RU2261279C1 - Method for preparing affinity surface based on chemically cross- linked protein a - Google Patents
Method for preparing affinity surface based on chemically cross- linked protein a Download PDFInfo
- Publication number
- RU2261279C1 RU2261279C1 RU2004103843/13A RU2004103843A RU2261279C1 RU 2261279 C1 RU2261279 C1 RU 2261279C1 RU 2004103843/13 A RU2004103843/13 A RU 2004103843/13A RU 2004103843 A RU2004103843 A RU 2004103843A RU 2261279 C1 RU2261279 C1 RU 2261279C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protein
- layer
- affinity
- antibodies
- linked
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области охраны окружающей среды, медицинской и микробиологической промышленности. Сущность изобретения состоит в приготовлении аффинных поверхностей, предназначенных для специфической иммобилизации биологических объектов, путем нанесения на гидрофобную поверхность слоя стафилококкового белка А, химической внутренней прошивки этого слоя, и нанесения на его поверхность антител, специфичных в отношении определенного лиганда. Свойства комплекса белок А - антитело таковы, что в условиях использования аффинной поверхности (в жидкости, содержащей лиганд) антитела на поверхности слоя белка А ориентированы активными участками в жидкость, что обеспечивает эффективный захват лиганда.The invention relates to the field of environmental protection, medical and microbiological industry. The essence of the invention consists in the preparation of affinity surfaces intended for the specific immobilization of biological objects by applying a layer of staphylococcal protein A to the hydrophobic surface, chemical internal firmware of this layer, and applying antibodies specific to a specific ligand to its surface. The properties of the protein A – antibody complex are such that, under conditions of using an affinity surface (in a liquid containing a ligand), antibodies on the surface of a protein A layer are oriented by active sites into the liquid, which ensures efficient ligand capture.
Аффинные поверхности широко используются для высокочувствительного детектирования наличия высокомолекулярных соединений и биологических объектов субмикронных размеров в окружающей среде, при высокоспецифичном выделении различных субстанций из смеси, концентрировании (аффинная хроматография, плазмоферез). В аналитических и медицинских целях используются также частицы с аффинной поверхностью. Несмотря на многообразие методов использования аффинных поверхностей, число молекулярных механизмов, обеспечивающих специфичность, и соответствующих способов организации аффинных поверхностей невелико. Из вариантов молекулярных взаимодействий, обеспечивающих специфичность, наиболее часто используются взаимодействия антиген - антитело. В последнее время широкое распространение получило также использование специфической гибридизации фрагментов ДНК или РНК, но этот молекулярный механизм применим только для обнаружения ДНК или РНК. В то же время взаимодействия антиген - антитело более универсальны. В настоящее время отработаны и широко используются методы препаративного получения специфических антител в отношении широчайшего спектра антигенов.Affinity surfaces are widely used for highly sensitive detection of the presence of high molecular weight compounds and biological objects of submicron sizes in the environment, with highly specific isolation of various substances from the mixture, concentration (affinity chromatography, plasmapheresis). Particles with an affinity surface are also used for analytical and medical purposes. Despite the variety of methods for using affine surfaces, the number of molecular mechanisms that provide specificity and the corresponding methods for organizing affine surfaces is small. Of the variants of molecular interactions that provide specificity, antigen-antibody interactions are most often used. Recently, the use of specific hybridization of DNA or RNA fragments has also become widespread, but this molecular mechanism is applicable only for the detection of DNA or RNA. At the same time, antigen-antibody interactions are more universal. Currently developed and widely used methods of preparative production of specific antibodies against the widest spectrum of antigens.
Число способов получения аффинных поверхностей на основе антител, т.е. закрепления антител или их активных фрагментов на поверхности, также невелико. Наибольшую прочность обеспечивает ковалентное закрепление, но при этом может существенно ограничиваться подвижность активных участков антител, что приводит к существенному падению эффективности захвата лиганда. Данный недостаток в значительной мере преодолевается путем использования гибких молекул-посредников между антителом и подложкой. Кроме того, ковалентное закрепление предполагает проведение химической реакции, которая может негативно сказываться на способности активных участков молекул к специфическому связыванию.The number of methods for producing affinity surfaces based on antibodies, i.e. the binding of antibodies or their active fragments to the surface is also small. The greatest strength is provided by covalent binding, but the mobility of the active sites of antibodies can be significantly limited, which leads to a significant decrease in the efficiency of ligand capture. This disadvantage is largely overcome by the use of flexible intermediary molecules between the antibody and the substrate. In addition, covalent bonding involves a chemical reaction that can adversely affect the ability of the active sites of molecules to specifically bind.
Некоторые дополнительные удобства обеспечивает применение для закрепления антител авидин-биотинового комплекса, один из компонентов которого (обычно - авидин) ковалентно закрепляется на подложке, а другой (биотин) - на антителах. В растворе авидин и биотин самопроизвольно образуют комплекс; в результате «биотинилированное» антитело оказывается закрепленным на покрытой авидином поверхности. При использовании данной схемы появляется возможность не хранить длительное время готовую аффинную поверхность (что сопряжено с риском ее деструкции при хранении), а готовить ее непосредственно перед использованием, так как для формирования авидин-биотинового комплекса не требуются сложные специальные условия и длительное время. К недостатку способа может быть отнесена необходимость биотинилирования антител, которая увеличивает их стоимость и требует проведения специальной процедуры.The use of an avidin-biotin complex for fixing antibodies provides some additional convenience. One of its components (usually avidin) is covalently attached to the substrate and the other (biotin) is attached to antibodies. In solution, avidin and biotin spontaneously form a complex; as a result, the “biotinylated” antibody is fixed on an avidin-coated surface. When using this scheme, it becomes possible not to store the finished affinity surface for a long time (which is associated with the risk of its destruction during storage), but to prepare it immediately before use, since complex special conditions and a long time are not required to form the Avidin-Biotin complex. The disadvantage of this method can be attributed to the need for biotinylation of antibodies, which increases their cost and requires a special procedure.
Одним из наиболее удобных способов закрепления антител на подложке является закрепление на слое белка А. Природа структуры белка А такова, что он способен связывать Fc - фрагмент любого IgG антитела, что дает возможность готовить аффинные поверхности на основе IgG антител без их специальной обработки.One of the most convenient ways of attaching antibodies to a substrate is to attach to a layer of protein A. The nature of protein structure A is such that it is able to bind the Fc fragment of any IgG antibody, which makes it possible to prepare affinity surfaces based on IgG antibodies without special treatment.
Характерным примером использования в аналитических целях закрепленного на твердом инертном носителе (стеклянных волокнах) агента, способного к специфическому связыванию (а именно - ковалентно закрепленных антител), является патент [1]. В биохимических тестах также широко распространено использование в качестве носителей антител полимеров, таких как агароза [2, 3]. Примером использования аффинных поверхностей на основе полинуклеотидов может служить патент [4]. В ряде случаев для детектирования антигенов удобно использовать не неподвижные поверхности или носители, являющиеся наполнителями биохимических колонок, а частицы с аффинной поверхностью [5, 6].A typical example of the use of an agent that is capable of specific binding (namely, covalently attached antibodies) fixed on a solid inert carrier (glass fibers) for analytical purposes is a patent [1]. In biochemical tests, the use of polymers such as agarose as carriers of antibodies is also widespread [2, 3]. An example of the use of affinity surfaces based on polynucleotides is the patent [4]. In some cases, for detecting antigens, it is convenient to use not fixed surfaces or carriers that are fillers of biochemical columns, but particles with an affinity surface [5, 6].
Примером использования аффинных поверхностей в медицине, в колонках для очистки крови, может служить патент [7], где такая система используется для борьбы с атеросклерозом, лейкозом, аутоиммунными заболеваниями. Для удаления антител из крови, необходимого для борьбы с некоторыми аутоиммунными заболеваниями, может использоваться белок А, ковалентно закрепленный на кремниевой матрице, помещенной в биохимическую колонку [8, 9]. В процессе использования этих колонок было установлено, что аналогичным терапевтическим эффектом обладают и частицы, смывающиеся с них и попадающие в плазму крови. Впоследствии был разработан способ специального приготовления обладающих терапевтическим эффектом частиц из химически прошитого белка А [10]. Известен также способ иммобилизации белка А, в одном из вариантов адсорбированного на частицах активированного угля, помещенных в коллодиевую мембрану, а в другом - ковалентно закрепленного на частицах нейлона, полистирола, метакрилата [11]. Данная система также используется для очистки плазмы крови.An example of the use of affine surfaces in medicine, in blood purification columns, is a patent [7], where such a system is used to combat atherosclerosis, leukemia, and autoimmune diseases. To remove antibodies from the blood, which is necessary to combat some autoimmune diseases, protein A can be used covalently attached to a silicon matrix placed in a biochemical column [8, 9]. In the process of using these columns, it was found that particles that wash off from them and enter the blood plasma have a similar therapeutic effect. Subsequently, a method was developed for the special preparation of particles with a therapeutic effect from chemically stitched protein A [10]. There is also known a method of immobilizing protein A, in one of the variants of activated carbon adsorbed on particles placed in a collodion membrane, and in the other, nylon, polystyrene, methacrylate covalently attached to particles [11]. This system is also used to purify blood plasma.
Сущность изобретения состоит в разработке простого и эффективного метода приготовления устойчивых аффинных поверхностей - подложек на основе белка А, на которые затем адсорбируются антитела. Для достижения поставленной цели на первом этапе на поверхности гидрофобной подложки формировался слой белка А. Белок А является мембранным белком Staphilococcus aureus. Молекула белка А имеет гидрофобные участки, которые в обычных условиях существования микроорганизма погружены в его мембрану, и гидрофильные участки, ориентированные в окружающую среду, способные к связыванию Fc-фрагмента антител, что составляет основу природной биологической защиты Staphilococcus aureus.The essence of the invention consists in the development of a simple and effective method for the preparation of stable affinity surfaces - substrates based on protein A, on which antibodies are then adsorbed. To achieve this goal, at the first stage, a layer of protein A was formed on the surface of the hydrophobic substrate. Protein A is a membrane protein of Staphilococcus aureus. The protein A molecule has hydrophobic regions, which are immersed in its membrane under normal conditions of the microorganism's existence, and environmental-oriented hydrophilic regions, capable of binding the Fc fragment of antibodies, which forms the basis of the natural biological defense of Staphilococcus aureus.
В искусственных условиях из раствора выделенного белка А на гидрофобной поверхности при определенных условиях формируется слой, в котором гидрофобные участки прилегают к подложке, а гидрофильные, как и в случае с микроорганизмом, обращены в раствор и способны эффективно связывать помещенные в раствор антитела. При этом активные группы антител также оказываются ориентированными в раствор, т.е. оптимальным для захвата антигенов образом. Этим объясняется тот факт, что на поверхностях с высокой гидрофобностью, например таких, как уголь [11], удается формировать эффективный аффинный слой из белка А и антител. Ковалентное закрепление слоя белка А на подложке не всегда позволяет добиться правильной ориентации молекул в слое, что отрицательно сказывается на эффективности последующего связывания антител.Under artificial conditions, a layer is formed from a solution of isolated protein A on a hydrophobic surface under certain conditions, in which the hydrophobic regions are adjacent to the substrate and the hydrophilic regions, as in the case of a microorganism, are turned into a solution and are able to efficiently bind antibodies placed in the solution. In this case, the active groups of antibodies also turn out to be solution oriented, i.e. optimal for capturing antigens. This explains the fact that it is possible to form an effective affinity layer of protein A and antibodies on surfaces with high hydrophobicity, such as coal [11]. The covalent attachment of the protein A layer to the substrate does not always allow the correct orientation of the molecules in the layer, which negatively affects the efficiency of subsequent antibody binding.
Недостатком адсорбированного слоя белка А является его низкая прочность. Для преодоления этого недостатка без потери правильной ориентации молекул белка в слое нами предлагается после адсорбции слоя на подложке произвести его внутреннюю химическую прошивку при помощи сшивающего агента, без химической пришивки к подложке. Затем на подготовленный таким образом слой адсорбируются антитела; полученная аффинная поверхность используется для проведения иммунологических анализов и может использоваться и в других перечисленных выше областях.The disadvantage of the adsorbed layer of protein A is its low strength. To overcome this disadvantage without losing the correct orientation of the protein molecules in the layer, we propose, after adsorption of the layer on the substrate, to carry out its internal chemical piercing with a crosslinking agent, without chemical sewing to the substrate. Then, antibodies are adsorbed onto the layer thus prepared; the resulting affinity surface is used for immunological analyzes and can be used in other areas listed above.
От методов, использующих адсорбированный на подложке белок А, предлагаемый способ отличается наличием процедуры химической прошивки слоя белка. От способов, использующих ковалентное связывание белка с носителем, в том числе используемого в патенте [11] - тем, что белок сшивается не с носителем, а используется внутренняя прошивка белка А. В способе, изложенном в [10], внутренняя химическая прошивка белка А применяется, но белок при этом используется в виде суспензии изолированных частиц, а не закреплен на плоской поверхности - носителе. В предлагаемом нами способе гидрофобный носитель не только составляет основу аффинной поверхности, но и обеспечивает правильную ориентацию молекул белка А, наиболее эффективную для иммобилизации антител.From the methods using protein A adsorbed on a substrate, the proposed method differs by the presence of a procedure for chemical flashing of the protein layer. From methods using covalent binding of a protein to a carrier, including that used in the patent [11], by the fact that the protein is not cross-linked with the carrier, but using the internal firmware of protein A. In the method described in [10], the internal chemical firmware of protein A It is used, but the protein is used in the form of a suspension of isolated particles, and is not fixed on a flat surface - the carrier. In our proposed method, a hydrophobic carrier not only forms the basis of the affinity surface, but also ensures the correct orientation of protein A molecules, which is most effective for immobilizing antibodies.
Несмотря на отсутствие ковалентных связей с подложкой, пленка прошитого белка А весьма прочно держится на ней, так как при попытке отрыва силы межмолекулярного сцепления Ван-дер-Ваальса действуют кооперативно. При необходимости пленка все-таки может быть отделена от подложки. При этом она сохраняет в отличие от случая с ковалентным закреплением на подложке свою целостность и может быть подвергнута дополнительным исследованиям (например, при помощи метода просвечивающей электронной микроскопии).Despite the absence of covalent bonds with the substrate, the film of cross-linked protein A is very firmly held on it, since when trying to break off the van der Waals intermolecular adhesion forces act cooperatively. If necessary, the film can still be separated from the substrate. Moreover, in contrast to the case with covalent attachment to the substrate, it retains its integrity and can be subjected to additional studies (for example, using transmission electron microscopy).
Способ разрабатывался в первую очередь для использования в исследованиях биологических объектов, закрепленных на аффинной поверхности, при помощи метода атомно-силовой микроскопии (АСМ). На фиг.1 показано полученное при помощи этого метода изображение слоя стафилококкового белка А, прошитого глутаровым альдегидом, на атомарно-гладкой поверхности графита. Размеры даны в микронах. Поверхность слоя ровная и однородная, что гарантирует низкий уровень помех при проведении исследований. На фиг.2 показано полученное при помощи сканирующего электронного микроскопа изображение пленки белка А, отделенной от подложки. Обращает на себя внимание то, что отделенная пленка сохраняет свою целостность и при необходимости может быть исследована и другими методами. На фиг.3 показаны бактерии E.coli, закрепленные на приготовленной при помощи предлагаемого способа аффинной поверхности, несущей специфичные в отношении данных бактерий антитела.The method was developed primarily for use in the study of biological objects mounted on an affinity surface using the atomic force microscopy (AFM) method. Figure 1 shows the image obtained using this method of a layer of staphylococcal protein A stitched with glutaraldehyde on an atomically smooth surface of graphite. Dimensions are given in microns. The surface of the layer is smooth and uniform, which guarantees a low level of interference during research. Figure 2 shows the image obtained with a scanning electron microscope image of a film of protein A, separated from the substrate. It is noteworthy that the separated film retains its integrity and, if necessary, can be investigated using other methods. Figure 3 shows the bacteria E. coli, mounted on prepared using the proposed method affinity surface that is specific for these bacteria antibodies.
Техническим результатом разработки данного способа является создание аффинных поверхностей, используемых для детектирования событий специфической сорбции при помощи современных методов микроскопии, а также позволяющих применять с этой целью и другие физические методы детектирования, в основе которых лежат поверхностные эффекты. Универсализация приготовления поверхностей позволяет исследовать один и тот же объект различными методами детектирования.The technical result of the development of this method is the creation of affine surfaces used to detect specific sorption events using modern microscopy methods, as well as allowing the use of other physical detection methods for this purpose, which are based on surface effects. The universalization of surface preparation allows one and the same object to be examined by various detection methods.
Пример 1Example 1
1. Белок А (лиофилизированный, полученный из Staphylococcus aureus) растворяют в дистиллированной воде до концентрации 1 мг/мл.1. Protein A (lyophilized, obtained from Staphylococcus aureus) is dissolved in distilled water to a concentration of 1 mg / ml.
2. Раствор наносят на свежеобновленную поверхность пластинки графита в количестве 3 мкл. Затем образец подсушивают на воздухе (под тягой) при комнатной температуре до полного высыхания в течение 2-4 часов.2. The solution is applied to a freshly renewed surface of a graphite plate in an amount of 3 μl. Then the sample is dried in air (under draft) at room temperature until completely dry for 2-4 hours.
3. На пятно белка наносят 1% раствора глутарового альдегида в дистиллированной воде, объемом 3 мкл; образец выдерживают во влажной атмосфере (в чашке Петри вместе с листком фильтровальной бумаги, смоченным водой) в течение 2 часов.3. A 1% solution of glutaraldehyde in distilled water, 3 μl; the sample is kept in a humid atmosphere (in a Petri dish with a piece of filter paper moistened with water) for 2 hours.
4. Пластинку промывают путем помещения на поверхность воды активным слоем вниз на 5 минут.4. The plate is washed by placing it on the water surface with the active layer down for 5 minutes.
5. После удаления остатков воды, но без дополнительного подсушивания, на поверхность пятна наносят 0,3 М буферный раствор Трис-HCl, рН=8,8 на 1 час.5. After removing residual water, but without additional drying, 0.3 M Tris-HCl buffer solution, pH = 8.8 for 1 hour, is applied to the spot surface.
6. После промывки аналогично п.4 на пятно наносят 3 мкл раствора антител (поликлональные антитела кроличьей сыворотки против Esherichia coli шт. К-12) на 30 минут, затем опять проводят промывку.6. After washing, similarly to item 4, 3 μl of antibody solution (polyclonal rabbit serum antibodies against Esherichia coli pcs. K-12) is applied to the stain for 30 minutes, then washing is carried out again.
7. На пятно наносят 3 мкл основного иммобилизуемого объекта (препарат Esherichia coli шт. К-12, концентрация 108 кл/мл) на 30 минут. После промывки образец высушивают под тягой в течение 2 часов и передают для исследований. Изображение, полученное при помощи атомно-силового микроскопа (Digital Instruments, 3А) представлено на фиг.3. Наблюдается связывание бактерий Esherichia coli шт. К-12 с поверхностью графита, покрытого слоем белка А и антителами, специфичными в отношении этих бактерий.7. Apply 3 μl of the main immobilized object (Esherichia coli preparation K-12, concentration 10 8 cells / ml) to the spot for 30 minutes. After washing, the sample is dried under draft for 2 hours and transferred for research. The image obtained using an atomic force microscope (Digital Instruments, 3A) is presented in Fig.3. Binding of bacteria Esherichia coli pcs. K-12 with a graphite surface coated with a layer of protein A and antibodies specific for these bacteria.
Пример 2Example 2
1. Белок А (лиофилизированный, полученный из Staphylococcus aureus) растворяют в дистиллированной воде до концентрации 1 мг/мл.1. Protein A (lyophilized, obtained from Staphylococcus aureus) is dissolved in distilled water to a concentration of 1 mg / ml.
2. Раствор наносят на свежеобновленную поверхность пластинки графита в количестве 3 мкл. Затем образец подсушивают на воздухе (под тягой) при комнатной температуре до полного высыхания в течение 2-4 часов.2. The solution is applied to a freshly renewed surface of a graphite plate in an amount of 3 μl. Then the sample is dried in air (under draft) at room temperature until completely dry for 2-4 hours.
3. На пятно белка наносят 1% раствора глутарового альдегида в дистиллированной воде, объемом 3 мкл; образец выдерживают во влажной атмосфере (в чашке Петри вместе с листком фильтровальной бумаги, смоченным водой) в течение 2 часов.3. A 1% solution of glutaraldehyde in distilled water, 3 μl; the sample is kept in a humid atmosphere (in a Petri dish with a piece of filter paper moistened with water) for 2 hours.
4. Пластинку промывают путем помещения на поверхность воды активным слоем вниз на 5 минут.4. The plate is washed by placing it on the water surface with the active layer down for 5 minutes.
5. После удаления остатков воды, но без дополнительного подсушивания на поверхность пятна наносят 0,5 М раствор глицина, рН=8,5 на 1 час.5. After removing residual water, but without additional drying, a 0.5 M glycine solution is applied to the stain surface, pH = 8.5 for 1 hour.
6. После промывки на пятно наносят 3 мкл раствора антител (моноклональные антитела, специфичные в отношении спор вакцинного штамма Bacillus anthracis СТИ, концентрация 0,1 мг/мл) на 30 минут, затем опять проводят промывку.6. After washing, 3 μl of antibody solution (monoclonal antibodies specific for spores of the vaccine strain of Bacillus anthracis STI, concentration 0.1 mg / ml) is applied to the spot for 30 minutes, then washing is carried out again.
7. На пятно наносят 3 мкл основного иммобилизуемого объекта (препарат спор СТИ, концентрация 109 спор/мл) на 30 минут; после промывки образец высушивается под тягой в течение 2 часов и передается для исследований. Наблюдается связывание спор СТИ с аффинной поверхностью в количестве более 100 шт. на площади 10×10 мкм.7. 3 μl of the main immobilized object (STI spore preparation, concentration 10 9 spores / ml) is applied to the stain for 30 minutes; after washing, the sample is dried under draft for 2 hours and transferred for research. There is a binding of STI spores to an affinity surface in an amount of more than 100 pcs. over an area of 10 × 10 microns.
Пример 3Example 3
1. Белок А (лиофилизированный, полученный из Staphylococcus aureus) растворяют в дистиллированной воде до концентрации 1 мг/мл.1. Protein A (lyophilized, obtained from Staphylococcus aureus) is dissolved in distilled water to a concentration of 1 mg / ml.
2. Раствор наносят на свежеобновленную поверхность пластинки графита в количестве 3 мкл. Затем образец подсушивают на воздухе (под тягой) при комнатной температуре до полного высыхания в течение 2-4 часов.2. The solution is applied to a freshly renewed surface of a graphite plate in an amount of 3 μl. Then the sample is dried in air (under draft) at room temperature until completely dry for 2-4 hours.
3. На пятно белка наносят 0,1% раствор диметилсуберимидата, рН=8,0 объемом 3 мкл. Образец выдерживают во влажной атмосфере в течение 2 часов.3. A 0.1% solution of dimethylsuberimidate, pH = 8.0 with a volume of 3 μl, is applied to the protein spot. The sample is kept in a humid atmosphere for 2 hours.
4. Пластинку промывают путем помещения на поверхность воды активным слоем вниз на 5 минут.4. The plate is washed by placing it on the water surface with the active layer down for 5 minutes.
5. После удаления остатков воды, но без дополнительного подсушивания на поверхность пятна наносят 0,05% раствор моноэтаноламина, рН=8,1 на 1 час.5. After removing residual water, but without additional drying, a 0.05% solution of monoethanolamine is applied to the stain surface, pH = 8.1 for 1 hour.
6. После промывки на пятно наносят 3 мкл раствора антител (моноклональные антитела против бактерий Legionella macdedi, концентрация 0,2 мг/мл) на 30 минут, затем опять промывают.6. After washing, 3 μl of antibody solution (monoclonal antibodies against bacteria Legionella macdedi, concentration 0.2 mg / ml) is applied to the spot for 30 minutes, then washed again.
7. Наносят 3 мкл основного иммобилизуемого объекта (препарат бактерий Legionella macdedi, концентрация 5·107 кл/мл) на 30 минут; после промывки образец высушивается под тягой в течение 2 часов и передают для исследований. Наблюдается связывание бактерий Legionella macdedi с поверхностью, несущей антитела, специфичные в отношении данных бактерий, в количестве более 30 бактерий на площади 25×25 мкм.7. Apply 3 μl of the main immobilized object (preparation of bacteria Legionella macdedi, concentration 5 · 10 7 cells / ml) for 30 minutes; after washing, the sample is dried under draft for 2 hours and transferred for research. Binding of Legionella macdedi bacteria to a surface carrying antibodies specific for these bacteria in an amount of more than 30 bacteria over an area of 25 × 25 μm is observed.
Список используемой литературыBibliography
1. Патент США 5861319.1. US patent 5861319.
2. Патент США 6379908.2. US patent 6379908.
3. Патент США 6376204.3. US patent 6376204.
4. Патент США 6221581.4. US patent 6221581.
5. Патент США 5898005.5. US patent 5898005.
6. Патент США 6121056.6. US patent 6121056.
7. Патент США 5753227.7. US patent 5753227.
8. Патент США 4614513.8. US patent 4614513.
9. Патент США 4681870.9. US patent 4681870.
10. Патент США 6447777.10. US patent 6447777.
11. Патент США 5091091.11. US patent 5091091.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2004103843/13A RU2261279C1 (en) | 2004-02-10 | 2004-02-10 | Method for preparing affinity surface based on chemically cross- linked protein a |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2004103843/13A RU2261279C1 (en) | 2004-02-10 | 2004-02-10 | Method for preparing affinity surface based on chemically cross- linked protein a |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2004103843A RU2004103843A (en) | 2005-07-27 |
| RU2261279C1 true RU2261279C1 (en) | 2005-09-27 |
Family
ID=35843124
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2004103843/13A RU2261279C1 (en) | 2004-02-10 | 2004-02-10 | Method for preparing affinity surface based on chemically cross- linked protein a |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2261279C1 (en) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5091091A (en) * | 1981-11-06 | 1992-02-25 | Terman David S | Protein A perfusion and post perfusion drug infusion |
| RU2123860C1 (en) * | 1995-06-28 | 1998-12-27 | Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.Пастера | Affine sorbent for removal of tumor necrosis factor and method of its preparing |
| US6447777B1 (en) * | 1996-03-29 | 2002-09-10 | David S. Terman | Polymerized staphylococcal protein a for treatment of diseases |
-
2004
- 2004-02-10 RU RU2004103843/13A patent/RU2261279C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5091091A (en) * | 1981-11-06 | 1992-02-25 | Terman David S | Protein A perfusion and post perfusion drug infusion |
| RU2123860C1 (en) * | 1995-06-28 | 1998-12-27 | Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.Пастера | Affine sorbent for removal of tumor necrosis factor and method of its preparing |
| US6447777B1 (en) * | 1996-03-29 | 2002-09-10 | David S. Terman | Polymerized staphylococcal protein a for treatment of diseases |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2004103843A (en) | 2005-07-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4657873A (en) | Preactivated plastics surfaces for immobilizing organo-chemical and biologic materials | |
| JP3741719B2 (en) | Method for aligning polymers by movement of meniscus and use thereof | |
| US7727710B2 (en) | Materials, methods, and kits for reducing nonspecific binding of molecules to a surface | |
| JPH03500457A (en) | Modified glass supports for peptide and protein sequencing | |
| JP4443764B2 (en) | Method for immobilizing biological molecules on a support surface | |
| JP5388462B2 (en) | Carrier and production method thereof | |
| JP5026070B2 (en) | Polymer particles | |
| CN103333299B (en) | Glycidyl methacrylate and PEG alkylmethacrylate polymer microballoon and its preparation method and application | |
| JP4197279B2 (en) | Biologically-derived substance detection substrate and manufacturing method thereof | |
| JP2708590B2 (en) | Enzyme membrane, ELISA membrane, sensor membrane with immobilized biologically active molecules | |
| RU2261279C1 (en) | Method for preparing affinity surface based on chemically cross- linked protein a | |
| CN101166693B (en) | Structure, porous body, sensor, and method for manufacturing structure, and method for detecting specimen | |
| JPS6155415B2 (en) | ||
| Turkova | Affinity chromatography | |
| KR101311736B1 (en) | Sandwich immunoassay Biochip and immunoassay method using the same | |
| CN114660283B (en) | Immunoassay plate type chip based on electrical acceleration and preparation method thereof | |
| CN108663523A (en) | It can be used for diagnosing the kit of human enterovirus 71 infection | |
| KR101971246B1 (en) | Biosensor comprising coating layer modified with polydopamine and protein G mixture and method for detecting biological material using the same | |
| RU2420580C2 (en) | Method of water-soluble active protein conversion in hydrophobic active proteins, their application for producing monomolecular layers of oriented active proteins, and devices comprising water-soluble active proteins converted to hydrophobic active proteins | |
| US20070287828A1 (en) | Compositions and Methods for the Reversible Capture of Biomolecules | |
| JP2008044917A (en) | Protein immobilization method | |
| Shlyapnikov et al. | Rapid detection of femtogram amounts of protein by gel-free immunoblot | |
| CN108663517A (en) | It can be used for diagnosing the kit of human enterovirus infection | |
| JPH0894621A (en) | Antibody detection material and antibody detection method using it | |
| CN1410545A (en) | Microarray chip used for cell or microorganism detection and its preparation method |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20090211 |