RU2362145C2 - Differential diagnosis method for microbes and amino acids - Google Patents
Differential diagnosis method for microbes and amino acids Download PDFInfo
- Publication number
- RU2362145C2 RU2362145C2 RU2007112513/28A RU2007112513A RU2362145C2 RU 2362145 C2 RU2362145 C2 RU 2362145C2 RU 2007112513/28 A RU2007112513/28 A RU 2007112513/28A RU 2007112513 A RU2007112513 A RU 2007112513A RU 2362145 C2 RU2362145 C2 RU 2362145C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- fluorescence
- microbes
- spectral
- spectra
- amino acids
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине, биологии, микробиологии, именно к исследованию микорбосодержащих материалов и продуктов их жизнедеятельности путем определения их физических и химических свойств, и может быть использовано в промышленных, пищевых и медицинских биотехнологиях.The invention relates to medicine, biology, microbiology, namely to the study of microbial materials and their metabolic products by determining their physical and chemical properties, and can be used in industrial, food and medical biotechnologies.
Возможность определения видов микробов и их концентраций в суспензии на основе лазерного спектрально-флуоресцентного анализа представляет практический и теоретический интерес, поскольку может стать основой диагностики заболеваний микробной этиологии.The possibility of determining the types of microbes and their concentrations in suspension based on laser spectral-fluorescence analysis is of practical and theoretical interest, since it can become the basis for the diagnosis of diseases of microbial etiology.
Известен способ диагностики микробов и сложных аминокислот, заключающийся в том, что в нем используют в качестве диагностической информации спектральные интегральные интенсивности индуцированной лазером флуоресценции микробов, на основе которых констатируют наличие микробов и их концентрацию. Суспензия микробов представляет собой смесь люминесцирующих и нелюменисцирующих молекул. При специфических условиях возбуждения удается в способе реализовать преимущественное возбуждение макромолекул биологических контаминантов, по чему судят о наличии живых и полуживых микробов. Используя спектральное разложение и интегрирование по отдельным участкам можно делать вывод об аэробном или анаэробном характере микробной популяции (Александров М., Воробьев А., Полянский Е., Филатов М., Мищенко И., Багрянова Г. Лазерная флуоресцентная диагностика в медицине, пищевой промышленности, индустрии, экологии. 2003. // Электроника: НТБ 3/03) [1].A known method for the diagnosis of microbes and complex amino acids, which consists in the fact that it uses the spectral integrated intensities of the laser-induced fluorescence of microbes as diagnostic information, based on which the presence of microbes and their concentration are detected. A microbial suspension is a mixture of luminescent and non-luminescent molecules. Under specific excitation conditions, it is possible in the method to realize the predominant excitation of macromolecules of biological contaminants, which makes it possible to judge the presence of living and semi-living microbes. Using spectral decomposition and integration over individual sites, we can conclude about the aerobic or anaerobic nature of the microbial population (Alexandrov M., Vorobyov A., Polyansky E., Filatov M., Mishchenko I., Bagryanova G. Laser fluorescence diagnostics in medicine, food industry , industry, ecology. 2003. // Electronics: NTB 3/03) [1].
Способ позволяет предсказать распространение патологического процесса микробной природы уже на стадии его начального развития на основе флуоресцентной индикации возбудителей болезни, обладает высокой чувствительностью и позволяет определять преимущественную аэробность или анаэробность возбудителей, а также обладает экспрессностью проведения диагностики.The method allows to predict the spread of the pathological process of microbial nature already at the stage of its initial development on the basis of fluorescence indication of pathogens, has a high sensitivity and allows you to determine the primary aerobicity or anaerobicity of pathogens, and also has expressiveness of diagnosis.
Однако этот способ обладает следующими недостатками: не предоставляет достаточной информации о видовой специфике микробов и сложных аминокислот и не позволяет вычислить концентрацию конкретного вида микроба, особенно в микробных ассоциациях, что не обеспечивает дифференциальную диагностику микробов и сложных аминокислот.However, this method has the following disadvantages: it does not provide sufficient information about the specificity of microbes and complex amino acids and does not allow to calculate the concentration of a specific type of microbe, especially in microbial associations, which does not provide differential diagnosis of microbes and complex amino acids.
Известен также способ, являющийся стандартным методом количественного и качественного спектрально-эмиссионного анализа биологических объектов химического состава их вещества и который состоит в обнаружении и оценке характерных узкополосных особенностей в спектрах флуоресценции. Концентрацию выбранного исследуемого химического субстрата в этом методе оценивают с помощью измерения интенсивности конкретных полос флуоресценции, используя градуировочные кривые, получаемые на этапе градуировки. Эти процедуры проводят на приспособленном для этого диагностическом комплексе, включающем в себя тракт лазерного возбуждения образца, измерительный тракт, спектранализатор и ЭВМ, содержащем программное обеспечение обработки спектров и базу данных градуировочных кривых. Градуировочные кривые получают на этапе обучения на спектрах флуоресценции образцов с известным химическим содержимым (Э.А.Свириденков. Люминесцентный анализ, М., 1961). [2]There is also a known method, which is a standard method for quantitative and qualitative spectral-emission analysis of biological objects of the chemical composition of their substance and which consists in the detection and evaluation of characteristic narrow-band features in fluorescence spectra. The concentration of the selected test chemical substrate in this method is estimated by measuring the intensity of specific fluorescence bands using the calibration curves obtained at the calibration stage. These procedures are carried out on a diagnostic complex adapted for this, which includes a laser excitation path for the sample, a measuring path, a spectral analyzer, and a computer containing spectral processing software and a database of calibration curves. Calibration curves are obtained at the stage of training on the fluorescence spectra of samples with known chemical contents (E. A. Sviridenkov. Luminescent analysis, M., 1961). [2]
Этот метод позволяет проводить количественный и качественный анализ газообразных веществ, а также некоторых минеральных веществ в конденсированной фазе.This method allows quantitative and qualitative analysis of gaseous substances, as well as some mineral substances in the condensed phase.
Однако этот метод обладает следующими недостатками: трудно применять этот метод для аналитической оценки флуоресцирующих органических суспензий и с помощью него нельзя определить микробиологический состав суспензии. Определение параметров микробов по данным спектрального анализа этим методом, учитывающим выделенные значения на отдельных длинах волн, невозможно из-за сильного перекрытия спектральных полос отдельных молекул. Эти недостатки обусловлены особенностью микробосодержащего вещества, выражающиеся в том, что флуоресценция входящих в них органических веществ имеет специфику, вследствие которой подобные спектрально-аналитические методы малопригодны для идентификации, так как флуоресцентные спектры таких объектов имеют контуры, не имеющие каких-либо ярко выраженных, узкополосных характерных особенностей. Помимо многокомпонентности биологического субстрата, спектры флуоресценции неспецифичны вследствие однородного и неоднородного уширения линий, присущих конденсированной фазе вещества.However, this method has the following disadvantages: it is difficult to use this method for the analytical evaluation of fluorescent organic suspensions and it is impossible to determine the microbiological composition of the suspension with it. The determination of microbial parameters from spectral analysis data by this method, taking into account the selected values at individual wavelengths, is impossible due to the strong overlap of the spectral bands of individual molecules. These disadvantages are due to the peculiarity of the microbial substance, which is expressed in the fact that the fluorescence of the organic substances contained in them is specific, as a result of which such spectral-analytical methods are of little use for identification, since the fluorescence spectra of such objects have contours that do not have any pronounced, narrow-band salient features. In addition to the multicomponent nature of the biological substrate, the fluorescence spectra are nonspecific due to the homogeneous and inhomogeneous broadening of the lines inherent in the condensed phase of a substance.
Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому изобретению является способ лазерно-флуоресцентной диагностики, заключающийся в том, что лазерно-флуоресцентная диагностика (ЛФД) суспензий микробов была дополнена процедурой обработки спектров при помощи искусственных нейронных сетей. Для нужд дистанционного мониторинга и мониторинга в режиме реального времени образцов из приповерхностных слоев водоемов используется техника измерения спектров флуоресцентного отклика небольшого объема воды в приповерхностном слое при дистанционном облучении лазером. Излучение собирают при помощи телескопической системы и направляют на спектроанализатор. Полученные спектры обрабатываются предварительно обученной искусственной нейронной сетью с целью получения информации о видах живых микроорганизмов в этой воде (И.В.Гердова, С.А.Доленко, Т.А.Доленко, И.Г.Персиянцев, В.В.Фадеев, И.В.Чурина. Новые возможности в решении обратных задач лазерной спектроскопии с применение искусственных нейронных сетей. 2002. // Известия Российской Академии Наук, Серия физическая, 2002, т.66, 8, с.1116-1124) [3].Closest to the technical nature of the present invention is a method of laser fluorescence diagnostics, which consists in the fact that laser fluorescence diagnostics (APD) of microbial suspensions was supplemented by a spectral processing procedure using artificial neural networks. For the needs of remote monitoring and real-time monitoring of samples from the surface layers of water bodies, the technique of measuring the fluorescence response spectra of a small volume of water in the surface layer using remote laser irradiation is used. The radiation is collected using a telescopic system and sent to a spectrum analyzer. The obtained spectra are processed by a pre-trained artificial neural network in order to obtain information about the types of living microorganisms in this water (I.V. Gerdova, S.A. Dolenko, T.A. Dolenko, I.G. Persiyantsev, V.V. Fadeev, I.V. Churina, New Opportunities for Solving Inverse Laser Spectroscopy Problems Using Artificial Neural Networks, 2002. // Proceedings of the Russian Academy of Sciences, Physical Series, 2002, v. 66, 8, p. 1116-1124) [3].
Способ позволяет экспрессно измерять специфическую населенность суспензии микробами и микроорганизмами.The method allows rapid measurement of the specific population of the suspension by microbes and microorganisms.
Однако предлагаемый способ обладает следующими недостатками: вычисление концентраций происходит с ошибками и обладает плохой воспроизводимостью. Это происходит по причине переопределенности моделирования концентраций бактерий искусственными нейронными сетями, вследствие которой результаты обработки будут содержать большую долю статистически необоснованных компонент и ошибок, из-за чего происходит часто неверное вычисление концентраций видов организмов (О.Е.Родионова, А.Л.Померанцев. Хемометрика в аналитической химии) [6].However, the proposed method has the following disadvantages: the calculation of concentrations occurs with errors and has poor reproducibility. This is due to the overdetermination of modeling bacterial concentrations by artificial neural networks, due to which the processing results will contain a large proportion of statistically unjustified components and errors, which often leads to incorrect calculation of the concentrations of species of organisms (O.E. Rodionova, A.L. Pomerantsev. Chemometrics in analytical chemistry) [6].
Техническим результатом предлагаемого изобретения является устранение видовой неспецифичности и повышение аналитической специфичности лазерной флуоресцентной диагностики микробов и сложных аминокислот, а также повышение точности и скрининговой информативности способа как местных, так и удаленных биологических объектов, экспрессности и систематичности, определение видов микробов, концентрации в суспензии каждого из них как в чистых культурах, так и в микробных смесях.The technical result of the invention is to eliminate species non-specificity and increase the analytical specificity of the laser fluorescence diagnosis of microbes and complex amino acids, as well as increase the accuracy and screening information content of the method of both local and remote biological objects, expressivity and systematicity, determine the types of microbes, and the concentration in suspension of each them both in pure cultures and in microbial mixtures.
Указанный технический результат достигается тем, что в способе дифференциальной диагностики микробов и сложных аминокислот для определения ведущего микроба, конкурирующих ассоциантов и сложных аминокислот по спектру их флуоресценции с помощью специального программного обеспечения диагностического комплекса, сравнивающего хранящиеся в базе данных комплекса спектры известных образцов суспензий с микробами и спектр микроба для анализа микробосодержащих субстратов и продуктов их жизнедеятельности, используют значения спектральной интенсивности во всем спектральном диапазоне аппаратуры оптического диапазона, при этом производимую на этапе наладки комплекса процедуру обучения модели концентраций микробов проводят программно реализуя получение статистической модели концентраций микробов, формулируя ее в виде произведения специального вида градуировочной матрицы на вектор спектральных характеристик флуоресценции исследуемого образца, при этом градуировочную матрицу модели находят экспериментально с помощью хранящихся в базе данных комплекса спектров микробов и аминокислот через регрессию референтной информации о концентрациях микробов в образцах из базы данных на факторы главных компонент их спектральных характеристик, градуировочную матрицу приравнивают произведению матрицы коэффициентов регрессии на матрицу нагрузок главных компонент, затем на основе модели с помощью программного обеспечения производят вычисление концентраций микробов или аминокислот в диагностируемых образцах, на основе вычисленных концентраций в дальнейшем производят определение ведущего микроба по характеристическому концентрационному и видовому критерию, что определение концентраций специфических микробов и/или аминокислот производят на различных этапах диагностического процесса, связанного с микробами или аминокислотами, применительно к биотехнологиям с применением стандартных техник флуоресцентных спектроскопических измерений и что в глобальном варианте реализации дифференциальной диагностики с помощью дистанционных методов по спектрам лазерно-индуцированной флуоресценции определяют обсемененность микробами близких или удаленных проб, при этом диагностический комплекс стоит из единого блока анализа информации, обрабатывающего спектры флуоресценции сразу нескольких блоков, измеряющих эти спектры и передающих свою информацию для обработки блоку анализа по локальным или глобальным сетям связи с использованием стандартных протоколов, в том числе и протоколов шифрования.The specified technical result is achieved by the fact that in the method of differential diagnosis of microbes and complex amino acids to determine the leading microbe, competing associates and complex amino acids by their fluorescence spectrum using special diagnostic complex software that compares the spectra of known suspension samples with microbes stored in the database of the complex microbe spectrum for the analysis of microbial substrates and products of their vital activity; spectral values are used intensities in the entire spectral range of the optical range equipment, while the procedure for training the model of microbial concentrations carried out at the stage of setting up the complex is carried out programmatically, obtaining a statistical model of microbial concentrations, formulating it as a product of a special kind of calibration matrix by the vector of spectral characteristics of the fluorescence of the sample, while the calibration the model matrix is found experimentally with the help of micro spectra stored in the database of the complex bov and amino acids through the regression of reference information on the concentrations of microbes in the samples from the database on the factors of the main components of their spectral characteristics, the calibration matrix is equated with the matrix of the regression coefficients and the load matrix of the main components, then, based on the model, the concentrations of microbes or amino acids are calculated using the software in the diagnosed samples, based on the calculated concentrations, the leading microbe is subsequently determined by the character the historical concentration and species criterion that the determination of the concentrations of specific microbes and / or amino acids is carried out at various stages of the diagnostic process associated with microbes or amino acids, as applied to biotechnologies using standard techniques of fluorescence spectroscopic measurements, and that in the global implementation of differential diagnostics using remote methods Spectra of laser-induced fluorescence determine the seeding by microbes of relatives or beats samples, and the diagnostic complex consists of a single information analysis unit that processes the fluorescence spectra of several units that measure these spectra and transmit their information for processing to the analysis unit via local or global communication networks using standard protocols, including encryption protocols.
Описание способаMethod description
В предполагаемом изобретении способ лазерной флуоресцентной спектроскопии, используемый для получения спектральных зависимостей флуоресценции микробов и сложных аминокислот в условиях возбуждения, учитывающих физико-химическую специфику биомолекулы и ее окружения, объединен с математико-статистическим аппаратом линейного анализа главных компонент в качестве основы экспресс-диагностики в области медико-биологических приложений. При этом достигнуты преимущества: повышенная экспрессность, повышенная специфичность и улучшенное качество информации. Диагностика микробов по предлагаемому методу производится следующим образом. Берется проба микробов и/или сложных аминокислот и помещается в стандартную пробирку или на стандартную контактную поверхность; далее у содержимого этой пробирки с помощью диагностической установки измеряется спектр флуоресценции с последующей регистрацией характеристик рассеяния и поглощения и с помощью программы вычисляется концентрация известных видов бактерий. Полученные данные применяются для целей, усмотренных надобностью подобной диагностики для клинических целей (фиг.7, 8). В зависимости от вида сред и метода съема программное обеспечение использует соответствующие им эмпирические градуировочные матрицы, хранящиеся в базе данных ЭВМ. Получение градуировочных матриц в методе происходит на этапе обучения модели распознавания микробов и сложных аминокислот в заданном типе исследуемого субстрата с реализацией процедуры регрессии на главные компоненты, которую проводят до практического применения налаженного диагностического комплекса. Для упрощения понимания принципа применения способа и следования потока данных до окончательной постановки диагностики на фиг.1 приведена его блок-схема.In the alleged invention, the method of laser fluorescence spectroscopy, used to obtain spectral dependences of the fluorescence of microbes and complex amino acids under excitation conditions, taking into account the physicochemical specifics of the biomolecule and its environment, is combined with the mathematical-statistical apparatus for linear analysis of the main components as the basis for rapid diagnostics in the field of biomedical applications. At the same time, advantages were achieved: increased expressivity, increased specificity and improved quality of information. Diagnosis of microbes by the proposed method is as follows. A sample of microbes and / or complex amino acids is taken and placed in a standard test tube or on a standard contact surface; Further, the fluorescence spectrum is measured using the diagnostic device for the contents of this test tube, followed by recording the scattering and absorption characteristics, and using the program, the concentration of known types of bacteria is calculated. The data obtained are used for the purposes, the need for such a diagnosis for clinical purposes (Fig.7, 8). Depending on the type of media and the method of removal, the software uses the corresponding empirical calibration matrices stored in the computer database. Obtaining calibration matrices in the method occurs at the stage of training the model of recognition of microbes and complex amino acids in a given type of the studied substrate with the implementation of the regression procedure on the main components, which is carried out before the practical application of an established diagnostic complex. To simplify the understanding of the principle of applying the method and following the data stream to the final diagnosis, figure 1 shows its block diagram.
Идея распознавания неизвестного образца по результатам вычислительного сравнения с известными образцами лежит в основе другого подхода к реализации дифференциальной диагностики, основанного на программировании искусственных нейронных сетей. Принцип предлагаемого способа отличен от такового при использовании программного продукта в виде нейросетей. При прогнозировании вместо схемы устойчивых связей, полученных в обучении в случае нейросети в способе модель руководствуется вектором уровней статистической значимости детектируемых физических характеристик исследуемого образца. Данный способ имеет преимущество перед упомянутым по устойчивости, успешности распознавания, воспроизводимости и точности.The idea of recognizing an unknown sample based on the results of a computational comparison with known samples is the basis of another approach to the implementation of differential diagnostics based on the programming of artificial neural networks. The principle of the proposed method is different from that when using a software product in the form of neural networks. When predicting instead of the scheme of stable connections obtained in training in the case of a neural network in the method, the model is guided by a vector of levels of statistical significance of the detected physical characteristics of the studied sample. This method has an advantage over the above in terms of stability, recognition success, reproducibility and accuracy.
Специфическая спектрально-флуоресцентная диагностика без применения маркирующих добавок, к которой применяется способ, является видом флуоресцентной диагностики. Ее применение сопряжено с использованием спектроснимающей аппаратуры. Диагностические установки для ЛФД снабжены автоматическим интерфейсом для ЭВМ. Это реализуется применением многоканальных светочувствительных элементов и аналогово-цифровых преобразователей, передающих спектральный сигнал с каждого канала, являющийся аналогом спектральной интенсивности на определенном участке спектра, на входной канал компьютера в понятной ему форме. Таким образом, применение метода происходит при участи соответствующе подобранного аппаратного и написанного к нему программного обеспечения специальной установки (фиг.2) для лазерно-флуоресцентной диагностики, представляющей собой лазер L с соответствующе подобранной длиной волы генерации, раздвоенный оптический кабель с волокнами для подвода возбуждающего излучения Fa к анализируемому образцу и снятия флуоресцентного отклика и подвода его к спектроанализатору Flif, спектроанализатора М, сотоящего из оптического фильтра на длину волны накачки F, диспергирующего элемента, и многоканального полупроводникового детектора FD, усилителя электрического сигнала, АЦП (DT) и ЭВМ (PC), имеющего программное обеспечение для обработки и хранения спектральной информации. Программное обеспечение написано по алгоритму, позволяющему на основе базы данных и снятого спектра оценивать видовой и количественный состав микробов в виде концентрации специфического вида микроорганизма. Этот алгоритм позволяет проводить количественный специфический анализ микробосодержащего биологического субстрата (МБС) или аминокислот по их спектральной информации посредством реализации линейной регрессии на главные компоненты (ГК) спектральных характеристик. ГК и коэффициенты регрессии хранятся в базе данных и являются статической невычисляемой в ходе процедуры диагноза информацией.Specific spectral-fluorescence diagnostics without the use of marking additives, to which the method is applied, is a type of fluorescence diagnostics. Its use involves the use of spectroscopic equipment. Diagnostic units for the APD are equipped with an automatic computer interface. This is realized by the use of multichannel photosensitive elements and analog-to-digital converters that transmit a spectral signal from each channel, which is an analog of the spectral intensity in a certain part of the spectrum, to the input channel of the computer in an understandable form. Thus, the application of the method takes place with the participation of appropriately selected hardware and special software written for it (Fig. 2) for laser-fluorescence diagnostics, which is a L laser with an appropriately selected generation wavelength, a bifurcated optical cable with fibers for supplying exciting radiation Fa to the analyzed sample and taking the fluorescence response and bringing it to the spectrum analyzer F lif , spectrum analyzer M, which is spanned from the optical filter by the wavelength pumping F, a dispersing element, and a multichannel semiconductor detector FD, an electric signal amplifier, ADC (DT), and a computer (PC), which has software for processing and storing spectral information. The software is written according to an algorithm that allows, based on a database and a recorded spectrum, to evaluate the species and quantitative composition of microbes in the form of the concentration of a specific type of microorganism. This algorithm allows a specific quantitative analysis of the microbial biological substrate (MBS) or amino acids according to their spectral information through the implementation of linear regression on the main components (HA) of spectral characteristics. GC and regression coefficients are stored in the database and are static non-calculable information during the diagnosis procedure.
Имеется много задач, схожих решаемой в данном способе задаче. Их общей концептуально-методологической направленностью является распознавание неизвестного образца по его некоторым диагностическим характеристикам на основе данных, полученных из образцов с известными диагностическими досье. Диагностическими характеристиками могут являться различные физические свойства, измеряемые при помощи диагностической аппаратуры. В дальнейшем они будут обозначаться как признаки. Последовательные этапы применения метода для диагностического комплекса построены и упорядочены в согласии с логикой идеи задачи распознавания.There are many tasks similar to the problem being solved in this method. Their general conceptual and methodological orientation is the recognition of an unknown sample by its certain diagnostic characteristics based on data obtained from samples with known diagnostic files. Diagnostic characteristics may include various physical properties measured with diagnostic equipment. In the future, they will be designated as signs. The successive stages of the application of the method for the diagnostic complex are constructed and ordered in accordance with the logic of the idea of the recognition problem.
Задача распознавания ставится следующим образом. Исходной информацией для задачи распознавания являются описания объектов Sj (j=1, …, n), в виде признаков хi, (i=1, …, k), характеризующих различные стороны-свойства объекта Sj. Набор признаков образует векторThe recognition problem is posed as follows. The initial information for the recognition problem is the description of objects S j (j = 1, ..., n), in the form of signs x i , (i = 1, ..., k), characterizing the various side-properties of the object S j . Set of signs forms a vector.
У каждого из объектов Sj, принадлежащих множеству объектов S, существует "основное свойство" y(Sj), которое для части объектов S':Each of the objects S j belonging to the set of objects S has a “main property” y (S j ), which for a part of the objects S ':
предполагается известным. Значение переменной, описывающей данное свойство, принимает известное численное либо логическое значение. Для остальной части объектов S/S' из S:supposedly famous. The value of the variable that describes this property takes a known numerical or logical value. For the rest of the objects S / S 'of S:
основное свойство является неизвестным. Процедура распознавания предполагает наличие обучающей или эталонной выборки, включающей в себя множество S' и совокупность соответствующих значений признаков y(S1), y(S2), …, y(Sm). Задача распознавания состоит в том, чтобы, используя информацию, содержащуюся в эталонной или обучающей выборке, определить значения свойства y(Sj) для выбранного объекта Sj из S/S' с максимальным уровнем статистической значимости.the main property is unknown. The recognition procedure assumes the presence of a training or reference sample that includes the set S 'and the set of corresponding characteristic values y (S 1 ), y (S 2 ), ..., y (S m ). The recognition task is to use the information contained in the reference or training sample to determine the values of the property y (S j ) for the selected object S j from S / S 'with the maximum level of statistical significance.
В данном случае в качестве распознаваемых параметров выступают концентрации некоторых нужных для диагностики видов микробов и/или сложных аминокислот по спектрам флуоресценции микробосодержащего биологического субстрата.In this case, the recognizable parameters are the concentrations of some types of microbes and / or complex amino acids needed for diagnostics by the fluorescence spectra of the microbial-containing biological substrate.
Этапы способа и их содержательные описанияThe stages of the method and their meaningful descriptions
1. Обучение комплекса (тренировка модели концентрации микробов)1. Training complex (training model of concentration of microbes)
Спектроскопическую информацию об образце можно представить в виде векторной величины большой размерности, равной числу каналов спектроскопического датчика. Каждая координата в пронумерованном порядке равна значению сигнала на соответствующем канале. Если данную операцию проделать для большого количества спектров, то получается набор векторов, которые можно собрать в матрицу - матрицу данных. В силу схожести и различия в химическом составе образцов, их спектры будут иметь корреляции в определенных спектральных диапазонах. Эту корреляцию можно использовать для уменьшения количества значимых единиц информации, описывающей данные спектры, т.е. уменьшения размерности пространства векторов спектральных характеристик через замену исходной совокупности, разложенной по каналам датчика спектральной информации совокупностью меньшего числа конечных параметров, выражающих первые по выявленным и зафиксированным закономерностям. Эта процедура производится с помощью известного метода главных компонент (МГК). До применения МГК часто приходится корректировать спектральные данные с учетом поглощающих и рассеивающих свет свойств субстрата. Тогда спектр флуоресценции образца программно восстанавливается с учетом дополнительно снятого спектра поглощения и рассеивания по закону, подобранному для конкретной геометрии возбуждения и снятия данных.Spectroscopic information about the sample can be represented as a vector quantity of large dimension equal to the number of channels of the spectroscopic sensor. Each coordinate in numbered order is equal to the signal value on the corresponding channel. If this operation is done for a large number of spectra, then we get a set of vectors that can be assembled into a matrix - a data matrix. Due to the similarities and differences in the chemical composition of the samples, their spectra will have correlations in certain spectral ranges. This correlation can be used to reduce the number of significant units of information describing these spectra, i.e. reducing the dimensionality of the space of vectors of spectral characteristics by replacing the original set laid out along the channels of the spectral information sensor with a set of a smaller number of final parameters expressing the first according to the revealed and fixed patterns. This procedure is performed using the well-known principal component method (CIM). Before applying the MHC, it is often necessary to correct the spectral data taking into account the absorbing and scattering properties of the substrate. Then the fluorescence spectrum of the sample is programmatically restored taking into account the additionally taken absorption and scattering spectrum according to the law selected for a specific geometry of excitation and data acquisition.
МГК в применении к измерениям флуоресценции микробов состоит в следующем. Исследуется достаточно большое количество образцов микробов и полученные спектры собираются с матрицу через трансформацию дискретных спектров в векторное представление (вектор признаков).MGK as applied to microbial fluorescence measurements is as follows. A sufficiently large number of microbial samples is studied and the obtained spectra are collected from the matrix through the transformation of discrete spectra into a vector representation (feature vector).
где x1, x2, …, xI - значения спектральных мощностей на длинах волн, соответствующих 1, 2, …, I каналам спектроанализатора.where x 1 , x 2 , ..., x I are the values of spectral powers at wavelengths corresponding to 1, 2, ..., I channels of the spectrum analyzer.
Матрица данных собирается по строкам, где каждая строка есть вектор признаков отдельного образца. Таким образом матрица (матрица данных) будет иметь размер по столбцам, равный количеству каналов в спектрах (размерности пространства векторов признаков) и по строкам - количеству образцов. Матрица данных далее центрируется, поскольку преобразование матрицы данных в этом методе не содержит свободных членов. Это имеет важное практическое значение, позволяя, избавится от постоянной составляющей показаний спектрометра как от систематической ошибки. Далее матрица данных раскладывается на три матрицы согласно формуле:The data matrix is collected in rows, where each row is a feature vector of a separate sample. Thus, the matrix (data matrix) will have a column size equal to the number of channels in the spectra (dimension of the space of feature vectors) and row-wise to the number of samples. The data matrix is further centered because the transformation of the data matrix in this method does not contain free terms. This is of great practical importance, allowing you to get rid of the constant component of the readings of the spectrometer as a systematic error. Next, the data matrix is decomposed into three matrices according to the formula:
F - матрица факторов главных компонент, Q - матрица нагрузок главных компонент, Е-матрица остатков. Матрица факторов, представляющая набор конечных параметров, имеет размер по столбцам меньший, чем у матрицы данных. Этот размер определяет количество главных компонент (ГК), принимаемых для расчета. Считается, что матрица остатков имеет р-нормальное распределение элементов, отличающихся от нуля на незначительное значение по сравнению с матрицей F. Количество ГК выбирается достаточным для обеспечения максимально низкой величины дисперсии остатков Е и не слишком большим для избегания переоценки модели и неустойчивости диагноза, для этого хорошо подходит критерий Кэттеля [4].F - matrix of factors of the main components, Q - matrix of loads of the main components, E-matrix of residues. The matrix of factors representing a set of finite parameters has a smaller column size than the data matrix. This size determines the number of principal components (HA) that are taken for calculation. It is believed that the residual matrix has a p-normal distribution of elements that differ from zero by an insignificant value compared to the matrix F. The amount of HA is chosen to be sufficient to ensure the lowest possible dispersion of residuals E and not too large to avoid over-estimation of the model and the instability of the diagnosis, for this Kattel’s criterion fits well [4].
Матрица факторов главных компонент представляет собой набор значимых параметров спектральных данных от заданного типа суспензий. С помощью нее можно перейти от изначальных спектров со многими схожими между собой чертами к представлению спектральных особенностей каждого образца в виде факторов. Таким образом, для каждого образца вычисляется индивидуальный набор определенного общего количества значимых параметров. Представление в виде факторов спектральной информации образцов эквивалентно начальному представлению в виде спектров, поскольку в соотношении (5) они явно выражают начальную совокупность данных за вычетом несущественной бесструктурной информации, выражающей априори ошибки зашумленности спектров фотонными флуктуациями и небольшими случайными вариациями оптических свойств образца. При этом оно имеет преимущество в отсутствии сингулярности матрицы факторов. Это преимущество позволяет с хорошей точностью вычислять градуировочные коэффициенты для спектральных компонент посредством определения коэффициентов регрессии референтной обучающей информации на факторы главных компонент, что невозможно для имеющей сильную интеркорреляцию матрицы спектральных данных. Коэффициенты регрессии связаны с коэффициентами градуировки через матрицу нагрузок главных компонент, определяющую соотношения между факторами и спектральными признаками. Размер матрицы нагрузок подобран таким образом, что число столбцов равно числу главных факторов, а число строк равно числу спектральных признаков. Факторы имеют нумерацию по убыванию уровня их статистической значимости.The matrix of factors of the main components is a set of significant parameters of spectral data from a given type of suspension. Using it, one can go from the initial spectra with many similar features to the representation of the spectral features of each sample as factors. Thus, for each sample, an individual set of a certain total number of significant parameters is calculated. Representation of the spectral information of the samples as factors is equivalent to the initial representation in the form of spectra, since in relation (5) they explicitly express the initial set of data minus the non-essential structureless information expressing a priori the noise of the spectral noise by photonic fluctuations and small random variations of the optical properties of the sample. Moreover, it has an advantage in the absence of a singularity matrix of factors. This advantage makes it possible to calculate calibration coefficients for spectral components with good accuracy by determining the regression coefficients of reference training information on factors of the main components, which is impossible for a matrix of spectral data having a strong intercorrelation. The regression coefficients are related to the calibration coefficients through the matrix of loads of the main components, which determines the relationship between factors and spectral features. The size of the load matrix is selected so that the number of columns is equal to the number of main factors, and the number of rows is equal to the number of spectral features. Factors are numbered in descending order of their statistical significance.
Процедура анализа главных компонент, состоящая в разложении матрицы данных по выраженной в (5) форме, может быть реализована любым из имеющихся стандартных алгоритмов такого анализа. Например, это алгоритм NIPALS (Martens H., Naes Т. Multivariative calibration. 1998, Willey) [5].The analysis procedure for the main components, which consists in decomposing the data matrix in the form expressed in (5), can be implemented by any of the available standard algorithms for such an analysis. For example, this is the NIPALS algorithm (Martens H., Naes T. Multivariative calibration. 1998, Willey) [5].
Чтобы с помощью факторов главных компонент вычислять концентрации неизвестных образцов, производят регрессию референтной информации о концентрациях микробов или сложных аминокислот в образцах обучающей выборки на главные компоненты матрицы данных спектральных признаков образцов обучающей выборки.In order to calculate the concentrations of unknown samples using factors of the main components, the reference information on the concentrations of microbes or complex amino acids in the samples of the training set is regressed to the main components of the data matrix of the spectral features of the samples of the training set.
В представленной модели считается, что концентрации микробов по флуоресцентным данным численно равны линейной суперпозиции факторов главных компонент. Коэффициенты суммирования факторов определяются при помощи аппроксимации искомой зависимости референтных данных обучающей выборки от факторов их линейной функцией с добавлением дополнительного члена в состав аргументов линейной функции, численно равного единице, методом наименьших квадратов. При этом для определения каждого вида микробов определяется своя совокупность коэффициентов регрессии.In the presented model, it is believed that the concentration of microbes according to fluorescence data is numerically equal to a linear superposition of factors of the main components. The factors for summing factors are determined by approximating the required dependence of the reference data of the training sample on factors by their linear function with the addition of an additional term in the composition of the arguments of the linear function, numerically equal to one, by the least square method. Moreover, to determine each type of microbes, its own set of regression coefficients is determined.
где Cik - референтная информация (элемент матрицы концентраций) о k-й компоненте микробов или сложных аминокислот в i-м образце обучающей выборки, Rjk - коэффициенты регрессии j-й ГК на концентрационную шкалу k-й компоненты микробов или сложных аминокислот, R0k - постоянное смещение для шкалы концентрации k-й компоненты микробов или сложных аминокислот, Fij - фактор j-й ГК для i-го образца, являющийся информацией, получаемой в результате анализа ГК спектров ансамбля образцов микробов или сложных аминокислот.where C ik is the reference information (element of the concentration matrix) about the k-th component of microbes or complex amino acids in the i-th sample of the training sample, R jk are the regression coefficients of the j-th HA on the concentration scale of the k-th component of microbes or complex amino acids, R 0k is the constant bias for the concentration scale of the k-th component of microbes or complex amino acids, F ij is the factor of the j-th HA for the i-th sample, which is information obtained as a result of the analysis of the HA spectra of the ensemble of samples of microbes or complex amino acids.
Эта процедура производится по стандартному алгоритму метода наименьших квадратов (МНК) [5].This procedure is performed according to the standard least squares (LSM) algorithm [5].
Градуровочная матрица равна произведению матрицы коэффициентов регрессии на матрицу нагрузок главных компонент, дополненную вектором единиц.The calibration matrix is equal to the product of the matrix of regression coefficients by the matrix of loads of the main components, supplemented by a vector of units.
2. Определение концентраций микробов или сложных аминокислот в неизвестном образце2. Determination of concentrations of microbes or complex amino acids in an unknown sample
Диагностика неизвестного образца микробов или сложных аминокислот производится следующим образом. Берется проба из микробов или сложных аминокислот и помещается в стандартную пробирку, далее, у этой пробирки с помощью диагностической установки измеряется спектр индуцированной лазерным излучением флуоресценции и с помощью программы вычисляются наличие и концентрация известных видов микробов. Для оптически не чистых образцов спектр флуоресценции образца программно восстанавливается с учетом дополнительно снятого спектра поглощения и рассеивания по закону подобранному для конкретной геометрии возбуждения и снятия данных. Для этого неизвестного образца программа вычисляет концентрации проекцией центрированного вектора его признаков (спектр) на градуировочную матрицу W (7) и определяет по критерию наличие микроба.Diagnosis of an unknown sample of microbes or complex amino acids is as follows. A sample is taken from microbes or complex amino acids and placed in a standard test tube, then the spectrum of laser-induced fluorescence is measured from this test tube using a diagnostic tool and the presence and concentration of known types of microbes are calculated using the program. For optically non-pure samples, the fluorescence spectrum of the sample is programmatically restored taking into account the additionally taken absorption and scattering spectra according to the law selected for a specific excitation and data acquisition geometry. For this unknown sample, the program calculates the concentrations by projecting the centered vector of its features (spectrum) onto the calibration matrix W (7) and determines the presence of a microbe by the criterion.
Полученные данные применяются для целей, усмотренных надобностью подобной диагностики (фиг. 6, 7).The data obtained are used for the purposes considered necessary for such a diagnosis (Fig. 6, 7).
3. Определение вида микроба по концентрационному или нозологическому критерию.3. Determination of the type of microbe according to the concentration or nosological criterion.
По референтным диагностическим данным эталонного набора образцов и результатам пункта 2 находятся динамические пределы изменения вычисляемой концентрации микроба или в альтернативном варианте, специфические для диагностируемой болезни пределы изменений факторов главных компонент. При диагностике новых образцов по принадлежности их указанных концентрационных или статистических параметров данным динамическим пределам делается вывод о положительном диагнозе и при выходе параметров за эти пределы ставится отрицательный диагноз болезни вызываемой данным микробом.According to the reference diagnostic data of the reference set of samples and the results of
4. Наблюдение за производственным процессом4. Monitoring the production process
Данная реализация получается при использовании специальных стандартизованных емкостей как замкнутого, так и проточного типа. В первом варианте продукт, на какой-либо стадии производства исследуется пробой пробы и заключается в стандартную емкость. Эту емкость помещают в крепление для снятия спектра, где с помощью лазера возбуждают флуоресценцию образца и снимают ее спектр, занося на ЭВМ. Далее с помощью программного обеспечения и соответствующей базы данных определяют концентрацию различных видов микробов в смеси. Во втором варианте емкость непосредственно встроена в технологический тракт и имеет окно для возбуждения и наблюдения флуоресценции. Далее последовательность шагов как в первом варианте.This implementation is obtained using special standardized containers of both closed and flow type. In the first embodiment, the product, at any stage of production, the sample is examined and is contained in a standard container. This capacitance is placed in a mount for recording the spectrum, where the fluorescence of the sample is excited with a laser and its spectrum is recorded by transferring it to a computer. Then, using the software and the corresponding database, the concentration of various types of microbes in the mixture is determined. In the second embodiment, the capacitance is directly integrated into the technological path and has a window for excitation and observation of fluorescence. The following is a sequence of steps as in the first embodiment.
5. Рекомендации по лечению пациента, проба которого исследуется этим методом, и определение более точных критериев для дальнейшего использования комплекса.5. Recommendations for the treatment of a patient whose sample is examined by this method, and the definition of more accurate criteria for further use of the complex.
Проба, взятая у пациента, исследуется на наличие ведущего микроба с помощью метода в пунктах 2-3. По результатам наблюдения назначаются антибиотики и антисептики для лечения пациента от обнаруженного вида болезни. По результатам некоторого количества актов лечения определяется неточность постановки диагноза и корректируются динамические пределы изменений концентрационных и статистических параметров. Делаются более точные рекомендации по использованию лекарственных препаратов. Тем самым производится двухэтапное замыкание так называемой триады Паскаля. Также с помощью данной процедуры определяются наиболее эффективные из имеющихся лекарственных препаратов.A sample taken from a patient is examined for the presence of a host microbe using the method in paragraphs 2-3. Based on the results of the observation, antibiotics and antiseptics are prescribed to treat the patient from a detected type of disease. According to the results of a number of treatment reports, the inaccuracy of the diagnosis is determined and the dynamic limits of changes in concentration and statistical parameters are adjusted. More precise recommendations are made on the use of drugs. Thus, a two-stage closure of the so-called Pascal triad is made. Also, using this procedure, the most effective of the available drugs are determined.
6. Диагностика нужна для контроля зараженности пищевых продуктов специфическими видами микробов.6. Diagnosis is needed to control food contamination with specific types of microbes.
Модель для вычисления концентраций в пункте 1 обучается на образцах, приготовленных на исследуемом типе пищевых продуктов в качестве субстрата, и по пункту 2 определяется концентрация специфических видов микробов в образцах, взятых из диагностируемых продуктов выбранного типа. Определяется свежесть или заряженность продуктов холерой, тифом, ботулизмом и прочими микробами, что позволяет в режиме реального времени контролировать свежесть продуктов и предотвращать заболевания, связанные с патогенными микробами в пище.The model for calculating concentrations in
7. Удаленная диагностика объектов с целью определения их микробной обсемененности (фиг.8).7. Remote diagnostics of objects in order to determine their microbial contamination (Fig. 8).
Для диагностики образцов микробов или сложных аминокислот, измерение спектров индуцированной лазерным излучением флуоресценции которых производится на расположенных на удаленных географических территориях диагностических установках, используются локальные и глобальные сети, при котором снятие диагностических данных производится на дистанционно расположенной диагностической установке, далее эти данные передаются по локальным и глобальным сетям связи с использованием стандартных протоколов, в том числе и протоколов шифрования, расположенному на головном ЭВМ серверу. Программа, находящаяся на головном ЭВМ и реализующая по пунктам 1-2, с использованием имеющейся на головном ЭВМ базы данных градуировочных матриц и спектров, вычисление наличия и концентрации микробов и сложных аминокислот, использует полученные от удаленного диагностического комплекса диагностические данные для определения микробов или сложных аминокислот в диагностируемом удаленном образце и по пунктам 3-6 выдает обработанную нужную информацию по сети связи соответствующему диагностическому комплексу. Эта информация используется для целей диагностики микробов или сложных аминокислот, лечения пациента, контроля пищевых и промышленных объектов на удаленной географической территории.For the diagnosis of microbial samples or complex amino acids, the measurement of the spectra of laser-induced fluorescence of which is carried out at diagnostic facilities located in remote geographical areas, local and global networks are used, in which diagnostic data are taken at a remote diagnostic facility, then these data are transmitted via local and global communication networks using standard protocols, including encryption protocols, p memory location at the main computer server. The program, located on the host computer and implementing items 1-2, using the database of calibration matrices and spectra available on the host computer, calculates the presence and concentration of microbes and complex amino acids, uses the diagnostic data obtained from the remote diagnostic complex to determine microbes or complex amino acids in the diagnosed remote sample and in paragraphs 3-6, it provides the processed necessary information over the communication network to the corresponding diagnostic complex. This information is used for the diagnosis of microbes or complex amino acids, for treating a patient, for monitoring food and industrial facilities in a remote geographical area.
Производится также удаленное зондирование с помощью известных способов дистанционного съема лазерно-индуцированной флуоресцентной спектроскопической информации и пунктов 1-2. Для оптического возбуждения удаленного объекта применяют оптическую систему наведения луча лазера на объект. Для снятия спектральной информации флуоресценции объекта применяют телескопическую систему сбора и фокусировки света флуоресценции объекта на входную щель спектроанализатора. Полученные спектры обрабатываются согласно способу.Remote sensing is also performed using known methods of remote sensing of laser-induced fluorescence spectroscopic information and items 1-2. For optical excitation of a distant object, an optical system is used to direct the laser beam at the object. To take the spectral information of the object fluorescence, a telescopic system is used to collect and focus the object fluorescence light on the entrance slit of the spectrum analyzer. The obtained spectra are processed according to the method.
8. Повышение точности и надежности диагностики микробов и сложных аминокислот при использовании флуоресцентного микроскопа.8. Improving the accuracy and reliability of the diagnosis of microbes and complex amino acids using a fluorescence microscope.
В предлагаемом способе предполагается дополнительно повысить точность и надежность идентификации бактерий по спектрам их флуоресценции за счет анализа спектров единичных бактерий. Можно предложить следующую схему установки (фиг.3).In the proposed method, it is supposed to further increase the accuracy and reliability of the identification of bacteria by their fluorescence spectra by analyzing the spectra of single bacteria. You can offer the following installation scheme (figure 3).
Здесь поляризованное излучение эксимерного лазера направляют в кювету с исследуемым образцом. Излучение флуоресценции единичной бактерии через поляризатор и спектральный фильтр попадает в микроскоп, снабженный CCD-камерой. RGB-сигнал камеры служит своеобразной хэш-таблицей исследуемого образца, фильтра и длины волны возбуждения. Компьютер сравнивает этот сигнал с имеющейся библиотекой и определяет вид бактерии. Зная объем кюветы и посчитав «поштучно» бактерии, вычисляют их концентрацию. В некоторых случаях степень деполяризации может уточнить и дополнить сигнал.Here, the polarized radiation of an excimer laser is directed into a cell with a sample under study. The fluorescence radiation of a single bacterium through a polarizer and a spectral filter falls into a microscope equipped with a CCD camera. The camera’s RGB signal serves as a kind of hash table for the sample, filter and excitation wavelength. The computer compares this signal with the existing library and determines the type of bacteria. Knowing the volume of the cuvette and counting the "piece by piece" bacteria, calculate their concentration. In some cases, the degree of depolarization can refine and complement the signal.
Пусть ультрафиолетовый лазер освещает поле микроскопа размером 1х1 мм и суммарная энергия излучения здесь 1 мДж. Пусть в этом поле находится одна бактерия размером 10 мкм и в эмиссию флуоресценции преобразуется примерно 10% падающей энергии (у многих органических веществ эта эффективность более 90% и в расчете приводятся заведомо худшие условия для флуоресценции). Если волна излучения эксимерного лазера 248 нм (KrF), то из общего числа фотонов в поле микроскопа 1015 на бактерию «упадет» примерно 1011 и даже если объектив и оптическая система микроскопа передадут на камеру только 1% сигнала флуоресценции, то примерно 108 фотонов попадут на детектор (камеру). Это очень большой сигнал, особенно с учетом того, что квантовая эффективность современных научных CCD камер достигает 30% и они способны регистрировать отдельные фотоны. Даже при минимальном размере бактерии 1 мкм примерно 106 фотонов попадут на детектор.Let an ultraviolet laser illuminate a microscope field of 1x1 mm in size and the total radiation energy here is 1 mJ. Suppose that there is one
Таким образом, сигнала оказывается достаточно не только для регистрации спектра отдельной бактерии, но и для применения дополнительных методов спектрального или поляризационного разделения сигналов и спектров флуоресценции. При этом теоретически возможно получить всю информацию за один импульс лазера без накопления сигнала. Кроме того, эксимерные лазерные обладают дополнительным преимуществом в виде нескольких длин волн излучения на одном приборе, поскольку просто смена состава газовой смеси позволяет получать на одном устройстве излучение с длиной волны 193 нм (ArF), 222 нм (KrCl), 248 нм (KrF), 308 (XeCl) и 353 (XeF). Изменение длины волны возбуждения изменит спектр флуоресценции без существенного изменения энергетических параметров лазера. То есть появляется дополнительная возможность идентификации бактерий.Thus, the signal is sufficient not only to register the spectrum of an individual bacterium, but also to apply additional methods of spectral or polarization separation of signals and fluorescence spectra. In this case, it is theoretically possible to obtain all the information in one laser pulse without signal accumulation. In addition, excimer lasers have the additional advantage of several wavelengths of radiation on one device, since simply changing the composition of the gas mixture allows one to receive radiation with a wavelength of 193 nm (ArF), 222 nm (KrCl), 248 nm (KrF) on one device 308 (XeCl) and 353 (XeF). A change in the excitation wavelength will change the fluorescence spectrum without a significant change in the laser energy parameters. That is, there is an additional opportunity to identify bacteria.
Примеры выполнения способа.Examples of the method.
1. Обнаружение ведущего микроба по спектрам флуоресценции образцов определенного типа микробов.1. Detection of the leading microbe by the fluorescence spectra of samples of a certain type of microbes.
С целью специфической диагностики микробов в отношении ведущего микроба, имеющего наибольшую концентрацию в исследуемом субстрате, провели измерение спектров 5 видов микробов в отдельности и в смеси. Полученные спектры использовали для определения градуировочных матриц модели концентраций микробов в среде способом дифференциальной диагностики микробов. Применение способа включает в себя вычисление главных компонент спектральных характеристик флуоресценции и последующую регрессию матрицы концентраций на главные компоненты. Полученную в результате анализа градуировочную матрицу использовали для нахождения концентраций микробов в образцах из проверочной выборки и определения ведущего микроба. Результаты исследований свидетельствуют о приемлемой частоте правильного диагноза.In order to specifically diagnose microbes in relation to the leading microbe, which has the highest concentration in the test substrate, we measured the spectra of 5 types of microbes individually and in a mixture. The obtained spectra were used to determine the calibration matrices of the model of microbial concentrations in the medium by the method of differential diagnosis of microbes. Application of the method includes the calculation of the main components of the spectral characteristics of fluorescence and the subsequent regression of the concentration matrix on the main components. The calibration matrix obtained as a result of the analysis was used to find the concentration of microbes in the samples from the test sample and determine the leading microbe. Research results indicate an acceptable frequency of correct diagnosis.
Образцы из проверочной выборки имели известный видовой состав. Этот видовой состав нужен для сравнения результата применения метода по спектрам флуоресценции. Для этого спектры флуоресценции перемножаются на градуировочную матрицу и полученная в результате перемножения матрица распознанных концентраций сравнивается по структуре с матрицей известных концентраций микробов в этих образцах. Они представлены на фиг.4, где были анализированы концентрации этих пяти видов микробов и рядом с таблицей приведены известные концентрации по микробиологическим данным. Результат такого сравнения дает удовлетворительные совпадения для образцов, содержащих ведущий патоген в концентрации >108 и посредственный в концентрации <108. Однако дальнейшее развитие точности способа позволит определять специфичность с более низким концентрационным порогом обнаружения.Samples from the test sample had a known species composition. This species composition is needed to compare the result of applying the method for fluorescence spectra. For this, the fluorescence spectra are multiplied by a calibration matrix and the matrix of recognized concentrations obtained as a result of multiplication is compared in structure with the matrix of known microbial concentrations in these samples. They are presented in figure 4, where the concentrations of these five types of microbes were analyzed and the known concentrations according to microbiological data are shown next to the table. The result of this comparison gives satisfactory agreement for samples containing the leading pathogen at a concentration of> 10 8 and mediocre at a concentration of <10 8 . However, further development of the accuracy of the method will allow to determine the specificity with a lower concentration threshold of detection.
Приложение к примеру:Application for example:
Микробные смеси и чистые культуры микробов приготовляли из высевов на питательных средах, которые содержали одинаковую основу. Часть образцов содержала микробы только одного вида (обучающая выборка), а часть образцов содержала различные виды микробов в смеси (проверочная выборка). У всех образцов измеряли спектры флуоресценции при возбуждении излучением лазера с длиной волны 633 нм. Спектры образцов из обучающей выборки собрали в специальную матрицу, содержащую спектры, имеющие определенное количество дискретных позиций спектральной мощности по длине волны, в качестве строк. С применением процедуры анализа главных компонент выявили факторы и нагрузки главных компонент матрицы данных в виде отдельных матриц. Для этой группы образцов была информация о количественном и видовом составе населенности микробов, которую удобно для последующего анализа собрать в матрицу концентраций, которая определялась по строкам номерами образцов а по столбцам - номерами анализируемых видов микробов. Эта матрица с помощью процедуры регрессии связывалась в линейный закон зависимости с матрицей факторов методом наименьших квадратов. Полученная матрица связи, определяющая закон нахождения концентраций по факторам, умножается на матрицу нагрузок главных компонент. Результат этой операции дает градуировочную матрицу концентраций для спектров флуоресценции.Microbial mixtures and pure cultures of microbes were prepared from seeding on nutrient media that contained the same base. Some samples contained microbes of only one species (training sample), and some samples contained various types of microbes in the mixture (test sample). All samples were measured fluorescence spectra upon excitation by laser radiation with a wavelength of 633 nm. The spectra of the samples from the training set were collected in a special matrix containing spectra having a certain number of discrete positions of spectral power along the wavelength, as rows. Using the main component analysis procedure, factors and loads of the main components of the data matrix in the form of separate matrices were identified. For this group of samples, there was information on the quantitative and species composition of the microbial population, which is convenient for collecting for subsequent analysis in a concentration matrix, which was determined by line by number of samples and by column by numbers of analyzed types of microbes. Using the regression procedure, this matrix was connected in a linear law of dependence with the matrix of factors by the least squares method. The resulting coupling matrix, which determines the law of finding concentrations by factors, is multiplied by the matrix of loads of the main components. The result of this operation gives a calibration matrix of concentrations for the fluorescence spectra.
2. Определение наличия и концентрации микобактерий разных видов в чистом виде и в смеси.2. Determination of the presence and concentration of mycobacteria of various species in pure form and in a mixture.
С целью определения конкретного вида микобактерий в суспензии, состоящей из пяти видов, произвели процедуру обучения модели на образцах с чистыми культурами в физрастворе. Далее составили две смеси с различными видами микобактерий и сняли спектры флуоресценции этих суспензий. С помощью программы, использующей градуировочную матрицу модели, на компьютере вычислили концентрации пяти видов бактерий микобактерий.In order to determine the specific type of mycobacteria in a suspension consisting of five species, the model was trained on samples with pure cultures in saline. Next, we made two mixtures with different types of mycobacteria and took the fluorescence spectra of these suspensions. Using a program using the calibration matrix of the model, the concentrations of five types of mycobacteria bacteria were calculated on a computer.
Образцы с чистыми культурами бактерий приготовляли из посевов на питательных средах. Эти пять видов микобактерий имеют номенклатурные обозначения следующие: М.Avium, М.Vaccae, Tuberculosis(H37), М.Intracellulare и М.Kansasii. Смыв со сред растворяли в физрастворе и помещали в стандартные пробирки. Эти пробирки ставились в измерительный тракт диагностической установки и, возбуждая образцы излучением He-Ne лазера на длине волны 633 нм, подводимого к образцу по оптоволокну, снимали спектры их флуоресценции. Спектры некоторых из них приведены на фиг.5. Однако модель, построенная по предлагаемому способу, способна определить принадлежность этих спектров определенным видам микробов и определить их долю в смесях.Samples with pure cultures of bacteria were prepared from crops on nutrient media. These five types of mycobacteria have the following nomenclature: M. Avium, M. Vacae, Tuberculosis (H37), M. Intracellulare and M. Kansasii. Rinse off the media was dissolved in saline and placed in standard tubes. These tubes were placed in the measuring path of the diagnostic unit and, exciting the samples with He-Ne laser radiation at a wavelength of 633 nm, supplied to the sample via optical fiber, they recorded their fluorescence spectra. The spectra of some of them are shown in Fig.5. However, the model constructed by the proposed method is able to determine whether these spectra belong to certain types of microbes and to determine their share in mixtures.
Для получения градуировочной матрицы провели процедуру регрессии на главные компоненты согласно способу. В использовавшейся референтной информации о концентрациях предполагали, что в образцах с наиболее густыми суспензиями концентрации составляли 1000 единиц. Это связано с тем, что отсутствует стандарт мутности для микобактерий в этих концентрациях, по которой обычно определяется концентрация разведении чистых культур для других видов микробов.To obtain a calibration matrix, a regression procedure was performed on the main components according to the method. In the reference concentration information used, it was assumed that in the samples with the thickest suspensions, the concentrations were 1000 units. This is due to the fact that there is no standard turbidity for mycobacteria at these concentrations, which is usually used to determine the concentration of dilution of pure cultures for other types of microbes.
По пяти образцам с чистыми культурами и двумя образцами со смесями микобактерий определяли способность модели определять концентрации бактерий по их спектрам флуоресценции. Спектры флуоресценции этих образцов снимались в аналогичных условиях, что и для образцов обучающей выборки. Далее на компьютере, следуя модели, вычислили концентрации микобактерий в этих образцах. Результаты вычисления приведены на фиг.6. Здесь по горизонтали отложены определяемые виды бактерий а по вертикали - конкретные образцы. В двух последних образцах, обозначенных Mix1 и Mix2, присутствовали соответственно М.Vaccae, М.Intracellulare и М.Avium, M.Intacellulare, М.Kansasii. Как видно из таблицы, вычисленные концентрации довольно хорошо показывают качественный состав и в пределах ошибки измерений - количественный.Using five samples with pure cultures and two samples with mixtures of mycobacteria, we determined the ability of the model to determine the concentration of bacteria from their fluorescence spectra. The fluorescence spectra of these samples were recorded under similar conditions as for the samples of the training sample. Further on the computer, following the model, the concentrations of mycobacteria in these samples were calculated. The calculation results are shown in Fig.6. Here, defined species of bacteria are laid horizontally and concrete samples are laid out vertically. In the last two samples, designated Mix1 and Mix2, M. Vaccae, M. Intracellulare and M. Avium, M. Intacellulare, M. Kansasii were present, respectively. As can be seen from the table, the calculated concentrations show a fairly good qualitative composition and quantitative within the measurement error.
На первый взгляд, как уже отмечалось, спектры флуоресценции микробов обладают малой специфичностью. Для модели эта специфичность достаточна, для того чтобы определить наличие в образцах разных видов микобактерий. Это демонстрирует приведенная на фиг.6 таблица, а также составляющие градуировочную матрицу весовые функции, служащие законом линейного отображения центрированных спектральных характеристик образца на нормированные шкалы концентраций, принадлежащих конкретным видам микробов. На фиг.7 приведены две весовые функции для микобактерий М.Tuberculosis H37 и М.Avium. Сильное отличие их друг от друга, а также таковых для всех микобактерий, обусловлено тем, что имеется ощутимое отличие в спектрах флуоресценции чистых культур. Эти функции также показывают на каких спектральных диапазонах имеются характерные особенности в спектрах, отличающие бактерии друг от друга. Для большей точности вычислительная модель использует по алгоритму максимальное количество этих особенностей.At first glance, as already noted, the fluorescence spectra of microbes have low specificity. For the model, this specificity is sufficient to determine the presence in the samples of different types of mycobacteria. This is shown in the table in Fig. 6, as well as the weight functions that make up the calibration matrix, which serve as the law of linear mapping of the centered spectral characteristics of the sample to normalized concentration scales belonging to specific types of microbes. Figure 7 shows two weight functions for mycobacteria M. Tuberculosis H37 and M. Avium. Their strong difference from each other, as well as those for all mycobacteria, is due to the fact that there is a noticeable difference in the fluorescence spectra of pure cultures. These functions also show on which spectral ranges there are characteristic features in the spectra that distinguish bacteria from each other. For greater accuracy, the computational model uses the algorithm for the maximum number of these features.
Концентрации разных видов микробов вычисляли с ошибкой, содержащейся в измерениях. Это неизбежно, так как используются для измерения аппаратурные узлы, имеющие собственные шумовые искажения, а также из-за того, что регистрируемое спектроанализатором фотонное поле содержит квантовые флуктуации. Все это в совокупности искажает снимаемые данные, и основанные на них вычисления будут давать тоже отличающиеся от действительности результаты. Ситуация усугубляется при малом структурном составляющем данных, обусловленным малым сигналом от микробного объекта. Для улучшения сигнала от образцов с суспензиями микробов провели дополнительные измерения с добавлением в приготовляемые образцы детергента, разрушающего защитную оболочку микробов и растворяющего их содержимое в окружающем субстрате. Этот процесс высвобождает флуоресцирующие молекулы, которые ранее не проявляли флуоресценцию из-за тушения флуоресценции внутри цитоплазмы. В результате вычислений по таким данным получились следующие концентрации, показанные на фиг.8. Здесь определение концентрации микобактерий туберкулеза дает неточное совпадение, что связано с некоторыми химическими изменениями при воздействии детергента на этот вид бактерий. Однако для отдельных других видов это определение удовлетворительно.The concentrations of different types of microbes were calculated with the error contained in the measurements. This is inevitable, since hardware nodes with intrinsic noise distortions are used for measurement, and also because the photon field recorded by the spectrum analyzer contains quantum fluctuations. All this in aggregate distorts the captured data, and the calculations based on them will also give results that differ from reality. The situation is exacerbated with a small structural component of the data due to the small signal from the microbial object. To improve the signal from samples with microbial suspensions, additional measurements were carried out with detergent added to the prepared samples, which destroys the protective shell of the microbes and dissolves their contents in the surrounding substrate. This process releases fluorescent molecules that previously did not show fluorescence due to quenching of fluorescence within the cytoplasm. As a result of calculations from such data, the following concentrations were obtained, shown in Fig. 8. Here, the determination of the concentration of mycobacterium tuberculosis gives an inaccurate coincidence, which is associated with some chemical changes under the influence of a detergent on this type of bacteria. However, for certain other species, this definition is satisfactory.
3. Специфическая диагностика туберкулеза по лазерно-флуоресцентному анализу плазмы крови пациентов.3. Specific diagnosis of tuberculosis by laser-fluorescence analysis of blood plasma of patients.
С целью разработки экспресс-метода диагностики туберкулеза были проведены исследования на поиск информативных критериев инфицированности пациентов микобактериями туберкулеза по спектральным характеристикам флуоресценции. В результате найдены динамические поля величин, имеющих закон вычисления, определяемый эмпирической градуировочной матрицей.In order to develop an express method for the diagnosis of tuberculosis, studies were conducted to search for informative criteria for the infection of patients with mycobacterium tuberculosis according to the spectral characteristics of fluorescence. As a result, dynamic fields of quantities having a calculation law determined by an empirical calibration matrix are found.
В данной работе множество объектов S представлено определенным количеством пациентов клиники, плазма крови которых была протестирована методом ЛФД (один человек - один тест). Общая численность группы составляла 130 человек. Для каждого из лиц этой группы было установлено независимыми медико-биологическими исследованиями нозологическое досье, использовавшееся для нахождения основного свойства объектов по спектрам флуоресценции. Группа была разбита на две подгруппы: S' - обучающая подгруппа (60 человек) и контрольно-тестовая подгруппа (70 человек). После проведения анализа главных компонент на обучающей подгруппе были выявлены главные факторы модели и проведена привязка областей локализации полученных данных к заранее известному из досье типу заболевания. Данная привязка приводила к соответствующим регрессионным соотношениям. На контрольной подгруппе S/S' оценивалась эффективность распознавания заболеваний путем сопоставления данных модели факторного анализа, настроенной по S', и фактических данных, взятых у пациентов этой группы из их истории болезни.In this work, many S objects are represented by a certain number of clinic patients whose blood plasma was tested by the APD method (one person - one test). The total number of the group was 130 people. For each of the persons of this group, an nosological dossier was established by independent biomedical research, which was used to find the main property of objects from the fluorescence spectra. The group was divided into two subgroups: S '- a training subgroup (60 people) and a control and test subgroup (70 people). After the analysis of the main components in the training subgroup, the main factors of the model were identified and the areas of localization of the obtained data were linked to the type of disease previously known from the dossier. This binding led to the corresponding regression relationships. In the control subgroup S / S ', the efficiency of disease recognition was evaluated by comparing the data of the factor analysis model adjusted according to S' and the actual data taken from patients in this group from their medical history.
В число испытуемых входили пациенты категории "практически здоровые", пациенты больные туберкулезом и пациенты с другими заболеваниями, включающими воспаление легких и гнойные процессы. Последняя группа именуется далее - "пациенты с другими легочными заболеваниями".The subjects included “practically healthy” patients, patients with tuberculosis and patients with other diseases, including pneumonia and purulent processes. The last group is referred to below as “patients with other pulmonary diseases”.
В случае спектрально-флуоресцентного анализа многомерный признак представляет собой спектр люминесцентного сигнала, оцифрованный в каждом спектральном канале ПЗС матрицы полихроматора. Полихроматор был включен в состав диагностического комплекса, имеющего лазер на длине волны генерации 532 нм для возбуждения образцов.In the case of spectral-fluorescence analysis, a multidimensional feature is the spectrum of the luminescent signal digitized in each spectral channel of the CCD of the polychromator matrix. A polychromator was included in the diagnostic complex having a laser at a wavelength of 532 nm to excite samples.
По завершении цикла тестирования оцифрованные спектры флуоресценции использовались в качестве исходных массивов для проведения анализа главных компонент и диагностики заболеваний в тестируемой группе. Типичные спектры лазерно-индуцированной флуоресценции проб, полученные при длине волны возбуждающего излучения 532 нм, приведены на фиг.9.At the end of the testing cycle, the digitized fluorescence spectra were used as initial arrays for the analysis of the main components and the diagnosis of diseases in the test group. Typical laser-induced fluorescence spectra of samples obtained at an excitation radiation wavelength of 532 nm are shown in FIG. 9.
Как видно на фиг.9, измеренные спектры флуоресценции на вид практически лишены характерных спектральных особенностей и малопригодны для диагностики, непосредственно опирающейся на обнаружение флуоресцирующих ферментных центров, вырабатываемых патогенными бактериями. Вместе с тем, использование для анализа массива таких спектров метода главных компонент позволяет определить соответствующие классам диагностируемых заболеваний динамические поля значений параметров, которые описывают характерные пределы изменений этих параметров.As can be seen in Fig. 9, the measured fluorescence spectra look almost devoid of characteristic spectral features and are of little use for diagnostics directly based on the detection of fluorescent enzyme centers produced by pathogenic bacteria. At the same time, the use of the method of principal components for the analysis of the array of such spectra allows us to determine the dynamic fields of parameter values corresponding to the classes of diagnosed diseases that describe the characteristic limits of changes in these parameters.
Процедура анализа главных компонент данных, накопленных в обучающей выборке, выявила наличие в пространстве признаков трех главных компонент (р=3) и соответствующих общих факторов, обуславливающих особенности измеренных спектров. Значение р=3, соответствует критерию Кэттеля [4], фиксирующего номер итерации, приводящей к максимальному замедлению убыли остаточной дисперсии.The analysis procedure of the main components of the data accumulated in the training sample revealed the presence of three main components (p = 3) in space and the corresponding general factors that determine the characteristics of the measured spectra. The value p = 3 corresponds to the Kattel criterion [4], fixing the iteration number, leading to the maximum slowdown of the decrease in the residual variance.
В подпространстве общих факторов точки локализуются в областях, отвечающих определенному, известному из досье обучающей группы, диагностируемому заболеванию. При проведении предварительной компьютерной 3D-визуализации распределения, имитирующего локализацию экспериментальных точек в факторном подпространстве, эти области оказались вытянутыми и приближенно ориентированными вдоль одного направления. Следовательно, информация, существенная в отношении дискриминации объектов по классам диагностируемых заболеваний, содержится в координатах проекций этих точек на некоторую плоскость S, ортогональную найденному ориентационному направлению. Таким образом, задача распознавания сводится к определению и разделению 2D-областей локализации координат точек в S-плоскости для обучающей выборки с последующим отнесением объекта из контрольно-тестовой выборки к одной из этих областей.In the subspace of common factors, points are localized in areas that correspond to a specific, known from the dossier of the training group, diagnosed disease. During preliminary 3D computer visualization of the distribution simulating the localization of experimental points in the factor subspace, these regions turned out to be elongated and approximately oriented along one direction. Therefore, the information that is relevant in relation to discrimination of objects according to the classes of diagnosed diseases is contained in the coordinates of the projections of these points onto some plane S orthogonal to the found orientational direction. Thus, the recognition problem is reduced to the determination and separation of 2D regions of localization of the coordinates of points in the S plane for the training sample, with the subsequent assignment of the object from the test sample to one of these areas.
На фиг.10 представлены диаграммы распределения экспериментальных точек в S-плоскости для обучающей выборки (4а) и для контрольно-тестовой выборки (4б). Начало 2D-системы координат в S-плоскости взято в точке пересечения с ориентационной осью. Ось Х для удобства представления выбрана параллельной плоскости первых двух ортов факторного пространства: связь Х-проекции и координат образца f1, f2 в факторном базисе задана соотношениемFigure 10 presents the distribution diagrams of the experimental points in the S-plane for the training sample (4a) and for the control and test sample (4b). The origin of the 2D coordinate system in the S-plane is taken at the intersection with the orientation axis. For convenience, the X axis was chosen parallel to the plane of the first two unit vectors of the factor space: the relationship of the X projection and the sample coordinates f1, f2 in the factor basis is given by
Десятикратное "растяжение" значений f2 имеет целью компенсацию убыли собственного значения второго фактора по сравнению с первым и, соответственно, предотвращение сжатия области локализации точек в одном из направлений. С учетом сделанных замечаний связь Y-проекции в S-плоскости и координат образца f1, f2, f3 выражается соотношениемA tenfold "stretching" of the values of f2 is aimed at compensating for the decrease in the eigenvalue of the second factor compared to the first and, accordingly, preventing compression of the localization region of the points in one of the directions. Taking into account the remarks made, the relation between the Y projection in the S plane and the sample coordinates f1, f2, f3 is expressed by the relation
Данные, отображенные на фиг.10, представляют две группы испытуемых: практически здоровые пациенты и пациенты, больные туберкулезом. Видно, что области сгущения точек или динамические поля, найденные по обучающей выборке, имеют хорошее разделение в данном пространстве. По точкам контрольно-тестовой группы можно заметить, что доминирующая их часть лежит в определенных для своих групп полях. Это свидетельствует о приемлемой эффективности дискриминации пациентов по этим группам.The data shown in FIG. 10 represent two groups of subjects: practically healthy patients and patients with tuberculosis. It can be seen that the areas of point condensation or dynamic fields found from the training set have a good separation in this space. At the points of the control and test group, you can notice that their dominant part lies in the fields defined for their groups. This indicates the acceptable effectiveness of patient discrimination in these groups.
Вследствие большого разнообразия заболеваний, связанных с патогенной микрофлорой, в задачу диагностики входит не только дискриминация больных и здоровых, но и отделение больных одной нозологической группы от других. В соответствии с целями данного исследования, а именно создания экспресс-методики выявления больных зараженных туберкулезом, проведено сравнение спектральных параметров флуоресценции проб, взятых у туберкулезных больных, и группы больных с другими легочными заболеваниями. На фиг.11 представлены диаграммы распределения экспериментальных точек для группы больных туберкулезом и группы больных с другими легочными заболеваниями. Как и на фиг.10 здесь, соответственно, представлены результаты для обучающей (5а) и контрольно-тестовой (5б) группы. Как видно из представленной диаграммы, динамические поля туберкулеза и группы других легочных заболеваний также хорошо разделяются.Due to the wide variety of diseases associated with pathogenic microflora, the diagnostic task includes not only discrimination of patients and healthy, but also the separation of patients from one nosological group from others. In accordance with the objectives of this study, namely, the creation of an express method for identifying patients infected with tuberculosis, a comparison is made of the spectral fluorescence parameters of samples taken from tuberculosis patients and the group of patients with other pulmonary diseases. Figure 11 shows the distribution diagrams of experimental points for a group of patients with tuberculosis and a group of patients with other pulmonary diseases. As in FIG. 10, here, respectively, the results are presented for the training (5a) and control and test (5b) groups. As can be seen from the diagram, the dynamic fields of tuberculosis and the groups of other pulmonary diseases are also well separated.
Подсчет количества точек в динамических полях S-плоскости позволил оценить статистическую значимость диагностической процедуры, вычисленную как относительная частота правильного заключения при постановке диагноза в полном наборе проб контрольно-тестовой группы. Уровень выявления заболевания туберкулезом по результатам мониторинга с однократным отбором проб в контрольно-тестовой группе составил 80%.Counting the number of points in the dynamic fields of the S-plane made it possible to evaluate the statistical significance of the diagnostic procedure, calculated as the relative frequency of the correct conclusion when making a diagnosis in a complete set of samples of the control and test group. The detection rate of tuberculosis disease according to the results of monitoring with a single sampling in the control and test group was 80%.
4. Сетевая мультитерминальная компьютеризированная система индивидуальной экспресс-диагностики и экспертной оценки эффективности лечения заболеваний и процессов микробной природы4. Network multi-terminal computerized system of individual express diagnostics and expert assessment of the effectiveness of the treatment of diseases and microbial processes
Для проведения диагностики заболеваний микробной этиологии применяется методика получения физико-химической информации проб с помощью явления лазерно-индуцированной флуоресценции, основанная на прямой обработке снимаемой информации в режиме реального времени и без применения сложной аппаратуры, что позволяет применять ее для многих случаев, где это не было достижимо по многим критериям обычными методами. Например, для обнаружения патогенных микроорганизмов в среде с необходимой скоростью этот способ подходит больше всех, что дает его основное преимущество и ряд других преимуществ.To diagnose diseases of microbial etiology, a technique is used to obtain physicochemical information of samples using the phenomenon of laser-induced fluorescence, based on direct processing of the recorded information in real time and without the use of complex equipment, which allows it to be used in many cases where it was not achievable by many criteria by conventional methods. For example, for the detection of pathogenic microorganisms in an environment with the necessary speed, this method is most suitable, which gives its main advantage and a number of other advantages.
В лазерно-флуоресцентной диагностике спектральные исследования в основном варианте проводят на экспериментальном лазерном волоконном многоканальном спектроанализаторе, который в результате измерений дает спектр индуцированной лазером флуоресценции в определенном спектральном диапазоне. С помощью специального ПО компьютера полученные данные обрабатываются и отображаются на его мониторе в виде спектра. Спектры флуоресценции являются источником диагностической информации. Процесс экспресс-диагностики занимает не более минуты, и даже секунды.In laser-fluorescence diagnostics, spectral studies in the main version are carried out on an experimental laser fiber multichannel spectroanalyzer, which, as a result of measurements, gives a spectrum of laser-induced fluorescence in a certain spectral range. Using special computer software, the received data is processed and displayed on its monitor in the form of a spectrum. Fluorescence spectra are a source of diagnostic information. The process of express diagnostics takes no more than a minute, and even a second.
Результат дифференциальной диагностики достигается тем, что в способе лазерной флуоресцентной диагностики микробов для определения ведущего микроба, конкурирующих ассоциантов и сложных аминокислот по спектру их флуоресценции с помощью специального программного обеспечения диагностического комплекса, с целью повышения чувствительности, точности, специфичности, информативности, применяют решения, заключающиеся в том, что для анализа используются значения спектральной интенсивности во всем спектральном диапазоне аппаратуры оптического диапазона. При этом производится на этапе наладки комплекса процедура обучения получение статистической модели концентраций микробов, формулируемой в виде произведения специального вида градуировочной матрицы на вектор спектральных характеристик флуоресценции исследуемого образца. На основе модели с помощью программного обеспечения производится вычисление концентраций микробов или аминокислот в диагностируемых образцах. На основе вычисленных концентраций в дальнейшем производят определение ведущего микроба по характеристическому концентрационному и видовому критерию. Все этапы процедуры диагностики реализуются программно на ЭВМ диагностического комплекса с участием пользовательского интерфейса.The result of differential diagnostics is achieved by the fact that in the method of laser fluorescence diagnostics of microbes to determine the leading microbe, competing associates and complex amino acids by their fluorescence spectrum using special diagnostic complex software, in order to increase sensitivity, accuracy, specificity, and information content, solutions consisting of in that the analysis uses the values of spectral intensity in the entire spectral range of the optical equipment who range. In this case, at the stage of setting up the complex, the training procedure is performed to obtain a statistical model of microbial concentrations, formulated as a product of a special kind of calibration matrix by the vector of spectral characteristics of the fluorescence of the test sample. Based on the model, the software calculates the concentrations of microbes or amino acids in the diagnosed samples. Based on the calculated concentrations, the leading microbe is subsequently determined by the characteristic concentration and species criteria. All stages of the diagnostic procedure are implemented programmatically on the computer of the diagnostic complex with the participation of the user interface.
Этот метод позволяет обеспечивать экспрессность, точность, информативность и экономическую целесообразность диагностики микробов и соответствующих нозологий.This method allows us to ensure expressness, accuracy, informativeness and economic feasibility of the diagnosis of microbes and related nosologies.
Проводили экспериментальные измерения и проверку результатов программного обеспечения. Все измерения поведены по измерениям флуоресценции в спектральном диапазоне 650-800 нм при возбуждении флуоресценции гелий-неоновым лазером. Объектом исследования являлись 5 видов микобактерий, которые обозначены на приведенных иллюстрациях следующим образом: Мb.а - М. Avium, Mb.b - М. Vaccae, Mb.h -Tuberculosis(H37), Mb.i - М. Intracellulare, Mb.k - М. Kansasii. Сначала были приготовлены суспензии, состоящие из пяти видов указанных микробов, на основе которых произвели процедуру обучения модели на образцах с чистыми культурами в физрастворе. Далее составили образцы смесей с различными видами микобактерий и сняли спектры флуоресценции этих суспензий. С помощью программы, использующей градуировочную матрицу модели, на компьютере вычислили концентрации пяти видов бактерий микобактерий.Conducted experimental measurements and verification of software results. All measurements are based on fluorescence measurements in the spectral range of 650-800 nm upon excitation of fluorescence by a helium-neon laser. The object of the study was 5 species of mycobacteria, which are indicated in the illustrations as follows: Mb.a - M. Avium, Mb.b - M. Vaccae, Mb.h-Tuberculosis (H37), Mb.i - M. Intracellulare, Mb. k - M. Kansasii. First, suspensions were prepared, consisting of five types of these microbes, on the basis of which the procedure for training the model on samples with pure cultures in saline was performed. Next, samples of mixtures with various types of mycobacteria were compiled and the fluorescence spectra of these suspensions were recorded. Using a program using the calibration matrix of the model, the concentrations of five types of mycobacteria bacteria were calculated on a computer.
Образцы с чистыми культурами бактерий приготовляли из посевов на питательных средах. Смыв со сред растворяли в физрастворе и помещали в стандартные пробирки. Спектры некоторых из них приведены справа на фиг.12. На первый взгляд эти спектры отличаются лишь по величине общего сигнала, но не имеют качественных отличий. Однако модель, построенная по предлагаемому способу, способна определить принадлежность этих спектров определенным видам микробов и определить их долю в смесях. Это демонстрируют составляющие градуировочную матрицу весовые функции, служащие законом линейного отображения спектральных характеристик образца на нормированные шкалы концентраций, принадлежащих конкретным видам микробов. На фиг.12 слева приведены две весовые функции для микобактерий М.Tuberculosis H37 и М.Avium.Samples with pure cultures of bacteria were prepared from crops on nutrient media. Rinse off the media was dissolved in saline and placed in standard tubes. The spectra of some of them are shown on the right in FIG. At first glance, these spectra differ only in the magnitude of the total signal, but do not have qualitative differences. However, the model constructed by the proposed method is able to determine whether these spectra belong to certain types of microbes and to determine their share in mixtures. This is demonstrated by the weight functions composing the calibration matrix, which serve as the law of linear mapping of the spectral characteristics of the sample to normalized concentration scales belonging to specific types of microbes. 12, two weight functions are shown on the left for M. tuberculosis H37 and M. Avium mycobacteria.
Результаты вычисления приведены на фиг.13. Здесь по горизонтали отложены определяемые виды бактерий а по вертикали конкретные образцы. В двух последних образцах, обозначенных Mix1 и Mix2, присутствовали соответственно М. Vaccae+М. Intracellulare и М. Avium+М. Intacellulare, + М. Kansasii. Как видно из таблицы (см. фиг. 14), вычисленные концентрации довольно хорошо показывают качественный состав и в пределах ошибки измерений количественный (концентрации условные, нормированные на 1000 единиц).The calculation results are shown in Fig.13. Here, defined species of bacteria are laid horizontally and concrete samples are vertically laid. In the last two samples, designated Mix1 and Mix2, M. Vaccae + M, respectively, was present. Intracellulare and M. Avium + M. Intacellulare, + M. Kansasii. As can be seen from the table (see Fig. 14), the calculated concentrations show a rather good qualitative composition and quantitative within the measurement error (conditional concentrations normalized to 1000 units).
Для повышения чувствительности измерений были проведены измерения спектров лазерно-индуцированной флуоресценции образцов микобактерий, смешанных с детергентом, разрушающим клеточную стенку микробов и высвобождающих молекулы содержимого цитоплазмы (концентрации условные, нормированные на 10 единиц).To increase the sensitivity of measurements, we measured the spectra of laser-induced fluorescence of mycobacterial samples mixed with a detergent that destroys the cell wall of microbes and releases molecules of the cytoplasm contents (conventional concentrations normalized to 10 units).
В образцах смеси присутствовали следующие микобактерий:The following mycobacteria were present in the mixture samples:
Mix1:Mb.b + Mb.IMix1: Mb.b + Mb.I
Mix2: Mb.a + Mb.h. + Mb.I.Mix2: Mb.a + Mb.h. + Mb.I.
Mix3: Mb.a + Mb.h. + Mb.k.Mix3: Mb.a + Mb.h. + Mb.k.
Mix3: Mb.a + Mb.h. + Mb.k. + Mb.b.Mix3: Mb.a + Mb.h. + Mb.k. + Mb.b.
В результате этих исследований была получена 60-70% эффективность определения микробов в смесях.As a result of these studies, a 60-70% efficiency in the determination of microbes in mixtures was obtained.
Для получения более достоверных данных об исследуемом объекте необходимо иметь четкое представление о его характеристиках поглощения, рассеяния, а также о вероятной концентрации в нем тех или иных флуоресцирующих веществ. Для повышения точности определения микробов и их концентраций в смесях по данному методу провели дополнительные измерения спектров пропускания образцов, с помощью которых восстанавливали спектры лазерно-индуцированной флуоресценции образцов. На основе восстановленных спектров вычислили концентрацию в образцах, обработанных детергентом, и сравнили с их содержимым, что демонстрирует таблица на фиг.15 (концентрации условные, нормированные на 1000 единиц).To obtain more reliable data on the studied object, it is necessary to have a clear idea of its absorption, scattering characteristics, as well as the probable concentration of certain fluorescent substances in it. To increase the accuracy of determination of microbes and their concentrations in mixtures according to this method, we additionally measured the transmission spectra of the samples, with which we restored the spectra of laser-induced fluorescence of the samples. Based on the reconstructed spectra, the concentration in the samples treated with the detergent was calculated and compared with their contents, which is shown in the table in Fig. 15 (conventional concentrations normalized to 1000 units).
В образцах смеси присутствовали следующие микобактерий:The following mycobacteria were present in the mixture samples:
Mix1: Mb.a. + Mb.h. + Mb.I.Mix1: Mb.a. + Mb.h. + Mb.I.
Mix2: Mb.a + Mb.b. + Mb.I.Mix2: Mb.a + Mb.b. + Mb.I.
В результате этих исследований была получена 80-100% эффективность определения микробов в смесях, что доказывает увеличение эффективности при учете оптических характеристик среды.As a result of these studies, an 80-100% efficiency in the determination of microbes in mixtures was obtained, which proves an increase in efficiency when optical characteristics of the medium are taken into account.
Предлагаемый способ дифференциальной диагностики позволяет реализовать систему индивидуальной экспресс-диагностики и экспертной оценки эффективности лечения заболеваний микробных, когда с помощью дистанционных методов по спектрам лазерно-индуцированной флуоресценции определяют обсемененность микробами близких или удаленных проб, при этом диагностический комплекс стоит из единого блока анализа информации, обрабатывающего спектры флуоресценции сразу нескольких блоков измеряющих эти спектры и передающих свою информацию для обработки блоку анализа по локальным или глобальным сетям связи с использованием стандартных протоколов, в том числе и протоколов шифрования. См. схему сетевой мультитерминальной компьютеризированной системы индивидуальной экспресс-диагностики и экспертной оценки эффективности лечения заболеваний и процессов микробной природы (фиг.16). Данный способ обладает следующими преимуществами:The proposed method of differential diagnosis allows you to implement a system of individual express diagnostics and expert evaluation of the effectiveness of the treatment of microbial diseases, when using remote methods using laser-induced fluorescence spectra determine the microbial contamination of nearby or remote samples, while the diagnostic complex is from a single unit of information analysis processing fluorescence spectra of several blocks measuring these spectra and transmitting their information for processing quipment analysis unit for local or global communications networks using standard protocols, including encryption protocols. See the diagram of the network multi-terminal computerized system of individual express diagnostics and expert evaluation of the effectiveness of the treatment of diseases and processes of microbial nature (Fig. 16). This method has the following advantages:
- практическое отсутствие расходных материалов,- the practical lack of consumables,
- скрининг - при экспресс-оценке инфекционных заболеваний (туберкулез, СПИД, сифилис, холера и др.),- screening - during the rapid assessment of infectious diseases (tuberculosis, AIDS, syphilis, cholera, etc.),
- диспансеризация населения с целью выявления заболеваний и процессов микробной природы и регистрации фоновых (контрольных) показателей различных биологических жидкостей (моча, слюна, кровь и др.) для создания паспорта здоровья населения,- medical examination of the population in order to identify diseases and processes of microbial nature and registration of background (control) indicators of various biological fluids (urine, saliva, blood, etc.) to create a health passport for the population,
- население получает современную высокоэффективную, экологически чистую технологию без применения расходных материалов и экономическую выгоду (стоимость одного анализа в 10-100 раз дешевле стандартных применяемых аналогов),- the population receives modern high-performance, environmentally friendly technology without the use of consumables and economic benefits (the cost of one analysis is 10-100 times cheaper than the standard analogues used),
- экспресс-диагностика и оценка эффективности лечения дисбактериоза (страдает 90% населения),- express diagnostics and evaluation of the effectiveness of the treatment of dysbiosis (90% of the population suffers),
- самообучаемость системы с достижением новых информативных возможностей, учитывающих изменения видов микроорганизмов в медицинских учреждениях, находящихся в разных климатических и географических условиях,- self-learning system with the achievement of new informative opportunities, taking into account changes in the types of microorganisms in medical institutions located in different climatic and geographical conditions,
- слежение за ареалом распространения инфекции,- monitoring the area of infection,
- экономическая целесообразность и существенное сокращение расходов на диагностику вследствие централизованности системы.- economic feasibility and a significant reduction in diagnostic costs due to the centralization of the system.
Система состоит из единого сервера и удаленных клиентов. Сервер содержит систематизированную библиотеки микробов как музейных, так и клинических штаммов и специальное программное обеспечение, проводящее диагностику и делающее рекомендации по лечению. Клиентами являются диагностические комплексы на удаленных локальных клинических объектах.The system consists of a single server and remote clients. The server contains a systematic library of microbes of both museum and clinical strains and special software that diagnoses and makes recommendations for treatment. Clients are diagnostic complexes at remote local clinical sites.
Часть клиентов выступает как в качестве потребителя информационных возможностей сервера, так и поставщика дополнительной уточняющей информации по изменчивым видам микроорганизмов.Some clients act both as a consumer of the server’s information capabilities and as a supplier of additional clarifying information on variable types of microorganisms.
Предлагаемый способ дифференциальной диагностики микробов и сложных аминокислот обеспечивает экспрессность диагностики: время диагностики определяется скоростью взятия пробы, а также временем снятия спектра флуоресценции и временем вычисления концентраций микробов, и определение ведущего микроба. Также он обеспечивает специфичность: позволяет в реальном времени на принципе обратной связи определять концентрации и наличие различных видов микробов в микс-системах (ассоциации), превышающих порог определения по концентрации, и улучшенное качество информации: использует все значения спектральных интенсивностей флуоресценции и определяет максимально структурную часть информации в спектральных данных, что повышает успешность диагностики.The proposed method for differential diagnosis of microbes and complex amino acids provides rapid diagnostic: the diagnostic time is determined by the speed of sampling, as well as the time of taking the fluorescence spectrum and the time of calculating the concentration of microbes, and determining the leading microbe. It also provides specificity: it allows in real time, on the basis of the feedback principle, to determine the concentrations and the presence of various types of microbes in mix systems (associations) that exceed the threshold of determination by concentration, and improved information quality: it uses all the values of the spectral intensities of fluorescence and determines the maximum structural part information in spectral data, which increases the success of diagnostics.
Дешевизна: не требует применения дополнительных расходных материалов в качестве реактивов и маркеров.Cheap: does not require the use of additional consumables as reagents and markers.
На основе диагностики ведущего микроба дают рекомендации по лечению пациента, проба которого исследуется, затем проводят определение новых лечебных и диагностических критериев по отзывам о результатах процесса лечения, используя человека в качестве биологической модели; для экспрессного определения заболевания человека, связанного с микробной этиологией, применяют динамические пределы вариаций главных факторов для диагностики; определяют концентрации специфических видов микробов в определенном типе пищевых продуктов.Based on the diagnosis of the leading microbe, recommendations are given for the treatment of the patient whose sample is being examined, then new therapeutic and diagnostic criteria are determined according to feedback on the results of the treatment process, using the person as a biological model; for the rapid determination of human diseases associated with microbial etiology, apply the dynamic limits of variations of the main factors for diagnosis; determine the concentration of specific types of microbes in a particular type of food.
ЛитератураLiterature
1. Александров М., Воробьев А., Полянский Е., Филатов М., Мищенко И., Багрянова Г. Лазерная флуоресцентная диагностика в медицине, пищевой промышленности, индустрии, экологии. // Электроника: НТБ 3/031. Alexandrov M., Vorobev A., Polyansky E., Filatov M., Mishchenko I., Bagryanova G. Laser fluorescence diagnostics in medicine, food industry, industry, and ecology. // Electronics:
2. И.В.Гердова, С.А.Доленко, Т.А.Доленко, И.Г.Персиянцев, В.В.Фадеев, И.В.Чурина. Новые возможности в решении обратных задач лазерной спектроскопии с применение искусственных нейронных сетей. Известия Российской Академии Наук, Серия физическая, 2002, т.66,8, с.1116-1124.2. I.V. Gerdova, S. A. Dolenko, T. A. Dolenko, I. G. Persiyantsev, V. V. Fadeev, I. V. Churina. New opportunities in solving inverse problems of laser spectroscopy using artificial neural networks. Proceedings of the Russian Academy of Sciences, Physical Series, 2002, vol. 66.8, pp. 1116-1124.
3. Э.А.Свириденков. Люминесцентный анализ, М., 1961.3. E.A. Sviridenkov. Luminescent analysis, M., 1961.
4. Cattell, R.В. The screen test for the number of factors. 1966, Multivariate Behavioral Research, 1, 629-637.4. Cattell, R.V. The screen test for the number of factors. 1966, Multivariate Behavioral Research, 1, 629-637.
5. Martens H., Naes Т. Multivariative calibration. 1998, Willey.5. Martens H., Naes T. Multivariative calibration. 1998, Willey.
6. O.E.Родионова, А.Л.Померанцев. Хемометрика в аналитической химии.6. O.E. Rodionova, A. L. Pomerantsev. Chemometrics in analytical chemistry.
Claims (4)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2007112513/28A RU2362145C2 (en) | 2007-04-05 | 2007-04-05 | Differential diagnosis method for microbes and amino acids |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2007112513/28A RU2362145C2 (en) | 2007-04-05 | 2007-04-05 | Differential diagnosis method for microbes and amino acids |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2007112513A RU2007112513A (en) | 2008-10-10 |
| RU2362145C2 true RU2362145C2 (en) | 2009-07-20 |
Family
ID=39927501
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2007112513/28A RU2362145C2 (en) | 2007-04-05 | 2007-04-05 | Differential diagnosis method for microbes and amino acids |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2362145C2 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2488097C1 (en) * | 2011-11-22 | 2013-07-20 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Вологодский государственный технический университет" (ВоГТУ) | Method of analysing biological preparations |
| RU2828816C1 (en) * | 2023-12-08 | 2024-10-21 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Пензенский государственный университет" | QUANTUM SENSOR BASED ON QUANTUM DOT WITH IMPURITY COMPLEX (A++e) IN AN EXTERNAL ELECTRIC FIELD |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1382848A1 (en) * | 1986-09-08 | 1988-03-23 | Всесоюзный научно-исследовательский институт биологического приборостроения | Method of measuring concentration of microorganisms in suspension |
| EP1067199A1 (en) * | 1998-12-28 | 2001-01-10 | Sapporo Breweries Ltd. | Method of counting microorganisms and device for accomplishing the counting |
| US20040171137A1 (en) * | 2002-01-22 | 2004-09-02 | Powers Linda S. | Method and apparatus for detecting the presence of microbes and determining their physiological status |
| RU2280692C2 (en) * | 1999-12-30 | 2006-07-27 | Налко Кемикал Компани | Method for control of attached and plankton microbiological populations in industrial aqueous system (two variants) |
-
2007
- 2007-04-05 RU RU2007112513/28A patent/RU2362145C2/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1382848A1 (en) * | 1986-09-08 | 1988-03-23 | Всесоюзный научно-исследовательский институт биологического приборостроения | Method of measuring concentration of microorganisms in suspension |
| EP1067199A1 (en) * | 1998-12-28 | 2001-01-10 | Sapporo Breweries Ltd. | Method of counting microorganisms and device for accomplishing the counting |
| RU2280692C2 (en) * | 1999-12-30 | 2006-07-27 | Налко Кемикал Компани | Method for control of attached and plankton microbiological populations in industrial aqueous system (two variants) |
| US20040171137A1 (en) * | 2002-01-22 | 2004-09-02 | Powers Linda S. | Method and apparatus for detecting the presence of microbes and determining their physiological status |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2488097C1 (en) * | 2011-11-22 | 2013-07-20 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Вологодский государственный технический университет" (ВоГТУ) | Method of analysing biological preparations |
| RU2828816C1 (en) * | 2023-12-08 | 2024-10-21 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Пензенский государственный университет" | QUANTUM SENSOR BASED ON QUANTUM DOT WITH IMPURITY COMPLEX (A++e) IN AN EXTERNAL ELECTRIC FIELD |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2007112513A (en) | 2008-10-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Rehse et al. | Laser-induced breakdown spectroscopy (LIBS): an overview of recent progress and future potential for biomedical applications | |
| JP4745959B2 (en) | Automatic characterization and classification of microorganisms | |
| US7409299B2 (en) | Method for identifying components of a mixture via spectral analysis | |
| US6421121B1 (en) | Method and apparatus for rapid particle identification utilizing scattered light histograms | |
| US20250123209A1 (en) | Detecting an analyte in a medium | |
| Singh et al. | Culture-independent Raman spectroscopic identification of bacterial pathogens from clinical samples using deep transfer learning | |
| RU2406078C2 (en) | Method for detection and identification of biological microobjects and their nanocomponents and related device for implementation thereof | |
| EP4314778A1 (en) | Detection of micro-organisms | |
| US12061150B2 (en) | Detection of biological substances | |
| Pistiki et al. | Application of Raman spectroscopy in the hospital environment | |
| RU2362145C2 (en) | Differential diagnosis method for microbes and amino acids | |
| CN118609669B (en) | Mass spectrometry detection method, system, storage medium and electronic device for microbial drug sensitivity | |
| US20220000414A1 (en) | Systems and methods for detecting cognitive diseases and impairments in humans | |
| JP2008536144A (en) | Method and apparatus for spectral analysis of mixtures | |
| US20230121472A1 (en) | Detecting an analyte in a medium | |
| CN208239409U (en) | A kind of animal products quality inspection device | |
| CN111060476A (en) | Near-infrared spectrum system for detecting bacterial infection of wound surface or LB culture solution and detection method thereof | |
| Mets | Measurement theory, nomological machine and measurement uncertainties (in classical physics) | |
| CN119355052B (en) | Real-time in-situ on-line monitoring method and device for microorganisms or enzymes | |
| CN117783025B (en) | Multi-wavelength multi-angle three-dimensional spectrum detection method and device for bacterial microorganisms | |
| Kwamboka | Label-free Raman Spectrometric Detection and Differentiation Between Bacteria Staphylococcus Aureus and Neisseria Gonorrhoeae | |
| US20240287436A1 (en) | Raman spectroscopy method and system for monitoring invasive species in algal bioreactors | |
| JP4644383B2 (en) | Method and apparatus for measuring surface distribution of protein secondary structure | |
| WO2021106156A1 (en) | Method and device for predicting growth of microorganism | |
| RU2321855C1 (en) | Method for assay of microorganism sensitivity to antibacterial preparations |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE Effective date: 20120216 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20150406 |