RU2331670C1 - Method of accelerated acquiring of mesenchymal stem cells (msc) culture of mammals, except human, with low heterogeneity and high viability - Google Patents
Method of accelerated acquiring of mesenchymal stem cells (msc) culture of mammals, except human, with low heterogeneity and high viability Download PDFInfo
- Publication number
- RU2331670C1 RU2331670C1 RU2007119977/13A RU2007119977A RU2331670C1 RU 2331670 C1 RU2331670 C1 RU 2331670C1 RU 2007119977/13 A RU2007119977/13 A RU 2007119977/13A RU 2007119977 A RU2007119977 A RU 2007119977A RU 2331670 C1 RU2331670 C1 RU 2331670C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- culture
- mscs
- msc
- heterogeneity
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии, медицине и может быть использовано при получении культур стволовых клеток для различных целей.The invention relates to biotechnology, medicine and can be used to obtain stem cell cultures for various purposes.
С учетом возрастания области применения стволовых клеток перед цитологами достаточно остро стоит проблема получения в короткий временной период требуемого количества мезенхимальных стволовых клеток с низкой гетерогенностью и высокой жизнеспособностью, поскольку именно такие клетки необходимы для решения практических задач.Given the increasing use of stem cells, cytologists are faced with a rather acute problem of obtaining, in a short time period, the required number of mesenchymal stem cells with low heterogeneity and high viability, since such cells are necessary for solving practical problems.
Стромальные костномозговые клетки-предшественники, называемые также мезенхимальными стволовыми клетками (МСК), могут быть выделены из различных тканей. Они представляют собой малочисленную популяцию клеток, характеризующихся большим пролиферативным потенциалом, способных к самоподдержанию с сохранением недифференцированного состояния, а также обладающих возможностью дифференцироваться в различные клеточные типы под действием определенных стимулов [3, 4, 6, 12, 13]. Способность МСК дифференцироваться по крайней мере в клетки тканей мезенхимального происхождения лежит в основе их репаративного потенциала.Stromal bone marrow progenitor cells, also called mesenchymal stem cells (MSCs), can be isolated from various tissues. They represent a small population of cells characterized by a large proliferative potential, capable of self-maintenance while maintaining an undifferentiated state, and also having the ability to differentiate into different cell types under the action of certain stimuli [3, 4, 6, 12, 13]. The ability of MSCs to differentiate at least into tissue cells of mesenchymal origin is the basis of their reparative potential.
Известен способ выращивания человеческих мезенхимальных стволовых клеток, взятых из крови, в котором одним из условий является повышенное количество CO2 (патент US 7060494 от 13.06.2006 г., класс 435/366, C12N 5/00).A known method of growing human mesenchymal stem cells taken from blood, in which one of the conditions is an increased amount of CO 2 (patent US 7060494 from 06.13.2006, class 435/366, class C 12 N 5/00).
Гипоксия является ключевым звеном во многих патофизиологических процессах, а также в процессах тканевой репарации. Пониженное содержание кислорода может оказывать влияние на жизнеспособность МСК и их пролиферативный потенциал, что, в свою очередь, может влиять на протекание репаративных процессов в ткани.Hypoxia is a key link in many pathophysiological processes, as well as in tissue repair processes. Reduced oxygen content can affect the viability of MSCs and their proliferative potential, which, in turn, can affect the course of reparative processes in the tissue.
Известно, что гипоксия может увеличивать пролиферации ряда клеток предшественников [5, 8, 11]. Однако все проводимые эксперименты по изучению влияния гипоксии на стволовые клетки проводили в очень короткие временные интервалы, используя раличное содержание кислорода. Кратковременная экспозиция и различия в содержании кислорода не позволяют сделать определенные выводы о возможном использовании этого фактора для наращивания массы клеток, пригодной для регенеративных целей. Важными проблемами при культивировании клеток-предшественников является также их гетерогенность, различная степень коммитирования и процессы апоптоза и некроза in vitro, поскольку для практического применения используют стволовые клетки только с низкой гетерогенностью и высокой жизнеспособностью.It is known that hypoxia can increase the proliferation of a number of progenitor cells [5, 8, 11]. However, all ongoing experiments to study the effect of hypoxia on stem cells were performed at very short time intervals using different oxygen contents. Short-term exposure and differences in oxygen content do not allow us to draw certain conclusions about the possible use of this factor to increase the mass of cells suitable for regenerative purposes. Important problems in the cultivation of precursor cells are also their heterogeneity, varying degrees of committing, and in vitro apoptosis and necrosis processes, since stem cells with only low heterogeneity and high viability are used for practical use.
Гетерогенность клеток проявлялась в наличии в культуре нескольких типов клеток, отличающихся по морфологии и пролиферативной активности, что описано рядом авторов [1, 2, 7, 10]. Так, в культурах МСК, по крайней мере, можно было выделить активно пролиферирующие клетки веретеновидной или треугольной формы с однородной цитоплазмой; активно пролиферирующие, более распластанные фибробластоподобные клетки с крупным ядром; медленно пролиферирующие, сильно распластанные, варьирующие по размеру клетки, имеющие полигональную, округлую или неправильную форму и неоднородную цитоплазму.Cell heterogeneity was manifested in the presence in the culture of several types of cells that differ in morphology and proliferative activity, as described by a number of authors [1, 2, 7, 10]. So, in MSC cultures, at least, actively proliferating spindle-shaped or triangular cells with a homogeneous cytoplasm could be distinguished; actively proliferating, more flattened fibroblast-like cells with a large nucleus; slowly proliferating, very flattened, varying in size cells having a polygonal, round or irregular shape and a heterogeneous cytoplasm.
Наиболее близким к заявленному способу является известный способ получения стволовых клеток по Javason (2001), в котором клетки культивировали в условиях нормального содержания кислорода (около 20%) и пересаживали при достижении субконфлуента.Closest to the claimed method is a known method for producing stem cells according to Javason (2001), in which the cells were cultured under conditions of normal oxygen content (about 20%) and transplanted upon reaching subconfluent.
Стромальные клетки-предшественники, используемые в работе, выделяли из бедренных костей крыс. После ресуспендирования клетки переносили во флаконы для адгезии, через 2 суток удаляли флотирующие агрегаты, первичную культуру отмывали и добавляли свежую культуральную среду. В качестве среды для культивирования использовалась α-МЕМ (ICN, США или "Биолот", Россия) с добавлением 2 мМ L-глутамина (Gibco, США), пирувата натрия (Gibco, США), 100 ед/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина (Gibco, США) и 8-10% эмбриональной телячьей сыворотки (Gibco, США). При достижении культурой 70-90% монослоя проводили пассирование клеток. Среду во флаконах с культивируемыми клетками меняли каждые 4 дня, субкультивирование продолжали на высоких пассажах. Морфологические характеристики МСК оценивали визуально с помощью фазовоконтрастного микроскопа (Axiovert 25, Zeiss, Германия), сопряженной с ним камеры и специального программного обеспечения (Sigma Scan Pro5). Оценка пролиферативной активности культур МСК проводилась путем подсчета числа клеток в случайно выбранных фиксированных полях зрения до и после инкубации. Иммунофенотипическая характеристика МСК проводилась с помощью метода проточной цитофлуориметрии (цитофлуориметр Beckman Coulter, США) с использованием моноклональных антител (BD Bioscience, США) к маркерам МСК. Использовались антитела как к позитивным маркерам (CD90, CD44, CD54, CD106, CD73), так и к негативным маркерам (CD45, CD11b, CD62L). Необходимое количество клеток (1·105-5·105) после трипсинизации и отмывки отбирали для окрашивания антителами в рекомендуемой концентрации в 100 мкл фосфатного буфера при 4°С в течение 30 минут. Оценка жизнеспособности МСК проводилась также цитофлуориметрически с использованием набора Annexin V FITC Kit (Immunotech, Франция) согласно инструкции производителя.The stromal progenitor cells used in the work were isolated from rat femurs. After resuspension, the cells were transferred to adhesion vials, after 2 days, the floating units were removed, the primary culture was washed and fresh culture medium was added. Α-MEM (ICN, USA or Biolot, Russia) with the addition of 2 mM L-glutamine (Gibco, USA), sodium pyruvate (Gibco, USA), 100 u / ml penicillin and 100 mg / ml of streptomycin (Gibco, USA) and 8-10% fetal calf serum (Gibco, USA). When the culture reached 70-90% of the monolayer, cells were passaged. The medium in bottles with cultured cells was changed every 4 days, subculture was continued at high passages. The morphological characteristics of MSCs were evaluated visually using a phase contrast microscope (Axiovert 25, Zeiss, Germany), an associated camera, and special software (Sigma Scan Pro5). The proliferative activity of MSC cultures was assessed by counting the number of cells in randomly selected fixed fields of view before and after incubation. Immunophenotypic characterization of MSCs was carried out using flow cytometry (Beckman Coulter cytofluorimeter, USA) using monoclonal antibodies (BD Bioscience, USA) to MSC markers. Antibodies were used both to positive markers (CD90, CD44, CD54, CD106, CD73), and to negative markers (CD45, CD11b, CD62L). The required number of cells (1 · 10 5 -5 · 10 5 ) after trypsinization and washing were selected for antibody staining in the recommended concentration in 100 μl of phosphate buffer at 4 ° C for 30 minutes. MSC viability was also assessed by cytofluorometry using the Annexin V FITC Kit (Immunotech, France) according to the manufacturer's instructions.
Однако получаемые при этом клетки обладали довольно высокой гетерогенностью, что делает их малопригодными для трансплантации. Кроме того, процесс получения достаточной массы клеток занимал значительное время - более 2-3 недель.However, the resulting cells had a fairly high heterogeneity, which makes them unsuitable for transplantation. In addition, the process of obtaining a sufficient mass of cells took a considerable time - more than 2-3 weeks.
Неожиданно нами было обнаружено, что культивирование стромальных клеток-предшественников костного мозга от 4 до 10 суток при использовании 1-2 пассажей в условиях гипоксии не только ускоряет пролиферацию клеток, но и приводит к снижению гетерогенности культуры, уменьшению количества апоптотических и некротических клеток при повышении ее пролиферативной активности и жизнеспособности клеток и при сохранении фенотипа и дифференцировочного потенциала, т.е. по сути нами была решена проблема ускоренного получения культур МСК с низкой гетерогенностью и высокой жизнеспособностью.We unexpectedly found that culturing stromal bone marrow progenitor cells from 4 to 10 days when using 1-2 passages under hypoxic conditions not only accelerates cell proliferation, but also leads to a decrease in culture heterogeneity, a decrease in the number of apoptotic and necrotic cells with an increase in it proliferative activity and cell viability, while maintaining the phenotype and differentiation potential, i.e. in fact, we solved the problem of accelerated production of MSC cultures with low heterogeneity and high viability.
Техническим результатом способа получения стволовых клеток с низкой гетерогенностью и высокой жизнеспособностью является повышение пролиферативной активности культуры стромальных клеток-предшественников, ускорения тем самым процесса получения клеток, снижение гетерогенности культуры за счет преобладания быстроделящихся однотипных клеток над крупными медленно пролиферирующими клетками, уменьшения количества апоптотических и некротических клеток, при сохранении фенотипических характеристик по основным маркерам (кластерам дифференцировки).The technical result of a method for producing stem cells with low heterogeneity and high viability is to increase the proliferative activity of a culture of stromal progenitor cells, thereby accelerating the process of obtaining cells, reducing the heterogeneity of the culture due to the predominance of rapidly dividing cells of the same type over large slowly proliferating cells, reducing the number of apoptotic and necrotic cells , while maintaining the phenotypic characteristics of the main markers (clusters of diff rentsirovki).
Технический результат достигался тем, что в известном способе ускоренного получения культур мезенхимальных стволовых клеток (МСК) с низкой гетерогенностью и высокой жизнеспособностью, включающем выделение клеток-предшественников и их последующее культивирование до получения целевой клеточной культуры при том, что культивирование ведут от 4 до 10 дней в условиях гипоксии с содержанием кислорода не менее 5%, используют клетки от 1-го до 2-го пассажей, после чего определяют количество апоптически и некротически поврежденных клеток, их морфологические характеристики, по экспрессии маркеров CD90, CD54, CD44, CD73, CD11b, CD45 определяют иммунофенотип клеток и при снижении суммарного количества апоптически и некротически поврежденных клеток не менее чем в 2 раза по сравнению с репрезентативными культурами в условиях нормоксии при полном сохранении имммунофенотипа МСК и при превышении числа быстроделящихся однотипных клеток над крупными медленно пролиферирующими клетками получаемую культуру считают культурой мезенхимальных клеток с низкой гетерогенностью и высокой жизнеспособностью.The technical result was achieved by the fact that in the known method of accelerated production of mesenchymal stem cell cultures (MSCs) with low heterogeneity and high viability, including the isolation of progenitor cells and their subsequent cultivation to obtain the target cell culture, while the cultivation is carried out from 4 to 10 days under hypoxia conditions with an oxygen content of at least 5%, cells from the 1st to 2nd passages are used, after which the number of apoptically and necrotic damaged cells, their morpho are determined The logical characteristics, according to the expression of the markers CD90, CD54, CD44, CD73, CD11b, CD45, determine the immunophenotype of the cells and, when the total number of apoptotic and necrotic cells is reduced by at least 2 times, compared to representative cultures under normoxia, while the MSC immunophenotype is fully preserved and with an excess of the number of rapidly dividing cells of the same type over large slowly proliferating cells, the resulting culture is considered a culture of mesenchymal cells with low heterogeneity and high viability.
В качестве клеток-предшественников использовали стромальные костномозговые клетки-предшественники.As precursor cells, stromal bone marrow progenitor cells were used.
Морфологически однотипными клетками культур для МСК из костного мозга крыс считают клетки, имеющие размер 20-60 мкм.Morphologically similar cells of cultures for MSCs from rat bone marrow are considered cells having a size of 20-60 microns.
Морфологически однотипными клетками для МСК культур, выделенных из костного мозга человека, считают клетки, имеющие размер 10-20 мкм.Morphologically the same type of cells for MSC cultures isolated from human bone marrow, consider cells having a size of 10-20 microns.
Способ осуществляют следующим образом.The method is as follows.
Для осуществления способа выделяли стромальные клетки-предшественники костного мозга по Javason (2001).To implement the method, stromal bone marrow progenitor cells were isolated according to Javason (2001).
В работе использовали 1-2 пассажи культур МСК, выделенных из диафизов бедренных и больших берцовых костей молодых беспородных крыс по описанной ранее методике [10].We used 1-2 passages of MSC cultures isolated from the diaphysis of the femur and tibia of young outbred rats according to the previously described method [10].
Стромальные клетки-предшественники, используемые в работе, выделяли из бедренных костей крыс. После ресуспендирования клетки переносили во флаконы для адгезии, через 2 суток удаляли флотирующие агрегаты, первичную культуру отмывали и добавляли свежую культуральную среду. В качестве среды для культивирования использовалась α-МЕМ (ICN, США или "Биолот", Россия) с добавлением 2 мМ L-глутамина (Gibco, США), пирувата натрия (Gibco, США), 100 ед/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина (Gibco, США) и 8-10% эмбриональной телячьей сыворотки (Gibco, США). При достижении культурой 70-90% монослоя проводили пассирование клеток. Среду во флаконах с культивируемыми клетками меняли каждые 4 дня, субкультивирование продолжали на высоких пассажах. Морфологические характеристики МСК оценивались визуально с помощью фазовоконтрастного микроскопа (Axiovert 25, Zeiss, Германия), сопряженной с ним камеры и специального программного обеспечения (Sigma Scan Pro5). Оценка пролиферативной активности культур МСК проводилась путем подсчета числа клеток в случайно выбранных фиксированных полях зрения до и после инкубации. Иммунофенотипическая характеристика МСК проводилась с помощью метода проточной цитофлуориметрии (цитофлуориметр Beckman Coulter, США) с использованием моноклональных антител (BD Bioscience, США) к маркерам МСК. Использовались антитела как к позитивным маркерам (CD90, CD44, CD54, CD106, CD73), так и к негативным маркерам (CD45, CD11b, CD62L). Необходимое количество клеток (1·105-5·105) после трипсинизации и отмывки отбирали для окрашивания антителами в рекомендуемой концентрации в 100 мкл фосфатного буфера при 4°С в течение 30 минут. Оценка жизнеспособности МСК проводилась также цитофлуориметрически с использованием набора Annexin V FITC Kit (Immunotech, Франция) согласно инструкции производителя.The stromal progenitor cells used in the work were isolated from rat femurs. After resuspension, the cells were transferred to adhesion vials, after 2 days, the floating units were removed, the primary culture was washed and fresh culture medium was added. Α-MEM (ICN, USA or Biolot, Russia) with the addition of 2 mM L-glutamine (Gibco, USA), sodium pyruvate (Gibco, USA), 100 u / ml penicillin and 100 mg / ml of streptomycin (Gibco, USA) and 8-10% fetal calf serum (Gibco, USA). When the culture reached 70-90% of the monolayer, cells were passaged. The medium in bottles with cultured cells was changed every 4 days, subculture was continued at high passages. The morphological characteristics of MSCs were evaluated visually using a phase contrast microscope (Axiovert 25, Zeiss, Germany), an associated camera, and special software (Sigma Scan Pro5). The proliferative activity of MSC cultures was assessed by counting the number of cells in randomly selected fixed fields of view before and after incubation. Immunophenotypic characterization of MSCs was carried out using flow cytometry (Beckman Coulter cytofluorimeter, USA) using monoclonal antibodies (BD Bioscience, USA) to MSC markers. Antibodies were used both to positive markers (CD90, CD44, CD54, CD106, CD73), and to negative markers (CD45, CD11b, CD62L). The required number of cells (1 · 10 5 -5 · 10 5 ) after trypsinization and washing were selected for antibody staining in the recommended concentration in 100 μl of phosphate buffer at 4 ° C for 30 minutes. MSC viability was also assessed by cytofluorometry using the Annexin V FITC Kit (Immunotech, France) according to the manufacturer's instructions.
Для создания гипоксии в среде культивирования использовали герметичную камеру (Stem Cell Technologies, Канада), в которую подавали газовую смесь (95% N2, 5% CO2) до установления в среде концентрации кислорода 5%. Содержание кислорода и давление в газовой среде контролировали с помощью встроенных в камеру датчиков. Контрольные клетки находились в стандартных нормоксических условиях CO2 инкубатора с 5% CO2.To create hypoxia in the culture medium, a sealed chamber (Stem Cell Technologies, Canada) was used, into which a gas mixture (95% N 2 , 5% CO 2 ) was supplied until an oxygen concentration of 5% was established in the medium. The oxygen content and pressure in the gas medium were monitored using sensors built into the chamber. Control cells were under standard normoxic conditions of a CO 2 incubator with 5% CO 2 .
Результаты осуществления способаThe results of the method
В большинстве культур к четвертому пассажу наблюдался спад пролиферативной активности, характеризующийся доминированием медленно делящихся распластанных клеток. При дальнейшем субкультивировании это так называемое "пролиферативное торможение" сменялось подъемом и стабилизацией пролиферативной активности, что сопровождалось доминированием в культуре однородных по морфологии клеток. В работе использовались МСК на ранних пассажах (до второго), т.е. до момента, когда в культурах наблюдалось пролиферативное торможение. При оценке морфологических характеристик МСК, культивируемых в разных условиях, было показано, что гипоксия стимулировала образование островков из небольших по размеру клеток с однородной по оптической плотности цитоплазмой.In most cultures, by the fourth passage, a decrease in proliferative activity was observed, characterized by the dominance of slowly dividing spread cells. With further subcultivation, this so-called "proliferative inhibition" was replaced by a rise and stabilization of proliferative activity, which was accompanied by the dominance of homogeneous morphological cells in the culture. MSCs were used in the work in the early passages (up to the second), i.e. until the time when proliferative inhibition was observed in cultures. When assessing the morphological characteristics of MSCs cultivated under different conditions, it was shown that hypoxia stimulated the formation of islands from small-sized cells with a homogeneous optical density of the cytoplasm.
Количество и размер таких островков были больше в гипоксических культурах (чертеж). В условиях гипоксии также снижалась доля варьирующих по размеру и разнородных по морфологическим особенностям крупных (60-200 мкм), распластанных, медленно делящихся клеток. Таким образом, гипоксия снижала степень гетерогенности культур МСК, увеличивая долю однотипных, небольших по размеру клеток (20-60 мкм). Можно предположить, что более низкая пролиферативная активность крупных распластанных клеток в культуре отражали степень их повреждения в условиях окислительного стресса при культивировании клеток в нормоксии (21% О2). Снижение концентрации кислорода обуславливало уменьшение интенсивности окислительного стресса, вероятно, влияющего на долю крупных распластанных клеток, также называемых некоторыми авторами "зрелыми" МСК [10] в культуре. Торможение пролиферации и морфологические особенности этих клеток, возможно, отражают степень их повреждения в условиях окислительного стресса.The number and size of such islands were larger in hypoxic cultures (drawing). Under conditions of hypoxia, the proportion of large (60-200 μm), spread out, slowly dividing cells varying in size and heterogeneous in morphological features also decreased. Thus, hypoxia reduced the degree of heterogeneity of MSC cultures, increasing the proportion of cells of the same type, small in size (20-60 microns). It can be assumed that the lower proliferative activity of large spread cells in the culture reflected the degree of their damage under conditions of oxidative stress during cell cultivation in normoxia (21% O 2 ). A decrease in oxygen concentration caused a decrease in the intensity of oxidative stress, which probably affects the proportion of large spread cells, which are also called by some authors “mature” MSCs [10] in culture. The inhibition of proliferation and the morphological features of these cells may reflect the degree of their damage under conditions of oxidative stress.
Пролиферативная активность МСК оценивалась по увеличению количества клеток в рандомически выбранных полях зрения после четырех суток культивирования МСК на 1-2 пассажах. Было показано, что гипоксия статистически достоверно стимулировала пролиферативную активность клеток-предшественников, что согласуется с данными других исследователей [5, 8, 11]. При культивировании клеток в условиях гипоксии их число увеличилось в среднем в 7 раз, в то время как в нормоксических условиях количество клеток возросло в среднем лишь в 2,1 раза. Следует отметить, однако, что прирост количества клеток в нормоксических культурах варьировал, отражая, вероятно, индивидуальные особенности животных, из костного мозга которых были выделены клетки; особенности определенных этапов культивирования; а также неспецифичность метода выделения МСК, не позволяющего получение при каждом выделении стандартной по ряду характеристик популяции клеток. Механизм активации пролиферации МСК при гипоксии связан, вероятно, с индукцией некоторых киназных каскадов, таких как SAP-киназные сигнальные пути (JNK и р38), активируемых обычно в ответ на стрессовые факторы и приводящих к стимуляции пролиферативной активности клеток [14].The proliferative activity of MSCs was evaluated by increasing the number of cells in randomly selected fields of view after four days of culturing MSCs in 1-2 passages. It was shown that hypoxia statistically significantly stimulated the proliferative activity of progenitor cells, which is consistent with data from other researchers [5, 8, 11]. When cells were cultured under hypoxic conditions, their number increased on average by 7 times, while under normal toxic conditions, the number of cells increased by an average of only 2.1 times. It should be noted, however, that the increase in the number of cells in normoxic cultures varied, probably reflecting the individual characteristics of animals from which bone cells were isolated; features of certain stages of cultivation; as well as the non-specificity of the method for isolating MSCs, which does not allow obtaining, at each isolation, a standard for a number of characteristics of the cell population. The mechanism of activation of MSC proliferation during hypoxia is probably associated with the induction of certain kinase cascades, such as SAP kinase signaling pathways (JNK and p38), which are usually activated in response to stress factors and lead to stimulation of cell proliferative activity [14].
Оценка жизнеспособности клеток при их культивировании в нормо- и гипоксических условиях показала, что процент как апоптотических, так и некротических клеток был примерно в два раза ниже в гипоксических культурах по сравнению с нормоксическими (Таблица 1), т.е. стимулирующий эффект гипоксии на пролиферацию клеток-предшественников на ранних этапах культивирования сопровождался отсутствием ее повреждающего действия на клетки. Следует отметить, что естественной средой для стромальных клеток-предшественников in vivo является костный мозг, где содержание кислорода не превышает 5%, что может быть связано с цитопротекторной ролью гипоксии на ранних этапах культивирования, до появления устойчивой к новым условиям стабильно пролиферирующей популяции клеток. С другой стороны, есть данные, что в некоторых случаях гипоксия может опосредовать образование ряда антиапоптотических белков [9].Assessment of cell viability during their cultivation under normal and hypoxic conditions showed that the percentage of both apoptotic and necrotic cells was approximately two times lower in hypoxic cultures compared to normoxic ones (Table 1), i.e. The stimulating effect of hypoxia on proliferation of progenitor cells in the early stages of cultivation was accompanied by the absence of its damaging effect on cells. It should be noted that the natural environment for stromal precursor cells in vivo is bone marrow, where the oxygen content does not exceed 5%, which may be associated with the cytoprotective role of hypoxia in the early stages of cultivation, until a stable proliferating cell population appears resistant to new conditions. On the other hand, there is evidence that in some cases hypoxia can mediate the formation of a number of antiapoptotic proteins [9].
Проведение иммунофенотипической характеристики культур, находившихся в нормо- и гипоксических условиях, показало, что гипоксия не изменяет значительно экспрессию поверхностных маркеров, характерных для МСК, но снижает и без того небольшое количество клеток, экспрессирующих гемопоэтические маркеры, стимулируя образование более гомогенной по иммунофенотипическим показателям популяции клеток-предшественников (Таблица 2).The immunophenotypic characterization of cultures under normal and hypoxic conditions showed that hypoxia does not significantly alter the expression of surface markers characteristic of MSCs, but reduces the already small number of cells expressing hematopoietic markers, stimulating the formation of a population of cells more homogeneous in terms of immunophenotypic parameters precursors (table 2).
Таким образом, культивирование клеток в условиях 5% O2 оказывало стимулирующий эффект на стромальные клетки-предшественники из костного мозга крыс на ранних этапах культивирования, что выражалось в изменении соотношения морфологических типов клеток в культуре; стимуляции пролиферативной активности клеток; отсутствии повреждающего и/или наличии протективного воздействия на клетки; снижении доли клеток, экспрессирующих гемопоэтические маркеры.Thus, cell cultivation under conditions of 5% O 2 had a stimulating effect on stromal progenitor cells from rat bone marrow in the early stages of cultivation, which was manifested in a change in the ratio of morphological cell types in culture; stimulation of proliferative activity of cells; the absence of a damaging and / or protective effect on the cells; reducing the proportion of cells expressing hematopoietic markers.
Источники информацииInformation sources
1. Анохина Е.Б., Григорьева О.В., Буравкова Л.Б // Материалы VI Международной конференции "Молекулярная генетика соматических клеток" 2005., Звенигород, с.861. Anokhina EB, Grigoryeva OV, Buravkova LB // Materials of the VI International conference "Molecular genetics of somatic cells" 2005., Zvenigorod, p.86
2. Лагарькова М.А., Лякишева А.В., Филоненко Е.С и др. // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2006. - №1. - с.3-7.2. Lagarkova MA, Lyakisheva AV, Filonenko E.S. et al. // Cellular technologies in biology and medicine. - 2006. - No. 1. - p. 3-7.
3. Паюшина О.В., Домарацкая Е.И., Старостин В.И. // Известия РАН. Серия биологическая. - 2006. - №1. - С.6-25.3. Payushina OV, Domarackaya EI, Starostin V.I. // Proceedings of the RAS. Biological Series. - 2006. - No. 1. - S.6-25.
4. Чертков И.Л., Дризе Н.И. // Вестник Российской АМН. - 2005. - №10. - С.37-44.4. Chertkov I.L., Drize N.I. // Bulletin of the Russian Academy of Medical Sciences. - 2005. - No. 10. - S. 37-44.
5. Annabi В., Lee Y.T., Turcotte S. et al. // Stem Cells. - 2003. - Vol.21. - P.337-347.5. Annabi B., Lee Y. T., Turcotte S. et al. // Stem Cells. - 2003 .-- Vol.21. - P.337-347.
6. Barry P.P., Murphy M.J. // The International Journal of Biochemistry and Cell biology. - 2004. - Vol.36. - P.568-584.6. Barry P.P., Murphy M.J. // The International Journal of Biochemistry and Cell biology. - 2004 .-- Vol.36. - P.568-584.
7. Bianco P., Riminucci M., Gronthos S., Robey P.G. // Stem Cells. - 2001. - Vol.19. - P. 180-192.7. Bianco P., Riminucci M., Gronthos S., Robey P.G. // Stem Cells. - 2001. - Vol.19. - P. 180-192.
8. Cipolleschi M.G., Rovida E., Ivanovic Z. et al. // Leukemia. - 2000. - Vol.14. - P.735-739.8. Cipolleschi M.G., Rovida E., Ivanovic Z. et al. // Leukemia. - 2000. - Vol.14. - P.735-739.
9. Greijer A.E., van der Wall E. // Journal of Clinical Pathology. - 2004. - Vol.57. - P.1009-1014.9. Greijer A.E., van der Wall E. // Journal of Clinical Pathology. - 2004 .-- Vol. 57. - P.1009-1014.
10. Javazon E.H., Colter D.C., Schwarz E.J., Prockop D.J. // Stem Cells. - 2001. - Vol.19, N 3. - P.219-225.10. Javazon E.H., Colter D.C., Schwarz E.J., Prockop D.J. // Stem Cells. - 2001. - Vol.19, N 3. - P.219-225.
11. Lennon D.P., Edmison J.M., Caplan A.I. // J Cell Physiol. - 2001. - Vol.187, N3. - P.345-355.11. Lennon D.P., Edmison J.M., Caplan A.I. // J Cell Physiol. - 2001 .-- Vol. 187, N3. - P.345-355.
12. Minguel J.J., Erices A., Conget P. // Experimental biology and medicine. - 2001. - Vol.226. - P.507-520.12. Minguel J.J., Erices A., Conget P. // Experimental biology and medicine. - 2001 .-- Vol.226. - P.507-520.
13. Prockop D.J. // Science. - 1997. - Vol.276. - P.71-74.13. Prockop D.J. // Science. - 1997 .-- Vol.276. - P.71-74.
14. Scott P.H., Paul A., Belham C.M. et al. // Am J Respir Crit Care Med. - 1998. - Vol.158. - P.958-962.14. Scott P.H., Paul A., Belham C.M. et al. // Am J Respir Crit Care Med. - 1998 .-- Vol. 158. - P.958-962.
15. Патент US 7060494 от 13.06.2006 г., класс 435/366, C12N 5/00.15. Patent US 7060494 from 06.13.2006, class 435/366, C12N 5/00.
Claims (4)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2007119977/13A RU2331670C1 (en) | 2007-05-30 | 2007-05-30 | Method of accelerated acquiring of mesenchymal stem cells (msc) culture of mammals, except human, with low heterogeneity and high viability |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2007119977/13A RU2331670C1 (en) | 2007-05-30 | 2007-05-30 | Method of accelerated acquiring of mesenchymal stem cells (msc) culture of mammals, except human, with low heterogeneity and high viability |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2331670C1 true RU2331670C1 (en) | 2008-08-20 |
Family
ID=39748031
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2007119977/13A RU2331670C1 (en) | 2007-05-30 | 2007-05-30 | Method of accelerated acquiring of mesenchymal stem cells (msc) culture of mammals, except human, with low heterogeneity and high viability |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2331670C1 (en) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2443778C1 (en) * | 2010-08-27 | 2012-02-27 | Государственное Учебно-Научное Учреждение Факультет Фундаментальной Медицины Московского Государственного Университета Имени М.В. Ломоносова | Method for improving angiogenic potential of fat mesenchymal stem cells |
| RU2525143C1 (en) * | 2013-03-22 | 2014-08-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр Российской Федерации-Институт медико-биологических проблем Российской академии наук | METHOD FOR CORD BLOOD MONONUCLEAR CELLS (cbMNC) EXPANSION ex vivo IN PRESENCE OF MULTIPOTENT MESENCHYMAL STROMAL CELLS (MMSCS) |
| RU2722173C1 (en) * | 2019-06-18 | 2020-05-28 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства" | Method for predicting growth rate of culture by amount of aldehyde dehydrogenase-positive bone marrow mesenchymal cells of donors |
| US20220072059A1 (en) * | 2008-12-05 | 2022-03-10 | Regenerative Sciences, Llc | Methods and compositions to facilitate repair of avascular tissue |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2280462C2 (en) * | 2004-04-09 | 2006-07-27 | Александр Сергеевич Тепляшин | Method for detaching mesenchyma trunk cells |
-
2007
- 2007-05-30 RU RU2007119977/13A patent/RU2331670C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2280462C2 (en) * | 2004-04-09 | 2006-07-27 | Александр Сергеевич Тепляшин | Method for detaching mesenchyma trunk cells |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20220072059A1 (en) * | 2008-12-05 | 2022-03-10 | Regenerative Sciences, Llc | Methods and compositions to facilitate repair of avascular tissue |
| RU2443778C1 (en) * | 2010-08-27 | 2012-02-27 | Государственное Учебно-Научное Учреждение Факультет Фундаментальной Медицины Московского Государственного Университета Имени М.В. Ломоносова | Method for improving angiogenic potential of fat mesenchymal stem cells |
| RU2525143C1 (en) * | 2013-03-22 | 2014-08-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр Российской Федерации-Институт медико-биологических проблем Российской академии наук | METHOD FOR CORD BLOOD MONONUCLEAR CELLS (cbMNC) EXPANSION ex vivo IN PRESENCE OF MULTIPOTENT MESENCHYMAL STROMAL CELLS (MMSCS) |
| RU2722173C1 (en) * | 2019-06-18 | 2020-05-28 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства" | Method for predicting growth rate of culture by amount of aldehyde dehydrogenase-positive bone marrow mesenchymal cells of donors |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101378874B1 (en) | Immunomodulation using placental stem cells | |
| US10358629B2 (en) | Regulating stem cells | |
| US8697441B2 (en) | Method of inducing high activity of human adipose stem cell and medium therefor | |
| WO2011101834A1 (en) | A method for obtaining mesenchymal stem cells, media, methods and composition thereof | |
| CN101631852A (en) | Methods and compositions for treating bone defects with placental cell populations | |
| KR20060010847A (en) | Isolated pluripotent adult stem cells and methods for isolation and culture thereof | |
| JP5570814B2 (en) | Muscle-derived cells for the treatment of gastroesophageal pathology and their preparation and use | |
| WO2013146992A1 (en) | Method for producing pluripotent stem cells derived from dental pulp | |
| CN115361960A (en) | Methods for treating chronic graft versus host disease | |
| RU2331670C1 (en) | Method of accelerated acquiring of mesenchymal stem cells (msc) culture of mammals, except human, with low heterogeneity and high viability | |
| US11834679B2 (en) | Method for producing cardiomyocytes | |
| EP2845898B1 (en) | Method for culturing neural crest stem cells, and use thereof | |
| US9404084B2 (en) | Regulating stem cells | |
| KR101895648B1 (en) | Pharmaceutical composition for treatment of neurological diseases comprsing dental pulp stem cell and method for preparing the same | |
| CN118931830A (en) | Application of human umbilical cord highly active mesenchymal stem cells | |
| JP7554436B2 (en) | Method for culturing cell populations and use thereof | |
| WO2021227573A1 (en) | Xeno-free culture medium and method for expansion of mesenchymal stem cells by means of using same | |
| RU2631005C1 (en) | Method for human salivary gland cells cultivation | |
| US20090148416A1 (en) | Angiogenically induced transplants and methods for their use and manufacture | |
| Citro et al. | Mesenchymal Stem Cells | |
| CN115461448B (en) | Method for culturing cell population containing cartilage-derived Tie2 positive cells and application thereof | |
| Phruksaniyom et al. | Effect of Culture Conditions on Colony-Forming Ability of Stem Cells from Human Exfoliated Deciduous Teeth. | |
| IL193947A (en) | Cultured cells that stain as cd31bright, method for stimulating the same to differentiate into a progenitor/precursor cell population (pcp), use of said pcp in the preparation of medicaments and apparatus for implantation comprising the same |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| RH4A | Copy of patent granted that was duplicated for the russian federation |
Effective date: 20090130 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20150531 |