RU2366663C2 - Immunoassay device with using influenza b virus antibody - Google Patents
Immunoassay device with using influenza b virus antibody Download PDFInfo
- Publication number
- RU2366663C2 RU2366663C2 RU2006103302/13A RU2006103302A RU2366663C2 RU 2366663 C2 RU2366663 C2 RU 2366663C2 RU 2006103302/13 A RU2006103302/13 A RU 2006103302/13A RU 2006103302 A RU2006103302 A RU 2006103302A RU 2366663 C2 RU2366663 C2 RU 2366663C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- virus
- influenza
- antibody
- zone
- developer
- Prior art date
Links
- 241000713196 Influenza B virus Species 0.000 title claims abstract description 80
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 title abstract description 7
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 claims abstract description 41
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 60
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 59
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 50
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 44
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 44
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 44
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 37
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 37
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 36
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 33
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 33
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims description 28
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 21
- 241000701076 Macacine alphaherpesvirus 1 Species 0.000 claims description 16
- 108010046023 influenza B virus nucleoprotein Proteins 0.000 claims description 16
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 15
- 208000037798 influenza B Diseases 0.000 claims description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- 230000002155 anti-virotic effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 abstract 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 abstract 1
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 42
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 40
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 35
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 31
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 description 30
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 15
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 15
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 15
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 15
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 15
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 15
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 14
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 14
- 238000010324 immunological assay Methods 0.000 description 14
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 12
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 12
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 11
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 10
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 10
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 9
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 9
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 8
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 8
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 8
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 8
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 7
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 7
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 6
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 6
- 235000001630 Pyrus pyrifolia var culta Nutrition 0.000 description 6
- 240000002609 Pyrus pyrifolia var. culta Species 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 6
- 239000000123 paper Substances 0.000 description 6
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 6
- 241001500350 Influenzavirus B Species 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 5
- 239000011358 absorbing material Substances 0.000 description 5
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 5
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 5
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 5
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 5
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-L (5-bromo-4-chloro-1h-indol-3-yl) phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP([O-])(=O)[O-])=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 4
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 4
- ZTOJFFHGPLIVKC-YAFCTCPESA-N (2e)-3-ethyl-2-[(z)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound S\1C2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=C2N(CC)C/1=N/N=C1/SC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=C2N1CC ZTOJFFHGPLIVKC-YAFCTCPESA-N 0.000 description 3
- ZTOJFFHGPLIVKC-UHFFFAOYSA-N 3-ethyl-2-[(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound S1C2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=C2N(CC)C1=NN=C1SC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=C2N1CC ZTOJFFHGPLIVKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 3
- 241001647372 Chlamydia pneumoniae Species 0.000 description 3
- 241000606153 Chlamydia trachomatis Species 0.000 description 3
- 241000186227 Corynebacterium diphtheriae Species 0.000 description 3
- 241001466953 Echovirus Species 0.000 description 3
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 description 3
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 3
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 3
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 description 3
- 241000186779 Listeria monocytogenes Species 0.000 description 3
- 241000711386 Mumps virus Species 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 241000202934 Mycoplasma pneumoniae Species 0.000 description 3
- 241001467460 Myxogastria Species 0.000 description 3
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 description 3
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 3
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 3
- 241000607715 Serratia marcescens Species 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 3
- 241000191963 Staphylococcus epidermidis Species 0.000 description 3
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 description 3
- 241000194022 Streptococcus sp. Species 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 3
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 3
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 description 3
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 229940038705 chlamydia trachomatis Drugs 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 3
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 3
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 3
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 3
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 3
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 3
- BCHIXGBGRHLSBE-UHFFFAOYSA-N (4-methyl-2-oxochromen-7-yl) dihydrogen phosphate Chemical compound C1=C(OP(O)(O)=O)C=CC2=C1OC(=O)C=C2C BCHIXGBGRHLSBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YUDPTGPSBJVHCN-DZQJYWQESA-N 4-methylumbelliferyl beta-D-galactoside Chemical compound C1=CC=2C(C)=CC(=O)OC=2C=C1O[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O YUDPTGPSBJVHCN-DZQJYWQESA-N 0.000 description 2
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 2
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 2
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 2
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 description 2
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 2
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 2
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 2
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 2
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 229940117432 influenza b virus antigen Drugs 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000010030 laminating Methods 0.000 description 2
- 239000002923 metal particle Substances 0.000 description 2
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- VSZGPKBBMSAYNT-RRFJBIMHSA-N oseltamivir Chemical compound CCOC(=O)C1=C[C@@H](OC(CC)CC)[C@H](NC(C)=O)[C@@H](N)C1 VSZGPKBBMSAYNT-RRFJBIMHSA-N 0.000 description 2
- 229960002194 oseltamivir phosphate Drugs 0.000 description 2
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 2
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 2
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 2
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 2
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 229960001028 zanamivir Drugs 0.000 description 2
- ARAIBEBZBOPLMB-UFGQHTETSA-N zanamivir Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](N=C(N)N)C=C(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO ARAIBEBZBOPLMB-UFGQHTETSA-N 0.000 description 2
- PVGATNRYUYNBHO-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 4-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)butanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCN1C(=O)C=CC1=O PVGATNRYUYNBHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UMTZYGZMIJRCFG-UHFFFAOYSA-N 3-phenyldioxetane Chemical compound C1OOC1C1=CC=CC=C1 UMTZYGZMIJRCFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- HUDPLKWXRLNSPC-UHFFFAOYSA-N 4-aminophthalhydrazide Chemical compound O=C1NNC(=O)C=2C1=CC(N)=CC=2 HUDPLKWXRLNSPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000709687 Coxsackievirus Species 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 101900222562 Influenza A virus Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 241000371980 Influenza B virus (B/Shanghai/361/2002) Species 0.000 description 1
- 241000713297 Influenza C virus Species 0.000 description 1
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 241000609499 Palicourea Species 0.000 description 1
- 241000845082 Panama Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N Selenium Chemical compound [Se] BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000978776 Senegalia senegal Species 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 101000874347 Streptococcus agalactiae IgA FC receptor Proteins 0.000 description 1
- 241000589884 Treponema pallidum Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 1
- XYIPYISRNJUPBA-UHFFFAOYSA-N [3-(3'-methoxyspiro[adamantane-2,4'-dioxetane]-3'-yl)phenyl] dihydrogen phosphate Chemical compound O1OC2(C3CC4CC(C3)CC2C4)C1(OC)C1=CC=CC(OP(O)(O)=O)=C1 XYIPYISRNJUPBA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 description 1
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N aldrithiol Chemical compound C=1C=CC=NC=1SSC1=CC=CC=N1 HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001280 amantadine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- WOLHOYHSEKDWQH-UHFFFAOYSA-N amantadine hydrochloride Chemical compound [Cl-].C1C(C2)CC3CC2CC1([NH3+])C3 WOLHOYHSEKDWQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N diethanolamine Chemical compound OCCNCCO ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000011152 fibreglass Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229960003971 influenza vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000005439 maleimidyl group Chemical group C1(C=CC(N1*)=O)=O 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 241000856131 recombinant Influenza A viruses Species 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 1
- 238000012764 semi-quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 235000019982 sodium hexametaphosphate Nutrition 0.000 description 1
- GCLGEJMYGQKIIW-UHFFFAOYSA-H sodium hexametaphosphate Chemical compound [Na]OP1(=O)OP(=O)(O[Na])OP(=O)(O[Na])OP(=O)(O[Na])OP(=O)(O[Na])OP(=O)(O[Na])O1 GCLGEJMYGQKIIW-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000001577 tetrasodium phosphonato phosphate Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 235000021119 whey protein Nutrition 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
- C07K16/1018—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/5302—Apparatus specially adapted for immunological test procedures
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
- G01N2333/08—RNA viruses
- G01N2333/11—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Область техникиTechnical field
Данное изобретение относится к моноклональному антителу к вирусу типа В гриппа и устройству для иммунологического анализа с использованием антитела.This invention relates to a monoclonal antibody to influenza type B virus and a device for immunological analysis using antibodies.
Уровень техникиState of the art
С древних времен грипп является наиболее широко распространяющимся во всем мире, периодически повторяющимся заболеванием. Каждый раз при широком распространении инфекции некоторое количество людей умирает от этого заболевания. В 1931 году вирус, вызывающий заболевание, был выявлен, что открыло дорогу к выяснению причин заболевания. Вирус, вызывающий грипп, классифицируют на три типа, а именно на типы А, В и С, в зависимости от антигенности растворимого нуклеопротеина (NP), локализованного в вирусе. Вирус А гриппа далее разделяют на подтипы в зависимости от антигенности двух оболочечных гликопротеинов, гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA).Since ancient times, the flu is the most widespread worldwide, periodically recurring disease. Each time with the widespread infection, a certain number of people die from this disease. In 1931, the virus causing the disease was detected, which opened the way to finding out the causes of the disease. The influenza-causing virus is classified into three types, namely, types A, B and C, depending on the antigenicity of the soluble nucleoprotein (NP) localized in the virus. Influenza A virus is further divided into subtypes depending on the antigenicity of two enveloped glycoproteins, hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA).
С 1972 года для профилактики гриппа использовали вакцину, инактивированную формалином, после ее обработки эфиром. В последние годы помимо вакцины, используемой для профилактики гриппа, были разработаны лекарства против гриппа, которые в настоящее время широко используются. Такие терапевтические лекарства включают в себя гидрохлорид амантадина, эффективный против вируса А гриппа, и занамивир (zanamivir) и фосфат осельтамивира (oseltamivir phosphate), эффективные против вирусов А и В гриппа.Since 1972, a formalin inactivated vaccine has been used to prevent influenza after treatment with ether. In recent years, in addition to the vaccine used to prevent influenza, flu drugs have been developed that are now widely used. Such therapeutic drugs include amantadine hydrochloride, effective against influenza A virus, and zanamivir (zanamivir) and oseltamivir phosphate (oseltamivir phosphate), effective against influenza A and B viruses.
При выборе таких терапевтических лекарств важно обнаружить вирус гриппа в образце, подтвердить, что он является причиной инфекции, и определить, является ли вирус гриппа вирусом типа А или типа В. Далее, в связи с тем что вирус А гриппа является более заразным, чем вирус В гриппа, и вызывает возникновение серьезных симптомов, определение типа инфекционного вируса является особенно важным для ранней терапии.When choosing such therapeutic drugs, it is important to detect the influenza virus in the sample, confirm that it is the cause of the infection, and determine if the influenza virus is a type A or type B virus. Furthermore, due to the fact that influenza A virus is more infectious than the virus In influenza, and causes severe symptoms, determining the type of infectious virus is especially important for early treatment.
Вирусы гриппа обычно определяли (детектировали), используя антитела к вирусу гриппа. Что касается антител к вирусу А гриппа, известны антитела для определения подтипа вируса, специфично распознающие НА или NA вируса, необходимые для производства вакцины после определения подтипа вируса, который, как ожидается, будет превалировать (см., например, ссылки на патентные источники 1 и 2).Influenza viruses are usually detected (detected) using antibodies to the influenza virus. As for antibodies to influenza A virus, antibodies are known to determine the virus subtype, specifically recognizing the HA or NA of the virus needed to produce the vaccine after determining the virus subtype that is expected to prevail (see, for example, references to
В качестве устройства для детектирования вируса гриппа известно устройство проточного типа (см. ссылку на патентные источники 3), которое содержит твердую фазу, на которой может быть иммобилизован антиген вируса гриппа. В этом устройстве вирус гриппа, содержащийся в образце, взаимодействует с твердой фазой, затем антитело к вирусу А гриппа, меченное первым ферментом, и антитело к вирусу В гриппа, меченное вторым ферментом, взаимодействуют с твердой фазой. После этого добавляют субстраты для проведения реакции и визуально наблюдают окрашивание твердой фазы. Несмотря на то что в этом устройстве используют антитела к нуклеопротеинам вирусов гриппа, чувствительность измерений является низкой, а процедура измерений является сложной, так что это устройство не является простым измерительным средством. Кроме того, известно устройство для иммунологического анализа (которое далее будет названо «иммунохроматографическим устройством»), в котором использовано моноклональное антитело к нуклеопротеину вируса гриппа (см. ссылку 1 на непатентную литературу).As a device for detecting an influenza virus, a flow-type device is known (see reference to Patent Sources 3), which contains a solid phase in which the influenza antigen can be immobilized. In this device, the influenza virus contained in the sample interacts with the solid phase, then the antibody to influenza A virus labeled with the first enzyme and the anti-influenza virus B labeled with the second enzyme interact with the solid phase. After this, substrates for the reaction are added and solid phase staining is visually observed. Although antibodies to influenza nucleoproteins are used in this device, the sensitivity of the measurements is low and the measurement procedure is complicated, so this device is not a simple measuring tool. In addition, a device for immunological analysis (which will hereinafter be called "immunochromatographic device") is known, which uses a monoclonal antibody to the influenza virus nucleoprotein (see
С другой стороны, было разработано иммунохроматографическое устройство, в котором использована сходная с лентой основа (матрикс), через которую может быть осуществлен перенос жидкости (далее это устройство будет названо «иммунохроматографическим устройством»). С помощью этого устройства можно легко и за короткое время измерить антитело или антиген в образце просто посредством нанесения образца на заранее определенную область без специального устройства или сложной измерительной техники. Например, было разработано иммунохроматографическое устройство, в котором множество антигенов Treponema pallidum (TP антигены) связаны в зоне детектирования, и множество антител к TP, содержащихся в образце, можно определить в отдельных зонах детектирования (см. ссылку на патентные источники 4). Это устройство содержит множество зон детектирования, в которых соответственно связаны различные TP антигены. При помощи этого устройства различные антитела к TP определяют раздельно. Это позволяет определить время инфицирования, что используют при выборе терапевтического лекарства и пр.On the other hand, an immunochromatographic device has been developed that uses a tape-like base (matrix) through which fluid transfer can take place (hereinafter this device will be called an “immunochromatographic device”). Using this device, you can easily and quickly measure the antibody or antigen in the sample simply by applying the sample to a predetermined area without a special device or sophisticated measuring technique. For example, an immunochromatographic device has been developed in which multiple Treponema pallidum antigens (TP antigens) are linked in a detection zone, and many anti-TP antibodies contained in a sample can be detected in separate detection zones (see reference to Patent Sources 4). This device contains many detection zones in which various TP antigens are respectively linked. Using this device, various antibodies to TP are determined separately. This allows you to determine the time of infection, which is used when choosing a therapeutic drug, etc.
Ссылки на патентные источники.References to patent sources.
1. Выложенная заявка на патент Японии (Kokai) №6-100594.1. Japanese Patent Application Laid-Open (Kokai) No. 6-100594.
2. Выложенная заявка на патент Японии (Kokai) №7-304799.2. Japanese Patent Application Laid-Open (Kokai) No. 7-304799.
3. Выложенная заявка на патент Японии (Kokai) №2001-124775.3. Japanese Patent Application Laid-Open (Kokai) No. 2001-124775.
4. Выложенная заявка на патент Японии (Kokai) №9-229938.4. Japanese Patent Application Laid-Open (Kokai) No. 9-229938.
Ссылки на непатентную литературу.References to non-patent literature.
1. The Journal of the Japanese Association for Infectious Diseases, 2001; 75:792-799.1. The Journal of the Japanese Association for Infectious Diseases, 2001; 75: 792-799.
Раскрытие изобретенияDisclosure of invention
Проблемы, на решение которых направлено данное изобретениеProblems to be Solved by the Invention
Большинство традиционных моноклональных антител к вирусу В гриппа, распознающих поверхностный антиген НА или NA, обладают низкой реакционной способностью и специфичностью, так что они не могут быть признаны удовлетворительными для высокочувствительных иммунологических анализов. Кроме того, несмотря на то что в устройствах проточного типа используют антитела к нуклеопротеину вируса гриппа, процедуры измерений являются сложными, так что устройства также не являются простыми, и частота ошибочных положительных результатов при определении (детектировании) вируса В гриппа является высокой (см. J. Clin. Microbiol; 40:1675-1680, 2002).Most traditional monoclonal antibodies to influenza B virus that recognize the surface antigen of HA or NA have low reactivity and specificity, so that they cannot be considered satisfactory for highly sensitive immunological assays. In addition, despite the fact that flow-type devices use antibodies to the influenza virus nucleoprotein, the measurement procedures are complex, so the devices are also not simple, and the frequency of erroneous positive results in the determination (detection) of influenza B virus is high (see J Clin. Microbiol; 40: 1675-1680, 2002).
С другой стороны, для выбора терапевтического лекарства требуется устройство, с помощью которого можно отличить вирус типа А гриппа от вируса типа В гриппа за одну операцию в течение короткого промежутка времени, без использования специального диагностического оборудования или измерительного устройства, причем в таком устройстве должно быть использовано антитело, которое взаимодействует с вирусами типа В гриппа, включая мутировавшие штаммы вируса гриппа, но при этом не взаимодействует с вирусом типа А гриппа.On the other hand, to select a therapeutic drug, a device is needed that can be used to distinguish between type A influenza virus and type B influenza virus in a single operation within a short period of time, without the use of special diagnostic equipment or a measuring device, and such a device should be used an antibody that interacts with influenza type B viruses, including mutated strains of the influenza virus, but does not interact with influenza type A virus.
Следовательно, целью данного изобретения является получение антитела к вирусу типа В гриппа, обладающего высокой специфичностью. Другой целью данного изобретения является разработка устройства для иммунологического анализа, с помощью которого можно было бы специфично определить вирус типа В гриппа.Therefore, the aim of the present invention is to obtain antibodies to the type B virus of influenza with high specificity. Another objective of this invention is to develop a device for immunological analysis, with which it would be possible to specifically determine the type B virus of influenza.
Способы решения проблемWays to solve problems
Авторы данного изобретения интенсивно изучали и преуспели в создании антитела к вирусу типа В гриппа, соответственно к нуклеопротеину вируса В гриппа, которое специфично взаимодействует с вирусом В гриппа, что и является целью данного изобретения. Авторами данного изобретения также было сделано заключение, что можно разработать устройство для иммунологического анализа, с помощью которого можно определить вирус В гриппа, при этом отличая его от вируса А гриппа, за счет использования этого антитела к вирусу В гриппа.The authors of this invention have intensively studied and succeeded in creating antibodies to influenza type B virus, respectively, to influenza B virus nucleoprotein, which specifically interacts with influenza virus B, which is the purpose of this invention. The authors of the present invention also concluded that it is possible to develop a device for immunological analysis, with which you can determine the flu virus B, while distinguishing it from influenza A virus, through the use of this antibody to influenza virus B.
Таким образом, в данном изобретении создано моноклональное антитело к вирусу типа В гриппа или его антигенсвязывающий фрагмент, которое вступает в реакцию антиген-антитело с нуклеопротеином вируса В гриппа, имеющим молекулярную массу от 60 кДа до 75 кДа, и которое практически не вступает в реакцию антиген-антитело с вирусом А гриппа. В данном изобретении также разработано устройство для иммунологического анализа, содержащее зону меченого реагента, содержащую меченое мобильное антитело к вирусу В гриппа, зону нанесения образца, зону подачи проявителя, зону поглощения (впитывания) проявителя и зону детектирования вируса В гриппа, в которой антитело к вирусу В гриппа иммобилизовано на основе (макриксе), причем все зоны заданы на матриксе и, по крайней мере, одно из следующих - меченое антитело к вирусу В гриппа и антитело к вирусу В гриппа, иммобилизованное в зоне детектирования - является моноклональным антителом по данному изобретению.Thus, the present invention provides a monoclonal antibody to influenza type B virus or an antigen-binding fragment thereof that reacts an antigen-antibody with an influenza B virus nucleoprotein having a molecular weight of 60 kDa to 75 kDa, and which practically does not react antigen antibody with influenza A virus. The invention also provides an immunological assay device comprising a labeled reagent zone comprising a labeled mobile anti-B virus antibody, a sample application zone, a developer supply zone, a developer absorption (absorption) zone, and an influenza B virus detection zone in which the anti-virus antibody In influenza, it is immobilized on the basis of (macrix), with all zones defined on the matrix and at least one of the following is a labeled antibody to influenza B virus and an antibody to influenza B virus immobilized in the detection zone education - is a monoclonal antibody according to this invention.
Результат изобретения.The result of the invention.
В данном изобретении создано моноклональное антитело к вирусу В гриппа, которое иммунологически взаимодействует с вирусом В гриппа, но не взаимодействует с вирусом А гриппа. С помощью иммунологических анализов с использованием моноклонального антитела к вирусу В гриппа по данному изобретению можно определить (детектировать) или количественно измерить вирус В гриппа, при этом отличая его от вируса А гриппа. В данном изобретении также разработано устройство для иммунологического анализа, в котором используют описанное выше моноклональное антитело к вирусу В гриппа по данному изобретению. С помощью устройства для иммунологического анализа по данному изобретению вирус В гриппа можно легко детектировать, при этом отличая его от вируса А гриппа. Следовательно, ожидается, что данное изобретение внесет значительный вклад в диагностику и терапию гриппа.The present invention provides a monoclonal antibody to influenza B virus that immunologically interacts with influenza B virus but does not interact with influenza A virus. Using immunological assays using a monoclonal antibody to influenza B virus according to the present invention, it is possible to detect (detect) or quantify influenza B virus, while distinguishing it from influenza A virus. The invention also provides an immunological assay device that uses the above-described monoclonal anti-influenza virus B monoclonal antibody of the present invention. Using the immunoassay device of the present invention, influenza B virus can be easily detected while distinguishing it from influenza A virus. Therefore, the invention is expected to make a significant contribution to the diagnosis and treatment of influenza.
Краткое описание чертежей.A brief description of the drawings.
На Фиг.1 приведены результаты экспериментов, в которых моноклональные антитела по данному изобретению взаимодействуют с антигенами, фракционированными методом белкового блоттинга.Figure 1 shows the results of experiments in which the monoclonal antibodies of this invention interact with antigens fractionated by protein blotting.
На Фиг.2 приведено схематичное изображение в поперечном сечении варианта выполнения измерительного устройства по данному изобретению.Figure 2 shows a schematic cross-sectional view of an embodiment of the measuring device according to this invention.
На Фиг.3 приведен вид сверху, показывающий пример состояния (режима работы), когда измерительное устройство по данному изобретению помещено в кассету.FIG. 3 is a plan view showing an example of a state (operation mode) when the measuring device of the present invention is placed on a cassette.
На Фиг.4 приведено поперечное сечение, выполненное по линии А-А', показанной на Фиг.3.Figure 4 shows a cross section taken along the line aa 'shown in figure 3.
Наилучший вариант выполнения изобретения.The best embodiment of the invention.
Как было описано выше, моноклональное антитело по данному изобретению вступает в реакцию антиген-антитело с нуклеопротеином вируса В гриппа, причем нуклеопротеин имеет молекулярную массу от 60 кДа до 75 кДа. Тот факт, что антитело вступает в реакцию антиген-антитело с нуклеопротеином вируса В гриппа, имеющим молекулярную массу от 60 кДа до 75 кДа, может быть подтвержден методом белкового блоттинга, включающим гель-электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) с использованием вируса В гриппа в качестве образца. Согласно данным белкового блоттинга (см. Примеры ниже), моноклональное антитело по данному изобретению распознает нуклеопротеин, имеющий молекулярную массу от 60 кДа до 75 кДа.As described above, the monoclonal antibody of this invention reacts the antigen-antibody with the influenza B virus nucleoprotein, the nucleoprotein having a molecular weight of 60 kDa to 75 kDa. The fact that an antibody reacts with an antigen-antibody with an influenza B virus nucleoprotein having a molecular weight of 60 kDa to 75 kDa can be confirmed by protein blotting, including polyacrylamide gel electrophoresis in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS-PAGE) using influenza virus B as a sample. According to protein blotting data (see Examples below), the monoclonal antibody of this invention recognizes a nucleoprotein having a molecular weight of from 60 kDa to 75 kDa.
Как уже было отмечено выше, моноклональное антитело по данному изобретению практически не вступает в реакцию антиген-антитело с вирусом А гриппа. Термин «практически не вступает в реакцию антиген-антитело» в данном описании означает, что антитело не вступает в реакцию антиген-антитело на таком уровне, чтобы ее можно было детектировать, и даже если антитело вступает в реакцию антиген-антитело, то степень взаимодействия оказывается очевидно меньше, чем степень взаимодействия с вирусом В гриппа, так что специалистам в данной области ясно, что антитело не вступает в реакцию антиген-антитело с вирусом А гриппа. Термин «практически не вступает в реакцию антиген-антитело с вирусом А гриппа» означает, что антитело практически не вступает в реакцию антиген-антитело не только с нуклеопротеином вируса А гриппа, но также и с белками или другими компонентами вируса А гриппа. В предпочтительном варианте выполнения моноклональное антитело по данному изобретению также практически не взаимодействует с вирусом С гриппа.As noted above, the monoclonal antibody of this invention practically does not react antigen-antibody with influenza A virus. The term "practically does not react antigen-antibody" in this description means that the antibody does not react antigen-antibody at such a level that it can be detected, and even if the antibody reacts antigen-antibody, the degree of interaction is obviously less than the degree of interaction with influenza B virus, so it will be apparent to those skilled in the art that the antibody does not react antigen-antibody with influenza A virus. The term "practically does not react antigen-antibody with influenza A virus" means that the antibody practically does not react antigen-antibody not only with influenza A virus nucleoprotein, but also with proteins or other components of influenza A virus. In a preferred embodiment, the monoclonal antibody of this invention also does not substantially interact with influenza C virus.
Согласно предпочтительному варианту выполнения изобретения моноклональное антитело по данному изобретению вступает в реакцию антиген-антитело с нуклеопротеином каждого подтипа вируса В гриппа. На поверхности частицы вируса В гриппа расположены гемагглютинин (Н) и нейраминидаза (N), причем вирус В гриппа разделяют на подтипы в зависимости от различий в структурах Н и N. Моноклональное антитело по данному изобретению предпочтительно вступает в реакцию антиген-антитело с нуклеопротеинами, по крайней мере, тех подтипов вируса В гриппа, которые описаны далее в Примерах (см. Таблицу 3), и более предпочтительно с нуклеопротеинами всех известных подтипов вируса В гриппа.According to a preferred embodiment of the invention, the monoclonal antibody of this invention reacts the antigen-antibody with the nucleoprotein of each subtype of the influenza B virus. Hemagglutinin (H) and neuraminidase (N) are located on the surface of the influenza B virus particle, the influenza B virus being divided into subtypes depending on the differences in the structures of H and N. The monoclonal antibody of this invention preferably reacts with the antigen-antibody with nucleoproteins, at least those influenza B virus subtypes that are described later in the Examples (see Table 3), and more preferably with nucleoproteins of all known influenza B virus subtypes.
Согласно предпочтительному варианту выполнения изобретения моноклональное антитело по данному изобретению практически не вступает в реакцию антиген-антитело с патогенами других инфекционных заболеваний, симптомы которых хотя бы частично сходны с симптомами гриппа. Таким образом, предпочтительное моноклональное антитело по данному изобретению практически не вступает в реакцию антиген-антитело, например, с аденовирусом (типы с 1 по 7), коксаки-вирусом (типы А16 и В1-В6), вирусом простого герпеса 1, эховирусом (типы 3, 4, 7, 22 и 30), энтеровирусом (тип 71), вирусом свинки, полиовирусом (типы 1-3), RS (респираторно-синцитиальным) вирусом (подгруппы А и В), вирусом парагриппа (типы 1-3), Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Staphylococcus epidermidis, миксомицетами, Staphylococcus aureus, коринебактериями, Corynebacterium diphtheriae, Candida albicans, Streptococcus pyogenes, Streptococcus sp. (группы В, С, G и F), Streptococcus pneumoniae, Hemophilus influenzae, Listeria monocytogenes, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia trachomatis и Chlamydia pneumoniae.According to a preferred embodiment of the invention, the monoclonal antibody of this invention practically does not react with the antigen-antibody with pathogens of other infectious diseases, the symptoms of which are at least partially similar to the symptoms of influenza. Thus, the preferred monoclonal antibody of the present invention practically does not react with an antigen antibody, for example, with adenovirus (
Хорошо известно, что с помощью расщепления антитела папаином или пепсином можно получить фрагменты антитела, обладающие способностью связываться с соответствующим антигеном, такие как Fab фрагмент и F(ab')2 фрагмент (которые в данном описании названы «антигенсвязывающими фрагментами»). Согласно данному изобретению антигенсвязывающие фрагменты моноклонального антитела по данному изобретению можно использовать таким же образом, как и моноклональное антитело по данному изобретению, что находится в рамках данного изобретения.It is well known that by cleavage of the antibody with papain or pepsin, fragments of the antibody capable of binding to the corresponding antigen can be obtained, such as the Fab fragment and the F (ab ') 2 fragment (which are referred to herein as "antigen binding fragments"). According to the invention, the antigen binding fragments of the monoclonal antibody of the invention can be used in the same manner as the monoclonal antibody of the invention which is within the scope of the invention.
Моноклональное антитело по данному изобретению можно получить традиционным гибридомным способом, используя нуклеопротеин вируса В гриппа в качестве иммуногена. В связи с тем, что в качестве иммуногена используют нуклеопротеин вируса В гриппа, может быть использована любая вирусная культуральная среда, вакцина против НА гриппа, НА антиген для HI и рекомбинантный антиген до тех пор, пока нуклеопротеин присутствует в большом количестве и может служить в качестве иммуногена. Для того чтобы ингибировать высокоиммуногенные НА и NA, присутствующие в антигене, нуклеопротеин очищают с помощью ультрацентрифугирования (см., например, J. Biochem.; 102:1241-1249, 1987) или можно использовать антиген, обработанный протеазой (см., например, J. Immunol. Methods; 180:107-116, 1995).The monoclonal antibody of this invention can be obtained in the traditional hybridoma manner using the influenza B virus nucleoprotein as an immunogen. Due to the fact that the influenza B nucleoprotein is used as an immunogen, any viral culture medium, HA influenza vaccine, HA antigen for HI, and recombinant antigen can be used as long as the nucleoprotein is present in large quantities and can serve as immunogen. In order to inhibit the highly immunogenic HA and NA present in the antigen, the nucleoprotein is purified by ultracentrifugation (see, e.g., J. Biochem .; 102: 1241-1249, 1987) or a protease-treated antigen can be used (see, for example, J. Immunol. Methods; 180: 107-116, 1995).
Моноклональное антитело можно получить с помощью гибридомы, полученной иммунизацией животного антигеном, содержащим описанный выше нуклеопротеин вируса В гриппа, и слиянием животной клетки, продуцирующей моноклональное антитело, с опухолевой клеткой.A monoclonal antibody can be obtained using a hybridoma obtained by immunizing an animal with an antigen containing the influenza B virus nucleoprotein described above and fusing the animal cell producing the monoclonal antibody with the tumor cell.
Описанная выше гибридома может быть получена следующим способом. Нуклеопротеин вируса В гриппа, полученный как описано выше, который предполагают использовать в качестве антигена, внутрибрюшинно или внутривенно вводят животному, такому как мышь, дробно, несколько раз с промежутками от 2 до 3 недель вместе с полным адъювантом Фрейнда (Freund's complete adjuvant). Затем осуществляют слияние клеток селезенки или аналогичных клеток, продуцирующих антитела, с опухолевыми клетками, которые могут расти in vitro, такими как линия клеток миеломы.The hybridoma described above can be obtained by the following method. The influenza B virus nucleoprotein obtained as described above, which is intended to be used as an antigen, is intraperitoneally or intravenously administered to an animal, such as a mouse, fractionally, several times at intervals of 2 to 3 weeks, together with Freund's complete adjuvant. Then spleen cells or similar antibody-producing cells are fused to tumor cells that can grow in vitro, such as a myeloma cell line.
Слияние можно осуществить, используя полиэтиленгликоль согласно традиционному способу Коhlеr и Milstein (Nature, Vol.256, 495, 1975) или используя вирус Sendai или сходный вирус.The fusion can be carried out using polyethylene glycol according to the traditional method of Kohler and Milstein (Nature, Vol. 256, 495, 1975) or using the Sendai virus or a similar virus.
Отбор гибридом, продуцирующих антитело, которое распознает нуклеопротеин вируса В гриппа, из полученных слиянием клеток можно провести следующим образом. Те из полученных слиянием клеток, которые остаются живыми в HAT (гипоксантин, аминоптерин, тимидин) среде и/или НТ (гипоксантин, тимидин) среде, могут быть отобраны в качестве гибридом способом ограниченного разбавления. Затем гибридомы, продуцирующие моноклональное антитело, которое специфично распознает нуклеопротеин вируса В гриппа, можно отобрать с помощью EIA (иммуноферментного анализа) или сходным способом, причем культуральная среда гибридомы взаимодействует с высокоочищенным нуклеопротеином вируса В гриппа, иммобилизованным на аналитической плашке, а затем дополнительно взаимодействует с антимышиным иммуноглобулином (Ig) или аналогичным.The selection of hybridomas producing an antibody that recognizes the influenza B virus nucleoprotein from the obtained cell fusion can be carried out as follows. Those cells obtained by fusion that remain alive in HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine) medium and / or NT (hypoxanthine, thymidine) medium can be selected as a hybrid by the limited dilution method. Then, hybridomas producing a monoclonal antibody that specifically recognizes influenza B virus nucleoprotein can be selected using EIA (enzyme immunoassay) or a similar method, the hybridoma culture medium interacting with a highly purified influenza B virus nucleoprotein immobilized on an assay plate and then further interacting with anti-mouse immunoglobulin (Ig) or the like.
В приведенных ниже Примерах описано множество полученных предпочтительных моноклональных антител по данному изобретению, и три из них были названы соответственно гибридома FrB1-03, гибридома FrB1-07 и гибридома FVB2-16. Эти гибридомы были депонированы в Международном Патентном Депозитарии Организмов (International Patent Organism Depositary), Национальном Институте Развития Прикладной Науки и Технологий (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, AIST Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Япония), в качестве международного депонирования в соответствии с Будапештским Соглашением. Таким образом, гибридома FrB1-03 была депонирована под идентификационным названием «FrB1-03» под инвентарным номером FERM ВР-10070 (дата депонирования: 18 июля 2003; конвертирована 14 июля 2004 из внутреннего депонирования под инвентарным номером FERM P-19441); гибридома FrBl-07 была депонирована под идентификационным названием «FrB1-07» под инвентарным номером FERM ВР-10071 (дата депонирования: 18 июля 2003; конвертирована 14 июля 2004 из внутреннего депонирования под инвентарным номером FERM P-19442); и гибридома FVB2-16 была депонирована под идентификационным названием «FVB2-16» под инвентарным номером FERM BP-10069 (дата депонирования: 18 июля 2003; конвертирована 14 июля 2004 из внутреннего депонирования под инвентарным номером FERM P-19440).The following Examples describe the many obtained preferred monoclonal antibodies of this invention, and three of them were named FrB1-03 hybridoma, FrB1-07 hybridoma, and FVB2-16 hybridoma, respectively. These hybridomas were deposited at the International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology,
Каждую из описанных выше гибридом можно выделить путем культурирования гибридомы в среде, обычно используемой для клеточных культур, а моноклональное антитело можно выделить из супернатанта культуры. В альтернативном варианте моноклональное антитело можно выделить путем введения гибридомы животному того вида, от которого она была получена, для аккумулирования в нем асцита и путем выделения моноклонального антитела из асцита.Each of the hybridomas described above can be isolated by culturing the hybridoma in a medium commonly used for cell cultures, and the monoclonal antibody can be isolated from the culture supernatant. Alternatively, a monoclonal antibody can be isolated by introducing a hybridoma into an animal of the species from which it was obtained, to accumulate ascites therein and by isolating the monoclonal antibody from ascites.
Для выделения моноклонального антитела можно использовать традиционные способы очистки. Примеры таких способов очистки включают в себя гельпроникающую хроматографию, ионообменную хроматографию, аффинную хроматографию с использованием белка А и аналогичные способы.Conventional purification methods can be used to isolate the monoclonal antibody. Examples of such purification methods include gel permeation chromatography, ion exchange chromatography, protein A affinity chromatography, and similar methods.
Было подтверждено, что моноклональные антитела, полученные описанным выше способом, взаимодействуют с нуклеопротеином вируса В гриппа и с различными штаммами вируса В гриппа. Они вступают в реакцию с существующими в настоящее время доступными штаммами (см. Таблицу 3 ниже) вируса В гриппа, и исходные штаммы можно определить, используя моноклональные антитела по данному изобретению. С другой стороны, была протестирована перекрестная реактивность с микроорганизмами, например аденовирусом (типы 1-7), коксаки-вирусом (типы А16 и В1-В6), вирусом простого герпеса 1, эховирусом (типы 3, 4, 7, 22 и 30), энтеровирусом (тип 71), вирусом свинки, полиовирусом (типы с 1 по 3), RS вирусом (подгруппы А и В), вирусом парагриппа (типы с 1 по 3), Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Staphylococcus epidermidis, миксомицетами, Staphylococcus aureus, коринебактериями, Corynebacterium diphtheriae, Candida albicans. Streptococcus pyogenes, Streptococcus sp. (группы В, С, G и F), Streptococcus pneumoniae, Hemophilus influenzae, Listeria monocytogenes, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia trachomatis и Chlamydia pneumoniae. Взаимодействие не было обнаружено.It was confirmed that monoclonal antibodies obtained by the method described above interact with the influenza B virus nucleoprotein and with various strains of influenza B virus. They react with currently available strains (see Table 3 below) of influenza B virus, and the original strains can be determined using the monoclonal antibodies of this invention. On the other hand, cross-reactivity was tested with microorganisms, for example, adenovirus (types 1-7), coxsacki virus (types A16 and B1-B6),
Моноклональное антитело согласно данному изобретению можно использовать в иммунологических анализах для определения (детектирования) или количественного измерения вируса В гриппа. Иммунологические анализы сами по себе хорошо известны, и можно использовать любой из известных способов иммунологических исследований. Классифицируя известные способы иммунологических исследований по типу реакции, их можно разделить на сэндвичевые иммунологические анализы, конкурентные иммунологические анализы, иммунологические анализы, основанные на агглютинации, белковый блоттинг и пр. Классифицируя известные способы иммунологических исследований по использованной метке, их можно разделить на флуоресцентные иммунологические анализы, иммуноферментные анализы, радиоиммунологические исследования, иммунологические анализы, основанные на использовании биотина, и пр. Можно использовать любой из этих способов. Более того, диагноз можно получить с помощью иммуногистоокрашивания. В тех случаях, когда в иммунологическом исследовании используют меченое антитело, можно использовать любой из хорошо известных способов, т.к. сами по себе способы мечения антител хорошо известны. Известно, что расщепление антитела с помощью папаина или пепсина приводит к получению фрагмента антитела, такого как Fab фрагмент или F(аb')2 фрагмент, обладающего способностью связываться с соответствующим антигеном (такой фрагмент в данном описании назван «антигенсвязывающим фрагментом»). Антигенсвязывающие фрагменты антитела по данному изобретению также могут быть использованы таким же образом, как и само антитело по данному изобретению.The monoclonal antibody of this invention can be used in immunological assays to determine (detect) or quantify influenza B virus. Immunological assays are well known per se, and any of the known immunological assays can be used. Classifying the known methods of immunological studies by the type of reaction, they can be divided into sandwich immunological analyzes, competitive immunological analyzes, immunological analyzes based on agglutination, protein blotting, etc. Classifying the known methods of immunological studies by the used label, they can be divided into fluorescence immunological analyzes, enzyme-linked immunosorbent assays, radioimmunological assays, biotin-based immunological assays, and etc. You can use any of these methods. Moreover, the diagnosis can be obtained using immunohistostaining. In cases where a labeled antibody is used in an immunological study, any of the well-known methods can be used, because antibody labeling methods per se are well known. It is known that cleavage of an antibody with papain or pepsin results in an antibody fragment, such as a Fab fragment or F (ab ') 2 fragment, which is capable of binding to the corresponding antigen (such a fragment is referred to herein as an "antigen binding fragment"). Antigen binding fragments of an antibody of the invention may also be used in the same manner as the antibody of the invention itself.
Такие иммунологические исследования сами по себе хорошо известны из уровня техники, поэтому нет необходимости разъяснять их в данном описании. Если коротко, в сэндвичевых иммунологических анализах, например, антитело по данному изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент иммобилизуют на твердом носителе (подложке) как первое антитело. Первое антитело затем вступает в реакцию с образцом, а после промывания твердого носителя получившийся в результате комплекс взаимодействует со вторым антителом, которое вступает в реакцию антиген-антитело с нуклеопротеином вируса В гриппа по данному изобретению. После промывания твердого носителя измеряют второе антитело, связанное с твердым носителем. Если пометить второе антитело ферментом, флуоресцентным соединением, радиоактивным соединением, биотином и т.д., то измерить количество второго антитела, связанного с твердым носителем, можно, измеряя количество метки. Такое измерение проводят для множества стандартных образцов, каждый из которых содержит известную концентрацию нуклеопротеина, после чего для получения калибровочной кривой строят зависимость измеренного количества метки от концентрации нуклеопротеина в стандартных образцах. Определить количество нуклеопротеина в тестируемом образце можно, наложив измеренное количество на калибровочную кривую. Следует заметить, что описанные выше первое антитело и второе антитело можно поменять. В иммунологических анализах, основанных на агглютинации, антитело согласно данному изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент иммобилизуют на частицах, таких как латексные частицы, и частицы взаимодействуют с образцом, после чего проводят измерение оптической плотности. Такое измерение проводят для множества стандартных образцов, каждый из которых имеет известную концентрацию нуклеопротеина, и для получения калибровочной кривой строят зависимость измеренной оптической плотности от концентрации нуклеопротеина в стандартных образцах. Определить количество нуклеопротеина в тестируемом образце можно, сравнив измеренную оптическую плотность с калибровочной кривой.Such immunological studies themselves are well known in the art, so there is no need to explain them in this description. Briefly, in a sandwich immunological assay, for example, an antibody of the invention or an antigen binding fragment thereof is immobilized on a solid support (substrate) as the first antibody. The first antibody then reacts with the sample, and after washing the solid support, the resulting complex interacts with the second antibody, which reacts the antigen-antibody with the influenza B virus nucleoprotein of the present invention. After washing the solid support, a second antibody bound to the solid support is measured. If the second antibody is labeled with an enzyme, a fluorescent compound, a radioactive compound, biotin, etc., then the amount of the second antibody bound to the solid support can be measured by measuring the amount of label. Such a measurement is carried out for many standard samples, each of which contains a known concentration of nucleoprotein, after which, to obtain a calibration curve, the dependence of the measured label amount on the concentration of nucleoprotein in standard samples is built. The amount of nucleoprotein in the test sample can be determined by superimposing the measured amount on a calibration curve. It should be noted that the first antibody and the second antibody described above can be changed. In agglutination-based immunoassays, an antibody of the invention or an antigen binding fragment thereof is immobilized on particles, such as latex particles, and the particles interact with the sample, and then absorbance is measured. This measurement is carried out for many standard samples, each of which has a known concentration of nucleoprotein, and to obtain a calibration curve, the dependence of the measured optical density on the concentration of nucleoprotein in standard samples is built. The amount of nucleoprotein in the test sample can be determined by comparing the measured optical density with a calibration curve.
В данном изобретении также разработано устройство для иммунологического анализа, в котором использовано моноклональное антитело согласно данному изобретению, с помощью которого вирус В гриппа можно легко определить, при этом отличая его от вируса А гриппа.The invention also provides an immunological assay device that utilizes the monoclonal antibody of the invention, with which the influenza B virus can be easily detected while distinguishing it from the influenza A virus.
Устройство для иммунологического анализа содержит зону меченого реагента, содержащую меченое мобильное антитело к вирусу В гриппа, зону нанесения образца, зону подачи проявителя, зону поглощения (впитывания) проявителя и зону детектирования вируса В гриппа, в которой антитело к вирусу В гриппа иммобилизовано на основе (макриксе), причем все зоны заданы на матриксе, и, по крайней мере, одно из следующих - меченое антитело к вирусу В гриппа и антитело к вирусу В гриппа, иммобилизованное в зоне детектирования - является моноклональным антителом по данному изобретению. Образец, нанесенный в зоне нанесения образца, вступает в реакцию антиген-антитело с меченым антителом, находящимся в зоне меченого реагента, за счет чего формируется меченый комплекс антиген-антитело. Этот комплекс антиген-антитело быстро переносится проявителем, поступающим из зоны подачи проявителя, в зону детектирования вируса В гриппа. В данном случае антитело к вирусу В гриппа иммобилизовано на матриксе и меченый комплекс антиген-антитело вступает в реакцию антиген-антитело, так что меченый комплекс антиген-антитело оказывается иммобилизованным на матриксе. Иммобилизован ли комплекс антиген-антитело в зоне детектирования вируса В гриппа или нет, оценивают по наличию метки. Проявитель, проходящий через зону детектирования вируса В гриппа, абсорбируется в зоне поглощения (впитывания) проявителя. Зона нанесения образца и зона меченого реагента могут быть одной и той же зоной (в этом случае образец наносят на зону меченого реагента). В устройстве для иммунологического анализа согласно данному изобретению, по крайней мере, одно из следующих- меченое антитело и антитело, иммобилизованное в зоне детектирования вируса В гриппа - является моноклональным антителом по данному изобретению. Одно из антител может быть также поликлональным антителом. Так как множество молекул нуклеопротеина вируса В гриппа обычно связываются или соединяются друг с другом, вирус В гриппа можно определить, даже если меченое антитело и антитело, иммобилизованное в зоне детектирования вируса В гриппа, являются тем же самым моноклональным антителом.An immunological analysis device comprises a labeled reagent zone containing a labeled mobile antibody for influenza B virus, a sample application zone, a developer supply zone, a developer absorption (absorption) zone, and an influenza B virus detection zone in which an anti-influenza virus B antibody is immobilized based on ( Macrix), with all zones defined on the matrix, and at least one of the following - labeled anti-influenza B virus and anti-influenza B antibody immobilized in the detection zone - is a monoclonal antibody m according to this invention. The sample deposited in the area where the sample is applied reacts the antigen-antibody with a labeled antibody located in the labeled reagent region, whereby a labeled antigen-antibody complex is formed. This antigen-antibody complex is rapidly transferred by the developer from the developer supply zone to the influenza B virus detection zone. In this case, the anti-influenza B antibody is immobilized on the matrix and the labeled antigen-antibody complex reacts with the antigen-antibody, so that the labeled antigen-antibody complex is immobilized on the matrix. Whether the antigen-antibody complex is immobilized in the influenza B virus detection zone or not is assessed by the presence of a label. The developer passing through the influenza B virus detection zone is absorbed in the developer absorption zone. The sample application zone and the labeled reagent zone can be the same zone (in this case, the sample is applied to the labeled reagent zone). In an immunological assay device according to the invention, at least one of the following — a labeled antibody and an antibody immobilized in the influenza B virus detection zone — is a monoclonal antibody of the invention. One of the antibodies may also be a polyclonal antibody. Since many influenza B virus nucleoprotein molecules typically bind or bind to each other, influenza B virus can be detected even if the labeled antibody and the antibody immobilized in the influenza B virus detection area are the same monoclonal antibody.
Составные части (компоненты) устройства для иммунологического анализа согласно данному изобретению ниже будут описаны по отдельности.The constituent parts (components) of an immunological assay device according to this invention will now be described separately.
МатриксMatrix
Матрикс в виде ленты в устройстве для иммунологического анализа согласно данному изобретению изготовлен из водопоглощающего материала, в котором жидкость может перемещаться за счет капиллярных сил. Примеры водопоглощающих материалов включают в себя целлюлозу и ее производные, такие как целлюлоза и нитроцеллюлоза, и фильтровальную бумагу, изготовленную из одного стекловолокна или включающую стекловолокно, мембраны и пористые материалы. Несмотря на то что размер матрикса не ограничен, предпочтительными являются матриксы в форме полоски (ленты) с шириной примерно от 3 мм до 10 мм и длиной примерно от 30 мм до 100 мм, так как они удобны в обращении. Для предотвращения неспецифичной адсорбции белков, присутствующих в образце, на матриксе в процессе измерения, часть или весь матрикс можно блокировать сывороточным животным белком, таким, как бычий сывороточный альбумин (BSA (БСА)), казеином, сахарозой и др.The matrix in the form of a tape in the device for immunological analysis according to this invention is made of water-absorbing material in which the liquid can move due to capillary forces. Examples of water-absorbing materials include cellulose and its derivatives, such as cellulose and nitrocellulose, and filter paper made from a single glass fiber or including glass fiber, membranes and porous materials. Although the size of the matrix is not limited, strip-shaped (ribbon) matrices are preferred with a width of about 3 mm to 10 mm and a length of about 30 mm to 100 mm, as they are easy to handle. To prevent nonspecific adsorption of the proteins present in the sample on the matrix during the measurement process, part or all of the matrix can be blocked with animal whey protein, such as bovine serum albumin (BSA), casein, sucrose, etc.
Зона детектированияDetection area
В зоне детектирования можно задать участок детектирования вируса В гриппа, на котором на матриксе иммобилизовано антитело к вирусу В гриппа. По крайней мере, одно из следующих - антитело к вирусу В гриппа, иммобилизованное на этом участке детектирования, и меченое антитело к вирусу В гриппа, описанное ниже - является моноклональным антителом к вирусу В гриппа по данному изобретению, причем предпочтительно оба они являются моноклональным антителом к вирусу В гриппа по данному изобретению. Антитело к вирусу В гриппа в зоне детектирования предпочтительно размещено на матриксе в форме линии, перпендикулярной направлению перемещения потока жидкости (продольному направлению матрикса) для измерения с высокой чувствительностью. Подходящее поликлональное антитело, используемое в качестве поликлонального антитела к вирусу В гриппа, может быть выбрано из коммерчески и легко доступных поликлональных антител.In the detection zone, you can set the detection section of the influenza B virus, on which the anti-influenza B antibody is immobilized on the matrix. At least one of the following is an anti-influenza virus B antibody immobilized at this detection site and a labeled anti-influenza virus B, described below, is a monoclonal anti-influenza virus B of the invention, and preferably both are a monoclonal anti-virus influenza B virus of the present invention. The influenza B virus antibody in the detection zone is preferably placed on the matrix in the form of a line perpendicular to the direction of fluid flow (longitudinal direction of the matrix) for measurement with high sensitivity. A suitable polyclonal antibody used as a polyclonal antibody to influenza B virus can be selected from commercially and readily available polyclonal antibodies.
Антитело к вирусу В гриппа в зоне детектирования представляет собой описанное выше антитело, причем моноклональные антитела могут быть использованы индивидуально или в комбинации. Антитело к вирусу В гриппа может быть антителом к IgG или IgM или может быть Fab, F(ab')2 или аналогичным, являющимся антигенсвязывающим фрагментом этих антител.The influenza B virus antibody in the detection zone is the antibody described above, wherein monoclonal antibodies can be used individually or in combination. The antibody to influenza B virus can be an antibody to IgG or IgM, or it can be Fab, F (ab ') 2 or the like, which is an antigen-binding fragment of these antibodies.
Антитело к вирусу В гриппа, иммобилизованное на участке детектирования, может быть физически адсорбировано непосредственно в зоне детектирования матрикса или может быть зафиксировано с помощью химической связи, например ковалентной. В альтернативном варианте антитело к вирусу В гриппа может быть связано с нерастворимым в воде носителем, а носитель может содержаться в матриксе. Примеры нерастворимых носителей включают частицы, полученные путем осаждения смеси желатина, аравийской камеди и гексаметафосфата натрия (Японская патентная публикация №63-29223), полистирольные латексные частицы, стекловолокно и пр. Моноклональное антитело к вирусу В гриппа может быть связано с нерастворимым носителем за счет описанного выше химического связывания или физической адсорбции.An antibody to influenza B virus immobilized at the detection site can be physically adsorbed directly in the matrix detection area or can be fixed using a chemical bond, such as covalent. Alternatively, an anti-influenza B virus antibody may be coupled to a water-insoluble carrier, and the carrier may be contained in a matrix. Examples of insoluble carriers include particles obtained by precipitating a mixture of gelatin, gum arabic and sodium hexametaphosphate (Japanese Patent Publication No. 63-29223), polystyrene latex particles, fiberglass, etc. A flu B monoclonal antibody may be coupled to an insoluble carrier due to the described higher chemical bonding or physical adsorption.
В зоне детектирования, помимо участка детектирования вируса В гриппа с помощью антитела к вирусу В гриппа, может быть задан участок детектирования вируса А гриппа с помощью антитела к вирусу А гриппа. Такой участок детектирования вируса А гриппа может быть расположен вблизи от участка детектирования вируса В гриппа либо до («выше»), либо после («ниже») участка детектирования вируса В гриппа по направлению потока проявителя. Антитело к вирусу А гриппа, иммобилизованное на участке детектирования вируса А гриппа, может быть поликлональным антителом или моноклональным антителом, и может, как и в случае антитела к вирусу В гриппа, быть иммобилизовано на матриксе за счет химической связи или физической адсорбции.In the detection zone, in addition to the detection section of the influenza B virus using the anti-influenza B antibody, the detection section of the influenza A virus using the anti-influenza A antibody can be set. Such an influenza A virus detection section may be located close to the influenza B virus detection section either before (“above”) or after (“below”) the influenza B virus detection section in the direction of developer flow. The influenza A antibody antibody immobilized at the influenza A virus detection site may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and, as in the case of the influenza virus B antibody, can be immobilized on the matrix due to chemical bonding or physical adsorption.
Как было отмечено ранее, предпочтительно задать участок детектирования вируса А гриппа в дополнение к участку детектирования вируса В гриппа, для того чтобы одновременно определять (измерять) вирус В гриппа и вирус А гриппа. Такие участки детектирования расположены после зоны меченного ферментом реагента, зоны нанесения образца и зоны подачи проявителя, и до зоны поглощения проявителя, по направлению потока жидкости в матриксе. Участки детектирования могут быть заданы на матриксе в форме множества линий, каждая из которых имеет ширину от примерно 0.5 мм до 5 мм, причем эти линии расположены близко друг к другу. В случае использования матрикса с шириной около 5 мм, участки детектирования можно задать посредством нанесения антитела и антигена, обычно в количестве примерно от 0.1 мкг до 10 мкг соответственно, и высушивания матрикса.As noted previously, it is preferable to specify the detection site of the influenza A virus in addition to the detection site of the influenza B virus in order to simultaneously detect (measure) the influenza B virus and the influenza A virus. Such detection sites are located after the enzyme-labeled reagent zone, the sample application zone and the developer supply zone, and to the developer absorption zone, in the direction of fluid flow in the matrix. The detection sections can be defined on the matrix in the form of a plurality of lines, each of which has a width of from about 0.5 mm to 5 mm, and these lines are located close to each other. In the case of using a matrix with a width of about 5 mm, the detection sites can be set by applying an antibody and antigen, usually in an amount of about 0.1 μg to 10 μg, respectively, and drying the matrix.
Зона меченого реагентаLabeled Reagent Area
Зону меченого реагента можно сформировать путем нанесения меченого антитела к вирусу В гриппа на зону, заданную на матриксе, таким образом, чтобы меченое антитело сохраняло свою подвижность. Эта зона может быть сформирована до («выше») зоны детектирования по направлению потока проявителя из зоны подачи проявителя. Эта зона может быть сформирована путем нанесения меченного ферментом реагента на матрикс или посредством ламинирования водопоглощающей подложки, содержащей меченный ферментом реагент, или путем включения меченного ферментом реагента в часть или весь матрикс, который плотно контактирует с подложкой. В качестве водопоглощающей подложки может быть использована подложка, которую используют для зоны нанесения образца (описана ниже).The zone of the labeled reagent can be formed by applying a labeled antibody to influenza B virus to the area defined on the matrix, so that the labeled antibody retains its mobility. This zone can be formed up to ("above") the detection zone in the direction of flow of the developer from the developer supply zone. This zone can be formed by applying an enzyme-labeled reagent to the matrix, or by laminating a water-absorbing substrate containing the enzyme-labeled reagent, or by incorporating the enzyme-labeled reagent into part or all of the matrix that is in close contact with the substrate. As the water-absorbing substrate, a substrate can be used, which is used for the sample application zone (described below).
По крайней мере, одно из следующих - меченое антитело к вирусу В гриппа и антитело, иммобилизованное в зоне детектирования - является моноклональным антителом к вирусу В гриппа по данному изобретению, и предпочтительно оба они являются моноклональным антителом к вирусу В гриппа по данному изобретению. Помимо меченого антитела к вирусу В гриппа могут быть использованы его фрагменты, как и в случае описанного выше антитела в зоне детектирования.At least one of the following, a labeled anti-influenza B virus antibody and an antibody immobilized in the detection zone, is a monoclonal anti-influenza virus B antibody of the present invention, and preferably both are a monoclonal anti-influenza virus B of the invention. In addition to the labeled antibody for influenza B virus, fragments thereof can be used, as in the case of the antibody described above in the detection zone.
Меченое антитело к вирусу В гриппа можно получить путем связывания антитела с меткой. Примеры меток включают ферменты, коллоидные металлические частицы, окрашенные латексные частицы, люминесцентные соединения, флуоресцентные соединения и пр. В качестве фермента могут быть использованы различные ферменты, применяемые в иммунологических исследованиях (иммуноферментных анализах, EIA). Примеры ферментов включают щелочную фосфатазу, пероксидазу, β-D-галактозидазу и др. Примеры коллоидных металлических частиц включают коллоидное золото, коллоидный селен и др.A labeled anti-B virus antibody can be obtained by binding the antibody to a label. Examples of labels include enzymes, colloidal metal particles, colored latex particles, luminescent compounds, fluorescent compounds, etc. As an enzyme, various enzymes used in immunological studies (enzyme immunoassay, EIA) can be used. Examples of enzymes include alkaline phosphatase, peroxidase, β-D-galactosidase, etc. Examples of colloidal metal particles include colloidal gold, colloidal selenium, and others.
Метку и антитело к вирусу В гриппа можно соединить известными способами, используя ковалентную или нековалентную связь. Примеры способов связывания включают глутаральдегидный метод, периодатный метод, малеимидный метод, пиридилдисульфидный метод, а также способы, в которых используют различные сшивающие агенты (см., например, "PROTEIN, NUCLEIC АСID AND ENZYME" («Белок, нуклеиновая кислота и фермент»). Extra Edition (дополнительный выпуск), т.31, стр.37-45 (1985)). В способах, в которых применяют сшивающий агент, могут быть использованы, например, N-сукцинимидил-4-малеимид-масляная кислота (GMBS), N-сукцинимидил-6-малеимид-гексановая кислота, N-сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)-циклогексан-1-карбоновая кислота или другие аналогичные соединения. В способах, в которых применяют ковалентное связывание, могут быть использованы функциональные группы антитела. В альтернативном варианте меченое антитело к вирусу В гриппа можно получить описанными выше способами связывания после введения функциональной группы, такой как тиольная группа, амино группа, карбоксильная группа, гидроксильная группа и др. В способах, основанных на нековалентном связывании, может быть использована физическая адсорбция и др.The influenza B virus label and antibody can be coupled by known methods using a covalent or non-covalent bond. Examples of binding methods include the glutaraldehyde method, the batch method, the maleimide method, the pyridyl disulfide method, and methods that use various crosslinking agents (see, for example, “PROTEIN, NUCLEIC ACID AND ENZYME” (“Protein, Nucleic Acid and Enzyme”) Extra Edition (additional issue), vol. 31, pp. 37-45 (1985)). In methods that employ a crosslinking agent, for example, N-succinimidyl-4-maleimide-butyric acid (GMBS), N-succinimidyl-6-maleimide-hexanoic acid, N-succinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) can be used ) -cyclohexane-1-carboxylic acid or other similar compounds. In methods that employ covalent binding, antibody functional groups may be used. Alternatively, a labeled anti-influenza B virus antibody can be prepared by the above-described binding methods after administration of a functional group such as a thiol group, an amino group, a carboxyl group, a hydroxyl group, etc. Physical adsorption can be used in methods based on non-covalent binding. other
В тех случаях, когда вирус А гриппа определяют одновременно с детектированием вируса В гриппа, как было указано выше, меченое антитело к вирусу А гриппа вводят в зону меченого реагента для подготовки устройства. Меченое антитело к вирусу А гриппа и меченое антитело к вирусу В гриппа, содержащиеся в зоне меченого реагента, могут находиться либо в матриксе, либо в водопоглощающей подложке, либо они могут содержаться и в матриксе, и в водопоглощающей подложке. В случае одновременного определения вирусов А гриппа и В гриппа, в связи с тем, что используют большие количества меченых реагентов, для измерений с высокой чувствительностью меченные ферментом реагенты индивидуально или в комбинации полезно вводить и в матрикс, и в подложку. Несмотря на то что количество меченого антитела к вирусу А гриппа и меченого антитела к вирусу В гриппа может быть соответствующим образом выбрано в зависимости от ожидаемого количества изучаемого вещества в образце, обычно оно составляет от примерно 0.01 мкг до 5 мкг в расчете на сухой вес. При введении меченого антитела к вирусу А гриппа и меченого антитела к вирусу В гриппа в зону меченного ферментом реагента, их можно использовать вместе со стабилизатором, агентом, регулирующим солюбилизацию, и пр.In cases where influenza A virus is detected simultaneously with the detection of influenza B virus, as indicated above, a labeled antibody to influenza A virus is introduced into the labeled reagent zone to prepare the device. The labeled antibody to influenza A virus and the labeled antibody to influenza B virus contained in the labeled reagent region can be either in the matrix or in the water-absorbing substrate, or they can be both in the matrix and in the water-absorbing substrate. In the case of the simultaneous determination of influenza A and B viruses, due to the fact that large amounts of labeled reagents are used, it is useful to individually and in combination to enter both the matrix and the substrate for measuring with high sensitivity enzyme-labeled reagents. Although the amount of the labeled antibody for influenza A virus and the labeled antibody for influenza B virus can be appropriately selected depending on the expected amount of the test substance in the sample, it usually ranges from about 0.01 μg to 5 μg based on dry weight. With the introduction of labeled antibodies to influenza A virus and labeled antibodies to influenza B virus to the zone of the enzyme labeled reagent, they can be used together with a stabilizer, solubilization regulating agent, etc.
Зона нанесения образцаSample application area
Зону нанесения образца можно задать на матриксе после («ниже») зоны подачи проявителя и до («выше») зоны детектирования по направлению потока проявителя, без введения реагента или сходного вещества. Зону нанесения образца также можно задать в: 1) заранее заданной области (месте) после зоны подачи проявителя и до зоны меченного ферментом реагента по направлению потока проявителя, 2) заранее заданной области (месте) после зоны меченого реагента и до зоны детектирования по направлению потока проявителя, или 3) заранее заданном участке зоны меченого реагента. В устройстве, в котором зону нанесения образца формируют в зоне меченного ферментом реагента, предпочтительно вводить водопоглощающую подложку, содержащую ферментную метку для эффективного проведения исследования, как было указано выше. С помощью устройства, содержащего подложку, можно с высокой чувствительностью измерить неосновной (примесный) компонент, содержащийся в образце, так как можно нанести большое количество образца жидкости. Материал, из которого изготовлена водопоглощающая подложка, выбирают из материалов, которые плохо адсорбируют меченый реагент и вирус гриппа. Примеры материалов включают в себя пористые материалы, изготовленные из синтетических или природных полимерных соединений, таких как поливиниловый спирт (PVA), нетканые материалы, целлюлозу и пр., причем эти материалы можно использовать индивидуально или в комбинации. Несмотря на то что размер, толщина, плотность и прочие аналогичные характеристики подложки не ограничены, для эффективного проведения исследования предпочтительно использовать подложку, имеющую продольную и поперечную длину примерно от 3 мм до 10 мм и толщину примерно от 0.5 мм до 4 мм.The application zone of the sample can be set on the matrix after (below) the developer supply zone and before (above) the detection zone in the direction of developer flow, without introducing a reagent or similar substance. The sample application zone can also be set in: 1) a predetermined region (location) after the developer supply zone and to the zone of the enzyme labeled with the enzyme in the direction of the developer flow, 2) a predetermined region (place) after the labeled reagent zone and to the detection zone in the flow direction developer, or 3) a predetermined portion of the labeled reagent zone. In a device in which a sample deposition zone is formed in the region of an enzyme-labeled reagent, it is preferable to introduce a water-absorbing substrate containing an enzyme label for efficiently conducting the study, as described above. Using a device containing a substrate, it is possible to measure with high sensitivity the minority (impurity) component contained in the sample, since a large amount of the liquid sample can be applied. The material from which the water-absorbing substrate is made is selected from materials that poorly adsorb the labeled reagent and influenza virus. Examples of materials include porous materials made from synthetic or natural polymeric compounds, such as polyvinyl alcohol (PVA), non-woven materials, cellulose, etc., which materials can be used individually or in combination. Although the size, thickness, density, and other similar characteristics of the substrate are not limited, it is preferable to use a substrate having a longitudinal and transverse length of about 3 mm to 10 mm and a thickness of about 0.5 mm to 4 mm for effective research.
Зона подачи проявителяDeveloper Supply Area
Зона подачи проявителя представляет собой зону, в которую подается проявитель, сформированную на одном конце матрикса в его продольном направлении. Исследование можно начать путем погружения этой зоны в проявитель, содержащийся в емкости в количестве, достаточном для того, чтобы проявитель достиг зоны поглощения проявителя. Емкость для жидкости, содержащую проявитель, можно присоединить к зоне подачи проявителя, и исследование может быть начато посредством открывания заглушки (крышки, перегородки) сосуда с жидкостью, за счет чего проявитель вступает в контакт с матриксом. Проявитель может содержать подходящее поверхностно-активное вещество, буферный агент, стабилизатор, антибактериальный агент и пр. В тех случаях, когда в качестве метки используют фермент, в проявитель можно добавить субстрат в дополнение к описанной далее зоне субстрата. Примеры буферных растворов, содержащих буферный агент, включают ацетатный буфер, боратный буфер, трис-НСl буфер, буфер на основе диэтаноламина и т.д. В зоне подачи проявителя можно установить подложку для проявителя для его стабильной и непрерывной подачи в матрикс. В качестве подложки для проявителя можно использовать фильтровальную бумагу, изготовленную, например, из целлюлозы или производных целлюлозы.The developer supply zone is a zone into which a developer is formed formed at one end of the matrix in its longitudinal direction. The study can be started by immersing this zone in the developer, contained in the container in an amount sufficient to ensure that the developer reaches the absorption zone of the developer. A liquid container containing a developer can be attached to the developer supply zone, and research can be started by opening the plug (lid, septum) of the vessel with the liquid, whereby the developer comes into contact with the matrix. The developer may contain a suitable surfactant, a buffering agent, a stabilizer, an antibacterial agent, etc. In cases where an enzyme is used as a label, a substrate can be added to the developer in addition to the substrate zone described below. Examples of buffer solutions containing a buffering agent include acetate buffer, borate buffer, Tris-HCl buffer, diethanolamine-based buffer, etc. In the developer supply zone, a developer substrate can be installed for its stable and continuous supply to the matrix. As a substrate for the developer, you can use filter paper made, for example, from cellulose or cellulose derivatives.
Зона поглощения проявителяDeveloper Absorption Area
Зону поглощения (впитывания) проявителя задают на конце матрикса, противоположном тому концу, на котором расположена зона подачи проявителя. Эту зону создают для поглощения (впитывания) подаваемого в матрикс проявителя, с тем чтобы без труда осуществить проведение анализа. Зону поглощения проявителя можно задать за счет удлинения матрикса. Для ускорения поглощения к матриксу можно присоединить водопоглощающий материал. В качестве водопоглощающего материала можно использовать фильтровальную бумагу, обладающую высокой емкостью по отношению к воде, изготовленную из природных полимерных соединений, синтетических полимерных соединений и пр. Можно использовать губку или аналогичное приспособление. Несмотря на то что зона поглощения проявителя изготовлена из абсорбционного материала в форме подложки, объем которой позволяет впитать весь проявитель, компактное устройство для иммунологического анализа можно изготовить посредством ламинирования поглощающего материала, расположенного над или под матриксом.The developer absorption (absorption) zone is set at the end of the matrix opposite to that end at which the developer supply zone is located. This zone is created to absorb (absorb) the developer supplied to the matrix in order to easily carry out the analysis. The developer absorption zone can be set by lengthening the matrix. To accelerate absorption, a water-absorbing material can be attached to the matrix. As a water-absorbing material, filter paper having a high capacity with respect to water can be used, made from natural polymer compounds, synthetic polymer compounds, etc. You can use a sponge or similar device. Despite the fact that the developer absorption zone is made of absorption material in the form of a substrate, the volume of which allows the entire developer to be absorbed, a compact device for immunological analysis can be made by laminating the absorbing material located above or below the matrix.
Зона субстратаSubstrate zone
В тех случаях, когда в качестве метки используют фермент, находящийся в зоне меченого реагента, субстрат может содержаться в проявителе, как было описано выше, или зону субстрата можно задать на матриксе вблизи зоны подачи проявителя. Зона субстрата предпочтительно может быть образована в описанной выше подложке для проявителя, расположенной в зоне подачи проявителя, за счет введения субстрата в подложку для проявителя.In cases where an enzyme located in the labeled reagent zone is used as a label, the substrate may be contained in the developer, as described above, or the substrate zone can be set on the matrix near the developer supply zone. The substrate zone can preferably be formed in the developer substrate described above, located in the developer supply zone, by introducing the substrate into the developer substrate.
В качестве субстрата в зависимости от фермента, используемого в качестве метки, могут применять различные субстраты, дающие окрашивание, флуоресцентные субстраты, люминесцентные субстраты и пр.As a substrate, depending on the enzyme used as a label, various substrates giving staining, fluorescent substrates, luminescent substrates, etc. can be used.
(а) Субстраты, дающие окрашивание(a) Substrates giving staining
Для пероксидазы: 2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфонат) (ABTS), 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (ТМВ) и диаминобензидин (DAB), совместно с пероксидом водорода;For peroxidase: 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonate) (ABTS), 3.3 ', 5.5'-tetramethylbenzidine (TMB) and diaminobenzidine (DAB), together with hydrogen peroxide;
Для щелочной фосфатазы: 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат (BCIP).For alkaline phosphatase: 5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate (BCIP).
(б) Флуоресцентные субстраты.(b) Fluorescent substrates.
Для щелочной фосфатазы: 4-метилумбеллиферилфосфат (4MUP).For alkaline phosphatase: 4-methylumbelliferyl phosphate (4MUP).
Для β-D-галактозидазы: 4-метилумбеллиферил-β-D-галактозид (4MUG).For β-D-galactosidase: 4-methylumbelliferyl-β-D-galactoside (4MUG).
(в) Люминесцентные субстраты.(c) Luminescent substrates.
Для щелочной фосфатазы: 3-(2'-спироадамантан)-4-метокси-4-(3”-фосфорилокси)-фенил-1,2-диоксетан-2-натриевая соль (AMPPD).For alkaline phosphatase: 3- (2'-spiroadamantane) -4-methoxy-4- (3 ”-phosphoryloxy) phenyl-1,2-dioxetane-2-sodium salt (AMPPD).
Для β-D-галактозидазы: 3-(2'-спироадамантан)-4-метокси-4-(3”-β-D-галактопиранозил)-фенил-1,2-диоксетан (AMGPD).For β-D-galactosidase: 3- (2'-spiroadamantane) -4-methoxy-4- (3 ”-β-D-galactopyranosyl) phenyl-1,2-dioxetane (AMGPD).
Для пероксидазы: люминол и изолюминол совместно с пероксидом водорода.For peroxidase: luminol and isoluminol together with hydrogen peroxide.
В тех случаях, когда задают зону субстрата, ее обычно можно сформировать посредством нанесения водного раствора субстрата в форме линии на подложку для проявителя и высушивания раствора. При желании можно добавить агент, усиливающий сигнал, стабилизатор, агент, контролирующий солюбилизацию, и пр. Положение зоны субстрата не ограничено в пределах подложки для проявителя, расположенной на конце матрикса. Количество субстрата, добавляемого в проявитель или подложку для проявителя, можно выбрать в зависимости от условий проведения анализа. Обычно оно составляет от примерно 5 мкг до 500 мкг на устройство.In cases where a substrate zone is specified, it can usually be formed by applying an aqueous solution of the substrate in the form of a line to the developer substrate and drying the solution. If desired, you can add an agent that enhances the signal, a stabilizer, an agent that controls solubilization, etc. The position of the substrate zone is not limited within the developer substrate located at the end of the matrix. The amount of substrate added to the developer or developer substrate can be selected depending on the conditions of the analysis. Typically, it is from about 5 μg to 500 μg per device.
Расположение зонLocation of zones
Предпочтительный вариант выполнения устройства для иммунологического анализа согласно данному изобретению схематично показан на Фиг.2-4. На Фиг.2 цифрой 2 обозначен матрикс, цифра 4 обозначает зону меченого реагента, цифра 8 обозначает зону нанесения образца, цифра 3 обозначает зону подачи проявителя, цифра 5 - зону поглощения проявителя, цифрой 6а обозначена зона детектирования вируса А гриппа, цифра 7 обозначает зону субстрата, и цифра 9 обозначает образец. В этом варианте выполнения изобретения зона 8 нанесения образца и зона 4 меченого реагента представляют собой одну зону. Цифрой 6b обозначена зона детектирования вируса В гриппа, цифрой 10 обозначена зона контроля (подтверждения прохождения проявителя), и цифрой 11 обозначена емкость для проявителя (см. Пример 4 ниже).A preferred embodiment of an immunological assay device according to the invention is shown schematically in FIGS. 2-4. In figure 2, figure 2 denotes the matrix, figure 4 denotes the labeled reagent zone, figure 8 denotes the sample application zone, figure 3 denotes the developer supply zone, figure 5 denotes the developer absorption zone, figure 6a denotes the influenza A virus detection zone, figure 7 denotes the substrate, and the
Способ использования устройства для иммунологического анализа.The method of using the device for immunological analysis.
С помощью устройства для иммунологического анализа согласно данному изобретению можно определять (исследовать) вирус В гриппа в различных образцах. Анализы можно проводить, если сначала нанести образец в зону нанесения образца устройства для иммунологического анализа, а затем подать проявитель в подложку для проявителя, за счет чего образец будет перемещаться по матриксу. В качестве разбавителя для образца можно использовать буфер, содержащий поверхностно-активное вещество. Проявитель перемещается по матриксу за счет капиллярных сил и достигает зоны поглощения проявителя. В зоне поглощения проявителя абсорбируются те компоненты образца, которые не связались в зоне детектирования, меченный ферментом реагент и пр., и проявление (перемещение) заканчивается. Через заранее заданное время (обычно от 10 до 20 минут) исследуют зону детектирования и измеряют количество метки, связавшейся с участком детектирования за счет вируса В гриппа, содержащегося в образце, что позволяет определить (измерить) вирус В гриппа. В зависимости от использованных субстрата или субстрата и фермента детектирование можно провести с помощью визуального наблюдения или с помощью измерительного устройства, такого как колориметр, флуориметр, счетчик фотонов, фоточувствительная пленка и др. Простым способом измерения является, например, способ, согласно которому окрашивание зоны детектирования определяют визуально. Согласно этому способу, используя цветовую шкалу, соответствующую концентрациям вируса В гриппа, можно провести полуколичественный анализ. Можно провести количественный анализ, если окрашивание зоны детектирования перевести в цифровую форму с помощью колориметра или другого аналогичного устройства.Using the device for immunological analysis according to this invention, it is possible to determine (investigate) the influenza B virus in various samples. Analyzes can be carried out if you first apply the sample to the application area of the device for immunological analysis, and then submit the developer to the substrate for the developer, whereby the sample will move through the matrix. As a diluent for the sample, a buffer containing a surfactant can be used. The developer moves through the matrix due to capillary forces and reaches the developer absorption zone. In the absorption zone of the developer, those components of the sample that are not bound in the detection zone, the enzyme labeled reagent, etc., are absorbed, and the manifestation (movement) ends. After a predetermined time (usually from 10 to 20 minutes), the detection zone is examined and the amount of label associated with the detection site is measured by the influenza virus B contained in the sample, which allows the determination of the influenza B virus. Depending on the substrate or substrate and enzyme used, detection can be carried out by visual observation or by using a measuring device such as a colorimeter, fluorimeter, photon counter, photosensitive film, etc. A simple measurement method is, for example, a method according to which the coloring of the detection zone determined visually. According to this method, using a color scale corresponding to the concentrations of influenza B virus, a semi-quantitative analysis can be performed. A quantitative analysis can be carried out if the coloring of the detection zone is digitized using a colorimeter or other similar device.
Далее принцип исследования будет объяснен более подробно на примере предпочтительного варианта выполнения устройства для иммунологического анализа согласно данному изобретению, показанного на Фиг.2-4 в качестве примера. Образец 9 наносят на зону 8 нанесения образца, и проявитель из емкости 11 для проявителя подают в зону 3 подачи проявителя. Проявитель перемещается по матриксу 2 в направлении, показанном горизонтальной незаштрихованной стрелкой, за счет капиллярного воздействия. Субстрат, содержащийся в зоне 7 субстрата, растворяется в проявителе и продвигается вместе с ним. С другой стороны, образец 9 вступает в реакцию с меченым антителом в зоне 4 меченого реагента, так что образуется меченый комплекс антиген-антитело. Когда проявитель доходит до этого участка, меченый комплекс антиген-антитело начинает перемещение в матриксе 2, реагируя при этом с субстратом, содержащимся в проявителе. Когда меченый комплекс антиген-антитело достигает зоны 6b детектирования вируса В гриппа, он взаимодействует с антителом к вирусу В гриппа, иммобилизованным в этой зоне, за счет чего иммобилизуется. В тех случаях, когда вирус В гриппа содержится в образце, появляется окрашивание за счет реакции между меченым ферментом и субстратом. Напротив, когда вирус В гриппа в образце отсутствует, меченое антитело не может вступить в реакцию антиген-антитело и, таким образом, не может быть иммобилизовано в зоне 6b детектирования вируса В гриппа, и окрашивание не возникает. Таким образом, содержит ли образец вирус В гриппа или нет, можно определить по тому, окрашена ли зона 6b детектирования вируса В гриппа или нет. В зоне 10 контроля иммобилизован фермент, который дает окрашивание при реакции с реагентом в проявителе. Поэтому, если зона 10 контроля окрашена, это означает, что проявитель дошел до этой зоны. В альтернативном варианте в зоне 10 контроля может быть иммобилизовано антитело к ферментной метке, посредством чего меченый реагент, который доходит до зоны 10 контроля, захватывается этим антителом, и захваченная метка и субстрат, содержащийся в проявителе, взаимодействуют таким образом, что возникает окрашивание, когда туда доходит проявитель (в приведенных далее Примерах иммобилизовано антитело к щелочной фосфатазе). Одновременно можно также провести детектирование вируса А гриппа, вводя меченое антитело к вирусу А гриппа в зону 4 меченого реагента и задав зону 6а детектирования вируса А гриппа, так что в процессе одного анализа можно определить, является ли вирус гриппа вирусом типа А или вирусом типа В.Next, the research principle will be explained in more detail using an example of a preferred embodiment of an immunological assay device according to the invention, shown in FIGS. 2-4 as an example.
Матрикс можно ламинировать и закрепить на подложке, изготовленной из пластика, металла, бумаги и др. Посредством фиксации матрикса, в том случае если он изготовлен из пластика или аналогичного материала, использования емкости, содержащей проявитель, в зоне подачи проявителя, и применения покрытия матрикса в виде корпуса («чехла»), содержащего сквозные отверстия, соответствующие описанным выше зонам, можно создать удобное в обращении устройство. Образец, который должен быть проанализирован с помощью устройства для иммунологического анализа согласно данному изобретению, представляет собой образец, полученный от человека, животного и пр., который предположительно содержит вирус гриппа. Примеры образцов включают в себя экстракты жидкостей тела, таких как мазок из носа, аспират из носа, мазок из зева и пр.The matrix can be laminated and fixed on a substrate made of plastic, metal, paper, etc. By fixing the matrix, if it is made of plastic or similar material, use a container containing the developer in the developer supply zone, and use the matrix coating in a case (“cover”) containing through holes corresponding to the zones described above, it is possible to create a device that is convenient to use. The sample to be analyzed using the immunological analysis apparatus of this invention is a sample obtained from a human, animal, etc., which is suspected to contain the influenza virus. Examples of samples include extracts of body fluids, such as a nasal swab, a nasal aspirate, a throat swab, etc.
Данное изобретение ниже будет описано более подробно с помощью Сравнительных Примеров и Примеров. Однако изобретение не ограничено приведенными примерами.The invention will now be described in more detail using Comparative Examples and Examples. However, the invention is not limited to the examples given.
ПримерыExamples
Пример 1. Получение моноклонального антитела к вирусу В гриппаExample 1. Obtaining a monoclonal antibody to influenza B virus
Вакцину против НА гриппа (штамм B/Yamanashi/166/98), или рекомбинантный нуклеопротеин вируса В гриппа (r-NP/B из B/Yamanashi/166/98); база данных DDBJ/GenBank database), использовали в качестве иммуногена.The influenza HA vaccine (strain B / Yamanashi / 166/98), or the recombinant influenza B virus nucleoprotein (r-NP / B from B / Yamanashi / 166/98); DDBJ / GenBank database), used as an immunogen.
После полного перемешивания иммуногена с равным количеством полного адъюванта Фрейнда (производства IATRON) иммуноген вводили Balb/c мышам 4 раза с двухнедельными интервалами. За три дня до слияния клеток иммуноген вводили посредством инъекции в брюшную полость мышей, слияние клеток селезенки мышей и клеток миеломы (P3U1) осуществляли, используя полиэтиленгликоль. В качестве культуральной среды использовали HAT селекционную среду. Примерно две недели спустя собрали культуральный супернатант, который затем подвергли скринингу. При первичном скрининге использовали твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA (ТИФА)), в котором применяли твердую фазу, на которую были иммобилизованы вакцина против НА гриппа, содержащая нуклеопротеин антигена, и рекомбинантный нуклеопротеин антигена вируса В гриппа (r-NP/B). Если описывать более подробно, вакцину против НА гриппа разбавили в 300 раз 0.1 М карбонатным буфером, рН 9.6, рекомбинантный нуклеопротеин антигена вируса В типа разбавили до концентрации 1 мкг/мл тем же буфером. Соответствующие полученные растворы добавили в лунки микропланшетного модуля (производства NUNC) в количестве 100 мкл/лунку, и инкубировали микропланшет при 4°С в течение ночи для иммобилизации антигенов. После промывания каждой лунки PBS (фосфатно-солевым буферным раствором), содержащим 0.1% Твин 20 (товарный знак) (PBS-Tween), добавили 300 мкл 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в PBS и инкубировали микропланшет при 4°С в течение ночи, проводя, таким образом, блокирование. После удаления блокирующего раствора добавили 100 мкл культурального супернатанта и выдерживали полученную смесь для осуществления взаимодействия в течение часа при 37°С. После тщательного промывания каждой лунки PBS-Tween в каждую лунку добавили 100 мкл меченного ферментом антитела к мышиному Igs (производства DAKO), разбавленного в 2000 раз реакционной средой (0.05 М фосфатный буфер, рН 7.5, содержащий 0.2% BSA, 0.2% Emulgen 985, 1% сахарозы, 1% КСl), после чего смесь оставили для реакции при 37°С на один час. После реакции каждую лунку тщательно промыли PBS-Tween и в каждую лунку добавили по 100 мкл 2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоната) (ABTS). Реакционную смесь выдерживали при комнатной температуре в течение 30 минут для осуществления реакции, после чего в каждую лунку добавили по 100 мкл стоп-раствора и измерили уровень окрашивания при основной длине волны 415 нм и при второй длине волны 490 нм.After the immunogen was fully mixed with an equal amount of Freund's complete adjuvant (manufactured by IATRON), the immunogen was administered Balb / c to mice 4 times at two-week intervals. Three days before the cell fusion, the immunogen was administered by injection into the abdominal cavity of mice, the fusion of mouse spleen cells and myeloma cells (P3U1) was carried out using polyethylene glycol. As a culture medium used HAT selection medium. About two weeks later, the culture supernatant was collected, which was then screened. In the initial screening, an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used, in which a solid phase was used to immobilize the influenza HA vaccine containing the antigen nucleoprotein and the recombinant influenza B virus antigen nucleoprotein (r-NP / B). In more detail, the influenza HA vaccine was diluted 300 times with 0.1 M carbonate buffer, pH 9.6, the recombinant type B virus antigen nucleoprotein was diluted to a concentration of 1 μg / ml with the same buffer. The corresponding resulting solutions were added to the wells of the microplate module (manufactured by NUNC) in an amount of 100 μl / well, and the microplate was incubated at 4 ° C. overnight to immobilize the antigens. After washing each well with PBS (phosphate buffered saline) containing 0.1% Tween 20 (trademark) (PBS-Tween), 300 μl of 1% bovine serum albumin (BSA) was added to PBS and the microplate was incubated at 4 ° C for nights, spending thus blocking. After removal of the blocking solution, 100 μl of culture supernatant was added and the resulting mixture was kept to react for one hour at 37 ° C. After thoroughly washing each well with PBS-Tween, 100 μl of enzyme-labeled anti-mouse Igs antibody (manufactured by DAKO) diluted 2000 times with reaction medium (0.05 M phosphate buffer, pH 7.5, containing 0.2% BSA, 0.2% Emulgen 985, was added to each well). 1% sucrose, 1% KCl), after which the mixture was allowed to react at 37 ° C for one hour. After the reaction, each well was thoroughly washed with PBS-Tween and 100 μl of 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonate) (ABTS) was added to each well. The reaction mixture was kept at room temperature for 30 minutes to carry out the reaction, after which 100 μl stop solution was added to each well and the level of staining was measured at the main wavelength of 415 nm and at a second wavelength of 490 nm.
Культуральные супернатанты, оцененные как положительные, подвергли вторичному скринингу с помощью ELISA, используя рекомбинантные нуклеопротеины (r-NP/H1N1 из штамма A/New Caledonia/20/99 и I-NP/H3N2 из A/Kitakyushu/159/93; база данных DDBJ/GenBank). В результате получили три штамма гибридом (гибридома FrB1-03, гибридома FrB1-07 и гибридома FVB2-16), каждый из которых продуцирует антитело, взаимодействующее с нуклеопротеином антигена вируса В гриппа и не взаимодействующее с нуклеопротеином антигена вируса А гриппа. Все подклассы всех моноклональных антител, полученных от этих трех 3 гибридом, принадлежали к IgG1. Реакционная способность гибридом приведена в Таблице 1.Cultured supernatants rated positive were re-screened by ELISA using recombinant nucleoproteins (r-NP / H1N1 from strain A / New Caledonia / 20/99 and I-NP / H3N2 from A / Kitakyushu / 159/93; database DDBJ / GenBank). The result was three strains of hybridomas (hybridoma FrB1-03, hybridoma FrB1-07 and hybridoma FVB2-16), each of which produces an antibody that interacts with the influenza B antigen nucleoprotein and does not interact with the influenza A virus antigen nucleoprotein. All subclasses of all monoclonal antibodies obtained from these three 3 hybridomas belonged to IgG1. The reactivity of the hybridomas is shown in Table 1.
Реакционная способность моноклональных антител.Table 1
Reactivity of monoclonal antibodies.
Пример 2. Реакционная способность моноклональных антител согласно белковому блоттингу.Example 2. The reactivity of monoclonal antibodies according to protein blotting.
Реакционная способность моноклональных антител была подтверждена с помощью белкового блоттинга с использованием рекомбинантных антигенов, вакцины против НА гриппа (содержащей нуклеопротеин антигена) и раствора вируса. Каждый образец растворили в 0.01 М трис-НСl буфере (рН 8.0), содержащем 0.001 М ЭДТА, 1% SDS, 5% 2МЕ (2-меркаптоэтанол), 10% глицерина и 0.005% ВРВ (бромфеноловый голубой). Каждый из полученных растворов нагрели до 100°С, после чего исследовали с помощью электрофореза. Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) проводили стандартным способом, используя e-PAGEL, концентрация геля 10% (производства АТТО). После электрофореза полосы перенесли на PVDF мембрану (производства АТТО) и блокировали с помощью Block Асе (производства DAINIPPON PHARMACEUTICAL) при 4°С в течение ночи. После удаления блокирующего раствора и после промывания мембраны PBS-Tween добавили раствор каждого моноклонального антитела, доведенный до концентрации 10 мкг/мл и оставили для реакции при комнатной температуре на 45 минут. После тщательного промывания мембраны PBS-Tween добавили меченные ферментом антитела к мышиному IgG (производства CAPPEL), разбавленные в 4000 раз реакционной средой, и оставили для реакции при комнатной температуре на 45 минут. После тщательного промывания мембраны PBS-Tween мембрану экспонировали на рентгеновскую пленку (производства KODAK) в течение от 1 до 15 минут, используя для детектирования сигналов систему детектирования для белкового блоттинга ECL Western Blotting Detection System (производства AMERSHAM BIOSCIENCES).The reactivity of monoclonal antibodies was confirmed by protein blotting using recombinant antigens, a vaccine against HA flu (containing the antigen nucleoprotein) and a virus solution. Each sample was dissolved in 0.01 M Tris-Hcl buffer (pH 8.0) containing 0.001 M EDTA, 1% SDS, 5% 2ME (2-mercaptoethanol), 10% glycerol, and 0.005% BPB (bromophenol blue). Each of the resulting solutions was heated to 100 ° C, and then examined by electrophoresis. Polyacrylamide gel electrophoresis in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS-PAGE) was performed in a standard manner using e-PAGEL, gel concentration 10% (manufactured by ATTO). After electrophoresis, the bands were transferred onto a PVDF membrane (manufactured by ATTO) and blocked using Block ACE (manufactured by DAINIPPON PHARMACEUTICAL) at 4 ° C overnight. After removing the blocking solution and after washing the PBS-Tween membrane, a solution of each monoclonal antibody was added, adjusted to a concentration of 10 μg / ml, and allowed to react at room temperature for 45 minutes. After thoroughly washing the PBS-Tween membranes, enzyme-labeled anti-mouse IgG antibodies (manufactured by CAPPEL), diluted 4,000 times with the reaction medium, were added and allowed to react at room temperature for 45 minutes. After thoroughly washing the PBS-Tween membrane, the membrane was exposed to X-ray film (manufactured by KODAK) for 1 to 15 minutes using the ECL Western Blotting Detection System (AMERSHAM BIOSCIENCES) protein blot detection system for signal detection.
Моноклональные антитела FrB1-03 и FrB1-07 дали полосу в районе примерно от 60 кДа до 75 кДа. Результаты приведены на Фиг.1.Monoclonal antibodies FrB1-03 and FrB1-07 gave a band in the region of about 60 kDa to 75 kDa. The results are shown in figure 1.
Пример 3. Измерение антигена с помощью ELISA с использованием моноклонального антитела.Example 3. Measurement of antigen by ELISA using a monoclonal antibody.
Раствор каждого из трех типов очищенных моноклональных антител в 0.1 М фосфатном буфере, рН 7.5, имеющий концентрацию 2 мкг/мл, добавили в лунки микропланшетного модуля (производства NUNC) в количестве 100 мкл на лунку и инкубировали микропланшет при 4°С в течение ночи, чтобы иммобилизовать антитело. Затем каждую лунку промыли PBS, содержащим 0.1% Твин 20 (Tween 20, товарный знак) (PBS-Tween), туда же добавили по 300 мкл 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в PBS и проводили блокирование при 4°С в течение ночи. Раствор вируса В гриппа, растворенного в реакционной среде, добавили в каждую лунку в количестве 100 мкл на лунку и оставили для реакции при 37°С на один час. После тщательного промывания каждой лунки PBS-Tween в них добавили каждое из меченных щелочной фосфатазой моноклональных антител, растворенных в реакционной среде, в количестве 100 мкл/лунку и оставили для реакции при 37°С на один час. После реакции каждую лунку тщательно промыли PBS-Tween и добавили в каждую лунку по 100 мкл 4-нитрофенилфосфата (4-NPP). После реакции при комнатной температуре в течение 30 минут добавили стоп-раствор в количестве 100 мкл/лунку. Измерили уровень окрашивания при основной длине волны 415 нм и при второй длине волны 490 нм. Те образцы, для которых уровень окрашивания превосходил контрольный (на буфере) не менее чем в 2.1 раза, считали положительными, и реакционную способность выражали в терминах окончательного разведения, при котором образец все еще считался положительным.A solution of each of the three types of purified monoclonal antibodies in 0.1 M phosphate buffer, pH 7.5, at a concentration of 2 μg / ml, was added to the wells of a microplate module (manufactured by NUNC) in an amount of 100 μl per well and the microplate was incubated at 4 ° C overnight, to immobilize the antibody. Then, each well was washed with PBS containing 0.1% Tween 20 (Tween 20, trademark) (PBS-Tween), 300 μl of 1% bovine serum albumin (BSA) in PBS was added thereto and blocked at 4 ° C overnight . A solution of influenza B virus dissolved in the reaction medium was added to each well in an amount of 100 μl per well and allowed to react at 37 ° C. for one hour. After thoroughly washing each well with PBS-Tween, they added each of alkaline phosphatase-labeled monoclonal antibodies dissolved in the reaction medium in an amount of 100 μl / well and allowed to react at 37 ° C for one hour. After the reaction, each well was thoroughly washed with PBS-Tween and 100 μl of 4-nitrophenyl phosphate (4-NPP) was added to each well. After the reaction at room temperature, a stop solution of 100 μl / well was added over 30 minutes. The level of staining was measured at the main wavelength of 415 nm and at the second wavelength of 490 nm. Those samples for which the staining level exceeded the control (on buffer) by at least 2.1 times were considered positive, and reactivity was expressed in terms of the final dilution, at which the sample was still considered positive.
Все из 9 комбинаций, полученных с тремя типами моноклональных антител, обладали реакционной способностью, в 4 и более раз превосходящей реакционную способность коммерческих моноклональных антител к вирусу В гриппа. Результаты приведены в Таблице 2.All of the 9 combinations obtained with the three types of monoclonal antibodies had a reactivity 4 or more times greater than the reactivity of commercial monoclonal antibodies to influenza B virus. The results are shown in Table 2.
ELISA для измерения антигенов.table 2
ELISA for measuring antigens.
** Коммерчески доступное моноклональное антитело* Fab'-tagged
** Commercially available monoclonal antibody
Сравнительный Пример 1. Получение моноклонального антитела к вирусу В гриппа, меченного щелочной фосфатазой.Comparative Example 1. Obtaining a monoclonal antibody to influenza B virus labeled with alkaline phosphatase.
Моноклональное антитело к вирусу В гриппа (FrB1-03) обработали пепсином для удаления Fc участка, с тем чтобы получить F(аb')2, дисульфидную связь расщепили 2МЕ (2-меркаптоэтанолом производства NACALAI TESQUE) для получения F(ab')2 с открытой тиольной группой. Затем щелочную фосфатазу, в которую была введена малеимидная группа, соединили с F(ab')2, полученный продукт очистили с помощью гель-проникающей хроматографии для получения очищенного антитела к вирусу В гриппа, меченного щелочной фосфатазой.Influenza B virus monoclonal antibody (FrB1-03) was treated with pepsin to remove the Fc region to obtain F (ab ') 2 , the disulfide bond was cleaved with 2ME (2-mercaptoethanol manufactured by NACALAI TESQUE) to obtain F (ab') 2 s open thiol group. Then, alkaline phosphatase, into which the maleimide group was introduced, was combined with F (ab ') 2 , and the obtained product was purified by gel permeation chromatography to obtain a purified antibody for influenza B virus labeled with alkaline phosphatase.
Сравнительный Пример 2. Получение моноклональных антител к вирусу А гриппа.Comparative Example 2. Obtaining monoclonal antibodies to influenza A virus.
Вакцину против НА гриппа (производства KAKETSUKEN: штамм A/New Caledonia/20/99(H1N1)(IVR-116), штамм A/Panama/2007/99(H3N2)NIB-41 и штамм B/Yamanashi/166/98), содержащую нуклеопротеин антигена гриппа, использовали в качестве иммуногена.HA flu vaccine (manufactured by KAKETSUKEN: strain A / New Caledonia / 20/99 (H1N1) (IVR-116), strain A / Panama / 2007/99 (H3N2) NIB-41 and strain B / Yamanashi / 166/98) containing the influenza antigen nucleoprotein was used as an immunogen.
После полного перемешивания иммуногена с равным количеством полного адъюванта Фрейнда (производства IATRON) иммуноген вводили Balb/c мышам 4 раза с двухнедельными интервалами. За три дня до слияния клеток иммуноген ввели посредством инъекции в брюшную полость мышей, слияние клеток селезенки мышей с клетками миеломы (P3U1) осуществляли, используя полиэтиленгликоль. В качестве культуральной среды использовали HAT селекционную среду. Примерно две недели спустя собрали культуральный супернатант, который затем подвергли скринингу. При первичном скрининге использовали твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), при котором применяли твердую фазу, на которую были иммобилизованы вакцина против НА гриппа и рекомбинантный нуклеопротеин антигенов вируса А гриппа (r-NP/H1N1 из штамма A/New Caledonia/20/99 и r-NP/H3N2 из A/Kitakyushu/159/93). Если описывать более подробно, вакцину против НА гриппа разбавили в 300 раз 0.1 М карбонатным буфером, рН 9.6, рекомбинантный нуклеопротеин антигена вируса А типа разбавили до концентрации 1 мкг/мл тем же буфером. Соответствующие полученные растворы добавили в лунки микропланшетного модуля (производства NUNC) в количестве 100 мкл/лунку, и инкубировали микропланшет при 4°С в течение ночи для иммобилизации антигенов. После промывания каждой лунки PBS (фосфатно-солевым буферным раствором), содержащим 0.1% Твин 20 (товарный знак Tween 20) (PBS-Tween), добавили 300 мкл 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в PBS и инкубировали микропланшет при 4°С в течение ночи, проводя, таким образом, блокирование. После удаления блокирующего раствора добавили 100 мкл культурального супернатанта и полученную смесь выдерживали для осуществления взаимодействия в течение часа при 37°С. После тщательного промывания каждой лунки PBS-Tween в каждую лунку добавили 100 мкл меченного ферментом антитела к мышиному Igs (производства DAKO), разбавленного в 2000 раз реакционной средой (0.05 М фосфатный буфер, рН 7.5, содержащий 0.2% BSA, 0.2% Emulgen 985, 1% сахарозы, 1% КСl), после чего смесь оставили для реакции при 37°С на один час. После проведения реакции каждую лунку тщательно промыли PBS-Tween и в каждую лунку добавили по 100 мкл 2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоната) (ABTS). Реакционную смесь выдерживали при комнатной температуре в течение 30 минут для осуществления реакции, после чего в каждую лунку добавили по 100 мкл стоп-раствора и измерили уровень окрашивания при основной длине волны 415 нм и при второй длине волны 490 нм.After the immunogen was fully mixed with an equal amount of Freund's complete adjuvant (manufactured by IATRON), the immunogen was administered Balb / c to mice 4 times at two-week intervals. Three days before the cell fusion, the immunogen was introduced by injection into the abdominal cavity of mice, the fusion of mouse spleen cells with myeloma cells (P3U1) was carried out using polyethylene glycol. As a culture medium used HAT selection medium. About two weeks later, the culture supernatant was collected, which was then screened. In the initial screening, an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used, in which a solid phase was used to immobilize the influenza HA vaccine and the recombinant influenza A virus antigens nucleoprotein (r-NP / H1N1 from strain A / New Caledonia / 20/99 and r -NP / H3N2 from A / Kitakyushu / 159/93). If described in more detail, the influenza HA vaccine was diluted 300 times with 0.1 M carbonate buffer, pH 9.6, the recombinant type A virus antigen nucleoprotein was diluted to a concentration of 1 μg / ml with the same buffer. The corresponding resulting solutions were added to the wells of the microplate module (manufactured by NUNC) in an amount of 100 μl / well, and the microplate was incubated at 4 ° C. overnight to immobilize the antigens. After washing each well with PBS (phosphate buffered saline) containing 0.1% Tween 20 (trademark Tween 20) (PBS-Tween), 300 μl of 1% bovine serum albumin (BSA) was added to PBS and the microplate was incubated at 4 ° C. during the night, thus carrying out blocking. After removing the blocking solution, 100 μl of culture supernatant was added and the resulting mixture was allowed to react for one hour at 37 ° C. After thoroughly washing each well with PBS-Tween, 100 μl of enzyme-labeled anti-mouse Igs antibody (manufactured by DAKO) diluted 2000 times with reaction medium (0.05 M phosphate buffer, pH 7.5, containing 0.2% BSA, 0.2% Emulgen 985, was added to each well). 1% sucrose, 1% KCl), after which the mixture was allowed to react at 37 ° C for one hour. After the reaction, each well was thoroughly washed with PBS-Tween, and 100 μl of 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonate) (ABTS) was added to each well. The reaction mixture was kept at room temperature for 30 minutes to carry out the reaction, after which 100 μl stop solution was added to each well and the level of staining was measured at the main wavelength of 415 nm and at a second wavelength of 490 nm.
Культуральные супернатанты, оцененные как положительные, подвергли вторичному скринингу с помощью ELISA, используя рекомбинантный нуклеопротеин вируса В гриппа (r-NP/B из B/Yamanashi/166/98), и 3 штамма гибридом (гибридома FVA2-3, гибридома FVA2-6 и гибридома FVA2-11), каждый из которых продуцирует антитело, взаимодействующее с нуклеопротеином антигена вируса А гриппа и не взаимодействующее с нуклеопротеином антигена вируса В гриппа. Эти гибридомы депонировали в Международный Патентный Депозитарий Организмов (International Patent Organism Depositary) и Национальный Институт Развития Прикладной Науки и Технологий (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology). Гибридома FVA2-3 была депонирована под инвентарным номером FERM ВР-10066, гибридома FVA2-6 была депонирована под инвентарным номером FERM ВР-10067, а гибридома FVA2-11 была депонирована под инвентарным номером FERM ВР-10068.Positive culture supernatants were re-screened by ELISA using recombinant influenza B virus nucleoprotein (r-NP / B from B / Yamanashi / 166/98) and 3 hybridoma strains (FVA2-3 hybridoma, FVA2-6 hybridoma and hybridoma FVA2-11), each of which produces an antibody that interacts with the influenza A antigen nucleoprotein and does not interact with the influenza B virus antigen nucleoprotein. These hybridomas were deposited with the International Patent Organism Depositary and the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology. FVA2-3 hybridoma was deposited under accession number FERM BP-10066, FVA2-6 hybridoma was deposited under accession number FERM BP-10067, and FVA2-11 hybridoma was deposited under accession number FERM BP-10068.
Сравнительный Пример 3. Получение антитела к вирусу А гриппа, меченного щелочной фосфатазой.Comparative Example 3. Obtaining antibodies to influenza A virus labeled with alkaline phosphatase.
Повторяя действия, описанные выше в Сравнительном Примере 1, получили меченное щелочной фосфатазой моноклональное антитело к вирусу А гриппа, используя при этом моноклональное антитело к вирусу А гриппа (FVA2-11), полученное, как описано в Сравнительном Примере 2.Repeating the steps described above in Comparative Example 1, an alkaline phosphatase-labeled monoclonal antibody to influenza A virus was obtained using a monoclonal antibody to influenza A virus (FVA2-11) prepared as described in Comparative Example 2.
Пример 3. Устройство для одновременного иммунологического анализа вируса А гриппа и вируса В гриппа.Example 3. A device for the simultaneous immunological analysis of influenza A virus and influenza B virus.
Как показано на Фиг.2, на участки, расположенные на расстоянии 16 мм и 13.5 мм от того конца матрикса 2 (изготовленного из нитроцеллюлозной мембраны, производства MILLIPORE), где расположена зона 5 поглощения проявителя, нанесли соответственно 0.7 мкл водного раствора антитела к вирусу А гриппа (FVA2-11), полученного согласно Сравнительному Примеру 2, и 0.7 мкл водного раствора антитела к вирусу В гриппа (FrB1-03), полученного согласно Примеру 2, и высушили с получением зон 6а и 6b детектирования. На участок, расположенный на расстоянии 11 мм от конца матрикса 2 со стороны зоны 5 поглощения проявителя, нанесли антитело к щелочной фосфатазе (производства DAKO) и высушили с получением зоны 10 контроля. Затем на матрикс нанесли 5 мкл смешанного водного раствора, содержащего меченное щелочной фосфатазой антитело к вирусу А гриппа (5 мкг/мл), полученное согласно Сравнительному Примеру 3, и меченное щелочной фосфатазой антитело к вирусу В гриппа (7.5 мкг/мл), полученное согласно Сравнительному Примеру 1, и высушили с получением зоны меченого реагента, представляющей собой подложку 4 для меченного ферментом реагента.As shown in FIG. 2, 0.7 μl of an aqueous anti-virus A antibody solution was applied, respectively, to areas located 16 mm and 13.5 mm from that end of matrix 2 (made of a nitrocellulose membrane manufactured by MILLIPORE) where
Подложку 3 для проявителя получили путем нанесения (в форме линии шириной 6.1 мм) 100 мкг 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфата (BCIP) в качестве субстрата на фильтровальную бумагу шириной 5 мм и длиной 20 мм (производства MILLIPORE) и высушивания субстрата. Описанный выше матрикс 2, подложку 3 для проявителя, подложку 4 для меченного ферментом реагента и подложку 5 для поглощения проявителя (фильтровальная бумага производства MILLIPORE шириной 10 мм, длиной 20 мм и толщиной 1 мм) закрепили в пластиковом корпусе, снабженном емкостью 11 для проявителя, получив, таким образом, показанное на Фиг.3 и 4 устройство 1 для иммунологического анализа, предназначенное для одновременного анализа вируса типа А гриппа и вируса типа В гриппа.The
Сравнительный Пример 4. Устройство для одновременного иммунологического анализа вируса А гриппа и вируса В гриппа (традиционное устройство).Comparative Example 4. A device for the simultaneous immunological analysis of influenza A virus and influenza B virus (traditional device).
Действуя так же, как и в Примере 3, изготовили такое же устройство 1 для иммунологического анализа, предназначенное для одновременного анализа вируса А гриппа и вируса В гриппа, как и описанное ранее в Примере 3, за исключением того, что зоны 6а и 6b детектирования задали, используя соответственно приобретенное (коммерческое) моноклональное антитело к вирусу А гриппа и коммерческое моноклональное антитело к вирусу В гриппа. Получили устройство для иммунологического анализа, предназначенное для одновременного анализа вируса А гриппа и вируса В гриппа (ESPLINE Influenza А&В (производства FUJIREBIO); традиционное устройство для иммунологического анализа).Proceeding in the same manner as in Example 3, the
Пример 4. Анализ вируса А гриппа и вируса В гриппа.Example 4. Analysis of influenza A virus and influenza B virus.
В зону 8 нанесения образца устройства 1 для иммунологического анализа, предназначенного для одновременного анализа вируса А гриппа и вируса В гриппа (устройство для анализа по данному изобретению), изготовленного как описано в Примере 3, нанесли 30 мкл образца подтипа вируса В гриппа, приведенного в Таблице 3 (в качестве разбавителя использовали трис буфер, рН 8.0, содержащий поверхностно-активное вещество), после чего надавили на зону запуска 12 деформируемого элемента для его деформации таким образом, чтобы погрузить подложку 3 для проявителя в емкость 11 для проявителя с выступом 3 на деформируемом элементе, и, таким образом, начали проведение анализа. Через пятнадцать минут после начала проведения анализа окрашивание зоны 10 контроля подтвердило, что проявитель достиг этой зоны. После этого визуально наблюдали окрашивание зон 6а и 6b детектирования. Результаты приведены в Таблице 3.In the
Результаты анализа штаммов вируса В гриппаTable 3
The results of the analysis of strains of the virus In influenza
жидкостьChorioallantoic
liquid
В качестве контроля 30 мкл каждого из описанных выше образцов, приведенных в Таблице 3, проанализировали, используя традиционное устройство, изготовленное, как описано в Сравнительном Примере 4. Результаты анализов приведены в Таблице 3.As a control, 30 μl of each of the above samples, shown in Table 3, were analyzed using a conventional device made as described in Comparative Example 4. The results of the analyzes are shown in Table 3.
Как видно из приведенных результатов, все подтипы вируса В гриппа, которые невозможно определить с помощью традиционного устройства для анализа, оказалось возможным определить с помощью устройства по данному изобретению.As can be seen from the above results, all subtypes of influenza B virus that cannot be determined using a traditional analysis device were found to be possible using the device of this invention.
Пример 5Example 5
Используя устройство 1 для анализа, предназначенное для одновременного определения (исследования) вируса А гриппа и вируса В гриппа (устройство для анализа по данному изобретению), изготовленное, как описано в Примере 3, аналогично тому, как это описано в Примере 6, проверили перекрестную реактивность с аденовирусом (типы с 1 по 7), коксаки-вирусом (типы А16 и B1 - В6), вирусом простого герпеса 1, эховирусом (типы 3, 4, 7, 22 и 30). энтеровирусом (тип 71), вирусом свинки, полиовирусом (типы с 1 по 3), RS вирусом (подгруппы А и В), вирусом парагриппа (типы с 1 по 3), Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Staphylococcus epidermidis, миксомицетами, Staphylococcus aureus, коринебактериями, Corynebacterium diphtheriae, Candida albicans. Streptococcus pyogenes, Streptococcus sp. (группы В, С, G и F), Streptococcus pneumoniae, Hemophilus influenzae, Listeria monocytogenes, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia trachomatis и Chlamydia pneumoniae. He было обнаружено взаимодействие ни с одним из этих вирусов и бактерий.Using the
Claims (2)
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003-278528 | 2003-07-23 | ||
| JP2003278528 | 2003-07-23 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2006103302A RU2006103302A (en) | 2007-09-10 |
| RU2366663C2 true RU2366663C2 (en) | 2009-09-10 |
Family
ID=34074724
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2006103302/13A RU2366663C2 (en) | 2003-07-23 | 2004-07-23 | Immunoassay device with using influenza b virus antibody |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPWO2005007698A1 (en) |
| KR (1) | KR20060054333A (en) |
| CN (1) | CN100441597C (en) |
| RU (1) | RU2366663C2 (en) |
| WO (1) | WO2005007698A1 (en) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102112878A (en) * | 2008-06-06 | 2011-06-29 | 国立大学法人富山大学 | Device for detecting influenza virus |
| EP2418488B1 (en) * | 2009-04-09 | 2015-08-12 | ARKRAY, Inc. | Sample analyzing tool, method of manufacturing sample analyzing tool, and method of minimizing drop in solution permeability of deployment member |
| JP2010261912A (en) * | 2009-05-11 | 2010-11-18 | Bl:Kk | Immunology-detection method of human influenza virus h3 subtype |
| JP5567932B2 (en) * | 2010-08-03 | 2014-08-06 | 田中貴金属工業株式会社 | Reagent composition for immunochromatography and measuring method using the same |
| RU2491338C2 (en) * | 2011-06-30 | 2013-08-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский Институт гриппа" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ФГБУ "НИИ гриппа" Минздравсоцразвития России) | Using monoclonal antibodies for identifying yamagata or victorian influenza b viral evolution line, hybridoma 4h7 strain for preparing monoclonal antibodies used to identify influenza b viruses in yamagata branch, hybridoma b/4h1 strain for preparing monoclonal antibodies used to identify influenza b viruses in victorian branch |
| TW201346040A (en) | 2012-03-30 | 2013-11-16 | Tanaka Precious Metal Ind | Kit for identifying influenza a virus |
| JP6182027B2 (en) * | 2013-09-10 | 2017-08-16 | デンカ生研株式会社 | Method for measuring influenza B virus |
| JP6262969B2 (en) | 2013-09-10 | 2018-01-17 | デンカ生研株式会社 | Method for measuring influenza A virus |
| JP5831918B2 (en) * | 2013-11-29 | 2015-12-09 | 積水メディカル株式会社 | Detection method using immunochromatography |
| JP6985572B2 (en) * | 2015-11-09 | 2021-12-22 | 国立大学法人京都工芸繊維大学 | Single-chain antibody screening method and single-chain antibody |
| JP7065338B2 (en) * | 2017-09-12 | 2022-05-12 | パナソニックＩｐマネジメント株式会社 | Antibodies and complexes that bind to influenza virus nuclear proteins, detection devices and detection methods using them |
| CN114276441B (en) * | 2020-09-27 | 2022-12-27 | 东莞市朋志生物科技有限公司 | Anti-influenza B virus antibody, preparation method thereof and detection kit |
| CN114276440B (en) * | 2020-09-27 | 2022-12-27 | 东莞市朋志生物科技有限公司 | Antibody and detection kit for influenza B virus |
| CN117384279A (en) * | 2022-07-05 | 2024-01-12 | 东莞市朋志生物科技有限公司 | Anti-influenza B virus antibody, and reagent and kit for detecting influenza B virus |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2518607B2 (en) * | 1985-08-29 | 1996-07-24 | 雪印乳業株式会社 | Monoclonal antibody against influenza A virus HA antigen and method for producing the same |
| JP3334558B2 (en) * | 1997-04-23 | 2002-10-15 | 富士レビオ株式会社 | Enzyme immunoassay and test strips |
-
2004
- 2004-07-23 KR KR1020067001431A patent/KR20060054333A/en not_active Ceased
- 2004-07-23 WO PCT/JP2004/010476 patent/WO2005007698A1/en not_active Ceased
- 2004-07-23 RU RU2006103302/13A patent/RU2366663C2/en not_active IP Right Cessation
- 2004-07-23 CN CNB2004800211308A patent/CN100441597C/en not_active Expired - Fee Related
- 2004-07-23 JP JP2005511914A patent/JPWO2005007698A1/en active Pending
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| NAKAGAVA N. et al. Rapid detection and identification of two lineages of influenza В strains with monoclonal antibodies. J. Virol Methods. 1999 Apr; 79(1): 113-20. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2005007698A1 (en) | 2005-01-27 |
| CN100441597C (en) | 2008-12-10 |
| RU2006103302A (en) | 2007-09-10 |
| JPWO2005007698A1 (en) | 2008-01-17 |
| KR20060054333A (en) | 2006-05-22 |
| CN1826355A (en) | 2006-08-30 |
| HK1096975A1 (en) | 2007-06-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2366662C2 (en) | Monoclonal influenza a virus antibody and immonuassay device with using antibody | |
| RU2366663C2 (en) | Immunoassay device with using influenza b virus antibody | |
| WO2016080591A1 (en) | Antibody recognizing nucleocapsid of middle east respiratory syndrome coronavirus, and use thereof | |
| JP7634064B2 (en) | Detection reagent or kit for detecting respiratory syncytial virus and method for detecting respiratory syncytial virus | |
| WO2023036152A1 (en) | Detection method and kit for sars-cov-2 | |
| EP3306319B1 (en) | Test object detection method, and immunoassay instrument and monoclonal antibody for same | |
| JP2023181275A (en) | Mycoplasma pneumoniae immunoassay method and immunoassay device | |
| JP7498556B2 (en) | Immunoassay method and immunoassay device | |
| US20220403010A1 (en) | Anti-rs virus n protein-recognizing antibody, and immunoassay method and immunoassay apparatus using the antibody | |
| JP7157061B2 (en) | Method and kit for detecting Zika virus | |
| JP2019207248A (en) | Method of detecting test target, immunoassay instrument, and monoclonal antibody | |
| US11912783B2 (en) | Monoclonal antibody against IgM and non-specific reaction inhibitor | |
| US20200378965A1 (en) | Monoclonal antibody and non-specific reaction inhibitor | |
| HK1096975B (en) | Monoclonal antibody against influenza b virus and immunoassay instrument using the antibody |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20140724 |