N@]1C[C@@H](C[C@]2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C([C@]56[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]7(CC)C=CCN([C@H]67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)C[C@@](C1)(O)CC)CC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 1
- OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N vincristine Natural products C1C(CC)(O)CC(CC2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C(C56C(C(C(OC(C)=O)C7(CC)C=CCN(C67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)CN1CCC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине и биотехнологии и может быть использовано для получения конъюгатов целевого белка с ципрофлоксацином, специфически проникающих в клетки, несущие рецептор альфа-фетопротеина (АФП).The invention relates to medicine and biotechnology and can be used to obtain conjugates of the target protein with ciprofloxacin, specifically penetrating into cells carrying the alpha-fetoprotein receptor (AFP).
Одним из основных направлений современной фармакологии является направленный транспорт лекарственных препаратов к специфическим локусам организма человека. Преимуществом данного подхода является возможность снижения эффективной дозы лекарственного препарата, так как вместо пассивной диффузии лекарственный препарат направленно доставляется к клеткам-мишеням. Принципиальным для данного подхода является создание химически или биологически сконструированных макромолекул, состоящих из векторной части и неспецифической части, являющейся лекарственным препаратом.One of the main directions of modern pharmacology is the directed transport of drugs to specific loci of the human body. The advantage of this approach is the ability to reduce the effective dose of the drug, because instead of passive diffusion, the drug is directed to the target cells. Fundamental for this approach is the creation of chemically or biologically engineered macromolecules consisting of a vector part and a non-specific part, which is a drug.
Известны технические решения, в которых описаны конъюгаты, например конъюгат пептидного препарата и цитотоксического агента, способный целенаправленно проникать в опухолевую клетку, представляющий собой препарат, ковалентно связанный с цитотоксическим агентом в молярном соотношении от 1:1 до 1:10, при этом в качестве цитотоксического агента содержит вещество, выбранное из группы паклитаксел, доцетаксел, доксорубицин, дауномицин, карминомицин, винкристин, винбластин, мелфалан, метотрексат, цитарабин [RU 2285537 С1, А61К 38/12, 20.10.2006].Technical solutions are known in which conjugates are described, for example, a conjugate of a peptide preparation and a cytotoxic agent capable of targeted penetration into a tumor cell, which is a drug covalently bound to a cytotoxic agent in a molar ratio of 1: 1 to 1:10, while being a cytotoxic the agent contains a substance selected from the group of paclitaxel, docetaxel, doxorubicin, daunomycin, carminomycin, vincristine, vinblastine, melphalan, methotrexate, cytarabine [RU 2285537 C1, A61K 38/12, 20.10.2006].
Недостатком этого решения является относительно узкая область использования, поскольку при его реализации не реализуется возможность получения конъюгатов целевого белка с ципрофлоксацином, специфически проникающих в клетки, несущие рецептор альфа-фетопротеина.The disadvantage of this solution is the relatively narrow field of use, since its implementation does not realize the possibility of obtaining conjugates of the target protein with ciprofloxacin, specifically penetrating into cells carrying the alpha-fetoprotein receptor.
Наиболее близким по своей сущности к предлагаемому является способ получения конъюгата, основанный на том, что осуществляют реакцию связывания между концевой альдегидной группой или карбоксильной группой, образующейся за счет селективного окисления концевой альдегидной группы, или активированной карбоксильной группой, полученной превращением указанной карбоксильной группы молекулы гидроксиалкилкрахмала и функциональной группой низкомолекулярного вещества, выбранной из группы, состоящей из аминогруппы, карбоксильной группы, тиоловой группы и гидроксильной группы, которая является реакционноспособной по отношению к этой альдегидной группе или карбоксильной группе или происходящей от нее активированной карбоксильной группе молекулы гидроксиалкилкрахмала, и при этом связь, образующуюся непосредственно при реакции связывания, в случае необходимости модифицируют за счет дальнейшей реакции [RU 2327702 С1, С08В 31/12, 27.06.2008].The closest in essence to the proposed one is a method for producing a conjugate based on the fact that a binding reaction is carried out between the terminal aldehyde group or the carboxyl group formed by selective oxidation of the terminal aldehyde group or activated carboxyl group obtained by converting the indicated carboxyl group of the hydroxyalkyl starch molecule and a functional group of a low molecular weight substance selected from the group consisting of an amino group, a carboxyl group, a thiol a new group and a hydroxyl group which is reactive with respect to this aldehyde group or carboxyl group or an activated carboxyl group of a hydroxyalkyl starch molecule derived from it, and wherein the bond formed directly during the binding reaction is modified if necessary due to further reaction [RU 2327702 C1, C08B 31/12, 06/27/2008].
Недостатком известного способа является относительно узкая область применения, поскольку способ может быть использован в основном для конъюгата гидроксиалкилкрахмала и низкомолекулярного вещества и не может быть использован для получения востребованного конъюгата фрагмента альфа-фетопротеина (АФП) человека с ципрофлоксанином.The disadvantage of this method is the relatively narrow scope, since the method can be used mainly for the conjugate of hydroxyalkyl starch and low molecular weight substances and cannot be used to obtain the desired conjugate of a fragment of human alpha-fetoprotein (AFP) with ciprofloxanin.
Требуемый результат заключается в расширении области применения за счет обеспечения получения конъюгата фрагмента альфа-фетопротеина (АФП) человека с ципрофлоксанином, относящегося к конъюгату целевого белка с ципрофлоксацином, специфически проникающим в клетки, несущие рецептор альфа-фетопротеина.The desired result is to expand the scope by providing a conjugate of a fragment of alpha-fetoprotein (AFP) of a person with ciprofloxanin related to the conjugate of the target protein with ciprofloxacin, specifically penetrating into cells carrying the alpha-fetoprotein receptor.
Требуемый результат достигается тем, что в способе, основанном на проведении реакции конъюгирования, полученную в результате реакции конъюгирования реакционную смесь вводят в раствор фрагмента альфа-фетопротеина (АФП) человека, а полученные при этом побочные продукты удаляют диализом, при этом реакцию конъюгирования проводят путем активации карбоксильной группы ципрофлоксацина с использованием карбодиимида.The desired result is achieved by the fact that in the method based on the conjugation reaction, the reaction mixture obtained as a result of the conjugation reaction is introduced into the solution of the human alpha-fetoprotein (AFP) fragment, and the by-products obtained from this are removed by dialysis, and the conjugation reaction is carried out by activation the carboxyl group of ciprofloxacin using carbodiimide.
Кроме того, требуемый технический результат достигается тем, что реакцию конъюгирования проводят путем смешивания в течение 5 мин при комнатной температуре ципрофлоксацина с карбодиимидом в соотношении карбодиимид: ципрофлоксацин 1:1.In addition, the desired technical result is achieved by the fact that the conjugation reaction is carried out by mixing for 5 minutes at room temperature ciprofloxacin with carbodiimide in the ratio carbodiimide: ciprofloxacin 1: 1.
Кроме того, требуемый технический результат достигается тем, что введение реакционной смеси в раствор фрагмента АФП человека осуществляют путем добавления к раствору фрагмента АФП человека реакционной смеси с последующей инкубацией полученного раствора в течение 20-30 мин при перемешивании и контроле показаний рН.In addition, the required technical result is achieved by the fact that the introduction of the reaction mixture into the solution of the human AFP fragment is carried out by adding the reaction mixture to the solution of the human AFP fragment, followed by incubation of the resulting solution for 20-30 minutes while stirring and monitoring the pH readings.
Кроме того, требуемый технический результат достигается тем, что побочные продукты, полученные в результате введения реакционной смеси в раствор фрагмента АФП человека, удаляют диализом против фосфатно-солевого буфера, рН 8.0.In addition, the desired technical result is achieved in that the by-products obtained by introducing the reaction mixture into the solution of the human AFP fragment are removed by dialysis against phosphate-buffered saline, pH 8.0.
На чертеже представлены зависимости, характеризующие эффективность цитотоксического действия конъюгата ципрофлоксацина с фрагментом АФП человека на клетки аденокарциномы яичника.The drawing shows the dependencies characterizing the effectiveness of the cytotoxic effect of the conjugate of ciprofloxacin with a fragment of human AFP on ovarian adenocarcinoma cells.
Осуществляется предложенный способ получения конъюгата фрагмента АФП человека с ципрофлоксацином следующим образом.The proposed method for producing a conjugate of a fragment of a human AFP with ciprofloxacin is carried out as follows.
Ципрофлоксацин является антибактериальным препаратом широкого спектра действия. Он относится к фторхинолонам второго поколения и разрешен для клинического применения с начала 80-х годов. Механизм его действия включает ингибирование двух жизненно важных ферментов - ДНК-гиразы и топоизомеразы IV, что приводит к нарушению синтеза ДНК.Ciprofloxacin is a broad-spectrum antibacterial drug. It belongs to the second generation fluoroquinolones and has been approved for clinical use since the early 80s. The mechanism of its action includes the inhibition of two vital enzymes - DNA gyrase and topoisomerase IV, which leads to disruption of DNA synthesis.
Пример получения конъюгата фрагмента АФП человека с ципрофлоксацином.An example of obtaining a conjugate of a fragment of human AFP with ciprofloxacin.
Активацию карбоксильной группы ципрофлоксацина проводили с использованием карбодиимида в соотношении карбодиимид:ципрофлоксацин 1:1 непосредственно перед реакцией конъюгирования в течение 5 мин при комнатной температуре. Затем реакционную смесь добавляли к раствору белка и инкубировали в течение 20-30 мин при перемешивании, контролируя показания рН. Побочные продукты реакции удаляли диализом против фосфатно-солевого буфера, рН 8.0.The activation of the carboxyl group of ciprofloxacin was carried out using carbodiimide in the ratio carbodiimide: ciprofloxacin 1: 1 immediately before the conjugation reaction for 5 min at room temperature. Then the reaction mixture was added to the protein solution and incubated for 20-30 minutes with stirring, monitoring the pH. The reaction by-products were removed by dialysis against phosphate-buffered saline, pH 8.0.
Анализ количества молекул ципрофлоксацина в молекуле белка проводили, измеряя прирост интенсивности поглощения при 280 нм. Ципрофлоксацин имеет максимум поглощения при данной длине волны.The analysis of the number of ciprofloxacin molecules in the protein molecule was carried out by measuring the increase in absorbance at 280 nm. Ciprofloxacin has a maximum absorption at a given wavelength.
Определение цитотоксической активности конъюгата фрагмента АФП человека с ципрофлоксацином проводили с использованием клеток аденокарциномы яичника человека линии SKOV3. В качестве контроля были использованы лимфоциты периферической крови.The cytotoxic activity of the conjugate of a human AFP fragment with ciprofloxacin was determined using SKOV3 human ovary adenocarcinoma cells. Peripheral blood lymphocytes were used as a control.
Клетки за 1 сутки до эксперимента рассевали в 96-луночные планшеты для микротитрования (Corning, США) в среде для культивирования в плотности 5000-7000 клеток в лунку. Раствор ципрофлоксацина и конъюгата стерилизовали фильтрованием через фильтры с диаметром пор 0.22 мкм (Millipore Corporation, США) и добавляли к клеткам. Инкубировали клетки в стандартных условиях 72 ч, после чего определяли их выживаемость.Cells 1 day before the experiment were scattered in 96-well microtiter plates (Corning, USA) in a culture medium at a density of 5000-7000 cells per well. A solution of ciprofloxacin and conjugate was sterilized by filtration through filters with a pore diameter of 0.22 μm (Millipore Corporation, USA) and added to the cells. Cells were incubated under standard conditions for 72 h, after which their survival was determined.
Для количественной оценки выживаемости клеток при инкубации в среде, содержащей цитотоксический агент, использовали МТТ-тест согласно методике [Mosmann Т. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxity assays. // J.Immunol. Meth. - 1983. - №65. - P.55-63]. Выживаемость клеток в контрольной и в обработанной препаратами группах определяли через 72 ч инкубации. Для этого за 2-4 ч до окончания инкубации в каждую лунку добавляли 50 мкл раствора МТТ (метилтиазолилдифенилтетразолий бромид; Sigma, США) в среде для культивирования клеток до конечной концентрации 200 мкг/мл. По прошествии времени инкубации среду над клетками полностью удаляли, и образовавшиеся микрокристаллы формазана растворяли, добавляя в каждую лунку по 0,1 мл диметилсульфоксида. Через 5 мин измеряли поглощение (λ=540 нм) в каждой лунке с помощью многоканального спектрофотометра (Bio-Rad, США). Рассчитывали степень влияния на пролиферацию клеток цитотоксических препаратов в исследованных концентрациях, принимая за 100% поглощение в соответствующих контрольных лунках. ЦТА препарата выражали в единицах IC50 (молярная концентрация препарата, вызывающая гибель 50% клеток).To quantify cell survival during incubation in a medium containing a cytotoxic agent, the MTT test was used according to the method of [Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxity assays. // J. Immmunol. Meth. - 1983. - No. 65. - P.55-63]. Cell survival in the control and drug-treated groups was determined after 72 h of incubation. To this end, 50 μl of a solution of MTT (methylthiazolyldiphenyltetrazolium bromide; Sigma, USA) in a cell culture medium to a final concentration of 200 μg / ml was added to each well 2–4 hours before the end of incubation. After the incubation time, the medium above the cells was completely removed, and the formed formazan microcrystals were dissolved by adding 0.1 ml of dimethyl sulfoxide to each well. After 5 min, the absorbance (λ = 540 nm) in each well was measured using a multichannel spectrophotometer (Bio-Rad, USA). The degree of influence on cell proliferation of cytotoxic drugs in the studied concentrations was calculated, taking as 100% absorption in the corresponding control wells. The CTA of the drug was expressed in units of IC 50 (molar concentration of the drug causing the death of 50% of the cells).
Статистическую достоверность полученных данных определяли, используя t-критерий Стьюдента с помощью компьютерной программы Origin™ 6.0 (Microcal Software Inc., США). Как статистически значимый рассматривали уровень p<0,05.The statistical reliability of the obtained data was determined using Student's t-test using the Origin ™ 6.0 computer program (Microcal Software Inc., USA). The level of p <0.05 was considered statistically significant.
Результаты эксперимента показали, что цитотоксическое действие конъюгата ципрофлоксацина с фрагментом АФП человека на клетки аденокарциномы яичника человека линии SKOV3 на несколько порядков превышает цитотоксическое действие несвязанного с белком ципрофлоксацина (см. чертеж).The experimental results showed that the cytotoxic effect of the ciprofloxacin conjugate with a fragment of human AFP on SKOV3 cells of a human ovarian adenocarcinoma is several orders of magnitude higher than the cytotoxic effect of ciprofloxacin unbound with the protein (see drawing).
Таким образом, благодаря модификации известных способов достигается требуемый результат, заключающийся в расширении области применения, поскольку обеспечивается получение конъюгата фрагмента АФП человека с ципрофлоксанином, специфически проникающих в клетки, несущие рецептор альфа-фетопротеина.Thus, due to the modification of known methods, the desired result is achieved, which is to expand the scope, since it provides the conjugate of a fragment of a human AFP with ciprofloxanin, specifically penetrating into cells carrying the alpha-fetoprotein receptor.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2010103748/10A RU2431639C1 (en) | 2010-02-05 | 2010-02-05 | Method of producing conjugate of fragment of human alpha-fetoprotein with ciprofloxacin |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2010103748/10A RU2431639C1 (en) | 2010-02-05 | 2010-02-05 | Method of producing conjugate of fragment of human alpha-fetoprotein with ciprofloxacin |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2010103748A RU2010103748A (en) | 2011-08-10 |
| RU2431639C1 true RU2431639C1 (en) | 2011-10-20 |
Family
ID=44754238
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2010103748/10A RU2431639C1 (en) | 2010-02-05 | 2010-02-05 | Method of producing conjugate of fragment of human alpha-fetoprotein with ciprofloxacin |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2431639C1 (en) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2139083C1 (en) * | 1998-01-22 | 1999-10-10 | Сотниченко Александр Иванович | Method of preparing preparation for directed delivery of antitumor drug in cancer cell |
| RU2285537C1 (en) * | 2005-04-05 | 2006-10-20 | Автономная некоммерческая организация "Институт молекулярной диагностики (АНО "ИнМоДи") | Antitumor peptide preparation based on alpha-fetoprotein fragment, its conjugate, pharmaceutical composition and method for treatment of hormone-dependent tumors |
| RU2317102C1 (en) * | 2006-05-31 | 2008-02-20 | Автономная некоммерческая организация "Институт молекулярной диагностики" (АНО "ИнМоДи") | Peptide representing analog of alpha-fetoprotein fragment, conjugate of peptide with doxorubicin and pharmaceutical composition based on thereof for treatment of oncology disease |
| RU2327702C2 (en) * | 2002-03-06 | 2008-06-27 | Фрезениус Каби Дойчланд Гмбх | A conjugate of hydroxyalkyl starch and low-molecular substance and method of obtaining it |
-
2010
- 2010-02-05 RU RU2010103748/10A patent/RU2431639C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2139083C1 (en) * | 1998-01-22 | 1999-10-10 | Сотниченко Александр Иванович | Method of preparing preparation for directed delivery of antitumor drug in cancer cell |
| RU2327702C2 (en) * | 2002-03-06 | 2008-06-27 | Фрезениус Каби Дойчланд Гмбх | A conjugate of hydroxyalkyl starch and low-molecular substance and method of obtaining it |
| RU2285537C1 (en) * | 2005-04-05 | 2006-10-20 | Автономная некоммерческая организация "Институт молекулярной диагностики (АНО "ИнМоДи") | Antitumor peptide preparation based on alpha-fetoprotein fragment, its conjugate, pharmaceutical composition and method for treatment of hormone-dependent tumors |
| RU2317102C1 (en) * | 2006-05-31 | 2008-02-20 | Автономная некоммерческая организация "Институт молекулярной диагностики" (АНО "ИнМоДи") | Peptide representing analog of alpha-fetoprotein fragment, conjugate of peptide with doxorubicin and pharmaceutical composition based on thereof for treatment of oncology disease |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2010103748A (en) | 2011-08-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7095035B2 (en) | Peptide compounds and peptide conjugates for the treatment of cancer with receptor-mediated chemotherapy | |
| Sardi et al. | Pharmacological modulation of blood-brain barrier increases permeability of doxorubicin into the rat brain | |
| Wang et al. | Persistent degradation of HER2 protein by hybrid nanoPROTAC for programmed cell death | |
| Dong et al. | Multifunctionalized gold sub‐nanometer particles for sensitizing radiotherapy against glioblastoma | |
| Styslinger et al. | Site-selective glycosylation of hemoglobin with variable molecular weight oligosaccharides: potential alternative to PEGylation | |
| Madariaga et al. | Detection of tumor-associated glycopeptides by lectins: the peptide context modulates carbohydrate recognition | |
| Pragti et al. | Chitosan–biotin-conjugated pH-responsive Ru (II) glucose nanogel: A dual pathway of targeting cancer cells and self-drug delivery | |
| Tian et al. | Novel near-infrared fluorescence probe with large Stokes shift for monitoring CCl4-induced toxic hepatitis | |
| Wang et al. | A light-controlled switch after dual targeting of proliferating tumor cells via the membrane receptor EGFR and the nuclear protein Ki-67 | |
| Gaál et al. | Low toxicity and high antitumour activity of daunomycin by conjugation to an immunopotential amphoteric branched polypeptide | |
| Vasconcelos et al. | Host-guest interaction of ZnBDC-MOF+ doxorubicin: A theoretical and experimental study | |
| CN106334194B (en) | Conjugate and its preparation method and application | |
| Han et al. | Design, synthesis of novel platinum (II) glycoconjugates, and evaluation of their antitumor effects | |
| Fan et al. | Carbon nanoparticles induce DNA repair and PARP inhibitor resistance associated with nanozyme activity in cancer cells | |
| Khamari et al. | Thermal reversibility and structural stability in lysozyme induced by epirubicin hydrochloride | |
| Huang et al. | A hydrogen sulfide-responsive prodrug for monitoring real-time release and improving therapeutic effects of anticancer drug SN-38 | |
| Butowska et al. | The product of matrix metalloproteinase cleavage of doxorubicin conjugate for anticancer drug delivery: Calorimetric, spectroscopic, and molecular dynamics studies on peptide–doxorubicin binding to DNA | |
| KR101923919B1 (en) | Aptamer-hydrophilic polymer-photosensitizer conjugates and preparation method thereof | |
| Xu et al. | On‐Membrane Supramolecular Assemblies Serving as Bioorthogonal Gating for Melphalan | |
| RU2431639C1 (en) | Method of producing conjugate of fragment of human alpha-fetoprotein with ciprofloxacin | |
| Zaber et al. | N-methylmorpholine incorporation into the structure of biphenyl leads to the bioactive inhibitor of PD-1/PD-L1 interaction | |
| Ahmed et al. | Spectroscopic investigation on the interaction of ruthenium complexes with tumor specific lectin, jacalin | |
| EP3209694A1 (en) | Therapeutic agents and use thereof | |
| Cao et al. | Peptide-drug conjugates with linker-dependent payload release coordinate dual antitumor efficacy: Intrinsic RGDS-mediated metastasis suppression synergizes with camptothecin cytotoxicity | |
| Kanoujia et al. | Recent advances in BCRP‐induced breast cancer resistance treatment with marine‐based natural products |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20200206 |