RU2428189C2

RU2428189C2 - Применение производных холест-4-ен-3-она для получения цитопротекторного лекарственного средства

Info

Publication number: RU2428189C2
Application number: RU2008143248/15A
Authority: RU
Inventors: Ребекка ПРЮСС (FR); Ребекка ПРЮСС; Брюно БЮИССОН (FR); Брюно БЮИССОН; Тьерри БОРДЕ (FR); Тьерри БОРДЕ
Original assignee: Трофо
Priority date: 2006-03-31
Filing date: 2007-03-28
Publication date: 2011-09-10
Also published as: CN101443019B; RU2008143248A; WO2007118967A1; EP2001483A1; BRPI0709925A2; DK2001483T3; ATE493989T1; EP2001483B1; AU2007239395B2; ES2359173T3; KR101409027B1; AU2007239395A1; KR20090016549A; CA2647501C; HK1129841A1; FR2899108B1; IL194293A0; JP2009531397A; CN101443019A; DE602007011739D1

Abstract

Изобретение относится к области медицины, а именно к химико-фармацевтической промышленности, в частности к применению производных холест-4-ен-3-она для получения цитопротекторных лекарственных средств, за исключением нейропротективных лекарственных средств. 12 з.п. ф-лы, 1 табл.

Description

Изобретение относится к применению производных холест-4-ен-3-он для получения цитопротекторных лекарственных средств, за исключением нейропротективных лекарственных средств.

Дегенеративные процессы в клетках характеризуются дисфункцией клеток, часто приводящей к нежелательной клеточной активности и гибели клеток.

Клетки развили механизмы адаптации при реакции на стресс, которые продлевают время их жизни или замедляют либо предотвращают гибель клеток (цитопротекторные механизмы).

Однако этих цитопротекторных механизмов иногда недостаточно, либо они неадекватны, либо индуцируются слишком поздно, чтобы быть эффективными, и клетки умирают. Поэтому может оказаться важным наличие новых цитопротекторных лекарственных средств, которые бы способствовали цитопротекции. Это является одной из целей данного изобретения.

Термин «цитопротекторный» относится к способности природных либо неприродных веществ/средств защищать клетку от клеточной смерти, в частности от патологической клеточной смерти, и/или от нарушений клеточных функций, приводящих к смерти клеток. Эти нарушения клеточных функций могут, например, иметь митохондриальное происхождение, такие как снижение способности к производству АТФ, неспособность накапливать и/или удерживать кальций или выработка свободных радикалов.

Среди основных механизмов клеточной смерти выделяют некроз, апоптоз и некроптоз.

Некроз является так называемой "случайной" клеточной смертью, которая происходит при повреждении ткани. Наиболее сильно затронутой оказывается клеточная плазматическая мембрана, что вызывает изменение гомеостаза клетки. Клетки будут впитывать воду до степени, приводящей к лизису их плазматических мембран. Клеточный лизис ведет к высвобождению цитоплазматического содержимого в окружающую среду. Некроз является началом воспалительного процесса.

Некроз может затрагивать группу клеток или ткань, тогда как другие соседние сегменты остаются живыми. Полученное преобразование является некрозом клеток или тканей.

Другими словами, некроз определяется морфологическими изменениями, которые происходят, когда клетка доходит до конца своей жизни в результате таких событий как значительная травма, такая как прерывание или снижение кровоснабжения в органе, перегревание (при значительном повышении температуры), интоксикация химическим реагентом, механический удар и т.д.

Одним из наиболее известных видов некроза является таковой в миокарде во время инфаркта (прерывание кровоснабжения в сердечной мышце) вследствие закупорки коронарной артерии.

Апоптоз является неотъемлемой частью нормальной физиологии организма. Это жестко регулируемая физиологическая форма клеточной смерти, и она необходима для выживания многоклеточных организмов. Апоптоз представляет собой процесс, который играет основополагающую роль в процессе эмбриогенеза.

Клетки в апоптозе или апоптотические клетки, будут сами себя изолировать от других клеток. В апоптоз обычно вовлекаются индивидуальные клетки ткани, не вызывая воспаления. Одной из отличительных морфологических особенностей апоптоза является значительное сжатие/уплотнение как ядра, так и цитоплазмы, что вызывает значительное уменьшение объема клетки. Затем ядро фрагментируется, каждый фрагмент окружен двойной оболочкой. Затем апоптотические тельца (цитоплазматические и ядерные элементы) высвобождаются и будут поглощены соседними клетками путем фагоцитоза.

Апоптоз может быть вызван различными способами. Например, радиация, присутствие химических реагентов или гормонов являются стимулами, которые могут вызвать каскад апоптотических событий в клетке. Внутриклеточные сигналы, такие как незавершенный митоз или повреждения ДНК, также могут вызвать апоптоз.

Апоптоз происходит также при воздействии генотоксических агентов или во время болезни. Некоторые патологии характеризуются аномальным апоптозом, ведущим к потере определенных клеточных популяций, такие, например, как гепатотоксичность, ретинопатии, кардиотоксичность.

Различие, таким образом, проводят между физиологическим апоптозом и патологическим апоптозом. Изобретение преимущественно сфокусировано на патологическом апоптозе.

Существуют и другие механизмы клеточной смерти, такие, например, как некроптоз, который имеет отличительные черты и апоптоза, и некроза. Клетка, умирающая по пути некроптоза, имеет сходные особенности с клетками, погибающими от некроза, но биохимические этапы этого механизма больше похожи на таковые при апоптозе. Этот механизм клеточной смерти имеет место, например, при ишемии.

Соответственно, одной из целей данного изобретения также является создание новых доступных лекарственных средств, которые будут способствовать профилактике и/или лечению некроза, и/или патологического апоптоза, и/или некроптоза (противонекротические и/или противоапоптотические, и/или противонекроптотические лекарственные средства).

Клеточные дегенеративные процессы могут происходить, помимо прочего, в результате патологических ситуаций, объединенных в группу под термином дегенеративных заболеваний или поражений, травм либо воздействия различных факторов.

Эти травмы и факторы могут включать в себя, к примеру, воздействие облучения (ультрафиолет, гамма-облучение), гипоксию, или недостаток кислорода, недостаток питательных веществ, недостаток ростовых факторов, яды, клеточные токсины, загрязнение, токсины окружающей среды, свободные радикалы, активные формы кислорода или даже определенные медицинские события и/или процедуры, такие, например, как хирургические травмы, включая трансплантацию клеток, тканей и органов. Также могут быть перечислены химические или биологические агенты, применяемые в качестве терапевтических средств в связи с лечением, такие, например, как цитостатики или противовоспалительные средства.

Целью изобретения является рассмотрение невнеклеточных причин патологий или дегенеративных процессов, которые могут приводить к клеточной смерти, а фактически последствий на клеточном уровне указанных патологических процессов или указанных патологий, и, в частности, защиту клетки от указанных последствий.

Среди наиболее значимых патологических ситуаций, характеризующихся дегенеративными процессами, за исключением неврологических или нейродегенеративных нарушений, к которым данное изобретение не относится, обнаружены следующие:

заболевания костей, суставов, соединительной ткани и хряща, такие как остеопороз, остеомиелит, артриты, включая, например, остеоартрит, ревматоидный артрит и псориатический артирит, аваскулярный некроз, прогрессирующая оссифицирующая фибродисплазия, рахит, синдром Иценко-Кушинга;

мышечные заболевания, такие как мышечная дистрофия, как, например, мышечная дистрофия Дюшенна, миотонические дистрофии, миопатии и миастении;

болезни кожи, такие как дерматит, экзема, псориаз, старение или даже нарушения рубцевания;

сердечно-сосудистые заболевания, такие как сердечная и/или сосудистая ишемия, инфаркт миокарда, ишемическая кардиопатия, хроническая или острая сердечная недостаточность, нарушение сердечного ритма, мерцание предсердий, мерцание желудочков, пароксизмальная (приступообразная) тахикардия, застойная сердечная недостаточность, гипертрофическая кардиопатия, аноксия, гипоксия, побочные эффекты вследствие лечения противоопухолевыми лекарственными средствами;

расстройства кровообращения, такие как атеросклероз, артериосклероз и болезни периферических сосудов, инсульты (нарушения мозгового кровообращения), аневризмы;

заболевания крови и сосудов, такие как анемия, сосудистая амилоидная дистрофия, кровотечения, дрепаноцитоз, синдром фрагментации эритроцитов, нейтропения, лейкопения, медуллярная аплазия, пантоцитопения, тромбоцитопения, гемофилия;

заболевания легких, включая пневмонию, астму; хронические обструктивные болезни легких, такие, например, как хронический бронхит и эмфизема;

болезни желудочно-кишечного тракта, такие как язва;

заболевания печени, такие, например, как гепатит, в частности гепатит вирусного происхождения или имеющий причиной другие инфекционные агенты, алкоголический гепатит, аутоиммунный гепатит, фульминантный (молниеносный) гепатит, некоторые наследственные нарушения обмена веществ, болезнь Вильсона, циррозы, алкогольные заболевания печени (ALD), заболевания печени вследствие действия токсинов и лекарственных средств; стеатозы, такие, например, как:

- неалкогольный стеатогепатит (NASH) или гепатит, сопутствующий экзогенной интоксикации алкоголем, лекарственными средствами, токсинами/ядами или вирусный гепатит, осложнения при хирургических операциях, нарушения обмена веществ (такие как диабет, синдром непереносимости глюкозы, ожирение, гиперлипедимии, нарушения в функционировании гипоталамо-гипофизарной системы, абеталипопротеинемия (синдром Бассена-Корнцвейга), галактоземия, гликогеноз, болезнь Вильсона, болезнь Вебера-Кристиана, синдром Рефсума, недостаток карнитина,

- осложнения на печень вследствие воспалительных заболеваний пищеварительного тракта,

- аутоиммунный гепатит.

Путем воздействия на стеатозы или печеночный апоптоз, вне зависимости от причины, соединения могут вызывать профилактику развития фиброза печени и предотвращать возникновение цирроза;

- заболевания поджелудочной железы, такие, например, как острый или хронический панкреатит;

- нарушения обмена веществ, такие как сахарный диабет и несахарный диабет, воспаление щитовидной железы;

- болезни почек, такие, например, как острые почечные расстройства или гломерулонефрит;

- жесткие интоксикации химическими веществами, ядами или лекарственными средствами;

- дегенеративные заболевания, ассоциированные с Приобретенным Синдромом Иммунодефицита (СПИД);

- заболевания, ассоциированные со старением, такие как синдром ускоренного старения;

- заболевания зубов, такие как те, что вызывают разрушение тканей, например, как периодонтит;

- глазные заболевания или нарушения, включая диабетические ретинопатии, глаукому, птоз, атрофию зрительного нерва, хроническую прогрессирующую наружную офтальмоплегию, дистрофию желтого пятна, атрофию сетчатки, пигментную дистрофию сетчатки, разрывы сетчатки, отслоение сетчатки, ишемию сетчатки, острые ретинопатии, ассоциированные с травмой, воспалительные дистрофии, осложнения после операции, ретинопатии вследствие медицинского вмешательства, катаракту;

- нарушения слуховых каналов, такие как отосклероз и глухота, вызванная действием антибиотиков;

- болезни, связанные с митохондриями (митохондриальные патологии), такие как атаксия Фридриха, врожденная мышечная дистрофия со структурными митохондриальными аномалиями, некоторые миопатии (синдром MELAS, синдром MERFF, синдром Пирсона), синдром MIDD (митохондриальный диабет и глухота), синдром Вольфрама, дистония.

Изобретение связано также с защитой клеток, тканей и/или пересаженных органов до, в процессе (извлечение, транспорт и/или пересадка) и после трансплантации.

Все еще продолжается поиск фармакологически активных соединений для контроля над перечисленными выше дегенеративными процессами.

Данное изобретение отвечает этим потребностям в цитопротекторных соединениях. Действительно, Заявителем обнаружено, что производные холест-4-ен-3-она, в частности оксим холест-4-ен-3-она, наделены значительными цитопротекторными свойствами.

Вот почему целью данного изобретения является применение по меньшей мере одного из соединений, приведенных в формуле I

где X представляет собой =N-OH-группу,

и R представляет собой группу, выбранную из

A представляет собой атом водорода, либо, в сочетании с B, углерод-углеродную связь,

B представляет собой атом водорода, гидроксильную группу либо, в сочетании с А, углерод-углеродную связь,

C представляет собой атом водорода либо, в сочетании с D, углерод-углеродную связь,

D представляет собой атом водорода либо, в сочетании с C, углерод-углеродную связь,

E представляет собой атом водорода либо, в сочетании с F, углерод-углеродную связь,

F представляет собой атом водорода либо, в сочетании с E, углерод-углеродную связь,

либо одной из его солей присоединения фармацевтически приемлемой кислоты, либо одним из его спиртов, либо одной из его солей присоединения фармацевтически приемлемых кислот указанных спиртов,

для получения цитопротекторного лекарственного средства, за исключением нейропротективных лекарственных средств.

Соединения формулы I, как они определены выше, известны (WO 2004/082581).

Соли присоединения фармацевтически приемлемых кислот могут быть, например, солями, образованными с соляной, бромистоводородной, азотной, серной, фосфорной, уксусной, муравьиной, пропионовой, бензойной, малеиновой, фумаровой, янтарной, виннокаменной, лимонной, щавелевой, глиоксиловой, аспарагиновой, алкансульфоновыми кислотами, как метан- или этансульфоновые кислоты, арил-сульфоновыми кислотами, как бензол- или паратолуол-сульфоновые кислоты, либо органическими кислотами.

Согласно изобретению оксим-группа представляет собой чистые или смешанные син- и анти- изомеры, в связи с ориентацией N-O связи, по отношению к двойной связи C=N.

Среди соединений, описанных выше, особенным образом будут подразумеваться вышеуказанные соединения, для которых

A совместно с B представляет собой углерод-углеродную связь, C, D, означают атомы водорода, E, F означают атомы водорода либо совместно углерод-углеродную связь, и R имеет значение R1,

A совместно с B представляет собой углерод-углеродную связь, C, D означают атомы водорода, E, F означают атомы водорода, и R имеет значение R2 или R3, или R4,

A совместно с B представляет собой двойную связь, C совместно с D представляет собой углерод-углеродную связь, E, F означают атомы водорода, и R имеет значение R1 либо R6,

A совместно с B представляет собой двойную связь, C совместно с D представляет собой углерод-углеродную связь, E совместно с F представляет собой углерод-углеродную связь, и R имеет значение R1,

E совместно с F представляет собой двойную связь, C, D, A, B означают атомы водорода, и R имеет значение R1,

а также и их соли присоединения фармацевтически приемлемых кислот.

Преимущественно согласно изобретению применяется по меньшей мере одно соединение формулы I, выбранное из

- холестан-3-он оксима,

- холест-4-ен-3-он оксима,

- холест-1,4-диен-3-он оксима,

- или одна из их солей присоединения фармацевтически приемлемых кислот, либо один из их спиртов, либо одна из их солей присоединения фармацевтически приемлемых кислот указанных спиртов.

Предпочтительно применяют холест-4-ен-3-он-оксим либо холест-1,4-диен-3-он-оксим, либо одну из их солей присоединения фармацевтически приемлемых кислот, либо один из их эфиров, либо одну из их солей присоединения фармацевтически приемлемых кислот указанных эфиров.

Интересные цитопротекторные свойства соединений формулы I оправдывают их применение для получения цитопротекторных лекарственных средств, в частности предназначенных для лечения или профилактики некроза и/или патологического апоптоза, и/или некроптоза (противонекротические, и/или противоапоптотические, и/или противонекроптотические лекарственные средства) или последующих заболеваний, таких как

заболевания костей, суставов, соединительной ткани и хряща,

мышечные болезни,

кожные заболевания,

сердечно-сосудистые заболевания,

расстройства кровообращения,

заболевания крови и сосудов,

болезни легких,

заболевания желудочно-кишечного тракта,

болезни печени,

болезни поджелудочной железы,

нарушения обмена веществ,

болезни почек,

жесткие интоксикации,

дегенеративные заболевания, связанные с Синдромом Приобретенного Иммунодефицита (СПИД),

нарушения, связанные со старением,

болезни зубов,

глазные болезни или нарушения,

заболевания слухового канала,

болезни, связанные с митохондриями (митохондриальные патологии).

Изобретение также связано с защитой клеток, тканей и/или пересаженных органов до, в процессе (извлечение, транспорт и/или пересадка) и после трансплантации.

Преимущественно соединения формулы I могут применяться в приготовлении лекарственных средств, предназначенных для защиты клеток сердца (кардиопротективное лекарственное средство), защиты клеток печени (гепатопротективное лекарственное средство) либо лекарственного средства, предназначенного для лечения или профилактики болезней, связанных с митохондриями.

Согласно изобретению соединение формулы I преимущественно присутствует в цитопротекторном лекарственном средстве в физиологически эффективных дозах; указанные лекарственные средства в значительной мере содержат эффективную цитопротекторную дозу по меньшей мере одного из соединений формулы I.

В качестве лекарственных средств соединения, соответствующие формуле I, их сложные эфиры, их соли присоединения фармацевтически приемлемых кислот, равно как и соли присоединения фармацевтически приемлемых кислот указанных эфиров, могут быть изготовлены для дигестивного или парентерального пути приема.

Лекарственные средства согласно изобретению могут дополнительно содержать по меньшей мере один иной терапевтически активный компонент, независимо от того, активен ли он в отношении той же патологии или другой патологии, для одновременного, раздельного применения, либо применения, длительного по времени, особенно при лечении пациента, подверженного одной из вышеперечисленных патологий.

Согласно изобретению соединение формулы I может быть использовано как компонент лекарственного средства, смешанный с одним или более инертными, то есть фармацевтически неактивными и нетоксичными, вспомогательными средствами или носителями. Последние могут быть изготовлены, к примеру, из солевого, физиологического, изотонического, буферного раствора и т.п., совместимых с фармацевтическим назначением и известного специалистам в данной области. Композиции могут содержать одно или более средств или носителей, выбранных из диспергирующих веществ, растворителей, стабилизаторов, консервантов и т.д. Средства или носители, которые могут быть использованы в композициях (жидкие и/или инъецируемые, и/или твердые композиции), представляют собой, в частности, метилцеллюлозу, гидроксиметилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу, циклодекстрины, полисорбат 80, маннит, желатин, лактозу, растительные или животные масла, камедь и т.д. Предпочтительно применяются растительные масла. Композиции могут быть изготовлены в виде впрыскиваемых суспензий, гелей, масел, таблеток, свечей, порошков, желатиновых капсул, капсул и т.д., возможно, посредством галеновых форм или приспособлений, обеспечивающих возможность длительного и/или замедленного высвобождения. Для такого типа композиции в качестве вспомогательных средств преимущественно применяют целлюлозу, карбонаты или крахмалы.

Введение лекарственного средства можно осуществить любым способом, известным специалисту в данной области, предпочтительно оральным путем или с помощью инъекции, обычно внутрибрюшным, внутримозговым, спинальным, внутривенным, внутриартериальным или внутримышечным путями. Оральный способ приема является предпочтительным. В случае длительного лечения предпочтительным способом приема будет подъязычный, оральный или чрескожный.

Для инъекций соединения обычно составлены в виде жидких суспензий, которые могут быть инъецированы, например, посредством шприцов или перфузий. Понятно, что скорость протекания и/или доза инъекции либо в целом назначаемая доза могут быть подобраны специалистом в данной области в зависимости от конкретного пациента, патологии, способа введения и т.д. Понятно, что могут осуществляться повторные назначения, возможно, в сочетании с другими активными ингредиентами или любым фармацевтически приемлемым носителем (буферами, солевыми, изотоническими растворами, в присутствии стабилизаторов и т.д.).

Изобретение можно применять в отношении млекопитающих, в частности человека.

Обычно суточная доза соединения соответствует наименьшей дозе для получения требуемого терапевтического эффекта. Дозировки соединений, описанных выше, и, к примеру холест-4-ен-3-он оксима, обычно будут составлять от 0,001 до 100 мг на килограмм веса человека в день.

При необходимости суточная доза может назначаться в два, три, четыре, пять, шесть или более приемов в день либо путем многократных суб-доз, назначаемых через приемлемые интервалы в течение дня.

Выбранное количество/дозировка будет зависеть от множества факторов, в частности от пути приема, продолжительности приема, момента приема, скорости выведения вещества, различного/ых продукта/ов, применяемых в комбинации с данным веществом, от возраста, веса и физического состояния пациента, равно как и от его/ее истории болезни и любой другой информации, известной в медицине (важной для медицинских целей).

Предписания лечащего врача могут начинаться с дозировок, меньших, чем обычно применяемые, и эти дозировки будут затем постепенно повышаться с целью улучшения контроля над проявлением возможных побочных эффектов.

Пример 1: Противоапоптотическое действие холест-4-ен-3-он-оксима

Противоапоптотические свойства холест-4-ен-3-он-оксима исследовали на кардиомиоцитах с помощью теста дисфункции сокращения, вызванной доксорубицином.

Использовали исходный (маточный) раствор холест-4-ен-3-он-оксима с концентрацией 10 мМ в 100% ДМСО. Конечная концентрация в ДМСО была одна и та же для всех экспериментальных точек, независимо от применяемых молекулярных концентраций. Оксим холест-4-ен-3-он анализировали в концентрациях 0,3, 1 и 3 мкМ, разведя в растворе Тирода (состав в ммоль/л: NaCl 135, KCl 5,4, NaH₂PO₄ 0,33, CaCl₂ 1,2, MgCl₂ 1,0, Hepes 10; pH доведен до 7,4 с помощью NaOH).

Методы

Сократительная способность и апоптоз желудочковых кардиомиоцитов кролика

A.1. Получение изолированных клеток желудочковых кардиомиоцитов кролика

Изолированные желудочковые клетки были получены из сердец самцов новозеландских кроликов, как описано в A. d'Anglemont de Tassigny et al., Fund. Clin. Pharmacol., 18: pp. 531-38, 2004. Вкратце, кроликов (2,0-2,5 кг) анестезировали с помощью раствора пентобарбитала (50 мг/кг), а затем обрабатывали гепарином (200 МЕд/кг). Сердца извлекали и немедленно промывали в течение 10-15 минут с помощью аппарата Лангендорфа без циркуляции, насыщенным кислородом (без кальция) изотоническим раствором Тирода (95%, 2-5% CO₂) (в мМ: NaCl 135, KCl 5,4, Na₂PO₄ 0,33, MgCl₂ 1,0, HEPES 10, pH доведен до 7,4 с помощью 1N NaOH при 37°C, 280-300 мОсмоль/кг H₂O). Затем все сердца промывали 3 минуты способом "рециркуляции" в том же растворе Тирода без кальция (коронарная скорость протекания 10-15 мл/мин), дополненном 1 мг/мл коллагеназы типа II и 0,28 мг/мл протеазы типа XIV. Наконец, все сердца промывали способом без рециркуляции тем же раствором Тирода, дополненным 0,3 мМ CaCl₂, в течение 10 мин. Левый желудочек удаляли и разрезали на маленькие кусочки; диссоциации клеток достигали путем мягкого механического перемешивания. Внеклеточный кальций добавляли партиями, каждые 15 минут, с целью достижения физиологической концентрации в 1,0 мМ. Изолированные миоциты хранили в среде без сыворотки, содержащей (в мМ) NaCl 110, KCl 5,4, Na₂PO₄ 0,33, NaHCO₃ 25, Глюкозы 5, MgCl₂ 0,8, CaCl₂ 1, при pH 7,4, вплоть до 1 часа 30 минут перед экспериментом. Все клетки были стержневидными, имели поперечно-полосатую исчерченность и не имели никаких везикул на поверхности при наблюдении под световым микроскопом.

A.2. Мечение аннексином V

Мечение фосфатидилсерина аннексином V использовали в качестве способа количественного измерения апоптоза с помощью набора MiniMacs cell isolation kit (Miltenyi Biotec, Bergisch, Gladbach, Germany). Вкратце, клетки, экспонирующие (имеющие на поверхности) фосфатидилсерин, метили магнитными микробусинами с аннексином V, затем наносили на колонку, помещенную в магнитное поле. Меченые клетки (которые несут магнитно-меченый фосфатидилсерин) удерживаются в колонке, тогда как немеченные (некротические клетки и не-апоптотические) не удерживаются. Колонку выводят из магнитного поля; удержанные магнитным способом клетки, экспонирующие фосфатидилсерин, элюируют в виде положительной фракции и подсчитывают с помощью устройства для подсчета клеток Mallassez. Процентное содержание апоптотических клеток затем определяют из их отношения к исходному количеству клеток.

A.3. Измерение активности каспазы-3

Активность каспазы-3 используют в качестве способа количественного измерения апоптоза. Вкратце, клетки лизируют и надосадочную фракцию используют для измерения активности каспазы-3 с применением AK-005 kit (Biomol Research Laboratories, Plymouth Meeting, PA, USA). Флуорогенный субстрат для измерения активности каспазы-3 (DEVD) метят флуорохромом 7-амино-4-метилкумарином (AMC), который продуцирует желто-зеленую флуоресценцию, детектируемую в УФ-свете при 360/460 нм в течение 210 мин. AMC высвобождается из субстрата путем расщепления каспазой-3, экспрессию фермента выражают в фмоль/мин.

A.4. Измерение сократительной способности

Миоциты переносят в камеру при 37°C, непрерывно промывают и устанавливают на столике инверсионного микроскопа. Камеру промывают физиологическим буфером, содержащим (в мМ): NaCl 140; KCl 5,4; CaCl₂ 1; MgCl₂ 0,8; HEPES 10 и глюкозу 5,6 (pH 7,4; 290 мОсмоль/кг H₂O).

Сокращение миоцитов индуцируют раз в секунду (1 Гц) платиновыми конденсаторными электродами, помещенными в камеру и связанными с симулятором. Изображения записываются непрерывно с помощью объектива x20 и передаются в CCD камеру (видеокамера на основе устройства с зарядовой связью) при скорости 240 импульсов/с. Изображения CCD камеры проецируются на видеоэкран.

Миоциты отбирали для исследования согласно следующим критериям: стержневидный внешний вид с очень выраженной исчерченностью и отсутствие внутриклеточных вакуолей, отсутствие спонтанных сокращений при стимуляции 1 мМ Ca²⁺, неизменные длина в состоянии покоя и амплитуда сокращения. Длину саркомеров измеряли с помощью программы анализа видеоизображений, и данные записывали при скорости 240 импульсов/с. Изображения, полученные камерой, переводили в значения измерений длины саркомеров. Процентное отношение сокращений высчитывали из этих данных о длине саркомеров.

A.5. Анализ данных

Все данные выражены как среднее значение ± стандартное отклонение. Сравнение данных между различными группами осуществляли с помощью ANOVA, с последующим установлением критерия Стьюдента с достоверным отклонением p<0,05.

Методика эксперимента

Апоптоз в изолированных кардиомиоцитах вызывали путем воздействия 1 мкМ доксорубицина, добавленного в изотоническом растворе, содержащем (в мМ) NaCl 110, KCl 5,4, Na₂PO₄ 0,33, NaHCO₃ 25, глюкозы 5, MgCl₂ 0,8, CaCl₂ 1, при pH, доведенном до 7,4, в течение 3-8 часов. Мечение аннексином V проводили через 3 часа после начала воздействия доксорубицина, так как это событие происходит очень рано в апоптотическом каскаде. Измерения активности каспазы-3 осуществляли через 8 часов после начала воздействия доксорубицина, так как это событие происходит позже в процессе апоптоза. Сократительную способность кардиомиоцитов измеряли каждый час в течение 8 часов воздействия доксорубицина. После всех обработок клетки сравнивали с контрольными кардиомиоцитами, не подвергавшимися воздействию доксорубицина.

Кардиомиоциты предварительно обрабатывали соединением оксима холест-4-ен-3-она в течение 15 мин до начала воздействия доксорубицина. Во время исследования анализировали три концентрации этого соединения: 0,3 мкМ, 1 мкМ и 3 мкМ.

Результаты

Средняя длина саркомеров клеток, используемых в данном исследовании, незначительно отличалась между группами.

Влияние доксорубицина на сократительную способность миоцитов и на апоптоз

Воздействие доксорубицина приводит с течением времени к уменьшению укорочения саркомера. Укорочение при наибольшей концентрации доксорубицина было похожим на таковое в контроле в течение первых трех часов, а затем значительно снижалось через 4 часа воздействия (-53,20±7,70% против -19,49±2,06% относительно базисной линии доксорубицина и контроля, p<0,05, n=5, соответственно).

Обработка 1 мкМ доксорубицином вызывала апоптоз со значительным повышением мечения аннексином V и активности каспазы-3

Влияние холест-4-ен-3-он-оксима на дисфункцию на уровне сократимости (сократительной способности), вызванной доксорубицином, и апоптоз.

Обработка 1 мкМ доксорубицином приводила к значительному снижению максимального укорочения желудочковых кардиомиоцитов, что не происходило в присутствии холест-4-ен-3-он-оксима (0,3; 1 и 3 мкМ). Действительно, через 4 часа обработки максимальное укорочение под действием доксорубицина (-53,20±7,70%) оставалось значительно сниженным при концентрации соединения 0,3 мкМ (-25,35±0,18%), при 1 мкМ (-15,66±5,72%) и при 3 мкМ (-13,95±3,17%) относительно базисной линии.

Далее повышение мечения аннексином V и активности каспазы-3 вследствие воздействия доксорубицина блокировалось оксимом холест-4-ен-3-она при 0,3; 1 и 3 мкМ.

Апоптоз, оцениваемый как изменение в % мечения аннексином V через 3 часа после добавления доксорубицина, дает следующие результаты: контроль: 100%; доксорубицин: 291% ± 32; доксорубицин + 0,3 мкМ холест-4-ен-3-он-оксима: 130% ± 12,43; доксорубицин + 1 мкМ холест-4-ен-3-он-оксима: 121% ± 4,74; доксорубицин + 3 мкМ холест-4-ен-3-она: 115,5% ± 16,35. Результаты измерений активности каспазы-3 таковы: контроль: 18±9 фмоль/мин; доксорубицин: 120±15 фмоль/мин; доксорубицин + 0,3 мкМ холест-4-ен-3-он-оксим: 33±9 фмоль/мин; доксорубицин + 1 мкМ холест-4-ен-3-он-оксим: 18±8 фмоль/мин; доксорубицин + 3 мкМ холест-4-ен-3-он-оксим: 11±4 фмоль/мин.

Комментарии и выводы

Соединение холест-4-ен-3-он-оксима оказывает кардиопротективный эффект в отношении дисфункции сократимости, вызванной доксорубицином, и апоптоза изолированных кроличьих кардиомиоцитов. Данная молекула в соответствующих дозах действительно может защитить от кардиотоксичности, вызванной доксорубицином, который известен как ограничивающий фактор при лечении раковых пациентов этим антрациклином. Следовательно, соединение холест-4-ен-3-он-оксима может быть использовано для ограничения кардиотоксичности доксорубицина у таких пациентов.

Пример 2: Влияние холест-4-ен-3-он-оксима в in vivo модели острой гепатотоксичности

Гепатоциты, как и многие другие клетки, несут на своей цитоплазматической мембране рецептор Fas/CD95. Стимуляция пути Fas вызывает клеточную смерть путем активации каскада каспаз.

Модель острого поражения печени может быть индуцирована однократной инъекцией антител к Fas Jo2 (Ogasawara et al., Nature, August 1993), вызывающей тяжелые поражения печени наподобие вирусных, аутоиммунных поражений или гепатитов, вызванных лекарственными средствами.

Аланинаминотрансфераза (ALAT), также называемая сывороточной глутамат-пируваттрансаминазой (SGPT), является ферментом, присутствующим в гепатоцитах. Ее активность значительно повышается в плазме после печеночного лизиса, и, следовательно, она является хорошим показателем для оценки повреждений печени.

Проведенное исследование заключалось в интоксикации животных Jo2, с последующим тестом на ALAT, и анализе способности холест-4-ен-3-он-оксима защищать гепатоциты.

Материалы и методы

Животные

Использовали взрослых самцов мышей CD1 производства "Elevage Janvier" (Le Genest-Saint-Isle, France). Животных идентифицировали индивидуально, и они имели свободный доступ к воде и пище.

Объекты поддерживались при контролируемом световом режиме (7:00 до полудня -7:00 после полудня) и при температуре 20±2°C и 50±20% влажности.

Подготовка антител Jo2

Исходный раствор моноклонального антитела хомячка против мышиного CD95 (Fas), называемого Jo2, от Pharmingen (BD Biosciences, ref. 554254 batch 66081), содержит его в концентрации 1 мг/мл в воде. Используемые разведения производят в 0,9% водном растворе хлорида натрия.

Подготовка анализируемого соединения

Требуемое количество холест-4-ен-3-он-оксима взвешивали и перемалывали в тонкоизмельченный порошок, затем суспендировали (60 мг/мл) в кукурузном масле. Соединение вводили орально (путем принудительного кормления) в концентрации 5 мл/кг.

Методика

Предварительную терапию холест-4-ен-3-он-оксимом проводили в дозе 300 мг/кг путем орального приема за 4 часа до приема антител Jo2. Антитело Jo2 вводили путем внутрибрюшинной инъекции, дозировка 125 мкг/кг в объеме 5 мл/кг веса тела.

Контролем служили животные, предварительно принимавшие орально тот же объем кукурузного масла, что и использовался для приготовления соединения, но без соединения, за 4 часа до приема антитела.

Количественный анализ ALAT

Кровь у анестезированных мышей отбирали через 24 часа после приема Jo2. Количественный анализ ALAT проводили с применением набора (Roche Diagnostics) и спектрофотометра (Hitachi Modular), согласно методике, стандартизованной IFCC (Международной Федерацией Клинической Химии).

Результаты и выводы

Внутрибрюшинный прием Jo2 в дозе 125 мкг/кг вызвал смерть 3 мышей из 19 в контрольной группе в течение 24-часового периода после инъекции.

Активность ALAT значительно снижалась под действием анализируемого соединения в концентрации 300 мг/кг.

Активность ALAT, измеренная через 24 часа после приема Jo2
Схема приема/исследование	Активность ALAT (Ед/л) Среднее значение +/- СОС (стандартная ошибка среднего) (n)
Контроль	2,586±474 (16)
Холест-4-ен-3-он-оксим (300 мг/кг)	1,136±175 (20)**
**: p=0,0037, t-анализ относительно контрольной группы.

Оказалось, что при приеме холест-4-ен-3-он-оксима в концентрации 300 мг/кг за 4 часа до приема антитела Jo2 можно

- предотвратить смерть мышей, получавших антитело Jo2, в течение 24 часов после инъекции;

- ограничить смертность клеток, вызванную сублетальной дозой антитела; активность ALAT, биологического маркера лизиса клеток печени, присутствующего в плазме, значительно ниже у мышей, получавших оксим холест-4-ен-3-она, чем у неполучавших его контрольных мышей.

Выводы

Гепатопротективные свойства холест-4-ен-3-он-оксима могут быть продемонстрированы на модели острой гепатотоксичности, вызванной у мышей антителом против Fas (Jo2).

На основании полученных значительных эффектов соединения формулы I могут рассматриваться как подходящие для применения в изготовлении цитопротекторного лекарственного средства общего действия.

Токсикологическое исследование

Введение мышам оральным, подкожным, внутрибрюшинным и внутривенным путями, в частности, холест-4-ен-3-он-оксима в дозах вплоть до 300 мг/кг/день при ежедневном приеме, который может длиться до 28 дней, не выявило никакой значимой токсичности.

У обезьян при оральном приеме суточных доз вплоть до 1500 мг/кг в течение 10 дней токсичности не выявлено.

Claims

1. Применение по меньшей мере одного соединения, соответствующего формуле I

где Х представляет собой =N-OH-группу,
и R представляет собой группу, выбранную из

А представляет собой атом водорода либо, в сочетании с В, углерод-углеродную связь,
В представляет собой атом водорода, гидроксильную группу либо, в сочетании с А, углерод-углеродную связь,
С представляет собой атом водорода либо, в сочетании с D, углерод-углеродную связь,
D представляет собой атом водорода либо, в сочетании с С, углерод-углеродную связь,
Е представляет собой атом водорода либо, в сочетании с F, углерод-углеродную связь,
F представляет собой атом водорода либо, в сочетании с Е, углерод-углеродную связь,
или одной из его солей присоединения фармацевтически приемлемых кислот, или одного из его сложных эфиров, или одной из его солей присоединения фармацевтически приемлемых кислот указанных эфиров,
для получения цитопротекторного лекарственного средства, за исключением нейропротективных лекарственных средств.

2. Применение по п.1, отличающееся тем, что в формуле I А совместно с В представляет собой углерод-углеродную связь, С, D представляют собой атомы водорода, Е, F представляют собой атомы водорода либо - в сочетании друг с другом - углерод-углеродную связь, и R имеет значение R1.

3. Применение по п.1, отличающееся тем, что в формуле I А совместно с В представляет собой углерод-углеродную связь. С, D представляют собой атомы водорода, Е, F представляют собой атомы водорода, и R имеет значение R2 или R3, или R4.

4. Применение по п.1, отличающееся тем, что в формуле I А совместно с В представляет собой двойную связь, С совместно с D представляет собой углерод-углеродную связь, Е, F представляют собой атомы водорода, и R имеет значение R1 или R6.

5. Применение по п.1, отличающееся тем, что в формуле I А совместно с В представляет собой двойную связь, С совместно с D представляет собой углерод-углеродную связь, Е совместно с F представляет собой углерод-углеродную связь, и R имеет значение R1.

6. Применение по п.1, отличающееся тем, что в формуле I Е совместно с F представляет собой двойную связь, С, D, А, В представляют собой атомы водорода, и R имеет значение R1.

7. Применение по п.1, отличающееся тем, что соединение формулы выбрано из:
- холестан-3-он-оксима,
- холест-4-ен-3-он-оксима,
- холест-1,4-диен-3-он-оксима,
или одной из их солей присоединения фармацевтически приемлемых кислот, или одного из их сложных эфиров, или одной из солей присоединения фармацевтически приемлемых кислот указанных эфиров.

8. Применение по п.1, отличающееся тем, что соединение формулы I выбрано из холест-4-ен-3-он-оксима или холест-1,4-диен-3-он-оксима, или одной из их солей присоединения фармацевтически приемлемых кислот, или одного из их сложных эфиров, или одной из солей присоединения фармацевтически приемлемх кислот указанных эфиров.

9. Применение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что лекарственное средство предназначено для лечения или профилактики некроза и/или патологического апоптоза, и/или некроптоза (противонекротические и/или противоапоптотические, и/или противонекроптотические лекарственные средства), или, кроме того, таких заболеваний как
- заболевания костей, суставов, соединительной ткани и/или хряща,
- мышечные заболевания,
- кожные заболевания,
- сердечно-сосудистые заболевания,
- расстройства кровообращения,
- заболевания крови и сосудов,
- болезни легких,
- заболевания желудочно-кишечного тракта,
- болезни печени,
- болезни поджелудочной железы,
- нарушения обмена веществ,
- болезни почек,
- тяжелые интоксикации,
- дегенеративные заболевания, связанные с Синдромом Приобретенного Иммунодефицита (СПИД),
- нарушения, связанные со старением,
- болезни зубов,
- глазные болезни или нарушения,
- заболевания слуховых каналов,
- болезни, связанные с митохондриями (митохондриальные патологии).

10. Применение по любому из пп.1-8, отличающееся тем, что лекарственное средство предназначено для защиты клеток сердца (кардиопротектор).

11. Применение по любому из пп.1-8, отличающееся тем, что лекарственное средство предназначено для защиты клеток печени (гепатопротектор).

12. Применение по любому из пп.1-8, отличающееся тем, что лекарственное средство предназначено для лечения или профилактики болезней, ассоциированных с митохондриями.

13. Применение по любому из пп.1-8, отличающееся тем, что лекарственное средство предназначено для защиты клеток, ткани или органа до, в процессе или после трансплантации.