RU2378364C1 - Способ молекулярного типирования chlamydia trachomatis - Google Patents
Способ молекулярного типирования chlamydia trachomatis Download PDFInfo
- Publication number
- RU2378364C1 RU2378364C1 RU2008141993/13A RU2008141993A RU2378364C1 RU 2378364 C1 RU2378364 C1 RU 2378364C1 RU 2008141993/13 A RU2008141993/13 A RU 2008141993/13A RU 2008141993 A RU2008141993 A RU 2008141993A RU 2378364 C1 RU2378364 C1 RU 2378364C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- trachomatis
- chlamydia
- genes
- chlamydia trachomatis
- sequencing
- Prior art date
Links
- 241000606153 Chlamydia trachomatis Species 0.000 title claims abstract description 77
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 46
- 229940038705 chlamydia trachomatis Drugs 0.000 title claims abstract description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 42
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims abstract description 33
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 claims abstract description 20
- 101150116202 pmpF gene Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 101150033948 tsf gene Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 101150115693 ompA gene Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 101100295756 Acinetobacter baumannii (strain ATCC 19606 / DSM 30007 / JCM 6841 / CCUG 19606 / CIP 70.34 / NBRC 109757 / NCIMB 12457 / NCTC 12156 / 81) omp38 gene Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 101150042295 arfA gene Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 101150087557 omcB gene Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000012568 clinical material Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 22
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 abstract description 18
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract description 15
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 19
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 6
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 6
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 6
- 210000003708 urethra Anatomy 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 4
- 101100462378 Danio rerio otpb gene Proteins 0.000 description 4
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 3
- 206010061041 Chlamydial infection Diseases 0.000 description 3
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 3
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 3
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 3
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 201000000902 chlamydia Diseases 0.000 description 3
- 208000012538 chlamydia trachomatis infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 3
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 3
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 3
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001647372 Chlamydia pneumoniae Species 0.000 description 2
- 241001647378 Chlamydia psittaci Species 0.000 description 2
- 101710164702 Major outer membrane protein Proteins 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 2
- FKJSFKCZZIXQIP-UHFFFAOYSA-N 2-bromo-1-(4-bromophenyl)ethanone Chemical compound BrCC(=O)C1=CC=C(Br)C=C1 FKJSFKCZZIXQIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000031295 Animal disease Diseases 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 101100172879 Caenorhabditis elegans sec-5 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100172886 Caenorhabditis elegans sec-6 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100027987 Chlamydia trachomatis omcB gene Proteins 0.000 description 1
- 108700042132 Chlamydia trachomatis omp1 Proteins 0.000 description 1
- 101100024013 Chlamydia trachomatis ompA gene Proteins 0.000 description 1
- 241000606069 Chlamydiaceae Species 0.000 description 1
- 241000498849 Chlamydiales Species 0.000 description 1
- 102100021309 Elongation factor Ts, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- 101710105759 Major outer membrane porin Proteins 0.000 description 1
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000002508 Peptide Elongation Factors Human genes 0.000 description 1
- 206010037151 Psittacosis Diseases 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 208000005448 Trichomonas Infections Diseases 0.000 description 1
- 206010044620 Trichomoniasis Diseases 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 108010063460 elongation factor T Proteins 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 101150005487 ftsI gene Proteins 0.000 description 1
- 101150084188 hctB gene Proteins 0.000 description 1
- 201000001371 inclusion conjunctivitis Diseases 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 208000001581 lymphogranuloma venereum Diseases 0.000 description 1
- 208000037941 meningococcal disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 238000002966 oligonucleotide array Methods 0.000 description 1
- 201000000901 ornithosis Diseases 0.000 description 1
- 101150090944 otomp gene Proteins 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 101150060462 pbpB gene Proteins 0.000 description 1
- 238000013081 phylogenetic analysis Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000005100 tissue tropism Effects 0.000 description 1
- 206010044325 trachoma Diseases 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии и представляет собой способ молекулярного типирования Chlamydia trachomatis путем секвенирования вариабельных участков трех генов Chlamydia trachomatis, таких как ompA, tsf, pmpF, полученных из бактериальной ДНК Chlamydia trachomatis, выделенной из клинического материала пациентов с урогенитальным хламидиозом, подвергнутых амплификации с последующим восстановлением последовательностей анализируемых генов, выравниванием и сравнительным анализом нуклеотидных последовательностей. Данный способ позволяет повысить разрешающую способность метода молекулярного типирования Chlamydia trachomatis, воспроизводимость и производительность способа, а также увеличить легкость интерпретации получаемых результатов и легкость выполнения. 2 табл.
Description
Изобретение относится к микробиологии и представляет собой способ молекулярного типирования Chlamydia trachomatis. Изобретение может быть использовано для изучения эпидемиологии урогенитального хламидиоза, оценки генетического родства отдельных штаммов возбудителя урогенитального хламидиоза - C.trachomatis - и выявления штаммов C.trachomatis, которые определяют характер клинического течения заболевания.
Хламидии как возбудитель разнообразной патологии человека являются весьма гетерогенными. Среди более 20 представителей семейства Chlamydiaceae, объединенных в два рода (Chlamydia и Chlamydophila), известно как минимум три вида хламидий, вызывающих болезни человека:
- Chlamydia pneumoniae (по современной номенклатуре Chlamydophila pneumoniae) - возбудитель инфекций дыхательных путей, в эксперименте показана роль этого микроорганизма в развитии атеросклероза, однако в клинике это однозначно не доказано;
- Chlamydia psittaci (по современной номенклатуре Chlamydophila psittaci) - возбудитель пситтакоза;
- Chlamydia trachomatis - возбудитель инфекций урогенитального тракта и ряда других;
- другие хламидии могут вызывать болезни животных или лишены патогенных свойств.
Возбудитель урогенитального хламидиоза Chlamydia trachomatis - относится к облигатным патогенам и передается от человека к человеку преимущественно половым путем. В течение последних лет в Российской Федерации заболеваемость урогенитальной хламидийной инфекцией вышла на первое место среди всех бактериальных инфекций, передаваемых половым путем (ИППП). В нашей стране сегодня урогенитальный хламидиоз - вторая по распространенности регистрируемая ИППП после трихомоноза.
Разработка эффективных мероприятий по снижению уровня заболеваемости урогенитальным хламидиозом должна базироваться на четких представлениях об особенностях эпидемиологии этого заболевания. Одним из основных условий для решения этих вопросов является возможность выявления сходства и различия между штаммами бактерий одного биологического вида, выделенных от различных пациентов, то есть осуществления типирования.
Одним из критериев выбора способа типирования является воспроизводимость метода и разрешающая (дискриминирующая) способность. При этом получаемые результаты должны легко учитываться и интерпретироваться без привлечения дополнительной экспертизы, под которой подразумевают способность метода оценить, как отдельные типы, штаммы, случайно отобранные из бактериальной популяции. Для количественной оценки дискриминирующей способности методов типирования применяют индекс разнообразия Симпсона (D) [Gaston, M.A. and P.R.Hunter. 1989. Efficient selection of tests for bacteriological typing schemes. J Clin Pathol 42: 763-766; Hunter, P. R. and M. A. Gaston. 1988. Numerical index of the discriminatory ability of typing systems: an application of Simpson's index of diversity. J Clin Microbiol 26:2465-2466.], который рассчитывают по формуле:
где S - число групп, на которое данный метод разделяет всю выборку штаммов, nj - число штаммов в j-й группе и N - общее число штаммов в исследованной выборке.
В идеале для методов с максимальной разрешающей способностью индекс Симпсона должен быть равен 1. Это означает, что метод может отнести к различным типам два любых штамма.
Другими критериями выбора метода молекулярного типирования могут быть:
- способность осуществлять анализ большого количества образцов; для лабораторий, проводящих обширные эпидемиологические исследования, данный критерий может являться определяющим;
- хранение генетических профилей, то есть создание базы данных, также является важным критерием выбора метода.
В литературе имеется описание различных методик молекулярного типирования С.trachomatis.
Основным методом типирования С.trachomatis до последнего времени являлся метод серотипирования, основанный на выявлении вариантов антигенной структуры основного белка внешней мембраны микроорганизма (The Major outer membrane protein - MOMP). Описано 19 сероваров С.trachomatis и установлено, что серотипы А, В и С вызывают трахому, серотипы от D до K - урогенитальный хламидиоз и три серотипа (L1-L3) - венерическую лимфогранулему; урогенитальный хламидиоз наиболее часто ассоциируется с сероварами D-F [Spaargaren J., Verhaest I., MooiJ S. et al. Analysis of Chlamidya trachomatis. Serovar distribution changes in the Netherlands (1986-2002). Sex Transm Infect 2004, 80: 151-152]. Вместе с тем серотипирование является достаточно трудоемким и длительным процессом, требующим получения чистой культуры хламидий, высокой квалификации персонала и наличия набора моноклональных антител [Wang S.P., Kuo С.С., Bames R.C. et al. Immunotyping of Chlamidya trachomatis with monoclonal antibodies. J Infect Dis 1085, 152:791-800; Osserwarde J.M., Rieffe M. De Vries., Derksen-Navrocki R.P. et al. Comparison of two panels of monoclonal antibodies for determination of Chlamidya trachomatis serovars. J Clin Microbiol 1994, 32: 2968-2974]. В связи с указанными фактами традиционное серотипирование в настоящее время вытесняется молекулярными методами, основанными на амплификации гена, кодирующего основной белок внешней мембраны, и последующем анализе ампликона.
Для амплификации ДНК C.trachomatis чаще всего используют гнездную ПЦР. Получаемые ампликоны исследуются методами анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, обратной гибридизации
[Stothard, D.R. 2001. Use of a reverse dot blot procedure to identify the presence of multiple serovars in Chlamydia trachomatis urogenital infection. J Clin Microbiol 39: 2655-2659 №; Xiong, L., F. Kong, H. Zhou, and G. L. Gilbert. 2006. Use of PCR and reverse line blot hybridization assay for rapid simultaneous detection and serovar identification of Chlamydia trachomatis. J Clin Microbiol 44:1413-1418.]., олигонуклеотидных чипов [Zheng, H. P., L. F. Jiang, D.Y.Fang, Y.H.Xue, Y.A.Wu, J.M.Huang, and Z.Y.Ou. 2007. Application of an oligonucleotide array assay for rapid detecting and genotyping of Chlamydia trachomatis from urogenital specimens. Diagn Microbiol Infect Dis 57: 1-6] и секвенирования [Bandea, С.I., K. Kubota, Т.M.Brown, P.H.Kilmarx, V. Bhullar, S. Yanpaisam, P. Chaisilwattana, W. Siriwasin, and C.M.Black. 2001. Typing of Chlamydia trachomatis strains from urine samples by amplification and sequencing the major outer membrane protein gene (ompi). Sex Transm Infect 77: 419-422; Klint, M., M. Lofdahl, C. Ek, A. Airell, T. Berglund, and B. Herrmann. 2006. Lymphogranuloma venereum prevalence in Sweden among men who have sex with men and characterization of Chlamydia trachomatis ompA genotypes. J Clin Microbiol 44: 4066-4071; Stothard, D.R., G. Boguslawski, and R. B. Jones. 1998. Phylogenetic analysis of the Chlamydia trachomatis major outer membrane protein and examination of potential pathogenic determinants. Infect Immun. 66:3618-3625.]. Сравнительно недавно для типирования С.trachomatis был предложен метод гнездной ПЦР в реальном времени, по разрешающей способности не уступавший секвенированию omp1 гена (Jalal, В., Н. Stephen, S. Alexander, С.Came, and С.Sonnex. 2007. Development of real-time PCR assays for genotyping of Chlamydia trachomatis. J Clin Microbiol 45:2649-2653.]. Использование некоторых из современных молекулярных методов типирования позволят получать результаты, идентичные традиционному серотипированию.
Наиболее широко распространенным методом, применяемым для молекулярного типирования ряда микроорганизмов, является мультилокусное секвенирование (MultiLocus Sequence Typing - MLST).
Принцип метода MLST основан на проведении секвенирования и последующего анализа нуклеотидных последовательностей большого числа (от 6 до 16) генов домашнего хозяйства микроорганизма. Одними из первых бактерий, к типированию которых был применен метод MLST, были менингококки [Feavers, I.М., S.J.Gray, R.Urwin, J.Е.Russell, J.A.Bygraves, E.B.Kaczmarski, and M.C.Maiden. 1999. Multilocus sequence typing and antigen gene sequencing in the investigation of a meningococcal disease outbreak. J Clin Microbiol 37:3883-3887].
При типировании методом MLST С.trachomatis [K-lint, М., Н.Н.Fuxelius, R.R.Goldkuhl, Н.Skarin, С.Rutemark, S.G.Andersson, К.Persson, and B.Herrmann. 2007. High-resolution genotyping of Chlamydia trachomatis strains by multilocus sequence analysis. J Clin Microbiol 45: 1410-1414.] в качестве мишеней для типирования были использованы высоковариабельные области: два аннотированных гена (hctB и pbpB) и три гипотетических гена (СТ058, СТ144 и СТ172).
Основные недостатки указанного способа: при воспроизведении описанного метода MLST возникает ряд трудностей, связанных с подбором праймеров для амплификации генов и условий реакции. Кроме этого, метод требует выделения хламидий в чистой культуре. Типирование по пяти генам является достаточно дорогостоящим и трудоемким.
Данный способ является наиболее близким к заявляемому способу молекулярного типирования C.trachomatis. Данный способ выбран в качестве ближайшего аналога предлагаемого способа.
Задачей изобретения является разработка более эффективного способа молекулярного типирования C.trachomatis.
Технический результат изобретения заключается в повышении разрешающей способности метода молекулярного типирования C.trachomatis, воспроизводимости и производительности способа, а также в увеличении легкости интерпретации получаемых результатов и легкости выполнения.
Это достигается за счет того, что из клинического материала, полученного от пациентов с урогенитальным хламидиозом, производят выделение бактериальной ДНК C.trachomatis; с помощью полимеразной цепной реакции получают амплифицированные фрагменты вариабельных участков трех генов C.trachomatis, таких как ompA, tsf и pmpF; проводят их секвенирование, восстановление последовательностей анализируемых генов, выравнивание и сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей.
Характеристика генов, отобранных для типирования C.trachomatis:
ompA - ген, кодирующий основной белок наружной мембраны C.trachomatis;
tsf - ген, кодирующий фактор элонгации C.trachomatis (EF-TS); играет важную роль в биосинтезе белка, а также вовлечен в регуляцию других белков C.trachomatis, ассоциированных с циклом развития микробной клетки, что может иметь значение в изменении фенотипических свойств микроорганизма и определять фенотипические различия между сероварами C.trachomatis [Zhang Y., Tao J., Zhou M. et al. Elongation factor Ts of C.trachomatis: structure of the gene and properties of the protein. Arch Biochem Biophys 1997, 344:43-52; Brunelle В. W, Nicholson T.L., Stephens R.S. Microarrey-based genomic surveying of gene polymorphisms in C.trachomatis. Genome Biology 2004, 5:R42];
pmpF - член семейства генов Chlamydiales, локализованных во внешней мембране и кодирующих полиморфные мембранные белки, ответственные за аутотранспорт, транлокацию N-терминального региона клеточной поверхности C.trachomatis и адгезию микроорганизма к клеткам организма хозяина [Gomes J.P., Nunes A., Bruno W.J. et al. Polymorphisms in the Nine Polymorphic Membrane Proteins of C.trachomatis across All Serovars: Evidence for Serovar Da recombination and Correlation with Tissue Tropism. J Bacteriol Jan 2006: 275-286].
Способ осуществляется следующим образом.
Из клинического материала, полученного от больных с урогенитальным хламидиозом, стандартным способом производят выделение бактериальной ДНК C.trachomatis.
С помощью полимеразной цепной реакции получают амплифицированные фрагменты вариабельных участков трех генов C.trachomatis (ompA, tsf, pmpF). Характеристика использованных в работе генов-мишеней, примененных для типирования C.trachomatis, праймеров для их амплификации и условий постановки полимеразной цепной реакции для C.trachomatis, представлена в таблице 1.
| Таблица 1 Гены-мишени, использованные для типирования C.trachomatis, праймеры для их амплификации и условия постановки полимеразной цепной реакции |
|||||
| ген | Название праймера | Последовательность 5'-3' | Размер ампликона п.н. | Условия амплификации | |
| 1 | ompA | ompAf | ctaagaaaagatcctaatataa | 1260 | 30 циклов |
| 2 | ompAr | gatagcgagcacaaagaga | 95°С - 30 сек | ||
| 56°С - 15 сек | |||||
| 72°С - 20 сек | |||||
| 3 | tsf | tsff | tccagaagacaaagtgctcaa | 823 | 30 циклов |
| 4 | tsfr | gagcgacttctccatggaaa | 95°С - 30 сек | ||
| 60°С - 15 сек | |||||
| 72°С - 20 сек | |||||
| 5 | pmpF | pmpF1f pmpF2f pmpF3f |
tatcctttgcttgcctcagtt ggttacattgacatccgagat cctataccatcacgcttaataa |
||
| 1032 | 30 циклов | ||||
| 1190 | 95°С - 30 сек | ||||
| 6 | pmpF1r pmpF2r pmpF3r |
caggcagcagagttatttaga gcgatggaggtagcagatgt gctcctcctgcattgatgta |
1130 | 60°С - 15 сек | |
| 72°С - 20 сек | |||||
Постановку реакции секвенирования проводят с использованием набора d-Rhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit (Applied Biosystems, Warrington, UK) согласно инструкции фирмы-производителя. Анализ результатов реакции секвенирования проводят на приборе ABI-3130 (Applied Biosystem, USA).
Восстановление последовательностей анализируемых генов, выравнивание и сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей проводят с использованием модулей ContigExprress и AlignX программного пакета «Vector NTI® 9.0» (Informax, Inc).
Полученные в результате секвенирования нуклеотидные последовательности исследуемых генов сравнивают с нуклеотидными последовательностями аллелей соответствующих генов в базе данных GeneBank с помощью сервиса BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).
На основании нуклеотидной последовательности штамму C.trachomatis присваивают номер сиквенс-типа, который помещают в базу данных для последующего анализа клонального родства штаммов C.trachomatis.
Пример №1
Обследован пациент мужского пола (1) с подозрением на наличие инфекции, передаваемой половым путем. При обследовании соскобного материала уретры методом ПЦР (тест-система НПФ «Литех», «Полимик-Хл» г.Москва) у пациента обнаружена ДНК C.trachomatis.
Проведено типирование C.trachomatis в соответствии с предлагаемым способом.
Этапы исследования включали:
- выделение тотальной бактериальной ДНК С.trachomatis из соскобного материала уретры с использованием набора для выделения «ДНК ЭКСПРЕСС» (ООО НПФ Литех, ТУ-9398-450-17253567-03);
- подбор праймеров для проведения полимеразной цепной реакции с целью выявления и амплификации фрагментов генов оmрА, tsf и pmpF (таблица 1);
- проведение полимеразной цепной реакции с целью получения амплификатов фрагментов исследуемых генов С.trachomatis в соответствии с условиями проведения реакции, изложенными в таблице 1, и использованием следующих реактивов: 10xReaction buffer [раствор: 0,66 М трис-HCL (кат. №Т 6791, фирма Sigma, США); 25 мМ магния хлорида (кат. №960-9, фирма Sigma, США); раствор дезоксинуклеотидтрифосфатов (ДНТФ) [водный раствор дНТФ-дАТФ (кат №Т3-100, НПО "Вектор", Новосибирск); дГТФ (кат. №Т3-ПО, НПО "Вектор", Новосибирск); дЦТФ (кат. №Т3-130, НПО "Вектор", Новосибирск); дТТФ (кат. №Т3-120, НПО "Вектор", Новосибирск)]; концентрация каждого дНТФ - 2,5 мМ]; вода депонированная [фирма Millipore, США (кат. №ZPMG 23004)], Taq-полимераза (Promcga, USA);
- оценку результатов прохождения реакций амплификации проводили в 2% агарозном геле (агароза (кат. №А 9918, фирма Sigma, США), раствор бромистого этидия (1% раствор (кат. №11615, фирма Merk, Германия)), 50-кратный ТАЕ-буфер: 2 М трис-ацетат (кат. №Т 1258, фирма Sigma, США), 0,05 М этилендиаминтстрауксусной кислоты дииатриевая соль (кат. №Е 9884, фирма Sigma, США), рН 8,2);
- визуализацию продуктов амплификации осуществляли с помощью видеосистемы для документирования гель-электрофореграмм по появлению светящихся оранжево-красных полос при облучении УФ-излучением с длиной волны 310 нм;
- постановку реакции секвенирования с использованием набора d-Rhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit (Applied Biosystems, Warrington, UK) согласно инструкции фирмы-производителя; анализ результатов реакции секвенирования проводят на приборе ABI-3130 (Applied Biosystem, USA);
- восстановление последовательностей анализируемых генов, выравнивание и сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей с использованием модулей ContigExprress и AlignX программного пакета «Vector NTI® 9.0» (Informax, Inc).
Полученные в результате секвенирования нуклеотидные последовательности исследуемых генов сравнивали с нуклеотидными последовательностями аллелей соответствующих генов в базе данных GeneBank с помощью сервиса BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).
В результате секвенирования фрагмента гена оmрА установлено наличие замены А на Г в 35 положении.
В результате секвенирования фрагмента гена tsf установлено наличие замены С на Т в 44 положении.
В результате секвенирования фрагмента гена pmpF установлено наличие замены А на С в 134 положении.
На основании нуклеотидных последовательностей фрагментов генов оmрА, tsf и pmpF штамму C.trachomatis присвоен номер 10 сиквенс-типа; номер сиквенс-типа помещен в базу данных для последующего анализа клонального родства штаммов С.trachomatis.
Пример №2
Обследована пациентка женского пола (2) с целью исключения урогенитального хламидиоза, которая являлась половым партнером пациента (1). При обследовании соскобного материала шейки матки и уретры методом ПЦР (тест-система НПФ «Литех», «Полимик-Хл» г.Москва) у пациентки обнаружена ДНК C.trachomatis.
Проведено типирование C.trachomatis в соответствии с предлагаемым способом.
Этапы исследования включали:
- выделение тотальной бактериальной ДНК С.trachomatis из соскобного материала шейки матки и уретры с использованием набора для выделения «ДНК ЭКСПРЕСС» (ООО НПФ Литех, ТУ-9398-450-17253567-03);
- подбор праймеров для проведения полимеразной цепной реакции с целью выявления и амплификации фрагментов генов оmрА, tsf и pmpF (таблица 1);
- проведение полимеразной цепной реакции с целью получения амплификатов фрагментов генома С.trachomatis в соответствии с условиями проведения реакции, изложенными в таблице 1, и использованием следующих реактивов: 10xReaction buffer [раствор: 0,66 М трис-HCL (кат. №Т 6791, фирма Sigma, США); 25 мМ магния хлорида (кат. №960-9, фирма Sigma, США); 0,05 М этилендиаминтстрауксусной кислоты дииатриевая соль (кат. №Е 9884, фирма Sigma, США), рН 8,2; раствор дезоксинуклеотидтрифосфатов (ДНТФ) [водный раствор дНТФ-дАТФ (кат. №Т3-100, НПО "Вектор", Новосибирск); дГТФ (кат. №Т3-ПО, НПО "Вектор", Новосибирск); дЦТФ (кат. №Т3-130, НПО "Вектор", Новосибирск); дТТФ (кат. №Т3-120, НПО "Вектор", Новосибирск)]; концентрация каждого дНТФ - 2,5 мМ]; вода депонированная [фирма Millipore, США (кат. №ZPMG 23004)], Taq-полимераза (Promcga, USA);
- оценку результатов прохождения реакций амплификации проводили в 2% агарозном геле (агароза (кат. №А 9918, фирма Sigma, США), раствор бромистого этидия (1% раствор (кат. №11615, фирма Merk, Германия)), 50-кратный ТАЕ-буфер: 2 М трис-ацетат (кат. №Т 1258, фирма Sigma, США), 0,05 М этилендиаминтстрауксусной кислоты дииатриевая соль (кат. №Е 9884, фирма Sigma, США), рН 8,2);
- визуализацию продуктов амплификации осуществляли с помощью видеосистемы для документирования гель-электрофореграмм по появлению светящихся оранжево-красных полос при облучении УФ-излучением с длиной волны 310 нм;
- постановку реакции секвенирования с использованием набора d-Rhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit (Applied Biosystems, Warrington, UK) согласно инструкции фирмы-производителя; анализ результатов реакции секвенирования проводят на приборе ABI-3130 (Applied Biosystem, USA);
- восстановление последовательностей анализируемых генов, выравнивание и сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей с использованием модулей ContigExprress и AlignX программного пакета «Vector NTI® 9.0» (Informax, Inc).
Полученные в результате секвенирования нуклеотидные последовательности исследуемых генов сравнивали с нуклеотидными последовательностями аллелей соответствующих генов в базе данных GeneBank с помощью сервиса BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).
В результате секвенирования фрагмента гена оmрА установлено наличие замены А на Г в 35 положении.
В результате секвенирования фрагмента гена tsf установлено наличие замены С на Т в 44 положении.
В результате секвенирования фрагмента гена pmpF установлено наличие замены А на С в 134 положении.
На основании нуклеотидных последовательностей фрагментов генов оmрА, tsf и pmpF штамму C.trachomatis присвоен номер 10 сиквенс-типа; номер сиквенс-типа помещен в базу данных для последующего анализа клонального родства штаммов C.trachomatis.
В результате типирования C.trachomatis, выделенной от пациентов (1) и (2), являвшихся половыми партнерами, было установлено наличие в урогенитальном тракте обоих партнеров C.trachomatis, относившейся к одному сиквенс-типу.
Полученные данные позволяют заключить, что примененный метод типирования C.trachomatis может быть применен для установления заражения половых партнеров (в частности, в судебно-медицинской экспертизе) и изучения путей распространения урогенитальной хламидийной инфекции.
Пример №3
Обследована пациентка женского пола (3) с подозрением на наличие инфекции, передаваемой половым путем. При обследовании соскобного материала шейки матки и уретры методом ПЦР (тест-система НПФ «Литех», «Полимик-Хл» г.Москва) у пациентки обнаружена ДНК C.trachomatis.
Проведено типирование C.trachomatis в соответствии с предлагаемым способом.
Этапы исследования включали:
- выделение тотальной бактериальной ДНК С.trachomatis из соскобного материала шейки матки и уретры с использованием набора для выделения «ДНК ЭКСПРЕСС» (000 НПФ Литех, ТУ-9398-450-17253567-03);
- подбор праймеров для проведения полимеразной цепной реакции с целью выявления и амплификации фрагментов генов оmрА, tsf и pmpF (таблица 1);
- проведение полимеразной цепной реакции с целью получения амплификатов фрагментов генома С.trachomatis в соответствии с условиями проведения реакции, изложенными в таблице 1, и использованием следующих реактивов: 10xReaction buffer [раствор: 0,66 М трис-HCL (кат. №Т 6791, фирма Sigma, США); 25 мМ магния хлорида (кат. №960-9, фирма Sigma, США); 0,05 М этилендиаминтстрауксусной кислоты дииатриевая соль (кат. №Е 9884, фирма Sigma, США), рН 8,2; раствор дезоксинуклеотидтрифосфатов (ДНТФ)[водный раствор дНТФ - дАТФ (кат. №Т3-100, НПО "Вектор", Новосибирск); дГТФ (кат. №Т3-ПО, НПО "Вектор", Новосибирск); дЦТФ (кат. №Т3-130, НПО "Вектор", Новосибирск); дТТФ (кат. №Т3-120, НПО "Вектор", Новосибирск)]; концентрация каждого дНТФ - 2,5 мМ]; вода депонированная [фирма Millipore, США (кат. №ZPMG 23004)], Taq-полимераза (Promcga, USA);
- оценку результатов прохождения реакций амплификации проводили в 2% агарозном геле (агароза (кат. №А 9918, фирма Sigma, США), раствор бромистого этидия (1% раствор (кат. №11615, фирма Merk, Германия)), 50-кратный ТАЕ-буфер: 2 М трис-ацетат (кат. №Т 1258, фирма Sigma, США), 0,05 М этилендиаминтстрауксусной кислоты дииатриевая соль (кат. №Е 9884, фирма Sigma, США), рН 8,2);
визуализацию продуктов амплификации осуществляли с помощью видеосистемы для документирования гель-электрофореграмм по появлению светящихся оранжево-красных полос при облучении УФ-излучением с длиной волны 310 нм;
- постановку реакции секвенирования с использованием набора d-Rhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit (Applied Biosystems, Warrington, UK) согласно инструкции фирмы-производителя; анализ результатов реакции секвенирования проводят на приборе АВ 1-313 0 (Applied Biosystem, USA);
- восстановление последовательностей анализируемых генов, выравнивание и сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей с использованием модулей ContigExprress и AlignX программного пакета «Vector NTI® 9.0» (Informax, Inc).
Полученные в результате секвенирования нуклеотидные последовательности исследуемых генов сравнивали с нуклеотидными последовательностями аллелей соответствующих генов в базе данных GeneBank с помощью сервиса BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).
В результате секвенирования фрагмента гена оmрА установлено наличие замены А на Ц в 97 положении.
В результате секвенирования фрагмента гена tsf установлено наличие замены С на Т в 44 положении.
В результате секвенирования фрагмента гена pmpF установлено наличие замены Г на А в 347 положении.
На основании нуклеотидных последовательностей фрагментов генов оmрА, tsf и pmpF штамму C.trachomatis присвоен номер 12 сиквенс-типа; номер сиквенс-типа помещен в базу данных для последующего анализа клонального родства штаммов C.trachomatis.
В результате типирования C.trachomatis, выделенной от пациентов (1) и (2), являвшихся половьми партнерами, и пациентки (3) было установлено, что в урогенитальном тракте обследованных половых партнеров - пациенты (1) и (2), присутствует C.trachomatis, относящаяся к одному сиквенс-типу, а в урогенитальном тракте пациентки (3) присутствует C.trachomatis, относящаяся к другому сиквенс-типу. Таким образом, примененный метод типирования C.trachomatis позволил выявить различие между двумя штаммами C.trachomatis, полученными от лиц, не являющихся половыми партнерами, что свидетельствует о его высокой дискриминирующей способности.
Полученные данные позволяют заключить, что примененный метод типирования С.trachomatis может быть применен для оценки генетического родства отдельных штаммов возбудителя урогенитального хламидиоза, а также путей распространения урогенитальной хламидийной инфекции.
При сравнении заявленного метода типирования с другими наиболее распространенными методами были выявлены следующие преимущества указанного способа:
- проведение секвенирования вариабельных участков трех генов C.trachomatis, обладающих выраженным нуклеотидным полиморфизмом, позволяет (в сравнении с генотипированием по одному гену) значительно повысить разрешающую способность и воспроизводимость метода типирования C.trachomatis;
- исследование небольшого (в сравнении с методом MLST) числа генов C.trachomatis позволяет значительно снизить стоимость и сократить время проведения исследований по типированию штаммов C.trachomatis и увеличивает его производительность; а также увеличить легкость интерпретации получаемых результатов и легкость выполнения.
Сравнительная характеристика предлагаемого и известных методов молекулярного типирования C.trachomatis приведена в таблице 2.
Claims (1)
- Способ молекулярного типирования Chlamydia trachomatis, включающий выделение из клинического материала, полученного от пациента с урогенитальным хламидиозом, бактериальной ДНК Chlamydia trachomatis, получение амплифицированных фрагментов вариабельных участков генов Chlamydia trachomatis и проведение их секвенирования с последующим восстановлением последовательностей анализируемых генов, выравниванием и сравнительным анализом нуклеотидных последовательностей, отличающийся тем, что получают амплифицированные фрагменты трех вариабельных участков генов Chlamydia trachomatis, таких, как ompA, tsf, pmpF.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2008141993/13A RU2378364C1 (ru) | 2008-10-23 | 2008-10-23 | Способ молекулярного типирования chlamydia trachomatis |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2008141993/13A RU2378364C1 (ru) | 2008-10-23 | 2008-10-23 | Способ молекулярного типирования chlamydia trachomatis |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2378364C1 true RU2378364C1 (ru) | 2010-01-10 |
Family
ID=41644193
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2008141993/13A RU2378364C1 (ru) | 2008-10-23 | 2008-10-23 | Способ молекулярного типирования chlamydia trachomatis |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2378364C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2443782C1 (ru) * | 2010-08-03 | 2012-02-27 | Федеральное государственное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.Н. Габричевского Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" (ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора) | Способ генотипирования chlamydia trachomatis |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6403306B1 (en) * | 1997-04-09 | 2002-06-11 | Emory University | Serogroup-specific nucleotide sequences in the molecular typing of bacterial isolates and the preparation of vaccines thereto |
-
2008
- 2008-10-23 RU RU2008141993/13A patent/RU2378364C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6403306B1 (en) * | 1997-04-09 | 2002-06-11 | Emory University | Serogroup-specific nucleotide sequences in the molecular typing of bacterial isolates and the preparation of vaccines thereto |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| KLINT М. High-resolution genotyping of Chlamydia trachomatis strains by multilocus sequence analysis. J Clin Microbiol. 2007 May; 45(5): 1410-4. FEAVERS IM et.al. Multilocus sequence typing and antigen gene sequencing in the investigation of a meningococcal disease outbreak. J Clin Microbiol. 1999 Dec; 37(12): 3883-7. BANDEA et.al. Typing of Chlamydia trachomatis strains from urine samples by amplification and sequencing the major outer membrane protein gene (ompl). Sex Transm Infect. 2001 Dec; 77(6): 419-22. Rodriguez P Typing of Chlamydia trachomatis by restriction endonuclease analysis of the amplified major outer membrane protein gene. J Clin Microbiol. 1991 Jun; 29(6): 1132-6. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2443782C1 (ru) * | 2010-08-03 | 2012-02-27 | Федеральное государственное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.Н. Габричевского Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" (ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора) | Способ генотипирования chlamydia trachomatis |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Pantchev et al. | New real-time PCR tests for species-specific detection of Chlamydophila psittaci and Chlamydophila abortus from tissue samples | |
| Wang et al. | Development and application of an oligonucleotide microarray for the detection of food-borne bacterial pathogens | |
| Nazarian et al. | Design and implementation of a protocol for the detection of Legionella in clinical and environmental samples | |
| Vargas et al. | Is there an association between ocular adnexal lymphoma and infection with Chlamydia psittaci?: the University of Rochester experience | |
| US7625704B2 (en) | Methods and compositions for identifying bacteria associated with bacteria vaginosis | |
| Kostrzynska et al. | Application of DNA microarray technology for detection, identification, and characterization of food-borne pathogens | |
| US20100075306A1 (en) | Method for diagnosis of and following a bacterial vaginosis by molecular quantification | |
| Gookin et al. | Identification of Pentatrichomonas hominis in feline fecal samples by polymerase chain reaction assay | |
| KR20100044736A (ko) | 눈과 중앙 신경조직의 세균성, 균성, 기생성 및 바이러스성 감염을 동시에 검출 및 판별하기 위한 신규한 방법 | |
| CN101815791A (zh) | 微生物种群分析 | |
| Miya et al. | Development of a multilocus variable-number of tandem repeat typing method for Listeria monocytogenes serotype 4b strains | |
| Mabrok et al. | Rapid visualization in the specific detection of Flavobacterium columnare, a causative agent of freshwater columnaris using a novel recombinase polymerase amplification (RPA) combined with lateral flow dipstick (LFD) assay | |
| Conrads et al. | Simultaneous detection of Bacteroides forsythus and Prevotella intermedia by 16S rRNA gene-directed multiplex PCR | |
| Marangoni et al. | Chlamydia trachomatis serovar distribution and other sexually transmitted coinfections in subjects attending an STD outpatients clinic in Italy | |
| Lovett et al. | Cervicovaginal microbiota predicts neisseria gonorrhoeae clinical presentation | |
| RU2625006C1 (ru) | Способ таргетной амплификации геномов возбудителей инфекций органов репродукции человека с целью одновременной идентификации возбудителей с набором праймеров | |
| RU2360972C1 (ru) | Способ детекции и определения биотипа, серогруппы и токсигенности возбудителя холеры и набор для его осуществления | |
| Cai et al. | Molecular genetic methods in the veterinary clinical bacteriology laboratory: current usage and future applications | |
| Pron et al. | Diagnosis and follow-up of Whipple's disease by amplification of the 16S rRNA gene of Tropheryma whippelii | |
| Muvunyi et al. | Evaluation of a new multiplex polymerase chain reaction assay STDFinder for the simultaneous detection of 7 sexually transmitted disease pathogens | |
| Lynn et al. | Genetic typing of the porin protein of Neisseria gonorrhoeae from clinical noncultured samples for strain characterization and identification of mixed gonococcal infections | |
| KR20080020475A (ko) | 다중-중합효소연쇄반응에 의한 성전파질환 원인균 검출을위한 신규한 유형 특이적 프라이머와 이를 이용한 검출방법 | |
| US20110287965A1 (en) | Methods and compositions to detect clostridium difficile | |
| Debruyne et al. | Comparative performance of different PCR assays for the identification of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli | |
| Ojha et al. | Examination of animal and zoonotic pathogens using microarrays |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20111024 |