RU2352580C1 - Пептид, обладающий антифунгальной активностью - Google Patents
Пептид, обладающий антифунгальной активностью Download PDFInfo
- Publication number
- RU2352580C1 RU2352580C1 RU2007132639/13A RU2007132639A RU2352580C1 RU 2352580 C1 RU2352580 C1 RU 2352580C1 RU 2007132639/13 A RU2007132639/13 A RU 2007132639/13A RU 2007132639 A RU2007132639 A RU 2007132639A RU 2352580 C1 RU2352580 C1 RU 2352580C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- gly
- peptide
- cys
- antifungal activity
- tyr
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 40
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 title claims abstract description 12
- 241000190150 Bipolaris sorokiniana Species 0.000 claims abstract description 14
- 241000584609 Alternaria consortialis Species 0.000 claims abstract description 5
- 241000223194 Fusarium culmorum Species 0.000 claims abstract description 5
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 6
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 abstract description 13
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 240000006694 Stellaria media Species 0.000 abstract description 2
- 241000258712 Runaria Species 0.000 abstract 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 abstract 1
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 11
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 7
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 229940097012 bacillus thuringiensis Drugs 0.000 description 4
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 4
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000218922 Magnoliophyta Species 0.000 description 3
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFDVPJUYSDEJTH-UHFFFAOYSA-N 4-ethenylpyridine Chemical compound C=CC1=CC=NC=C1 KFDVPJUYSDEJTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 2
- 240000001592 Amaranthus caudatus Species 0.000 description 2
- 235000009328 Amaranthus caudatus Nutrition 0.000 description 2
- 244000237956 Amaranthus retroflexus Species 0.000 description 2
- 235000013479 Amaranthus retroflexus Nutrition 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 2
- 235000012735 amaranth Nutrition 0.000 description 2
- 239000004178 amaranth Substances 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 description 2
- 244000053095 fungal pathogen Species 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004476 plant protection product Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 101710174470 Antimicrobial peptide Ar-AMP Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000219321 Caryophyllaceae Species 0.000 description 1
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 241000131095 Oniscidea Species 0.000 description 1
- IHPVFYLOGNNZLA-UHFFFAOYSA-N Phytoalexin Natural products COC1=CC=CC=C1C1OC(C=C2C(OCO2)=C2OC)=C2C(=O)C1 IHPVFYLOGNNZLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000228453 Pyrenophora Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 244000223014 Syzygium aromaticum Species 0.000 description 1
- 235000016639 Syzygium aromaticum Nutrition 0.000 description 1
- 241000726445 Viroids Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000036579 abiotic stress Effects 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000012272 crop production Methods 0.000 description 1
- WISCONQAEAWCKO-UHFFFAOYSA-N cyclohexa-2,4-diene-1-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1CC=CC=C1 WISCONQAEAWCKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000001408 fungistatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 1
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000280 phytoalexin Substances 0.000 description 1
- 150000001857 phytoalexin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 244000000003 plant pathogen Species 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- QHGVXILFMXYDRS-UHFFFAOYSA-N pyraclofos Chemical compound C1=C(OP(=O)(OCC)SCCC)C=NN1C1=CC=C(Cl)C=C1 QHGVXILFMXYDRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000011514 reflex Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006273 synthetic pesticide Substances 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биохимии и может быть использовано в сельском хозяйстве. Из семян звездчатки средней (Stellaria media (L.) Vill.) выделен пептид, обладающий антифунгальной активностью против фитопатогенов Alternaria consortiale, Fusarium culmorum, Helminthosporium sativum (syn. Bipolaris sorokiniana, Drechslera sorokiniana), Thielatiopsis basicola. Применение изобретения позволяет расширить ассортимент пептидов растительного происхождения, обладающих антифунгальной активностью. 1 табл., 3 ил.
Description
Изобретение относится к биохимии, а именно к биологически активным пептидам, обладающим антифунгальным действием, которые могут найти применение в биотехнологии.
Ущерб, наносимый мировому сельскому хозяйству со стороны патогенов культурных растений (грибов, бактерий, вирусов и вироидов) и насекомых-вредителей (две главные причины ущерба), оценивается трлн рублей ежегодно. Потери нередко достигают 45% урожая. Современные методы, применяемые с целью снижения убытков, в основном сводятся к использованию синтетических пестицидов, многие из которых являются экологически агрессивными веществами. Использование химических средств защиты растений представляет значительную опасность для окружающей среды, биологические средства защиты растений являются более безопасными. Внедрение инсектицидов нового поколения позволило улучшить ситуацию лишь на 5-10% [Oerke Е.С., Dehne H.W., Schönbeck F., Weber A. Crop Production and Crop Protection: Estimated Losses in Major Food and Cash Crops. - 1994. - Elsevier, Amsterdam].
Применение методов генной инженерии для трансформации растений открывает новые возможности создания культур, обладающих широкой устойчивостью к патогенам, вредителям, а также абиотическому стрессу (засухе, засоленности почвы и др.). Впервые работы по получению резистентных сортов сельскохозяйственных культур с использованием технологий рекомбинантных ДНК были выполнены около 20 лет назад [Andrews R.E., Faust R.M., Wabiko H., Raymond K.C., Bulla L.A. The biotechnology of Bacillus thuringiensis. // Crit. Rev. Biotech. - 1987. - Vol.6. - P.163-232. Vaeck M., Reynaerts A., Höfte H., Jansens S., De Beuckeleer M., Dean C., Zabeau M., Van Montagu M., Leemans J. Transgenic plants protected from insect attack. // Nature - 1987. - Vol.328. - P.33-37]. С использованием гена инсектицидного белка бактерии Bacillus thuringiensis были получены трансгенные растения табака, устойчивые по отношению к паразитическим личинкам бабочки Manducta sexta. С тех пор, по крайней мере, 10 генов энтомотоксинов из Bacillus thuringiensis были перенесены и экспрессированы как минимум в 26 видах растений, приобретших устойчивость к некоторым вредителям [Schuler Т.Н., Poppy G.M., Kerry B.R., Denholm I. Insect-resistant transgenic plants. // Trends Biotech. - 1998. - Vol.16. - P.168-175]. Значительная часть мирового урожая приходится сегодня на долю Bt-трансформированных продуктов (информация взята с официального сайта Департамента сельского хозяйства США: www.aphis.usda.gov). Тем не менее до сих пор не решен вопрос о безопасности Bt-содержащих продуктов для человека, не совсем ясны экологические последствия глобального распространения трансгенных растений, содержащих гены энтомотоксинов Bacillus thuringiensis [Vazquez-Padron R.I., Moreno-Fierros L., Neri-Bazan L., de la Riva G.A., Lopez-Revilla R. Intragastric and intraperitoneal administration of Cry1Ac protoxin from Bacillus thuringiensis induces systemic and mucosal antibody responses in mice. // Life Sci. - 1999. - Vol.64. - P.1897-1912]. Кроме того, видимое нарушение межвидового барьера получает отрицательный отклик в современном обществе. На рынке практически не представлены другие генмодифицированные сорта с повышенной устойчивостью. Более того инженерия устойчивости к заболеваниям оказалась более сложной задачей, нежели повышение сопротивляемости насекомым.
Согласно современным представлениям наиболее перспективными подходами к получению устойчивых сортов являются те, что направлены на усиление собственных защитных свойств растительного организма. К соединениям, продуцируемым растениями для защиты от патогенов, относятся так называемые фитоалексины и фитоантисипины - вещества различной химической природы, а также некоторые белки и пептиды. Перспективным является получение устойчивых сортов с измененной экспрессией собственных защитных генов или же перенесение генов из одного растения в другое, например из дикорастущего в культурное, поскольку известно, что в ходе селекции и отбора сельскохозяйственные растения, приобретая одни полезные признаки, теряли другие. Наибольший интерес вызывают полипептидные соединения, обладающие защитными свойствами, ввиду возможности их прямого использования для получения трансгенных растений [Carlini C.R., Grossi-de-Sā M.F. Plant toxic proteins with insecticidal properties. A review on their potentialities as bioinsecticides. // Toxicon - 2002. - Vol.40. - P.1515-1539].
По структуре и антифунгальным свойствам к заявляемому пептиду наиболее близок пептид Ar-АМР из семян амаранта Amaranthus retroflexus [Lipkin A., Anisimova V., Nikonorova A., Babakov A., Krause E., Bienert M., Grishin E., Egorov T. An antimicrobial peptide Ar-АМР from amaranth (Amaranthus retroflexus L.) seeds. // Phytochemistry. - 2005. - Vol.66. - P.2426-2431]. Вещество относится к обширному семейству цистеин-богатых хитин-связывающих пептидов, ингибирует рост некоторых патогенных грибов в концентрациях 3,5-30 мкМ.
Изобретение решает задачу расширения ассортимента пептидов растительного происхождения, обладающих антифунгальной активностью.
Поставленная задача решается за счет структуры нового пептида Sm-AMP-1.1a, имеющего следующую аминокислотную последовательность:
H2N-Serl-Gly2-Proз-Asn4-Gly5-Gln6-Cys7-Gly8-Pro9-Gly10-Trpll-Glyl2-Gly13-Cysl4-Argl5-Glyl6-Glyl7-Leul8-Cysl9-Cys20-Ser21-Gln22-Tyr23-Gly24-Tyr25-Cys26-Gly27-Ser28-Gly29-Pro30-Lys31-Tyr32-Cys33-Ala34-His35-OH
Заявляемый пептид проявляет выраженную антифунгальную активность в отношении следующих грибов-патогенов растений: Alternaria consortiale, Fusarium culmorum, Helminthosporium sativum (syn. Bipolaris sorokiniana, Drechslera sorokiniana), Thielatiopsis basicola. Для полного ингибирования роста перечисленных грибов in vitro необходимы микромолярные концентрации пептида. Техническим результатом предлагаемого изобретения является высокая антифунгальная активность заявляемого пептида.
Пептид Sm-AMP-1.1a состоит из 35 аминокислотных остатков и может быть получен химическим синтезом или биотехнологически.
Пептид Sm-AMP-1.1a получают из природного источника - семян сорного растения звездчатки средней, или мокрицы Stellaria media (L.) Vill., которая относится к семейству гвоздичные Caryophyllaceae, классу двудольные Dicotyledones (Magnoliopsida), отделу покрытосеменные или цветковые растения Magnoliophyta (Angiospermae).
Изобретение иллюстрируют следующие примеры.
Пример 1.
Выделение пептида Sm-AMP-1.1a
Семяна звездчатки измельчают в кофейной мельнице и проводят экстракцию 10-ю объемами 10%-ной (v/v) уксусной кислоты при комнатной температуре и перемешивании в течение 1 ч. Суспензию цетрифугируют при 22000 g в течение 15 мин при комнатной температуре, осадок отбрасывают. Надосадочную жидкость далее обессоливают с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке Aquapore RP-300 C8 (10×30 мм, размер пор 300 Å, диаметр частиц 7,5 мкм; Applied Biosystems, США). Используют следующие растворы: А - 0,1%-ная (v/v) трифторуксусная кислота в воде, Б - 80%-ный (v/v) ацетонитрил в 0,1%-ной трифторуксусной кислоте. Колонку промывают 5-ю объемами раствора Б с последующим уравновешиванием 5-ю объемами раствора А со скоростью элюции 1,5 мл/мин. Детекцию осуществляют по оптическому поглощению элюата при 214 нм. После нанесения кислотного экстракта на колонку ее промывают раствором А до тех пор, пока уровень поглощения элюата не приблизится к исходному. Пептиды и белки десорбируют раствором Б, элюат упаривают на водоструйном насосе для удаления ацетонитрила, затем лиофилизуют.
Полученный сухой остаток из 10 г исходного сырья растворяют в 4 мл раствора В (10 мМ Трис-HCl, рН 7,2) и разделяют с помощью аффинной хроматографии на колонке размером 25×40 мм, заполненной носителем Heparin Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare, США) и предварительно уравновешенной буферным раствором В. После нанесения образца и вымывания несорбировавшихся веществ пептиды и белки элюируют сначала 100-мМ NaCl в буфере В (фракция I), а затем 500-мМ NaCl в буфере В (фракция II) со скоростью 1 мл/мин. Детекцию осуществляют по оптическому поглощению элюата при 280 нм (фиг.1). Полученные фракции обессоливают и высушивают, как описано выше, проводят тестирование их биологической активности.
Фракцию I растворяют в 1 мл раствора Г (5%-ный (v/v) ацетонитрил в 0,05%-ной (v/v) трифторуксусной кислоте) и разделяют с помощью гель-фильтрации на колонке размером 2,5×90 см, заполненной носителем HiPrep Sephacryl S-100 HR (GE Healthcare, США) и предварительно уравновешенной раствором Г. Разделение ведут при скорости элюции 1 мл/мин и комнатной температуре. Детекцию осуществляют по оптическому поглощению при 214 нм (фиг.2). Собирают фракции объемом 10 мл, высушивают, проводят тестирование их биологической активности.
Фракции со временем элюции 240-280 мин (фиг.2), для которых обнаружена антифунгальная активность, объединяют и разделяют с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке Vydac Ci18 (4,6×250 мм, размер пор 300 Å, диаметр частиц 5 мкм; The Nest Group, Inc., США). Фракционирование проводят в линейном градиенте ацетонитрила: 5-40% раствора Б за 60 мин при скорости элюции 0,7 мл/мин и температуре 40°С. Детекцию осуществляют по оптическому поглощению при 214 нм (фиг.3), проводят тестирование полученных фракций. Пептид Sm-AMP-1.1a элюируется со временем удерживания 41 мин. Проводят дополнительную стадию очистки в тех же условиях. В результате получают препарат искомого пептида с содержанием примесей менее 3%, что подтверждается хроматографией на аналитической колонке Luna C18 (1×150 мм, размер пор 100 Å, диаметр частиц 3 мкм, Phenomenex, США) в линейном градиенте концентрации ацетонитрила: 5-40% раствора Б за 60 мин при скорости элюции 50 мкл/мин, детекцию осуществляют по оптическому поглощению при 210 нм.
Пример 2.
Установление аминокислотной последовательности пептида Sm-AMP-1.1a
Для однозначной идентификации остатков цистеина в аминокислотной последовательности пептида проводят восстановление дисульфидных связей и алкилирование свободных тиольных групп. Восстановление и алкилирование осуществляют по модифицированной методике [Thomsen J., Bayne S. Microscale alkylation with 4-vinylpyridine. // J. Protein Chem. - 1988. - Vol.7. - P.295-296]. Пептид (1 нмоль) растворяют в 40 мкл буфера (6 М гуанидин-гидрохлорид и 2 мМ ЭДТА в 0,5 М Трис-HCl, рН 8,5), добавляют 2 мкл водного раствора, содержащего 1 мкмоль 1,4-дитиотреитола, тщательно продувают азотом, перемешивают, осаждают капли и оставляют при 40°С в течение 4 ч. Затем добавляют 2 мкл 50%-ного раствора 4-винилпиридина в 2-пропаноле, пробирку осторожно перемешивают, осаждают капли. Реакцию алкилирования проводят в темноте при комнатной температуре в течение 15 мин. Затем смесь разбавляют в 4 раза 0,1%-ной трифторуксусной кислотой, наносят на колонку Vydac C18 (4,6×250 мм, размер пор 300 Å, диаметр частиц 5 мкм; The Nest Group, Inc., США), предварительно уравновешенную 4%-ным ацетонитрилом в 0,1%-ной трифторуксусной кислоте. Реагенты и побочные продукты реакции отделяют промывкой колонки тем же раствором, пока уровень поглощения элюата не приблизится к исходному, далее хроматографию проводят в условиях, описанных в примере 1 для очистки пептида Sm-AMP-1.1a.
Определение N-концевой аминокислотной последовательности очищенного восстановленного и алкилированного пептида Sm-AMP-1.1a проводят методом ступенчатой деградации по Эдману на автоматическом секвенаторе Precise 492 (Applied Biosystems, США). В результате устанавливают полную аминокислотную последовательность Sm-AMP-1.1a, состоящую из 35 аминокислотных остатков:
H2N-Serl-Gly2-Pro3-Asn4-Gly5-Gln6-Cys7-Gly8-Pro9-Gly10-Trpll-Glyl2-Glyl3-Cysl4-Argl5-Glyl6-Glyl7-Leu18-Cysl9-Cys20-Ser21-Gln22-Tyr23-Gly24-Tyr25-Cys26-Gly27-Ser28-Gly29-Pro30-Lys31-Tyr32-Cys33-Ala34-His35
Пример 3.
Определение относительной молекулярной массы и числа свободных и дисульфидсвязанных остатков цистеина в пептиде Sm-AMP-1.1a
Полученную аминокислотную последовательность, а также индивидуальность очищенного пептида подтверждают масс-спектрометрическим анализом. Масс-спектры получают на MALDI-времяпролетном масс-спектрометре ultraflex II TOF/TOF (Bruker Daltonik, Германия), с идентификацией положительных ионов в рефлекторном режиме. В качестве матрицы используют дигидробензойную кислоту (10 мг/мл) в 50%-ном (v/v) ацетонитриле, содержащем 0,1%-ную (v/v) трифторуксусную кислоту. Для калибровки прибора используют стандартную смесь пептидов с диапазоном молекулярных масс 700-3500 Да (Sigma, США).
Измеренная моноизотопная молекулярная масса природного пептида Sm-AMP-1.1a составляет 3460,20 Да. Расчетная масса пептида со свободными тиольными группами у остатков цистеина составляет 3466,36 Да, т.е. отличается от измеренной на 6,16 Да. Расчетная масса пептида при условии образования трех дисульфидных связей составляет 3460,31 Да, т.е. отличается от измеренной на 0,11 Да. Таким образом, пептид Sm-AMP-1.1a не содержит свободных тиольных групп, а все 6 остатков цистеина вовлечены в образование 3 внутримолекулярных дисульфидных связей, пептид не содержит каких-либо дополнительных химических модификаций.
Пример 4.
Биологические свойства пептида Sm-AMP-1.1a
Для определения антигрибной активности фракций, полученных в ходе разделения кислотного экстракта семян звездчатки, а также очищенного пептида Sm-AMP-1.1a используют культуры следующих патогенных грибов из класса Deuteromycetes: Alternaria consortiale, Fusarium culmorum, Helminthosporium sativum (syn. Bipolaris sorokiniana, Drechslera sorokiniana), Thielatiopsis basicola.
Для изучения активности выделенные фракции замораживают в жидком азоте и высушивают лиофильно, перерастворяют в воде, снова высушивают. Наконец, сухие вещества растворяют в 50 мкл стерилизованной воды. Концентрацию определяют по спектру поглощения в УФ диапазоне. Активность изучают методом радиальной диффузии на питательной среде с агаром. Грибы выращивают двое суток на чашках Петри со средой, приготовленной из смеси крупяных хлопьев Nestle (20 г/л) и агара, при термостатировании (26°С). Затем вырезают блок гриба диаметром 3 мм и помещают в центр чашки Петри (диаметром 9 см) со средой так, чтобы мицелий прижимался к поверхности чашки, оставляют на 48 ч при той же температуре. Испытываемые образцы (50 мкл) помещают в лунки диаметром и глубиной 3 мм, вырезанные в агаре на расстоянии 3 см от центра чашки. На каждой чашке вырезают 4 лунки, одна из которых служит контролем - сюда помещают 50 мкл чистой стерилизованной воды. Чашки Петри инкубируют в термостате двое суток, после чего оценивают ингибирующую (фунгистатическую) активность образцов на рост гриба (по ширине зоны ингибирования в сравнении с контролем) и влияние их на морфологические изменения в развитии мицелия.
Определение минимальных концентраций пептидов, необходимых для подавления роста грибов (минимальных действующих концентраций), проводят методом двойного разбавления. Результаты для пептида Sm-AMP-1.1a приведены в таблице.
| Таблица Антигрибные свойства пептида Sm-AMP-1.1a |
|
| Гриб | Минимальная действующая концентрация, мкМ |
| Alternaria consortiale | 0,7 |
| Fusarium culmorum | 2,1 |
| Helminthosporium sativum | 0,7 |
| Thielatiopsis basicola | 5,6 |
Claims (1)
- Пептид, обладающий антифунгальной активностью против фитопатогенов Alternaria consortiale, Fusarium culmorum, Helminthosporium sativum (syn. Bipolaris sorokiniana, Drechslera sorokiniana), Thielatiopsis basicola, имеющий следующую аминокислотную последовательность:
H2N-Ser1-Gly2-Pro3-Asn4-Gly5-Gln6-Cys7-Gly8-Pro9-Gly10-Trp11-Gly12-Gly13-Cys14-Arg15-Gly16-Gly17-Leu18-Cys19-Cys20-Ser21-Gln22-Tyr23-Gly24-Tyr25-Cys26-Gly27-Ser28-Gly29-Pro30-Lys31-Tyr32-Cys33-Ala34-His35-OH.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2007132639/13A RU2352580C1 (ru) | 2007-08-30 | 2007-08-30 | Пептид, обладающий антифунгальной активностью |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2007132639/13A RU2352580C1 (ru) | 2007-08-30 | 2007-08-30 | Пептид, обладающий антифунгальной активностью |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2352580C1 true RU2352580C1 (ru) | 2009-04-20 |
Family
ID=41017715
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2007132639/13A RU2352580C1 (ru) | 2007-08-30 | 2007-08-30 | Пептид, обладающий антифунгальной активностью |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2352580C1 (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2457251C1 (ru) * | 2011-01-21 | 2012-07-27 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Биоорганической Химии Им. Академиков М.М. Шемякина И Ю.А. Овчинникова Российской Академии Наук | Гены звездчатки stellaria media, кодирующие защитные пептиды |
| RU2603058C1 (ru) * | 2015-04-29 | 2016-11-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук | Пептид звездчатки stellaria media l., обладающий антифунгальной активностью |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5856127A (en) * | 1996-07-26 | 1999-01-05 | The Research Foundation Of State University Of New York | Antimicrobial peptides |
| RU99115785A (ru) * | 1996-12-13 | 2001-06-27 | Монсанто Компани | Противогрибковый полипептид и способы борьбы с фитопатогенными грибками |
-
2007
- 2007-08-30 RU RU2007132639/13A patent/RU2352580C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5856127A (en) * | 1996-07-26 | 1999-01-05 | The Research Foundation Of State University Of New York | Antimicrobial peptides |
| RU99115785A (ru) * | 1996-12-13 | 2001-06-27 | Монсанто Компани | Противогрибковый полипептид и способы борьбы с фитопатогенными грибками |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ALEKSEY LIPKIN et al., An antimicrobial peptide Ar-AMP from amaranth (Amaranthus retroflexus L.) seeds, Phytochemistry, Volume 66, Issue 20, October 2005, Pages 2426-2431. * |
| BROEKAERTW.F. et al., Antimicrobial peptides from Amaranthus caudatus seeds with sequence homology to the cysteine/glycine-rich domain of chitin-binding proteins. (1992) Biochemistry 31:4308-4314. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2457251C1 (ru) * | 2011-01-21 | 2012-07-27 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Биоорганической Химии Им. Академиков М.М. Шемякина И Ю.А. Овчинникова Российской Академии Наук | Гены звездчатки stellaria media, кодирующие защитные пептиды |
| RU2603058C1 (ru) * | 2015-04-29 | 2016-11-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук | Пептид звездчатки stellaria media l., обладающий антифунгальной активностью |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Lipkin et al. | An antimicrobial peptide Ar-AMP from amaranth (Amaranthus retroflexus L.) seeds | |
| ES2435777T3 (es) | Una nueva proteína, un gen que la codifica, y un método para su uso | |
| UA123480C2 (uk) | Химерний інсектицидний білок, інгібіторний відносно лускокрилих шкідників | |
| Astafieva et al. | A novel cysteine-rich antifungal peptide ToAMP4 from Taraxacum officinale Wigg. flowers | |
| UA125491C2 (uk) | Поліпептид, що має інгібуючу активність щодо комах | |
| Gonçalves et al. | Peroxidase is involved in Pepper yellow mosaic virus resistance in Capsicum baccatum var. pendulum | |
| Odintsova et al. | Plant antimicrobial peptides | |
| Rahul et al. | Defense transcriptome analysis of sugarcane and Colletotrichum falcatum interaction using host suspension cells and pathogen elicitor | |
| ES2225835T3 (es) | Proteinas antimicrobianas. | |
| Frantzeskakis et al. | The plant-dependent life cycle of Thecaphora thlaspeos: a smut fungus adapted to Brassicaceae | |
| RU2352580C1 (ru) | Пептид, обладающий антифунгальной активностью | |
| McLaughlin et al. | Apple bitter rot and Glomerella leaf spot: A comprehensive review of causal species and their biology, fungicide sensitivities, and management strategies | |
| RU2603058C1 (ru) | Пептид звездчатки stellaria media l., обладающий антифунгальной активностью | |
| CN116157018B (zh) | 生物刺激素和生物保护肽及它们在农业中的用途 | |
| JP2008245640A (ja) | 耐虫性タンパク質及び該耐虫性タンパク質をコードする耐虫性遺伝子 | |
| CN104530204A (zh) | 一种油菜抗菌肽BnPRP1及其应用 | |
| RU2380374C1 (ru) | Пептид, обладающий антимикробной активностью | |
| Hossain et al. | Inhibition of conidial growth of Venturia inaequalis by the extracellular protein fraction from the antagonistic bacterium Pseudomonas fluorescens Bk3 | |
| Mohamed et al. | Molecular Characterization, Heterologous Expression and Antimicrobial Activity of Phaseolus vulgaris L. Defensin Peptide (Pv-Def) against various Human MDR Pathogens | |
| US10597430B2 (en) | Chimeric gene for heterologous expression which encodes for peptides with antimicrobial activity | |
| RU2531505C1 (ru) | ГЕН ЗВЕЗДЧАТКИ Stellaria media, КОДИРУЮЩИЙ АНТИМИКРОБНЫЙ ПЕПТИД Sm-AMP-X | |
| Kumar et al. | Biotechnological Approaches for Bacterial Disease Management in Solanaceous Vegetable Crops | |
| GOPISETTY | MOLECULAR CHARACTERIZATION OF SESAME PHYLLODY PHYTOPLASMA AND ITS EPIDEMIOLOGY IN ANDHRA PRADESH | |
| Carrégalo-Ríos et al. | Early seed priming with closely related Bacillus strains induces divergent physiological and defense responses in melon | |
| Noreña-Ramírez et al. | Assessment of Phaseolus vulgaris L and Vigna unguiculata (L.) Walp leaves for antifungal metabolites against two bean fungal pathogens Colletotricum lindemuthianum and Phaeoisariopsis griseola |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC4A | Invention patent assignment |
Effective date: 20100416 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20120831 |