RU2260598C2 - Peptide eliciting capacity to inhibit migration of monocytic cells stimulated by protein mcp-1 - Google Patents
Peptide eliciting capacity to inhibit migration of monocytic cells stimulated by protein mcp-1 Download PDFInfo
- Publication number
- RU2260598C2 RU2260598C2 RU2003131626/04A RU2003131626A RU2260598C2 RU 2260598 C2 RU2260598 C2 RU 2260598C2 RU 2003131626/04 A RU2003131626/04 A RU 2003131626/04A RU 2003131626 A RU2003131626 A RU 2003131626A RU 2260598 C2 RU2260598 C2 RU 2260598C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- peptide
- mcp
- migration
- cells
- cells stimulated
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 50
- 230000005012 migration Effects 0.000 title description 15
- 238000013508 migration Methods 0.000 title description 15
- 101100504320 Caenorhabditis elegans mcp-1 gene Proteins 0.000 title 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 4
- 101710155857 C-C motif chemokine 2 Proteins 0.000 abstract description 22
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 11
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 abstract description 6
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 abstract description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 230000004899 motility Effects 0.000 abstract description 2
- 208000037803 restenosis Diseases 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 102100021943 C-C motif chemokine 2 Human genes 0.000 abstract 1
- 238000002399 angioplasty Methods 0.000 abstract 1
- 230000007721 medicinal effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 abstract 1
- 102000000018 Chemokine CCL2 Human genes 0.000 description 25
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 20
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 14
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 14
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 8
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 7
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 7
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 6
- -1 9-fluorenylmethoxycarbonyl Chemical group 0.000 description 5
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N N-Methylpyrrolidone Chemical compound CN1CCCC1=O SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 3
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 3
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 3
- 230000004224 protection Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 2
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N Styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1 PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 239000002975 chemoattractant Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 2
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 2
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 125000001151 peptidyl group Chemical group 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- FDKXTQMXEQVLRF-ZHACJKMWSA-N (E)-dacarbazine Chemical compound CN(C)\N=N\c1[nH]cnc1C(N)=O FDKXTQMXEQVLRF-ZHACJKMWSA-N 0.000 description 1
- BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 1,3-diisopropylcarbodiimide Chemical compound CC(C)N=C=NC(C)C BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- YEDUAINPPJYDJZ-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxybenzothiazole Chemical compound C1=CC=C2SC(O)=NC2=C1 YEDUAINPPJYDJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NALREUIWICQLPS-UHFFFAOYSA-N 7-imino-n,n-dimethylphenothiazin-3-amine;hydrochloride Chemical compound [Cl-].C1=C(N)C=C2SC3=CC(=[N+](C)C)C=CC3=NC2=C1 NALREUIWICQLPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 208000037260 Atherosclerotic Plaque Diseases 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 102000009410 Chemokine receptor Human genes 0.000 description 1
- 108050000299 Chemokine receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000897480 Homo sapiens C-C motif chemokine 2 Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710093543 Probable non-specific lipid-transfer protein Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 1
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001510 aspartic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000036523 atherogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 150000003857 carboxamides Chemical group 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000009087 cell motility Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000007887 coronary angioplasty Methods 0.000 description 1
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 150000002307 glutamic acids Chemical class 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N guanidine group Chemical group NC(=N)N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 102000046768 human CCL2 Human genes 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 description 1
- 238000004989 laser desorption mass spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008752 local inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000001906 matrix-assisted laser desorption--ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000001617 migratory effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- GEUFMGZEFYJAEJ-UHFFFAOYSA-N tris(2-methylpropyl)silicon Chemical compound CC(C)C[Si](CC(C)C)CC(C)C GEUFMGZEFYJAEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 230000025033 vasoconstriction Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
Предлагаемое изобретение относится к биологически активным пептидам и белкам, способным ингибировать подвижность клеток, стимулированную хемокином МСР-1, а также к лекарственным средствам на их основе. The present invention relates to biologically active peptides and proteins capable of inhibiting cell motility stimulated by the chemokine MCP-1, as well as to drugs based on them.
Известно, что при непосредственном участии хемотаксических цитокинов - хемокинов в организме осуществляется привлечение лейкоцитов в участки воспаления, их активация и дифференцировка. Кроме того, известно, что воспаление является неотъемлемым компонентом многих патологических состояний, таких как онкогенез, атеросклероз, аутоиммунные заболевания, болезнь Альцгеймера и др. [1]. Хемокины - это семейство небольших по массе основных белков (8-12 кДа), действие которых осуществляется через специальные хемокиновые рецепторы. Установлено, что в патогенезе атеросклероза ведущая роль принадлежит хемокину МСР-1 (monocyte chemoattractant protein-1), который экспрессируется макрофагами, гладкомышечными и эндотелиальными клетками стенки сосуда [2]. Ниже представлена аминокислотная последовательность МСР-1 человека:It is known that with the direct participation of chemotactic cytokines - chemokines in the body, leukocytes are attracted to the sites of inflammation, their activation and differentiation. In addition, it is known that inflammation is an integral component of many pathological conditions, such as oncogenesis, atherosclerosis, autoimmune diseases, Alzheimer's disease, etc. [1]. Chemokines are a family of low-mass basic proteins (8-12 kDa), the action of which is via special chemokine receptors. It has been established that the leading role in the pathogenesis of atherosclerosis belongs to the chemokine MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1), which is expressed by macrophages, smooth muscle and endothelial cells of the vessel wall [2]. The following is the amino acid sequence of human MCP-1:
Присутствие в атеросклеротической бляшке моноцитов/макрофагов и Т-клеток свидетельствует о развитии локального воспалительного процесса в сосудистой стенке [3]. Значительная роль МСР-1 в развитии воспаления и, в частности, в атерогенезе [4] вызвала необходимость синтеза ингибиторов МСР-1.The presence of monocytes / macrophages and T cells in the atherosclerotic plaque indicates the development of a local inflammatory process in the vascular wall [3]. The significant role of MCP-1 in the development of inflammation and, in particular, in atherogenesis [4] necessitated the synthesis of MCP-1 inhibitors.
Известны вещества непептидной (пиринидилимидазольной) природы, тормозящие миграцию моноцитарных клеток посредством блокирования некоторых звеньев внутриклеточной сигнализации [5], вследствие чего в отличие от пептидов препараты такого класса часто являются токсичными.Substances of a non-peptide (pyrinidilimidazole) nature are known that inhibit the migration of monocytic cells by blocking some units of intracellular signaling [5], as a result of which, in contrast to peptides, drugs of this class are often toxic.
Известно [6], что пептид последовательности 51-62 МСР-1 (Н-EICADPKQKWVQ-OH) ингибирует миграцию моноцитов крови человека и клеток моноцитарной линии ТНР-1, стимулированных хемокинами, и не оказывает влияния на миграцию клеток, вызванную хемоаттрактантами нехимокиновой природы.It is known [6] that the peptide of sequence 51-62 MCP-1 (H-EICADPKQKWVQ-OH) inhibits the migration of human blood monocytes and cells of the THP-1 monocytic line stimulated by chemokines and does not affect cell migration caused by chemoattractants of non-chemokine nature.
Известно, что аналог пептида последовательности 51-62 МСР-1 с заменой аланина на лейцин в положении 4 и валина на изолейцин в положении 11: H-EICLDPKQKWIQ-OH в 3-4 раза более активен, чем пептид 51-62 МСР-1, и согласно Reckless и Grainger [6] является лучшим кандидатом для проявления ингибирующей активности in vivo. It is known that the analogue of the peptide of sequence 51-62 MCP-1 with the replacement of alanine with leucine at position 4 and valine with isoleucine at position 11: H-EICLDPKQKWIQ-OH is 3-4 times more active than peptide 51-62 MCP-1, and according to Reckless and Grainger [6], it is the best candidate for in vivo inhibitory activity.
Известен также пептид следующей структуры [7]:A peptide of the following structure is also known [7]:
Недостатками прототипа являются сложность синтеза, обусловленная наличием дисульфидной связи в составе структуры пептида, что, как правило, приводит к уменьшению выхода целевого продукта за счет стадии циклизации, а также дороговизна синтеза (все аминокислоты, входящие в состав этого пептида D-конфигурации, что в несколько раз увеличивает стоимость исходных продуктов для синтеза этого пептида по сравнению с аналогичными пептидами, состоящими из остатков L-аминокислот).The disadvantages of the prototype are the complexity of the synthesis, due to the presence of a disulfide bond in the structure of the peptide, which, as a rule, leads to a decrease in the yield of the target product due to the cyclization stage, as well as the high cost of synthesis (all amino acids that make up this peptide of the D configuration, which several times increases the cost of the starting products for the synthesis of this peptide compared to similar peptides consisting of residues of L-amino acids).
Известно также, что С-концевая область хемокина МСР-1 не имеет функционального значения в стимуляции клеточной миграции [8, 9] и пептиды из этой области не конкурируют с меченым МСР-1 при взамодействии с рецепторами ТНР-1 клеток [10].It is also known that the C-terminal region of the MCP-1 chemokine does not have functional significance in stimulating cell migration [8, 9] and peptides from this region do not compete with labeled MCP-1 when interacting with THP-1 receptors of cells [10].
Задачей, стоящей перед авторами настоящего изобретения, явился поиск и синтез пептидов, ингибирующих МСР-1-стимулированную миграцию моноцитарных клеток, причем синтез таких пептидов должен быть значительно проще и дешевле по сравнению с синтезом пептида-прототипа. Актуальность такого исследования связана, в частности, с поиском соединений для покрытия стентов, используемых при коронарной ангиопластике у больных с ишемической болезнью сердца для предупреждения развития рестенозов (повторного сужения сосудов).The challenge facing the authors of the present invention was the search and synthesis of peptides that inhibit MCP-1-stimulated migration of monocytic cells, and the synthesis of such peptides should be much simpler and cheaper compared to the synthesis of the prototype peptide. The relevance of this study is associated, in particular, with the search for compounds to cover stents used in coronary angioplasty in patients with coronary heart disease to prevent the development of restenosis (repeated narrowing of blood vessels).
Поставленная задача решается путем синтеза пептида формулы: Н-DHLDKQTQTPKT-OH или его фармацевтически приемлемых солей. В структуре заявляемого пептида по сравнению с прототипом отсутствует дисульфидная связь, что всегда упрощает синтез и очистку целевого продукта. Заявляемый пептид содержит одинаковое с прототипом количество аминокислотных остатков - 12, но все они - L-конфигурации, благодаря чему затраты на синтез уменьшаются в несколько раз, поскольку D-аминокислиты гораздо дороже L-аминокислот.The problem is solved by synthesis of a peptide of the formula: H-DHLDKQTQTPKT-OH or its pharmaceutically acceptable salts. In the structure of the claimed peptide in comparison with the prototype there is no disulfide bond, which always simplifies the synthesis and purification of the target product. The inventive peptide contains the same amount of amino acid residues as the prototype — 12, but all of them are L-configurations, due to which synthesis costs are reduced several times, since D-amino acids are much more expensive than L-amino acids.
Неочевидность изобретения обусловлена тем, что поставленная задача решается путем синтеза пептида последовательности 66-76 МСР-1 из С-концевой части молекулы МСР-1, хотя из литературы известно, что С-концевая область хемокина МСР-1 не имеет функционального значения в стимуляции клеточной миграции [8.9] и пептиды из этой области не конкурируют с меченым МСР-1 при взамодействии с рецепторами ТНР-1 клеток [10]. Таким образом, из литературных данных не следовало, что поиск пептидных ингибиторов МСР-1 стимулированной подвижности моноцитарых клеток из С-концевой части молекулы МСР-1 может привести к желаемым результатам. Заявляемый пептид нетоксичен, поскольку является фрагментом эндогенного белка МСР-1.The non-obviousness of the invention is due to the fact that the task is solved by synthesizing a peptide of sequence 66-76 MCP-1 from the C-terminal part of the MCP-1 molecule, although it is known from the literature that the C-terminal region of the MCP-1 chemokine does not have a functional value in stimulating cell migration [8.9] and peptides from this region do not compete with labeled MCP-1 when interacting with THP-1 cell receptors [10]. Thus, it did not follow from the literature that the search for peptide inhibitors of MCP-1 stimulated motility of monocytic cells from the C-terminal part of the MCP-1 molecule can lead to the desired results. The inventive peptide is non-toxic, as it is a fragment of the endogenous protein MCP-1.
Следует отметить, что наряду с заявляемым пептидом подобной ингибирующей активностью могут обладать и его аналоги общей формулы: X1-DHLDKQTQTPKT-X2, или их фармацевтически приемлемые соли, или их эфиры, или амиды, где X1-H, низший ацил или X1 содержит один или несколько аминокислотных остатков, причем аминокислоты выбраны из алифатической, ароматической или гетероциклической групп, Х2-ОН, либо - NH2, или содержит один или несколько аминокислотных остатков, причем аминокислоты выбраны из алифатической, ароматической или гетероциклической групп. Так, в литературе [10] имеются данные о том, что амидирование фрагментов МСР-1 усиливает их активность.It should be noted that, along with the claimed peptide, similar inhibitors of the general formula: X 1 -DHLDKQTQTPKT-X 2 , or their pharmaceutically acceptable salts, or their esters, or amides, where X 1 -H, lower acyl or X, can possess similar inhibitory activity 1 contains one or more amino acid residues, the amino acids selected from aliphatic, aromatic or heterocyclic groups, X 2 —OH, or —NH 2 , or contains one or more amino acid residues, the amino acids selected from aliphatic, aromatic or heterocyclic groups. So, in the literature [10] there is evidence that the amidation of fragments of MCP-1 enhances their activity.
В структуре заявляемого пептида по сравнению с прототипом отсутствует дисульфидная связь, что всегда упрощает синтез и очистку целевого продукта. Заявляемый пептид содержит одинаковое с прототипом количество аминокислотных остатков - 12, но все они - L-конфигурации, благодаря чему затраты на синтез пептида уменьшаются в несколько раз, поскольку D-аминокислоты гораздо дороже L-аминокислот.In the structure of the claimed peptide in comparison with the prototype there is no disulfide bond, which always simplifies the synthesis and purification of the target product. The inventive peptide contains the same amount of amino acid residues as the prototype — 12, but all of them are L-configurations, due to which the costs of peptide synthesis are reduced by several times, since D-amino acids are much more expensive than L-amino acids.
Синтез заявляемого пептида осуществляется по стандартной технологии пептидного синтеза на твердой фазе [11] с применением Fmoc-(9-флуоренилметоксикарбонил)-технологии. В качестве нерастворимого носителя использовали сополимер стирола с 1% дивинилбензола с кислотолабильными якорными группами. Для блокирования функциональных групп боковых цепей аминокислот применяли следующие защиты: трет-бутильную для карбоксильных групп аспарагиновой и глутаминовой кислот и гидроксильных функций серина и треонина; трет-бутилоксикарбонильную (Boc) - защиту для ε-аминогруппы лизина; 2, 2, 5, 7, 8-пентаметилхроман-6-сульфонильную (Pmc) - защиту для гуанидиновой функции аргинина; третильную (Trt) - группу для карбоксамидной функции глутамина. Пептидную цепь наращивали по одной аминокислоте, начиная синтез с С-конца. Для создания амидных связей использовали N,N' - диизопропилкарбодиимид в присутствии 1- гидроксибензотриазола (DIC/HOBt-метод). Для заключительного деблокирования и отщепления пептидов от носителя применяли трифторуксусную кислоту со скэвенджерами. Сырой продукт твердофазного синтеза очищали с использованием препаративной ВЭЖХ.The synthesis of the claimed peptide is carried out according to the standard technology of peptide synthesis on the solid phase [11] using the Fmoc- (9-fluorenylmethoxycarbonyl) technology. A copolymer of styrene with 1% divinylbenzene with acid labile anchor groups was used as an insoluble carrier. The following protections were used to block the functional groups of the amino acid side chains: tert-butyl for the carboxyl groups of aspartic and glutamic acids and the hydroxyl functions of serine and threonine; tert-butyloxycarbonyl (Boc) - protection for the ε-amino group of lysine; 2, 2, 5, 7, 8-pentamethylchroman-6-sulfonyl (Pmc) - protection for guanidine function of arginine; tertiary (Trt) is a group for the carboxamide function of glutamine. The peptide chain was increased by one amino acid, starting synthesis from the C-terminus. To create amide bonds, N, N '- diisopropylcarbodiimide was used in the presence of 1-hydroxybenzotriazole (DIC / HOBt method). Trifluoroacetic acid with scavengers was used for the final release and cleavage of the peptides from the carrier. The crude solid phase synthesis product was purified using preparative HPLC.
Пример 1. Синтез пептида H-DHLDKQTQTPKT-OH. Пептид синтезировали по стандартной программе для однократной конденсации Fmoc-аминокислот. Согласно этой программе синтетический цикл включал 20-минутную активацию 1 ммоль присоединяемой аминокислоты в присутствии эквивалентных количеств DIC и НОВТ в NMP (N-метилпирролидоне), деблокирование α-аминогрупп 20% раствором пиперидина в NMP в течение 20 мин, конденсацию с 1 ммоль (4-кратным избытком) ацилирующего агента в NMP в течение 37 мин и все необходимые промежуточные промывки пептидилполимера. Example 1. The synthesis of the peptide H-DHLDKQTQTPKT-OH. The peptide was synthesized according to the standard program for a single condensation of Fmoc amino acids. According to this program, the synthetic cycle included a 20-minute activation of 1 mmol of the attached amino acid in the presence of equivalent amounts of DIC and HOBT in NMP (N-methylpyrrolidone), the release of α-amino groups with a 20% solution of piperidine in NMP for 20 minutes, condensation with 1 mmol (4 -fold excess) of the acylating agent in NMP for 37 min and all necessary intermediate washes of the peptidyl polymer.
Для заключительного деблокирования и отщепления пептида от носителя пептидилполимеры суспендировали в 10 мл деблокирующей смеси: трифторуксусная кислота (TFA) - фенол - триизобутилсилан (TIBS) - тиоанизол - 1,2-этандитиол (EDT) (8.25: 0.5: 0.5: 0.5: 0.25) и перемешивали при 20°С 2 ч. Смолу отфильтровывали, промывали TFA (2×1 мл), фильтрат упаривали до объема 3-5 мл и прибавляли 100 мл сухого эфира или этилацетата. Осадок отфильтровывали, промывали эфиром и этилацетатом, сушили.For the final release and cleavage of the peptide from the carrier, the peptidyl polymers were suspended in 10 ml of the unlocking mixture: trifluoroacetic acid (TFA) - phenol - triisobutylsilane (TIBS) - thioanisole - 1,2-ethanedithiol (EDT) (8.25: 0.5: 0.5: 0.5: 0.25) and stirred at 20 ° C for 2 hours. The resin was filtered off, washed with TFA (2 × 1 ml), the filtrate was evaporated to a volume of 3-5 ml and 100 ml of dry ether or ethyl acetate was added. The precipitate was filtered off, washed with ether and ethyl acetate, and dried.
Очистка пептида. Полученный сырой продукт растворяли в 5-10% уксусной кислоте (АсОН) и хроматографировали на колонке (25×250 мм) с Диасорбом-130Т C16, 10 мкм. Элюцию проводили градиентом концентрации (0.5% в минуту) СН3CN в 0.01М ацетате аммония, рН 4.5 со скоростью потока 12 мл/мин. Фракции, соответствующие целевому продукту, объединяли, упаривали, остаток растворяли в воде и лиофилизовали. Чистота полученного продукта - 96% по данным высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Выход в расчете на стартовую аминокислоту составил 46%. Для C59P98N18O22 найдено: MALDI-MS (масс-спектрометрия с лазерной десорбцией): m/z [М+Н]+ 1411,7, вычислено [М+Н]+ 1411,5. Структура полученного соединения подтверждена спектром ядерного магнитного резонанса (1Н-ЯМР).Purification of the peptide. The resulting crude product was dissolved in 5-10% acetic acid (AcOH) and chromatographed on a column (25 × 250 mm) with Diasorb-130T C 16 , 10 μm. Elution was carried out with a concentration gradient (0.5% per minute) of CH 3 CN in 0.01 M ammonium acetate, pH 4.5 with a flow rate of 12 ml / min. The fractions corresponding to the target product were combined, evaporated, the residue was dissolved in water and lyophilized. The purity of the obtained product is 96% according to high performance liquid chromatography (HPLC). The yield per starting amino acid was 46%. For C 59 P 98 N 18 O 22 found: MALDI-MS (laser desorption mass spectrometry): m / z [M + H] + 1411.7, calculated [M + H] + 1411.5. The structure of the obtained compound was confirmed by a nuclear magnetic resonance spectrum ( 1 H-NMR).
Тестирование синтезированного пептида проводилось по оценке его влияния на миграцию промоноцитарных клеток линии ТНР-1 и моноцитов периферической крови человека, стимулированную МСР-1.Testing of the synthesized peptide was carried out to assess its effect on the migration of promonocytic cells of the THP-1 line and monocytes of human peripheral blood, stimulated by MCP-1.
Пример 2. Определение миграционной способности клеток. Миграционную способность клеток оценивали, используя камеру Бойдена [12]. В нижние ячейки камеры Бойдена помещали раствор МСР-1, 50-100 нг/мл, в верхние ячейки камеры вносили по 50 мкл суспензии клеток. Верхние и нижние ячейки разделяли поликарбонатной мембраной с размером пор 5 мкм (для оценки миграции моноцитов) и 8 мкм (для оценки миграции клеток ТНР-1). Камеру переносили в СО2-инкубатор на 1 час (при исследовании миграции моноцитов) или на 3 часа (при изучении миграции клеток ТНР-1). Непромигрировавшие клетки счищали, клетки, оставшиеся на фильтре, фиксировали в метаноле 5 мин и окрашивали красителем Гимза. Мембрану с прокрашенными клетками сканировали на сканере HP ScanJet 5300С и обсчитывали при помощи программы SigmaGel. Данные представляли в относительных единицах, представляющих отношение клеточной миграции в опыте к контрольной величине, полученной при оценке миграции клеток, прошедших сквозь фильтр в отсутствии хемоаттрактанта.Example 2. Determination of the migratory ability of cells. Migration ability of cells was evaluated using a Boyden chamber [12]. A solution of MCP-1, 50-100 ng / ml, was placed in the lower cells of the Boyden chamber, 50 μl of cell suspension was added to the upper cells of the chamber. The upper and lower cells were separated by a polycarbonate membrane with a pore size of 5 μm (to assess the migration of monocytes) and 8 μm (to assess the migration of THP-1 cells). The camera was transferred to a CO 2 incubator for 1 hour (when studying the migration of monocytes) or for 3 hours (when studying the migration of THP-1 cells). Non-migrating cells were cleaned, the cells remaining on the filter were fixed in methanol for 5 min and stained with Giemsa stain. The stained cell membrane was scanned on an HP ScanJet 5300C scanner and counted using the SigmaGel program. Data were presented in relative units, representing the ratio of cell migration in the experiment to the control value obtained by evaluating the migration of cells that passed through the filter in the absence of a chemoattractant.
Пептид растворяли в бидистиллированной Н2О в концентрации 10 мМ и добавляли как в клеточную суспензию перед внесением в микрокамеру, так и в нижние ячейки микрокамеры. Конечная концентрация пептидов составляла 100 мкМ. Достоверность различий в данных по миграции клеток оценивали с помощью t-критерия Стьюдента.The peptide was dissolved in bidistilled H 2 O at a concentration of 10 mM and added both to the cell suspension before entering the microcamera and to the lower cells of the microcamera. The final concentration of peptides was 100 μM. The significance of differences in cell migration data was evaluated using Student's t-test.
Было показано, что заявляемый пептид ингибировал МСР-1-опосредованную миграцию клеток ТНР-1 на 30±5%, в то время как пептид-прототип ингибировал МСР-1-опосредованную миграцию клеток ТНР-1 на 15±5%. Было показано также, что заявляемый пептид ингибировал миграцию моноцитов в условиях модели in vitro на 21±5%, в то время как пептид-прототип ингибировал миграцию моноцитов в условиях модели in vitro на 32±7%. Эти данные свидетельствуют о сходном ингибирующем влиянии заявляемого пептида и прототипа. Полученные данные проиллюстрированы на приведенном чертеже.It was shown that the claimed peptide inhibited MCP-1-mediated migration of THP-1 cells by 30 ± 5%, while the prototype peptide inhibited MCP-1-mediated migration of THP-1 cells by 15 ± 5%. It was also shown that the claimed peptide inhibited the migration of monocytes in the in vitro model by 21 ± 5%, while the prototype peptide inhibited the migration of monocytes in the in vitro model by 32 ± 7%. These data indicate a similar inhibitory effect of the claimed peptide and prototype. The data obtained are illustrated in the drawing.
Заявляемый пептид нетоксичен, поскольку является фрагментом эндогенного белка МСР-1.The inventive peptide is non-toxic, as it is a fragment of the endogenous protein MCP-1.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫLIST OF REFERENCES
1. Baggiolini M. //Nature. 1998. V.392. P. 565-568.1. Baggiolini M. // Nature. 1998. V.392. P. 565-568.
2. Libby P. //J. Intern. Med. 2000. V.247. P.349-358.2. Libby P. // J. Intern. Med. 2000. V.247. P.349-358.
3. Ross R. // Am Heart J. 1999. V.138. P. 419-420.3. Ross R. // Am Heart J. 1999. V.138. P. 419-420.
4. Rollins B.L. // Blood. 1997. V.90. P.909-928.4. Rollins B.L. // Blood. 1997. V.90. P.909-928.
5. Lee J.C. // Immunophatology. 2000. V. 47. P. 185-201.5. Lee J.C. // Immunophatology. 2000.V. 47.P. 185-201.
6. Reckleess J., Grainger D. J. II Biochem. J. 1999. V. 340. P. 803-Gong J.-H., Clark-Levis I. // J Exp.Med. 1995. V 181. P. 631-640.6. Reckleess J., Grainger D. J. II Biochem. J. 1999. V. 340. P. 803-Gong J.-H., Clark-Levis I. // J Exp.Med. 1995. V 181. P. 631-640.
7. Reckleess J., Tatalick L. M., Grainger D. J. // Immunology. 2001. V. 103. P. 1-17.7. Reckleess J., Tatalick L. M., Grainger D. J. // Immunology. 2001. V. 103. P. 1-17.
8. Нап К.Н., Green S.R., Tangirala R.K., Tanaka S., Quenhenberger O. // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 32055-32062.8. Nap K.N., Green S.R., Tangirala R.K., Tanaka S., Quenhenberger O. // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 32055-32062.
9. Jarnagin К., Grunherger D., Mulkins M., Wong В., Hemmerich S., Paavola C; Bloom A., Bhakta S., Diehl F., Freedman R., McCarley D., Polsky I., Ping-Tsou A., Kosaka A., Handel T.M. // Biochemistry. 1999. V.38. P. 16167-16177.9. Jarnagin K., Grunherger D., Mulkins M., Wong B., Hemmerich S., Paavola C; Bloom A., Bhakta S., Diehl F., Freedman R., McCarley D., Polsky I., Ping-Tsou A., Kosaka A., Handel T.M. // Biochemistry. 1999. V.38. P. 16167-16177.
10. Steitz S.A.. Hasegava K., Chiang S.-L., Coob R.R., Castro MA, Lobl T.J\ Yamada M., Lazarides E., Cardarelli HP.M. //FEBS Letters. 1998. V.430. P. 158-164.10. Steitz S.A .. Hasegava K., Chiang S.-L., Coob R.R., Castro MA, Lobl T.J. \ Yamada M., Lazarides E., Cardarelli HP.M. // FEBS Letters. 1998. V.430. P. 158-164.
11. Neimark J. and Brian J. P.// Peptide Research. 1993. V/6. P 216.11. Neimark J. and Brian J. P. // Peptide Research. 1993. V / 6. P 216
12. Valente A.J., Rozek M.M., Schwartz C.J., Graves D.T. //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991. V. 176. P. 309-314.12. Valente A.J., Rozek M.M., Schwartz C.J., Graves D.T. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991. V. 176. P. 309-314.
13. Falk W., Goodwin R. H. Jr., Leonard E.J. // J. Immunol. Methods. 1980. V. 33. P.239-247.13. Falk W., Goodwin R. H. Jr., Leonard E.J. // J. Immunol. Methods 1980. V. 33. P.239-247.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2003131626/04A RU2260598C2 (en) | 2003-10-29 | 2003-10-29 | Peptide eliciting capacity to inhibit migration of monocytic cells stimulated by protein mcp-1 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2003131626/04A RU2260598C2 (en) | 2003-10-29 | 2003-10-29 | Peptide eliciting capacity to inhibit migration of monocytic cells stimulated by protein mcp-1 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2003131626A RU2003131626A (en) | 2005-05-10 |
| RU2260598C2 true RU2260598C2 (en) | 2005-09-20 |
Family
ID=35746296
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2003131626/04A RU2260598C2 (en) | 2003-10-29 | 2003-10-29 | Peptide eliciting capacity to inhibit migration of monocytic cells stimulated by protein mcp-1 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2260598C2 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2340626C1 (en) * | 2007-07-10 | 2008-12-10 | Федеральное государственное учреждение "Российский кардиологический научно-производственный комплекс Росмедтехнологий" (ФГУ "РКНПК Росмедтехнологий") | Method of obtaining dodecapeptide and tripeptide for its realisation |
| RU2827765C2 (en) * | 2022-06-02 | 2024-10-01 | Общество с ограниченной ответственностью "ЦитоНИР" (ООО "ЦитоНИР") | Peptide drug |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995009232A2 (en) * | 1993-09-28 | 1995-04-06 | Diane Van Alstyne | Peptides representing epitopic sites for bacterial and viral meningitis causing agents and their cns carrier, antibodies thereto, and uses thereof |
| RU2194054C2 (en) * | 1996-01-18 | 2002-12-10 | Стено Рисерч Груп А/С | Synthetic analogs of il-10 |
| RU2214417C2 (en) * | 1997-04-11 | 2003-10-20 | Сэнгстат Медикал Корпорейшн | Cytomodulating lipophilic peptides for modulation of immune system activity and suppression of inflammation |
-
2003
- 2003-10-29 RU RU2003131626/04A patent/RU2260598C2/en active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995009232A2 (en) * | 1993-09-28 | 1995-04-06 | Diane Van Alstyne | Peptides representing epitopic sites for bacterial and viral meningitis causing agents and their cns carrier, antibodies thereto, and uses thereof |
| RU2194054C2 (en) * | 1996-01-18 | 2002-12-10 | Стено Рисерч Груп А/С | Synthetic analogs of il-10 |
| RU2214417C2 (en) * | 1997-04-11 | 2003-10-20 | Сэнгстат Медикал Корпорейшн | Cytomodulating lipophilic peptides for modulation of immune system activity and suppression of inflammation |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2340626C1 (en) * | 2007-07-10 | 2008-12-10 | Федеральное государственное учреждение "Российский кардиологический научно-производственный комплекс Росмедтехнологий" (ФГУ "РКНПК Росмедтехнологий") | Method of obtaining dodecapeptide and tripeptide for its realisation |
| RU2827765C2 (en) * | 2022-06-02 | 2024-10-01 | Общество с ограниченной ответственностью "ЦитоНИР" (ООО "ЦитоНИР") | Peptide drug |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2003131626A (en) | 2005-05-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK2409988T3 (en) | Peptide fragments for inducing synthesis of extracellular matrix proteins | |
| KR101464576B1 (en) | Peptides Having Pharmacological Activity for Treating Disorders Associated with Altered Cell Migration, Such as Cancer | |
| JPH0789990A (en) | Peptide amide | |
| JP2014514365A (en) | High affinity dimer inhibitor of PSD-95 as an efficient neuroprotective agent for the treatment of ischemic brain injury and pain | |
| KR20200005526A (en) | Novel Stapled Peptides and Uses thereof | |
| CH637111A5 (en) | POLYPEPTIDE COMPOUNDS WITH THERMAL OR ANTAGONIST ACTIVITY AND METHODS OF SYNTHESIS THEREOF. | |
| US5786335A (en) | Sulfhydryl containing peptides for treating vascular disease | |
| RU2260598C2 (en) | Peptide eliciting capacity to inhibit migration of monocytic cells stimulated by protein mcp-1 | |
| Sidorova et al. | Peptide fragments and structural analogues of chemokine MCP-1: synthesis and effect on the MCP-1-induced migration of mononuclear cells | |
| AU2012216555B2 (en) | Peptide fragments for inducing synthesis of extracellular matrix proteins | |
| Laufer | Lehrstuhl II für Organische Chemie–Institute for Advanced Study | |
| Hamdan et al. | Synthesis of modified RGD based peptides and their in vitro | |
| HK1217346B (en) | Peptide fragments for inducing synthesis of extracellular matrix proteins | |
| HK1161599B (en) | Peptide fragments for inducing synthesis of extracellular matrix proteins | |
| HK1161600B (en) | Peptide fragments for inducing synthesis of extracellular matrix proteins |