RU2265658C2 - Strain of hybrid cells of animal mus musculus l, 9e2, used in preparing monoclonal antibody to west nile virus protein e of strain wnv/leiv-vig99-27889 - Google Patents
Strain of hybrid cells of animal mus musculus l, 9e2, used in preparing monoclonal antibody to west nile virus protein e of strain wnv/leiv-vig99-27889 Download PDFInfo
- Publication number
- RU2265658C2 RU2265658C2 RU2004100930/13A RU2004100930A RU2265658C2 RU 2265658 C2 RU2265658 C2 RU 2265658C2 RU 2004100930/13 A RU2004100930/13 A RU 2004100930/13A RU 2004100930 A RU2004100930 A RU 2004100930A RU 2265658 C2 RU2265658 C2 RU 2265658C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- strain
- wnv
- west nile
- nile virus
- cells
- Prior art date
Links
- 241000710886 West Nile virus Species 0.000 title claims abstract description 42
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 title claims abstract description 16
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 title abstract description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title description 2
- 101710204837 Envelope small membrane protein Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 101710088839 Replication initiation protein Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 19
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 abstract description 13
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 9
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 abstract description 6
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 abstract description 6
- 241001529936 Murinae Species 0.000 abstract description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 abstract description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 description 9
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 6
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 4
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 3
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 3
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N octanoic acid Chemical compound CCCCCCCC(O)=O WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N pristane Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 235000011121 sodium hydroxide Nutrition 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RDEIXVOBVLKYNT-VQBXQJRRSA-N (2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2r,3r,6s)-3-amino-6-(1-aminoethyl)oxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-5-methyl-4-(methylamino)oxane-3,5-diol;(2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2r,3r,6s)-3-amino-6-(aminomethyl)oxan-2-yl]o Chemical compound OS(O)(=O)=O.O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H](CC[C@@H](CN)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N.O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H](CC[C@H](O2)C(C)N)N)[C@@H](N)C[C@H]1N.O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N RDEIXVOBVLKYNT-VQBXQJRRSA-N 0.000 description 1
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 239000005635 Caprylic acid (CAS 124-07-2) Substances 0.000 description 1
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 108010015078 Pregnancy-Associated alpha 2-Macroglobulins Proteins 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 201000006449 West Nile encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 206010057293 West Nile viral infection Diseases 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229960002446 octanoic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000003024 peritoneal macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии и вирусологии и касается получения нового штамма гибридных клеток Mus musculus L. НИИМБ-280 (9E2) - продуцента моноклональных антител к белку Е вируса Западного Нила (ВЗН), которые могут найти применение в медицине, иммунологии и биотехнологии с целью идентификации ВЗН, а также для стандартизации содержания белка Е в иммунодиагностикумах.The invention relates to biotechnology and virology and relates to the production of a new strain of hybrid cells of Mus musculus L. NIIMB-280 (9E2), a producer of monoclonal antibodies to protein E of West Nile virus (WNV), which can be used in medicine, immunology and biotechnology to identify WNV, as well as to standardize the content of protein E in immunodiagnostics.
Известны зарубежные коллекции мышиных моноклональных антител (МКА) к вирусу Западного Нила, продуцируемые штаммами гибридных клеток животных [2-7]. Однако аналоги штаммов гибридных клеток животного Mus musculus - продуцентов моноклональных антител к штаммам вируса Западного Нила, циркулирующим на территории России, неизвестны.Foreign collections of mouse monoclonal antibodies (MABs) to West Nile virus produced by strains of animal hybrid cells are known [2-7]. However, analogues of the strains of hybrid cells of the animal Mus musculus, producers of monoclonal antibodies to West Nile virus strains circulating in Russia, are unknown.
Техническим результатом заявляемого изобретения является получение штамма гибридных клеток Mus musculus L. НИИМБ-280 (9E2), секретирующих МКА к белку Е вируса Западного Нила, (штамм WNV/LEIV-Vlg99-27889), выделенного в Волгоградской области в 1999 году от больного [1]. Продуцируемые МКА можно эффективно использовать для выявления штамма WNV/LEIV-Vlg99-27889 ВЗН, который вызывает заболевания человека на территории России.The technical result of the claimed invention is to obtain a strain of hybrid cells of Mus musculus L. NIIMB-280 (9E2) secreting MAB to protein E of West Nile virus (strain WNV / LEIV-Vlg99-27889) isolated in the Volgograd region in 1999 from a patient [ 1]. The produced MCAs can be effectively used to identify the WNV / LEIV-Vlg99-27889 WNV strain that causes human diseases in Russia.
Указанный технический результат достигается путем слияния клеток мышиной p3-X63/Ag8.653 (NS0/1) миеломы с клетками селезенки мыши BALB/c, иммунизированной инактивированным препаратом ВЗН (штамм WNV/LEIV-Vlg99-27889), который был получен в результате культивирования и очистки вируса [1].The specified technical result is achieved by fusion of murine p3-X63 / Ag8.653 (NS0 / 1) myeloma cells with BALB / c mouse spleen cells immunized with an inactivated WNV preparation (strain WNV / LEIV-Vlg99-27889), which was obtained by culturing and purification of the virus [1].
Заявляемый штамм гибридных клеток Mus musculus L. НИИМБ-280 (9E2) получен в Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии "Вектор" (ГНЦ ВБ "Вектор") Минздрава Российской Федерации и депонирован в Коллекции клеточных культур НИИ клеточных культур ГНЦ ВБ "ВЕКТОР" под номером №НИИМБ-280. Авторское название гибридомной клеточной линии - 9Е2.The inventive strain of hybrid cells Mus musculus L. NIIMB-280 (9E2) was obtained at the State Scientific Center for Virology and Biotechnology "Vector" (SSC WB "Vector") of the Ministry of Health of the Russian Federation and deposited in the Cell Culture Collection of the Research Institute of Cell Culture SSC WB "VECTOR" under number No. NIIMB-280. The author's name for the hybridoma cell line is 9E2.
Штамм Mus musculus L. НИИМБ - 280 (9Е2) характеризуется следующими признаками:The strain of Mus musculus L. NIIMB - 280 (9E2) is characterized by the following features:
Родословная штамма. Штамм гибридных культивируемых клеток получен путем слияния клеток мышиной миеломы p3-X63/Ag8.653 (NS0/1) с клетками селезенки BALB/c мышей, иммунизированных очищенным инактивированным препаратом вируса Западного Нила. В качестве сливающего агента использовали 45% раствор полиэтиленгликоля фирмы Sigma с молекулярным весом 1000. Штамм выращивали на селективной среде ГАТ, затем трижды клонировали методом предельных разведений, используя в качестве клеток-кормилок перитонеальные макрофаги мышей BALB/c. Выход позитивных клонов в последнем клонировании составил 100%.The pedigree of the strain. The hybrid cultured cell strain was obtained by fusion of mouse p3-X63 / Ag8.653 (NS0 / 1) mouse myeloma cells with BALB / c spleen cells from mice immunized with a purified inactivated West Nile virus drug. A Sigma 45% polyethylene glycol solution with a molecular weight of 1000 was used as a confluent. The strain was grown on GAT selective medium, then it was cloned three times using the limiting dilution method using peritoneal macrophages of BALB / c mice as helper cells. The yield of positive clones in the last cloning was 100%.
Число пассажей к моменту депонирования - 7-10 пассажейThe number of passages at the time of deposit - 7-10 passages
Маркерные признаки и методы их оценки. Штамм секретирует мышиные иммуноглобулины, специфически взаимодействующие с белком Е ВЗН. Анализ мышиных иммуноглобулинов проводят методом иммуноферментного анализа, используя в качестве антигена 200 нг очищенного и инактивированного вируса Западного Нила, и антитела против IgG мыши, меченные пероксидазой хрена.Marker signs and methods for their assessment. The strain secrets murine immunoglobulins that specifically interact with WNV protein E. Analysis of murine immunoglobulins is carried out by enzyme-linked immunosorbent assay using 200 ng of purified and inactivated West Nile virus as antigen and anti-mouse IgG antibodies labeled with horseradish peroxidase.
Контаминация бактериями и грибами не обнаружена.Contamination by bacteria and fungi was not detected.
Морфологические признаки. Культура состоит из крупных округлых клеток, сходных по морфологии и размерам с исходной родительской миеломой NS0/1.Morphological signs. The culture consists of large rounded cells, similar in morphology and size to the original parental myeloma NS0 / 1.
Культуральные свойства. Среда для культивирования - среда Игла MEM в модификации Дульбекко, содержащая увеличенные количества аргинина до 200 мг/л, фолиевой кислоты до,12 мг/л, аспарагина до 36 мг/л, а также 0,05 мМ 2-меркаптоэтанола и 20 мМ HEPES. Содержание фетальной сыворотки в ростовой среде - 10%. В среду также добавляют, 80-160 мкг/мл сульфата гентамицина.Cultural properties. Cultivation medium — Dulbecco's MEM needle medium containing increased amounts of arginine up to 200 mg / l, folic acid up to 12 mg / l, asparagine up to 36 mg / l, and 0.05 mM 2-mercaptoethanol and 20 mM HEPES . The content of fetal serum in the growth medium is 10%. 80-160 μg / ml gentamicin sulfate is also added to the medium.
Штамм является монослойно-суспензионной культурой, в которой до 20% клеток находится в суспензии, не прикрепляясь к поверхности посуды для культивирования. Клетки с поверхности культуральной посуды удаляются раствором трипсина:версена=1:1 (объем/объем). Посевная доза 200 тысяч кл/мл. Частота пассирования через 3-4 суток. Индекс пролиферации - не менее 5.The strain is a monolayer-suspension culture in which up to 20% of the cells are in suspension, without attaching to the surface of the dishes for cultivation. Cells from the surface of culture dishes are removed with a trypsin solution: versene = 1: 1 (v / v). Sowing dose of 200 thousand cells / ml. Passaging frequency after 3-4 days. Proliferation index - not less than 5.
Культивирование гибридомы в организме животного. Самкам мышей BALB/c (виварий ГНЦВБ "Вектор") предварительно вводят внутрибрюшинно 0,3-0,5 мл пристана (Sigma). Через 2-4 недели животным прививают внутрибрюшинно 10 млн гибридных клеток. Асцитическая опухоль формируется на 7-10 день. От одного животного можно получить 3-5 мл асцитической жидкости, содержащей МКА. Гибридома прививается в 100% случаев.The cultivation of hybridomas in the body of the animal. Female BALB / c mice (vivarium of the State National Center for Seventeenth Century "Vector") are pre-injected intraperitoneally with 0.3-0.5 ml pristan (Sigma). After 2-4 weeks, animals are inoculated intraperitoneally with 10 million hybrid cells. Ascitic tumor forms on the 7-10th day. 3-5 ml of ascitic fluid containing MCA can be obtained from one animal. Hybridoma is vaccinated in 100% of cases.
Характеристика полезного продукта. Типирование гибридомных иммуноглобулинов проведено методом иммунодиффузии по Оухтерлони. МКА относятся к субклассу IgG2A. Они специфически взаимодействуют с белком Е ВЗН (53-54 kD) в реакции иммуноблота. Титр МКА в асците составляет не менее 1:2187000 в ИФА. Стабильная продукция МКА сохраняется на протяжении не менее 10 пассажей in vitro. Из одного миллилитра асцитической жидкости можно получить 3-5 мг очищенных моноклональных антител. Штамм стабильно продуцирует МКА на протяжении одного месяца непрерывного перевивания в культуре.The characteristic of a useful product. Typing of hybridoma immunoglobulins was carried out by Ouchterloni immunodiffusion method. MCAs belong to the IgG2A subclass. They specifically interact with WNV protein E (53-54 kD) in an immunoblot reaction. The titer of MCA in ascites is at least 1: 2187000 in ELISA. Stable MCA production is maintained for at least 10 passages in vitro. 3-5 milligrams of purified monoclonal antibodies can be obtained from one milliliter of ascitic fluid. The strain stably produces MCA for one month of continuous inoculation in culture.
Криоконсервирование. Среда для замораживания - среда ДМЕМ(М) - 50%, фетальная сыворотка - 40%, диметилсульфоксид - 10%. 1-1,5 мл клеточной суспензии переносят в пластиковые криопробирки и помещают в пенопластовый контейнер с толщиной стенок 1,0 см. Контейнер вносят в пары жидкого азота и через 18-24 часа пробирки переносят в жидкий азот. Размораживание проводят, опуская пробирки в воду с температурой 37-41°С. Клетки разводят средой ДМЕМ(М) и центрифугируют при 1000 об/мин. Осадок ресуспендируют в ростовой среде и клетки переносят в культуральные флаконы в концентрации 200-300 тысяч в миллилитре. Жизнеспособность клеток после размораживания составляет 60-80% (по результатам окрашивания 0,25% трипановым синим). Каждая ампула содержит не менее 1,0 млн/мл клеток.Cryopreservation. The freezing medium is DMEM (M) medium - 50%, fetal serum - 40%, dimethyl sulfoxide - 10%. 1-1.5 ml of the cell suspension is transferred into plastic cryovials and placed in a foam container with a wall thickness of 1.0 cm. The container is placed in a pair of liquid nitrogen and after 18-24 hours the tubes are transferred into liquid nitrogen. Defrosting is carried out by lowering the tubes into water at a temperature of 37-41 ° C. Cells are diluted with DMEM (M) and centrifuged at 1000 rpm. The sediment is resuspended in a growth medium and the cells are transferred into culture bottles at a concentration of 200-300 thousand per milliliter. Cell viability after thawing is 60-80% (according to the results of staining with 0.25% trypan blue). Each ampoule contains at least 1.0 million / ml cells.
Изобретение поясняется графическим материалом, представленным на фиг.1 и раскрывающим связывание в иммуноблоте моноклональных антител, продуцируемых штаммом Mus musculus L. НИИМБ - 280 (9Е2), с белком Е вируса Западного Нила, (штамм WNV/LEIV-Vlg99-27889).The invention is illustrated by the graphic material shown in figure 1 and revealing the binding in the immunoblot of monoclonal antibodies produced by the strain Mus musculus L. NIIMB - 280 (9E2), with protein E of the West Nile virus (strain WNV / LEIV-Vlg99-27889).
Методика получения заявляемого штаммаThe method of obtaining the inventive strain
Штамм гибридных клеток Mus musculus L. НИИМБ - 280 (9Е2) получают следующим образом. Самок мышей BALB/c (виварий ГНЦВБ "Вектор"), массой 15-20 г, иммунизируют по схеме, которая приведена ниже в таблице.The strain of hybrid cells of Mus musculus L. NIIIMB - 280 (9E2) is obtained as follows. Female BALB / c mice (vivarium GNTSVB "Vector"), weighing 15-20 g, are immunized according to the scheme shown in the table below.
Схема иммунизацииTable
Immunization schedule
Для слияния используют 150 млн селезеночных клеток мышей и 150 млн клеток мышиной миеломы NS0/1. Смесь клеток центрифугируют, супернатант тщательно удаляют и к клеточному осадку добавляют 0,4 мл 45% раствора полиэтиленгликоля (ПЭГ) с молекулярной массой 1000. Смесь центрифугируют 15 мин при 1000 об/мин. После 3 мин паузы слой ПЭГ медленно разбавляют 5 мл раствора версена, после чего осадок ресуспендируют. Затем клетки снова осаждают (10 мин при 1000 об/мин) и осадок растворяют в ростовой среде. Клетки распределяют в пять 96-луночных микроплат (Costar) по 100 мкл в лунку. Селекцию гибридных клеток проводят в среде ГАТ, состоящей из питательной среды ДМЕМ(М), в которую добавлены 10% фетальной сыворотки коров (Gipco), 0,1 мМ гипоксантина, 0,04 мМ тимидина и 0,01 мМ аминоптерина.150 million mouse spleen cells and 150 million mouse NS0 / 1 mouse myeloma cells are used for fusion. The mixture of cells is centrifuged, the supernatant is thoroughly removed and 0.4 ml of a 45% solution of polyethylene glycol (PEG) with a molecular weight of 1000 is added to the cell pellet. The mixture is centrifuged for 15 minutes at 1000 rpm. After a 3 min pause, the PEG layer was slowly diluted with 5 ml of versene solution, after which the precipitate was resuspended. Then the cells are pelleted again (10 min at 1000 rpm) and the pellet is dissolved in the growth medium. Cells are dispensed into five 96-well microplates (Costar) at 100 μl per well. Selection of hybrid cells is carried out in GAT medium, consisting of DMEM (M) nutrient medium, to which 10% fetal bovine serum (Gipco), 0.1 mM hypoxanthine, 0.04 mM thymidine and 0.01 mM aminopterin are added.
Отбор специфических гибридов проводят методом иммуноферментного анализа (ИФА). В лунки микроплат (ВНИИМедПолимер) в качестве антигена сорбируют 100-200 нг очищенного ВЗН. Места неспецифического связывания насыщают 0,5% раствором казеина (ICN). Затем в лунки переносят по 100 мкл культуральной среды исследуемых гибридом и инкубируют 45 мин при 37°С. После инкубации лунки промывают 3-5 раз физиологическим раствором, содержащим 0,05% твин-26 (Sigma). Далее в планшеты вносят по 100 мкл антивидового коньюгата (иммуноглобулины кролика против IgG мыши, меченные пероксидазой хрена) и выдерживают 45 мин при 37°С. Планшеты промывают и проводят ферментативную реакцию. Результаты анализа определяют на спектрофотометре MULTISCAN при длине волны 492 нм. Полученный гибридный штамм Mus musculus L. НИИМБ-280 (9Е2) дважды клонируют методом предельных разведении, переводят в массовую культуру и замораживают в жидком азоте. Приведенные ниже примеры подробно раскрывают полезные свойства объекта изобретения.Specific hybrids are selected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). In the wells of microplates (VNIIMedPolymer), 100-200 ng of purified WNV are adsorbed as antigen. Non-specific binding sites are saturated with a 0.5% casein solution (ICN). Then, 100 μl of the culture medium of the studied hybridomas are transferred to the wells and incubated for 45 min at 37 ° C. After incubation, the wells are washed 3-5 times with saline containing 0.05% tween-26 (Sigma). Then, 100 μl of antispecific conjugate (rabbit immunoglobulins against mouse IgG labeled with horseradish peroxidase) were added to the tablets and incubated for 45 min at 37 ° C. The tablets are washed and carry out an enzymatic reaction. The analysis results are determined on a MULTISCAN spectrophotometer at a wavelength of 492 nm. The obtained hybrid strain of Mus musculus L. NIIMB-280 (9E2) was twice cloned by the method of limiting dilution, transferred to mass culture and frozen in liquid nitrogen. The following examples detail the useful properties of the subject invention.
Пример 1. Культивирование штамма Mus musculus L. НИИМБ-280 (9Е2), секретирующего моноклональные антитела к белку Е вируса Западного Нила в организме животных, мышей BALB/c.Example 1. The cultivation of a strain of Mus musculus L. NIIMB-280 (9E2), secreting monoclonal antibodies to protein E of West Nile virus in animals, BALB / c mice.
Вариант 1. Мышам BALB/c (виварий ГНЦВБ "Вектор"), весом 20-22 г, не менее чем за 10 дней до прививки гибридомных клеток вводят внутрибрюшинно по 0,3-0,5 мл пристана. Культивируемые клетки штамма, находящиеся в логарифмической фазе роста, стерильно центрифугируют 5-10 мин при 1000 об/мин на центрифуге ОПН-3. Надосадок удаляют, а осадок клеток суспензируют в стерильном растворе Эрла или Хенкса. Самкам мышей BALB/c (виварий ГНЦВБ "Вектор") весом 20-22 г. внутрибрюшинно вводят каждой по 1 мл клеточной суспензии, содержащей не менее 10 млн гибридомных клеток. Через 7-10 дней животных усыпляют и из брюшной полости извлекают 3-5 мл асцитической жидкости. Клетки из асцитической жидкости отделяют центрифугированием и используют для дальнейшего перевивания гибридомы, а в надосадочной жидкости определяют титр антител с помощью иммуноферментного анализа, как описано выше.Option 1. To mice BALB / c (vivarium GNTSVB "Vector"), weighing 20-22 g, not less than 10 days before vaccination of hybridoma cells, 0.3-0.5 ml of pristan is administered intraperitoneally. The cultured cells of the strain, which are in the logarithmic phase of growth, are sterile centrifuged for 5-10 minutes at 1000 rpm in an OPN-3 centrifuge. The supernatant is removed and the cell pellet is suspended in a sterile Earl or Hanks solution. Female BALB / c mice (vivarium GNTSVB "Vector") weighing 20-22 g. Each ml of cell suspension containing at least 10 million hybridoma cells is intraperitoneally administered. After 7-10 days, the animals are euthanized and 3-5 ml of ascitic fluid is removed from the abdominal cavity. Cells from ascitic fluid are separated by centrifugation and used for further transplantation of the hybridoma, and the antibody titer is determined in the supernatant using an enzyme-linked immunosorbent assay as described above.
Пример 2. Выделение очищенных моноклональных антител, продуцируемых штаммом гибридных культивируемых клеток Mus musculus L. НИИМБ-280 (9Е2).Example 2. The selection of purified monoclonal antibodies produced by a strain of hybrid cultured cells of Mus musculus L. NIIMB-280 (9E2).
Вариант №1. Асцитическую жидкость или культуральную среду, содержащие МКА, центрифугируют 20 мин при 5000 g и осадок удаляют. К выбранному объему асцитической жидкости или культуральной среды добавляют равный объем насыщенного раствора сульфата аммония. Полученную суспензию после инкубирования в течение ночи (18 часов) при +4°С центрифугируют 20 мин при 5000 g. Осадок, содержащий обогащенную фракцию иммуноглобулинов, растворяют в 0,01 М растворе фосфатного буфера, при рН 7,2. Остаток сульфата аммония удаляют путем гельфильтрации. С этой целью используется колонка 3×30 см, заполненная сефадексом G-25 и уравновешенная 0,01 М фосфатным буфером, рН 7,2.Option number 1. Ascitic fluid or culture medium containing MAB was centrifuged for 20 min at 5000 g and the precipitate was removed. An equal volume of a saturated solution of ammonium sulfate is added to the selected volume of ascitic fluid or culture medium. The resulting suspension, after incubation overnight (18 hours) at + 4 ° C, is centrifuged for 20 min at 5000 g. The precipitate containing the enriched fraction of immunoglobulins is dissolved in a 0.01 M phosphate buffer solution, at pH 7.2. The remaining ammonium sulfate is removed by gel filtration. For this purpose, a 3 × 30 cm column is used, filled with Sephadex G-25 and balanced with 0.01 M phosphate buffer, pH 7.2.
Вариант №2. Один объем асцитической жидкости, содержащей МКА, разводят 4 объемами 0,6 М ацетатного буфера (0,04 М лимонной кислоты, 0,2 М натрия ацетата), рН 4,0 и доводят рН до 4,5 с помощью 0,1 N раствора едкого натра. К разведенному образцу добавляют по каплям, с постоянным перемешиванием, каприловую кислоту из расчета 25 мкл на 1 мл раствора и инкубируют ночь при +4°С. Затем центрифугируют 30 мин при 8000 g и осадок удаляют, а надосадок смешивают с 10-кратным фосфатно-солевым буфером (ФСБ) и устанавливают рН 7,4 раствором 1,0 N едкого натра. Равный объем насыщенного раствора сульфата аммония добавляют (V:V) к этому раствору, встряхивают и выдерживают ночь при +4°С или 30 мин при +20-25°С. Центрифугируют 15 мин при 5000 g. Надосадок сливают, а осадок растворяют в ФСБ, рН 7,4. Остатки сульфата аммония удаляют путем диализа против 50-100 объемов ФСБ, рН 7,4.Option number 2. One volume of ascitic fluid containing MCA is diluted with 4 volumes of 0.6 M acetate buffer (0.04 M citric acid, 0.2 M sodium acetate), pH 4.0, and adjusted to pH 4.5 with 0.1 N caustic soda solution. To the diluted sample, caprylic acid is added dropwise, with constant stirring, at the rate of 25 μl per 1 ml of solution and incubated overnight at + 4 ° C. Then it is centrifuged for 30 min at 8000 g and the precipitate is removed, and the supernatant is mixed with 10-fold phosphate-buffered saline (PBS) and the pH is adjusted to 7.4 with a solution of 1.0 N sodium hydroxide. An equal volume of a saturated solution of ammonium sulfate is added (V: V) to this solution, shaken and incubated overnight at + 4 ° C or 30 min at + 20-25 ° C. Centrifuge for 15 min at 5000 g. The supernatant is drained, and the precipitate is dissolved in PBS, pH 7.4. Residues of ammonium sulfate are removed by dialysis against 50-100 volumes of FSB, pH 7.4.
Пример 3. Определение методом ИФА специфического взаимодействия МКА, продуцируемых штаммом Mus musculus L. НИИМБ-280 (9Е2), с вирусом Западного Нила.Example 3. Determination by ELISA of the specific interaction of MCA produced by the strain of mus musculus L. NIIMB-280 (9E2), with West Nile virus.
ИФА проводился на полистироловых планшетах; антиген (очищенный и инактивированный вирус Западного Нила, штамм WNV7LEIV-Vlg99-27889) сорбировали в ФСБ, рН 7,4 в объеме 100 мкл/лунку на планшеты. Места неспецифического связывания насыщали при 37°С 45 минут 0,5% раствором казеина в буфере ТСБ-Твин (0.145 М хлористого натрия, 20 mM Трис-HCl, 5 mM PMSF (Sigma), 0,1% Tween-20 (Serva), pH-7,4) и затем инкубировали с моноклональными антителами 45 минут при 37°С. Специфическое связывание МКА с антигеном выявляли антивидовыми меченными пероксидазой антителами против IgG мыши. Далее добавляли хромоген, 0,1% O-фенилендиамин, в цитратно-фосфатном буфере (0,2 М лимонной кислоты, 0,5 М Na2HPO3, рН 5,0) с 0,03% перекиси водорода). Останавливали реакцию добавлением 100 мкл на лунку 1 N HCl и измеряли оптическую плотность образцов на спектрофотометре "Multiscan" (Финляндия) с использованием светофильтра с максимумом пропускания 492 нм. В качестве отрицательного и положительного контроля использовали, соответственно, гомологичные неиммунную (нормальную) и гипериммунную сыворотки.ELISA was carried out on polystyrene tablets; the antigen (purified and inactivated West Nile virus, strain WNV7LEIV-Vlg99-27889) was sorbed in FSB, pH 7.4 in a volume of 100 μl / well on tablets. Non-specific binding sites were saturated at 37 ° C for 45 minutes with a 0.5% casein solution in TSB-Tween buffer (0.145 M sodium chloride, 20 mM Tris-HCl, 5 mM PMSF (Sigma), 0.1% Tween-20 (Serva) , pH-7.4) and then incubated with monoclonal antibodies for 45 minutes at 37 ° C. Specific binding of MCA to the antigen was detected by anti-peroxidase-labeled antibodies against mouse IgG. Next, a chromogen, 0.1% O-phenylenediamine, was added in citrate phosphate buffer (0.2 M citric acid, 0.5 M Na 2 HPO 3 , pH 5.0) with 0.03% hydrogen peroxide). The reaction was stopped by adding 100 μl per well of 1 N HCl and the optical density of the samples was measured on a Multiscan spectrophotometer (Finland) using a light filter with a maximum transmission of 492 nm. As a negative and positive control, homologous non-immune (normal) and hyperimmune serums were used, respectively.
Пример 4. Выявление в иммуноблоте взаимодействия МКА, продуцируемых штаммом Mus musculus L. НИИМБ-280 (9Е2), с белком Е ВЗН штамм WNV/LEIV-Vlg99-27889.Example 4. Detection in the immunoblot of the interaction of MCA produced by the strain of Mus musculus L. NIIMB-280 (9E2), with protein E WNV strain WNV / LEIV-Vlg99-27889.
Вирусные белки после 12% ПААГ-электрофореза были перенесены на нитроцеллюлозную мембрану (Millipore, США). Места неспецифического связывания насыщали 0,5% раствором казеина в буфере ТСБ-Твин (0,145 М хлористого натрия, 20 mM Трис-HCl, 5 mM PMSF (Sigma), 0.1% Tween-20 (Serva), pH-7,4) при 37°С 2 часа. Затем отдельные полоски мембраны инкубировали с моноклональными антителами 4 часа при 20-22°С. Специфическое связывание антител, взаимодействующих с вирусными белками, выявляли с помощью конъюгата антивидовых антител против IgG мыши, меченных пероксидазой хрена.Viral proteins after 12% PAAG electrophoresis were transferred to the nitrocellulose membrane (Millipore, USA). Non-specific binding sites were saturated with a 0.5% casein solution in TSB-Tween buffer (0.145 M sodium chloride, 20 mM Tris-HCl, 5 mM PMSF (Sigma), 0.1% Tween-20 (Serva), pH-7.4) at 37 ° C for 2 hours. Then, individual membrane strips were incubated with monoclonal antibodies for 4 hours at 20-22 ° C. The specific binding of antibodies interacting with viral proteins was detected using a conjugate of anti-mouse anti-mouse IgG labeled with horseradish peroxidase.
В качестве отрицательного контроля использовали NS/0-асцитическую жидкость в разведении 1/500, в качестве положительного контроля - антисыворотку к ВЗН в разведении 1/500 от мышей, используемых для получения гибридом. Результаты представлены на чертеже.A 1/500 dilution NS / 0 ascitic fluid was used as a negative control, and WNV antiserum in a dilution of 1/500 from mice used to obtain hybridomas was used as a positive control. The results are presented in the drawing.
Вышеприведенные свойства штамма гибридных клеток НИИМБ-280 (авторское название клеточной линии 9Е2) позволяют заключить, что впервые на основе мышиной миеломы получена гибридома Mus museums L. НИИМБ - 280 (9Е2) - продуцент МКА к белку Е вируса Западного Нила, штамм WNV/LEIV-Vlg99-27889. Штамм гибридных клеток обеспечивает получение мышиных иммуноглобулинов класса IgG2a в количестве 3-5 мг очищенных антител из миллилитра асцитической жидкости. Очищенные МКА специфично реагировали в ИФА с вирусом Западного Нила (титр МКА составлял не менее 1:2187000) и выявляли в иммуноблоте белок Е ВЗН, штамм WNV/LEIV-Vlg99-27889. Указанный вирус был выделен в Волгоградской области в 1999 году от больного [1], что позволяет эффективно использовать продуцируемые штаммом МКА для выявления случаев лихорадки вируса Западного Нила на территории России.The above properties of the NIIMB-280 hybrid cell strain (the author's name is the cell line 9E2) allow us to conclude that for the first time a hybridoma of Mus museums L. was obtained on the basis of mouse myeloma. -Vlg99-27889. The strain of hybrid cells provides the production of mouse IgG2a class immunoglobulins in an amount of 3-5 mg of purified antibodies from a milliliter of ascitic fluid. The purified MABs specifically reacted in ELISA with West Nile virus (MAB titer was not less than 1: 2187000) and WNV protein E, strain WNV / LEIV-Vlg99-27889 was detected in the immunoblot. The indicated virus was isolated in the Volgograd region in 1999 from a patient [1], which makes it possible to efficiently use the MCA produced by the strain to detect cases of West Nile virus fever in Russia.
Вышеуказанные свойства штамма Mus museums L. НИИМБ-280 (9Е2) отличают его от всех описанных ранее гибридом, продуцирующих МКА к белкам вируса Западного Нила.The above properties of the strain Mus museums L. NIIMB-280 (9E2) distinguish it from all the previously described hybridomas producing MCAs for West Nile virus proteins.
Источники информацииSources of information
1. А.Г.Прилипов, Е.И.Самохвалов, Д.К.Львов, В.Л.Громашевский, А.М.Бутенко, О.И.Вышемирский, В.Ф.Ларичев, С.Я.Гайдамович, Н.В.Хуторецкая, А.Г.Воронина, Д.В.Новиков, В.В.Мохонов, С.В.Альховский. Генетический анализ вирусов лихорадки Западного Нила, выделенных на юге Русской равнины (Волгоградская и Астраханская области) в 1999 г. Вопросы вирусологии 2001, 46(1): 8-12.1. A. G. Prilipov, E. I. Samokhvalov, D. K. Lvov, V. L. Gromashevsky, A. M. Butenko, O. I. Vyshemirsky, V. F. Larichev, S. Ya. Gaidamovich, N.V. Khutoretskaya, A.G. Voronina, D.V. Novikov, V.V. Mokhonov, S.V. Alkhovsky. Genetic analysis of West Nile fever viruses isolated in the south of the Russian Plain (Volgograd and Astrakhan regions) in 1999. Virology Issues 2001, 46 (1): 8-12.
2. Blitvich B.J., Marienee N.L., Hall R.A., Calisher C.H., Bowen R.A., Roehrig J.T., Komar N., Langevin S.A., Beaty B.J. Epitope-blocking enzyme-linked immunosorbent assays for the detection of serum antibodies to west nile virus in multiple avian species. J. Clin. Microbiol. 2003, Mar; 41(3): 1041-7.2. Blitvich B.J., Marienee N.L., Hall R.A., Calisher C.H., Bowen R.A., Roehrig J.T., Komar N., Langevin S.A., Beaty B.J. Epitope-blocking enzyme-linked immunosorbent assays for the detection of serum antibodies to west nile virus in multiple avian species. J. Clin. Microbiol. 2003, Mar; 41 (3): 1041-7.
3. Beasley D.W., Barrett A.D. Identification of neutralizing epitopes within structural domain III of the West Nile virus envelope protein. J. Virol. 2002, Dec; 76(24): 13097-100.3. Beasley D.W., Barrett A.D. Identification of neutralizing epitopes within structural domain III of the West Nile virus envelope protein. J. Virol. 2002, Dec; 76 (24): 13097-100.
4. Hall R.A., Scherret J.H., Sedlak P., Poidinger, Mackenzie J.S. Isolation of homologous arbovirus cultures from heterologous mixtures using limig dilution and virus-specific enzyme immunoassays. J. of Virol. Meth. (1999), 83: 189-192.4. Hall R.A., Scherret J.H., Sedlak P., Poidinger, Mackenzie J.S. Isolation of homologous arbovirus cultures from heterologous mixtures using limig dilution and virus-specific enzyme immunoassays. J. of Virol. Meth. (1999), 83: 189-192.
5. Hunt A.R., Hall R.A., Kerst A.J., Nasci R.S., Savage H.M., Panella N.A., Gottfried K.L., Burkhalter K.L., Roehrig J.T. Detection of West Nile virus antigen in mosquitoes and avian tissues by a monoclonal antibody-based capture enzyme immunoassay. J. Clin. Microbiol. 2002, Jun; 40(6): 2023-30.5. Hunt A.R., Hall R.A., Kerst A.J., Nasci R.S., Savage H.M., Panella N.A., Gottfried K.L., Burkhalter K.L., Roehrig J.T. Detection of West Nile virus antigen in mosquitoes and avian tissues by a monoclonal antibody-based capture enzyme immunoassay. J. Clin. Microbiol. 2002, Jun; 40 (6): 2023-30.
6. Peiris J.S.M., Porterfield J.S. and Roehrig J.T. Monoclonal antibodies against the flavivirus West Nile. J. Gen. Virol. 1982; 58: 283-289.6. Peiris J.S.M., Porterfield J.S. and Roehrig J.T. Monoclonal antibodies against the flavivirus West Nile. J. Gen. Virol. 1982; 58: 283-289.
7. Morvan J., Besselaar T., Fontenille D., Coulanges P. Antigenic variations in West Nile virus strains isolated in Madagascar since 1978. Res Virol. 1990 Nov-Dec; 141(6): 667-76.7. Morvan J., Besselaar T., Fontenille D., Coulanges P. Antigenic variations in West Nile virus strains isolated in Madagascar since 1978. Res Virol. 1990 Nov-Dec; 141 (6): 667-76.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2004100930/13A RU2265658C2 (en) | 2004-01-09 | 2004-01-09 | Strain of hybrid cells of animal mus musculus l, 9e2, used in preparing monoclonal antibody to west nile virus protein e of strain wnv/leiv-vig99-27889 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2004100930/13A RU2265658C2 (en) | 2004-01-09 | 2004-01-09 | Strain of hybrid cells of animal mus musculus l, 9e2, used in preparing monoclonal antibody to west nile virus protein e of strain wnv/leiv-vig99-27889 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2004100930A RU2004100930A (en) | 2005-08-27 |
| RU2265658C2 true RU2265658C2 (en) | 2005-12-10 |
Family
ID=35846502
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2004100930/13A RU2265658C2 (en) | 2004-01-09 | 2004-01-09 | Strain of hybrid cells of animal mus musculus l, 9e2, used in preparing monoclonal antibody to west nile virus protein e of strain wnv/leiv-vig99-27889 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2265658C2 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2595429C1 (en) * | 2015-04-21 | 2016-08-27 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор") | STRAIN OF HYBRID ANIMAL CELLS Mus musculus L. 5H6 - PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODIES FOR DETECTING GLYCOPROTEIN E OF WEST NILE VIRUS, 5H6 MONOCLONAL ANTIBODIES PRODUCED BY SAID STRAIN OF HYBRID CELLS, AND IMMUNOENZYMOMETRIC KIT FOR DETECTING GLYCOPROTEIN E OF WEST NILE VIRUS USING SAID MONOCLONAL ANTIBODIES |
| RU2801532C1 (en) * | 2022-10-11 | 2023-08-10 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | pVEAL2-9E2ch-SCFv PLASMID GENETIC CONSTRUCT, STRAIN OF RECOMBINANT CELL LINE CHO-K1-9E2ch AND CHIMERIC SINGLE-CHAIN ANTIBODY 9E2ch AGAINST WEST NILE VIRUS PRODUCED BY THE SPECIFIED STRAIN OF CELL LINE CHO-K1-9E2ch WITH HIGH AFFINITY FOR NEONATAL FcRn RECEPTOR |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002081511A1 (en) * | 2001-04-04 | 2002-10-17 | Institut Pasteur | Neurovirulent strain of the west nile virus and applications thereof |
-
2004
- 2004-01-09 RU RU2004100930/13A patent/RU2265658C2/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002081511A1 (en) * | 2001-04-04 | 2002-10-17 | Institut Pasteur | Neurovirulent strain of the west nile virus and applications thereof |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2595429C1 (en) * | 2015-04-21 | 2016-08-27 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор") | STRAIN OF HYBRID ANIMAL CELLS Mus musculus L. 5H6 - PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODIES FOR DETECTING GLYCOPROTEIN E OF WEST NILE VIRUS, 5H6 MONOCLONAL ANTIBODIES PRODUCED BY SAID STRAIN OF HYBRID CELLS, AND IMMUNOENZYMOMETRIC KIT FOR DETECTING GLYCOPROTEIN E OF WEST NILE VIRUS USING SAID MONOCLONAL ANTIBODIES |
| RU2801532C1 (en) * | 2022-10-11 | 2023-08-10 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | pVEAL2-9E2ch-SCFv PLASMID GENETIC CONSTRUCT, STRAIN OF RECOMBINANT CELL LINE CHO-K1-9E2ch AND CHIMERIC SINGLE-CHAIN ANTIBODY 9E2ch AGAINST WEST NILE VIRUS PRODUCED BY THE SPECIFIED STRAIN OF CELL LINE CHO-K1-9E2ch WITH HIGH AFFINITY FOR NEONATAL FcRn RECEPTOR |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2004100930A (en) | 2005-08-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2265658C2 (en) | Strain of hybrid cells of animal mus musculus l, 9e2, used in preparing monoclonal antibody to west nile virus protein e of strain wnv/leiv-vig99-27889 | |
| CN105132376B (en) | One can the how individual epitopes of specific recognition HBsAg monoclonal antibody and its application | |
| RU2143488C1 (en) | Strain of hybrid cultured cells of animal mus musculus l for preparing monoclonal antibodies raised to protein 105 kda of excretory-secretory antigen of human hepatic trematode opisthorchis felineus | |
| RU2395575C1 (en) | STRAIN OF HYBRID ANIMAL CELLS Mus musculus L - PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODIES FOR EXPOSING VP40 PROTEIN OF MARBURG VIRUS, (Popp STRAIN) (VERSIONS), MONOCLONAL ANTIBODY PRODUCED BY SAID STRAIN (VERSIONS) AND SET FOR "SANDWICH" FORMAT IMMUNOENZYMOMETRIC SYSTEM FOR EXPOSING VP40 MATRIX PROTEIN OF MARBURG VIRUS (Popp STRAIN) | |
| SU1742325A1 (en) | Strain of hybridous cultured mammalian cells mus musculis l - a producer of monoclonal antibodies to choleric enterotoxin of eltor biotype | |
| RU2070926C1 (en) | Strain of hybrid cultured cells mus musculus l used for preparing monoclonal antibodies to the c-terminal part of protein p24 of human immunodeficiency virus type 1 | |
| RU2142507C1 (en) | Strain of hybrid cultured cell of animal rattus norvegicus used for preparing monoclonal antibodies raised to human hepatitis a virus | |
| RU2535982C1 (en) | Strain of cultivated hybrid animal cells mus musculus l cchfv vd-1-producer of monoclonal antibody 4g4/b6 to virus of crimean-congo hemorrhagic fever (cchf) | |
| RU2012594C1 (en) | Strain of hybrid cultured mammalian cells mus musculus l - a producer of monoclonal antibodies to 146s-component of foot and mouth disease virus asia-1 | |
| SU1595902A1 (en) | Strain of mus musculus l hybrid cultivable cells for producing monoclonal antibodies to atigen cd38 | |
| RU2281327C2 (en) | STRAIN OF HYBRID CULTURING Rattus norvegicus 122H9 CELLS WHICH IS PRODUCER OF CROSS-REACTIVE NEUTRALIZING MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST PATHOGENIC FOR HUMAN ORTHOPOXVIRUSES | |
| RU1801117C (en) | Method of monoclonal antibody preparation to monoclonal antibody to the protein of human lymphocyte t4, culturing cell of hybridoma jti -if3 - a producer of monoclonal antibody to monoclonal antibody to the protein of human lymphocyte t4, culturing cell of hybridoma jti -if3-e5 - a producer of monoclonal antibody to monoclonal | |
| SU1640158A1 (en) | Strain of hybridous cultivating mammalian cells, mus musculus l, tsed for preparation of monoclonal antibodies for dna-dependent rna-polymerase of bacteriophaga t7 | |
| RU2528869C1 (en) | STRAIN OF CULTIVATED HYBRID CELLS OF ANIMAL MUS MUSCULUS L CCHFV Vd-3-PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODY 3H6/F2 TO VIRUS OF CRIMEAN-CONGO HAEMORRHAGIC FEVER | |
| SU1640157A1 (en) | Strain of hybridous cultivating mammalian cells, mus musculus l, used for preparation of monoclonal antibodies for dna-dependent rna-polymerase of bacteriophage t7 | |
| Schots et al. | Production of monoclonal antibodies | |
| SU1416509A1 (en) | Method of producing monoclonal antibodies to light chains of human immunoglobulins | |
| RU2116344C1 (en) | Strain of cultured hybrid cells of animal mus musculus - a producer of monoclonal antibody raised to thermostable surface antigen of meliodosis pathogen | |
| RU2542381C2 (en) | MUS MUSCULUS'S HYBRID CULTURE CELL STRAIN α PRODUCING MONOCLONAL ANTIBODIES SPECIFIC TO HUMAN GRANULOCYTE COLONY-STIMULATING FACTOR (GCSF) | |
| SU1751202A1 (en) | Strain of hybridous cultured mammalian cells mus musculus l , producing monoclonal antibodies to 146 s-component of foot-and-mouth virus a@@@ (aglie) | |
| RU1798372C (en) | Strain of hybridous cultured mammalian cells - mus musculus l - a producer of protective monoclonal antibodies to equine east encephalitis virus | |
| RU2652885C1 (en) | MUS MUSCULUS HYBRID CULTIVATED ANIMAL CELLS STRAIN α - THE PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODIES SPECIFIC TO THE CANCER-TESTICULAR ANTIGEN OF THE PERSON GAGE | |
| SU1666532A1 (en) | Strain of hybridous cultured mammalian cells, mus musculcs l. producing monoclonal antibodies for nucleocapside protein or cattle virus | |
| SU1640156A1 (en) | Strain of hybridous cultivating mammalian cells, mus musculus l, used for preparation of monoclonal antibodies for dna-dependent rna-polymerase of bacteriophage t7 | |
| RU2528868C1 (en) | STRAIN OF CULTIVATED HYBRID CELLS OF ANIMAL MUS MUSCULUS L CCHFV Vd-2-PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODY 1E2/E5 TO VIRUS OF CRIMEAN-CONGO HAEMORRHAGIC FEVER |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC43 | Official registration of the transfer of the exclusive right without contract for inventions |
Effective date: 20120320 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20210110 |