RU2378372C2 - Генетическая конструкция для обеспечения экспрессии целевых гомологичных и гетерологичных генов в клетках мицелиального гриба penicillium verruculosum, используемого в качестве хозяина, способ получения штамма гриба penicillium verruculosum и способ получения ферментного препарата - Google Patents
Генетическая конструкция для обеспечения экспрессии целевых гомологичных и гетерологичных генов в клетках мицелиального гриба penicillium verruculosum, используемого в качестве хозяина, способ получения штамма гриба penicillium verruculosum и способ получения ферментного препарата Download PDFInfo
- Publication number
- RU2378372C2 RU2378372C2 RU2008107784/13A RU2008107784A RU2378372C2 RU 2378372 C2 RU2378372 C2 RU 2378372C2 RU 2008107784/13 A RU2008107784/13 A RU 2008107784/13A RU 2008107784 A RU2008107784 A RU 2008107784A RU 2378372 C2 RU2378372 C2 RU 2378372C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- gene
- verruculosum
- enzyme
- penicillium verruculosum
- strain
- Prior art date
Links
- 241001516650 Talaromyces verruculosus Species 0.000 title claims abstract description 66
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 title claims abstract description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 37
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 title description 2
- 108010008885 Cellulose 1,4-beta-Cellobiosidase Proteins 0.000 claims abstract description 44
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 34
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims abstract description 34
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 claims abstract description 6
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims abstract description 6
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims abstract description 6
- 101710121765 Endo-1,4-beta-xylanase Proteins 0.000 claims description 21
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 13
- 101100382641 Aspergillus aculeatus cbhB gene Proteins 0.000 claims description 12
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 claims description 12
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 9
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 9
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 6
- 101000649352 Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (strain 4287 / CBS 123668 / FGSC 9935 / NRRL 34936) Endo-1,4-beta-xylanase A Proteins 0.000 claims description 6
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 4
- 229920001221 xylan Polymers 0.000 claims description 4
- 150000004823 xylans Chemical class 0.000 claims description 4
- 241000223262 Trichoderma longibrachiatum Species 0.000 claims description 3
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 claims description 3
- 238000004362 fungal culture Methods 0.000 claims 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 35
- 230000009466 transformation Effects 0.000 abstract description 5
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 abstract 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 abstract 1
- 150000003738 xylenes Chemical class 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 22
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 18
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 15
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 12
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 12
- 101150095344 niaD gene Proteins 0.000 description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 12
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 11
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 10
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 9
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 9
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108010002430 hemicellulase Proteins 0.000 description 7
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 7
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 6
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 6
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 6
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 6
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 108010084185 Cellulases Proteins 0.000 description 4
- 102000005575 Cellulases Human genes 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 4
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 4
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 description 4
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 229940059442 hemicellulase Drugs 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 3
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 3
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 241000228172 Penicillium canescens Species 0.000 description 3
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 3
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 3
- 238000007852 inverse PCR Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 210000004196 psta Anatomy 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- 235000018185 Betula X alpestris Nutrition 0.000 description 2
- 235000018212 Betula X uliginosa Nutrition 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- 101710111935 Endo-beta-1,4-glucanase Proteins 0.000 description 2
- 229920002488 Hemicellulose Polymers 0.000 description 2
- 241001480714 Humicola insolens Species 0.000 description 2
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 2
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 229930182478 glucoside Natural products 0.000 description 2
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 2
- 239000003262 industrial enzyme Substances 0.000 description 2
- 239000012978 lignocellulosic material Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Chemical compound [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 108010011619 6-Phytase Proteins 0.000 description 1
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 101150098499 III gene Proteins 0.000 description 1
- 101150031639 IV gene Proteins 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 108090000913 Nitrate Reductases Proteins 0.000 description 1
- 101150084044 P gene Proteins 0.000 description 1
- 108010029182 Pectin lyase Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 1
- 241001136494 Talaromyces funiculosus Species 0.000 description 1
- 241000228178 Thermoascus Species 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 108010089934 carbohydrase Proteins 0.000 description 1
- 108010085318 carboxymethylcellulase Proteins 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006151 minimal media Substances 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229940085127 phytase Drugs 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004317 sodium nitrate Substances 0.000 description 1
- RPACBEVZENYWOL-XFULWGLBSA-M sodium;(2r)-2-[6-(4-chlorophenoxy)hexyl]oxirane-2-carboxylate Chemical compound [Na+].C=1C=C(Cl)C=CC=1OCCCCCC[C@]1(C(=O)[O-])CO1 RPACBEVZENYWOL-XFULWGLBSA-M 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 235000015099 wheat brans Nutrition 0.000 description 1
- -1 which are promoter Proteins 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения фермента, предпочтительно целлюлазы или ксиланазы, расщепляющих целлюлозу или ксиланы соответственно, путем культивирования штамма гриба Penicillium verruculosum. При этом указанный штамм получают трансформацией клетки гриба Penicillium verruculosum генетической конструкцией, содержащей целевую кодирующую последовательность фермента, функционально связанную с регуляторными элементами гена целлобиогидролазы I Penicillium verruculosum, которые представляют собой промотор и терминатор гена целлобиогидролазы I, a сигнальный пептид при этом зависит от того, каков целевой фермент. Изобретение позволяет получать ферменты с высокой степенью эффективности. 3 н. и 3 з.п. ф-лы, 1 табл., 6 ил.
Description
Изобретение в области биотехнологии относится к микробиологической промышленности и представляет собой способ получения ферментных препаратов с карбогидразной активностью путем культивирования мультикопийных штаммов мицелиальных грибов рода Penicillium verruculosum, трансформированных фрагментами ДНК с клонированными гомологичными и гетерологичными генами.
Энергетические потребности человечества на настоящем этапе его развития требуют привлечения возобновляемых источников энергии, в первую очередь растительной биомассы. Основа процесса биоконверсии растительной биомассы заключается в ферментативном гидролизе целлюлозы и гемицеллюлозы до сахаров с их последующей переработкой путем сбраживания в этанол или превращения в другие продукты микробного синтеза.
В глобальном процессе разложения растительной биомассы основную роль выполняют бактерии и мицелиальные грибы. Глубокая деструкция целлюлозы и гемицеллюлозы осуществляется под действием полиферментных систем целлюлаз и гемицеллюлаз (ксиланаз). В настоящее время во многих странах ведется поиск новых грибных продуцентов целлюлаз и гемицеллюлаз. Наибольшее распространение получили грибные продуценты, представители рода Trichoderma, которые обладают высокой секреторной способностью. В свою очередь грибы рода Penicillium синтезируют ферментные комплексы целлюлаз и гемицеллюлаз более сбалансированного состава и эффективнее расщепляют целлюлозу и содержащее ее растительное сырье. При этом индивидуальные ферменты Penicillium обладают высокой каталитической активностью и операционной стабильностью.
В последнее десятилетие получили широкое распространение мультикопийные грибные суперпродуценты ферментов, у которых амплификация генов, кодирующих секретируемые ферменты, позволила резко увеличить продуктивность штаммов микроорганизмов для получения дешевых промышленных ферментов. К известным мультикопийным продуцентам эндо-β1,4-глюканаз относятся штаммы на основе Trichoderma longibrachiatum [Clarkson et al., 1995, US Patent 5,419,778], Tr.reesei [Saloheimo et al., 1994, WO Patent 94/28117] и Humicola insolens [Rasmussen et al., 1991, Patent WO 91/17243]. Известны различные грибные мультикопийные продуценты ксиланаз - Aspergillus niger [van den Broek et al., 1994, US Patent 5,358,864], Tr.reesei [Nevalainen et al., 1994, US Patent 5,298,405], Thermoascus auranticus [Yu et al., 1990, US Patent 4,966,850], H.insolens [Schulein et al., 1997, US Patent 5,610,048].
Из грибов рода Penicillium большой интерес представляют Penicillium verruculosum.
Прототипом разработанного технического решения может служить патент РФ №2288267 '"Способ получения кормового комплексного ферментного препарата (варианты) и штамм Penicillium canescens (варианты)", в котором охарактеризован способ получения препаратов с высокой эндоглюканазной, ксиланазной, фитазной и пектин-лиазной активностью при ферментации мультикопийных штаммов P.canescens, в которых у включенных копий генов регуляторная область была представлена промоторами либо гена β-галактозидазы или гена ксиланазы P.canescens.
Техническая задача, решаемая группой разработанных технических решений, состоит в разработке способа получения ферментных препаратов с различными типами целлюлазной и гемицеллюлазной (ксиланазной) активности при ферментации мультикопийных штаммов, полученных при трансформации реципиентных высокопродуктивных штаммов P.verruculosum клонированными участками ДНК с гомологичными и гетерологичными генами, кодирующими ферменты целлюлазы и гемицеллюлазы (ксиланазы).
Технический результат, получаемый при реализации разработанных технических решений, состоит в получении промышленных ферментных препаратов с высокой активностью индивидуальных ферментов целлюлаз и гемицеллюлаз (ксиланаз) при ферментации новых мультикопийных штаммов грибов рода Penicillium, полученных с привлечением технологии рекомбинантных молекул ДНК.
Для получения указанного технического результата предложено использовать генетическую конструкцию для обеспечения экспрессии целевых гомологичных и гетерологичных генов в клетках мицелиального гриба P.verruculosum, используемого в качестве хозяина, содержащую целевую кодирующую последовательность, функционально связанную с регуляторными элементами гена целлобиогидролазы I P.verruculosum, которые представляют собой промотор, сигнальный пептид и терминатор гена целлобиогидролазы I.
Также для получения указанного технического результата предложено использовать способ получения штамма гриба P.verruculosum - продуцента фермента, кодируемого гомологичной или гетерологичной нуклеотидной последовательностью, предусматривающей трансформацию клетки гриба P.verruculosum генетической конструкцией, содержащей целевую кодирующую последовательность, функционально связанную с регуляторными элементами гена целлобиогидролазы I P.verruculosum, которые представляют собой промотор, сигнальный пептид и терминатор гена целлобиогидролазы I.
Кроме того, для получения указанного технического результата предложено использовать способ получения ферментного препарата, включающего ферменты целлюлазы и гемицеллюлазы (ксиланазы), путем культивирования микроорганизмов, причем указанным выше способом получают штамм гриба P.verruculosum, осуществляют культивирование полученного штамма и выделяют целевой продукт из культуральной жидкости гриба. В первом варианте реализации указанного способа для получения ферментного препарата получают штамм P.verruculosum PV-Cbh1P (BKM F-3973D), мультикопийный по гомологичному гену cbhI - целлобиогидролазы I P.verruculosum. Во втором варианте реализации указанного способа для получения ферментного препарата получают штамм P.verruculosum PV-Egl4T (BKM F-3976D), мультикопийный по гетерологичному гену eglIV - эндоглюканазы IV Tr.longibrachiatum. В третьем варианте реализации указанного способа для получения ферментного препарата получают штамм P.verruculosum PV-Xyl3T (BKM F-3979D), мультикопийный по гетерологичному гену xylIII - ксиланазы III Tr.longibrachiatum.
Указанные варианты не исчерпывают возможности разработанного способа.
Схема разработки способа получения каждого из ферментных препаратов, обладающего одной из целлюлазной или ксиланазной активностей, складывется из выполнения одного подготовительного и трех типовых этапов.
Подготовительный этап.Выделяют ген, кодирующий целлобиогидролазу I P.verruculosum и конструируют экспрессионный вектор для трансформации клеток P.verruculosum, в котором ген целевого белка сопряжен с регуляторными последовательностями (промотор и терминатор) гена, кодирующего целлобиогидролазу I Р.verruculosum.
Этап 1. Путем клонирования в фаговом векторе или ПЦР-синтезом получают фрагмент ДНК, кодирующий ген каждого из перечисленных ферментов с полной регуляторной областью или только структурную часть последовательности, кодирующую зрелый белок. Включают этот фрагмент ДНК в структуру векторной молекулы. Получают экспрессионную плазмиду, в которой нуклеотидная последовательность структурной части целевого гена функционально совмещена с нуклеотидной последовательностью, кодирующей промоторную область и сигнальный пептид гена cbhI целлобиогидролазы I P.verruculosum (или линейный фрагмент ДНК, содержащий нуклеотидную последовательность гена и указанные выше регуляторные области).
Этап 2. Каждой экспрессионной плазмидой с включенным геном (или фрагментом ДНК в линейной форме) проводят трансформацию реципиентного высокопродуктивного штамма P.verruculosum 537(niaD-) в условиях котрансформации вместе с плазмидой (или фрагментом ДНК в линейной форме), несущей последовательность niaD гена, как маркера селекции, и осуществляют отбор трансформантов, секретирующих в культуральную жидкость искомую активность. Проводят ферментацию отобранных трансформантов в качалочных колбах и среди них выбирают наиболее продуктивный вариант(ы) штамма-продуцента.
Этап 3. Проводят процесс ферментации отобранного наиболее активного варианта штамма-продуцента в ферментерах, получают и характеризуют ферментные препараты с высокой активностью целевого фермента.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Выделение и секвенирование фрагмента ДНК, несущего cbhI ген целлобиогидролазы P.verruculosum (целлобиогидролаза I 7-го семейства гликозид-гидролаз, молекулярная масса 66 кДа), и получение векторной плазмиды pUC-LIC на основе структурных элементов этого гена.
На базе гомологии аминокислотных и нуклеотидных последовательностей грибных целлобиогидролаз семейства 7 глюкозид-гидролаз синтезируют два олигонуклеотидных праймера:
(1) 5'-ACCAACTGCTACACCGGCAACACCTGG-3'
(2) 5'CGGTAAGGGTTGAA(G/A)TCACA(G/A)TC(G/A)CAICCATC-3',
где I - инозин.
Далее с помощью ПЦР полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтезируют внутренний фрагмент ДНК гена целлобиогидролазы I размером 660 п.н. В качестве матрицы для ПЦР используют геномную ДНК штамма P.verruculosum, выделенную из мицелия. Нуклеотидную последовательность полученного фрагмента определяют методом Сэнгера по обеим цепям. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей ДНК пробы и генов грибных целлобиогидролаз показывает, что максимальная гомология между последовательностью выделенной ДНК пробы и последовательностями целлобиогидролаз из P.funiculosum и P.occitanis составляет 90% и 89% соответственно, что позволяет отнести полученную последовательность к фрагменту целлобиогидролазы I семейства 7 глюкозид-гидролаз.
Для получения полноразмерного гена целлобиогидролазы I P.verruculosum применяют метод инверсного ПЦР. Для этого геномную ДНК P.verruculosum обрабатывают рестриктазами EcoRI, SalI, XbaI, PstI и циркулизируют при помощи Т4 ДНК лигазы, что являлось матрицей для инверсного ПЦР. Для амплифицирования оставшихся участков гена целлобиогидролазы используют два противоположно направленных олигонуклеотидных праймера.
(3) 5'-AACAACTCCAACACCGGAATCGGCAACCAC-3'
(4) 5'-AACCGGTGACGAAGTTGAGACGCAACGAGT-3'
На ДНК-матрице, полученной при гидролизе геномной ДНК с использованием рестриктазы EcoRI максимальная величина амплифицированного ПЦР фрагмента достигает 2000 п.н. Нуклеотидную последовательность ДНК гена определяют по обеим цепям методом Сэнгера. Ген целлобиогидролазы I P.verruculosum состоит из 1575 п.н. и не содержит интронов. Транслированная аминокислотная последовательность целлобиогидролазы I включает в себя 525 аминокислот.
Чтобы определить структуру промотора и терминатора гена целлобиогидролазы I применяют метод инверсного ПЦР. Используют праймеры (3) и (4), а также синтезируют новые праймеры (5), (6) и (7) для секвенирования ДНК промоторной части гена в 5'-нетранслируемой области:
(5) 5'-GATAATGTCTGATTCTTCAAGGGAA-3'
(6) 5'-GCTTCAGCCTCTGCTCTCCA-3'
(7) 5'-GACTGGAGACGAGCTGACAGCA-3'
В качестве матрицы используют лигированную геномную ДНК, предварительно обработанную эндонуклеазой рестрикции HindIII. Амплифицированный ПЦР фрагмент имеет размер в 3500 п.н. и его структуру определяют методом Сэнгера по обеим цепям при использовани праймеров для амплификации. Промоторный район из 1303 п.н. содержит структурные элементы, свойственные промоторам эукариотических генов - ТАТА бокс (-90 п.н. от стартового кодона), транскрипционную область (-65 п.н. от стартового кодона) и CreI участок (-492 п.н. от стартового кодона). Аналогичным способом изучают последовательность гена целлобиогидролазы в 3'-нетранслируемой области, что позволило идентифицировать ее как терминаторную часть гена. Общая структура cbhI гена P.verruculosum - промотора, участка гена cbhI, кодирующего сигнальный пептид и зрелый белок целлобиогидролазы I, и терминатора представлена на фиг.1.
Для облегчения дальнейших шагов по клонированию гомологичных и гетерологичных белков штамма-продуцента P.verruculosum конструируют универсальный вектор на основе двух известных плазмид pUC19 и pLIC-SGC. NdeI-HindIII фрагмент плазмиды pLIC выделяют и клонируют в плазмиду pUC19, разрезанную по тем же сайтам рестрикции. Полученный вектор был назван pUC-LIC. Линеаризацию плазмиды pUC-LIC проводят путем разрезания BseRI, что приводит к экспонированию двух сайтов для лигирования ПЦР фрагментов - 5'-ТАСТТССААТССАТ-3' и 5'-AGTAAAGGTGGAT-3'. После обработки вектора и клонируемой вставки Т4 ДНК полимеразой в условиях проявления ее эндонуклеазной активности (в смеси только с одним нуклеотидом) на векторе и на вставке образуются два комплементарных одноцепочечных участка, которые соответственно лигируются. Также в результате линеаризации вектора pUC-LIC из исходного вектора удаляется ген SacB, что обеспечивает дополнительную селекцию колоний на чашках Петри с сахарозой после клонирования в pUC-LIC. Схематическое изображение вектора pUC-LIC показано на фиг.2.
Пример 2. Получение ферментных препаратов с увеличенной целлобиогидролазной активностью при ферментации штаммов P.verruculosum, мультикопийных по cbhI гену P.verruculosum (ген целлобиогидролазы I, 7-е семейство гликозид-гидролаз, молекулярная масса 66 кДа).
На первом этапе получают экспрессионную плазмиду pCBH1-12, в которой клонированная нуклеотидная последовательность полного cbhI гена P.verruculosum соединена с гомологичными районами промоторной области, сигнального пептида и терминаторной области. Для этой цели синтезируют следующие олигонуклеотиды:
(8) 5'-TACTTCCAATCCATGAAGCTTGGAAACGACGCCGACA-3'
(9) 5'-TATCCACCTTTACTGCGGCCGCATCCATTCAATCTCGTATG-3'
Полученный ПЦР фрагмент клонируют в вектор pUC-LIC по указанным выше сайтам лигирования (см. пример 1). Таким образом, экспрессионная плазмида pCBH1-12 содержит все регуляторные части для экспрессии гомологичного гена целлобиогидролазы I. Для возможности линеаризации экспрессионной плазмиды перед трансформацией в штамм реципиент между сайтом лигирования и вектором вводят рестрикционный сайт NotI.
Реципиентный штамм P.verruculosum 537(niaD-) получают путем отбора клонов, дефектных по нитрат-редуктазе и не способных расти на минимальной среде, где в качестве единственного источника азота используется нитрат натрия - NaNO3.
На втором этапе проводят котрансформацию реципиентного штамма P.verruculosum 537(niaD-) 10-20 мкг экспрессионной векторной плазмиды pCBH1-12 и 1-3 мкг маркерной плазмиды pSTA (niaD+) и осуществляют скрининг клонов на наличие трансформантов с повышенной секрецией целлобиогидролазы.
Полученные niaD+ трансформанты пересевают на чашки с минимальной средой и источником азота NaNO3 и инкубируют при 30°С в течение 140 часов до образования конидий. Затем трансформанты ферментируют в качалочных колбах, используя водную ферментационную среду следующего состава, в г/л: микрокристаллическая целлюлоза (МКЦ) - 40, пшеничные отруби - 10, дрожжевой экстракт - 10, (NH4)2SO4 - 5, KH2PO4 - 5, MgSO4×7H2O - 0,3, CaCl2×2H2O - 0,3, рН 4,5. Колбы инкубируют на качалке при 32°С и 200 об/мин в течение 144 ч. Далее отбирают трансформанты с увеличенной по сравнению с реципиентным штаммом P.verruculosum целлобиогидролазной активностью. Целлобиогидролазную активность в культуральной жидкости измеряют по гидролизу МКЦ.
При анализе в ДДС-электрофорезе в денатурирующих условиях обнаружено увеличение размера полосы, соответствующей зоне, занимаемой целлобиогидролазой I (66 кДа).
На третьем этапе проводят ферментацию наиболее продуктивного из трансформированных штамма P.verruculosum PV-Cbh1P (BKM F-3973D) в 10-литровом ферментере, используя питательную среду того же состава, что в качалочных колбах, и проводя подпитку глюкозой, при рН 4,5 и 32°С в течение 144 часов. После окончания ферментации с помощью ультрафильтрации культуральной жидкости на полых волокнах (с пределом отсечения 10 kDа) и последующего лиофильного высушивания получают сухие ферментные препараты и характеризуют их по уровню целлобиогидролазной активности.
Активность целлобиогидролзы в культуральной жидкости наиболее активного трансформанта P.verruculosum PV-Cbh1P (BKM F-3973D) составлялет 35 ед/мл, активность целлобиогидролзы в сухом препарате - 1200 ед/г.
Целлобиогидролаза I обладает высокой удельной гидролитической (осахаривающей) активностью по отношению к нерастворимым кристаллическим целлюлозным субстратам (см. таблицу).
| Удельная активность целлобиогидролаз по отношению к микрокристаллической целлюлозе (50°С, рН 5), ед/мг белка | ||
| Микроорганизм | Ферменты | |
| Целлобиогидролаза I | Целлобиогидролаза II | |
| Penicillium verruculosum | 0,4 | 0,5 |
| Trichoderm longibrachiatum | 0,2 | 0,3 |
Пример 3. Получение ферментных препаратов с эндоглюканазной активностью при ферментации штаммов P.verruculosum мультикопийных по eglIV гену Tr.longibrachiatum (ген эндо-β1,4-глюканазы IV, 61-е семейство гликозид-гидролаз, молекулярная масса 36 кДа).
На первом этапе получают фрагмент ДНК с нуклеотидной последовательнстью eglIV гена, кодирущей эндоглюканазу IV Tr.longibrachiatum и получают экспрессионную плазмиду pPrCBHI-EGIV_Trich. Для амплификации гена eglIV синтезируют пару праймеров:
(10) 5'-CAAACAGAAGCAACCGACACAATGATCCAGAAGCTTTCCAACCTC-3'
(11) 5'-GAGGAGAAGCCCGGTTAGTTAAGGCACTGGGCGTAGTAG-3'
Олигонуклеотиды (10) и (11) синтезируют для конструирования плазмиды pPrCBHI-EGIV_Trich. В качестве матрицы для первичных реакций ПЦР используют геномную ДНК Tr.longibrachiatum. Так как Tr.longibrachiatum является вариантом Tr.reesei, за основу для создания праймеров взята последовательность гена из кДНК эндоглюканазы IV из Tr.reesei, доступная в базе данных EMBL (AN:Y 11113). Нуклеотидная последовательность гена эндоглюканазы IV из Tr.longibrachiatum состоит из 1086 пар оснований и содержит 1 интрон (фиг.З)
Плазмида pPrCBHI-EGIV_Trich содержит все структурные элементы, необходимые для экспрессии в P.verruculosum: cbhI промотор и cbhI терминатор. В данной конструкции клонируют полноразмерный ген эндоглюканазы IV Tr.longibrachiatum, включая последовательность, кодирующую сигнальный пептид.
Схематическая карта экспрессионной плазмиды pPrCBHI-EGIV_Trich представлена на фиг.4.
На втором этапе проводят котрансформацию реципиентного штамма P.verruculosum 537(niaD-) 10-20 мкг экспрессионной векторной плазмиды pPrCBHI-EGIV_Trich и 1-3 мкг маркерной плазмиды pSTA(niaD+) и осуществляют скрининг клонов на наличие трансформантов с повышенной секрецией эндоглюканазы.
Полученные niaD+ трансформанты P.verruculosum пересевают на чашки с минимальной средой и источником азота NaNO3, инкубируют при 30°С в течение 140 часов до образования конидий. Затем трансформанты P.verruculosum ферментируют в качалочных колбах, как описано в примере 2, и далее отбирают трансформанты с увеличенной по сравнению с реципиентным штаммом P.verruculosum эндоглюканазной активностью. Эндоглюканазную активность в культуральной жидкости измеряют по гидролизу Na-соли карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ).
При анализе в ДДС-электрофорезе в денатурирующих условиях обнаружено, что эндоглюканаза IV занимает зону, соответствующую 36 кДа.
На третьем этапе проводят ферментацию наиболее продуктивного из трансформированных штамма P.verruculosum PV-Egl4T (BKM F-3976D) в 10-литровом ферментере (как описано в примере 2).
Активность эндоглюканазы в культуральной жидкости штамма P.verruculosum PV-Egl4T (BKM F-3976D) в конце ферментации составляет 850 ед/мл.
Сухой ферментный препарат получают с помощью ультрафильтрации культуральной жидкости на полых волокнах (с пределом отсечения 10 кДа) и последующим лиофильным высушиванием. Активность эндоглюканазы в сухом ферментном препарате трансформанта P.verruculosum PV-Egl4T (BKM F-3976D) составляет 6500 ед/г.
Пример 4. Получение ферментных препаратов с ксиланазной активностью при ферментации штаммов P.verruculosum мультикопийных по xynIII гену Tr.longibrachiatum (ген эндо-β1,4-ксиланазы III, 10-го семейства гликозид-гидролаз, молекулярная масса 30 кДа).
На первом этапе получают фрагмент ДНК с нуклеотидной последовательностью xynIII гена, кодирущей ксиланазу III Tr.longibrachiatum и экспрессионную плазмиду pPrCBHI-XylIII_Trich. Для амплификации гена xynIII синтезируют пару праймеров:
(36) 5'-CAAACAGAAGCAACCGACACAATGAAAGCAAACGTCATCTTGT-3'
(37) 5'-GAGGAGAAGCCCGGTTATTGTAAGATGCCAACAATGCT-3'
В качестве матрицы для первичных реакций ПЦР используют геномную ДНК Tr.longibrachiatum. Так как Tr.longibrachiatum является вариантом Tr.reesei, за основу для написания праймеров используют последовательность гена из кДНК ксиланазы III из Tr.reesei, доступную в базе данных GeneBank (AN:AB036796). Нуклеотидная последовательность ксиланазного гена из Tr.longibranchiatum состоит из 1349 пар оснований, содержит 2 интрона и полностью идентична последовательности ксиланазного гена из Tr.reesei (фиг.5).
Плазмида pPrCBHI-XylIII_Trich содержит все структурные элементы, необходимые для экспрессии в P.verruclosum: cbhI промотор и cbhI терминатор. В данной конструкции клонируют полноразмерный ген ксиланазы III Tr.longibrachiatum, включая последовательность, кодирующую сигнальный пептид. Схематическая карта экспрессионной плазмиды pPrCBHI-XylIII_Trich представлена на фиг.6.
На втором этапе проводят котрансформацию штамма реципиентного P.verruculosum 537(niaD-) 10-20 мкг экспрессионной векторной плазмиды pPrCBHI-XylIII_Trich и 1-3 мкг маркерной плазмиды pSTA(niaD+) и осуществляют скрининг клонов на наличие трансформантов с повышенной секрецией ксиланазы.
Полученные niaD+ трансформанты P.verruculosum пересевают на чашки с минимальной средой и источником азота NaNO3, инкубируют при 30°С в течение 140 часов до образования конидий.
Затем трансформанты P.verruculosum ферментируют в качалочных колбах, как описано в примере 2, и далее отбирают трансформанты с увеличенной по сравнению с реципиентным штаммом P.verruculosum ксиланазной активностью. Ксиланазную активность в культуральной жидкости измеряют по гидролизу березового ксилана.
При анализе в ДДС-электрофорезе в денатурирующих условиях обнаружено, что ксиланаза III занимает зону, соответствующую 30 кДа.
На третьем этапе проводят ферментацию наиболее продуктивного из трансформированных штамма P.verruculosum PV-Xyl3T (ВКМ F-3979D) в 10-литровом ферментере (как описано в примере 2).
Ксиланазная активность в культуральной жидкости штамма P.verruculosum PV-Xyl3T (BKM F-3979D) в конце ферментации составляет 1950 ед/мл.
Сухой ферментный препарат получают с помощью ультрафильтрации культуральной жидкости на полых волокнах (с пределом отсечения 10 кДа) и последующим лиофильным высушиванием. Активность ксиланазы в сухом ферментном препарате трансформанта P.verruculosum PV-Xyl3T (В KM F-3979D) составляет 43600 ед/г.
Методы определения активности. Целлобиогидролазную (авицелазную) активность измеряют, проводя гидролиз МКЦ (5 мг/мл) при рН 5,0 (0,1 М ацетатный буфер) и 50°С в течение 60 минут. После этого определяют в реакционной смеси концентрацию восстанавливающих сахаров (ВС) методом Нельсона-Сомоджи. За единицу целлобиогидролазной активности принимают такое количество фермента, которое в течение 1 минуты при температуре 50°С и рН 5,0 при гидролизе суспензии МКЦ концентрацией 5 мг/мл освобождает количество ВС, эквивалентных 1 микромолю глюкозы, определяемых методом Сомоджи-Нельсона.
Эндоглюканазную (КМЦ-азную) активность измеряют, проводя гидролиз КМЦ (5 мг/мл) при рН 5,0 (0,1 М ацетатный буфер) и 50°С в течение 10 минут. За единицу эндоглюканазной активности принимают такое количество фермента, которое в течение 1 минуты при температуре 50°С и рН 5,0 при гидролизе раствора КМЦ концентрацией 5 мг/мл приводит к образованию количества ВС, эквивалентного 1 микромолю глюкозы, определяемых методом Сомоджи-Нельсона (А.П.Синицын, А.В.Гусаков, И.М.Черноглазов. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов, Учебное пособие. - М.: Изд-воМГУ, 1995, с.144-156).
Ксиланазную активность измеряют, проводя гидролиз березового ксилана (5 мг/мл) при рН 5,0 (0,1 М ацетатный буфер) и 50°С в течение 10 минут. За единицу ксиланазной активности принимают такое количество фермента, которое в течение 1 минуты при температуре 50°С и рН 5,0 при гидролизе раствора ксилана концентрацией 5 мг/мл приводит к образованию количества ВС, эквивалентных 1 микромолю ксилозы, определяемых методом Сомоджи-Нельсона (А.П.Синицын, А.В.Гусаков, И.М.Черноглазов. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов, Учебное пособие. - М.: Изд-во МГУ, 1995, с.144-156).
Таким образом, предлагаемое изобретение позволяет осущеставить получение ферментных препаратов с высокой целлобиогидролазной, эндоглюканазной и ксиланазной активностями путем культивирования мультикопийных штаммов мицелиального гриба Penicillium verruculosum, трансформированных фрагментами ДНК с клонированными гомологичными и гетерологичными генами.
Claims (6)
1. Генетическая конструкция для обеспечения экспрессии целевых гомологичных и гетерологичных генов ферментов в клетках мицелиального гриба Penicillium verruculosum, используемого в качестве хозяина, содержащая целевую кодирующую последовательность фермента, функционально связанную с регуляторными элементами гена целлобиогидролазы I Penicillium verruculosum, которые представляют собой промотор и терминатор гена целлобиогидролазы I, а сигнальный пептид при этом зависит от того, каков целевой фермент.
2. Способ получения штамма гриба Penicillium verruculosum - продуцента фермента, кодируемого нуклеотидной последовательностью, предусматривающий трансформацию клетки гриба Penicillium verruculosum генетической конструкцией, содержащей целевую кодирующую последовательность фермента, функционально связанную с регуляторными элементами гена целлобиогидролазы I Penicillium verruculosum, которые представляют собой промотор и терминатор гена целлобиогидролазы I, а сигнальный пептид при этом зависит от того, каков целевой фермент.
3. Способ получения фермента, предпочтительно целлюлазы или ксиланазы, расщепляющих целлюлозу или ксиланы соответственно, путем культивирования микроорганизмов, отличающийся тем, что способом по п.2 получают штамм гриба Penicillium verruculosum, осуществляют культивирование полученного штамма и выделяют целевой продукт из культуральной жидкости гриба.
4. Способ получения фермента по п.3, отличающийся тем, что получают штамм Penicillium verruculosum PV-CbhIP (BKM F-3973D), содержащий множество копий гена cbhI - высокоактивной целлобиогидролазы I Penicillium verruculosum.
5. Способ получения фермента по п.3, отличающийся тем, что получают штамм Penicillium verruculosum PV-Egl4T (BKM F-3976D), содержащий множество копий гена eglIV - эндоглюканазы IV Trichoderma longibrachiatum.
6. Способ получения фермента по п.3, отличающийся тем, что получают штамм Penicillium verruculosum PV-Xyl3T (BKM F-3979D), содержащий множество копий гена xylIII - ксиланазы III Trichoderma longibrachiatum.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2008107784/13A RU2378372C2 (ru) | 2008-03-03 | 2008-03-03 | Генетическая конструкция для обеспечения экспрессии целевых гомологичных и гетерологичных генов в клетках мицелиального гриба penicillium verruculosum, используемого в качестве хозяина, способ получения штамма гриба penicillium verruculosum и способ получения ферментного препарата |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2008107784/13A RU2378372C2 (ru) | 2008-03-03 | 2008-03-03 | Генетическая конструкция для обеспечения экспрессии целевых гомологичных и гетерологичных генов в клетках мицелиального гриба penicillium verruculosum, используемого в качестве хозяина, способ получения штамма гриба penicillium verruculosum и способ получения ферментного препарата |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2008107784A RU2008107784A (ru) | 2009-09-10 |
| RU2378372C2 true RU2378372C2 (ru) | 2010-01-10 |
Family
ID=41165997
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2008107784/13A RU2378372C2 (ru) | 2008-03-03 | 2008-03-03 | Генетическая конструкция для обеспечения экспрессии целевых гомологичных и гетерологичных генов в клетках мицелиального гриба penicillium verruculosum, используемого в качестве хозяина, способ получения штамма гриба penicillium verruculosum и способ получения ферментного препарата |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2378372C2 (ru) |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014502144A (ja) * | 2010-10-06 | 2014-01-30 | ビーピー・コーポレーション・ノース・アメリカ・インコーポレーテッド | バリアントｃｂｈｉポリペプチド |
| RU2532840C2 (ru) * | 2012-09-19 | 2014-11-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук (ИБФМ РАН) | ШТАММ ГРИБА Penicillium verruculosum B10 EGII ПРОДУЦЕНТ ЭНДО-1.3/1.4-β-ГЛЮКАНАЗЫ, ЦЕЛЛЮЛАЗЫ, β-ГЛЮКОЗИДАЗЫ И КСИЛАНАЗЫ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОРМОВОГО КОМПЛЕКСНОГО ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА |
| RU2550044C2 (ru) * | 2013-09-10 | 2015-05-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук (ИНБИ РАН) | ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ФЬЮЖН-КОНСТРУКЦИЯ ДЛЯ ОБЕСПЕЧЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ МУЛЬТИФЕРМЕНТНОГО КОМПЛЕКСА КАРБОГИДРАЗ В КЛЕТКАХ МИЦЕЛИАЛЬНОГО ГРИБА Penicillium verruculosum, ИСПОЛЬЗУЕМОГО В КАЧЕСТВЕ ХОЗЯИНА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ШТАММА ГРИБА Penicillium verruculosum И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА НА ЕГО ОСНОВЕ |
| RU2574206C1 (ru) * | 2014-10-02 | 2016-02-10 | Общество с ограниченной ответственностью Научно-производственная компания "Фермтек" (ООО НПК "Фермтек") | Новый рекомбинантный штамм (варианты) мицелиального гриба penicillium verruculosum и ферментный препарат (варианты), предназначенный для гидролиза плодово-ягодного сырья, и способ его получения |
| RU2646136C2 (ru) * | 2015-12-02 | 2018-03-01 | Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук" (ФИЦ Биотехнологии РАН) | Рекомбинантный штамм мицелиального гриба penicillium verruculosum ( варианты) и способ получения ферментного препарата с его использованием (варианты) |
| RU2646132C1 (ru) * | 2016-12-13 | 2018-03-01 | Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук (ФИЦ Биотехнологии РАН) | Рекомбинантный штамм мицелиального гриба penicillium canescens cl14, продуцирующий компонент целллюлосомы clostridium thermocellum, и способ его культивирования |
| RU2653429C1 (ru) * | 2017-05-10 | 2018-05-08 | Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук (ФИЦ Биотехнологии РАН) | Генетическая конструкция для обеспечения экспрессии комплекса ферментов эндоглюканаз и ксиланаз в клетках гриба penicillium verruculosum и способ получения комплексных ферментных препаратов на его основе, предназначенных для кормопроизводства |
| US10081802B2 (en) | 2013-07-29 | 2018-09-25 | Danisco Us Inc. | Variant Enzymes |
| RU2711578C1 (ru) * | 2018-08-22 | 2020-01-17 | Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук (ФИЦ Биотехнологии РАН) | Штамм гриба penicillium verruculosum mx-73 продуцент модифицированной ксиланазы е с повышенной термостабильностью, ферментный препарат на его основе для использования в пищевой и кормовой промышленности и способ его получения |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2126049C1 (ru) * | 1997-04-02 | 1999-02-10 | Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов | Фрагмент днк pcg 2,6, кодирующий синтез секретируемой бета-галактозидазы penicillium canescens, и штамм гриба penicillium canescens - продуцент секретируемой бета-галактозидазы |
| RU2288267C2 (ru) * | 2004-09-09 | 2006-11-27 | ООО НПК "Фермтек" | Способ получения кормового комплексного ферментного препарата (варианты) и штамм penicillium canescens (варианты) |
-
2008
- 2008-03-03 RU RU2008107784/13A patent/RU2378372C2/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2126049C1 (ru) * | 1997-04-02 | 1999-02-10 | Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов | Фрагмент днк pcg 2,6, кодирующий синтез секретируемой бета-галактозидазы penicillium canescens, и штамм гриба penicillium canescens - продуцент секретируемой бета-галактозидазы |
| RU2288267C2 (ru) * | 2004-09-09 | 2006-11-27 | ООО НПК "Фермтек" | Способ получения кормового комплексного ферментного препарата (варианты) и штамм penicillium canescens (варианты) |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| KOCH et. al. Cloning, sequencing, and heterologous expression of a cellulase- encoding cDNA (cbhl) from Penicilliam janthinellum, Gene, 1993 Feb 14; 124(1):57-65. HOU Y et. al. Cloning, sequencing and expression analysis of the first cellulase gene encoding cellobiohydrolase 1 from a cold-adaptive Penicillium chrysogenum FS010. Acta Biochim Biophvs Sin (Shanghai). 2007 Feb; 39(2):101-7. * |
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014502144A (ja) * | 2010-10-06 | 2014-01-30 | ビーピー・コーポレーション・ノース・アメリカ・インコーポレーテッド | バリアントｃｂｈｉポリペプチド |
| RU2532840C2 (ru) * | 2012-09-19 | 2014-11-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук (ИБФМ РАН) | ШТАММ ГРИБА Penicillium verruculosum B10 EGII ПРОДУЦЕНТ ЭНДО-1.3/1.4-β-ГЛЮКАНАЗЫ, ЦЕЛЛЮЛАЗЫ, β-ГЛЮКОЗИДАЗЫ И КСИЛАНАЗЫ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОРМОВОГО КОМПЛЕКСНОГО ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА |
| US10081802B2 (en) | 2013-07-29 | 2018-09-25 | Danisco Us Inc. | Variant Enzymes |
| US10479983B2 (en) | 2013-07-29 | 2019-11-19 | Danisco Us Inc | Variant enzymes |
| RU2550044C2 (ru) * | 2013-09-10 | 2015-05-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук (ИНБИ РАН) | ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ФЬЮЖН-КОНСТРУКЦИЯ ДЛЯ ОБЕСПЕЧЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ МУЛЬТИФЕРМЕНТНОГО КОМПЛЕКСА КАРБОГИДРАЗ В КЛЕТКАХ МИЦЕЛИАЛЬНОГО ГРИБА Penicillium verruculosum, ИСПОЛЬЗУЕМОГО В КАЧЕСТВЕ ХОЗЯИНА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ШТАММА ГРИБА Penicillium verruculosum И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА НА ЕГО ОСНОВЕ |
| RU2574206C1 (ru) * | 2014-10-02 | 2016-02-10 | Общество с ограниченной ответственностью Научно-производственная компания "Фермтек" (ООО НПК "Фермтек") | Новый рекомбинантный штамм (варианты) мицелиального гриба penicillium verruculosum и ферментный препарат (варианты), предназначенный для гидролиза плодово-ягодного сырья, и способ его получения |
| RU2646136C2 (ru) * | 2015-12-02 | 2018-03-01 | Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук" (ФИЦ Биотехнологии РАН) | Рекомбинантный штамм мицелиального гриба penicillium verruculosum ( варианты) и способ получения ферментного препарата с его использованием (варианты) |
| RU2646132C1 (ru) * | 2016-12-13 | 2018-03-01 | Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук (ФИЦ Биотехнологии РАН) | Рекомбинантный штамм мицелиального гриба penicillium canescens cl14, продуцирующий компонент целллюлосомы clostridium thermocellum, и способ его культивирования |
| RU2653429C1 (ru) * | 2017-05-10 | 2018-05-08 | Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук (ФИЦ Биотехнологии РАН) | Генетическая конструкция для обеспечения экспрессии комплекса ферментов эндоглюканаз и ксиланаз в клетках гриба penicillium verruculosum и способ получения комплексных ферментных препаратов на его основе, предназначенных для кормопроизводства |
| RU2711578C1 (ru) * | 2018-08-22 | 2020-01-17 | Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук (ФИЦ Биотехнологии РАН) | Штамм гриба penicillium verruculosum mx-73 продуцент модифицированной ксиланазы е с повышенной термостабильностью, ферментный препарат на его основе для использования в пищевой и кормовой промышленности и способ его получения |
| RU2810538C2 (ru) * | 2022-06-13 | 2023-12-27 | Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук" (ФИЦ Биотехнологии РАН) | ШТАММ ГРИБА PENICILLIUM VERRUCULOSUM ПРОДУЦЕНТ КОМПЛЕКСА ФИТАЗЫ А И ЭНДО-1,4-β-ГЛЮКАНАЗЫ II И ФЕРМЕНТНЫЙ ПРЕПАРАТ НА ЕГО ОСНОВЕ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В КАЧЕСТВЕ ДОБАВКИ В КОРМАХ |
| RU2836771C1 (ru) * | 2024-03-29 | 2025-03-21 | Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук" | ШТАММ ГРИБА PENICILLIUM VERRUCULOSUM B6/PMO-BG-25 И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСНОГО ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА β-ГЛЮКОЗИДАЗЫ, ЦЕЛЛОБИОГИДРОЛАЗЫ И ПОЛИСАХАРИДМОНООКСИГЕНАЗЫ НА ЕГО ОСНОВЕ ДЛЯ БИОКОНВЕРСИИ ЦЕЛЛЮЛОЗОСОДЕРЖАЩИХ МАТЕРИАЛОВ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2008107784A (ru) | 2009-09-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2378372C2 (ru) | Генетическая конструкция для обеспечения экспрессии целевых гомологичных и гетерологичных генов в клетках мицелиального гриба penicillium verruculosum, используемого в качестве хозяина, способ получения штамма гриба penicillium verruculosum и способ получения ферментного препарата | |
| ES2582078T3 (es) | Tratamiento de material celulósico y enzimas útiles en el mismo | |
| EP2013338B1 (en) | Thermostable cellulase and methods of use | |
| JP4922524B2 (ja) | 糸状菌の分野における新規発現調節配列および発現産物 | |
| CA2757040C (en) | Improved endoglucanases | |
| KR101120359B1 (ko) | 섬유소를 효과적으로 분해할 수 있는 유전자가 삽입된 재조합 벡터, 그 재조합벡터를 포함하는 형질전환체, 및 그 형질전환체를 이용한 에탄올 생산방법 | |
| da Silva Delabona et al. | The relation between xyr1 overexpression in Trichoderma harzianum and sugarcane bagasse saccharification performance | |
| CN102292438A (zh) | 用于生产纤维素酶的宿主和发酵方法 | |
| KR20120106774A (ko) | 동시 당화 발효 반응의 효율을 향상시키는 방법 | |
| JP2002506616A (ja) | β−グルコシダーゼの増強された産生のための遺伝子構築物および遺伝子改変された微生物 | |
| US20150329841A1 (en) | Cellulose-degrading enzyme composition comprising gh16 | |
| Kislitsin et al. | The effect of cellobiohydrolase 1 gene knockout for composition and hydrolytic activity of the enzyme complex secreted by filamentous fungus Penicillium verruculosum | |
| CN102827820B (zh) | 一种β-葡糖苷酶及其应用 | |
| US10457925B2 (en) | Process for the production of cellulolytic and/or hemicellulolytic enzymes | |
| Giwa et al. | Cellulose degradation enzymes in filamentous fungi, a bioprocessing approach towards biorefinery | |
| MX2011000552A (es) | Glicosidasa modificadas de la familia 6 con especificidad alterada del sustrato. | |
| Wei et al. | Molecular cloning and characterization of two major endoglucanases from Penicillium decumbens | |
| US20120115235A1 (en) | Enhanced cellulase expression in s. degradans | |
| WO2018113431A1 (zh) | 一种能降解纤维素生产益生纤维寡糖并分泌抗菌肽的多功能酿酒酵母 | |
| RU2550044C2 (ru) | ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ФЬЮЖН-КОНСТРУКЦИЯ ДЛЯ ОБЕСПЕЧЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ МУЛЬТИФЕРМЕНТНОГО КОМПЛЕКСА КАРБОГИДРАЗ В КЛЕТКАХ МИЦЕЛИАЛЬНОГО ГРИБА Penicillium verruculosum, ИСПОЛЬЗУЕМОГО В КАЧЕСТВЕ ХОЗЯИНА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ШТАММА ГРИБА Penicillium verruculosum И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА НА ЕГО ОСНОВЕ | |
| RU2532840C2 (ru) | ШТАММ ГРИБА Penicillium verruculosum B10 EGII ПРОДУЦЕНТ ЭНДО-1.3/1.4-β-ГЛЮКАНАЗЫ, ЦЕЛЛЮЛАЗЫ, β-ГЛЮКОЗИДАЗЫ И КСИЛАНАЗЫ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОРМОВОГО КОМПЛЕКСНОГО ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА | |
| RU2238974C2 (ru) | Фрагмент днк мицелиального гриба penicillium verruculosum, кодирующий синтез секретируемой эндоглюканазы iii и группа штаммов penicillium canescens, синтезирующих эндоглюканазу iii penicillium verruculosum, сконструированных методами трансформации и генетической инженерии на основе этого фрагмента днк | |
| RU2646132C1 (ru) | Рекомбинантный штамм мицелиального гриба penicillium canescens cl14, продуцирующий компонент целллюлосомы clostridium thermocellum, и способ его культивирования | |
| RU2288267C2 (ru) | Способ получения кормового комплексного ферментного препарата (варианты) и штамм penicillium canescens (варианты) | |
| KR20100131208A (ko) | 바이오 에탄올 생산능이 향상된 재조합 벡터 및 그 형질 전환체 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20100304 |