RU2270023C2 - Способ экстракции и очистки протеогликана хрящевого типа (варианты) - Google Patents
Способ экстракции и очистки протеогликана хрящевого типа (варианты) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2270023C2 RU2270023C2 RU2002104499/13A RU2002104499A RU2270023C2 RU 2270023 C2 RU2270023 C2 RU 2270023C2 RU 2002104499/13 A RU2002104499/13 A RU 2002104499/13A RU 2002104499 A RU2002104499 A RU 2002104499A RU 2270023 C2 RU2270023 C2 RU 2270023C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- proteoglycan
- cartilage
- acetic acid
- precipitate
- crude
- Prior art date
Links
- 238000000605 extraction Methods 0.000 title claims description 19
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims description 19
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 63
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 32
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 14
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims abstract description 14
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims abstract description 13
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 claims abstract description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 11
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 9
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 claims abstract description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 7
- -1 sodium chloride saturated ethanol Chemical class 0.000 claims description 4
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 4
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 abstract 1
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 68
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 68
- 210000002184 nasal cartilage Anatomy 0.000 description 21
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 18
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 18
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 13
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 8
- SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-2-(trifluoromethoxy)pyridine Chemical compound FC(F)(F)OC1=CC=C(Br)C=N1 SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 6
- 229920001287 Chondroitin sulfate Polymers 0.000 description 6
- 229940059329 chondroitin sulfate Drugs 0.000 description 6
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 6
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 5
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 5
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 5
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 5
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 5
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 5
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000277338 Oncorhynchus kisutch Species 0.000 description 4
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 4
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 4
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 4
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 4
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N urea group Chemical group NC(=O)N XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 2-Amino-2-Deoxy-Hexose Chemical compound NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920000045 Dermatan sulfate Polymers 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 3
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 3
- AVJBPWGFOQAPRH-FWMKGIEWSA-L dermatan sulfate Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H](OS([O-])(=O)=O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](C([O-])=O)O1 AVJBPWGFOQAPRH-FWMKGIEWSA-L 0.000 description 3
- 229940051593 dermatan sulfate Drugs 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 3
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 3
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 3
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- LOHGGLZYTJNUAL-UHFFFAOYSA-M sodium;ethanol;chloride Chemical compound [Na+].[Cl-].CCO LOHGGLZYTJNUAL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- UJOBWOGCFQCDNV-UHFFFAOYSA-N 9H-carbazole Chemical compound C1=CC=C2C3=CC=CC=C3NC2=C1 UJOBWOGCFQCDNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283153 Cetacea Species 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 2
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000000729 antidote Substances 0.000 description 2
- 238000009924 canning Methods 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 2
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 235000021067 refined food Nutrition 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000052 vinegar Substances 0.000 description 2
- 235000021419 vinegar Nutrition 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102000011413 Chondroitinases and Chondroitin Lyases Human genes 0.000 description 1
- 108010023736 Chondroitinases and Chondroitin Lyases Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000202 analgesic effect Effects 0.000 description 1
- 229940035676 analgesics Drugs 0.000 description 1
- 239000000730 antalgic agent Substances 0.000 description 1
- 229940075522 antidotes Drugs 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010411 cooking Methods 0.000 description 1
- 238000005238 degreasing Methods 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 238000009920 food preservation Methods 0.000 description 1
- 235000011194 food seasoning agent Nutrition 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 150000002337 glycosamines Chemical class 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000010808 liquid waste Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000011034 membrane dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 210000001331 nose Anatomy 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000033458 reproduction Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000008400 supply water Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 125000003508 trans-4-hydroxy-L-proline group Chemical group 0.000 description 1
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии. Способ включает использование уксусной кислоты в качестве элюирующего растворителя для хряща. Способ также включает (по второму варианту) дополнительно фильтрацию раствора, содержащего неочищенный протеогликан, для удаления осадка из указанного раствора, центрифугирование раствора, полученного указанной фильтрацией, добавление этанола, насыщенного хлоридом натрия, к надосадочной жидкости, полученной указанным центрифугированием, а затем центрифугирование указанной надосадочной жидкости, к которой был добавлен насыщенный хлоридом натрия этанол для концентрирования указанного неочищенного протеогликана в осадок. По третьему варианту способ включает дополнительно растворение указанного осадка уксусной кислотой и диализ. Способ прост, экологически безопасен, а протеогликан, полученный указанным способом, может применяться перорально. 3 н.п. ф-лы, 3 ил., 2 табл.
Description
Предпосылки создания изобретения
Область, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к новому способу экстракции и очистки протеогликана хрящевого типа.
Описание уровня техники
Одна молекула протеогликана хрящевого типа, известного как конъюгированный углевод, характеризуется тем, что она имеет структуру, показанную на фиг.1, и представляет собой биополимер, имеющий нижеописанные структурные особенности. То есть от нескольких до десяти гликозаминогликановых цепей (далее сокращенно обозначаемых GAG), молекулярная масса каждой из которых составляет от нескольких десятков тысяч до нескольких сотен тысяч, связаны с одной каркасной молекулой белка, имеющей молекулярную массу от нескольких десятков тысяч до нескольких сотен тысяч, и которую называют коровым белком. По своей основной структуре GAG может быть отнесен к нескольким видам, таким как сульфат хондроитина или сульфат дерматана, а в основном, он представляет собой длинноцепочечный гетерокислотный полисахарид, состоящий из повторяющихся структур дисахарида с аминосахаром и уроновой кислотой. В указанной структуре GAG, за исключением гуалуроновой, кислоты связаны с коровым белком и образуют протеогликан.
Обычно протеогликан присутствует почти во всех организмах животных как один из важных компонентов внутриклеточного матрикса, который заполняет пространство между клетками (см. фиг.2) и в котором также присутствуют коллаген и гуалуроновая кислота. И он не только составляет важную часть структуры организма, но также образует физическую среду, окружающую клетки, и регулирует различные клеточные активности, такие как связывание, размножение или дифференцировка. Каждый компонент внеклеточного матрикса или GAG, взятый отдельно, имеет определенные функции, такие как удерживание и доставка воды, противоядия или анальгетика. Если эти компоненты связываются друг с другом и образуют макромолекулярную структуру, где каждый компонент действует в соответствии с другим компонентном, то наблюдается более значительный эффект.
Протеогликан хрящевого типа, который является объектом настоящего изобретения, имеет очень большую молекулярную массу по сравнению с коллагеном, гиалуроновой кислотой или GAG и имеет более сложную структуру. Поэтому даже если протеогликан взят отдельно, он обладает лучшей способностью удерживать и поставлять воду, чем другие компоненты во внеклеточном матриксе, и, кроме того, может обладать и другими функциями в зависимости от организации биологического информационного сигнала его GAG-части.
Между тем, в современном методе экстракции и очистки протеогликана в качестве исходного материала используется хрящ коров или китов, и экстракцию и очистку проводят с помощью сложной процедуры с использованием токсичных или вредных агентов, таких как хлороформ, метанол или гидрохлорид гуанидина. И этот способ не имеет промышленного применения. Протеогликаны некоторых типов продаются как реагенты в очень небольших количествах, и их цена составляет приблизительно десятки миллионов иен за один грамм.
Заявителями настоящего изобретения ранее уже был изобретен новый крупномасштабный упрощенный метод экстракции и очистки протеогликана, который может быть использован в промышленности с использованием носового хряща лосося, и была подана патентная заявка (заявка на патент Японии 11-331375, поданная 22 ноября 1999). Этот метод включает, в частности, процесс измельчения носового хряща лосося, процесс обезжиривания, процесс экстракции растворителем и процесс диализа. Благодаря этому методу, может быть осуществлен способ экстракции и очистки, отличающийся тем, что он является крупномасштабным и недорогостоящим, однако в нем используется не только хлороформ, метанол или гидрохлорид гуанидина, но также и вредный агент, такой как агент, препятствующий разложению ферментного белка, а поэтому возможность его использования в медицине в качестве материала для введения в организм человека или в качестве диетической и пищевой добавки связана с определенными трудностями, и такое применение ограничено нелекарственными химическими средствами или косметическими средствами. Кроме того, поскольку рыночная цена вышеупомянутых химических агентов является относительно высокой, то снижение затрат на экстракцию и очистку ограничено.
При этом поскольку авторами настоящей заявки был предложен указанный недорогостоящий протеогликан, то возникает все большее стремление изготовить протеогликансодержащие продукты, которые могли бы быть использованы не только в косметической промышленности, но также и в пищевой промышленности, в промышленности по изготовлению диетических продуктов или пищевых добавок и в медицине. Однако для основательного применения протеогликана в промышленности по изготовлению пищевых продуктов, в промышленности по изготовлению диетических или пищевых добавок или в медицине особое внимание необходимо уделить методу очистки протеогликана. В стандартном методе экстракции и очистки протеогликана обычно используется гидрохлоридная соль гуанидина. Однако для нового применения протеогликана крайне необходимо избегать использования указанного гидрохлорида гуанидина, а также токсичных или вредных агентов, таких как хлороформ, метанол или агент, препятствующий разложению белкового фермента. Кроме того, разработка более простого и менее дорогостоящего метода экстракции и очистки протеогликана остается крайне актуальной.
Авторами настоящего изобретения было проведено интенсивное исследование по разработке способа экстракции и очистки протеогликана, осуществление которого не требует использования токсических или вредных агентов и который, кроме того, отличается тем, что он является более простым и недорогостоящим, и на основании этого исследования было разработано настоящее изобретение. Поэтому целью настоящего изобретения является разработка более простого и менее дорогостоящего способа экстракции и очистки протеогликана хрящевого типа.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение относится к способу экстракции неочищенного протеогликана, отличающемуся тем, что в качестве элюирующего растворителя для хряща используется уксусная кислота. Настоящее изобретение также относится к способу очистки неочищенного протеогликана, включающему экстракцию неочищенного протеогликана с использованием уксусной кислоты в качестве элюирующего растворителя для хряща; фильтрацию раствора, содержащего неочищенный протеогликан для удаления осадка из указанного раствора; центрифугирование раствора, полученного такой фильтрацией; добавление насыщенного хлоридом натрия этанола к надосадочной жидкости, полученной указанным центрифугированием; а затем центрифугирование указанной надосадочной жидкости, к которой был добавлен указанный насыщенный хлоридом натрия этанол, для концентрирования указанного неочищенного протеогликана в осадок. Настоящее изобретение, кроме того, относится к улучшенному способу очистки неочищенного протеогликана, включающему экстракцию неочищенного протеогликана с использованием уксусной кислоты в качестве элюирующего растворителя для хряща; фильтрацию раствора, содержащего неочищенный протеогликан для удаления осадка из указанного раствора; центрифугирование раствора, полученного такой фильтрацией; добавление насыщенного хлоридом натрия этанола к надосадочной жидкости, полученной указанным центрифугированием; центрифугирование указанной надосадочной жидкости, к которой был добавлен указанный насыщенный хлоридом натрия этанол, для концентрирования указанного неочищенного протеогликана в осадок; растворение указанного осадка, содержащего неочищенный протеогликан, с использованием уксусной кислоты в качестве элюирующего растворителя для указанного неочищенного протеогликана; а затем, диализ.
Таким образом, важным аспектом настоящего изобретения является использование уксусной кислоты, хлорида натрия и немодифицированного этанола во всех способах экстракции и очистки протеогликана вместо токсичных или вредных агентов, таких как хлороформ, метанол или агент, препятствующий разложению ферментного белка. Эти вышеупомянутые агенты, такие как уксусная кислота, хлорид натрия и немодифицированный этанол, являются агентами, используемыми в пищевых продуктах, подвергающихся обработке. Для осуществления более простого способа экстракции и очистки можно исключить стадию замещения мочевиной и стадию разделения и очистки методом с использованием DEAE-Sephacel, которые были использованы в способе, описанном в вышеупомянутой патентной заявке (JPA 11-331375).
Краткое описание чертежей
На фиг.1 представлена структурная модель протеогликана, на фиг.2 схематически представлен внеклеточный матрикс, а на фиг.3 представлен график, иллюстрирующий изменение в процессе элюирования неочищенного протеогликана от времени.
Цифры, указанные на чертежах, обозначают: 1: коровый белок, 2: гликозаминогликановая цепь, 3: гиалуроновая кислота, 4: коллаген, 5: протеогликан.
Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения
Настоящее изобретение далее более подробно проиллюстрировано следующим описанием.
В качестве исходного материала протеогликана настоящего изобретения может быть использован хрящ коровы или кита, однако с точки зрения доступности и цены, желательно использовать носовой хрящ лосося. Особенно желательно использовать части головы кижуча, являющиеся отходами процесса производства пищевых продуктов, например, рыбоконсервной промышленности, в которой используется кижуч, вылавливаемый рыбаками у берегов, принадлежащих префектуре Аомори в Японии.
Уксусной кислотой, используемой в настоящем изобретении, может быть уксусная кислота любого типа, например, уксусная кислота, применяемая для приготовления пищи или в промышленности, и она может быть выбрана по усмотрению специалиста в зависимости от целей использования протеогликана. В соответствии с упомянутыми ниже результатами тестов, желаемая концентрация уксусной кислоты в качестве элюирующего растворителя составляет примерно 4%, однако эта концентрация не ограничивается указанным значением.
Пример
В качестве исходного материала используют части головы кижуча, являющиеся отходами процесса обработки пищевых продуктов в рыбоконсервной промышленности, где используется кижуч, вылавливаемый рыбаками у берегов, принадлежащих префектуре Аомори в Японии, и указанные части головы помещают на временное хранение при температуре -30°С.
Вышеупомянутый материал размораживают при 4°С в течение 20 часов и от головной части кухонным ножом отрезают носовую часть хряща и получают исходный материал. У носового хряща лосося щипчиками удаляют твердый жир и промывают физиологическим солевым раствором. Затем этот хрящ мелко измельчают вручную на мясорубке и получают фарш из носового хряща лосося.
Порцию указанного фарша вымачивают при 4°С в уксусе, применяемом в пивоваренной промышленности и разбавленном до 10 масс./об. (используемом путем разведения до концентрации 4%, которая аналогична концентрации уксусной кислоты в уксусе, далее сокращенно называемом 4% уксусно-кислотным растворителем), в течение 0, 6, 12, 24, 48, 72, 120 и 168 часов, а затем перемешивают. Изменение состояния элюирования неочищенного протеогликана наблюдают в зависимости от времени по количеству уроновой кислоты, которое определяют методом с использованием смеси карбазола и серной кислоты. Полученные результаты показаны на фиг.3. Как ясно видно из фиг.3, количество элюированного протеогликана заметно возрастает в течение первых 24 часов, а по прошествии 24 часов увеличение элюированного количества становится незначительным. Исходя из полученных результатов очевидно, что наиболее эффективное время элюирования неочищенного протеогликана 4%-ной уксусной кислотой в качестве растворителя составляет 48 часов.
Исходя из вышеупомянутых результатов, 50 г фарша из носового хряща лосося вымачивают в 4% уксусно-кислотном растворителе при 4°С в течение 48 часов, перемешивают для элюирования носового хряща и получают неочищенный протеогликан (п.1 формулы изобретения).
Затем элюированный раствор фильтруют через сито из нержавеющей стали (150 мкм) для удаления неэлюированного вещества. После этого, раствор, содержащий неочищенный протеогликан, разделяют центрифугированием (4°С, 1000 об./мин, в течение 20 минут). К полученной надосадочной жидкости добавляют трехкратное количество этанола, насыщенного хлоридом натрия, и снова разделяют на центрифуге (4°С, 1000 об./мин, в течение 20 минут), а затем получают концентрированный осадок, содержащий неочищенный протеогликан (п.2 настоящего изобретения).
Полученный осадок, содержащий неочищенный протеогликан, снова растворяют в 4% уксусно-кислотном растворителе, а затем раствор достаточно диализуют против воды в трубке для мембранного диализа из сложного эфира целлюлозы с отсечкой молекулярной массы 1000 кДа, и получают жидкий протеогликан с высокой степенью очистки (п.3 формулы настоящего изобретения).
Полученный жидкий протеогликан желательно сушить вымораживанием и хранить в порошкообразной форме. В этом примере диализованный внутренний раствор подвергают сушке вымораживанием и получают 240 мг образца порошкообразного протеогликана.
Химические свойства образца протеогликана, полученного, как указано в п.3 формулы изобретения, определяют методом, описанным ниже.
Результаты химических анализов представлены в таблице 1.
| Таблица 1. Химические анализы образца протеогликана, выделенного из носового хряща лосося |
|||
| Молярное отношение | Белок (% масс.) | ||
| Гексозамин | Уроновая кислота | Сульфат | |
| 1,00 | 0,99a | 0,67a | 6,99 |
| a указывает на молярное отношение, если количество гексозамина принято равным 1,00. | |||
В таблице 1 количества уроновой кислоты и сульфата показаны в виде молярного соотношения, если количество гексозамина принято равным 1,00, и составляют соответственно 0,99 и 0,67. Понятно, что эти три компонента присутствуют почти в равных количествах. Кроме того, количество корового белка составляет 6,99% (масс./масс.), а его отношение к количеству уроновой кислоты (коровый белок/уроновая кислота) составляет 0,23 (масс./масс.). Это численное значение показывает один из показателей для определения чистоты протеогликана и близок к значению 0,2, которое является теоретическим.
Был проанализирован тип аминокислот, составляющих белок в данном образце, и результаты этого анализа показали, что количество глицина, серина и глутаминовой кислоты являются значительно более высокими. А именно, во всех 1000 аминокислотных остатках общее число остатков глицина, серина и глутаминовой кислоты составляет 386, а число гидроксипролиновых остатков равно 2. Гидроксипролин представляет собой типичную аминокислоту в коллагеновом белке, и примесь коллагена в этом протеогликане носового хряща лосося может быть обнаружена, но это количество слишком мало и не может рассматриваться как значимое. Поэтому можно утверждать, что степень чистоты полученного протеогликана носового хряща лосося является очень высокой.
Затем, для получения данных о молекулярном размере протеогликана носового хряща лосося, осуществляют высокоэффективную жидкостную хроматографию на колонке SB805HQ (8×300 мм), и положение элюции подтверждают с помощью УФ-поглощения при 215 нм. Этот результат сравнивают с результатом, полученным для протеогликана коровьего носового хряща, который является коммерчески доступным в качестве реагента. В случае протеогликана носового хряща лосося, положение элюции (Kav), определяемое как симметричный пик с SВ805НQ-колонки, составляет 0,28, а в случае протеогликана коровьего носового хряща, этот пик составляет 0,17. Эти результаты показывают, что молекулярный размер протеогликана носового хряща лосося меньше, чем молекулярный размер протеогликана коровьего носового хряща.
Кроме того, часть корового белка протеогликана носового хряща лосося расщепляют проназой, а остальную часть образца GAG анализируют с помощью электрофореза на пленке, изготовленной из ацетата целлюлозы вместе с сульфатом хондроитина (Ch6S), сульфатом дерматана (DS) и гиалуроновой кислотой (НА), которые представляют собой стандартные образцы. В соответствии с полученными результатами, одна полоса соответствует сульфату хондроитина (Ch6S), который является стандартным образцом, и поэтому, очевидно, что большую часть GAG протеогликана носового хряща лосося составляет сульфат хондроитина.
Также были проведены исследования изомера указанного дисахаридного звена. После расщепления протеогликана проназой, а затем хондроитиназой АВС, полученный ненасыщенный дисахарид анализируют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографией (Полиамин-II). Полученные результаты показаны в таблице 2. Из данных таблицы 2 очевидно, что большую часть GAG составляет моносульфированное дисахаридное звено.
| Таблица 2. Анализ на ненасыщенные дисахариды | ||||
| Δ Di-0S | Δ Di-6S | Δ Di-4S | Δ Di-diSD | Δ Di-triS |
| 15,1 | 59,4 | 25,1 | 0,3 | 0,1 |
Как было упомянуто выше, тот факт, что протеогликан, исходным материалом которого является носовой хрящ лосося, получают лишь с использованием перечисленных агентов, используемых в качестве добавок для пищевых продуктов [см.например, "Explanation of Analytical Method of Additives in Foods, part III, Food Additives Except Chemically Synthetic Compound" edited by Akio Tanimura et al (1992, Kodansha)] или агентов, используемых в качестве материала для агента консервирования пищи или для приправ ["Encyclopedia of Safety Supply of Food" edited by Kageaki Kuriihara et al (1995, Publishing Center of Sangyo Chosakai)], может рассматриваться как изобретение, имеющее мировое значение. Кроме того, установление того факта, что, благодаря настоящему изобретению, можно избежать проведения стадий, осуществление которых требует много времени и является трудоемким, таких как замещение мочевиной или разделение и очистка методом с использованием DEAE-Sephacel, может рассматриваться как важнейшее изобретение. Таким образом, благодаря настоящему изобретению, может быть осуществлена поставленная цель, а именно разработка более простого и недорогостоящего способа экстракции и очистки протеогликана.
В соответствии с вышеупомянутыми результатами, протеогликан носового хряща лосося, полученный способом настоящего изобретения, может быть введен перорально, и его чистота является почти такой же, как и чистота протеогликана, полученного стандартным методом.
Эффект настоящего изобретения
В настоящее время, гиалуроновая кислота может быть продуцирована бактериями безопасным способом и в больших количествах и используется в медицине. При этом известно, что протеогликан обладает превосходной способностью удерживать и доставлять воду, действует как противоядие и как анальгетик и, кроме того, предполагается, что он обладает другими функциями, обусловленными GAG-частью. Однако протеогликан, полученный стандартным методом экстракции и очистки, не может быть введен человеку, и его ценность для организма человека не может быть проверена. Более того, попытка выделения конъюгированного углевода, т.е., протеогликана, происходящего из носового хряща лосося, не была предпринята до тех пор, пока не был разработан и применен указанный метод. Однако, благодаря настоящему изобретению, появилась возможность экстракции и очистки протеогликана, который обладает превосходными безопасными свойствами и может быть получен в больших количествах. Следовательно, необходимость в получении протеогликана становится все более актуальной и ожидается, что он будет иметь более широкое применение.
Кроме того, поскольку органический растворитель, такой как хлороформ, метанол или ацетон, применяемый для удаления твердого жира из головной части лосося, не используется, то переработки жидких отходов больше не требуется, а следовательно, и решаются проблемы, связанные с загрязнением окружающей среды. Способ настоящего изобретения является простым и эффективным, а протеогликан, полученный указанным способом, является безопасным и может быть введен перорально. Благодаря разработке настоящего изобретения становится возможным получение новых продуктов, которые могут применяться в косметике, немедицинской химии и медицине, а также для изготовления лекарственных препаратов, пищевых продуктов, подвергаемых обработке, диетических пищевых добавок и искусственных внутренних органов. Следовательно, настоящее изобретение вносит огромный вклад в область здравоохранения и медицины.
Claims (3)
1. Способ экстракции неочищенного протеогликана, отличающийся тем, что он включает использование уксусной кислоты в качестве элюирующего растворителя для хряща.
2. Способ экстракции неочищенного протеогликана, включающий экстракцию неочищенного протеогликана с использованием уксусной кислоты в качестве элюирующего растворителя для хряща, фильтрацию раствора, содержащего неочищенный протеогликан, для удаления осадка из указанного раствора, центрифугирование раствора, полученного указанной фильтрацией, добавление этанола, насыщенного хлоридом натрия, к надосадочной жидкости, полученной указанным центрифугированием, а затем центрифугирование указанной надосадочной жидкости, к которой был добавлен насыщенный хлоридом натрия этанол для концентрирования указанного неочищенного протеогликана в осадок.
3. Способ дополнительного улучшения очистки неочищенного протеогликана, включающий экстракцию неочищенного протеогликана с использованием уксусной кислоты в качестве элюирующего растворителя для хряща, фильтрацию раствора, содержащего неочищенный протеогликан, для удаления осадка из указанного раствора, центрифугирование раствора, полученного указанной фильтрацией, добавление этанола, насыщенного хлоридом натрия, к надосадочной жидкости, полученной указанным центрифугированием, центрифугирование указанной надосадочной жидкости, к которой был добавлен насыщенный хлоридом натрия этанол для концентрирования указанного неочищенного протеогликана в осадок, растворение указанного осадка, содержащего неочищенный протеогликан, с использованием уксусной кислоты в качестве элюирующего растворителя указанного неочищенного протеогликана, а затем диализ.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2002104499/13A RU2270023C2 (ru) | 2002-02-20 | 2002-02-20 | Способ экстракции и очистки протеогликана хрящевого типа (варианты) |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2002104499/13A RU2270023C2 (ru) | 2002-02-20 | 2002-02-20 | Способ экстракции и очистки протеогликана хрящевого типа (варианты) |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2002104499A RU2002104499A (ru) | 2003-09-20 |
| RU2270023C2 true RU2270023C2 (ru) | 2006-02-20 |
Family
ID=36051150
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2002104499/13A RU2270023C2 (ru) | 2002-02-20 | 2002-02-20 | Способ экстракции и очистки протеогликана хрящевого типа (варианты) |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2270023C2 (ru) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EA010724B1 (ru) * | 2006-06-22 | 2008-10-30 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Сиа Пептайдс" | Средство, нормализующее функции хрящевой ткани, и способ его получения |
| RU2401839C2 (ru) * | 2006-02-14 | 2010-10-20 | Кусиро Индастриал Текнолоджи Сентер | Способ получения протеогликана |
| RU2592850C2 (ru) * | 2011-01-19 | 2016-07-27 | Хиросаки Юниверсити | Способ крупномасштабного получения протеогликана |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0124984A1 (en) * | 1983-03-21 | 1984-11-14 | Arizona Board Of Regents | Marine organism extracts and their preparation |
| US4822607A (en) * | 1976-10-29 | 1989-04-18 | Lescarden Ltd. | Anti-tumor agent and method |
| US5075112A (en) * | 1990-02-12 | 1991-12-24 | Cartilage Technologies Inc. | Method of and dosage unit for inhibiting angiogenesis or vascularization in an animal using shark cartilage |
| RU2156132C2 (ru) * | 1994-04-28 | 2000-09-20 | Ле Лабораториз Аетерна Инк. | Экстракты акульего хряща, обладающие антиангиогенной активностью и оказывающие влияние на регрессию опухоли, способы их получения |
-
2002
- 2002-02-20 RU RU2002104499/13A patent/RU2270023C2/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4822607A (en) * | 1976-10-29 | 1989-04-18 | Lescarden Ltd. | Anti-tumor agent and method |
| EP0124984A1 (en) * | 1983-03-21 | 1984-11-14 | Arizona Board Of Regents | Marine organism extracts and their preparation |
| US5075112A (en) * | 1990-02-12 | 1991-12-24 | Cartilage Technologies Inc. | Method of and dosage unit for inhibiting angiogenesis or vascularization in an animal using shark cartilage |
| RU2156132C2 (ru) * | 1994-04-28 | 2000-09-20 | Ле Лабораториз Аетерна Инк. | Экстракты акульего хряща, обладающие антиангиогенной активностью и оказывающие влияние на регрессию опухоли, способы их получения |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2401839C2 (ru) * | 2006-02-14 | 2010-10-20 | Кусиро Индастриал Текнолоджи Сентер | Способ получения протеогликана |
| EA010724B1 (ru) * | 2006-06-22 | 2008-10-30 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Сиа Пептайдс" | Средство, нормализующее функции хрящевой ткани, и способ его получения |
| RU2592850C2 (ru) * | 2011-01-19 | 2016-07-27 | Хиросаки Юниверсити | Способ крупномасштабного получения протеогликана |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3731150B2 (ja) | 軟骨型プロテオグリカンの精製方法 | |
| CN102690370B (zh) | 一种海洋鱼类鱼骨的综合利用工艺 | |
| RU2592850C2 (ru) | Способ крупномасштабного получения протеогликана | |
| Aidos et al. | Collagen content in farmed Atlantic salmon (Salmo salar L.) | |
| Lalarukh et al. | Innovation of advanced polymers from seafood waste: Applications of chitin and chitosan | |
| Wang et al. | Sulfated glycosaminoglycan-derived oligosaccharides produced from chicken connective tissue promote iron uptake in a human intestinal Caco-2 cell line | |
| FI104974B (fi) | Glykogeenipolysakkaridit | |
| RU2270023C2 (ru) | Способ экстракции и очистки протеогликана хрящевого типа (варианты) | |
| JP2001172296A (ja) | 軟骨型プロテオグリカンの精製方法 | |
| AU593556B2 (en) | High purity hyaluronic acid from synovial fluid | |
| WO2018105919A2 (ko) | 마린 콜라겐을 함유한 석류음료 및 이의 제조방법 | |
| US7002007B2 (en) | Production of high molecular weight hyaluronates | |
| US20110288283A1 (en) | Process for producing glycosaminoglycans | |
| CN115651091A (zh) | 一种高抗凝血海参肠多糖及其制备方法与应用 | |
| CN116120483B (zh) | 一种鱼骨来源的硫酸软骨素c、制备方法及其应用 | |
| CN115232203A (zh) | 一种提取胶原蛋白的方法 | |
| CN1584044A (zh) | 鹿角多肽或龟板多肽的制备方法 | |
| AU2021100407A4 (en) | Mollusc heparin with a mild anticoagulant effect and preparation method and use thereof | |
| CN118620102B (zh) | 酶法-低共熔溶剂偶联提取硫酸软骨素的方法 | |
| CN113528605B (zh) | 一种超声辅助酶解制备单环刺螠内脏抗氧化肽的方法 | |
| KR20030068215A (ko) | 연골형 프로테오글리칸의 정제방법 | |
| Zhang et al. | A comprehensive overview of the composition, isolation, purification, and biological activities of abalone polysaccharides | |
| JP2007224286A (ja) | 生体組織からの多糖類の取得方法 | |
| Potier et al. | An enzymatic approach for producing chitin from snow crab and American lobster seashells | |
| RU2289956C1 (ru) | Способ получения комплексной биологически активной добавки к пище на основе морских гидробионтов (варианты) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20080221 |