RU2461623C1

RU2461623C1 - Method for cartilage cell culture

Info

Publication number: RU2461623C1
Application number: RU2011125438/10A
Authority: RU
Inventors: Борис Карпович Гаврилюк (RU); Борис Карпович Гаврилюк; Иван Васильевич Крайник (RU); Иван Васильевич Крайник; Василий Владимирович Михайлов (RU); Василий Владимирович Михайлов; Андрей Иванович Крайник (RU); Андрей Иванович Крайник
Original assignee: Борис Карпович Гаврилюк; Иван Васильевич Крайник; Василий Владимирович Михайлов; Андрей Иванович Крайник
Priority date: 2011-06-20
Filing date: 2011-06-20
Publication date: 2012-09-20

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: what is presented is a method for cartilage cell culture with the use of self-tissues with the self-tissue being ground to the graft size of no more than 0.5 mm³, while a support substrate is presented by autoplasma and thrombocytes; autoplasma is added with 10% calcium chloride 4 ml per plasma 1 ml, after plasma protein polymerisation and clotting reaction it is transferred onto nutrient mediums and placed in a thermostat for 3-4 days.

EFFECT: invention may be used for cartilage tissue cultivation in vitro.

Description

Изобретение относится к области медицины, в частности к области трансплантологии, и может быть использовано для выращивания хрящевой ткани in vitro.The invention relates to medicine, in particular to the field of transplantology, and can be used for growing cartilage in vitro.

Известен способ выращивания культур хрящевых клеток с использованием стволовых клеток. Известно, что костные морфогенетические белки (bonemorphogeneticproteins, BMPs) являются важным фактором формирования как костной, так и хрящевой ткани, что определяет интерес к их использованию для регенерации обоих тканей. Обычно при культивировании стволовых клеток in vitro для получения из них костной или хрящевой ткани под воздействием BMP использовали специфический для каждой ткани состав среды и условия выращивания (Kemmis C.M., Vahdati A., Weiss H.E., Wagner D.R. Bone morphogenetic protein 6 drives both osteogenesis and chondrogenesis in murine adipose-derived mesenchymal cells depending on culture conditions. Biochem Biophys Res Commun. 2010 Oct 8; 401(1):20-5. Epub 2010 Sep 9).A known method of growing cultures of cartilage cells using stem cells. Bone morphogenetic proteins (bonemorphogeneticproteins, BMPs) are known to be an important factor in the formation of both bone and cartilage tissue, which determines the interest in their use for the regeneration of both tissues. Typically, when stem cells were cultured in vitro to obtain bone or cartilage from BMP, they used the specific composition of the medium and growing conditions (Kemmis CM, Vahdati A., Weiss HE, Wagner DR Bone morphogenetic protein 6 drives both osteogenesis and chondrogenesis in murine adipose-derived mesenchymal cells depending on culture conditions. Biochem Biophys Res Commun. 2010 Oct 8; 401 (1): 20-5. Epub 2010 Sep 9).

Один из наиболее эффективных методов направленной дифференцировки стволовых клеток для клеточной терапии - трансфекция в них определенных генов.One of the most effective methods of targeted differentiation of stem cells for cell therapy is the transfection of certain genes in them.

Группа корейских ученых из College of Life Science, СНА University, Сеул, разработала невирусную векторную систему для трансфекции человеческих мезенхимальных стволовых клеток (МСК) с целью добиться их дифференцировки в клетки хрящевой ткани. Было исследовано несколько возможных носителей генов с оценкой их эффективности для трансфекции и направленной дифференцировки МСК. Наилучшие результаты были получены при использовании биодеградирующих наночастиц из полилактогликоевой кислоты, несущих плазмиды с соответствующей ДНК. При их применении была достигнута устойчивая экспрессия нужных генов МСК и эффективный хондрогенез. Было показано, что клетки активно захватывают несущие ген SOX9 наночастицы in vitro and in vivo. Экспрессия гена через 2 дня после трансфекции возрастала на 75%, как и синтез глюкозаминоглюкана, что было подтверждено различными методами (ПЦР, иммуноблоттинг, иммунофлюоресценция и др.).A group of Korean scientists from College of Life Science, SNA University, Seoul, has developed a non-viral vector system for transfection of human mesenchymal stem cells (MSCs) to differentiate them into cartilage tissue cells. We investigated several possible gene carriers with an assessment of their effectiveness for transfection and targeted differentiation of MSCs. The best results were obtained using biodegradable polylactoglycoic acid nanoparticles carrying plasmids with the corresponding DNA. With their use, stable expression of the desired MSC genes and effective chondrogenesis were achieved. Cells have been shown to actively capture SOX9 gene-carrying nanoparticles in vitro and in vivo. Gene expression 2 days after transfection increased by 75%, as did glucosaminoglucan synthesis, which was confirmed by various methods (PCR, immunoblotting, immunofluorescence, etc.).

Таким образом, ученые предложили метод, значительно повышающий эффективность формирования хрящевой ткани, который может быть применен в клеточной терапии артритов и других заболеваний (Kirn J.H., et al. The use of biodegradable PLGA nanoparticles to mediate SOX9 gene delivery in human mesenchymal stem cells (hMSCs) and induce chondrogenesis. Biomaterials. 2010 Sep 25).Thus, scientists have proposed a method that significantly improves the efficiency of cartilage tissue formation, which can be used in the cell therapy of arthritis and other diseases (Kirn JH, et al. The use of biodegradable PLGA nanoparticles to mediate SOX9 gene delivery in human mesenchymal stem cells (hMSCs ) and induce chondrogenesis. Biomaterials. 2010 Sep 25).

Создание искусственных органов и тканей оформилось в самостоятельную отрасль науки около десяти лет тому назад.. Ученые из Гетеборгского университета в Швеции экстрагировали хондроциты (клетки хряща) из суставов 23 пациентов, вырастили культуру клеток, которая образовала хрящевую ткань, а затем имплантировали ее в поврежденный коленный сустав. Результат оказался превосходным: у 14 из 16 пациентов было отмечено практически полное замещение поврежденного хряща новой тканью в месте ее имплантации. Выращивание хрящевой ткани занимает, к сожалению, много времени - несколько недель, поэтому ученые пытаются разработать методики более быстрого получения искусственных тканей (М.В. Плетников. Создание искусственных органов и тканей. Science, 1995, Vol.270, N 5234, pp.230-232).The creation of artificial organs and tissues took shape in an independent branch of science about ten years ago .. Scientists from the University of Gothenburg in Sweden extracted chondrocytes (cartilage cells) from the joints of 23 patients, grew a cell culture that formed cartilage, and then implanted it into a damaged knee joint. The result was excellent: in 14 out of 16 patients, almost complete replacement of the damaged cartilage with new tissue was noted at the site of its implantation. Unfortunately, it takes a lot of time to grow cartilage tissue - several weeks, so scientists are trying to develop methods for faster production of artificial tissues (M.V. Pletnikov. Creating artificial organs and tissues. Science, 1995, Vol.270, N 5234, pp. 230-232).

Травмы суставов и хрящей могут иметь серьезные последствия, включая и развитие остеоартрита. Дегенерация хряща в суставах является широко распространенным заболеванием во всем мире.Injuries to joints and cartilage can have serious consequences, including the development of osteoarthritis. Cartilage degeneration in joints is a widespread disease worldwide.

Деформирующий остеоартроз крупных суставов приводит не только к развитию болевого синдрома, но и по мере своего прогрессирования нарушает подвижность пациентов, приводя к их инвалидности. Поскольку хрящ не может регенерировать после того, как закончен рост органа, дефекты суставных поверхностей, вызванные травмами и износом, могут быть исправлены только путем пересадки новой хрящевой ткани. Генетическая инженерия и молекулярная биология сделали возможным получение здоровых клеток хрящей из организма пациента и дальнейшее их выращивание вне тела в специальных средах.Deforming osteoarthrosis of large joints leads not only to the development of pain, but also, as it progresses, disrupts the mobility of patients, leading to their disability. Since cartilage cannot regenerate after organ growth is completed, defects in articular surfaces caused by injuries and wear can only be corrected by transplanting new cartilage tissue. Genetic engineering and molecular biology have made it possible to obtain healthy cartilage cells from the patient’s body and further grow them outside the body in special environments.

Профессор Прасад Шастри - специалист в области тканевой инженерии (ТЕ), создающей и выращивающей биологические ткани с использованием собственных клеток организма. Он является профессором отделения биофункциональной химии высокомолекулярных соединений в Центре по исследованиям биологических сигнализаций (БИОСС), в университете Фрейбурга. Совместно со своими коллегами Прасад Шастри разработал быстрый и экономически эффективный способ получения достаточного количества костной и хрящевой ткани с использованием собственных клеток организма пациента. Выращенная in vitro здоровая хрящевая ткань использовалась для лечения дефектных суставов, где она приживалась и росла.Professor Prasad Shastri is a specialist in tissue engineering (TE), which creates and grows biological tissues using the body's own cells. He is a professor in the Department of Biofunctional Chemistry of High-Molecular Compounds at the Center for Biological Signaling Research (BIOSS), at the University of Freiburg. Together with his colleagues, Prasad Shastri has developed a fast and cost-effective way to obtain a sufficient amount of bone and cartilage tissue using the patient's own cells. In vitro grown healthy cartilage tissue was used to treat defective joints, where it took root and grew.

До недавних пор восстановление хрящевой и костной ткани с применением собственных клеток тела пациента являлось сложным и дорогостоящим процессом, требующим длительного времени на реализацию. В своей статье, опубликованной в американском журнале "Новости ортопедии", доктор Прасад Шастри и его соавторы представили новую стратегию выращивания костной и хрящевой ткани "Нова-де-Инжиниринг", которая требует лишь три недели. Проведенные исследования показали, что культурные хрящевые ткани, полученные по новой методике, хорошо приживаются и не проявляют признаков кальцификации даже через девять месяцев.Until recently, the restoration of cartilage and bone tissue using the patient’s own cells in the patient’s body was a complex and expensive process, requiring a long time to implement. In an article published in the American journal Orthopedics News, Dr. Prasad Shastri and his co-authors presented a new strategy for growing bone and cartilage tissue, Nova de Engineering, which requires only three weeks. Studies have shown that cultured cartilage tissue obtained by the new technique, are well established and do not show signs of calcification even after nine months.

Цель изобретения - ускорить и удешевить процесс выращивания культур хрящевых клеток.The purpose of the invention is to accelerate and reduce the cost of the process of growing cultures of cartilage cells.

Цель достигается тем, что выращивание культур хрящевых клеток осуществляют с использованием аутологичных тканей, причем проводят измельчение аутоткани до величины графтов не более 0,5 мм³, а в качестве поддерживающего субстрата используют аутоплазму и тромбоциты; в аутоплазму добавляют на 1 мл плазмы 4 капли 10% раствора хлористого кальция; после полимеризации белков плазмы и образования сгустка переносят на питательные среды и помещают в термостат на 3-4 суток. The goal is achieved in that the cultivation of cartilage cells is carried out using autologous tissues, moreover, autotissue is crushed to a graft size of not more than 0.5 mm ³ , and autoplasma and platelets are used as a supporting substrate; 4 drops of a 10% solution of calcium chloride are added to autoplasma per 1 ml of plasma; after polymerization of plasma proteins and the formation of a clot, they are transferred to nutrient media and placed in a thermostat for 3-4 days.

Способ осуществляют следующим образом.The method is as follows.

Измельченный любым способом аутохрящ в виде микрографтов, не превышающих по своим размерам объем 0,5 мм³, помещаем в аутоплазму, добавляем на 1 мл плазмы 4 капли 10% раствора хлористого кальция или такое же количество раствора глюконата кальция. Через 10-15 минут происходит полимеризация белков плазмы и образование сгустка. В его состав входят все находящиеся в плазме тромбоциты и размельченные фрагменты хряща. Сгусток со всей клеточной массой переносится на питательные среды или питательные среды добавляются в плазму, содержащую сгусток. Весь комплекс помещается в термостат. В течение 3-4 суток происходит рост и концентрация хондроцитов в сгустке. После извлечения из термостата содержащий хондроциты белковый сгусток можно использовать, придав ему любую форму.The autocartilage crushed by any method in the form of micrografts, not exceeding 0.5 mm ³ in size, is placed in the autoplasma, 4 drops of 10% calcium chloride solution or the same amount of calcium gluconate solution are added to 1 ml of plasma. After 10-15 minutes, the polymerization of plasma proteins and the formation of a clot occurs. It includes all platelets in the plasma and crushed fragments of cartilage. A clot with the entire cell mass is transferred to culture media or culture media is added to the plasma containing the clot. The whole complex is placed in a thermostat. Within 3-4 days, the growth and concentration of chondrocytes in the clot occurs. After extraction from the thermostat, a protein clot containing chondrocytes can be used, giving it any shape.

Claims

A method of growing cartilage cell cultures using autologous tissues, characterized in that autotissue is crushed to a graft size of not more than 0.5 mm ³ , and autoplasma and platelets are used as a supporting substrate; 4 drops of a 10% solution of calcium chloride are added to autoplasma per 1 ml of plasma; after polymerization of plasma proteins and the formation of a clot, they are transferred to nutrient media and placed in a thermostat for 3-4 days.